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MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用

阅读：402发布：2021-02-01

专利汇可以提供MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用。该融合抗菌肽是如下1)或2)或3)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；3)将组成1)或2)蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或2)衍生的蛋白质。本发明利用基因工程技术获得抗菌效应很强的抗菌肽，完成了在酵母细胞内高表达研究，发现其能耐受饲料制粒时的高温作用；并独创重组酵母发酵生产工艺，可望进一步深入研究开发为高效安全的多功能生物饲料，代替或减少抗生素添加剂，同时提高饲料的营养价值，为我国畜牧业的可持续发展提供新技术支撑。，下面是MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种蛋白，是如下1)或2)或3)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；
3)将组成1)或2)蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或2)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的第21-248位；
2)其核苷酸序列是序列表中序列1；
3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组原核表达载体或重组真核表达载体；所述重组原核表达载体是在质粒pGEX-4T-1的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体；所述重组真核表达载体是在质粒pYCa的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是含有权利要求4或5所述的重组原核表达载体的重组大肠杆菌或含有权利要求4或5所述的重组真核表达载体的重组酵母菌；所述重组大肠杆菌优选为重组大肠杆菌BL21；所述重组酵母菌优选为重组yCY3酵母。
7.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求6所述的重组菌发酵，得到所述蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组菌是所述重组大肠杆菌BL21，所述发酵的条件是：18-37℃、0.1和1.0mmol/L的IPTG诱导2-4h，优选的发酵条件是：37℃，
0.1mmol/L的IPTG诱导4h。
所述重组菌是所述重组yCY3酵母，所述发酵的条件是：28-30℃，280r/m振荡诱导培养
40h。
9.权利要求1所述的蛋白在制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和/或肺炎链球菌活性的试剂中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白在制备抑制圆环病毒2和/或呼吸繁殖综合症病毒的复制的试剂或者在制备动物饲料添加剂中的应用。

说明书全文

MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及MAPWA融合抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 我国是世界第一养猪大国，每年出栏牲猪7亿多头，存栏5亿多头；以猪为主体的畜牧业占大农业比重达34％左右，畜牧业对农业总产值增长的贡献率达60％以上。但是近年来，随着养猪业集约化、规模化的发展，疾病传染问题成为制约养猪业发展的重要难题。在养殖业中，重要的传染性疾病(病毒、细菌和寄生虫病)多达30多种，现在不仅老病未消灭，而且新病不断涌现，动物传染病的平均发病率和死亡率分别高达15-20％和8-10％左右，每年给我国的养殖业造成至少400多亿元的直接经济损失。因此有效控制疾病不仅是保障养殖业可持续发展、保护人民食品卫生和生命健康的重大科技问题，而且是我国畜牧业面对世界范围的大市场，突破“绿色壁垒”，参与有序的市场竞争，树立新形象的必然选择。

[0003] 养殖业目前是我国农业和农村经济发展的主要支柱，2008年我国生猪存栏量达到9亿多头，猪肉产量达4620多万吨；四川的养殖业产值占农业总值的54％左右，对农民收入和农村发展影响重大。作为养殖业最重要基础之一的饲料工业也获得了巨大的进步，到2008年我国配合饲料产量达到1.059亿吨，浓缩料2 531万吨，添加剂预混合饲料546万吨，成为世界第二大生产国。四川饲料工业发展迅速，2008年全省工业饲料总产量达到652.19万吨，其中猪饲料达到307.97万吨，占47.2％；禽料266.96万吨，占41％；水产饲料60.46万吨，占9.3％；

[0004] 现在限制我国养殖业进一步发展和提高经济效益的主要问题是动物疾病的控制、动物产品质量提高和优质廉价饲料的开发生产。我国出口动物产品因检疫和药残质量较低，出口所占比例很低，如猪肉为23万多吨，仅占国际贸易量的4％左右。尤其是四川动物饲料的豆粕等蛋白质原料的90％和玉米等能量饲料原料的70％均依赖外部供给，这就严重制约了我省的畜牧业生产发展和经济效益的提高。因此，如何利用高新生物技术开发高效特色生物饲料，充分利用本地饲料资源，减少饲料中抗生类素添加剂的使用，克服动物产品的药残危害，保障绿色有机动物食品的生产，保护人民群众生命健康安全，已成为当代亟需解决的重大科技和社会经济难题。

[0005] 动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区06年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也将严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂。

[0006] 近年来出现的抗菌肽(antibacterial peptide)就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，除有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用外，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素(Peptide antibiotics)，它不同于传统抗生素阻断大分子生物合成的作用机制，因而细菌不易对它产生耐药性。

[0007] 抗菌肽具有分子量小、理化性质稳定、水溶性好、热稳定、广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，以及活性浓度低，无致畸变作用，无蓄积毒性、不易引起病原产生耐药性等优点，是理想的抗生素替代品。研究表明，抗菌肽是免疫应答中极古老的成分，其在脊椎动物、昆虫和植物中的诱导途径相当保守，在炎症发生后能发挥多种潜在功能。近二十年来，随着对抗菌肽研究的深入，逐渐发现其在动物先天抗菌防御体系中具有重要作用。这些抗菌肽能作用于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫、癌细胞甚至被膜病毒(如HIV和HSV)，绝大多数对哺乳动物正常细胞无害，而且其杀菌机理与传统抗生素完全不同，从而显示了它在医学、兽医学等有关学科中独特的研究潜力。

[0008] 作为极具有替代传统抗菌素潜力的抗菌肽，其潜在药用价值倍受人们关注。然而天然抗菌肽来源十分困难，不能满足研究和临床应用的需要，因此通过基因工程技术生产抗菌肽成为人们关注的新焦点。近年来，抗菌肽转基因动物研究方面主要集中在提高动物的抗病能力和传染病防治并有了相当可人的效果。1998年Reed等将Shiva-1基因与小鼠IL-2基因的5′端从-593到+110区域以及SV40的多腺苷酸剪切信号一起感染导入小鼠中，结果表明转基因鼠对布鲁氏杆菌病抵抗力明显增加。1997年Durvasula等已成功得到一个转基因共生菌来对虫媒病进行治疗，天蚕素A转入昆虫Rhodnius prolixus中，昆虫携带了此转基因共生菌后，感染锥虫数量明显减少。Possani等研究转抗菌肽基因蚊子用以控制人疟疾的传播，在CecropinB基因的基础上构建融合基因Gst-shiva-3作报道基因可以产生一种转基因蚊子。1996年Yarus把牛TAP基因导入小鼠乳腺，在小鼠乳中检测到了牛TAP的存在，表明乳腺能转录出相应的TAP抗菌肽类，且TAP重组体数量多，比合成抗菌肽费用低得多。因此，借鉴已成功的方法，把抗菌肽基因转入畜禽特定细胞使其表达，产生抗病原菌感染的转基因动物新品种，将成为发展畜牧生产的新途径，其现实意义和经济价值不可估量。

[0009] 总之，近年来，在传染性疾病危害加重、新病种类增多、发病非典型化和病原出现新的变化、多病原感染(混合感染)病例增多、环境性病原微生物致病性日渐严重以及人畜(禽)交叉传染频率增高的情况下(崔保安，1999)，抗菌肽的研究具有潜在的极其广阔的应用前景，其应用可以经济高效地防治对畜牧业危害甚烈的传染性疾病(包括寄生虫病)，必将有力地推动畜牧业健康发展和经济效益提高，保证人民的食品卫生和健康安全。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种蛋白。

[0011] 本发明提供的蛋白是MAPWA融合抗菌肽，具体可以是如下1)或2)或3)的蛋白质：

[0012] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0013] 2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；

[0014] 3)将组成1)或2)蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或2)衍生的蛋白质。

[0015] 运用DNATools5.1对序列2进行分析，分子量为7.9KDa，等电点为10.72，疏水氨基酸22.7％，亲水氨基酸48.0％，碱性氨基酸28.0％，酸性氨基酸1.3％。

[0016] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。

[0017] 上述蛋白的编码基因具体可以为如下1)-4)中任一所述的基因：

[0018] 1)其编码序列是序列表中序列1的第21-248位；

[0019] 2)其核苷酸序列是序列表中序列1；

[0020] 3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码上述蛋白的基因；

[0021] 4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的基因。

[0022] 含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。

[0023] 上述重组载体为重组原核表达载体或重组真核表达载体；所述重组原核表达载体是在质粒pGEX-4T-1的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表达载体；所述重组真核表达载体是在质粒pYCa的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表达载体。

[0024] 上述重组菌是含有上述的重组原核表达载体的重组大肠杆菌或含有上述的重组真核表达载体的重组酵母菌；所述重组大肠杆菌优选为重组大肠杆菌BL21；所述重组酵母菌优选为重组yCY3酵母。

[0025] 本发明的另一目的在于提供一种制备上述蛋白的方法。

[0026] 本发明提供的方法是将上述的重组菌发酵，得到所述蛋白。

[0027] 在一个实施例中，上述重组菌是所述重组大肠杆菌BL21，所述发酵的条件是：18-37℃、0.1和1.0mmol/L的IPTG诱导2-4h，优选的发酵条件是：37℃，0.1mmol/L的IPTG诱导4h。

[0028] 在另一个实施例中，上述重组菌是所述重组yCY3酵母，所述发酵的条件是：28-30℃，280r/m振荡诱导培养40h。

[0029] 上述的蛋白在制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和/或肺炎链球菌活性的试剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。

[0030] 上述的蛋白在制备抑制圆环病毒2和/或呼吸繁殖综合症病毒的复制的试剂或者在制备动物饲料添加剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。

[0031] 本发明的内容具体包括新型MAPWA融合基因的构建、原核和酵母表达质粒的构建、表达产物活性研究、体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究。

[0032] 目前我们已经利用现代基因工程技术获得抗菌效应很强的抗菌肽，完成了在酵母细胞内高表达研究，发现它们在沸水30分钟仍不变性失活，能耐受饲料制粒时的高温作用；并独创重组酵母发酵生产工艺，可望进一步深入研究开发为高效安全的多功能生物饲料，代替或减少抗生素添加剂，增强动物的抗病力，克服药残危害；同时提高饲料的营养价值，为我国畜牧业的可持续良性发展提供可靠的新技术支撑，增加农民收入，推动我国农村经济和社会发展。附图说明

[0033] 图1重叠区扩增基因拼接法获得MAPWA融合基因示意图。

[0034] 图2四轮PCR结果的电泳图谱(2.0％琼脂糖凝胶)；

[0035] Lane1 ：50bp Ladder Marker；Lane2 ：PF1+PF2+PF3+PF4+PF5；Lane3：PF1+PF2+PF3+PF4；Lane4：PF1+PF2+PF3；Lane4：PF1+PF2。

[0036] 图3pG-MAPWA双酶切和质粒PCR电泳图谱(2.0％琼脂糖凝胶)；

[0037] LaneM：DL2000Marker；Lane1：pGEX-4T-1 质粒；Lane2：pG-MAPWA/BamHI+EcoRI；Lane3：PCR扩增MAPWA片段(引物PF1+PF5)。

[0038] 图4pG-MAPWA重组质粒原核表达产物SDS-PAGE(12％)；

[0039] LaneM：蛋白质分子量marker，

[0040] Lane1：经IPTG诱导的pGEX-4T-1表达产物，

[0041] Lane2：未经IPTG诱导的pGEX-4T-1表达产物，

[0042] Lane3：未经IPTG诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0043] Lane4：经IPTG诱导的pG-MAPWA表达产物。

[0044] 图5不同IPTG浓度和温度下重组质粒原核表达产物SDS-PAGE(12％)；

[0045] Lane1：1mM IPTG、18℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0046] Lane2：0.1mM IPTG、18℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0047] Lane3：0mM IPTG、18℃的pG-MAPWA表达产物，

[0048] Lane4：1mM IPTG、37℃诱导的pGEX-4T-1表达产物，

[0049] Lane5：1mM IPTG、28℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0050] Lane6：0.1mM IPTG、28℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0051] Lane7：1mM IPTG、37℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0052] Lane8：0.1mM IPTG、37℃诱导的pG-MAPWA表达产物，

[0053] LaneM：蛋白质分子量marker。

[0054] 图6不同时间诱导下pG-MAPWA重组质粒原核表达产物SDS-PAGE(12％)；

[0055] Lane1：0.1mM IPTG诱导4h的pG-MAPWA表达产物，

[0056] Lane2：0.1mM IPTG诱导3h的pG-MAPWA表达产物，

[0057] Lane3：0.1mM IPTG诱导2h的pG-MAPWA表达产物，

[0058] Lane4：0.1mM IPTG诱导1h的pG-MAPWA表达产物，

[0059] LaneM：蛋白质分子量marker。

[0060] 图7pG-MAPWA融合蛋白的SDS-PAGE(12％)电泳分析；

[0061] LaneM：蛋白质分子量marker，

[0062] Lane1：pGEX-MAPWA表达产物，

[0063] Lane2：pGEX-MAPWA表达产物细胞破碎的上清液，

[0064] Lane3：pGEX-MAPWA表达产物细胞破碎的沉淀。

[0065] 图8纯化效果的SDS-PAGE(12％)电泳分析；

[0066] Lane1：pGEX-MAPWA表达产物，

[0067] Lane2：pGEX-MAPWA表达产物细胞破碎的上清液，

[0068] Lane3：上清液中未结合的流出液，

[0069] Lane4：Glutathione Sepharose 4B洗涤液的GST-MAPWA融合蛋白，

[0070] Lane5：Glutathione Sepharose 4B洗脱的GST蛋白。

[0071] 图9.MAPWA基因PCR扩增片段电泳图；

[0072] Lane 1-2：MAPWA基因PCR扩增片段，

[0073] M：DL2000Marker。

[0074] 图10重组pYCa-MAPWA质粒PCR产物电泳图，

[0075] M：DNA marker，

[0076] 1：pYCa-MAPWA的PCR产物。

[0077] 图11重组pYCa-MAPWA质粒酶切电泳图；

[0078] 1-2：XhoI/XbaI双酶切，

[0079] M1：DL2000Marker，

[0080] M2：DL9000Marker。

[0081] 图12重组酵母菌表达上清液Tricine-SDS-PAGE电泳图；

[0082] 1-2：pYC-MAPWA表达上清液；M：低分子量蛋白Marker。

[0083] 图13纯化融合抗菌肽MAPWA的Western-blot结果。

[0084] 图14PH对融合杭菌肽抑菌活性的影响。

[0085] 图15融合抗菌肽100℃处理后的对金黄葡萄球菌抑菌活性变化。

[0086] 图16MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)对猪免疫细胞的刺激效应。

[0087] 图17MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)与PRRSV对猪免疫细胞的共刺激作用。

[0088] 图18MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)处理免疫细胞中PRRSV基因表达比值随培养时间的变化结果。

[0089] 图19MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)处理对PRRSV在Marc-145细胞中复制的影响。

[0090] 图20MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)处理对仔猪PCV-2含量影响。

[0091] 图21MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)处理对4月龄猪PCV-2含量影响。

[0092] 图22MAPWA基因重组酵母菌融合抗菌肽(P1)处理对4月龄猪PRRSV含量影响。

具体实施方式

[0093] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

[0094] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

[0095] 实施例1、新型融合抗菌肽基因MAPWA的构建和原核表达质粒的构建

[0096] 以重叠区基因拼接技术(Gene Splicing by Overlap Extension，GSOE)改造Magainin(MA)cDNA和美洲商陆素抗菌肽(PWA)cDNA，构建MAPWA融合基因，并构建了pG-MAPWA原核表达载体，经质粒PCR以及BamHI/EcoRI双酶切鉴定，测序结果证实MA/PWA融合基因已成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1。具体步骤如下：

[0097] 1、叠拼引物的设计与合成

[0098] 根据分别编码Magainin和PWA的成熟肽的cDNA碱基序列，设计并人工合成了五条引物，PF1含有BamHI和XhoI酶切位点；PF2的3’端含有一段与PF1的3’端互补的序列；PF3的3’端含与P1和P2扩增产物的正义链3’端互补的序列，PF1和PF2扩增产物与PF3反应后所得产物的正义链3’端与PF4的3’端互补，PF5含有终止密码子，并引入EcoRI和XbaI酶切位点以利于原核表达载体构建。PF1～PF2主要扩增Magainin基因；PF3～PF5主要扩增PWA基因，并在两段基因中插入Gly-Ser-Gly-Gly Ser-Gly-Gly-Ser的柔性连接肽序列，以利于Magainin和PWA各自的空间折叠。由于引物大小在50～70bp之间，为了避免发夹结构和引物二聚体的形成，引物设计时对部分密码子做了同义突变。

[0099] PF-1：69bp

[0100] 5’CT GGATCC CTCGAG AAA AGA ATG GGC AAG TTC CTG CAC TCT GCC AAGAAG TTC GGC AAG GCT TTC GTG GGC GAA A 3’

[0101] PF-2：57bp

[0102] 5’CCTCGAGCCT CCCGATCCAC CGCTGCCGTT AGACTTCTTG ATTTCGCCCACGAAAGC 3’[0103] PF-3：70bp

[0104] 5’GCATGTTGGA TGTGAGCTGC CCTTCATACA TCTTCCCCCA TTCTTTATGCATCCCGCCGA GCCTCCCGAT 3’

[0105] PF-4：60bp

[0106] 5’GAAGCCTCGG CATTGGCCTC CATGAAACCC CTCTGTTTGG CAAACAGCGGCACAGTTGCT CTTTCGGACG 3’

[0107] PF-5：60bp

[0108] 5’GTAGAATTCTCTAGA TTAATGGTGAT GGTGATGATG GTTGCGCTTGCAAGCACTCA TACCCTGGC 3’

[0109] 2、重叠区扩增基因拼接

[0110] 包括四轮连续的PCR，均采用热启动法，反应体系如下：

[0111] 第一轮PCR(50μl)

[0112] 在薄壁PCR管中加入38.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，2.5μl PF1，2.5μl PF22+
引物(各为10μmol/L)，10×PCR缓冲液(Mg 预混)5μl，Pfu polymerase 0.5U。

[0113] 第二轮PCR(50μl)

[0114] 在薄壁PCR管中加入12.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，1μl PF3引物(10pmol/2+
μl)，第一轮PCR产物20μl作为模板，10×PCR缓冲液(Mg 预混)5μl，Pfu polymerase
0.5U。

[0115] 第三轮PCR(50μl)

[0116] ①线性扩增：在薄壁PCR管中加入12.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，1μl PF4引2+
物(10pmol/μl)，第二轮PCR产物20μl，10×PCR缓冲液(Mg 预混)5μl，Pfu polymerase
0.5U。

[0117] ②对数扩增：在薄壁PCR管中加入45.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，1μl PF1，2+
1μl PF4引物(各为10pmol/μl)，①步中PCR产物1μl作为模板，10×PCR缓冲液(Mg预混)5μl，Pfu polymerase 0.5U。

[0118] 第四轮PCR(50μl)

[0119] ①线性扩增：在薄壁PCR管中加入12.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，1μl PF5引2+
物(10pmol/μl)，第三轮PCR产物20μl，10×PCR缓冲液(Mg 预混)5μl，Pfu polymerase
0.5U。

[0120] ②对数扩增：在薄壁PCR管中加入45.5μl的ddH2O，1μl 10mM dNTP，1μl PF1，2+
1μl PF5引物(各为10pmol/μl)，①步中PCR产物1μl作为模板，10×PCR缓冲液(Mg预混)5μl，Pfu polymerase 0.5U。

[0121] PCR反应程序如下：

[0122]循循环数反应参数
第一轮PCR 1 94℃(3min)
30 94℃(30s)，58℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)
第二轮PCR 1 94℃(3min)
Touchdown 10 94℃(30s)，54～44℃(30s)，72℃(20s)
20 94℃(30s)，44℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)
第三轮PCR
①
1 94℃(3min)
Touchdown 10 94℃(30s)，65～55℃(30s)，72℃(20s)
20 94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)
②
1 94℃(3min)
30 94℃(30s)，68℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)
第四轮PCR
①
1 94℃(3min)
Touchdown 10 94℃(30s)，60～50℃(30s)，72℃(20s)
20 94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)
②
1 94℃(3min)
30 94℃(30s)，68℃(30s)，72℃(20s)
1 72℃(1min)

[0123]

[0124] 通过4轮PCR实现了对两段基因片段以及连接肽序列的拼接(图1)，第一轮PCR得到100bp片段，第二轮PCR得到155bp片段，第三轮PCR得到207bp片段，第四轮PCR得到262bp片段，以50bp Ladder做对照，大小均与预期相符(图2)。

[0125] DNA测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1(263个碱基)所示，命名为MAPWA融合基因，其开放阅读框(ORF)为序列1的第21-248位，可编码序列表中序列2所示的蛋白(75个氨基酸)。运用DNATools5.1对氨基酸和蛋白亲水性进行分析，分子量为7.9KDa，等电点为10.72，疏水氨基酸22.7％，亲水氨基酸48.0％，碱性氨基酸28.0％，酸性氨基酸1.3％。

[0126] 3、原核表达质粒的构建

[0127] 纯化PCR产物进行20μl体系的BamHI和EcoRI双酶切，EP管中加入15μl纯化片段，2μl10×Tango缓冲液，0.5μl BamHI，0.5μl EcoRI，补H2O至20μl。37℃水浴2小时后，用DNA提取试剂盒直接回收酶切片段。

[0128] 提取pGEX-4T-1质粒(购自GE Healthcare公司)30μl加入4μl 10×Tango双酶切缓冲液，1μl BamHI，1μl EcoRI，补H2O至40μl。37℃水浴2小时后，加入5μl 10×碱性磷酸酶缓冲液，1μl碱性磷酸酶，补水至50μl，然后37℃处理1小时。用DNA提取试剂盒直接从反应液中提取纯化载体。

[0129] 按照片段与载体分子量浓度5∶1进行连接反应。取回收纯化的pGEX-4T-1载体2.5μl，加入回收的酶切过的PCR产物片段5μl，1μl T4DNA连接酶，1μl 10×连接缓冲液，0.5μl ddH2O，16℃水浴过夜连接。

[0130] 连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提转化子质粒，插入正确的质粒可以用BamHI和EcoRI酶切出约260bp的片段。进一步用PCR鉴定，得到含MAPWA片段的重组质粒，命名为pG-MAPWA(图3)。

[0131] 实施例2、MAPWA融合基因的原核表达与表达活性研究

[0132] MAPWA融合基因表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导融合蛋白表达，经SDS-PAGE分析带有GST标签的表达蛋白，其分子量符合预期的33.9KDa。融合蛋白的表达产物在细胞破碎的上清中以可溶形式存在，将大量表达的蛋白用亲和层析法纯化；融合蛋白在体外抗菌实验中明显抑制大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎球菌和绿脓杆菌的生长。具体步骤如下：

[0133] 一、融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE电泳分析

[0134] 1、实验步骤：挑取含pG-MAPWA和pGEX-4T-1转化子的单菌落接种于2ml含r100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜活化菌株，次日1/100转接于＝Amp的LB液体培养基，继续培养约3小时至OD600＝0.7，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导培养，4小时取样，12,000rpm离心30s收集菌体，弃尽上清，加入适量ddH2O悬浮菌体，再加入等量2×上样缓冲液(2.5ml 4×Tris-HCl/SDS pH6.8，2ml甘油，1g SDS，0.5ml β-巯基乙醇，0.25mg溴酚蓝，加水至10ml)，煮沸5分钟后冷却待用。

[0135] 参照不连续电泳方法制备12％丙烯酰胺凝胶溶液(30％丙烯酰胺/0.8％亚甲双丙烯酰胺溶液6ml，4×Tris-HCl/SDS溶液(pH8.8)3.75ml，ddH2O 5.25ml，10％过硫酸铵20μl，TEMED5μl)，聚合后，灌制3％浓缩胶(30％丙烯酰胺/0.8％亚甲双丙烯酰胺溶液
0.65ml，4×Tris-HCl/SDS溶液(pH6.8)4.3ml，10％过硫酸铵10μl，TEMED 2μl)，待凝胶聚合后，在电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，
0.1％SDS，pH8.3)。

[0136] 取制备样品，用微量进样器上样于凝胶梳孔中，起始电压120V，溴酚蓝带进入分离胶后，电压调为160V，电泳完毕后，以考马斯亮蓝R250染色液(50％甲醇，0.05％考马斯亮蓝R250，10％冰醋酸，40％ddH2O)染色4小时，以脱色液(5％甲醇，7％冰醋酸，88％ddH2O)脱色至背景完全脱去，凝胶置7％冰醋酸中保存。

[0137] 2、结果

[0138] 以经四小时诱导的pGEX-4T-1，pG-MAPWA和未被诱导的pGEX-4T-1，pG-MAPWA的细菌总蛋白进行电泳分析。结果如图4所示，经IPTG诱导的pGEX4T-1在E.coli BL21中的表达样品在26KDa处出现GST蛋白带，而未经IPTG诱导的pGEX-4T-1没有26KDa带；经IPTG诱导的pG-MAPWA表达样品在34KDa附近明显出现新的蛋白带，为26KDa的GST带和7.9KDa的MAPWA蛋白共同构成的融合蛋白。

[0139] 二、融合蛋白表达条件的探索

[0140] 1、不同IPTG浓度和温度对融合蛋白表达的影响

[0141] 挑取单个克隆的重组大肠杆菌接种于2ml含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养，培养12～15小时后，作为种子液(以下各步骤的种子液制备同此)。各取0.2ml种子液接种于2.0ml的LB培养基中，37℃培养3小时后，在各样品中分别按照每ml培养基加入100mmol/L的IPTG 10μl和1μl，使IPTG终浓度为1.0mmol/L和0.1mmol/L。在37℃、28℃和18℃温度诱导条件下培养4小时后，取出培养物，12,000rpm离心1分钟，去除上清后将细菌悬浮于适量清水，混匀后加入等量2×上样缓冲液。

[0142] 结果表明：在37℃下0.1mmol/L的IPTG能产生最多的融合蛋白，在温度较低的情况下较高浓度的IPTG也可以诱导表达较多的融合蛋白(图5)

[0143] 2、不同发酵时间对融合蛋白表达的影响

[0144] 各取0.2ml种子液接种于2.0ml的LB培养基中，37℃培养3小时后，在各样品中按照每ml培养基加入100mmol/L IPTG 1μl，使IPTG终浓度至0.1mmol/L。在37℃条件下诱导培养，分别在诱导1、2、3、4h取出培养物，12,000rpm离心1分钟，去除上清后将细菌悬浮于适量清水，混匀后加入等量2×上样缓冲液。

[0145] 结果图6表明：在37℃，0.1mmol/L IPTG诱导条件下，不同诱导时间的菌体裂解物均可在分子量34KD处看到清晰的蛋白条带，4小时诱导时间的蛋白条带最浓，说明4小时的诱导时间能得到最多的表达蛋白。

[0146] 综上所述，重组大肠杆菌最佳的发酵条件是：37℃，0.1mmol/L IPTG诱导4小时。

[0147] 三、用步骤二得出的最佳发酵条件进行蛋白表达以及蛋白的纯化

[0148] 于500ml 2×YT(含150μg/ml Amp)培养物中(OD600＝0.6)加入IPTG使其终浓度为0.1mmol/L，在37℃下诱导培养4h，5,000rpm 4℃离心10min收集菌体。将洗涤后菌体重悬于50ml冰冷的PBS裂解缓冲液(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)中，反复冻融数次，然后加入溶菌酶至1mg/ml，室温孵育15min。超声波破碎前加入适量TritonX-100和DTT，然后于冰桶中超声破碎至云雾状细菌悬液变澄清；以10,000×g4℃离心10min，取少量上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳并以考马斯亮蓝染色确定蛋白为可溶成分或不可溶的包涵体。结果发现该融合蛋白主要集中于上清中，说明该融合蛋白以可溶形式存在(图7)。

[0149] 重悬Glutathione Sepharose 4B基质，取适量于离心管中，500×g离心5min弃上清；用预冷的PBS清洗基质后弃上清；然后加PBS配置成50％悬液。

[0150] 加入待纯化样品，充分混匀后，室温温育30min，500×g离心5min弃上清，取40μl样SDS-PAGE检测吸附效果；用10倍体积的PBS清洗3次，加入洗脱缓冲液(10mM还原型谷胱苷肽，50mM Tris-HCl pH 8.0)，混匀后室温温育10min后，500×g离心5min收集上清，取40μl样SDS-PAGE检测洗脱效果。纯化效果如图8。

[0151] 四、表达蛋白的体外抑菌活性检测

[0152] 96孔板1～8列分别加入20μl稀释至2×105～7×105cfu/ml的4种菌液(大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌)；9～10列不加菌液而加200μl培养基。
然后从A～D行逐一加入相应的GST蛋白，溶菌酶，Amp，融合表达蛋白和ddH2O。37℃培养
16小时，用酶标仪在595nm对培养板进行扫描。

[0153] 以纯化回收的融合蛋白为样品，以等量的GST蛋白以及Amp、溶菌酶和无菌水为对照，进行体外抑菌活性检测，结果如表1：

[0154] 表1回收重组融合蛋白体外抑菌实验检测结果

[0155]

[0156]

[0157] 结果表明，pG-MAPWA原核表达产物对大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌均有明显的抑制作用(P＜0.05)。

[0158] 实施例3、融合抗菌肽MAPWA的酵母表达载体构建及其表达活性研究

[0159] 将融合抗菌肽MAPWA基因克隆入面包酵母分泌型表达载体pYCa(pYES2/CT插入a-factor分泌信号肽)，转化入yCY3面包酵母，筛选出高效表达菌株；对重组菌株诱导表达融合抗菌肽后，表达上清进行抗菌活性和纯化蛋白电泳分析，发现融合抗菌肽存在于表达上清中，分子量大致为7.9kDa；实现了抗菌肽的分泌表达；所产生的融合抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌均有显著的抑菌活性。具体步骤如下：

[0160] 一、MAPWA融合基因的扩增

[0161] 1、PCR引物设计

[0162] 利用Primers6.O，参照MAPWA融合基因组序列分别设计上下游寡核苷酸引物(分别命名为MF1、MR1)：在引物5’端分别添加XhoI和XbaI酶切位点。

[0163] MF1：5’CTCTCGAGAAAAGAATGGGCAAGTTC-3’

[0164] MR1：5’GCACTCTAGATTAATGGTGATGGTGATGATG-3’

[0165] 2、MAPWA融合基因的扩增

[0166] 取前面所获得的MAPW基因重组质粒pG-MAPWA为模板，作PCR扩增；pCR反应体系50uL(模板：50ng，20umol/L上下游引物各1uL，2xTaq plusMastermix25uL，去离子水补足至50uL)。反应条件如下：94℃热启动5min；94℃变性30s，600C 退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物各取5uL在1.5％琼脂糖凝胶上跑电泳验证，剩余的用胶回收试剂盒纯化。

[0167] 将PCR扩增产物经2％凉脂糖凝胶电泳，结果表明：得到了大致为260bp左右的片段(图9)，与预期融合抗菌肽基因大小相一致。

[0168] 二、pYCa重组表达载体的构建、鉴定以及重组酵母菌构建

[0169] 1、PCR产物经过胶回收纯化与质粒载体pYCa(购自Invitrogen公司)进行XhoI和XbaI双酶切，酶切产物经过纯化后在T4DNA连接酶作用下4℃过夜，连接产物转化TOP10F’感受态细胞；涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。抽提质粒(提取按照华舜质粒提取试剂盒说明书进行)，双酶切，1％琼脂糖凝胶进行电泳验证，然后送阳性克隆菌液于上海Invitrogen公司测序验证。正确的重组表达载体命名为pYCa-MAPWA。

[0170] 2、酵母感受态细胞的制备

[0171] 挑取尿嘧啶营养缺陷型酵母yCY3(购自Invitrogen公司)单菌落接种于1OmLYPD酵母丰富培养基，30℃振荡过夜，1∶100接至100mLYPD中扩大培养至OD6.0。30℃3000rpm离心5min，沉淀先用等体积预冷的灭菌去离子水洗2遍，4℃1500rpm离心5分钟；再用50mL预冷的灭菌ddH2O重悬浮细胞沉淀，4℃1500g离心5分钟；最后用2.0mL预冷的1mol/L山梨醇洗涤，4℃1500g离心5分钟，将细胞沉淀重悬浮于0.5mL预冷的1mol/L山梨醇中，混匀置于冰上，当天使用。

[0172] 3、电转化并筛选重组菌株

[0173] 取50ul上述制备好的酵母感受态细胞，加入10ul重组质粒(溶于10ul无菌去离子水中)，混匀后加入到冰预冷的0.2cm电击杯中，选取电压200V、电容25uF。电击时间为5ms，电击后迅速加入1mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶液混匀。

[0174] 以酵母选择培养基SD-U平板筛选获得阳性重组转化子；培养菌落提取作质粒PCR和XhoI和XbaI双酶切鉴定，凝胶电泳显示在大小处均出现了单一条带，大小符合预期，证明重组pYCa质粒构建成功(图10、11)；测序证实为正确的重组质粒(pYCa-MAPWA)也说明重组酵母菌正确，重组酵母命名为yCY3/MAPWA。

[0175] 4、融合抗菌肽的表达鉴定

[0176] 1)酵母菌株的小量诱导表达

[0177] 从培养好的平板上挑取阳性新鲜单菌落接入含5mLSD-U液体选择培养基(0.67g YNB，0.2g氨酸混合物不含尿嘧啶，加水90mL，121℃灭菌15min，待冷却后加入20％的葡萄糖10mL)中，摇床28-30℃培养过夜作为种子液(OD6001.5)，然后4℃，2000r/min离心5min，沉淀先用50mL灭菌去离子水洗3遍，4℃2000g离心5分钟；部分菌体沉淀再转接至
5mLSG-U液体选择培养基(0.67g YNB、0.2g氨酸混合物不含尿嘧啶，加水90mL，121℃灭菌
15m待冷却后加入作为诱导剂的20％的半乳糖10mL)重新悬浮，使OD600在0.8左右；重新放入摇床进入诱导阶段培养，连续诱导目的蛋白表达40小时(30℃、280r/min)；在相同条件下，以空质粒yCY3酿酒酵母诱导表达的蛋白作为阴性对照。

[0178] 2)重组表达抗菌肽的Tricine-SDS-PAGE分析

[0179] Tricine-SDS-PAGE采用三(羟甲基)氨基甘氨酸(Tricine)代替甘氨酸作为脱尾离子，能够明显提高对小肽的分辨率，减弱带型的弥散程度。所以本试验采取高浓度胶并添加甘油的方法，按照“分离胶一夹层胶一浓缩胶”的模式制作不连续梯度胶分离小分子多肽。

[0180] 将pYCa-MAPWA阳性重组酵母酵母菌(yCY3/MAPWA)进行小量摇瓶诱导表达，分别收集各时间点的诱导物，离心分离上清；煮沸离心后即可进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测。上清液经Ni-NTA agarose琼脂糖柱纯化后，加入上样缓冲液，同样进行电泳分析。已知MAPWA多肽含75个氨基酸，分子量大致是7.9kDa；Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示，重组酵母菌表达的MAPWA多肽与理论计算值相符(图12)。

[0181] 5、表达蛋白的体外抑菌活性检测

[0182] 96孔板分别加入20μl稀释至2×105～3×105cfu/ml的5种菌液(大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌)；然后逐一加入相应的融合抗菌肽、Amp、空载体酵母对照上清液和未诱导的重组酵母菌上清液以及ddH2O 20ul后，加LB培养基液至200ul；37℃培养16小时，用酶标仪在595nm对培养板进行扫描，测定培养液OD595，观察其抑菌活性。

[0183] 以大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、沙门氏菌为检测对象，利用液相比色法测定所得重组酵母表达菌产物的抑菌活性。表达上清液产物经煮沸后可检测抑菌活性；空对照及未诱导的酵母菌上清产物未见抑菌活性(详见下表2)；说明金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、大肠杆菌、沙门氏菌对该MAPWA融合抗菌肽敏感。

[0184] 表2pYCa-MAPWA表达上清液的抑菌结果

[0185]

[0186] 上述结果充分证明融合抗菌肽的重组酵母菌分泌表达载体构成功，并且其诱导表达产物可分泌到细胞外；具有显著的抑制革兰氏阳性和阴性细菌的活性。这些为下一步开展规模化生产和制备新型融合抗菌肽制剂奠定了良好的基础。

[0187] 实施例4、重组融合抗菌肽的纯化和体外抗菌活性研究

[0188] 融合抗菌肽具有显著的抗革兰氏阳性和阴性菌的活性，其抗菌活性在PH4-8比较稳定，以后随PH升高而减弱；融合抗菌肽对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和肺炎链球菌均以及耐药沙门氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很强的抑杀活性。扫描和透射电镜、激光共聚焦显微观察证实融合抗菌肽分子能够结合到细菌膜结构以及进入胞内结合染色质分子，破坏膜结构的完整性，降解染色质DNA和RNA分子，胞质呈现明显的空泡化，最终杀灭细菌。具体步骤如下：

[0189] 一、重组yCY3酿酒酵母菌的优化表达

[0190] 1、酵母菌株的小量诱导表达

[0191] 从培养好的平板上挑取新鲜单菌落接入含5mLSD-U液体选择培养基中，摇床培养过夜作为种子液(OD600＞3)，后4℃，2000r/min离心5min，沉淀先用50mL灭菌去离子水洗一遍，4℃2000g离心5分钟；部分菌体沉淀再转接至5mL SG-U液体选择培养基重新悬浮，使OD600在0.7-1.0之间，重新放入摇床进入诱导阶段培养，连续诱导目的蛋白表达40小时(培养条件均为28-30℃，280r/min)在相同条件下，以空载体质粒转化的yCY3酿酒酵母诱导表达的蛋白作为阴性对照。

[0192] 2、重组酵母菌株的大量诱导表达

[0193] 接种重组yCY3酿酒酵母菌株于1L SD-U培养基中培养，28℃-30℃，280r/m振荡培养至OD600＝1.5-2.0，无菌水清洗菌体三次(4℃，3000r/m离心5min)，把适量菌体接于3L SG-U培养基中，起始OD600＝0.5，28℃-30℃，280r/m振荡培养至OD600＝6.0-6.5，3000r/m离心收集菌体。

[0194] 3、重组融合抗菌肽的纯化

[0195] 酵母诱导菌培养液4℃5000r/min离心10min，离心收集酵母细胞培养上清液(即该上清液为实施例5中的P1上清，将离心后的沉淀重悬于PBS裂解缓冲液(140mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.3)，得到实施例5所述的P1沉淀)，空质粒yCY3表达做阴性对照。

[0196] 用Ni-NTA agarose琼脂糖(购自Qiagen公司)装1cm直径玻璃柱)，用100mM NiSO4清洗充电；再以缓冲液I(20mMNa2HPO4(含0.1％(v/v)Triton X-100，5mM glucose，1mMimidazole)平衡树脂柱。上离心样品液后，以缓冲液I充分冲洗，换用含20mM imidazole的缓冲液I充分洗涤后，再用含50mM imidazole的缓冲液I洗涤；最后用缓冲液II(20mMNa2HPO4，5mM glucose，0.5M(NH4)2SO4，0.1％(v/v)Triton X-100)洗脱吸附的融合抗菌肽分子。

[0197] 重组酵母菌发酵上清液经过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化后所获得的蛋白质进行Western-Blot分析，发现结果如图13所示：MAPWA的条带出现在分子量大致为8kDa的位置；说明重组酵母菌发酵液已成功表达出带有His标签的MAPWA融合抗菌肽，其分子量同预期相近。经检测，该发酵上清液中的融合蛋白浓度达31.56ug/ml。

[0198] 二、重组融合抗菌肽分子最佳活性的PH值测定

[0199] 用H3PO4或KOH调解磷酸盐缓冲液的pH值，将离心上清培养液的pH值分别调解为pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11后收集表达上清，以金黄色葡萄球菌为指示菌，做抑菌实验，第二天测量抑菌圈大小，绘制变化曲线，测定各自的抗菌活性。

[0200] 对金黄葡萄球菌抑菌实验结果显示，抗菌肽在pH为2-8时抑菌圈变化不明显；pH9-11时抑菌活性明显下降。说明pH过高抗菌活性菌明显下降(图14)。

[0201] 三、重组抗菌肽表达产物的生物活性研究

[0202] 1、抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

[0203] 最小抑制浓度(MIC)的测定：微量稀释法测定融合抗菌肽对大肠杆菌、鼠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)的测定。具体操作方7
法参照文献进行：把处于对数生长期OD600约0.5-0.7(细菌计数约1x10CFU/ml)的指示菌用LB培养液稀释到OD600为0.05，分别接种到96孔细胞培养板上，每孔接种100ul。将融合抗菌肽用pH6.0的0.1mol/LPBS分别倍比稀释成0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml至
128μg/ml；各取100ul分别加入培养孔中，混匀，每组重复3个孔，设只加LB培养液的孔为阴性对照，接种细菌而不加抗菌肽的LB培养液为阳性对照。置37℃培养箱孵育16h后取出，用紫外分光光度计测量培养液的OD600值，结果判断以无OD值变化的孔中抗菌肽的浓度(终浓度)即为最小抑菌浓度。再将MIC附近各管培养液点种到LB固体培养基上，37℃培养12h，无细菌生长的药物最小稀释浓度即为最小杀菌浓度(MBC)值。

[0204] 通过微量稀释法获得的抗菌肽对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的MIC和MBC见表3。

[0205] 表3融合抗菌肽的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

[0206]

[0207] 融合抗菌肽的抗菌谱检测结果如表4所示。

[0208] 表4真核表达融合抗菌肽的抗菌谱结果

[0209]菌株名 MAPWA
E.coli DH5a ++++
E.coli K99 +++
鼠伤寒沙门氏菌 ++++
耐药沙门氏菌 +++
金黄葡萄球菌(ATCC25923) +++
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) +++
猪链球菌(CVCC606) ++
肺炎链球菌 +++

[0210] 抑菌圈大小表示抑菌活性强弱，++：1.0-1.5cm；+++：1.6-2.0cm；++++：2.1-3.0cm[0211] 2、重组融合抗菌肽的热稳定性

[0212] 将融合抗菌肽液沸水浴5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、1h、2h再按上述方法进行抑菌试验，检测其抗菌活性的变化，以空载体转化酵母的表达上清和未煮沸的融合抗菌肽对照。

[0213] 从表5结果发现：煮沸10-40分钟，融合抗菌肽的抗金黄葡萄球菌活性无明显变化。煮沸至一个小时内，抗菌肽抑菌活性基本不变；煮沸一个小时以后，抑菌活性才明显下降；表明抗菌肽具有比较强的热稳定性(图15)。

[0214] 表5MAPWA融合抗菌肽分子抗菌活性热稳定性结果

[0215]

[0216] 实施例5、融合抗菌肽体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究

[0217] 用MAPWA与猪免疫细胞在体外培养，MTT法观察对免疫细胞的刺激增殖活性；同时加入PRRSV共培养，以定量实时RT-PCR技术检测免疫细胞和Marc-145细胞中及培养液的PRRSV病毒含量。结果发现：MAPWA融合抗菌肽具有显著的免疫激活特性，同时能够显著减少PRRSV在免疫细胞和Marc-145细胞的复制量。具体步骤如下：

[0218] 一、淋巴细胞增殖活性实验-MTT法：

[0219] 1、免疫细胞刺激增殖效应：

[0220] 选取健康的长白猪，前腔静脉采抗凝血15ml；用猪淋巴细胞分离液分离单个核细胞，台盼蓝检查细胞活率95％以上；D-Hank·s液清洗2次，用1640+10％犊牛血清培养基6
调节细胞悬液浓度1×10/ml，按照Costar细胞培养板每孔加入100ul免疫细胞悬浮液
6
(1×10/ml的细胞悬液)。按排版次序分别添加MAPWA融合抗菌肽发酵上清液(P1上清)和重组酵母菌裂解液(P1沉淀)各20ul培养液补充到200ul。置37℃，5％CO2孵育24、
48和72、96小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态。96孔细胞培养板分别测20小时，44小时，68、92小时每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h后；加入10％SDS 20ul，溶解结晶，用枪打匀。同时设置调零孔(培养基、MTT)，对照孔，每组设定3复孔。
在Bio-Rad3550酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。

[0221] 结果如图16所示，与对照比较，P1酵母发酵上清液及其细胞裂解分子(P1沉淀)均对猪淋巴细胞有显著的免疫刺激活性(P＜0.05)，能促进猪免疫细胞的分裂增殖和生长，达到提高其免疫机能的作用。

[0222] 2、融合抗菌肽分子和PRRSV共刺激免疫细胞的效应

[0223] 在上述步骤加入P1上清和P1沉淀后接着还加入5ul的PRRSV液(中国兽药监察9
所提供购买，10PFU/ml)，其余步骤相同。

[0224] 结果如图17所示：P1与PRRSV共同作用于猪免疫细胞时，与对照细胞相比较，P1仍然能呈现较强的免疫刺激作用，其增殖活性仍显著高于对照感染细胞(P＜0.05)。提示P1可减弱PRRSV对免疫细胞增殖抑制的效应。

[0225] 二、实时定量RT-PCR检测PRRSV在免疫细胞及Marc-145细胞复制的变化

[0226] 1、PRRSV在免疫细胞中复制量

[0227] 步骤一中PRRSV与猪免疫细胞共培养24、48、72和96小时后，qRT-PCR的分析培养细胞中复制的病毒含量，结果如表6和图18所示：

[0228] 表6荧光定量PCR检测培养免疫细胞PRRSV病毒的水平

[0229]

[0230] 从表6中可见：免疫细胞中的PRRSV含量24-48小时以对照细胞最多(P＜0.01)，其次为P1组细胞(P＜0.05)；72-96小时，对照细胞内的PRRSV含量远高于P1处理细胞(P＜0.01)；说明在后期处理组细胞中的病毒含量显著低于对照细胞，这可能与其免疫效应增强相关。

[0231] 2、Marc-145细胞中PRRSV含量的变化

[0232] 将上述猪免疫细胞替换成106/ml浓度的Marc-145细胞(中国兽药监察所提供)，其余步骤相同。

[0233] 从表7可见：当PRRSV在空Marc-145细胞中的复制量随时间延长而明显增多(P＜0.05)，显著高于用P1(MAPWA)融合抗菌肽处理的细胞；即是PRRSV在Marc-145细胞中的复制显著受到P1分子的抑制，致使其病毒含量远低于对照组空白细胞(P＜0.01)(图19)。

[0234] 表7不同处理对Marc-145细胞中PRRSV复制含量的影响

[0235]

[0236] 总之，上述结果首次发现融合抗菌肽MAPWA具有显著的促进猪免疫细胞分裂增殖的免疫增强效应；而且在能体外显著地抑制PRRSV病毒在免疫细胞和Marc-145细胞中的复制，减少靶细胞中PRRSV的含量。提示：融合抗菌肽MAPWA分子具有免疫强化作用和抑制PRRSV在靶细胞复制的生物效应；这为今后开发新型的PRRSV复制新制剂提供了有益的线索。

[0237] 上述qRT-PCR步骤如下：在NCBI上查找出PRRSV的基因序列，参照文献合成扩增PRRSV的引物，由TAKARA公司设计并合成病毒荧光定量引物。病毒检测引物序列为：PRRSV-F：TTGTGGTGTATCGTGCCG；PRRSV-R：CAAGGAAATGGCTGGTGG。以细胞内保守的看家基因-β-actin基因的表达作为内参标准，表达量设为1。β-Actin F：
5 ′-CTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3 ′；β-Actin R：5 ′-CCTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3 ′。
β-Actin PCR产物248bp。退火温度56℃。

[0238] (1)RNA提取：取新鲜全血100ul，加入1ml RNAiso(Takara公司)，打匀，7500rpm离心去除杂质；

[0239] (2)加入氯仿200ul、异丙醇400ul抽提RNA，充分混匀，静置5min，12000rpm离心15min；

[0240] (3)吸上清400ul转移至RNAfreeEP中，加入400ul异丙醇，混匀，冰浴10min，离心12000rpm 10min，弃上清；

[0241] (4)75％乙醇1ml洗沉淀，12000rpm 5min，弃上清，自然烘干；

[0242] (5)25ul RNAfree ddH2O溶解。

[0243] (6)反转录：采用天根(TianGen)公司cDNA第一链合成试剂盒，20ul体系。37℃1小时。

[0244] (7)定量PCR：反应体系

[0245] 经过优化，最后确定实施试验的反应条件为：95℃，10s；95℃、5s，56℃、20s，72℃、15s，40个循环。

[0246] 实施例6、融合抗菌肽饲料添加剂抑制猪体内PCV和PRRSV繁殖效应观察

[0247] 在仔猪全程40天和后备母猪20天内日粮添加0.2‰和0.3‰的融合防御素饲料添加剂，以同样条件的仔猪和后备母猪不添加融合防御素为对照组，其饲养和管理条件与实验猪完全相同，观察和分析融合防御素饲料添加剂对仔猪和后备母猪生长发育的影响。同时实验前后采取试验仔猪和母猪抗凝血，同前述以实时定量PCR检测PCV和PRRSV含量的变化，观察对仔猪和后备母猪体内病毒复制的效应。具体步骤如下：

[0248] 一、21日龄仔猪实验组

[0249] 90头21日龄仔猪作为实验组，实验全程40天，其日粮饲料中全程添加0.2‰(质量比)融合抗菌肽(实施例4的步骤一中的步骤3得到的融合抗菌肽)作为饲料添加剂，同时以110头同样条件的仔猪不添加融合抗菌肽为对照组，饲养和管理条件与实验组仔猪完全相同，观察、统计、分析该饲料添加剂产品对仔猪生长发育的影响。

[0250] 该抗菌肽饲料添加剂对仔猪生长发育有良好的促进作用(表8)，与对照组比较，保育期结束时头均多增重达到3.66kg/头，差异显著(P＜0.05)；与此同时，实验组仔猪体内的PCV-2含量(检测引物PCV-F 5’-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3’和PCV-R5’-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3’)也较实验前显著减少(P＜0.05)；表明P1融合抗菌肽作为饲料添加剂不仅具有显著的促进仔猪生长发育的良好效应，也能明显减少或抑制体内PCV-2的复制(表9和图20)。

[0251] 表8融合抗菌肽添加饲料饲喂仔猪40天生长性能数据对比

[0252]

[0253] 表9P1融合抗菌肽饲料饲喂仔猪体内PCV-2含量的变化

[0254]

[0255] 二、4月龄猪实验组

[0256] 后备母猪则实验组和对照组各10头，4月龄，品种和体重相同，实验组饲料日粮添加0.3‰(质量比)上述融合抗菌肽作为饲料添加剂，对照组除此外是饲养和管理条件完全相同；同时实验前后采实验猪抗凝血液，同前述以实时定量PCR技术检测PCV和PRRSV含量的变化，观察对实验猪体内病毒繁殖的影响。

[0257] 结果发现：其体内的PCV和PRRSV含量均较对照组母猪显著降低，阳性感染动物数量也明显减少(P＜0.05)(表10、11和图21、22)。而对照组后备母猪的PCV-2与PRRSV阳性感染率不仅升高，体内的病毒含量也显著高于实验组(P＜0.05)。这些结果证明融合抗菌肽饲喂能够显著提高后备母猪的抗病毒防御水平，抑制或减少了动物体内病毒PCV-2和PRRSV的复制与繁殖。

[0258] 表10实验后备母猪体内PCV-2病毒的检测分析结果

[0259]

[0260]

[0261] 表11实验后备母猪体内PRRSV的检测分析结果

[0262]

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