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用于药用胰腺酶制剂中的病毒灭活的β-丙内酯

阅读：77发布：2020-05-19

专利汇可以提供用于药用胰腺酶制剂中的病毒灭活的β-丙内酯专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了包含胰腺酶制剂（PEP）的药用组合物，这些胰腺酶制剂具有减少至低于显著水平的病毒感染性并且具有高的酶活性。这些PEP可以包含脂肪酶类，蛋白酶类，淀粉酶类，无包膜病毒（例如，猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒 2型（PCV-2）、猪脑心肌炎病毒（EMCV）），以及有包膜病毒（例如，水疱性口炎病毒（VSV）、和A型流感病毒（IF A））。本发明还包括通过给予这些药用组合物治疗胰功能不全的方法以及通过用β-丙内酯（BPL）处理该PEP以减少病毒感染性来制备这些药用组合物的方法。，下面是用于药用胰腺酶制剂中的病毒灭活的β-丙内酯专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有减少的病毒感染性的胰腺酶制剂(PEP)，该胰腺酶制剂包含(i)一种或多种胰腺酶以及(ii)3-羟基丙酸、β-丙内酯(BPL)、或它们的一种混合物。
2.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，包含(i)一种或多种胰腺酶以及(ii)3-羟基丙酸。
3.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，其中该制剂已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且所具有的猪细小病毒(PPV)的病毒感染性比末用BPL处理过的制剂的病毒感染性要低至少1log。
4.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，其中该制剂已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且所具有的无包膜病毒的病毒感染性比末用BPL处理过的制剂的病毒感染性要低至少
1log。
5.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，其中该制剂已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且所具有的有包膜病毒的病毒感染性比末用BPL处理过的制剂的病毒感染性要低至少
1log。
6.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，其中该制剂已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且所具有的猪脑心肌炎病毒(EMCV)的病毒感染性比末用BPL处理过的制剂的病毒感染性要低至少1log。
7.如权利要求1所述的胰腺酶制剂，其中该制剂具有小于约103FFID50/gPEP的猪细小病毒(PPV)的病毒感染性。
8.如权利要求1至7中任一项所述的胰腺酶制剂，其中在该制剂中的至少一种胰腺酶来自一种动物源。
9.如权利要求1至8中任一项所述的胰腺酶制剂，其中一种或多种酶是选自以下各项：
脂肪酶类、蛋白酶类、以及淀粉酶类。
10.如权利要求1至9中任一项所述的胰腺酶制剂，其中该制剂包含胰脂肪酶。
11.一种具有减少的病毒感染性的药用组合物，该药用组合物包含如权利要求1至10中任一项所述的制剂，以及任选的一种药学上可接受的赋形剂。
12.一种固体口服剂型，包括
一种具有减少的病毒感染性的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包括从约1,000到约
60,000USP单位的脂肪酶类、从约3,000到约360,000USP单位的蛋白酶类、以及从约3,000到约360,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且具有比没有用BPL处理的PEP的病毒感染性低至少1log的猪细小病毒(PPV)的病毒感染性，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。
13.如权利要求12所述的固体口服剂型，其中该剂型是处于一种粉末、片剂、微片剂、微球、球粒、或胶囊的形式。
14.一种固体口服剂型，包括
一种具有减少的病毒感染性的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包括从约1,000到约
60,000USP单位的脂肪酶类、从约3,000到约360,000USP单位的蛋白酶类、以及从约3,000到约360,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP具有低于约100FFID50/g PEP的PPV感染性，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。
15.一种固体口服剂型，包括
一种具有病毒减少/灭活的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包括从约2,500到约
45,000USP单位的脂肪酶类、从约7,500到约270,000USP单位的蛋白酶类、以及从约7,500到约270,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且具有比没有用BPL处理的PEP的病毒感染性低至少1log的猪细小病毒(PPV)的病毒感染性，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。
16.如权利要求15所述的固体口服剂型，其中该剂型是处于一种粉末、片剂、微片剂、微球、球粒、或胶囊的形式。
17.一种固体口服剂型，包括
一种具有病毒减少/灭活的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包括从约2,500到约
45,000USP单位的脂肪酶类、从约7,500到约270,000USP单位的蛋白酶类、以及从约7,500到约270,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP具有低于约100FFID50/g PEP的PPV感染性，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。
18.一种固体口服剂型，包括
一种具有减少的病毒感染性的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包括从约1,000到约
60,000USP单位的脂肪酶类、从约3,000到约360,000USP单位的蛋白酶类、以及从约3,000到约360,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP已经用β-丙内酯(BPL)预处理过并且具有比没有用BPL处理的PEP的病毒感染性低至少1log的猪细小病毒(PPV)的病毒感染性，
3-羟基丙酸、β-丙内酯(BPL)、或它们的混合物，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。其中该剂型是处于一种粉末、片剂、微片剂、微球、球粒、或胶囊的形式。
19.如权利要求18所述的固体口服剂型，其中该PEP包含从约2,500到约45,000USP单位的脂肪酶类、从约7,500到约270,000USP单位的蛋白酶类、以及从约7,500到约
270,000USP单位的淀粉酶类。
20.一种固体口服剂型，包括
一种具有减少的病毒感染性的胰腺酶制剂(PEP)，其中(i)该PEP包含从约1,000到约
60,000USP单位的脂肪酶类、从约3,000到约360,000USP单位的蛋白酶类、以及从约3,000到约360,000USP单位的淀粉酶类，并且(ii)该PEP具有低于约100FFID50/g PEP的PPV感染性，
3-羟基丙酸、β-丙内酯(BPL)、或它们的混合物，以及
任选地，一种或多种药学上可接受的赋形剂。其中该剂型是处于一种粉末、片剂、微片剂、微球、球粒、或胶囊的形式。
21.如权利要求20所述的固体口服剂型，其中该PEP包含从约2,500到约45,000USP单位的脂肪酶类、从约7,500到约270,000USP单位的蛋白酶类、以及从约7,500到约
270,000USP单位的淀粉酶类。
22.一种用于对需要治疗的病人进行胰功能不全的治疗的方法，该方法包括向该病人给予一个治疗有效量的如权利要求11所述的药用组合物。
21.一种制备胰腺酶制剂(PEP)的方法，该方法包括以下步骤：(a)使β-丙内酯(BPL)与含有一种或多种胰腺酶的一种制剂反应足够的时间，以减少该制剂中的病毒感染性。
22.如权利要求21所述的方法，其中与BPL反应后该制剂中的无包膜病毒的病毒感染性比与BPL反应前该制剂中的无包膜病毒的病毒感染性低至少1log。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中与BPL反应后该制剂中的有包膜病毒的病毒感染性比与BPL反应前该制剂中的有包膜病毒的病毒感染性低至少1log。
24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中与BPL反应后该制剂中的猪细小病毒(PPV)或猪脑心肌炎病毒(EMCV)的病毒感染性比与BPL反应前该制剂的PPV或EMCV的病毒感染性分别低至少1log。
25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括：
(i)将BPL加入一种溶液中，该溶液含有该一种或多种胰腺酶的制剂，并且(ii)在步骤(i)的溶液中将BPL孵育足够的时间，以减少该溶液中的病毒感染性。
26.如权利要求25所述的方法，其中步骤(i)包括加入到一种溶液或悬浮液中，该溶液或悬浮液包含从约100到约200mg PEP/ml、从约0.004％到约1.0％(v/v)的BPL。
27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其中该反应进行约30分钟到约72小时。
28.如权利要求21至27中任一项所述的方法，其中该反应在从约5℃到约50℃的温度下进行。
29.如权利要求21至28中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤(b)：在BPL与该含有这些胰腺酶的制剂进行反应后，使该BPL灭活。
30.如权利要求29所述的方法，其中步骤(b)包括将一种BPL灭活剂加到步骤(a)中形成的该溶液或悬浮液中。
31.如权利要求29所述的方法，其中步骤(b)包括将步骤(a)中形成的该溶液或悬浮液进行冷冻，然后将它冻干。
32.如权利要求29所述的方法，其中步骤(b)包括将步骤(a)中形成的该溶液或悬浮液孵育足够的时间，以将BPL降解为3-羟基丙酸，并且其中该溶液是一种水溶液。

说明书全文

用于药用胰腺酶制剂中的病毒灭活的β-丙内酯

[0001] 本申请要求2010年3月19号提交的美国临时专利申请号61/315,813的优先权，将其通过引用结合在此。发明领域

[0002] 本发明涉及具有减少的病毒感染性(viral infectivity)的胰腺酶制剂，特别涉及此种用β-丙内酯(BPL)处理过的制剂，含有它们的药用组合物，以及制备它们的方法。

发明背景

[0003] 胰外分泌功能不全是胰腺疾病(例如，慢性胰腺炎、囊性纤维病、严重的急性坏死性胰腺炎和胰腺癌)，胰腺外疾病(例如腹腔疾病和克罗恩氏病)以及胃肠和胰腺的外科切除术的一个主要后果。胰外分泌功能的置换(replacement)对于消除与营养不良有关的发病率和死亡率是重要的。一种胰外分泌功能不全的治疗是口服胰腺酶以在胃排空营养物质的时候为十二指肠腔提供充足的活性脂肪酶。

[0004] 在过去的70年，已经以各种形式使用从动物源获得的胰腺酶制剂(PEP)，以部分地治疗病人的酶缺乏症，这些病人患有各种胰腺酶缺乏症和消化障碍。PEP典型地含有至少三类酶(包括脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶)的一个组合，它们对于消化脂肪、蛋白和糖是重要的。一种被称为胰脂肪酶的PEP以结合在胶囊内的肠溶颗粒的形式市售，它含有高达35,000USP单位/胶囊的胰脂肪酶(例如， (消化治疗公司(Digestive Care,Inc.))、 (艾肯斯制药公司(Axcan Scandipharm Inc.))、
TM
PANCREAZE (麦克尼尔制药公司(McNeil Pharmaceutical))、 (美国研究
公司(Organon USA,Inc.))、 (尤兰德制药公司(EurandPharmaceuticals))以
及 (苏威制药公司(Solvay Pharmaceuticals,Inc.)))。由于这些酶是从动物源分离的，它们很容易被病毒污染，对于来自猪的材料，例如无包膜病毒(例如，猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪脑心肌炎病毒(EMCV))，以及有包膜病毒(例如，水疱性口炎病毒(VSV)、和A型流感病毒(IFA))。见于2008年12月召开的美国食品和药物管理局(FDA)抗病毒药物咨询委员会大会(Antiviral Drugs AdvisoryCommittee Meeting)的信息，这些信息可以在万维网WorldWideWebfda.gov/ohrms/dockets/ac/cder08.html#AntiviralDrugs网址上找到。

[0005] 参见，例如Mayr,从减毒的痘病毒开发非免疫性的类特异性的疫苗：一种新的疫苗类型(Development of non-immunizing,paraspecificvaccine from attenuated pox viruses:a new type of vaccine),Berl Munch TierarztlWochenschr.2001,114:184-7;Argüello Villares，兔病毒性出血性疾病：接种和免疫应答(Viral haemorrhagic disease of rabbits:vaccination and immuneresponse),Rev Sci Tech.1991,10:459-80;发现的使用血浆蛋白的病毒灭活Horowitz,(Inactivation of viruses found with plasma proteins),生物工程(Biotechnology)1991,19:417-30;Epstein and Fricke,目前的凝血因子浓缩物的安全性(Current safety of clotting factor concentrates),Arch Pathol Lab Med.1990,114:335-40;Stephan,通过用β-丙内酯处理和UV照射来灭活血浆和血浆衍生物中的肝炎病毒和HIV(Inactivation of hepatitis viruses and HIV inplasma and plasma derivatives by treatment with beta-propiolactone/UVirradiation)，Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989,56:122-7;Stephan,关于不稳定的血浆制品的病毒安全性的德国的观点(Virus safety of labile plasmaproducts from the German viewpoint),Beitr Infusionsther.1989,24:40-5;Anderson等人特异性IgE和β-丙内酯在由加强剂量的人二倍体细胞狂犬疫苗导致的反应中的作用(The role of specific IgE and beta-propiolactone inreactions resulting from booster doses of human diploid cell rabies vaccine),JAllergy Clin Immunol.1987,80:861-8;Prince等人，β-丙内酯/紫外线照射：用于灭活血液衍生物中的病毒的效力的综述(Beta-propiolactone/ultravioletirradiation:a review of its effectiveness for inactivation of viruses in bloodderivatives),Rev Infect Dis.1983,5:92-107;美国公开号2006/0115376。

[0006] 目前，需要无病毒的或病毒感染性减少的口服PEP，它们含有多个剂量的活性酶补充剂。发明概述

[0007] 本发明的诸位发明人发现了可以通过用一种化学剂(β-丙内酯，BPL)处理胰腺酶制剂(PEP)来有效地使该PEP中的病毒灭活，而不消除该PEP的酶活性。不希望受任何理论的限制，通过BPL使病毒灭活是基于该病毒的基因组的烷基化作用。诸位发明人还发现了除了这些病毒以外的PEP组分，例如胰腺酶或者核酸类，它们可能减少BPL的烷基化活性，不干扰PEP中的病毒的灭活。

[0008] 本发明的一个实施方案是一种具有减少的病毒感染性的PEP。该制剂包括(i)一种或多种经BPL处理过的胰腺酶以及(ii)3-羟基丙酸(即BPL的水解产物)、BPL、或它们3
的一种混合物。优选地，该PEP具有小于约10FFID50/g PEP的PPV病毒感染性，如通过美国公开号2009/0226414中所描述的PPV FFID感染性分析所测量的，该申请通过引用结合在此。优选地，该PEP的病毒感染性比末用BPL处理过的相似制剂的病毒感染性要低至少
1log，其中病毒感染性是无包膜病毒、有包膜病毒、PPV、EMCV、或它们的组合的病毒感染性。

[0009] 另一个实施方案是一种具有减少的病毒感染性的药用组合物，该药用组合物包含(i)一种或多种经BPL处理过的胰腺酶(或一种PEP)以及(ii)3-羟基丙酸、BPL、或它们的一种混合物。又另一个实施方案是一种对需要治疗的病人进行胰功能不全的治疗的方法，该方法是向该病人给予一个治疗有效量的本发明的该PEP或药用组合物。

[0010] 又另一个实施方案是一种制备PEP的方法，该方法包括以下步骤：(a)使BPL与含有一种或多种胰腺酶的一种制剂反应足够的时间，以减少该制剂中的病毒感染性。在一个实施方案中，步骤(a)中的反应通过以下步骤进行：(i)将BPL加到含有一种或多种胰腺酶的制剂的一种溶液或悬浮液中，并且(ii)在步骤(a)中使BPL在该溶液中孵育足够的时间，以减少该溶液中的病毒感染性。该方法可以进一步包括以下步骤：(b)在步骤(a)的反应后使该BPL灭活。可以通过在一种水溶液中孵育，通过加入一种灭活剂(例如硫代硫酸钠)，或者通过冷冻步骤(a)形成的该溶液然后将它冻干而使该BPL灭活。

[0011] 本发明的任何实施方案中的这些胰腺酶可以是重组形成的或者来自一种动物源(猪、羊和牛)。合适的胰腺酶包括，但不限于，脂肪酶类、蛋白酶类、淀粉酶类、以及上述任何项的任何组合。一种优选的胰腺酶的混合物是猪源的胰脂肪酶。发明详细说明
定义

[0012] 根据本发明，可以存在在本领域的技术范围内的大量的工具和技术，例如那些常用于分子免疫学、细胞免疫学、药理学、和微生物学的工具和技术。见，例如，Sambrook等人(2001)分子克隆：实验手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual.)第三版，冷泉港实验室出版社：冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel等人编辑(2005)目前的分子生物学的协议(Current Protocols inMolecular Biology).约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons,Inc.)Hoboken,NJ;Bonifacino等人编辑(2005)目前的细胞生物学的协议(CurrentProtocols in Cell Biology).约翰·威利父子出版公司:Hoboken,NJ;Coligan等人编辑(2005)目前的免疫学的协议(Current Protocols in Immunology)，约翰·威利父子出版公司:Hoboken,NJ;Coico等人编辑(2005)目前的微生物学的协议(Current Protocols in Microbiology),约翰·威利父子出版公司:Hoboken,NJ;Coligan等人编辑(2005)目前的蛋白科学的协议(CurrentProtocols in Protein Science),约翰·威利父子出版公司:Hoboken,NJ;andEnna等人编辑(2005)目前的药物学的协议(Current Protocols inPharmacology),约翰·威利父子出版公司:Hoboken,NJ.,以及动物细胞培养(Animal Cell Culture)(Freshney，编辑:1986)。

[0013] “病人”是指人或其他动物。

[0014] 对应度量单位、技术、特性或化合物的常用的缩写如下：“min”意思是分钟，“h”或“hr”意思是小时，“μL”或“μl”意思是微升，“mL”或“ml”意思是毫升，“mM”意思是毫摩尔的，“M”意思是摩尔的，并且“mmole”意思是毫摩尔。

[0015] 术语“USP单位”是指用来测量一种维生素或药物的效能(即，它的预期的生物效应)的单位。对于应用这种单位的每种物质，美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)已经确定了与1USP单位的剂量相关的生物效应。然后，可以用这个标准单位来表示该物质的其他量值。.在大多数情况下，该USP单位等于国际单位(IU)。

[0016] 一个USP单位的淀粉酶活性包含在以下胰脂肪酶的量值中，该胰脂肪酶以初始的速度分解淀粉，这样使得在通过引用结合在此的、胰脂肪酶的官方论著(Official Monograph for Pancrelipase，美国药典2009 32/国家处方集27(The 2009 United States Pharmacopia 32/National Formulary 27))的淀粉酶活性分析(Assay for amylase activity)的条件下，每分钟水解0.16μEq的糖苷键。

[0017] 一个USP单位的脂肪酶活性包含在以下胰脂肪酶的量值中，在pH为9.0和37℃温度下以及在通过引用结合与此的、胰脂肪酶的官方论著(美国药典2009 32/国家处方集27)的淀粉酶活性分析的条件下，该胰脂肪酶每分钟释放1.0μEq的酸。

[0018] 一个USP单位的蛋白酶活性包含在以下胰脂肪酶的量值中，在通过引用结合与此的、胰脂肪酶的官方论著(美国药典2009 32/国家处方集27)的蛋白酶活性分析的条件下，该胰脂肪酶以初始的速度水解酪蛋白，这样使得每分钟释放一定量的肽类，这些肽类没有被三氯乙酸沉淀，三氯乙酸具有与15nmol的酪氨酸相同的280nm处的吸光度。胰腺酶制剂(PEP)

[0019] 合适的胰腺酶制剂(PEP)可以含有消化酶(例如脂肪酶类、蛋白酶类、和淀粉酶类)的混合物。PEP可以来自动物源。动物源的PEP可以被至少一种或多种病毒污染，例如PPV、PCV-2、EMCV、VSV、和A型流感病毒，以及核酸类。PEP还可以含有残余量的异丙醇(IPA)。

[0020] 可以存在于PEP中的活性酶类包括，但不限于，胰腺酶，例如胰脂肪酶(脂肪酶类、蛋白酶类、和淀粉酶类的混合物)或者胰酶。可以存在于PEP中的其他活性酶类包括：(i)活性蛋白酶类，包括，但不限于：胰蛋白酶，E.C.(酶学委员会编号)3.4.4.4；糜蛋白酶，E.C.3,4,4,5；糜蛋白酶B，E.C.3,4,5,6；胰肽酶E，E.C.3.4.4.7；羧肽酶A，E.C.3.4.2.1；
和羧肽酶B，E.C.3.4.2.2；(ii)活性脂肪酶类，包括，但不限于：甘油酯水解酶(Lipase)，E.C.3.1.1.3；磷脂酶A2，E.C.3.1.1.4；和甾醇酯水解酶，E.C.3.1.1.13；(iii)核酸酶类，例如，但不限于：核糖核苷酸酶，E.C.2.7.7.16和脱氧核糖核酸酶，E.C.3.1.4.5；以及(iv)活性淀粉酶类，例如α-淀粉酶，E.C.3.2.1.1。

[0021] 在一个优选实施方案中，该PEP包括胰腺酶的混合物，这些胰腺酶包括脂肪酶类、蛋白酶类、和淀粉酶类、以及任选的核酸酶类(例如核糖核苷酸酶)。这些酶类可以来自动物源，例如狗、羊和牛。该PEP中还可以包括共脂肪酶。应该理解的是，如在此所使用的，术语“酶”不仅包括已经活化的形式还有酶原前体，该酶原前体能够在哺乳动物的肠液中被转化为活化的形式。

[0022] 在一个实施方案中，该PEP是胰脂肪酶，该胰脂肪酶具有从约69到约120U USP/mg的脂肪酶活性，大于或等于约216U USP/mg的淀粉酶活性，大于或等于约264U USP/mg的蛋白酶活性，以及大于或等于约264UUSP/mg的总蛋白酶活性。

[0023] 该PEP中的脂肪酶活性的范围(BPL处理之前或之后)可以是从约1,000到约150,000国际单位(U)。该PEP中的淀粉酶活性的范围(BPL处理之前或之后)可以是从约3,000到约500,000U。该PEP中的蛋白酶活性的范围(BPL处理之前或之后)可以是从约3,000到约500,000U。在另一个实施方案中，该PEP包含从约2,000到约75,000USP单位的脂肪酶，从约8,000到约250,000U的蛋白酶类，以及从约8,000到约250,000U的淀粉酶类。在又另一个实施方案中，该PEP包含从约2,000到约40,000USP单位的脂肪酶，从约
8,000到约160,000U的蛋白酶类，以及从约8,000到约160,000U的淀粉酶类。

[0024] 该PEP中的脂肪酶活性(BPL处理之前或之后)可以是从约3000到约25,000IU，从约4500到约25,000IU，例如，从约4500到约5500IU，从约9000到约11,000IU，从约13,500到约16,500IU，以及从约18,000到约22,000IU。该PEP中的淀粉酶活性(BPL处理之前或之后)可以是从约8100到约180,000IU，例如从约8000到约45,000IU，从约17,000到约90,000IU，从约26,000到约135,000IU，从约35,000到约180,000IU。该PEP中的蛋白酶活性(BPL处理之前或之后)可以是从约8000到约134,000IU，例如从约8000到约34,000IU，从约17,000到约67,000IU，从约26,000到约100,000IU，从约35,000到约134,000IU。在一个实施方案中，该脂肪酶活性的范围是从约4500到约5500IU，该淀粉酶活性的范围是从约8000到约45,000IU，并且该蛋白酶活性的范围是从约8000到约34,000IU。在另一个实施方案中，该脂肪酶活性的范围是从约9000到约11,000IU，该淀粉酶活性的范围是从约
17,000到约90,000IU，并且该蛋白酶活性的范围是从约17,000到约67,000IU。在又一个实施方案中，该脂肪酶活性的范围是从约13,500到约16,500IU，该淀粉酶活性的范围是从约26,000到约135,000IU，并且该蛋白酶活性的范围是从约26,000到约100,000IU。在还一个实施方案中，该脂肪酶活性的范围是从约18,000到约22,000IU，该淀粉酶活性的范围是从约35,000到约180,000IU，并且该蛋白酶活性的范围是从约35,000到约134,000IU。
在还一个实施方案中，该脂肪酶活性可以是约5,000到约30,000脂肪酶PhEur。

[0025] 该PEP中的淀粉酶/脂肪酶(以USP单位计)的比率的范围(BPL处理之前或之后)可以是从约1.8到约8.2，例如从约1.9到约8.2，以及约2.0到约8.2。该PEP中的蛋白酶/脂肪酶的比率的范围(BPL处理之前或之后)可以是从约1.8到约6.2，例如从约1.9到约6.1，以及约2.0到约6.1。

[0026] 在一个实施方案中，该PEP中的淀粉酶:脂肪酶的比率(BPL处理之前或之后)可以在从约1到约10，例如从约2.38到约8.75的范围内(其中淀粉酶分析是根据USP进行的)。该PEP中的蛋白酶:脂肪酶的比率(BPL处理之前或之后)可以在从约1.00到约8.00，例如从约1.86到约5.13的范围内(其中蛋白酶分析是根据USP进行的)。

[0027] 在一个实施方案中，该PEP含有脂肪酶类、蛋白酶类、以及淀粉酶类，其中(i)该PEP中的淀粉酶与脂肪酶的比率的范围是从约3:1到约6:1并且(ii)蛋白酶与脂肪酶的比率的范围是从约3:1到约6:1(如USP单位所测量的)。

[0028] 下表提供了另外的合适的胰腺酶混合物，其中脂肪酶类、蛋白酶类、以及淀粉酶类的量是以USP单位计。

[0029] 在另一个实施方案中，脂肪酶、蛋白酶、和淀粉酶的活性可以是以下表A和B中所描述的那些：表A
表B

[0030] 以下是一个用于转换淀粉酶、脂肪酶、和蛋白酶的单位的表。用于酶活性的单位的转换值
*只有游离的蛋白酶用于胰酶；总蛋白酶用于胰腺的提取物。
BP-英国药典；FIP-国际药学联合会；PhEur-欧洲药典。

[0031] 这些酶可以是浓缩的形式。这些酶可以是一种无定形粉末或结晶的形式。可以在制造过程中对一种PEP溶液进行过滤。BPL处理后PEP中的脂肪酶活性典型地是不小于约24USP Units/mg PEP，并且更优选地是不小于约39Units/mg PEP或者不小于约75USP Units/mg PEP。在一个实施方案中，BPL处理后PEP中的脂肪酶活性是从约86到约120Units/mg PEP。PBPL处理后PEP中的蛋白酶活性典型地是不小于约100Units/mg PEP，并且优选地是不小于约200Units/mg PEP或者不小于约240USP Units/mg PEP。在一个实施方案中，BPL处理后PEP中的蛋白酶活性是约280到约440USP Units/mg PEP。BPL处理后PEP中的淀粉酶活性典型地是不小于约100Units/mg PEP，并且优选地是不小于约
200USPUnits/mg PEP。在一个实施方案中，BPL处理后PEP中的淀粉酶活性是约210到约
570USP Units/mg PEP。

[0032] 在PEP中发现的有感染性的病毒颗粒或者一种有感染性的病毒可以是任何类型的，包括在猪源中发现的那些，例如PPV。PPV是一种无包膜的、小的DNA病毒(Bergeron等人，病毒学 (Virology)，1993，197(1)：86-98；以及J.Virol.1996 年4月；70(4)：2508-2515；Simpson等人分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，2002 315(5)：1189-98；Szelei等人2006.猪细小病毒(Porcine parvovirus)pp.434-445，在细小病毒(Parvoviruses)(Kerr等人，编辑)，Hodder Arnold Publ.，伦敦，英国)并且是在PEPs中发现的这些病毒中最显著的病毒。PPV具有高的环境稳定性程度，并且在制造过程中，它是耐水解酶和耐相对高的温度的，在一个宽的pH范围内保持感染性。由于PPV有高度耐受性的，它可以是一种用于在PEP中发现的其他病毒的模型病毒。

[0033] 其他可以在PEP中发现的无包膜病毒包括EMCV(猪脑心肌炎病毒，也称为MEV)、猪肝炎病毒(包括HEV(猪戊型肝炎病毒))、SVDV(猪水泡病病毒，也称为PEV9)、小囊泡疹病病毒、猪圆环病毒(包括PCV1(猪圆环病毒1)和PCV2(猪圆环病毒2))、猪轮状病毒(Rota A)、呼肠孤病毒(包括3型呼肠孤病毒，它也被称为Reo3)、手足口病病毒、猪捷申病毒1(PTV1，也称为PEV1)、猪腺病毒、以及猪呼吸道冠状病毒。也可以在PEP中发现包膜病毒，例如伪狂犬病病毒、VSV(水泡性口膜炎病毒)、IFA(A型流感病毒)、狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、传播性胃肠炎病毒、古典猪瘟病毒、西尼罗河病毒、猪痘病毒、汉坦病毒、猪巨细胞病毒、猪嗜淋巴疱疹病毒、猪内源性逆转录病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副粘病毒、和脑脊髓炎病毒。见来自于2008年12月召开的美国食品和药物管理局(FDA)抗病毒药物咨询委员会大会的信息，这些信息可以在万维网WorldWideWebfda.gov/ohrms/dockets/ac/cder08.html#AntiviralDrugs网址上找到。PEP还可能含有新出现的病毒，例如新出现的有包膜的或无包膜的外源因子(例如，埃博拉病毒)或者突变病毒。其他可以在PEP中发现的病毒包括假狂犬病毒、牛病毒性腹泻病毒、细小RNA病毒科病毒(包括猪细小RNA病毒科病毒)、呼肠孤病毒科病毒(包括猪呼肠孤病毒)、星状病毒科病毒(包括猪星状病毒科病毒)、腺病毒科病毒(包括猪腺病毒科病毒)以及肝炎病毒科病毒(包括猪肝炎病毒科病毒)。

[0034] 在一个实施方案中，如美国公开号2009/0226414中所描述的PPV FFID-感染5
性分析所测量的，有感染性的PPV病毒类的允许水平低于约10FFID50/g PEP(对应于约
4.5 3 2
10 TCID50)，优选地低于约10FFID50/gPEP，并且最优选地低于约10FFID50/g PEP。在另一个实施方案中，另一种有感染性的病毒，例如EMCV、HEV、SVDV、PCV1、PCV2、VSV、和IFA的
2
允许水平低于一种公布的分析技术的检出限(例如，小于约10 有感染性的病毒颗粒/g PEP)，并且优选地是约0有感染性的病毒颗粒/gPEP。病毒颗粒的水平可以在使用BPL处理PEP(如下面所讨论的)之前，之后或之前和之后进行测量。

[0035] 此外，该BPL可以作为一种抗微生物剂(例如，一种抗菌剂)。

[0036] 该PEP可以结合或形成于一种药用组合物中，例如，在与一种合适的药物赋形剂、稀释剂和/或载体的混合物中，该药物赋形剂、稀释剂和/或载体是考虑到预期的给药途径和标准的药物惯例而选定的。本发明的这些组合物可以配制成任何方便在人体中使用的给药方式。该PEP可以作为一种口服剂形式来给药。口服剂形式包括粉末、片剂、迷你片、微片、无包衣的剂型、有包衣的剂型、微球、小颗粒、胶囊形片剂、软胶囊、胶囊、以及药膳。片剂，例如，可以通过本领域公知的压缩技术来制作。典型地，这些酶以肠溶迷你微球的形式通过口服给药，以避免酸介导的脂肪酶灭活并且确保酶的胃排空与营养物质的胃排空平行。

[0037] 合适的药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，稀释剂类、粘合剂类、润滑剂类、助流剂类、崩解剂类以及着色剂类。其他组分，例如防腐剂、稳定剂、染料和调味剂可以包括在该剂型中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、抗坏血酸以及对羟基苯甲酸的酯类。还可以包括抗氧化剂和悬浮剂。药学上可接受的赋形剂、稀释剂、和治疗用途的载体在药物领域是公知的，并且在例如，在Remington:The Science and Practice of Pharmacy(药学科学和惯例)，利平科特·威廉斯和威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(A.R.Gennaro编辑2005))中进行了描述。
β-丙内酯(BPL)

[0038] β-丙内酯(BPL、2-丙醇酸丙酯)是内酯系列的一种小的有机化合物，具有一个四元环。它是一种透明的无色液体，具有微甜的气味，并且极易溶于水。由于它的高的水溶性和小的体积，BPL容易在具有高粘度和多粒状物质的溶液(例如具有高蛋白含量的溶液)中扩散。β-丙内酯缓慢地与水反应并且水解以生成一种无毒的化合物3-羟基丙酸(羟基丙烯酸(hydracryclic acid))。这样，BPL的活性是自我限制的并且没有残留的毒性污染物。

[0039] 根据一个实施方案，将BPL加到一种含水的或有机的、含有一种PEP的溶液或悬浮液中，该PEP的量可有效地将病毒感染性减少至向一位患者施用该PEP的可接受的水平。例如，在一个实施方案中，将从约0.004%到约1.0%(v/v)的BPL加到一种含有从约100到约200mg PEP/ml的溶液中。在优选的实施方案中，将从约0.1到约0.8%(v/v)的BPL加到一种含有从约100到约200mg PEP/ml的溶液中或者将从约0.2到约0.4%(v/v)的BPL加到一种含有从约100到约200mg PEP/ml的溶液中。不希望受任何理论的限制，发明人推理认为BPL通过将病毒烷化对其进行灭活。因此，一种用BPL处理后具有减少的病毒感染性的PEP可以含有灭活的病毒。

[0040] 可以将该含有BPL的PEP孵育约30分钟到约48或约72小时(或更长)。根据一个实施方案，在例如，从约5℃到约50℃、从约15℃到约40℃、或室温或约25℃的温度下，将该含有BPL的PEP孵育从约24到约72小时，或者约48小时。在另一个实施方案中，在例如，从约15℃到约40℃或室温或约25℃的温度下，将该含有BPL的PEP孵育从约15分钟到约2小时(例如，约30分钟)。在另一个实施方案中，在约4℃的温度下，将该含有BPL的PEP孵育从约15分钟到约12小时(例如约4小时)。

[0041] 孵育后，可以使该BPL灭活和/或从该PEP去除。通过在含水的培养基中孵育使BPL灭活，以形成无毒的3-羟基丙酸。水中的BPL的最大半衰期近似地是在25℃温度下210分钟或更少(Hoffman和Warshowsky,作为消毒剂的β-丙内酯蒸气(Beta-Propiolactone Vapor as aDisinfectant),应用微生物学(Appl Microbiol)1958,6:358–362)。BPL的灭活速率取决于环境因素，例如pH、温度和缓冲剂的离子强度(β-丙内酯作用下对于病毒悬浮液感染性的病毒基因组(V)理化筛选条件的选择性灭活原理(Budowsky和 Zalesskaya,Principles of selective inactivation ofviral genome(V)Rational selection of conditions for inactivation of the viralsuspension infectivity to a given extent by the action of beta-propiolactone), 疫苗(Vaccine)1991,9:319-325)。通过水解并且通过靶向于用于灭活的分子的烷化反应来消耗BPL。因此，在20℃温度下孵育8小时后，BPL的水平可以减少至少8倍。

[0042] 在用BPL处理后具有减少的病毒感染性的、含有(i)一种或多种胰腺酶以及(ii)3-羟基丙酸、BPL、或它们的混合物的PEP所具有的病毒感染性比末用BPL处理过的制剂的病毒感染性要低至少约1log，低至少约2logs，低至少约3logs，低约1log，低约2logs，或低约3logs，如以下所讨论的测量病毒感染性活性的方法中的其中之一所测量的，例如美国专利公开号2009/0226414中所描述的PPV FFID-感染性分析。该PEP的有关的病毒感染性可以是在该PEP中的无包膜病毒、有包膜病毒、所有病毒、或一种具体的病毒(例如，PPV或EMCV)的病毒感染性。

[0043] 一种使该BPL快速灭活的方法是加入一种BPL灭活剂(如硫代硫酸钠)。以下实例中终浓度为100mM的硫代硫酸钠足以灭活该BPL，以在4℃温度下在几分钟内完成。在一个实施方案中，用于中和BPL的硫代硫酸钠的最小浓度是约1.7-倍摩尔过量(例如，0.4%的BPL(v/v)(63.61mM)溶液将与至少十分之一体积的1.08M的硫代硫酸钠溶液混合)。

[0044] 含有BPL的PEP还可以进行冷冻和冻干以使该BPL灭活。可以对样品进行速冻以停止使用BPL的PPV的灭活反应。在存储该冷冻的材料时，在冰存在的情况下，BPL可以缓慢地降解并且部分蒸发。另外的PPV灭活还可以在这些条件下缓慢地发生。例如，这些制剂可以被放置在丙酮和干冰的混合物中进行速冻，接着在-80℃温度下存储，然后在-45℃温度下冻干约二天。.在该实验中冻干的长度取决于样品的体积，典型地，体积越小，所需的时间越少。测量病毒感染性活性

[0045] 在初始的和处理过的PEP中的病毒的活性可以通过本领域中已知的任何方法进行。优选地，对在处理过的PEP中的一种或多种病毒的病毒感染性进行测量。在一个实施方案中，对PPV、EMCV、PCV-2和/或其他病毒的病毒感染性进行测量。

[0046] 在一个实施方案中，感染性分析使用在组织培养孔中生长的细胞培养物，样品施加到这些细胞培养物中并且观察到细胞感染。

[0047] 例如，在96孔板上对二种制剂的PPV或另一种病毒进行检测，在另一个平行板上孵育阳性对照品。对于PPV，在应用前，在细胞培养基中，将这此样品逐个地稀释(例如，在每个步骤中进行1:4稀释，总共8个稀释度)，并且在37℃温度和5%CO2下与细胞培养物孵育至少5天。在移出样品并且用多聚甲醛固定这些细胞后，使用标准的免疫荧光分析，通过一种抗PPV抗体，对存在于每个孔中PPV(或其他)病毒感染进行监测。在表中记录含有阳性染色的细胞的孔的数量。根据以下Karber公式计算荧光灶传染性剂量(FFID50)：(D-0.5d+d(S))
FFID50=10 ;
其中D等于表明100%感染的最高稀释度的log10，基于具有给定的稀释度的所有的复制试验的每个孔中存在至少一个有传染性的荧光灶；d等于的该稀释因子的log10；并且S等于出现感染的孔的总数量与每个稀释度的孔的数量的比率。对于1-克干的PEP，例如，胰脂肪酶，样品，在考虑了加工后的样品体积和稀释度后，重新计算所有数据。在某此实施方案中，使用六个平行孔将该分析重复多次以量化有感染性的病毒的水平。

[0048] 用来测量病毒感染性的其他分析法包括TCID50分析法，如Hierholzer,J.C.,Killington,R.A.,1996.病毒分离和定量(Virus isolation andquantitation)In:Mahy,B.W.J.,Kangro,H.O.(编辑),病毒学方法手册(Virology methods manual.)学术出版社(Academic Press)，伦敦，25–46页)中所讨论的。

[0049] PEP的这些酶的活性可以对用于检测病毒感染性的细胞是有毒的并且这些酶还可以用其他方式来抑制测试细胞系的病毒感染。存在于这些制剂中的其他化合物还可以干扰病毒(例如PPV)感染。由于细胞增殖对于PPV复制是必须的，这些细胞抑制剂或有毒的酶中的任何一种的存在可以进一步减少病毒感染的效力并且防止精确确定PEP样品中的病毒感染性。因此，在测定PEP活性前对PEP样品进行处理是有帮助的。处理后，例如以下所描述的，这些样品可以溶解在细胞培养基中，它们的体积等于或小于原始样品体积以保持该感染性分析的灵敏性。

[0050] 通过引用结合于此的美国专利公开号2009/0226414提供了一种可再现的和有效的、用于检测一种酶制剂(例如，胰腺酶制剂)中的有感染性的无包膜病毒(例如，PPV)的方法，该方法是通过在测定它的病毒感染性之前对该制剂进行处理而实现的。这种方法保存了有感染性的无包膜病毒，同时基本上消除了来自这些PEP样品的有毒的酶材料。

[0051] 这种方法的步骤包括：(a)用氯仿对该制剂的一个样品提取至少二次，以产生一个澄清的、具有一个上层相和一个下层相的样品；
(b)用聚乙二醇(PEG)对步骤(a)的上层相进行沉淀；
(c)将步骤(b)的产物悬浮在一种缓冲剂中；
(d)用PEG对步骤(c)的产物进行沉淀；
(e)将步骤(d)的产物悬浮在一种溶液中；
(f)通过氯仿将过量的PEG和微粒从产物(e)中去除，这使得(i)在步骤(e)中，悬浮在小10-倍的体积中以使总灵敏度增加高达10倍；并且(ii)从最毒的样品的最小稀释的步骤中去除残余的干扰材料；并且
(g)检测该溶液中有感染性的病毒的存在或者测量该溶液中有感染性的病毒的量值。

[0052] 在某些情况下，热灭活、长时间的存储、超离心、以及其他提取方法对于在测量有感染性的病毒之前对样品进行处理也可以是有用的。

[0053] 可以使用TCID50分析对其他病毒(例如PCV-2和EMCV)的灭活的水平进行测量(Hierholzer,J.C.,Killington,R.A.,1996.病毒分离和定量(Virus isolation and quantitation.)In:Mahy,B.W.J.,Kangro,H.O.(编辑),病毒学方法手册(Virology methods manual.)学术出版社，伦敦，25-46页)。测量酶活性

[0054] 可以通过使用美国药典(United States Pharmacopeia，USP)的论著的方法对PEP的酶(例如，蛋白酶类、脂肪酶类和淀粉酶类)的酶活性进行测定(美国药典和国家处方集(USP 31/NF 26)2008.Rockville罗克维尔(MD)：美国药典委员会(United States Pharmacopeial Convention,Inc.)。使用PEP处理的方法

[0055] 具有减少的病毒感染性的该PEP或含有具有减少的病毒感染性的该PEP的一种药用组合物能够以一个有效量进行给药，以控制病人的脂肪泻或者治疗患有局部的或完全的胰腺外分泌功能不全的病人。胰腺功能不全可以是由以下病症导致的：囊性纤维病病(CF)，使用酒精或其他原因引起的慢性胰腺炎，严重的急性坏死性胰腺炎，胰腺癌，外科手术(进行或不进行Wirsung管注入的胰十二指肠切除术或Whipple’s手术，胰全切除)，阻塞(胰腺的和胆管结石、胰腺的和十二指肠肿瘤、导管狭窄)，其他胰腺疾病(例如，遗传性、外伤后和同种移植性胰腺炎，血色素沉着病、舒瓦克曼综合征(Shwachman’s Syndrome)、脂过多症、和甲状旁腺功能亢进)，胰腺外疾病(例如腹腔疾病、克罗恩氏病、不良混合型病征(Billroth II胃切除术、其他类型的胃分流术、胃泌素瘤)，以及I型和II型糖尿病。

[0056] “治疗有效量”总体上是指当给予一位病人(例如一个人)用于治疗一种状态、障碍或病状时足以实现这样的治疗的一个化合物或组合物的量。“治疗有效量”将取决于该化合物或组合物，该疾病和它的严重程度以及待治疗的动物的年龄、体重、身体状况和响应性。实例

[0057] 进行二组实验来研究用BPL使PPV和EMCV灭活。实例1-7表明BPL使PEP制剂中的PPV和EMCV灭活。第二组实例(实例8至11)测定在25℃温度下与BPL一起孵育30分钟并且随后通过硫代硫酸钠或者通过冷冻后再冻干使残余的BPL灭活后，PEP制剂中的病毒灭活的程度。对于实例8至11中所描述的样品，还测定了这些BPL处理过的PEP的酶的活性。实例1：通过浓度在0.1-0.8%(v/v)之间的BPL使PEP制剂中的PPV灭活。使用一种稀释法对PPV进行滴定。

[0058] 将来自2个不同批次的胰脂肪酶粉末分别溶解在100mM Tris中，pH为8.3，浓度为100mg/ml。将2ml的未纯化的PPV病毒原种(stock)(使用标准协议制备的Arella等人，细小病毒的物理化学性质、生产、和纯化(Physicichemical properties,production,and purification ofparvoviruses).1990,In Tijssen,P.(编辑),细小病毒的CRC手册(CRChandbook of parvoviruses).博卡拉顿(Boca Raton)，佛罗里达州，CRC出版社(FL:CRC Press,11-30))加到38ml的该胰脂肪酶溶液中。在室温下通过缓慢摇动将该病毒与该PEP混合一天。从PPV添加(spiked)的胰脂肪酶原种取多个等分部分，并且在室温(20℃)下将每个等分部分与不同浓度的BPL(从密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)得到的)(除对照品外)一起孵育48小时。由于添加的病毒的滴度很高，通过使用1,000倍或更多的连续的稀释度对PPV感染性进行滴定来测量病毒灭活的水平。
使用如美国专利公开号2009/0226414的PPV FFID-感染性分析中所描述的荧光分析法来测定FFID50。

[0059] 结果显示在表1中。表1：使用浓度为0.1％-0.8％(v/v)的BPL使PPV灭活。
使用稀释法对PPV进行滴定。
*低于103FFID50/g的检测限度
实例2：用浓度在0.1％0.8.％之间的BPL使EMCV灭活

[0060] 将四个不同批次的胰脂肪酶粉末溶解在100mM Tris中，pH为8.3，浓度为100mg/ml。将EMCV病毒原种(由Meng XJ，Paul PS，VaughnEM，Zimmerman JJ.用于检测猪的脑心肌炎病毒的放射性标记的核酸探针的发展(Development of a radiolabeled nucleic acid probe for the detection ofencephalomyocarditis virus of swine).J Vet Diagn Invest(兽医诊断调查).1993 5：254-8)与胰脂肪酶混合，在室温下缓慢地摇动一天，这样使得胰脂肪酶的终浓度为100mg/ml。从EMCV添加的胰脂肪酶原种中取多个等分部分，并且在室温(20℃)下将每个部分与不同浓度的BPL(从密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司得到的)一起孵育48小时。通过使用连续的稀释度对作用于VERO细胞的EMCV感染性进行滴定并且测定TCID50来测量失来活的水平，TCID50的测定如Hierholzer,J.C.,Killington,R.A.,1996..病毒分离和定量(Virus isolation and quantitation)In:Mahy，B.W.J.,Kangro,H.O.(编辑),病毒学方法手册(Virology methods manual).学术出版社，伦敦，25-46页所描述的。

[0061] 结果显示在表2中。表2：使用浓度在0.1-0.8%(v/v)之间的BPL使EMCV灭活
使用稀释法对EMCV进行滴定。
3
*低于10TCID50/g的检测限度
实例3：通过浓度在0.04-0.25.%(v/v)之间的BPL使PEP制剂中的PPV灭活。使用氯仿/PEG法对该PPV进行滴定。

[0062] 重复实例1中所描述的实验，除了如美国专利公开号2009/0226414中所描述的用PEG纯化的PPV进行感染性分析。

[0063] 结果显示在表3中。有时观察到更高的残余感染性，这可能是由于这些方法的敏感性增加(如实例1中使用了小于10倍的初始稀释度而不是1,000倍的稀释度)。表3显示0.25%的BPL使病毒灭活至约初始感染性的0.02%(减少约5,000至50,000倍)。表3：通过浓度在0.04%到0.25%之间的BPL使PPV灭活。使用氯仿/PEG法对PPV进
行滴定
实例4：通过浓度为0.04到0.25%(v/v)的BPL使PEP中的内源性PPV灭活。

[0064] 重复实例1中所描述的实验，除了不添加额外的PPV。像实例3一样，PEG/氯仿纯化后进行感染性分析。

[0065] 结果显示在表4中。表4显示BPL使该PEP的内源性PPV灭活。在实例3中，可能测量到0.002%的残余感染性(即，0.25%的BPL时，约50,000倍灭活)；这在实例4中不可能实现，因为没有足够的内源性病毒来测量全量程的灭活。使用美国专利公开号2009/0226414中所描述的PPV FFID-感染性分析，63FFID50/g PEP是在这个实验中可能检测到的病毒的最低水平。表4：通过具有0.04vol.%到0.25vol.%的浓度的BPL使内源性PPV灭活。
使用氯仿/PEG提取法对PPV进行滴定。
*低于63FFID50/g PEP的检测限度
实例5：使用浓度在0.004到0.4%(v/v)之间BPL使更高浓度的PEP中的PPV灭活。使用稀释法对PPV进行滴定。

[0066] 这个实验的重点是测量增加的PEP浓度对灭活过程的效率的影响并且评价BPL的更低浓度范围。

[0067] 将PPV病毒原种(使用标准协议制备的(Arella等人，细小病毒的物理化学性质、生产、和纯化).1990,In Tijssen,P.(编辑),细小病毒的CRC手册.博卡拉顿，佛罗里达10
州，CRC出版社11-30)用水稀释并且将这个溶液(含有1.42x10 FFID50PPV病毒)用来悬浮0.5克PEP粉末以使终浓度为200mg PEP/ml。

[0068] 添加BPL之前，管在25℃温度下孵育1小时。将BPL直接加到该PEP溶液中(为了最终浓度为0.4vol.%)或者为了最终浓度分别为0.04vol.%和0.004vol.%，将其首先稀释十倍和一百倍。添加BPL之后，该溶液进一步混合并且在25℃温度下孵育一段预定的时间(1、2、4、6、或8小时)。每个灭活实验的当天制备硫代硫酸钠溶液。BPL灭活的时间期满后，将硫代硫酸钠加到该PEP溶液中，充分混合并且在4℃温度下孵育至少6小时以淬灭过量的BPL。这个步骤后，进行如美国专利公开号2009/0226414中所描述的感染性滴定实验。对于每个时间点使用三个平行样本来进行所有的实验。表5：使用浓度在0.004到0.4%(v/v)之间的BPL使PPV灭活。使用稀释法对PPV进
行滴定。
实例6：用0.8%(v/v)的BPL在4℃温度下使PPV灭活。

[0069] 在4℃温度下用0.8%(v/v)的BPL对实例1中所制备的样品处理四小时。表6：用0.8%(v/v)的BPL在4°温度下使PPV灭活。使用稀释法对PPV进行滴定。
实例7：在4℃温度下用0.4%的BPL处理PEP样品使PPV灭活的动力学。

[0070] 在4℃温度下在一种含水的介质(即水和异丙醇的混合物)中对于用与实例1中所描述的方法相同的方法制备的样品进行处理。通过稀释法确定PPV感染性，并且如表7所示出的，处理45分钟后可以得到2log的减少量。表7：在4℃温度下用0.4%的BPL处理后平均PPV Log的减少量(PEP浓度为100mg/
mL)
实例8至11

[0071] 通过不时地混合一个50-ml的塑料管将4.5g胰脂肪酶(PEP)粉末溶解在44ml冰冷的100mM Tris中(pH为8.3)，除了摇动时，这个管大部分时间放置在冰上。向该溶解的样品中加入1ml(2x0.5ml)的PPV原种(使用标准协议在加拿大魁北克的Institut National de la RechercheScientifique制备的(Arella等人，细小病毒的物理化学性质、生产、和纯化.1990,In Tijssen,P.(编辑),细小病毒的CRC手册.博卡拉顿，佛罗里达州，CRC出版社)107FFID50/ml，见实例8和表8)并且再混合10分钟。

[0072] 将溶解的胰脂肪酶的三个部分转移到管(A-C)中，并且放在冰上，同时(A)(没有BPL，对照品)，(B)(0.4vol%的BPL)，或者(C)(0.8vol%的BPL)加到它们中。通过一个涡流机进行短暂的混合后，这些管在25℃温度下孵育30分钟。孵育结束时，将这些管转移到冰上并且立刻将四个部分从每个实验条件转移到新的管(a-d)中。将这些管放到丙酮/干冰的混合物中进行速冻。随后，在-80℃温度下贮存这些样品。

[0073] 来自于这些残余溶液，在含有硫代硫酸钠、并且补充了微量的氯仿的细胞培养基中将每个实验的等分部分(使用三份)稀释100倍。在进一步稀释来确定FFID50感染性前，样品短暂地混合并且在4℃温度下放置至少6小时。见实例9。

[0074] 上述的实验重复二次以上(总共：实验1-3)。

[0075] 这些冷冻的样品在-45℃温度下冻干二天，并且这些胰脂肪酶粉末在4℃-10℃温度下放置。将所有实验的样品a到b溶解在水中。使用稀释的样品进行感染性测量，400倍稀释的样品用作最低的稀释度步骤来确定FFID50。为了很容易地比较不同实验的结果，所有获得的感染性数据被转换成特定的感染性(FFID50/克PEP).见实例10和表Table 10。

[0076] 使用USP 31专论的方法对来自所有实验的样品c到d的脂肪酶、蛋白酶、和淀粉酶的酶活性进行测试。见实例11和表11。实例8的结果：原种PPV的生产和滴定

[0077] 生产并且滴定新制备的病毒原种。添加(spiking)后还对从PEP样品中回收的病毒进行测定。从这些样品中回收的等效的PPV滴度(表8)。表8：PPV原种的感染性
实例9的结果：通过BPL使PPV灭活以及后续的使用硫代硫酸钠使BPL灭活

[0078] 表9显示了在25℃温度下通过BPL使PPV灭活30分钟以及后续的通过将含有BPL的PEP溶液与硫代硫酸钠一起在4℃温度下孵育至少6小时使BPL灭活的结果。如上所讨论的，添加PPV后BPL灭活的三个独立实验之后通过硫代硫酸钠使BPL灭活(每个实验有三个平行)。表9：通过BPL使PPV灭活，接着使用硫代硫酸钠使BPL灭活
注释0*意思是在检测限度以下
实例10的结果：通过BPL使PPV灭活以及后续的样品的冷冻/冻干以使BPL灭活。

[0079] 表10显示了通过BPL在25℃温度下使含有PPV的PEP样品灭活30分钟，接着通过冷冻后冻干使BPL灭活的结果。表10：通过BPL使PPV灭活(从冷冻的和冻干的样品测量的)
0*意思是在检测限度以下
实例11的结果：BPL处理以及样品冷冻/冻干后的酶活性

[0080] 表11显示了对于在25℃温度下BPL处理30分钟接着进行冷冻和冻干(与实例10中的样品进行相同的处理)后该胰脂肪酶的等分部分的脂肪酶、蛋白酶、和淀粉酶的活性。表11：BPL处理、冷冻、和冻干后的酶活性
这些结果的精确度在5%-10%之间。
实例8至11的讨论。

[0081] 使用BPL接着用硫代硫酸钠处理使PPV灭活后立即对这些胰脂肪酶样品进行测试时，0.4vol%的BPL存在下，在室温下孵育30分钟时，病毒感染性减少60倍以上。而且，在相同条件下，0.8%的BPL使PPV灭活三个数量级。见表9。

[0082] 如表11中所示的，用0.4%的BPL和0.8%的BPL处理的这些冻干的样品保留了大部分的脂肪酶、蛋白酶、和淀粉酶的活性。这些结果表明PEP能够在病毒灭活后保持高的酶活性。***

[0083] 除另有定义外，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含意。在此提及的所有公布、专利申请、专利、以及其他参考

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