一种疫苗组合物及其制备方法和应用
阅读：413发布：2021-02-08
专利汇可以提供一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 疫苗 组合物，该疫苗组合物包括：免疫量的支气管败血波氏杆菌 抗原 、免疫量的多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原及 兽医学 上可接受的佐剂。该疫苗组合物能有效的防治由支气管波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌引起的混合感染的猪萎缩性鼻炎，及进一步包括其他其他抗原成分，防治由猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征。本发明通过减少抗原成分，用多杀性巴氏杆菌类毒素来替代多杀性巴氏杆菌不同血清型的抗原，达到了 预防 猪萎缩性鼻炎的目的；还通过提高疫苗组合物单位体积的抗原含量，使疫苗组合物免疫剂量降低到现有疫苗的1/4剂量，免疫效果没有降低。因此，本发明提供了一种免疫剂量更低，抗原成分更少，免疫成本更低，使用方便的疫苗组合物。，下面是一种疫苗组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种疫苗组合物，由免疫量的支气管败血波氏杆菌抗原，免疫量的多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原及兽医学上可接受的佐剂组成；其中，所述支气管败血波氏杆菌抗原为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原为多杀性巴氏杆菌D型的类毒素抗原或多杀性巴氏杆菌A型的类毒素抗原或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或几种多肽，多杀性巴氏杆菌D型为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌A型为多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原选自下列形式的一种或几种：
1)天然毒素的灭活形式的多杀性巴氏杆菌类毒素，
2)人工合成的多肽形式的多杀性巴氏杆菌类毒素，
3)含有多杀性巴氏杆菌的类毒素免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，其中所述多杀性巴氏杆菌的类毒素免疫原性氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原选自天然毒素的灭活形式、人工合成的多肽形式的多杀性巴氏杆菌类毒素。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原为多杀性巴氏杆菌D型HB4株类毒素和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或几种多肽。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的支气管败血波氏杆菌抗原含量为3×109～1.5×1010CFU/ml，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原含量为1～150μg/ml。
6.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，包括：
1)培养增殖支气管败血波氏杆菌，并灭活；
2)培养增殖多杀性巴氏杆菌，收集PMT毒素并灭活，或者人工合成PMT多肽抗原；
3)按比例混合所述灭活的支气管败血波氏杆菌抗原，多杀性巴氏杆菌PMT类毒素抗原或者PMT多肽抗原，加入佐剂，乳化；
其中，所述支气管败血波氏杆菌抗原为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原为多杀性巴氏杆菌D型的类毒素抗原或多杀性巴氏杆菌A型的类毒素抗原或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或几种多肽，多杀性巴氏杆菌D型为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌A型为多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
7.一种疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物由免疫量的支气管败血波氏杆菌抗原，免疫量的多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原、至少一种能有效对抗猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征的其他生物的免疫原活性成分及兽医学上可接受的佐剂组成；
其中，所述支气管败血波氏杆菌抗原为支气管败血波氏杆菌HN8株灭活株，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原为多杀性巴氏杆菌D型的类毒素抗原或多杀性巴氏杆菌A型的类毒素抗原或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或几种多肽，多杀性巴氏杆菌D型为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌A型为多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述能有效对抗猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征的其他生物的免疫原活性成分选自下列生物的抗原：猪肺炎支原体；猪鼻支原体；蓝耳病病毒；猪圆环病毒2型；猪伪狂犬病毒；副猪嗜血杆菌；传染性胸膜肺炎；猪流感病毒。
9.根据权利要求1～5任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗混合感染猪萎缩性鼻炎的药物中的应用。
10.根据权利要求7所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗继发感染猪萎缩性鼻炎引起的呼吸系统综合征的药物中的应用。
一种疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 猪萎缩性鼻炎（atrophic rhinitis,AR）是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高，症状一般出现在8-12周龄。
[0003] 猪萎缩性鼻炎可分为进行性猪萎缩性鼻炎（progressive atrophic rhinitis,PAR）和非进行性猪萎缩性鼻炎（nonprogressive atrophic rhinitis,NPAR）。进行性猪萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴氏杆菌（toxigenic Pasteurella multocida，Pm）引起，病原通常为荚膜D型或A型，是猪萎缩性鼻炎的主要形式；非进行性猪萎缩性鼻炎，单纯由支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）引起，由于其通常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变，而常常为人们所忽视。
[0004] 当前，我国所用的猪萎缩性鼻炎疫苗还主要是支气管败血波氏杆菌（Bb）灭活苗或支气管败血波氏杆菌（Bb）加有产毒素多杀性巴氏杆菌D型（Pm-D）和A型（Pm-A）的灭活苗。由于产毒素多杀性巴氏杆菌（Pm）荚膜D型和A型均可以分泌一种皮肤坏死毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT），发明人意外的发现将PMT灭活后作为一种抗原成分组成支气管败血波氏杆菌（Bb）加有产毒素多杀性巴氏杆菌D型（Pm-D）和A型（Pm-A）加PMT类毒素的多种抗原成分的疫苗组合物，能提供对猪萎缩性鼻炎有效的防控（公开于中国专利CN102302771A）。然而本发明人在进行工艺改进时，意外的发现PMT类毒素即能提供对产毒素多杀性巴氏杆菌（Pm）荚膜D型和A型两种病原的完全保护，有效的减少了抗原成分，极大地减少了免疫刺激。
[0005] 在本发明人工重现猪萎缩性鼻炎混合感染试验中，发明人意外的发现，猪体在感染少量的支气管败血波氏杆菌，并未有明显的临床症状，甚至也检测不到支气管败血波氏杆菌病原的存在，但是当猪体继发混合感染产毒素多杀性巴氏杆菌（Pm）A型或D型时，会产生严重的猪萎缩病鼻炎症状，比单独感染产毒素多杀性巴氏杆菌（Pm）A型或D型时症状明显严重。且在猪体携带支气管败血波氏杆菌病原的情况下，感染其他呼吸系统疾病病原，往往产生严重的继发感染，尤其是猪萎缩性鼻炎混合感染其他呼吸系统疾病病原，往往产生极其严重的继发感染症状。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物，包含免疫量的支气管败血波氏杆菌（Bb）抗原，免疫量多杀性巴氏杆菌的类毒素（PMT）抗原及兽药学上可接受的佐剂。
[0007] 所述的支气管败血波氏杆菌抗原是指含有至少一种支气管败血波氏杆菌抗原形式的任何组合物，所述支气管败血波氏杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗支气管败血波氏杆菌感染的免疫应答，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，如支气管败血波氏杆菌JB5株。
[0008] 所述的多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原是指含有至少一种多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原形式的任何组合物，所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗产毒素多杀性巴氏杆菌感染的免疫应答，包括本领域技术人员熟知的临床分离的不同血清型野毒株天然类毒素，以及经人工基因工程手段合成的类毒素及多肽。
[0009] 优选地，所述支气管败血波氏杆菌抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的支气管败血波氏杆菌抗原，含有支气管败血波氏杆菌免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，含有支气管败血波氏杆菌免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；所述多杀性巴氏杆菌的类毒素抗原为天然毒素的灭活形式、人工合成的多肽形式的多杀性巴氏杆菌类毒素，含有多杀性巴氏杆菌的类毒素免疫原性氨基酸序列的嵌合细菌，含有多杀性巴氏杆菌类毒素免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。
[0010] 本发明所用的术语“活的形式抗原”指的是从已经减毒但仍可复制宿主生物体的细胞的细菌制备的抗原。本发明所用的术语“减毒”用于指以使基因丧失致病性、但保持抗原性的方式对涉及病原体基本代谢的基因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培养实现减毒。外显的基因改变，如使已知序列中的特定核苷酸缺失以降低毒性或将核苷酸插入细菌基因组中，也可能导致减毒。
[0011] 所用的术语“灭活形式抗原”，也称作失活抗原，指的是用以制备疫苗产生免疫力的灭活细菌的混悬液。灭活抗原的例子包括全菌体抗原和裂解型抗原。使用已知方法可以很容易地产生灭活抗原。例如，通过用甲醛溶液处理细菌可获得全菌体抗原。裂解型抗原可在用醚处理后由细菌荚膜制备得到。
[0012] 术语“亚单位抗原”指的是包含通过提取从病原性生物体分离出来的纯化的抗原决定簇成分。它比全菌体疫苗引起副反应的可能性小。
[0013] 术语“合成抗原”指的是主要由化学合成方法或基因工程方法形成的抗原决定簇或肽。
[0014] 优选地，本发明的支气管败血波氏杆菌为支气管败血波氏杆菌HN8株。
[0015] 优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌的类毒素为使用甲醛灭活获得的类毒素或人工合成的多肽形式的类毒素。
[0016] 优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌的类毒素为多杀性巴氏杆菌D型的类毒素或多杀性巴氏杆菌A型的类毒素或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3中的一种或几种多肽。
[0017] 优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌D型为多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌A型为多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
[0018] 优选地，本发明的支气管败血波氏杆菌HN8株（Bordetella bronchiseptica HN8）保藏号为CCTCC NO：M2011223，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年06月28日，保藏地址为中国武汉·武汉大学；多杀性巴氏杆菌D型HB4株（Pasteurella multocida D Type HB4）保藏号为CCTCC NO：M2011221，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年06月28日，保藏地址为中国武汉·武汉大学；多杀性巴氏杆菌A型HN5株（Pasteurella multocida A Type HN5）保藏号为CCTCC NO：M2011222，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年06月28日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
[0019] 优选地，本发明的支气管败血波氏杆菌含量为3×109～1.5×1010CFU/ml。
[0020] 优选地，本发明的多杀性巴氏杆菌的类毒素含量为1～150μg/ml。
[0021] 优选地，本发明的兽药学上可接受的佐剂为水佐剂。
[0023] 优选地，本发明的兽药学上可接受的佐剂为gel佐剂。
[0024] 本发明的另一目的在于提供一种治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0025] （1）培养增殖支气管败血波氏杆菌，并灭活；
[0026] （2）培养增殖多杀性巴氏杆菌，收集PMT毒素并灭活，或者人工合成PMT多肽抗原；
[0027] （3）按比例混合所述灭活的支气管败血波氏杆菌抗原，多杀性巴氏杆菌PMT类毒素抗原或者PMT多肽抗原，加入佐剂，乳化。
[0028] 优选地，本发明的治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备方法，已灭活的支气管败血波氏杆菌的含量为3×109～1.5×1010CFU/ml、多杀性巴氏杆菌D型PMT类毒素的含量为1～150μg/ml。
[0029] 另外，猪萎缩性鼻炎感染后容易继发感染其他呼吸系统疾病病原，造成严重继发感染的呼吸系统综合征，造成严重的损失。而且在猪体携带猪萎缩性鼻炎少量病原时，表现不太明显的症状，但是当此时感染其他呼吸系统疾病病原，不仅会直接诱发猪萎缩性鼻炎的严重发生，也同时造成了感染的其他病原的疾病的发生。
[0030] 多价疫苗为现今疫苗发展的主要趋势，其优点是经过免疫后能同时预防多种疾病的感染，并可大幅降低因免疫多种疫苗所导致的多重压力以及减少接种疫苗的人工成本。本发明疫苗组合物可以和其他呼吸系统疾病抗原通过合理组合成多联疫苗来防控猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征。特别是，由于年龄越小的猪在感染猪萎缩性鼻炎后所产生的症状会越严重，而以本发明疫苗组合物同其他疾病抗原通过合理组合成多联疫苗来防控猪萎缩性鼻炎继发感染，尤其对仔猪免于相关疾病的早期感染，有着重要的作用。
[0031] 在现有情况下，猪萎缩性鼻炎的预防需要支气管败血波氏杆菌抗原、多杀性巴氏杆菌A型抗原、多杀性巴氏杆菌D型抗原等多种抗原成分，且免疫剂量大，一般需要加强免疫，免疫应激增大，特别不适合小日龄的仔猪。因此，当前研制出抗原成分少，免疫剂量小，免疫效果好，成本更低的预防猪萎缩性鼻炎疫苗组合物成为一项紧迫的任务。
[0032] 基于猪萎缩性鼻炎与猪肺炎支原体皆为猪的高传染性疾病，申请人进一步尝试将由本发明制备的猪萎缩性鼻炎疫苗与猪肺炎支原体疫苗组合，由此制造能对猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征产生良好保护效用的多联疫苗。以及用于预防由猪萎缩性鼻炎继发感染的其他呼吸系统综合征，本发明疫苗组合物可以包括其他抗原，比如容易继发及混合感染的猪肺炎支原体、猪鼻支原体、蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎、猪流感等，及其他加重猪萎缩性鼻炎症状的病原。
[0033] 优选地，本发明猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613（Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613），保藏号为CCTCC NO：M2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年06月13日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
[0034] 本发明的另一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗感染猪萎缩性鼻炎相关疾病的药物中的应用。
[0035] 本发明的另一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗混合感染猪萎缩性鼻炎的药物中的应用。
[0036] 本发明的另一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗继发感染猪萎缩性鼻炎引起的呼吸系统综合征的药物中的应用。
[0037] 本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制或推迟猪萎缩性鼻炎及继发感染的呼吸系统综合征发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪萎缩性鼻炎及继发感染的呼吸系统综合征引起的症状减轻或转好的所有行为。
[0038] 本发明所用的术语“猪萎缩性鼻炎相关疾病”用于指由支气管败血波氏杆菌或产毒多杀性巴氏杆菌或由产毒多杀性巴氏杆菌及支气管败血波氏杆菌共同感染引起的疾病。它的例子包括发病猪表现出鼻炎症状，打喷嚏，呼吸有鼾声，进一步发展引起鼻甲骨萎缩，生长发育迟缓，育肥时间延长；有的病症在鼻炎症状发生后几周，症状渐渐消失，并不出现鼻甲骨萎缩；有的感染猪只只是少量病菌的携带者，并无症状出现；但不限于此。
[0039] 本发明所用术语“混合感染猪萎缩性鼻炎”用于指由产毒多杀性巴氏杆菌及支气管败血波氏杆菌共同感染引起的疾病。
[0040] 本发明所用术语“继发感染猪萎缩性鼻炎引起的呼吸系统综合征”用于指有些感染猪萎缩性鼻炎的病猪或携带猪萎缩性鼻炎相关病原的猪只由于某些继发细菌或病毒及其他病原体通过损伤的鼻粘膜侵入呼吸系统而引起病症，如，发生鼻甲骨萎缩的猪群往往同时发生肺炎，并出现相应的症状。
[0041] 由本发明下面的实施例可以看出，本发明通过提高疫苗组合物单位体积的抗原含量，使疫苗免疫剂量降低到现有疫苗的1/4剂量，即对于3周龄仔猪，每只2ml，加强免疫一次，共4ml，降低到1ml，从而减小疫苗免疫对机体的应激反应，而且适应于小日龄鸡群，增大疫苗的适用范围。此外，在降低疫苗剂量的前提下，本发明的疫苗免疫效果没有降低。即，本发明提供了一种免疫剂量小、免疫效果好、成本更低的预防和治疗猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物。
具体实施方式
[0042] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0043] 实施例1治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备
[0044] 1.菌液的制备
[0045] 将支气管败血波氏杆菌HN8株划线于改良鲍姜氏血平板，与37℃培养48h，挑取溶血环明显的单克隆于含5ml BHI的试管中，于150-220rpm，37℃振荡培养16-24h，之后将菌液以1%的接种量于37℃扩大培养12-16h，转速150-220rpm。取样作系列十倍稀释，涂平板计数。
[0046] 将巴氏杆菌D型HB4株的菌种划线于TSA平板，与37℃培养16-20h，挑取单克隆于含5mlBHI的试管中，于150-220rpm，37℃振荡培养16-24h，之后将菌液以1%的接种量于37℃扩大培养12-16h，转速150-220rpm。取样作系列十倍稀释，涂平板计数。
[0047] 取支气管败血波氏杆菌HN8株菌液，加入甲醛，使甲醛的最终浓度为0.2％-0.4％体积，37℃灭活24-48h，其间不断摇动。灭活后取样涂布于BHI平板，37℃培养16-24h，无菌落生长。将灭活后的菌液离心浓缩，弃上清，用PBS悬浮稀释菌体，使细菌含量相当于灭活前活菌数为1×1011CFU／mL。
[0048] 将离心收集的巴氏杆菌D型HB4株菌体用灭菌双蒸水重悬，使细菌浓度达到1012CFU/mL。将重悬菌液置冰浴中经超声波破碎后，10000r／min离心30min，上清用0.22pm滤膜过滤，滤液为粗制PMT类毒素。用TE(10mmol／L Tris-HCl pH7.4，1mmol／L EDTA)平衡DEAE-52柱，以含0～0.5mol／L NaCI的TE线性梯度洗脱，流速30mL／h。收集各峰，取50μL进行SDS-PAGE分析。将DEAE-52分离到的样品用蔗糖浓缩后上Sephadex G-200柱，用TE以6mL／h流速洗脱，分段收集各峰，进行SDS-PAGE分析。收集的PMT蛋白用超滤管浓缩，并用考马斯亮蓝法测定PMT蛋白浓度。将浓缩的蛋白加入甲醛，使甲醛的最终浓度为0.2％-0.4％体积，37℃灭活24-48h，其间不断摇动。PMT类毒素灭活后取0.1ml于豚鼠背部皮肤注射，无皮肤坏死。
[0049] 2.疫苗组合物的配制
[0050] 取灭活后的支气管败血波氏杆菌HN8株和PMT类毒素缓缓加入到一定量的Gel佐剂（法国赛比克公司）中，加的过程中不断用玻璃棒搅拌，最后加入柳硫汞钠，使最终浓度为0.01％体积，混匀、检验、分装，即为猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物，其中疫苗中菌体含灭活前支气管败血波氏杆菌HN8株含量为3×109CFU／mL-1.5×1010CFU／mL，PMT类毒素含量为1-150μg/ml。
[0051] 实施例2治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备2
[0052] 菌种及菌种的灭活，PMT类毒素的提取和灭活同实施例1。
[0053] 实施例2的各个抗原的比例参见下表1。
[0054] 实施例3治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备3
[0055] 菌种及菌种的灭活，PMT类毒素的提取和灭活同实施例1。
[0056] 实施例3的各个抗原的比例参见下表1。
[0057] 实施例1-3的疫苗的具体配比如表1：
[0058] 表1猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的成分配比
[0059] 实施例1 实施例2 实施例3
支气管败血波氏杆菌 3×109 1×1010 1.5×1010
支气管败血波氏杆菌 3×109 1×1010 1.5×1010
[0060]（CFU/ml）
PMT类毒素含量（μg/ml） 1 20 50
Gel佐剂（%） 10 15 15
PMT类毒素含量（μg/ml） 1 20 50
Gel佐剂（%） 10 15 15
[0061] 实施例4治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的效力检验[0062] 根据实施例1-3的配比分别配制一批疫苗，批号分别为1104、1105和1106。
[0063] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪30头，分为两组，免疫组15头，对照15头。3周龄仔猪进行免疫，在7周龄进行攻毒，免疫仔猪组和对照组各再分成三组，每组5头，分别采取Bb/Pm（Pm-A或Pm-D）联合攻毒或PMT攻毒法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫仔猪为5头免疫猪至少4头以上获得保护，对照仔猪为5头攻毒猪至少4头以上发病。发病标准为：发病猪出现精神不振、呆滞、食欲下降，感染后期出现鼻子搔痒、打喷嚏、眼部出现泪斑，攻毒后30-45天剖杀所有猪，观察鼻甲骨病变，可见鼻甲骨卷曲出现不同程度的萎缩。免疫效果见表2、表3和表4。
[0064] 表2疫苗效力检验结果（Bb/Pm-A攻毒）
[0065]
[0066] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-A：1×1010CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
[0067] 表3疫苗效力检验结果（Bb/Pm-D攻毒）
[0068]
[0069] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-D：1×1010CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株。
[0070] 表4疫苗效力检验结果（Bb/PMT攻毒）
[0071]
[0072] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，PMT：100μg/kg体重，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株分泌PMT毒素。
[0073] 由表2、表3和表4数据结果可表明本发明疫苗能够对免疫仔猪提供强有力的保护，能够抵抗Bb、Pm-A和Pm-D强毒以及PMT的攻击。
[0074] 实施例5治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物免疫效果比较试验[0075] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪65头，分为五组，免疫组15头，注射实施例1中制备的批号为1104疫苗免疫，对比对照30头，其中15头注射按照中国专利CN102302771A实施例1中制备方法制备的批号为1204疫苗进行一次免疫；另15头注射按照中国专利CN102302771A实施例1中制备方法制备的批号为1204疫苗进行两次免疫。设攻毒对照组15头及空白对照组5头。3周龄免疫组及两个疫苗对比对照组仔猪进行免疫（需要进行两次免疫的在第5周进行），在7周龄连同攻毒对照组进行攻毒，免疫仔猪组，两个疫苗对比对照组及攻毒对照组各再分成三组，每组5头，分别采取Bb/Pm（Pm-A或Pm-D）联合攻毒或PMT攻毒法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪，疫苗对比对照猪及攻毒对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫仔猪为5头免疫猪至少4头以上获得保护，攻毒对照仔猪为5头攻毒猪至少4头以上发病，空白对照猪无异常，不发病。发病标准为：发病猪出现精神不振、呆滞、食欲下降，感染后期出现鼻子搔痒、打喷嚏、眼部出现泪斑，攻毒后30-45天剖杀所有猪，观察鼻甲骨病变，可见鼻甲骨卷曲出现不同程度的萎缩。免疫效果见表5。
[0076] 表5免疫效果比较试验结果
[0077]
[0078] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-A：1×1010CFU，Pm-D：1×1010CFU，PMT：100μg/kg体重，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株分泌PMT毒素。
[0079] 通过上述免疫效力检验证明，疫苗批号为1104三组疫苗都能达到效检标准；疫苗批号为1204按照两次免疫程序三组疫苗都能达到效检标准，按照本发明免疫量，一次免疫程序无法达到效检标准；攻毒对照及空白对照成立。提高疫苗抗原含量能够减少免疫剂量，但抗原含量与免疫剂量并非正相关，通过本试验证明免疫剂量减少到原剂量的1/4，抗原含量为原来的3倍即能达到效力检验标准。本发明所制备的疫苗能够对免疫仔猪提供强有力的保护，能够抵抗Bb、Pm-A和Pm-D强毒以及PMT的攻击，而免疫剂量是对照疫苗的1/4剂量。
[0080] 实施例6治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的制备4
[0081] 治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物包含的免疫量多杀性巴氏杆菌D型的类毒素（PMT）抗原也可以是多肽抗原，包括人工合成的多肽抗原。本发明实施例采用人工合成多肽抗原替代天然PMT类毒素抗原，依然可以达到本发明的目的。
[0082] 本实施的多肽可以通过ABI433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了9-芴甲氧羰基（Fmoc）修饰的氨基酸，固相载体为Rink Amide MBHA树脂。合成的多肽抗原，他们的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0083] 1.多肽抗原的制备
[0084] 1.1去保护反应：在20%（体积/体积）的六氢吡啶的N-甲基吡咯烷酮（NMP）溶液中在22℃条件下反应30分钟，脱出树脂氨基上的Fmoc保护基团，氮气吹干，NMP洗涤树脂；
[0085] 1.2氨基酸的活化：将合成用的带有Fmoc的各个氨基酸与1-烃基苯丙三唑（HOBT）反应合成氨基酸-HOBT酯；
[0087] 1.4乙酰化反应：使用2.5%（重量/体积）的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与上述步骤获得的树脂在22℃条件下反应30分钟，氮气吹干，甲醇洗涤树脂；
[0088] 1.5合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复上述步骤，反应完成后，用NMP清洗，除去残余的氨基酸，得到干燥的多肽树脂；
[0089] 1.6多肽与树脂的分离：将干燥的多肽-树脂放入玻璃容器内，将配制好的裂解试剂（体积比为三氟乙酸：三异丙基硅烷：乙二硫醇：苯酚：水=85:8:3:3:1）加入容器内，匀速搅拌3小时，将玻璃容器置于0℃下反应10分钟，取出恢复至室温，挥去三氟乙酸（TFA），将叔丁基甲醚及二乙醚加到多肽溶液中，搅拌洗涤，过滤分离出多肽溶液；
[0090] 1.7超滤纯化多肽抗原后进行无菌处理：使用膜包在22℃条件下超滤多肽抗原，使用0.22微米在线滤器除菌保存。
[0091] 2.疫苗组合物的配制
[0092] 取实施例1制备灭活后的支气管败血波氏杆菌HN8株和上述人工合成的多肽缓缓加入到一定量的Gel佐剂（法国赛比克公司）中，加的过程中不断用玻璃棒搅拌，最后加入柳硫汞钠，使最终浓度为0.01％体积，混匀、检验、分装，即为猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物。具体配比见表6。
[0093] 表6猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的成分配比2
[0094]
[0095] 注：PMT多肽可以是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3多肽中的一种或者几种的组合，本实施例中具体为三种的组合，比例为1:1:1。
[0096] 3.疫苗组合物的效力检验
[0097] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪30头，分为两组，免疫组15头，对照15头。3周龄仔猪进行免疫，在7周龄进行攻毒，免疫仔猪组和对照组各再分成三组，每组5头，分别采取Bb/Pm（Pm-A或Pm-D）联合攻毒或PMT攻毒法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫仔猪为5头免疫猪至少4头以上获得保护，对照仔猪为5头攻毒猪至少4头以上发病。发病标准为：发病猪出现精神不振、呆滞、食欲下降，感染后期出现鼻子搔痒、打喷嚏、眼部出现泪斑，攻毒后30-45天剖杀所有猪，观察鼻甲骨病变，可见鼻甲骨卷曲出现不同程度的萎缩。免疫效果见表7、表8和表9。
[0098] 表7疫苗效力检验结果（Bb/Pm-A攻毒）
[0099]
[0100] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-A：1×1010CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌A型HN5株。
[0101] 表8疫苗效力检验结果（Bb/Pm-D攻毒）
[0102]
[0103] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-D：1×1010CFU，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株。
[0104] 表9疫苗效力检验结果（Bb/PMT攻毒）
[0105]
[0106] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，PMT：100μg/kg体重，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株分泌PMT毒素。
[0107] 由表7、表8和表9数据结果可表明本发明疫苗能够对免疫仔猪提供强有力的保护，能够抵抗Bb、Pm-A和Pm-D强毒以及PMT的攻击。
[0108] 实施例7混合感染的猪萎缩性鼻炎的感染模型
[0109] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪40头，分为八组，所有小猪均通过口鼻途径按照表10的方案接种各菌毒液。
[0110] 表10混合感染的猪萎缩性鼻炎感染模型分组表
[0111]
[0112] 试验攻击结果：
[0113] A组：猪正常，未有任何症状，解剖各器官正常；
[0114] B组：猪正常，未有任何症状，解剖发现鼻甲骨有轻微萎缩，肺部未有病变，鼻拭子未检测到波氏杆菌；
[0116] D组：仔猪出现慢性型症状，偶有咳嗽症状，解剖发现鼻甲骨萎缩、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌D型病原；
[0117] E组：仔猪出现慢性型症状，偶有咳嗽症状，解剖发现鼻甲骨萎缩、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌PMT毒素病原；
[0118] F组：仔猪出现典型症状，鼻吻变短，有鼻炎症状，打喷嚏，呈连续或断续性发生，呼吸有鼾声，鼻部出现血样分泌物，解剖发现鼻甲骨严重损害、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌A型病原，未检测到波氏杆菌；
[0119] G组：仔猪出现典型症状，鼻吻变短，有鼻炎症状，打喷嚏，呈连续或断续性发生，呼吸有鼾声，鼻部出现血样分泌物，解剖发现鼻甲骨严重损害、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌D型病原，未检测到波氏杆菌；
[0120] H组：仔猪出现典型症状，鼻吻变短，有鼻炎症状，打喷嚏，呈连续或断续性发生，呼吸有鼾声，鼻部出现血样分泌物，解剖发现鼻甲骨严重损害、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌PMT毒素病原，未检测到波氏杆菌。
[0121] 通过试验意外发现，仅用低剂量的支气管败血波氏杆菌滴鼻感染，猪体不会发病，也无组织损伤情况出现，进行细菌分离鉴定未能检测到病原；而在用低剂量的支气管败血波氏杆菌滴鼻感染，并同时感染多杀性巴氏杆菌时，会出现混合感染较单独感染多杀性巴氏杆菌更严重的症状及组织损伤，在这些组织损伤中，可以分离到多杀性巴氏杆菌相关病原，但在这些相同的组织损伤中检测不到支气管败血波氏杆菌病原的存在；对照组也未观察到肉眼可见的或组织学的损伤。因此，似乎只有支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌这种组合可重现这种严重的混合感染的猪萎缩性鼻炎。
[0122] 仔猪免疫后混合攻毒效检：
[0123] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体阴性，PCR检测Bb，Pm阴性的3周龄断奶仔猪35头，分为七组，免疫组3组，攻毒对照组3组，空白对照1组，每组5头。3周龄免疫组仔猪分别免疫疫苗批号1104，间隔3周后，免疫组和攻毒对照组在6周龄用各个强毒株按照F组、G组和H组的攻毒方式和剂量，攻毒后观察4周。三组免疫组未有临床症状，解剖发现只有一头仔猪有轻微肺部病变，鼻甲骨正常，免疫保护率为5/5。三组攻毒对照组仔猪5/5发病，空白对照组正常。由以上结果表明免疫本发明组合物，在混合攻击（F组、G组及H组攻毒方式）的攻毒模式，能产生很好的免疫效果。
[0124] 表11仔猪免疫后混合攻毒效检结果
[0125]
[0126] 实施例8猪萎缩性鼻炎继发感染模型
[0127] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体、肺炎支原体抗体阴性，PCR检测Bb，Pm，Mhp阴性的3周龄断奶仔猪35头，分为七组，所有小猪均通过口鼻途径按照表12的方案接种各菌毒液。
[0128] 表12猪萎缩性鼻炎继发感染模型
[0129]
[0130] 试验攻击结果：
[0131] A组：猪正常，未有任何症状，解剖各器官正常；
[0132] B组：猪正常，未有任何症状，解剖发现鼻甲骨有轻微萎缩，肺部未有病变，鼻拭子未检测到波氏杆菌；
[0133] C组：仔猪出现慢性型症状，偶有咳嗽症状，解剖发现鼻甲骨萎缩、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌PMT毒素病原；
[0134] D组：有轻微症状，可以分离到相应病原；
[0135] E组：有症状，解剖发现鼻甲骨有轻微萎缩，肺部有病变，鼻拭子未检测到波氏杆菌，可以分离到猪肺炎支原体病原；
[0136] F组：仔猪出现慢性型症状，伴有咳嗽症状，解剖发现鼻甲骨萎缩、肺部多处坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，取各部病变能检测到多杀性巴氏杆菌PMT毒素病原及猪肺炎支原体病原；
[0137] G组：仔猪出现典型症状，鼻吻变短，有鼻炎症状，打喷嚏，呈连续或断续性发生，呼吸有鼾声，鼻部出现血样分泌物，解剖发现鼻甲骨严重损害、肺部多处严重坏死灶、胸膜及心包有纤维素絮状物附着，在损伤部位可以分离检测到多杀性巴氏杆菌PMT毒素病原及猪肺炎支原体病原，但是无法检测到波氏杆菌。
[0138] 混合感染的猪萎缩性鼻炎可破坏呼吸系统粘膜屏障，极易感染其他病原，这就是造成猪萎缩性鼻炎继发感染呼吸系统综合征的可能原因。
[0139] 基于猪萎缩性鼻炎与猪肺炎支原体皆为猪的高传染性疾病，申请人进一步尝试将由本发明制备的猪萎缩性鼻炎疫苗与猪肺炎支原体疫苗组合，由此制造能对猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征产生良好保护效用的多联疫苗。以及用于预防由猪萎缩性鼻炎继发感染的其他呼吸系统综合征，本发明疫苗组合物可以包括其他抗原，比如容易继发及混合感染的猪肺炎支原体、猪鼻支原体、蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎、猪流感等，及其他加重猪萎缩性鼻炎症状的病原，本实施例具体就预防由猪萎缩性鼻炎继发感染猪肺炎支原体引起的呼吸系统综合征制造产生良好保护作用的多联疫苗来进行说明。
[0140] 1.菌液的制备
[0141] 支气管波氏杆菌菌液的制备及灭活，PMT类毒素的提取及灭活同实施例1。
[0142] 将猪肺炎支原体菌HN0613用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7-10d,选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7-10d，作为一级种子。取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养4-7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0143] 液体培养基的配方（按1065m1计）：牛心浸出液300ml，ddH2O360ml，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份:Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25%酚红10ml猪血清200ml，5%水解乳蛋白100m1，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，
1%醋酸铊溶液25m1。
1%醋酸铊溶液25m1。
[0144] 固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。
[0145] 将液体培养基培养的猪肺炎支原体种子液以1:10(容积比)接种于液体培养基中。37℃下培养3-6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。
[0146] 用PCR方法对培养物进行计数。培养物含量应为1×109-2×109MHDCE/ml(MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。
[0147] 取猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%的甲醛溶液（V/V），放37℃灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出。
[0148] 将猪肺炎支原体培养液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda道尔顿）进行浓缩。浓缩后含量为1011MHDCE/ml。
[0149] 2.疫苗组合物的配制
[0150] 取灭活后的支气管败血波氏杆菌HN8株、PMT类毒素和猪肺炎支原体HN0613缓缓加入到一定量的Gel佐剂（法国赛比克公司）中，加的过程中不断用玻璃棒搅拌，最后加入柳硫汞钠，使最终浓度为0.01％体积，混匀、检验、分装，即为治疗和预防由猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征的疫苗组合物，其中疫苗中菌体含灭活前支气管败血波氏杆菌HN8株含量为3×109CFU／mL-1.5×1010CFU／mL，PMT类毒素含量为1-150μg/ml，猪肺炎支原体HN0613抗原含量为108～1010MHDCE/ml。具体配方见表13。
[0151] 表13猪萎缩性鼻炎继发感染的呼吸系统综合征的疫苗组合物成分配比[0152] 疫苗1 疫苗2 疫苗3
支气管败血波氏杆菌（CFU/ml） 3×109 1×1010 1.5×1010
PMT类毒素含量（μg/ml） 1 50 150
猪肺炎支原体（MHDCE/ml） 108 109 1010
Gel佐剂（%） 10 15 15
支气管败血波氏杆菌（CFU/ml） 3×109 1×1010 1.5×1010
PMT类毒素含量（μg/ml） 1 50 150
猪肺炎支原体（MHDCE/ml） 108 109 1010
Gel佐剂（%） 10 15 15
[0153] 3.疫苗组合物的效力试验
[0154] 选择波氏杆菌抗体、抗多杀性巴氏杆菌PMT毒素抗体、肺炎支原体抗体阴性，PCR检测Bb，Pm，Mhp阴性的3周龄断奶仔猪30头，免疫组15头，对照15头。3周龄仔猪进行免疫，在7周龄进行攻毒，免疫仔猪组和对照组各再分成三组，每组5头，分别采取Bb/Pm（Pm-A或Pm-D）联合攻毒或PMT攻毒法，攻毒后观察30～45天后，处理免疫猪和对照猪，观察仔猪鼻甲骨萎缩情况。免疫仔猪为5头免疫猪至少4头以上获得保护，对照仔猪为5头攻毒猪至少4头以上发病。发病标准为：发病猪出现精神不振、呆滞、食欲下降，感染后期出现鼻子搔痒、打喷嚏、眼部出现泪斑，攻毒后30-45天剖杀所有猪，观察鼻甲骨病变，可见鼻甲骨卷曲出现不同程度的萎缩。免疫效果见表14。
[0155] 表14疫苗效力检验结果（Bb/Pm-A攻毒）
[0156]
[0157] 注：攻毒剂量：Bb：1×1011CFU，Pm-A：1×1010CFU，Pm-D：1×1010CFU，PMT：100μg/kg体重，攻毒方式：气管注射。攻毒菌株来源：发病猪场分离强毒株支气管败血波氏杆菌HN8株，多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株，多杀性巴氏杆菌D型HB4株分泌PMT毒素。
[0158] 实施例9治疗和预防混合感染猪萎缩性鼻炎的疫苗组合物的应用
[0159] 此研究中包括787头商品猪，将这些猪按照体重、以及是否一窝所生区分开，随机分2组，即疫苗免疫组(387头猪)、对照组(400头猪)。
[0160] A组:在研究当天(第0天)，对约14日龄的猪进行单次肌肉接种本发明的疫苗组合物，1ml/头。
[0161] B组:对照组为未经治疗的猪。
[0162] 在肥育结束时(研究第24周)终止研究。
[0163] 所记录的参数
[0164] 参数记录如下:
[0165] （1）个体体重(所有动物)
[0166] （2）僵猪率(所有动物)
[0167] （3）临床表现(所有动物)
[0168] （4）死亡率(所有动物)
[0169] （5）尸检(若可能，每一只死亡或处死动物)
[0170] 养猪场发病情况
[0171] 根据饲养及肥育农场的发病史，动物自四周龄开始经历猪萎缩性鼻炎继发感染相关的呼吸道症状。这些症状伴有肥育期间的体重增加程度降低(ADWG750-780g)及死亡率增加(7.5-8.6%)。此时被认为涉及猪萎缩性鼻炎继发感染相关的呼吸道症状的病原体为SIV、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、猪圆环病毒2型，有时还涉及PRRSV。此研究中还发现，猪鼻支原体与此疾病综合征有关。有趣的是，此研究的结果表明，支气管败血性波氏杆菌和产毒多杀性巴氏杆菌的感染在猪萎缩性鼻炎症状发作的约3-5周前出现。可能是猪群中存在早期潜伏感染造成的。
[0172] 结果
[0173] 体重、体重增加、平均每日体重增加(ADWG)
[0174] 在研究起始时免疫组和对照组体重相当。在研究第17周及第24周，疫苗接种组之体重显著高于对照组的体重(分别为p=0.0006及p<0.0001)。
[0175] 自研究起始至研究第24周，疫苗接种组动物比对照组动物多增重3.75kg。此对应于，从研究启始至研究第17周时疫苗接种组动物的ADWG高15.4g/d，至研究第24周时疫苗接种组动物的ADWG高23.2g/d。对于整个肥育期(研究第10-24周)而言，ADWG因此可从对照组动物的801.0g/d增加至疫苗接种组动物的834.4g/d，具体情况见表15。
[0176] 表15接种疫苗对动物体重增长的影响
[0177]
[0178] *表示组间比较之t检验之p值，ns:不显著，***显著，p≤0.001极显著[0179] 僵猪率
[0180] 在任一称重时间点，未在疫苗接种组与对照组之间观测到僵猪率的显著差异。免疫组和对照组的僵猪率都较低(2.5%-4.0%)。
[0181] 临床表现
[0182] 对照组和免疫组有类似的临床表现，跛行、腹泻(在4%-7%的动物中)。这些表现在对照组和免疫组中出现频率相等。对死亡动物进行尸检且随后进行微生物学检验发现，猪链球菌可能是引起跛行的感染性病原体，溶血性大肠杆菌可能是腹泻的原因。此外，对照组在8-24周呼吸道症状明显（在15%-20%的动物中），咳嗽、呼吸困难，严重的猪只呈犬坐呼吸，对症状严重濒死猪只处死后，解剖进行微生物检验发现，呼吸道症状可能是由支气管败血波氏杆菌、产毒多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体混合感染引起的。与对照组相比，疫苗免疫组猪只中咳嗽及呼吸困难的频率分别降低31%及35.8%。表明免疫组对呼吸道综合症有较好防治效果。
[0183] 死亡率
[0184] 整个试验过程中，对照组猪只具有比疫苗接种组动物显著较高的死亡率(疫苗接种组动物:2.11%，安慰剂处理组动物:4.75%,p=0.0114)。疫苗接种组猪只的死亡率比对照组猪只下降56%。
[0185] 所述研究已在肥育后期有典型猪萎缩性鼻炎继发感染相关的呼吸道症状的农场进行。猪在5-24周龄时发展出呼吸道症状、死亡率增加、且体重增加幅度减小。通过血清学及微生物学筛查发现，SIV、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体、支气管败血波氏杆菌及多杀性巴氏杆菌都可能参与此种疾病综合征。
[0186] 与对照组相比，疫苗接种组的以下统计学显著表现值得注意:
[0187] -增重损失减小
[0188] -死亡率降低
[0189] -咳嗽及呼吸困难减少
[0190] 如所预期，僵猪率未观测到统计学显著差异，因为僵猪的出现并非猪萎缩性鼻炎继发感染相关的呼吸道疾病的典型表现。
[0191] 将这些表现汇总能得出以下结论:
[0192] 1、本研究在肥育中受猪萎缩性鼻炎继发感染相关的呼吸道疾病影响的畜群中进行。支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌及猪肺炎支原体参与此种疾病综合征，观测到呼吸道症状、增重损失及死亡率增加。
[0193] 2、本发明疫苗组合物对动物进行疫苗接种可降低或甚至防止猪萎缩性鼻炎继发猪肺炎支原体感染相关的呼吸道疾病。
[0194] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换例如换用其它基因相似的毒株或者两种商业化的疫苗临用前稀释合并等以及其它改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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