PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用
阅读：763发布：2021-01-31
专利汇可以提供PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用。该融合防御素是如下1)或2)或3)的 蛋白质 ：1)由 序列表 中序列2所示的 氨 基酸序列组成的蛋白质；2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；3)将组成1)或2)蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或2)衍生的蛋白质。本发明首次在猪防御素-2基因的 基础 上，对其蛋白质结构进行改造，以期望构建获得具有比原初的猪防御素抗菌活性更强的蛋白。通过基因工程手段获取新型防御素分子，进一步就其 生物 学与免疫学特性深入研究，为新的多功能防御素活性分子的构建及调节猪的免疫应答和抗细菌和病毒等病原感染进行有益的探索。，下面是PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用专利的具体信息内容。
1. 一种蛋白，是如下1)或幻或幻的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；3)将组成1)或幻蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或幻衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4) 中任一所述的基因：1)其编码序列是序列表中序列1的第23-334位；2)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组原核表达载体或重组真核表达载体；所述重组原核表达载体是在质粒PGEX-4T-1的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体；所述重组真核表达载体是在质粒pYCa的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是含有权利要求4或5所述的重组原核表达载体的重组大肠杆菌或含有权利要求4或5所述的重组真核表达载体的重组酵母菌；所述重组大肠杆菌优选为重组大肠杆菌BL21 ；所述重组酵母菌优选为重组yCY3 酵母。
7. 一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求6所述的重组菌发酵，得到所述蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组菌是所述重组大肠杆菌BL21， 所述发酵的条件是：18-37 °C、1.0mmol/L的IPTG诱导2_6h，优选的发酵条件是：28°C、 1. Ommo 1/L 的 IPTG 诱导 5h ；所述重组菌是所述重组yCY3酵母，所述发酵的条件是：28-30°C，280r/m振荡诱导培养 24-40h。
9.权利要求1所述的蛋白在制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和/或肺炎链球菌活性的试剂中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白在制备抑制圆环病毒2和/或呼吸繁殖综合症病毒的复制的试剂或者在制备动物饲料添加剂中的应用。
PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及PGBD-2融合防御素及其制备方法与其应用。 背景技术
[0002] 养殖业（畜牧业和水产）为大农业的重要组成部份，是我国农业现代化和农村经济发展、社会稳定的重要根基之一，欧美先进国家养殖业均十分发达，都在大农业中占50% 以上的比重。它为人类提供肉、奶、蛋、皮毛等高档食品及重要轻纺原料，畜产品是人们优质蛋白质、矿物质、维生素等营养物质的主要来源，其安全性直接关系到人类的身体健康。由于近年来畜产品引起的中毒、疾病传染等恶性事件不断发生，如欧洲的疯牛病、口蹄疫、亚洲的禽流感等，对畜牧生产和食品加工业造成了重大影响。动物疫病已成为影响畜产品安全、人类身体健康和社会稳定及广大农牧民增收致富的重要因素。在我国养殖业中，重要的动物传染性疾病多达30多种；我国现在不仅旧病未消灭，而且新病不断涌现，动物传染病的平均发病率和死亡率高达15-20%和8-10%左右，每年给我国的养殖业造成至少400多亿元的直接经济损失。现代人类正面临病原微生物感染难于控制的严峻挑战。因此高效防治传染性疾病和促进动物健康生长是保障我国养殖业提高经济效益和可持续发展的核心所在，也是保护人民食品卫生和生命健康迫切需要解决的重大科技难题；更是我国畜牧业面对世界范围的大市场，突破“绿色壁垒”，参与国际市场竞争，树立新形象的必然选择。
[0003] 鉴于现在畜禽传染病防治技术和饲料添加剂生产应用上存在的重大难题，国内尚缺乏成熟实用、高效经济的抗菌肽饲料添加剂，本项目构建克隆具有广谱高效抗菌和免疫调节效应的融合基因PGBD-2、构建分泌表达融合基因的安全酵母重组表达质粒，探索优化建立基因工程重组酵母菌的高效发酵生产工艺技术和活性成分检测技术与产品质量控制标准，建立重组酵母菌表达融合抗菌肽分子的包衣包装制粒技术，研制安全高效的新型生物饲料添加剂，并阐明它们对动物抗病免疫力的影响合体内外抑菌效应其机理，为研制和生产应用具有自主知识产权的新型高效抗菌肽生物饲料添加制剂奠定基础，为经济高效防止传染性疾病开辟新途径，保障我国畜牧业可持续发展和绿色有机安全食品的生产。
[0004] 养殖业目前是我国农业和农村经济发展的主要支柱，2008年我国生猪存栏量达到 9亿多头，猪肉产量达4620多万吨；四川的养殖业产值占农业总值的左右，对农民收入和农村发展影响重大。作为养殖业最重要基础之一的饲料工业也获得了巨大的进步，目前到我国已2008年配合饲料产量达到1. 059亿吨，浓缩料2531万吨，添加剂预混合饲料546 万吨。成为世界第二大生产国，四川饲料工业发展迅速，全省饲料总产量2008年工业饲料总产量达到652. 19万吨，其中猪饲料达到307. 97万吨，占47. 2% ；禽料沈6. 96万吨，占 41% ；水产饲料60. 46万吨，占9. 3% ；
[0005] 现在限制我国养殖业进一步发展和提高经济效益的主要问题是动物疾病的控制、 动物产品质量提高和优质廉价饲料的开发生产。我国出口动物产品因检疫和药残质量较低，出口所占比例很低，如猪肉为23万多吨，仅占国际贸易量的4%左右。尤其是四川动物饲料的豆粕等蛋白质原料的90%和玉米等能量饲料原料的70%均依赖外部供给，这就严重制约了我省的畜牧业生产发展和经济效益的提高。因此，如何利用高新生物技术开发高效特色生物饲料，充分利用本地饲料资源，减少饲料中抗生类素添加剂的使用，克服动物产品的药残危害，保障绿色有机动物食品的生产，保护人民群众生命健康安全，已成为当代亟需解决的重大科技和社会经济难题；
[0006] 目前中国畜禽养殖业随着集约化程度提高，畜禽养殖规模和养殖密度日益扩大， 迫于控制30多种传染性病原感染传播扩散的压力，尤其是禽流感和呼吸繁殖综合症等烈性病相继循环爆发，使抗生素等药物添加剂在饲料的滥用情况非常严重，畜禽疾病和抗生素饲料添加剂的公害问题已经成为制约我国畜禽养殖业发展水平和经济效益提高的瓶颈。 饲料抗生素添加剂的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，并且畜禽机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环， 畜禽各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展。
[0007] 动物饲料添加抗生素，长期或不适当使用不仅将诱导病菌出现抗药性，而且在动物产品出现药物残留，造成严重的食品安全隐患，损害人类健康以及招致治疗抗生素的药物失效。欧盟、美国等发达地区06年开始全面限制抗生素作为饲料添加剂。我国也将严格限制饲料添加抗生素。现代养殖业急需开发取代传统抗生素的无残留、无抗性诱导、安全无污染的新型生物饲料及其添加剂，作为动物自身的天然抗菌分子，抗菌肽不仅具备广谱抗菌和免疫调节效应，同时还具有安全无残留、不产生抗药性、耐热性好等特点。
[0008] 如何在根源上解决畜禽养殖业滥用药物控制疾病的困扰，为人民群众提供绿色有机安全食品，成为当前社会和养殖业最为迫切的需求。建立绿色、安全、高效的新技术产品和健康养殖模式，才能促进养殖业向绿色有机高效益的方向发展。
[0009] 目前我国畜牧业重点关注利用现代生物工程技术和发酵代谢途径工程技术，生产富有营养活性因子、功能多，可促进畜禽生长和抗病的生物饲料。近年来我国生物饲料的研究仍然存在许多缺陷和不足，例如在不同发酵底物和生产工艺、环境控制规程等问题表现为发酵生产工艺粗放，对发酵终端及过程控制不精确，对于产品的质量评判不科学，缺乏严谨细致的技术标准和完善的质量控制体系。要解决这些问题，首先要运用现代高新生物技术研究建立高效可靠的发酵技术体系和目标产物分子的检测、分离纯化和保护；同时，必须加强生物饲料的具体应用技术和生物效应分析、生物安全和环境安全评价。目前国内外有关生物饲料的效应和安全评价体系研究极为缺乏，严重制约着生物饲料的推广应用。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于提供一种蛋白，命名为PGBD-2融合防御素。
[0011] 本发明提供的蛋白是如下1)或2)或3)的蛋白质：
[0013] 2)GST标签与1)蛋白质融合成的蛋白质；
[0014] 3)将组成1)或幻蛋白质的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且具有抗菌活性的由1)或幻衍生的蛋白质。
[0015] 序列2所述的蛋白的分子量为11. 11^〜等电点为9.32 ；疏水氨基酸31. 1%，亲水氨基酸46. 6 %，碱性氨基酸20. 4 %，酸性氨基酸1. 9%。新的融合多肽具有两亲性，既有极性基团，能溶于水；也有疏水基团，能溶于脂类分子；这符合防御素应该具备的两亲性质。
[0016] 上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。
[0017] 上述蛋白的编码基因具体可以为如下1)-4)中任一所述的基因：
[0018] 1)其编码序列是序列表中序列1的第23-334位；
[0019] 2)其核苷酸序列是序列表中序列1 ；
[0020] 3)在严格条件下与1)或2、的基因杂交且编码上述蛋白的基因；
[0021] 4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码上述蛋白的基因。
[0022] 含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。
[0023] 上述重组载体可以为重组原核表达载体或重组真核表达载体；所述重组原核表达载体是在质粒PGEX-4T-1的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体；所述重组真核表达载体是在质粒PYCa的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
[0024] 进一步讲，上述重组菌是含有上述的重组原核表达载体的重组大肠杆菌或含有上述的重组真核表达载体的重组酵母菌；所述重组大肠杆菌优选为重组大肠杆菌BL21 ；所述重组酵母菌优选为重组yCY3酵母。
[0025] 本发明的另一目的在于提供一种制备上述蛋白的方法。
[0026] 本发明提供的方法是将上述的重组菌发酵，得到所述蛋白。
[0027] 在一个实施例中，上述重组菌是所述重组大肠杆菌BL21，所述发酵的条件是： 18-370C U. Ommol/L 的 IPTG 诱导 2_6h，优选的发酵条件是：28°C、1. Ommo 1/L 的 IPTG 诱导 5h ；
[0028] 在另一个实施例中，所述重组菌是所述重组yCY3酵母，所述发酵的条件是： 28-300C，280r/m 振荡诱导培养 M_40h。
[0030] 上述的蛋白在制备抑制圆环病毒2和/或呼吸繁殖综合症病毒的复制的试剂或者在制备动物饲料添加剂中的应用也属于本发明的保护范围之内。
[0031] 本发明内容具体包括新型PGBD-2融合基因的构建、原核和酵母表达质粒的构建、 表达产物活性研究、体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究和动物应用效果试验。
[0032] 本实验首次在猪防御素-2基因的基础上，对其蛋白质结构进行改造，以期望构建获得具有比原初的猪防御素抗菌活性更强的蛋白。通过基因工程手段获取新型防御素分子，进一步就其生物学与免疫学特性深入研究，为新的多功能防御素活性分子的构建及调节猪的免疫应答和抗细菌和病毒等病原感染进行有益的探索。附图说明
[0033] 图1PGBD-2的PCR扩增电泳图谱（2. 0 %琼脂糖凝胶）。
[0034] 图2pGPGBD_2重组子酶切鉴定电泳图谱（1. 0%琼脂糖凝胶）；
[0035] Lane M :DL2000 marker、Lane 1 :pGPGBD_2/BamHI+EcoRI、Lane 2 :pGPGBD_2 重组质粒。[0036] 图3不同诱导温度对GST-PGBD融合蛋白表达量的影响（12 % SDS-PAGE，IPTG ImM)；
[0037] M ：蛋白质分子量marker ；1 °C诱导的pGEX_4T_l表达产物；2 :37°C诱导的 PGEX-4T-1表达产物；3 :37°C诱导的pG-PGBD表达产物；4 诱导的pG-PGBD表达产物。
[0038] 图4pYCa-PGBD_2重组酵母表达质粒的Xhol/Xbal双酶切电泳图；
[0039] Ml :DL2000Marker, M2 :DL 9000Marker,
[0040] 1-2 :pYCa-PGBD-2 的 Xhol/Xbal 双酶切。
[0041] 图5重组酵母菌表达上清液Tricine-SDS-PAGE电泳图；
[0042] 1-2 :pYC-PGBD-2 表达上清液、
[0043] M ：低分子量蛋白Marker。
[0044] 图6PH对融合防御素抑菌活性的影响。
[0045] 图7融合防御素PGBD-2 (P2)对猪免疫细胞的刺激效应。
[0046] 图8融合防御素PGBD-2 (P2)与PRRSV对猪免疫细胞的共刺激作用。
[0047] 图9融合防御素PGBD-2 (P2)处理免疫细胞中PRRSV含量随培养时间的变化结果。
[0048] 图10融合防御素PGBD-2 (P2)处理对PRRSV在Marc-145细胞中复制的影响。
[0049] 图11融合防御素PGBD-2 (P2)处理对实验母猪PCV-2含量影响。
具体实施方式
[0050] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0051] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0052] 实施例1、新型猪防御素融合基因PGBD-2的构建和克隆
[0053] 应用分子设计和重叠PCR技术对猪防御素-2基因加以改造。去除部分非活性基团，保留关键活性部位，同时在序列中加入柔性连接肽序列，并在两端引入BamHI和B10I位点和EcoRI和^CbaI酶切位点，在末端设计终止密码子，克隆PCR产物，并构建了 pGPGBD-2 基因表达载体。经BamHI，EcoRI酶切及质粒PCR鉴定，证实PGBD-2基因已克隆到原核表达载体PGEX-4T-1，为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。具体步骤如下：
[0054] 一、融合基因PGBD-2的克隆
[0055] 1、PGBD_2基因引物的设计与合成
[0056] 根据编码猪Protegrin-I和PBD-2成熟肽的cDNA序列，优化设计出新型融合基因PGBD-2。根据互补重叠区扩增方法设计并人工合成如下六条引物，在PFl端引入BamHI 和BioI位点，在PF6端引入EcoRI和)(baI酶切位点以及终止密码子TAA，并在两者间引入 Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser 的柔性连接肽序列，以利于 Protegrin-Ι 和 PBD-2 自身的空间折叠。引物序列如下：
[0057] PF-I ：5'ATCT GGATCC CTCGAG AAAAGAATGCGCGGCGGACGGCTCTGCTACTGCCGCCGG AGG TTCTGCTGCCGCCGG 3'
[0058] PF-2 :5’ CAAGCAGAGGGCCCTCATCGATCCGGACGATCCACCGCTGCCTCCTCGTCCGACACAGAC CCGGCGGCAGCAGAACCT 3'
[0059] PF-3 :5’ AGCAGGTTAATACCTGCAGCCAGCTGGGAAGAGAGGAGGCAGACAGTCAGCAGCAG
[0060] CAAGCAGAGGGCCCTCAT 3'6[0061] PF-4 ： 5，GTGCCACCCTTCTTGGCACATATGTAGTGGTCGGACCTCTGGCCAAGACCCGTAAGCA
[0062] GGTTAATACCTGCAGCC 3’
[0063] PF-5 ：5' GCCACTGTAA CAGGTCCCTT CAATCCTGTT GAAGAGCGGG CACGGGGAGAAGTTGCAG
[0064] GT GCCACCCTTCTTGGCACAT 3’
[0065] PF-6 :5’ GTA GAATTC TCTAGA TTAATGGTGATGGTGATGATGGCGGATGCAGCACTTGGCC TTGCCACTGTAACAGGTCCCTTCA
[0066] 2、PGBD-2 基因的 PCR 扩增
[0067] 主要采用重叠区扩增法和热启动法。
[0068] (1)PF1、PF2扩增条件如下：在薄壁PCR EP管中加入38. 5 μ 1的ddH20，1 μ IlOmM dNTP，PFl、PF2 各 3μ 1 (各为 10pmol/ml)，5y 1 10 氺 PCR Buffer, 0. 5 μ 1 Pfu 酶。将上述液体配制好后，充分混合。然后用Thermo公司的480PCR仪进行PCR扩增。94°C预变性2分钟后，94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒共30个循环，然后72°C延伸2分钟，至4°C保存。扩增产物命名为：Z2。
[0069] (2)Z2、PF3扩增条件如下：取前次反应液(即Ζ2)17μ 1，PF3 1 μ 1 (10pmol/ml)加入薄壁 PCR EP 管中，并加入 Ιμΐ IOmM dNTP，3. 3μ1 10*PCR Buffer, 0. 5 μ 1 Pfu 酶，用 ddH20将总体积补至50 μ 1。将上述液体配制好后，充分混合。然后用Thermo公司的480PCR 仪进行PCR扩增。94°C预变性4分钟后，94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒共30个循环，然后72°C延伸2分钟，至4°C保存。扩增产物命名为：Z3。
[0070] (3)Z3、PF4 扩增条件如下：取前次反应液(即 Z3) 15 μ 1，PF40. 3 μ 1 (IOpmol/ml) 加入薄壁 PCR EP 管中，并加入 Ιμΐ IOmM dNTP，3. 5μ1 10 氺 PCR Buffer, 0. 5 μ 1 Pfu 酶，用 ddH20将总体积补至50 μ 1。将上述液体配制好后，充分混合。然后用Thermo公司的480PCR 仪进行PCR扩增。94°C预变性4分钟后，94°C 30秒、57°C 30秒、72°C 30秒共30个循环，然后72°C延伸3分钟，至4°C保存。扩增产物命名为：Z4。
[0071] (4)Z4、PF5 扩增条件如下：取前次反应液(即 Z4) 7. 5 μ 1, PF50. 3 μ 1 (10pmol/ml) 加入薄壁 PCR EP 管中，并加入 0. 5μ 1 IOmM dNTP, 1. 8μ 1 10*PCR Buffer, 0. 25 μ 1 Pfu 酶，用ddH20将总体积补至25μ1。将上述液体配制好后，充分混合。然后用Thermo公司的 480PCR仪进行PCR扩增。94°C预变性4分钟后，94°C 30秒、59°C 30秒、72°C 30秒共30个循环，然后72°C延伸3分钟，至4°C保存。扩增产物命名为：Z5。
[0072] (5)Z5、PF6扩增方法同Z5的扩增，但退火温度为55°C。再重复进行常规PCR扩增，方法同Z5’的扩增，以PF1、PF6为引物。产物命名为Z6，即本实验设计的新型融合猪防御素基因（PGBD-2)。
[0073] 每次PCR反应后，均取扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外观察。使用PFl、 PF2、PF3、PF4、PF5及PF6六条引物分别互为模板、互为引物扩增，通过PCR反应获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分别在127、178、2^、288、349bp处呈现一条与预期产物相对分子质量大小相符的DNA条带（结果见图1)。
[0074] 测序结果表明，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示（349个核苷酸），命名为PGBD-2融合基因，其开放阅读框（ORF)为序列1的第23-334位，可编码序列表中序列 2所示的蛋白（103个氨基酸），运用DNATools5. 1对氨基酸序列以及蛋白亲水性进行分析， 结果显示，蛋白分子量为11. lkDa，等电点为9. 32 ；疏水氨基酸31. 1 %，亲水氨基酸46. 6%，碱性氨基酸20.4%，酸性氨基酸1.9%。其氨基酸构成如下表1。从中可见：新的融合多肽具有两亲性，既有极性基团，能溶于水；也有疏水基团，能溶于脂类分子；这符合防御素应该具备的两亲性质。 [0075] 表1PGBD-2氨基酸构成分析
[0076]Hydrophobic Amino Acids Ala lie Leu Phe Pro Met ValNumber 5 4 13 3 2 2 3Hydrophilic Amino Acids Asp Cys Glu Gly Ser Thr TyrNumber 3 12 2 15 9 4 3Basic Amino Acids Arg Lys His Number 10 4 7 Acidic Amino Acids Asp Glu Number 1 1
[0077] 二、重组原核表达载体构建
[0078] 1、扩增片断的双酶切
[0079] PCR回收产物进行BamHI，EcoRI双酶切。取回收产物20 μ 1，加入10 μ 1 IOX酶切缓冲液，5μ l(10U/ml)BamHI,5y 1 (10U/ml)EcoRI，60 μ 1 ddH20，37°C 温浴 3 小时。产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm电泳1小时后，溴乙锭染色，在紫外灯下切下350bp左右大小片段的凝胶，采用MBI琼脂糖凝胶DNA抽提试剂盒回收DNA片段。
[0080] 2、pGEX-4T_l载体双酶切片断的制备
[0081]将载体 pGEX-4T-l (购自 GE Healthcare 公司)进行 BamHI、EcoRI 双酶切。20 μ 1 体系中加入 DNA 5 μ 1，IOXbuffer 2 μ l，BamHI/EcoRI 各 0. 5 μ 1，37°C水浴 3 小时。为防止载体自连，在双酶切之后即进行去磷酸化处理。加入5μ1 IOX碱性磷酸酶缓冲液，Iyl碱性磷酸酶，37°C处理30分钟。点样于0.7%的琼脂糖凝胶，电泳检测。胶回收酶切产物。
[0082] 3、PGBD_2 与 pGEX_4T_l 载体的连接
[0083] 连接体系（10 μ 1)
[0084] 酶切回收过的PGBD_2cDNA片段3 μ 1
[0085] pGEX-4T-l 载体 2. 5 μ 1
[0086] T4DNA 连接酶 1 μ 1
[0087] IOX反应缓冲液Ιμΐ
[0088] ddH20 2· 5 μ 1
[0089] 16 °C水浴过夜连接16h。
[0090] 将pGEX4T-l进行BamHI/EcoRI酶切去磷酸化后，同经BamHI/EcoRI酶切的PGBD-2 片段在T4DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，抽提转化子质粒，进行酶切和PCR鉴定，得到含PGBD-2cDNA片段的重组质粒pGPGBD_2 (结果见图2)。
[0091] 实施例2、新型猪防御素融合基因（PGBD-2)的原核表达及表达活性研究
[0092] 将构建的PGBD表达载体质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，以IPTG诱导融合蛋白表达，SDS-PAGE分析表明融合蛋白能在大肠杆菌中能正确转录，分子量约为37KD，与预期目标带大小一致。在观！：，IPTG终浓度为ImM的条件下诱导5小时，蛋白表达效果最佳。融合蛋白的表达产物以可溶形式存在。将融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B纯化后， 对大肠杆菌ATCC25922、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa) ATCC10211、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)ATCC26112、肺炎链球菌株检测抑菌效果，发现该融合蛋白具有显著的抑菌活性。具体步骤如下：
[0093] 一、PGBD融合蛋白诱导表达
[0094] 1、条件的优化
[0095] 1)不同温度下的诱导表达
[0096] 挑取pGEX-4T-l转化子和pGPGBD重组质粒转化子单菌落于Iml 2 X YT培养基 (含Amp 60yg/ml)，37°C振荡培养过夜，次日取10μ 1转接于Iml的2ΧΥΤ培养基（含 Amp60 μ g/ml)，继续培养约3小时至0D600 = 0. 6〜1. 0，加入IPTG至终浓度为lmmol/L， 分别在和37°C继续诱导培养4小时。
[0097] 以经和37°C诱导的pGEX-4T-l及pG_PGBD的细菌总蛋白进行电泳分析。经 IPTG诱导的pGEX4T-l在E. coli BL21中的表达样品在^KDa处出现GST蛋白带；经IPTG 诱导的PG-PGBD表达样品在37KDa处明显出现新的蛋白带，此带正是由^KDa的GST和 11. OKDa的PGBD蛋白共同构成的融合蛋白，而^KD处的GST带消失。诱导与37°C诱导的GST-PGBD融合蛋白表达量相差不大，但是在诱导的pGEX-4T-l的GST蛋白表达量明显高于37°C诱导条件下蛋白的表达。融合蛋白SDS-PAGE图谱见图3。
[0098] 2)不同诱导时间的诱导表达
[0099] 挑取pGPGBD重组质粒转化子单菌落于Iml 2 X YT培养基（含Amp 60 μ g/ml)， 37°C振荡培养过夜，次日取10 μ 1转接于Iml的2Χ YT培养基（含Amp 60 μ g/ml)，继续培养约3小时至0D600 = 0. 6〜1. 0，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，在下分别继续诱导培养1、2、3、4、5、6小时。然后分别制备样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
[0100] 以经4小时诱导的PGEX-4T-1及1，2，3，4，5，6小时pG_PGBD的细菌总蛋白进行电泳分析。随诱导时间的增加融合蛋白GST-PGBD的表达量增加，5小时以后接近最高表达量。
[0101] 2、用上述优化条件进行PGBD融合蛋白的表达及回收
[0102] 挑取pG-PGBD重组质粒转化子单菌落于^il 2 X YT培养基（含Amp 100 μ g/ml)， 37°C振荡培养过夜，次日取Iml转接于100ml的2X YT培养基（含Amp 100 μ g/ml)，继续培养约3小时至0D600 = 0. 6〜1. 0，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，继续诱导培养5 小时。6，OOOrpm离心5分钟收集菌体，弃尽上清。加入IOml预冷的PBS (137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KC1，4. 3mmol/L Na2HP04,1. 4mmol/L KH2P04, pH7. 3)悬浮菌体，6，OOOrpm 离心 5分钟收集菌体，弃尽上清。加入8ml预冷的PBS，然后液氮/37°C反复冻融10次。然后加入溶菌酶至lmg/ml，室温孵育15min。加入适量Triton X-100和DTT，然后于冰桶中超声波破碎至云雾状细菌悬液变澄清。超声破碎仪功率300W，工作5秒，间隔5秒，共破碎60次。 10，OOOrpm离心10分钟。以超声破碎细胞的上清及沉淀进行电泳分析。上清中含有融合蛋9白GST-PGBD，即融合蛋白GST-PGBD以可溶形式存在。
[0103] 分离上清与沉淀，分别取少量，加入上样缓冲液制备样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。其余上清与沉淀于-20°C保存。
[0104] 3、PGBD融合蛋白的纯化
[0105] 1)基质准备
[0106] 小心摇勻，重悬Glutathione Sepharose 4B基质，移至合适的管中，500X g离心5min，弃上清；用预冷的PBS清洗基质，离心后弃上清；然后按1. 33ml的基质加Iml的 IXPBS0
[0107] 2)纯化过程
[0108] 吸取适量基质，加入待纯化样品，充分混勻后，室混混育30min ；500Xg离心5min， 弃上清；用10倍柱床体积的PBS清洗3次后，加入适量的洗脱buffer(10mM reduced glutathione, 50mM Tris-HCl pH 8. 0)，混勻后室温温育 IOmin 后，500 X g 离心 5min，收集上清。
[0109] 用Glutathione Sepharose 4B将上清纯化，经SDS-PAGE电泳分析，证明纯化的融合蛋白为单一条带。
[0110] 二、PGBD融合蛋白的抑菌活性检测
[0111] 将处于对数生长期0D600 ^ 0. 6的大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922、绿 Mlflif (Pseudomonas aeruginosa) ATCC10211、金Jt^1 葡萄王求菌(Staphylococcus aureus) ATCC26112、肺炎链球菌（Sti^ptococcus pneumoniae)ATCC49619 用 LB 培养基稀释后，分别接种105CFU/ml 20ul细菌悬液至无菌的96孔微量酶标反应板中。将回收的融合蛋白 GST-PGBD、GST和氨苄青霉素（Amp)分别加入其中，使终浓度为10ug/ml，总体积为150 μ 1。 同时，用LB、菌液和蛋白做对照。每组设三个重复。置37°C培养箱孵育IMi后取出，用酶标仪；3550 (B10-Rad, Hercules, California, USA)在 595nm 下对平板进行扫描。
[0112] 取前述制备得到的GST-PGBD融合蛋白用灭菌水稀释至每空终浓度为lOug/ml，测定该浓度条件下，GST-PGBD融合蛋白对上述各菌的抑菌活性。结果发现，该蛋白对革兰氏阳性菌（肺炎球菌、金黄色葡萄球菌）有较明显的抑菌活性（P < 0. 05)，而对革兰氏阴性菌 (绿脓杆菌和大肠杆菌）的抑制效果较强（P < 0. 01)，优于氨苄青霉素（结果详见表2)。
[0113] 表2GST-PGBD融合蛋白抑菌活性测定
[0114]
[0115] 实施例3、猪防御素融合基因（PGBD-2)的酵母表达及表达活性研究
[0116] 将防御素融合基因PGBD-2克隆入面包酵母分泌型表达载体pYCa (pYES2/CT插入 a-factor分泌信号肽），转化入yCT3面包酵母，筛选出高效表达菌株；对重组菌株诱导表达融合防御素后，表达上清进行抗菌活性和纯化蛋白电泳分析，发现融合防御素存在于表达上清中，分子量大致为IlkDa ；实现了融合防御素的分泌表达；所产生的融合防御素对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌均有显著的抑菌活性。具体步骤如下：
[0117] 一、PGBD-2融合基因的扩增
[0118] 1、PCR引物设计
[0119] 利用ft~imers6. 0，参照PGBD-2融合基因组序列分别设计上下游寡核苷酸引物（分别命名为PFU PRl)：在引物5，端分别添加XhoI和XbaI酶切位点。
[0120] PFl :5，ATCTCTCGAGAAAAGAATGCGCGGCGGAC-3‘
[0121] PRl :5，GTATCTAGATTAATGGTGATGGTGATGAT-3‘
[0122] 2、PGBD_2融合基因的扩增
[0123] 取前面所获得的PGBD-2基因重组质粒pGPGBD_2为模板，作PCR扩增；pCR反应体系 50uL (模板:50ng,20umol/L 上下游引物各 IuLJxTaq plusMastermix25uL，去离子水补足至50uL)。反应条件如下：94°C热启动5min ；94°C变性30s，600C退火30s，72 °C延伸Imin， 共35个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。PCR扩增产物各取5uL在1. 5%琼脂糖凝胶上跑电泳验证，剩余的用胶回收试剂盒纯化。
[0124] 将PCR扩增产物经2%凉脂糖凝胶电泳，结果表明：得到了大致为320bp左右的片段，与预期融合防御素基因大小相一致。
[0125] 二、pYCa重组表达载体的构建、鉴定以及重组酵母菌构建
[0126] 1、重组表达载体的构建
[0127] PCR产物经过胶回收纯化与质粒载体pYCa(购自hvitrogen公司）进行助BioI和 XbaI双酶切，酶切产物经过纯化后在T4DNA连接酶作用下4°C过夜，连接产物转化T0P10F， 感受态细胞（大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法如前）；涂布于含有氨苄青霉素的LB 平板上筛选阳性克隆。抽提质粒，双酶切，琼脂糖凝胶进行电泳验证（图4)，然后送阳性克隆菌液测序验证。将正确的重组载体命名为pYCa-PGBD-2。
[0128] 2、酵母感受态细胞的制备
[0129] 挑取尿嘧啶营养缺陷型酵母yCT3单菌落（购自hvitrogen公司）接种于 IOmLYPD酵母丰富培养基，30°C振荡过夜，1 ： 100接至100ml YPD中扩大培养至0D6. 0。 300C 3000rpm离心5min，沉淀先用等体积预冷的灭菌去离子水洗2遍，4°C 1500rpm离心5 分钟；再用50mL预冷的灭菌ddH20重悬浮细胞沉淀；4°C 1500g离心5分钟；最后用2. OmL预冷的lmol/L山梨醇洗涤，4°C 1500g离心5分钟，将细胞沉淀重悬浮于0. 5mL预冷的lmol/ L山梨醇中，混勻置于冰上，当天使用。
[0130] 3、电转化并筛选重组菌株
[0131] 取50ul上述制备好的酵母感受态细胞，加入IOul重组质粒pYCa-PGBD-2 (溶于IOul无菌去离子水中），混勻后加入到冰预冷的0. 2cm电击杯中，选取电压200V、电容 25uF。电击时间为5ms，电击后迅速加入ImL用冰预冷的lmol/L山梨醇溶液混勻。
[0132] 以酵母选择培养基SD-U平板筛选获得阳性重组转化子；培养菌落提取作质粒PCR 和BioI和^CbaI双酶切鉴定，证明重组质粒pYCa-PGBD-2成功转入酿酒酵母yCY3，命名为 yCT3/PGBD-2。11[0133] 三、融合防御素的表达鉴定
[0134] 1、酵母菌株的小量诱导表达
[0135] 从培养好的平板上挑取阳性新鲜单菌落接入含5mLSD_U液体选择培养基 (0. 67gYNB,0. 2g氨酸混合物不含尿嘧啶，加水90mL，121°C灭菌15min，待冷却后加入20% 的葡萄糖IOmL)中，摇床培养过夜作为种子液（OD6qqL 5)，然后4°C，2000r/min离心5min，沉淀先用50mL灭菌去离子水洗3遍，4°C 2000g离心5分钟；部分菌体沉淀再转接至5mLSG-U液体选择培养基（0. 67g YNB,0. 2g氨酸混合物不含尿嘧啶，加水90mL，121°C灭菌15m待冷却后加入20%的半乳糖IOmL)重新悬浮，使0D_在0. 8左右；重新放入摇床进入诱导阶段培养，连续诱导目的蛋白表达40小时（30°C、280r/min)；在相同条件下，以空质粒yCY3酿酒酵母诱导表达的蛋白作为阴性对照。
[0136] 2、重组表达防御素的Tricine-SDS-PAGE分析
[0137] Tricine-SDS-PAGE采用三（羟甲基）氨基甘氨酸（Tricine)代替甘氨酸作为脱尾离子，能够明显提高对小肽的分辨率，减弱带型的弥散程度。所以本试验采取高浓度胶并添加甘油的方法，按照“分离胶一夹层胶一浓缩胶”的模式制作不连续梯度胶分离小分子多肽。
[0138] 将pYCa-PGBD-2阳性重组酵母酵母菌（yCY3/PGBD4)进行小量摇瓶诱导表达，分别收集各时间点的诱导物，离心分离上清；煮沸离心后即可进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测。上清液经Ni-NTA agarose琼脂糖柱纯化后，加入上样缓冲液，同样进行电泳分析。已知PGBD-2蛋白含有102个氨基酸，分子量约为IlKDa ；Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示，重组酵母菌表达的GPBD-2多肽与理论计算值相符（图5)。
[0139] 四、表达蛋白的体外抑菌活性检测
[0140] 96孔板分别加入20 μ 1稀释至2 X IO5〜3X105cfu/ml的5种菌液(大肠杆菌、 沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌）；然后逐一加入相应的融合防御素、 Amp、空酵母对照上清液和未诱导的重组酵母菌上清液以及ddH20 20ul后，加LB培养基液至200ul ；37°C培养12小时，用酶标仪在595nm对培养板进行扫描，测定培养液OD595，观察其抑菌活性。具体步骤如下：
[0141] 以大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、沙门氏菌为检测对象，利用液相比色法测定所得重组酵母表达菌产物的抑菌活性。表达上清液PGBD-2产物经煮沸后可检测抑菌活性；空对照及未诱导的酵母菌上清产物未见抑菌活性（详见下表幻；说明金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、大肠杆菌、沙门氏菌对该融合防御素更敏感。
[0142] 表3pYCa-PGBD_2表达上清液的抑菌结果
[0143]
[0144] 总之，上述结果充分证明融合防御素的重组酵母菌分泌表达载体构成功，并且其诱导表达产物可分泌到细胞外；具有显著的抑制革兰氏阳性和阴性细菌的活性。这些为下一步开展规模化生产和制备新型融合防御素制剂奠定了良好的基础。
[0145] 实施例4、重组猪融合防御素的纯化和体外抗菌活性研究
[0146] 融合防御素具有显著的抗革兰氏阳性和阴性菌的活性，其抗菌活性在PH4-8比较稳定，以后随PH升高而减弱；融合防御素对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和肺炎链球菌均以及耐药沙门氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很强的抑杀活性。扫描和透射电镜、激光共聚焦显微观察证实融合防御素分子能够结合到细菌膜结构以及进入胞内结合染色质分子，破坏膜结构的完整性，降解染色质DNA和RNA分子，胞质呈现明显的空泡化，最终杀灭细菌。具体步骤如下：
[0147] 一、重组yCY3酿酒酵母菌的优化表达
[0148] 1、酵母菌株的小量诱导表达
[0149] 从培养好的平板上挑取新鲜单菌落接入含5mLSD_U液体选择培养基中，摇床培养过夜作为种子液（OD6tltl > 3)后，4°C 2000r/min离心5min，沉淀先用50mL灭菌去离子水洗一遍，4°C 2000g离心5分钟；部分菌体沉淀再转接至5mL SG-U液体选择培养基重新悬浮， 使OD6tltl在0. 7-1. 0之间，重新放入摇床进入诱导阶段培养，连续诱导目的蛋白表达40小时 (培养条件均为^-30°C，280r/min)在相同条件下，以空载体质粒转化的yCY3酿酒酵母诱导表达的蛋白作为阴性对照。
[0150] 2、重组酵母菌株的大量诱导表达
[0151] 接种重组yCT3酿酒酵母菌株于IL SD-U培养基中培养，28°C _30°C，280r/m振荡培养至OD6tltl = 1. 5-2. 0，无菌水清洗菌体三次G°C，3000r/m离心5min)，把适量菌体接于3L SG-U 培养基中，起始 OD6tltl = 0. 5,28°C -30°C，280r/m 振荡培养至 OD6tltl = 6. 0-6. 5,3000r/m 离心收集菌体。
[0152] 3、重组融合防御素的纯化
[0153] 酵母诱导菌培养液4°C 5000r/min离心lOmin，离心收集酵母细胞培养上清液（即该上清液为实施例5中的P2上清，将离心后的沉淀重悬于PBS裂解缓冲液（HOmMNaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 7. 3)，得到实施例 5 所述的 P2 沉淀)，空质粒 yCY3表达做阴性对照。空质粒yCY3表达做阴性对照。
[0154] 用Ni-NTA agarose琼脂糖（购自Qiagen公司）装Icm直径玻璃柱），用 1 OOmMNiS04 清洗充电；再以缓冲液 I Q0mMNa2HP04(含 0. 1 % (v/v) Triton X-100， 5mMglucose,lmM imidazole)平衡树脂柱。上离心样品液后，以缓冲液I充分冲洗，换用含 20mM imidazole的缓冲液I充分洗涤后，再用含50mM imidazole的缓冲液I洗涤；最后用缓冲液 II QOmM Na2HPO4, 5mM glucose, 0. 5M(NH4) 2S04,0. 1% (v/v) TritonX-100)洗脱吸附的融合防御素分子。
[0155] 重组酵母菌发酵上清液经过M-NTA琼脂糖亲和层析纯化后所获得的蛋白质进行 Western-Blot分析，结果发现：PGBD_2的反应带在IlkDa的位置处；说明重组酵母菌发酵液已成功表达出带有His标签的PGBD-2融合防御素，其分子量同预期相近。经检测，该发酵上清液中的融合防御素的浓度达29. 63ug/ml。
[0156] 二、重组融合防御素分子最佳活性的PH值测定
[0157] 用H3PO4或KOH调解磷酸盐缓冲液的pH值，将离心上清培养液的pH值分别调解为 PH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11后收集表达上清，以金黄色葡萄球菌为指示菌，做抑菌实验，第二天测量抑菌圈大小，绘制变化曲线，测定各自的抗菌活性。
[0158] 对金黄葡萄球菌抑菌实验结果显示，融合防御素在pH为2-8时抑菌圈变化不明显；pH 8-11时抑菌活性明显下降。说明pH过高抗菌活性明显下降（图6)。
[0159] 三、重组防御素表达产物的生物活性研究
[0160] 1、最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定
[0161] 最小抑制浓度（MIC)的测定：微量稀释法测定融合防御素对大肠杆菌、鼠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC)的测定。具体操作方法参照文献进行：把处于对数生长期OD6tltl约0. 5-0. 7 (细菌计数约lxl07CFU/ml)的指示菌用LB培养液稀释到0D_为0. 05，分别接种到96孔细胞培养板上，每孔接种IOOul。将融合防御素用 ρΗ6· 0 的 0. lmol/L PBS 分别倍比稀释成 0. 25 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、l. 0 μ g/ml 至 128 μ g/ml ；各取IOOul分别加入培养孔中，混勻，每组重复3个孔，设只加LB培养液的孔为阴性对照，接种细菌而不加防御素的LB培养液为阳性对照。置37°C培养箱孵育1¾后取出，用紫外分光光度计测量培养液的0D_值，结果判断以无OD值变化的孔中防御素的浓度 (终浓度）即为最小抑菌浓度。再将MIC附近各管培养液点种到LB固体培养基上，37°C培养12h，无细菌生长的药物最小稀释浓度即为最小杀菌浓度（MBC)值。
[0162] 通过微量稀释法获得的防御素对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的MIC和MBC见表4。
[0163] 表4融合防御素的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度[0164]
[0165] 融合防御素的抗菌谱检测：
[0166] 表5真核表达融合防御素的抗菌谱结果
[0167]
[0168]抑菌圈大小表示抑菌活性强弱，++ ：1. 0-1. 5cm ；+++ :1. 6-2. Ocm ；++++ :2. 1-3. Ocm
[0169] 2、重组融合防御素的热稳定性
[0170] 从表6结果发现：煮沸10-40分钟，融合防御素的抗金黄葡萄球菌活性无明显不变；煮沸至一个小时内，防御素抑菌活性基本不变；煮沸至一个小时以后，抑菌活性才明显下降；表明防御素具有比较强的热稳定性。
[0171] 表6融合防御素分子抗菌活性热稳定性结果
[0172]
[0173] 实施例5、融合防御素体外对猪免疫调节和抑制病毒复制的研究
[0174] 用PGBD-2与猪免疫细胞在体外培养，MTT法观察对免疫细胞的刺激增殖活性；同时加入PRRSV共培养，以定量实时RT-PCR技术检测免疫细胞和Marc_145细胞中及培养液的PRRSV病毒含量。结果发现：PGBD-2融合防御素具有显著的免疫激活特性，同时能够显著减少PRRSV在免疫细胞和Marc-145细胞的复制量。具体步骤如下：
[0175] —、淋巴细胞增殖活性实验-MTT法：
[0176] 1、免疫细胞刺激增殖效应
[0177] 选取健康的长白猪，前腔静脉采抗凝血15ml ；用猪淋巴细胞分离液分离单个核细胞，台盼蓝检查细胞活率95%以上；D-Hank · s液清洗2次，用1640+10 %犊牛血清培养基调节细胞悬液浓度lX106/ml，按照Costar细胞培养板每孔加入IOOul免疫细胞悬浮液 (1 X 106/ml的细胞悬液）。按排版次序分别添加PGBD-2融合防御素P2上清和P2沉淀裂解液各20ul，最后将各孔细胞培养液补充到200ul。置37°C,5% C02孵育24,48和72,96小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态。96孔细胞培养板分别测20小时，44小时，68、92小时每孔加入IOul MTT溶液（511^/1111，即0.5^^17)，继续培养411后；加入10% SDS 20ul，溶解结晶，用枪打勻。同时设置调零孔（培养基、MTT)，对照孔，每组设定3复孔。在Bio-Rad3550 酶联免疫检测仪0D570nm(630nm校准）测量各孔的吸光值。
[0178] 图7显示：与对照上清液比较，P2酵母发酵上清液及其细胞裂解分子均对猪淋巴细胞有显著的免疫刺激活性（P < 0. 05)，能促进猪免疫细胞的分裂增殖和生长，达到提高其免疫机能的作用。
[0179] 2、融合防御素分子和PRRSV共刺激免疫细胞的效应
[0180] 在上述步骤加入P2上清和P2沉淀后接着还加入5ul的PRRSV液（中国兽药监察所提供购买，109PFU/ml。），其余步骤相同。[0181 ] 结果如图8所示：P2与PRRSV共同作用于猪免疫细胞时，与对照细胞相比较，P2仍然呈现较强的免疫刺激作用，其增殖活性仍显著高于对照感染细胞（P<0. 05)。提示P2具有抑制PRRSV干扰免疫细胞增殖的效应。
[0182] 二、实时定量RT-PCR检测PRRSV在免疫细胞及Marc-145细胞复制的变化
[0183] 1、PRRSV在免疫细胞中复制量
[0184] 步骤一中PRRSV与猪免疫细胞共培养M、48、72和96小时后，qRT_PCR的分析培养细胞中复制的病毒含量，结果如表7和图9所示：
[0185] 表7荧光定量PCR检测培养免疫细胞PRRSV病毒的水平
[0186]
[0187] 从表7中可见：免疫细胞中的PRRSV含量48小时以对照细胞最多（P <0.01)，其次为72小时；72-96小时，对照细胞内的PRRSV含量远高于P2处理细胞（P < 0. 01)；说明在后期处理组细胞中的病毒含量显著低于对照细胞，这可能与其免疫效应增强相关。
[0188] 2、Marc_145细胞中PRRSV含量的变化
[0189] 将上述猪免疫细胞替换成106/ml浓度的Marc-145细胞（中国兽药监察所提供)， 其余步骤相同。
[0190] 从表8可见：当PRRSV在空Marc-145细胞中的复制量随时间延长而明显增多（P < 0. 05)，显著高于用P2 (PGBD-2)融合防御素处理的细胞；即是PRRSV在Marc-145细胞中的复制显著受到P2分子的抑制，致使其病毒含量远低于对照组空白细胞（P < 0.01)(图 10)。
[0191] 表8不同处理对Marc-145细胞中PRRSV复制含量的影响
[0192]
[0193] 总之，上述结果首次发现融合防御素PGBD-2具有显著的促进猪免疫细胞分裂增殖的免疫增强效应；而且在能体外显著地抑制PRRSV病毒在免疫细胞和Marc-145细胞中的复制，减少靶细胞中PRRSV的含量。提示：融合防御素PGBD-2分子具有免疫强化作用和抑制PRRSV在靶细胞复制的生物效应；这为今后开发新型的PRRSV复制新制剂提供了有益的线索。
[0194] 上述qRT-PCR步骤如下：在NCBI上查找出PRRSV的基因序列，参照文献合成扩增PRRSV的引物，由TAKARA公司设计并合成病毒荧光定量引物。病毒检测引物序列为：PRRSV-F :TTGTGGTGTATCGTGCCG ； PRRSV-R :CAAGGAAATGGCTGGTGG。以细胞内保守的看家基因-β-actin基因的表达作为内参标准，表达量设为1。β -Actin F ： 5 ‘ -CTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3 ‘ ； β -Actin R ：5 ‘ -CCTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3 ‘。 β -Actin PCR 产物 248bp。退火温度 56°C。
[0195] (I)RNA 提取：取新鲜全血 IOOul，力口入 Iml RNA iso (Takara 公司)，打勻，7500rpm 离心去除杂质；
[0196] (2)加入氯仿200ul、异丙醇400ul抽提RNA，充分混勻，静置5min，12000rpm离心 15min ；
[0197] (3)吸上清400ul转移至RNA free EP中，加入400ul异丙醇，混勻，冰浴lOmin， 离心12000rpm lOmin，弃上清；
[0198] (4) 75%乙醇Iml洗沉淀，12000rpm 5min，弃上清，自然烘干；
[0199] (5) 25ulRNAfree ddH20 溶解。
[0200] (6)反转录：采用天根（TianGen)公司cDNA第一链合成试剂盒，20ul体系。37°C 1小时。[0201 ] (7)定量PCR ：反应体系
[0202] 经过优化，最后确定实施试验的反应条件为：95°C，10s ;95°C、5S，56°C、20S， 72°C>15s,40 个循环。
[0203] 实施例6、融合防御素饲料添加剂抑制猪体内PCV和PRRSV繁殖效应观察
[0204] 在怀孕母猪日粮全程添加0. 2%。融合防御素饲料添加剂至哺乳结束，以同样条件的母猪不添加融合防御素为对照组，其饲养和管理条件与实验母猪完全相同，观察和分析融合防御素饲料添加剂对母猪繁殖生产性能的影响。同时实验前后采取试验母猪抗凝血， 同前述以实时定量PCR检测PCV和PRRSV含量的变化，观察对母猪体内病毒繁殖的效应。具体步骤如下：
[0205] 58头母猪日粮从配种后1月龄至哺乳结束，实验全程110天，饲料中全程添加 0.2%。（质量比）融合防御素（实施例4的步骤一中的步骤3得到的纯化重组融合防御素）饲料添加剂，同时以49头同样条件的母猪不添加融合防御素为对照组，饲养和管理条件与实验组母猪完全相同，观察、统计、分析该饲料添加剂产品对母猪繁殖生产性能的影响。同时实验前后采实验猪抗凝血液，同前述以实时定量PCR检测PCV(检测引物PCV-F 5，-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3，和 PCV-R 5，-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3，)和 PRRSV(弓丨物为上述的PRRSV-F和PRRSV-R)含量的变化，观察对实验猪体内病毒繁殖的效应。
[0206] 结果证实：与对照组相比，实验母猪窝均活仔数提高了 0. 92头；窝均死胎数下降 0. 34头，下降比例达到4.15%,差异极显著(P < 0.01)(¾ -9)。显示融合防御素制剂对母猪繁育有良好的促进成效。
[0207] 表9P2融合防御素添加饲料饲喂母猪繁殖性能数据对比
[0208]
[0209] 表10显示饲料添加P2后实验组母猪体内的PCV-2含量较实验前明显降低（P <0.05)；而对照组母猪体内的PCV-2含量则较实验前有所增多，但差异不显著（P> 0. 05)；证明P2融合防御素可显著增强母猪抑制或清除体内PCV-2的良好效应（图11)。
[0210] 表10P2融合防御素饲料饲喂母猪体内PCV-2含量的变化[0211]
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