技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学领域，具体涉及用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物。
背景技术
[0002] 枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需
氧菌。可利用
蛋白质、多种糖及
淀粉，分解色
氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在
土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
[0003] 荧光实时定量 PCR(qRT-PCR) 具有操作简单， 成本较低， 灵敏度高的优势， 经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究， 其转录
水平的研究常常基于qRT-PCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因， 在稳定或是病原应激的细胞中， 管家基因都能相对较稳定表达。 但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的 qRT-PCR 实验结果是非常重要的。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供用于筛选枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物。本发明中的3对内参基因引物序列特异性扩增高，扩增效率接近，线性相关性好，可用于检测枯草芽胞杆菌168菌株中基因的表达量变化。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因引物，所述的引物序列为clsA F: GGGTCCAGAACGCTGAGAA，clsA R: AAAGCCTCCGACATAACCG；dnaN F: GCACTTGCCGCAGATTGA，dnaN R: AATGCAAGACGGTGGCTATC；rpoB F: TGTCCGCATTGATCGCAC，rpoB R: TCAAGCGTATTTCGCAGGTA。
[0007] 本发明采用的3对内参基因引物，可作为多内参体系应用于荧光定量PCR检测。
[0008] 一种枯草芽孢杆菌荧光定量PCR内参基因筛选方法，所述步骤包括如下：1）菌体总RNA的抽提、
质量检测及cDNA合成；2）SYBR Green 实时定量PCR扩增；3）内参基因的筛选。
[0009] 所述步骤1）中的具体步骤为：
[0010] (1)挑取枯草芽孢杆菌单菌落转接瓶中，加氯霉素至终浓度为5μg/mL，培养至对数期，OD600为0.6时，加1mM IPTG诱导， 6小时后进行RNA的提取；
[0011] (2) 取2mL菌液，12,000rpm离心收集细胞，加入液氮
研磨三次，研磨充分呈白色粉末状；
[0012] (3) 加入2mL Trizol至研钵中，并将研钵中的液体全部转移至离心管中；
[0013] (4) 将裂解后样品或匀
浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；
[0014] (5) 加入0.4 mL 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4℃离心10 min；
[0015] (6) 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min；
[0016] (7) 12,000 rpm 4°C 离心10 min，弃上清；
[0017] (8) 加入1 mL 75%
乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清，室温干燥5-10 min；
[0018] (9) 加入30-50 µL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA；
[0019] (10)取适量RNA样品，加入10×Loading Buffer，100V
电压下，进行1%的琼脂糖凝胶
电泳，检测RNA的完整性；
[0020] (11)将RNA进行合理倍数的稀释，测其A260及A280数值，检测RNA的纯度；
[0021] (12) 利用全式金公司的逆转录
试剂盒，将RNA分别逆转录为cDNA，每一个逆转录体系中加1μg RNA，42℃逆转录15min，85℃ 5s，去除逆转录酶活性。
[0022] 本发明的优点在于：
[0023] 为了检测检测基因在转录水平上的相对表达量，去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。由于单个的内参基因在不同的细胞，生长时期和培养条件下表达量是不稳定的，因此，仅使用一个参照基因进行靶标基因的相对定量可能会有比较大的误差，选择两个或两个以上的内参基因有利于减小系统偏差。本发明中的3对内参基因引物序列特异性扩增高，扩增效率接近，线性相关性好，可用于检测枯草芽胞杆菌168菌株中基因的表达量变化。
附图说明
[0024] 图1 geNorm
软件分析各内参基因的表达稳定值M。
[0025] 图2 geNorm 软件计算内参基因的
配对差异值。
具体实施方式
[0027] 实验菌种
[0028] 枯草芽孢杆菌168菌株和168-ORF2菌株均由实验室保藏，168-ORF2菌株是能包含猪
圆环病毒衣壳蛋白表达载体的168菌株，IPTG诱导时，该菌株可以表达
猪圆环病毒衣壳蛋白。
[0029] 实验试剂
[0030] 无液氮RNA样品储存液购于百泰克；DEPC、Total RNA Extractor(Trizol)、RNase free-DNase I、IPTG、氯霉素均购于生工生物；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和 Top Green qPCR SuperMix购于全式金；96孔版购自ABI。
[0031] 实验所需8对引物是利用primer premier 5 设计的，经由上海生工生物有限公司合成的。
[0032] 实验方法
[0033] 一、菌体总RNA的抽提、质量检测及cDNA合成
[0034] (1)挑取枯草芽孢杆菌168菌株和168-ORF2菌株单菌落各转接两瓶，168-ORF2加氯霉素至终浓度为5μg/mL,培养至对数期，OD600为0.6时，一瓶168菌株和一瓶168-ORF2加1mM IPTG诱导，另两瓶不处理，6小时后进行RNA的提取。
[0035] (2) 取2mL菌液，12,000rpm离心收集细胞，加入液氮研磨三次，研磨充分呈白色粉末状；
[0036] (3) 加入2mL Trizol至研钵中，并将研钵中的液体全部转移至离心管中；
[0037] (4) 将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离；
[0038] (5) 加入0.4 mL 氯仿，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。12,000 rpm 4℃离心10 min；
[0039] (6) 吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min；
[0040] (7) 12,000 rpm 4°C 离心10 min，弃上清；
[0041] (8) 加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心3 min，弃上清。室温干燥5-10 min；
[0042] (9) 加入30-50 µL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA；
[0043] (10)取适量RNA样品，加入10×Loading Buffer，100V电压下，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；
[0044] (11)将RNA进行合理倍数的稀释，测其A260及A280数值，检测RNA的纯度。
[0045] (12) 利用全式金公司的逆转录试剂盒，将4组RNA分别逆转录为cDNA。每一个逆转录体系中加1μg RNA，42℃逆转录15min，85℃ 5s，去除逆转录酶活性。
[0046] 二、SYBR Green 实时定量PCR体系及扩增程序
[0047] 本实验采用的定量PCR反应体系为20μL，反应成分及浓度见表1
[0048] 表1 实时定量PCR反应体系及各成分浓度
[0049]
[0050] 实时定量采用三步法，94℃预变性30s；94℃变性5s，53℃
退火15s，72℃延伸31s，40个循环； 熔解过程为95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s。在ABI 7300 荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR。
[0051] 三、绘制标准曲线
[0052] (1) 取168未诱导菌株的cDNA，以10倍为一个梯度，对其进行梯度稀释，分别稀释10倍、100倍、1,000倍、10,000倍；
[0053] (2) 以这些梯度的cDNA为模板，以表1 的体系加RT-PCR体系，进行荧光定量PCR，每组3个平行；
[0054] (3) RT-PCR结束后，求每组三个平行的Ct值的平均值，绘制不同
模版浓度下内参2
基因的标准曲线，并得到曲线方程、扩增效率以及R。
[0055] 四、内参选择数据的处理
[0056] (1) 提取不同处理的样本的RNA，逆转录成cDNA，按照表1的体系加样，进行RT-PCR，每组3个平行；
[0057] (2) 输出RT-PCR数据，得到每组的Ct值，把每个基因中Ct值最小的样本其Ct值设置为1，其余样本与该样本的Ct值之差为ΔCt，得到ΔCt表；
[0058] (3)利用2ΔCt，得到每个样本中内参基因的相对表达量，并将相对表达量输入excel表格中，第一列为样本名称，第一行为基因名称；
[0059] (4)用软件geNorm 计算8个基因的稳定值M和配对差异值Vn/n+1，根据M和Vn/n+1确定所需的内参基因个数及内参基因。
[0060] 实验结果及分析
[0061] RNA提取及质量检测
[0062] 提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳， 23SrRNA和16SrRNA条带都非常清晰，且明亮无拖尾现象，5SrRNA有模糊的条带，说明抽提的RNA完整性较好。4个样品的RNA A260/280介于1.8 2.0之间，说明RNA中蛋白杂质较少，且RNA完整性较好。
~
[0063] 内参基因引物特异性分析
[0064] 通过研究8个基因的熔解曲线，8对引物也只出现单一的
信号峰，说明没有非特异条带和引物二聚体形成。
[0065] 内参基因的标准曲线和扩增效率分析
[0066] 根据表2可见，每一个引物的线性相关系数介于0.9836-0.9997，说明在有效的浓度范围之内，模板梯度稀释下的引物扩增线性相关性很好。8个基因进行梯度RT-PCR时，除了L10和recA之外，其余6个基因的扩增效率介于0.95-1.1之间，符合RT-PCR对扩增效率的要求。
[0067] 表2 枯草芽孢杆菌内参基因引物扩增参数
[0068]
[0070] 用geNorm软件进行分析，得到基因表达稳定值M，如图1，从图中可以得到8个基因的表达稳定值排序，8个基因的表达稳定值M介于0.685 1.059之间，符合筛选内参基因所要~求的稳定值M要小于1.5。通过计算候选内参基因的配对差异值Vn/n+1。本章利用geNorm计算Vn/n+1，结果如图2，由图可知，V2/3=0.165,大于选择内参基因所要求的0.15，因此选择两个内参基因是不能准确应用于该系统的基因相对表达量研究，V3/4=0.134<0.15，说明无需引入第4个内参基因进行校正，因此，可以选择3个内参基因对靶基因进行定量，即选择clsA、dnaN和rpoB，其引物序列见表3。
[0071] 表3 筛选的内参引物序列
[0072]
[0073] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明
申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
