技术领域
[0001] 本
发明属于
水疱性口炎病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法。
背景技术
[0002] 水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，具有新泽西型和印第安纳型两个抗
原型，为
人畜共患病。
牛、
马、猪为易感动物，
双翅目昆虫(如蚊和白蛉)是主要虫媒。病畜的水疱液、水疱皮和淋巴结中病毒含量最多。其临床症状与
口蹄疫、猪水疱病难以区分。近年来，针对VSV的研究已有多种实验室检测方法，如：病毒分离试验(VI)、血清中和试验(SN)、病毒中和试验(VN)、酶联
免疫吸附试验(直接型、间接型、竞争型，ELISA)、逆转录聚合酶联合反应(RT-PCR)、实时荧光逆转录聚合酶联合反应(Real timeRT-PCR)、免疫色层分析测试片(Lateral flow devices,LFD)等方法在国际期刊上发表。根据世界动物卫生组织针对上述
疾病在不同的适用对象中有不同的推荐检测方法，但纵观上述实验室检测方法，虽然具有各自的优点，但也有不同层面的不足或
缺陷：VI检测周期长，不适用于快速
鉴别诊断；ELISA法易出现
假阳性，特异性不强；SN和VN法灵敏度不高；RT-PCR法需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大；Real time RT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高；LFD法步骤繁琐，不适用于大规模的筛查。
[0003] 综上所述，现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法，旨在解决现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐的问题。
[0005] 本发明所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法，所述合成方法包括：
[0007] 根据GenBank
数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子
生物学
软件LAMP designer1.14设计荧光LAMP引物，采用HPLC方式进行纯化，并将合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，保存于-20℃。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：
[0009] 步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取
试剂盒Mag-Bind Viral DNA/RNAKit
说明书提取样品核酸；
[0010] 步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL。，Bst DNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至
25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；
[0011] 步骤三，仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光
信号，荧光通道选为FAM。
[0012] 进一步，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法的内引物FIP和BIP浓度为1.6μmol/L、外引物F3和B3浓度为0.2μmol/L、环引物LF和LB浓度为0.8μmol/L，反应
温度为63℃。
[0013] 本发明提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，由于LAMP反应针对靶序列6个区域设计所涉及，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高；且DNA无需预先解链DNA，扩增速度快；环状引物的添加更使反应时间减半。本发明
实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物，当其内引物(FIP和BIP)浓度为1.6μmol/L、外引物(F3和B3)浓度为0.2μmol/L、环引物(LF和LB)浓度为0.8μmol/L、反应温度为63℃时，扩增效果最佳。本发明在原来LAMP技术的
基础上引入
荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。
附图说明
[0014] 图1是本发明实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的检测方法
流程图。
[0015] 图2是本发明实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP方法建立示意图。
[0016] 图3是本发明实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP特异性试验示意图。
[0017] 图4是本发明实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP灵敏度试验示意图。
[0018] 图5是本发明实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP检测
稳定性试验1示意图。
[0019] 图6是本发明实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP检测稳定性试验2示意图。
[0020] 图7是本发明实施例提供的样品检测结果示意图。
具体实施方式
[0021] 为更加明确地诠释本发明的目的、技术方案及优点，以下结合实施例，对本发明作详细描述。应当理解，此处所描述阐述的实施例仅用于解释本发明，不用于限定本发明。
[0022] 以下结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
[0023] 本发明实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物为：
[0024] SEQ ID NO：1
[0025] FIP TACCGCTGCAACTATCTTGGTGGCCTCGTTGAAGATGGATT
[0026] SEQ ID NO：2
[0027] BIP ATGAGCGTGCACCAATCAGATGCTAATGCTGCACAGTCT
[0028] SEQ ID NO：3
[0029] F3TGGATGGTTTAGAGAATCAGTG
[0030] SEQ ID NO：4
[0031] B3TCCACTGACCTTGCTTAGA
[0032] SEQ ID NO：5
[0033] LF CGGATCATTCTCCCATATGTCA
[0034] SEQ ID NO：6
[0035] LB CGGAACCATAGTCTCACGG
[0036] 如图1所示，本发明实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：
[0037] S101：样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-Bind Viral DNA/RNA Kit(200)说明书提取样品核酸；
[0038] S102：反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至
25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；
[0039] S103：仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧
光信号，荧光通道选为FAM。
[0040] 本发明实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法包括：
[0041] 根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计实时荧光LAMP引物，由上海辉睿生物科技有限公司合成，采用HPLC方式进行纯化。合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，保存于-20℃。
[0042] 以下结合试验对本发明的应用原理作详细描述。
[0043] 1.材料与仪器
[0044] (1)组织样品
[0045] 猪肉及猪内脏共8份，购于超市。
[0046] (2)病毒株和基因
[0047] 口蹄疫(O型、亚洲1型)
疫苗株；猪水疱病病毒VP1基因克隆载体；水疱性口病毒NP基因克隆载体；水疱疹病毒VP3基因克隆载体。基因的合成和克隆在上海旭冠生物科技有限公司完成。
[0048] (3)主要试剂
[0049] DNA/RNA恒温扩增试剂盒购自Deaou公司；核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit(200)购自OMEGA公司。
[0050] (4)主要仪器
[0051] ABI 7500Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；ViiA7Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；SIGMA高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；NanoDrop ND-1000Spectrophotometer紫外分光光度计(美国NanoDrop Technologies公司)。
[0052] 2.方法
[0053] (1)引物的设计与合成
[0054] 根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMP designer1.14设计实时荧光LAMP引物，由上海辉睿生物科技有限公司合成，采用HPLC方式进行纯化。合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，保存于-20℃。引物序列见表1。
[0055] 表1水疱性口炎病毒荧光LAMP引物序列
[0056]
[0057] (2)样品核酸的提取
[0058] 按照核酸提取试剂盒Mag-BindViral DNA/RNAKit(200)说明书提取样品核酸。
[0059] (3)反应体系和反应条件
[0060] LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM 12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL，Bst DNApolymerase 0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染。反应条件：63℃运行60min，每1min收集一次荧光。
[0061] (4)引物浓度的优化为优化反应的最佳引物浓度，根据试剂盒的推荐范围，进行4组不同的内外环引物终浓度比例优化，终浓度各自为：内引物(FIP和BIP)1.6μmol/L、外引物(F3和B3)0.1μmol/L、环引物(LF和LB)0.8μmol/L；内引物1.6μmol/L、外引物0.2μmol/L、环引物0.8μmol/L；内引物0.8μmol/L、外引物0.1μmol/L、环引物0.4μmol/L；内引物0.8μmol/L、外引物0.2μmol/L、环引物0.4μmol/L。
[0062] (5)特异性检测
[0063] 以合成的水疱性口炎病毒NP基因为阳性对照，以口蹄疫病毒核酸、猪水疱病病毒VP1基因和水疱疹病毒VP3基因为样品，使用上述反应体系和反应条件进行LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的特异性。
[0064] (6)灵敏度检测
[0065] 对阳性对照质粒，用紫外分光光度计测定其浓度，根据阿伏伽德罗常数换算成的拷贝数，进行10倍梯度稀释，对梯度稀释的阳性样品使用上述反应体系和反应条件进行LAMP扩增，以验证所设计引物及所建立方法的灵敏度。
[0066] (7)稳定性试验
[0067] 取105浓度的阳性对照质粒，间隔1个月进行两次试验，每次做20个重复。统计检测结果之间的差异。
[0068] (8)样品检测试验
[0069] 使用购买的8份猪肉及猪内脏组织，提取核酸之后，使用建立的实时荧光LAMP方法进行检测。
[0070] 3.结果
[0071] (1)荧光LAMP检测方法建立及条件优化
[0072] 如图2所示，经比较，当内引物终浓度为1.6μM、外引物终浓度为0.2μM、环引物终浓度为0.8μM，反应温度为63℃，LAMP扩增效果最佳。
[0073] (2)荧光LAMP检测方法特异性试验
[0074] 如图3所示，所检测的目标阳性样品出现实时荧光增长曲线，有较强的实时荧光信号，表现为阳性扩增，所检测的样品FMDV核酸、SVDV质粒、VESV质粒及空白对照均无扩增曲线。
[0075] (3)荧光LAMP检测方法灵敏度试验
[0076] 以上述克隆测序的质粒作为阳性样品，对稀释度为10至109个拷贝的水疱性口炎病毒阳性对照进行LAMP扩增，结果如图4所示，稀释度为10至109个拷贝的阳性对照均出现荧光增长曲线，具有较强的荧光信号，表明该检测方法的灵敏度可以达到10个拷贝。
[0077] (4)荧光LAMP检测方法稳定性试验
[0078] 对批内和批间出现荧光值增长的时间点进行统计分析，两次批内变异系数分别为1.14％和1.06％，批间变异系数为1.18％，批内和批间的稳定性差异均小于2％，表明试验稳定性好，见图5和图6。
[0079] (5)样品检测结果
[0080] 如图7所示，8份样品的检测结果均为阴性。
[0081] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
