用于检测水疱性口炎病毒的引物、试剂盒及制备方法
阅读：321发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于检测水疱性口炎病毒的引物、试剂盒及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种可用于检测 水 疱性口炎病毒的引物，由这些引物制成的检测 试剂 盒 和制备方法。本发明的用于检测 水疱性口炎 型病毒的引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。相关的实验表明，用本发明的引物序列可特异性快速扩增VSV的核酸，通过核酸 电泳 检测到特异性条带，同时具有特异性。本发明可在制备快速 鉴别 VSV的GeXP 诊断试剂盒 中应用，并在水疱性口炎流行病学研究中应用。，下面是用于检测水疱性口炎病毒的引物、试剂盒及制备方法专利的具体信息内容。
用于检测水疱性口炎病毒的引物、试剂盒及制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 水疱性口炎是由弹状病毒科（Rhabdoviridae）水泡病毒属（Vesiculovirus）的水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）引起的多种哺乳动物的高度接触性传染病，可以感染牛、马、猪等家畜。该病可以引起感染动物舌部、口腔、蹄部和乳房出现水泡以及溃疡，并使患处丧失生产力，且该病很难在临床症状上和口蹄疫进行区别。水疱性口炎并不是新出现的疾病，早在1801年美国东部地区就出现了该病的流行，随后不断在美国地区流行。二十世纪以来，该病相继在美洲、欧洲以及非洲地区出现流行，造成了严重的经济损失，此外该病也可以感染人，引起短暂的衰竭性疾病，因此该病被世界卫生组织（OIE）列为A类传染病，在我国该病属于外来病，在进出口检疫中被列为二类传染病。
[0003] VSV主要依据发病季节、发病率和病死率以及在病畜的特征性症状进行初步诊断。该病临床症状与猪口蹄疫、猪水疱病等非常相似。因此，仅通过上述方法并不能鉴别该病，还需要结合实验室诊断方法进一步确诊。
[0004] 目前实验室诊断VSV主要有下述方法：① 根据VSV的细胞嗜性来判断。由于VSV可在多种脊椎动物细胞如非洲绿猴肾细胞（VERO）、幼仓鼠肾细胞（BHK-21）和IB-RS-2细胞上生长，很快引起明显的细胞病变（CPE），18~24h即可引起细胞快速圆缩、脱落。而其感染昆虫细胞则引起持续性感染，不会产生CPE。口蹄疫病毒（FMDV）只能在BHK-21和IB-RS-2产生CPE，猪水疱病病毒（SVDV）只能在IB-RS-2产生CPE（农业部畜牧局，译.哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].北京：中国农业出版社，2002.）。但是该方法由于需要进行不同细胞的培养，因此工作量较大，非常繁琐费时。②根据接种动物临床表现判断。将VSV接种于猪蹄的冠状带或口鼻部，而马和牛多在舌皮内接种，接种后2～4d，可在嘴、乳头和蹄部的上皮组织见到水疱性损害，但接种于牛肌肉内则不发病。通过8~10日龄鸡胚的尿囊膜对2~7日龄未断乳小鼠的任何途径接种或3周龄小鼠的脑内接种，皆能使水疱性口炎病毒增殖分离出来，被接种动物会在2~5d内死亡。还可以通过乳鼠和乳兔接种试验来鉴别VSV、FMDV、SVDV和VEV这4种病毒。VSV动物接种于2日龄和7～9日龄乳鼠及乳兔的试验表明，乳兔不发病，乳鼠均发病；FMDV用病料接种2日龄和7～9日龄乳鼠及乳兔均发病；SVDV接种2日龄和7～9日龄乳鼠及乳兔，7～9日龄乳鼠不发病，其余均发病；VEV用病料接种2日龄和7～9日龄乳鼠及乳兔均不发病（蔡宝祥.家畜传染病学［M］.北京：中国农业出版社，2002.）。该方法由于需要饲养动物，而且接种病毒的剂量相对较大，因此非常耗时，同时工作量非常大且耗资较高。③血清学诊断。血清学方法能够克服上述方法的一些诸如需要实验动物等不足。如VSV的中和试验（NT）不但可以用来检测VSV抗原或抗体，而且可以对 VSV 进行定性。但是但用于急性感染和早期诊断时，其敏感性会有所下降，而且该试验要求严格无菌操作，需活的病毒及细胞培养，耗费时间较长，操作复杂。
[0005] 而酶联免疫吸附试验 （ELISA）则是目前 VSV和其他水疱病病毒血清型鉴定最广泛选用的诊断方法，也是国际贸易指定的抗原检测试验。用IN血清型3个亚型代表株的病毒颗粒制备的一套多价兔/豚鼠抗血清的 ELISA 方法，可以鉴定 VS S的IN血清型的所有毒株；对于VSV的NJ毒株的检测，可利用单价兔/豚鼠抗血清试剂盒（Alonso A, Martins M, Gomes M P D, et al. Development and evaluation of an enzyme -linked immunosorbent assay for detection, typing and subtyping of vesicular stomatitis virus [J]. J Vet Diagn Invest,1991,3：287-292.；Ferris N P, Donaldson A I. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of VSV antigen ［J］. Vet Microbiol, 1988，18：243-258.）。但是由于这些方法灵敏度均不是特别高，而且该试剂盒昂贵，而且当混合感染的时候容易出现假阳性。而补体结合试验 （CFT）：可用于早期抗体的定量 ，但一般在感染后5～8d才能检测到抗体。该方法也是国际贸易中进行VSV检测的指定方法之一，当得不到ELISA 试剂时，可进行CFT。补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁琐。而且猪血清在灭活后通常仍会有前补体物质存在，从而限制了 CF 在其检测中的应用，所以必须要有充足的正常猪血清对照以排除对CF试验结果的干扰。④基于分子生物学诊断技术也被用于VSV的诊断之中。如分子杂交技术，该方法是首先标记核酸的 1 条链，再通过核酸分子杂交方法检测待查样品中是否有与标记的核酸分子同源或部分同源的碱基序列，但是该方法操作也非常繁琐，而且不能进行规模化检测。RT-PCR技术：RT-PCR是近年来发展起来的一种快速诊断技术，具有快速（可在1 d内完成）、准确、安全、重复性较好等优点，相对来说适合没有 VSV 的国家和地区的口岸检疫。2000年Hole等人（Hole K, Velazquez-Salinas L, Clavijo A.Improvement and optimization of a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the detection and typing of Vesicular stomatitis virus. J Vet Diagn Invest. 2010 May;22(3):428-33.）以及2011年Wilson等人（Wilson WC, Letchworth GJ, Jiménez C, Herrero MV, Navarro R, Paz P, Cornish TE, Smoliga G, Pauszek SJ, Dornak C, George M, Rodriguez LL. Field evaluation of a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of Vesicular stomatitis virus. J Vet Diagn Invest. 2009 Mar;21(2):
179-86.）分别建立了多重RT-PCR方法。该方法是首先对 VSV 基因组中的某些小片段进行扩增，然后再被用来检测组织、水疱液样品和细胞培养物中 VSV的 RNA。检测临床样品时是比病毒分离或补体结合试验更敏感、更快速的方法，但不能确定是否有病毒感染，故不作为筛检 VS 病毒病例的常规方法。该方法与其他方法相互结合又产生了许多新检测技术，如半巢式 PCR（Hofner M C, Carpenter W C, Ferris N P, et al. A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid［J］.J Virol Methods,1994，50：11-20.）、RT-PCR-ELISA、实时荧光定量 RT-PCR（花群义，徐自忠，杨云庆.TaqMan RT-PCR 对水疱性口炎病毒的鉴定检测[J].动物医学进展，2004，25（2）：64-68.）和多重 RT-PCR 技术（钟金栋，花群义，夏雪山，等.多重 PCR 同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒［J］.动物医学进展，2006，27（7）：55-
58.）等。Krumbholz( Krumbholz A, Wurm R, Scheck O,et al. Detection of porcine teschoviruses and enteroviruses by LightCycler realtime PCR [J].J Virol Methods , 2003, 113 (1): 51.)和Reid等(Reid SM, Ferris NP, Hutchings GH,et al . Evaluation of realtime reverse transcription polymerase chain reaction assays for the detection of swine vesicular disease virus [J]. J Virol Methods , 2004, 116 (2): 169.)建立了使用LightCycler仪，通过散射和激发荧光的比例对扩增产物进行定量的检测VSV 的real-time PCR，该分析法通过在一个工作日内提供敏感、定性的结果是对传统诊断程序的补充，并且被污染的危险比常规RT-PCR低。 Lin等( Lin F, Mackay DK, Knowles NJ. Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse transcription polymerase chain reaction [J].J Virol Methods ,
1997, 65 (1): 111.)建立了nested RT-PCR分析法，该法比从组织培养病毒分离法敏感， 但是，nested RT-PCR系统被污染的危险系数大，需要非常严格的条件来降低交叉污染。
179-86.）分别建立了多重RT-PCR方法。该方法是首先对 VSV 基因组中的某些小片段进行扩增，然后再被用来检测组织、水疱液样品和细胞培养物中 VSV的 RNA。检测临床样品时是比病毒分离或补体结合试验更敏感、更快速的方法，但不能确定是否有病毒感染，故不作为筛检 VS 病毒病例的常规方法。该方法与其他方法相互结合又产生了许多新检测技术，如半巢式 PCR（Hofner M C, Carpenter W C, Ferris N P, et al. A hemi-nested PCR assay for the detection and identification of vesicular stomatitis virus nucleic acid［J］.J Virol Methods,1994，50：11-20.）、RT-PCR-ELISA、实时荧光定量 RT-PCR（花群义，徐自忠，杨云庆.TaqMan RT-PCR 对水疱性口炎病毒的鉴定检测[J].动物医学进展，2004，25（2）：64-68.）和多重 RT-PCR 技术（钟金栋，花群义，夏雪山，等.多重 PCR 同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒［J］.动物医学进展，2006，27（7）：55-
58.）等。Krumbholz( Krumbholz A, Wurm R, Scheck O,et al. Detection of porcine teschoviruses and enteroviruses by LightCycler realtime PCR [J].J Virol Methods , 2003, 113 (1): 51.)和Reid等(Reid SM, Ferris NP, Hutchings GH,et al . Evaluation of realtime reverse transcription polymerase chain reaction assays for the detection of swine vesicular disease virus [J]. J Virol Methods , 2004, 116 (2): 169.)建立了使用LightCycler仪，通过散射和激发荧光的比例对扩增产物进行定量的检测VSV 的real-time PCR，该分析法通过在一个工作日内提供敏感、定性的结果是对传统诊断程序的补充，并且被污染的危险比常规RT-PCR低。 Lin等( Lin F, Mackay DK, Knowles NJ. Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse transcription polymerase chain reaction [J].J Virol Methods ,
1997, 65 (1): 111.)建立了nested RT-PCR分析法，该法比从组织培养病毒分离法敏感， 但是，nested RT-PCR系统被污染的危险系数大，需要非常严格的条件来降低交叉污染。
发明内容
[0006] 本发明的第一个目的是公开4条可用于检测水疱性口炎病毒的引物；第二个目的是公开采用上述检测引物的的试剂盒，第三个目的是提供本发明的试剂盒非疾病诊断目的使用方法使用方法。
[0007] 本发明的用于检测水疱性口炎型病毒的引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。
[0008] 本发明的水疱性口炎病毒的检测试剂盒中包括有前述的四条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4，其中SEQ ID No.3的5’端添加有Cy5荧光标签。
[0009] 本发明的试剂盒非疾病诊断目的使用方法是以被检样品的RNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中268bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的阴阳性。
[0010] GeXP多重基因分析系统（GeXP Genetic Analysis System)是美国Beckman Coulter公司研发的用于多基因表达定量分析的平台。该系统将毛细管电泳分离技术和高灵敏的激光诱导荧光技术相结合，使基因表达定量分析实现了更高的灵敏度和更快的速度。该系统以mRNA为模版，在同一PCR反应体系中由荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物引发的多种PCR反应，随后经毛细管电泳分离技术进行分析。该方法具有高通量、高准确性、高灵敏度等优点，目前已被逐步应用于各种疾病病原的检测中。在我国已经先后建立了水泡带状疱疹病毒、流感病毒、呼吸道病毒、手足口病以及乳头瘤病毒的GeXP多重PCR检测体系，但是目前国内外尚无基于GeXP鉴别诊断VSV试剂盒和检测方法的报道，同样单独或者联合使用可以鉴别检测口VSV的GeXP方法也尚无报道。
[0011] 本发明中VSV的引物及扩增片段位于L片段区域，L基因在VSV中并不是十分保守的，但是有研究发现该基因中存在着两个血清型都比较保守的区段，并且该区段十分适合引物设计从而来进行检测。Kate曾经利用VSV的L基因设计引物成功的对VSV的两个血清型进行了检测。同时，该片段完全可以用于VSV，猪水泡病病毒，口蹄疫病毒的鉴别诊断。因此，本发明选择VSVL序列作为靶基因的区域，根据GeXP多重PCR检测体系引物的要求设计VSV的特异性引物。
[0012] 相关的实验表明，本发明的序列SEQ ID No.1（VSV-F）和SEQ ID No.2（VSV-R）可特异性快速扩增VSV的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但同等条件下不能扩增口蹄疫A型病毒、口蹄疫病毒Asia 1病毒、口蹄疫O型病毒和猪水泡病病毒的核酸。
[0014] 图1为本发明的VSV引物特异性验证的核酸电泳检测结果。其中VSV引物可以特异性地扩增出VSV的基因组片段，而猪水泡病病毒、口蹄疫A型病毒、口蹄疫O型病毒和口蹄疫Asia 1型病毒均无特异性条带产生。图1 说明本发明的VSV的GeXP引物的特异性非常高。
[0015] 图2为本发明的VSV引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中M为DL2000 Marker；1为108个拷贝；2为107个拷贝；3为106个拷贝；4为105个拷贝；5为104个拷贝；6为1032 9 4
个拷贝；7为10个拷贝；8为10个拷贝。由图可见10~10个拷贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图2可以看出本发明所设计的VSV的GeXP引物在58℃条件下PCR反应最少可以检出104个拷贝的模板。
个拷贝；7为10个拷贝；8为10个拷贝。由图可见10~10个拷贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图2可以看出本发明所设计的VSV的GeXP引物在58℃条件下PCR反应最少可以检出104个拷贝的模板。
[0016] 图3为本发明的VSV的GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出口蹄疫病毒O型268bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用VSV的引物对口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和猪水泡病病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明本发明的水疱性口炎病毒的GeXP引物具有非常好的特异性。
[0017] 图4至图7 为本发明的VSV的GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其中：图4为104copies，图5为103copies，图6为102copies，图7为10copies。结果显示104copies/µL~102 copies/µL的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/µL时检测不到特异性的信号峰值。从图中可以看出本发明中所设计的VSV的GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出102 copies/µL的模板。
具体实施方式
[0018] 以下结合实施例对本发明进行详细解说。
[0019] 1. 序列的制备
[0020] 根据GeXP引物设计要求和NCBI公布的VSV的基因组，选择保守区域设计特异性引物，并通过添加通用引物形成特异性嵌合引物，而通用引物序列属于非生物源性的核苷酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5’端添加Cy5荧光标签。所得到的引物序列分别是：SEQ ID No.1：AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA，在本发明中被命名为VSV-F；SEQ ID No.2：GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTT AGGGATCTGG，在本发明中被命名为VSV-R。用于本发明的通用引物：SEQ ID No.3：Cy5 AGGTGACACTATAGAATA，在本发明中被命名为UWD-F；及SEQ ID No.4：GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R。
[0021] 2．病毒基因组提取
[0022] 单层BHK-21细胞长至80%以上融合后，接种本实验室保藏的水疱性口炎病毒，37℃孵育30min后弃去毒液。加入细胞维持液，37℃ 5% CO2培养，定期观察细胞病变（CPE），待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒反复冻融3次，置-20℃冰箱保存备用。使用TaKaRa 公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中的RNA。
[0023] 3. 水疱性口炎病毒引物特异性验证
[0024] 以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，实验体系如下：
[0025]
[0026] 反应条件如下：
[0027]
[0028] 各取5μL 的PCR产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果表明，VSV的GeXP引物在58℃的条件下能特异性地扩增出VSV基因组片段，而口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和猪水泡病病毒均无特异性条带产生，说明VSV的GeXP引物的特异性非常高。
[0029] 4. 水疱性口炎病毒GeXP引物单重PCR灵敏性验证
[0030] 利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定VSV型基因组的浓度，根据VSV型基因组的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对VSV型基因组进行梯度稀释，各取1μL作为模板，检测单重PCR的敏感性，PCR反应体系为：
[0031]
[0032] 反应条件如下：
[0033]
[0034] 各取5μL 的PCR产物样品核酸电泳，电泳结果通过紫外凝胶成像系统进行检测并拍照。检测结果表明，109~104个拷贝的模板均有特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可看出本发明所设计的VSV的GeXP引物在58℃下，可检出反应体系中104个拷贝的模板。
[0035] 5. 水疱性口炎病毒GeXP-PCR的特异性检测
[0036] 根据Beckman Coulter公司的GenomeLab片段分析策略，建立25μL的PCR反应体系，反应体系为：
[0037]
[0038] RT-PCR反应：
[0039]
[0040] PCR产物的毛细管电泳分析：
[0041] 用甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS）对PCR产物进行10倍的稀释；配置上样反应体系（40μl），包含38.5μl的甲酰胺（Sample Loading Solution, SLS），0.5μl的DSS 400（分子量内标-400），1μl的PCR产物稀释液；在漩涡器上震荡30s混匀，或用枪头混匀，并做简易离心以除去气泡，每孔加一滴石蜡油防止样品挥发；在缓冲液板与上样板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；进入GeXP的Set Up程序，输入样品名称，对每个样品指定Frag-
3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本。
3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行样本。
[0042] 毛细管电泳结束，导出实验数据并对实验结果进行分析，从图可以看出在268bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用VSV的引物对口蹄疫A型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫O型病毒和猪水泡病病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明VSV的GeXP引物具有非常好的特异性。
[0043] 6. 水疱性口炎病毒GeXP-PCR灵敏性检测
[0044] 利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定VSV的RNA的浓度，根据病毒RNA的分子量和浓度计算其相应的拷贝数。对病毒RNA进行梯度稀释，稀释至106copies/µL~10 copies/µL，各取1μl作为模板，检测VSV的GeXP-PCR的灵敏性。
[0045] 结果显示，VSV的GeXP引物在58℃下对不同浓度基因组进行GeXP-PCR后的检测结果。结果显示104copies/µL~102 copies/µL的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/µL时检测不到特异性的信号峰值。从图中可以看出本发明中所设计的VSV的GeXP引物在本发明检测体系中可以检测出102 copies/µL的模板。
[0046] 由以上内容可见，本发明设计合成的4个基因序列以及其形成的GeXP方法可以单独在使用快速检测水疱性口炎病毒。
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