[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年2月4日提交的美国临时申请第62/291,453号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
[0003] 资助信息
[0004] 本
发明利用美国国立卫生研究院资助DP1CA174428的政府支持进行。政府具有本发明中的某些权利。
[0005] 发明背景发明领域
[0006] 本发明整体上涉及
细胞增殖的抑制剂，且更具体的涉及可用于
治疗癌症的rapafucin化合物。
[0007] 背景信息
[0008]
葡萄糖是真核
生物体中主要的
能量来源并且在新陈代谢和细胞稳态中起主要作用。葡萄糖转运蛋白是协助转运葡萄糖跨过质膜的一组宽泛的膜蛋白。由于
肿瘤快速生长，它们需要携带营养进入细胞的蛋白以全
力履行功能。因此，
癌症治疗的重要策略将是阻断这些蛋白。由于GLUT家族是将葡萄糖和其他物质转运进入细胞的一组主要的膜转运蛋白，抑制这些蛋白在阻止癌症扩散中应该是重要的。此外，GLUT在T淋巴细胞活化中也起关键作用。葡萄糖转运的抑制可以调节免疫应答并在治疗从移
植物排斥到各种自身免疫
疾病的各种免疫相关疾病的治疗中具有影响。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明基于开创性的发现：抑制细胞增殖和T细胞活化的rapafucin化合物。
[0011] 在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，包括向所述受试者施用抗增殖有效量的以下化合物中的任一种：
[0012]
[0013]
[0014]
[0015]
[0016] R1：
[0017]
[0018] 其中单独地或组合地，A，B，X，Y，Z＝C，N，或P
[0019]
[0020] 单独地或组合地，R2-R4：H，甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0021] 单独地或组合地，R5-R8：甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0022] R9＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0023] R10＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0024] R11-14＝H或Me.
[0025] R15＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0026] R16＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0027] 携带R15和R16的
碳之间的键可以是单键或者是E或Z构型的双键
[0028]
[0029] R1：
[0030]
[0031] 其中单独地或组合地，A，B，X，Y，Z＝C，N，或P
[0032] 其中单独地或组合地，R1′-R5′＝OH，NH2，SH，H，OAc，OMe
[0033]
[0034] 单独地或组合地，R2-R4：H，甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0035] 单独地或组合地，R5-R8：甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0036] R9-12＝H或Me.
[0037] R13＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0038] R14＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0039] 携带R13和R14的碳之间的键可以是单键或者是E或Z构型的双键
[0040] 其中残基1-4可以是以下列出的任何
氨基酸构建单元或者其修饰版本，[0041]
[0042] 从而治疗癌症。在一个方面，癌症是消化道/胃肠道癌、肝癌、
皮肤癌、
乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、
前列腺癌、淋巴瘤、白血病、肾癌(kidney cancer)、
肺癌、肌癌(muscle cancer)、骨癌、膀胱癌、脑癌、眼癌或者眼部癌症(eye or ocular cancer)、直肠癌、结肠癌、
宫颈癌、膀胱癌、
口腔癌、良性和
恶性肿瘤、胃癌、子宫体、睾丸癌、肾癌(renal cancer)、喉癌、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、维尔姆斯肿瘤、神经母细胞瘤、口/咽癌、食管癌、喉癌、神经
纤维瘤病、结节性硬化、血管瘤或淋巴管生成。在一个方面，癌症是转移的癌症。在一个方面，本发明化合物经静脉内施用。在一个方面，本发明提供了在施用本发明化合物之前、同时或之后另外施用
化学治疗化合物或表1的化合物。
[0043] 表1
[0044] 葡萄糖转运蛋白的抑制剂
[0045]
[0046] 在另一个实施方案中，以上化合物可以被用于在接受器官移植的受试者中治疗可能的器官排斥。
[0047] 在另一个实施方案中，以上化合物可以用于治疗自身免疫疾病。
[0048] 来自以上化合物的分离的化合物包括在本发明的一个实施方案中。此外，包括合成方案I或II的合成图1a中示出的化合物式A18或E11的方法包括在一个实施方案中。此外，本发明包括包含本发明化合物的药物组合物。
[0049] 方案I
[0050]
[0051] A18的合成。
试剂和条件：(a)Fmoc-AA-OH、HATU、DIPEA、DMF，RT，2h；(b)20％哌啶、DMF，RT，30min；(c)HATU、DIPEA、DMF，RT，2h；(d)2代Hoveyda-Grubbs催化剂(30mol％)、1,2-二氯乙烷、140℃
微波，30min。
[0052] 方案II
[0053]
[0054] E11的合成。试剂和条件：(a)Fmoc-AA-OH、HATU、DIPEA、DMF，RT，2h；(b)20％哌啶、DMF，RT，30min；(c)HATU、DIPEA、DMF，RT，2h；(d)2代Hoveyda-Grubbs催化剂(30mol％)、1,2-二氯乙烷、140℃微波，30min。
[0055] 可以用于治疗癌症、自身免疫疾病和可能的器官排斥的另外的化合物由以下一般结构表示：
[0056]
[0057] R1：
[0058]
[0059] 其中单独地或组合地，A，B，X，Y，Z＝C，N，或P
[0060]
[0061] 单独地或组合地，R2-R4：H，甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0062] 单独地或组合地，R5-R8：甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0063] R9＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0064] R10＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0065] R11-14＝H或Me.
[0066] R15＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0067] R16＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0068] 携带R15和R16的碳之间的键可以是单键或者是E或Z构型的双键
[0069]
[0070] R1：
[0071]
[0072] 其中单独地或组合地，A，B，X，Y，Z＝C，N，或P
[0073]
[0074] 单独地或组合地，R2-R4：H，甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0075] 单独地或组合地，R5-R8：甲基，乙基，丙基，异丙基，苯基，OH，NH2，SH，CN，[0076] R9-12＝H或Me.
[0077] R13＝OH，NH2，SH，CN，H；
[0078] R14＝OH，NH2，SH，CN，H.
[0079] 携带R13和R14的碳之间的键可以是单键或者是E或Z构型的双键
[0080] 残基1-4可以是表1中列出的任何氨基酸构建单元或其修饰版本。
[0081]
[0082] 表2.效应物结构域中残基的氨基酸构建单元
[0084] 图1A-1C.A18和E11是有效的细胞增殖抑制剂。(a)A18和E11的化学结构。(b)A18对不同癌细胞中的细胞增殖的抑制。(b)E11对不同癌细胞中的细胞增殖的抑制。
[0085] 图2A-2D.A18和E11对葡萄糖转运的抑制。(a)A18对A549细胞中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(b)E11对A549细胞中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(c)A18对A549 16细胞中2-脱
氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(d)E11对A549细胞中2-脱氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。
[0086] 图3A-3D.A18和E11对葡萄糖转运的抑制。(a)A18对人类红细胞中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(b)E11对人类红细胞中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(c)A18对红细胞血影中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(d)E11对红细胞血影中3-O-甲基-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。
[0087] 图4A-4B.E11是Glut1的特异性抑制剂。(a)通过
蛋白质印迹法分析的DLD-1野生型和DLD-1敲除细胞的Glut1蛋白
水平。(b)E11或A18对DLD-1野生型和DLD-1敲除细胞中2-脱氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。
[0088] 图5A-5C.E11示出了FKBP依赖。(a)SLF的化学结构。(b)(c)E11、A18和FKBP配体对A549细胞中2-脱氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。
[0089] 图6A-6B.A18和E11与Glut1的直接相互作用的鉴定。通过蛋白质印迹法分析的A18(a)或E11(b)下拉样品的Glut1蛋白水平。
[0090] 图7A-7B.(a)在HEK 293T细胞中，A18活化AMPK并抑制S6K。HEK 293T用A18处理不同的时间(左)或不同浓度(右)，并且将细胞裂解物置于SDS-PAGE随后是用所指示的
抗体的蛋白质印迹分析。(b)在HEK 293T细胞中，A18和E11活化AMPK并抑制S6K。
[0091] 图8.A18和E11的抗癌活性的提出的机制。
[0092] 图9.筛选结果的热图。刻度：0(红色)，完全抑制；1(绿色)，无抑制。使用亚甲蓝测定筛选rapafucin文库针对A549肺癌细胞的毒性命中。
[0093] 图10A-10B.A18的HPLC(a)和质谱(b)。
[0094] 图11A-11B.A18的1H-NMR(a)和13C-NMR(b)。
[0095] 图12A-12B.A18的2D COSY NMR(a)和2D HSQC(b)。
[0096] 图13A-13B.E11的1H-NMR(a)和13C-NMR(b)。
[0097] 图14.E11的2D COSY NMR。
[0098] 图15A-15C.高浓度的葡萄糖轻微逆转A18和E11的抗增殖作用。(a)(b)A18和E11在不同葡萄糖浓度培养的癌细胞中对细胞增殖的抑制。(c)来自(a)和(b)的A18和E11的详细IC50值。A18和E11对在不同葡萄糖浓度培养的癌细胞的亚甲蓝测定的潜能。
[0099] 图16A-16B.A18和E11对葡萄糖转运的抑制。使用细胞松弛素B(10μM)、A18(3μM)、E11(3μM)和DMSO对照处理A549细胞持续10min(a)或1min(b)，随后在添加2-脱氧-D-[3H]葡萄糖后1、2、10和30min后测量所处理的细胞中的葡萄糖摄入。
[0100] 图17A-17B.A18及其类似物对葡萄糖转运的抑制。(a)100nM A18及其类似物对A549细胞中2-脱氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。(b)A18及其类似物的氨基酸序列。
[0101] 图18.E11及其类似物对葡萄糖转运的抑制。(a)200nM E11及其类似物对A549细胞3
中2-脱氧-D-[H]葡萄糖摄入的抑制。(b)E11及其类似物的氨基酸序列。
[0102] 图19A-19C.E11是Glut1的特异性抑制剂。(a)(b)A18和E11对A549、DLD-1野生型和Glut1敲除细胞中细胞增殖的抑制。(c)A18和E11对A549、DLD-1野生型和Glut1敲除细胞的亚甲蓝测定的潜能。
[0103] 图20A-20C.E11是Glut1的特异性抑制剂。(a)通过蛋白质印迹法分析的野生型、Glut1和Glut3过表达细胞的Glut1和Glut3蛋白水平。(b)(c)A18和E11对HEK293T、Glut1和Glut3过表达细胞中细胞增殖的抑制。
[0104] 图21.A18、E11及其亲和探针对A549细胞中2-脱氧-D-[3H]葡萄糖摄入的抑制。
[0105] 图22A-22B.A18-S2-生物素(a)和E11-OH生物素(b)的化学结构。A18和E11可以下拉Glut1。
[0106] 图23.在HEK293T细胞中，在72h内，A18和E11不诱导DNA损伤。HEK 293T用A18或E11的增加的浓度、阴性对照(DMSO)和阳性对照(多柔比星)处理72h并将细胞裂解物置于SDS-PAGE随后是用所指示的抗体的蛋白质印迹分析。
[0107] 图24.在HEK293T细胞中，在24h内，A18和E11不诱导细胞凋亡。HEK 293T用A18或E11的不同浓度处理，并将细胞裂解物置于SDS-PAGE随后是用所指示的抗体的蛋白质印迹分析。
[0108] 图25A-25C.A18和E11将细胞周期进展抑制在S期。HEK 293T用DMSO(a)、5μM A18(b)或5μM E11(c)孵育24h，然后
收获细胞用于细胞周期分析。
[0109] 图26.Glut1和Glut3在A549肺癌细胞中的过表达。
[0110] 图27.
自下而上法(Bottom-up approach)。
[0111] 图28A-28D.(a)A18和E11抑制NFAT，且A18而不是E11刺激SRE报告子基因
信号。(b)E11抑制Jurkat T细胞中NFAT、NF-κB和IL2途径，但不抑制MEF-2或AP-1途径。(c)葡萄糖抑制剂刺激SRE报告子基因信号。(d)葡萄糖抑制剂抑制NFAT报告子基因信号。
[0112] 发明详述
[0113] 本发明基于新颖的细胞增殖抑制剂的鉴定。
[0114] 如本文中使用的，化合物的“
治疗有效量”是当被施用至个体或动物时在个体或动物中产生足够高水平的该化合物以引起细胞增殖的可辨别的抑制的化合物量。施用的准确剂量和
频率取决于所使用本发明的具体化合物、被治疗的具体状况、被治疗的状况的严重程度、具体患者的年龄、体重和一般身体状况以及个体可能服用的其他药物，这对于本领域熟练的施用医师是熟知的。此外，所述“治疗有效量”可以根据所治疗的患者的应答和/或根据开出本发明的化合物
处方的医师的评价降低或升高。因此，上文提及的每日有效量范围仅仅是指导。术语“药学上可接受的盐”指的是本发明的化合物的生理上和药学上可接受的盐，例如保持母体化合物的期望的生物学活性且不向其赋予不期望的毒性作用的盐。
[0115] 如本文中使用的，术语“癌症”或“癌性生长”意指细胞的不受控的、异常的生长并且在其范围内包括由细胞的不受控的和异常的生长引起的所有周知的疾病。常见癌症的非限制性实例包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和胃癌、
宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、肺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如骨髓性、淋巴细胞性、髓细胞性和淋巴母细胞性白血病)、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌和恶性黑素瘤。
[0116] 除了本发明化合物，本领域技术人员将意识到化学治疗剂可以在本发明化合物之前、同时或之后使用。示例性的剂包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根
碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、道诺霉素、二羟基蒽二
酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质
激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普
萘洛尔(propranolol)以及嘌呤霉素及其类似物或同系物。还设想治疗抗体或其他蛋白也与本发明的疗法组合。
[0118] 实施例1
[0119] 使用人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549的亚甲蓝细胞生存力测定筛选45,000个化合物和3000个池的rapafucin文库。在400nM/化合物或3μM/15个rapafucin的池的终浓度，我们获得了示出A549的显著抑制的超过50个命中(图9)。选择命中的最强效的池中的10个并合成来自每个池的每种单独的化合物、然后重新测试来自那些池的每种rapafucin。发现抑制A549的细胞增殖的几个强效的rapafucin命中。为了鉴定最强效的rapafucin命中，使活性化合物的初始集经受接下来的剂量依赖分析。两种最强效的rapafucin A18和E11的结构在图1a中示出。每种在制备规模重新合成、通过
硅胶色谱法纯化、随后是HPLC纯化，并经受一系列详细的结构表征(方案I和II；图10-14)。
[0120] 接下来，在数种其他人癌细胞系，包括乳腺癌HCC1954、胰腺癌PANC10.05、白血病Jurkat T和结肠癌RKO中评价A18和E11对细胞增殖的剂量依赖性抑制(图1b和1c)。发现两种rapafucin显著地抑制那些癌细胞系的生存力，IC50值的范围从100nM至700nM(表3)。此外，A18在除胰腺癌PANC10.05之外的大多数细胞系中示出了比E11更强效的抗增殖活性。这些结果表明，两种rapafucin A18和E11具有广谱的抗癌活性。(图1和9；表3)[0121] 表3
[0122] 不同癌细胞系上A18和E11对亚甲蓝测定的潜能。
[0123]
[0124] 为了鉴定两种rapafucin A18和E11的分子靶，进行一系列的基于细胞的和生物化学研究。有趣的是，发现当细胞在高浓度葡萄糖下培养时，A18和E11的抗增殖作用会轻微地降低(图16)。与低浓度的葡萄糖(1g/L)相比，当在高浓度的葡萄糖(4g/L)中培养HEK293T或HeLa细胞时，A18和E11的IC50值增加2-3倍。由于葡萄糖的持续摄入由
哺乳动物细胞中被称为“葡萄糖易化转运蛋白(GLUT)”转运蛋白的家族介导，推测A18和E11可能通过阻断葡萄糖通过GLUT的转运来工作。的确，葡萄糖摄入测定示出了A18和E11显著地抑制A549细胞中的葡萄糖转运(图16)。此外，由A18和E11诱导的葡萄糖转运的抑制在测定开始后1min内发生(图16a)，表明抑制活性可能是经由直接且快速的机制。另外，此测定揭示了对于E11，当用药物处理A549细胞持续1min时，仅实现50％葡萄糖摄入抑制。这表明，E11与其靶的结合比A18慢，且两种化合物可能具有不同的工作机制。
[0125] 然后，通过使用不同的氨基酸构建单元合成新的类似物进行1或2轮结构-活性(SAR)研究。初始SAR分析(图17和18)揭示了在A18中的四肽部分的任何氨基酸的代替是无法忍受的。然而，在E11中，用N-甲基-L-缬氨酸或N-甲基-L-正亮氨酸代替第四氨基酸N-甲基-L-丙氨酸可以轻微地增加活力。下文中，E11-72-1-31被命名为E11。
[0126] 对葡萄糖转运蛋白的直接作用通过监测3H-标记的3-O-甲基葡萄糖的摄入测量，3H-标记的3-O-甲基葡萄糖由葡萄糖转运蛋白转运但不被进一步代谢，允许评估葡萄糖摄入的初始速率。在这样的条件下，A18和E11分别以IC50值18.7nM和38.2nM显著抑制该标记的葡萄糖类似物的摄入(图2a和2b)。初始摄入还可以通过测量3H-标记的2-脱氧-D-葡萄糖的摄入评估，3H-标记的2-脱氧-D-葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白进入细胞并被己糖激酶磷
酸化，但由于在第2位缺少氧而不能被进一步代谢。A18和E11以相似的能力阻断该标记的葡萄糖类似物的摄入(图2c和2d)。与之前报道的葡萄糖转运蛋白抑制剂相比，A18和E11是具有IC50值低于50nM的前两种化合物(表1)。
[0127] 之前已经示出了A18和E11具有广谱的抗癌活性。如果抗癌活性通过葡萄糖转运蛋白抑制起作用，推测A18和E11的靶是Glut1，因为glut1在几乎所有细胞类型中负责
基础葡萄糖转运，并且glut1在许多测试的癌细胞中被上调。为了测试这一假设，应用红细胞(RBC)作为细胞模型，因为RBC表达Glut1作为其唯一的葡萄糖转运蛋白并经常用于研究葡萄糖转运。确实，3H-标记的3-O-甲基葡萄糖摄入测定示出了A18和E11抑制RBC中的葡萄糖转运，IC50值分别为34.2nM和74.2nM。为了消除其他可能性，在RBC衍生的血影中重复葡萄糖摄入测定，其中所有细胞内蛋白和酶被去除且仅保留膜结合的蛋白和膜相关蛋白。有趣的是，葡萄糖摄入测定揭示了只有A18抑制RBC--衍生的血影中的葡萄糖转运，IC50为49.5nM。但是，E11完全失去其抑制活性，表明E11可能通过首先结合其他细胞内蛋白并随后阻断葡萄糖转运来工作。(参见图2、3和15-18)
[0128] 到目前为止，已经在人类细胞中鉴定了至少14种不同的GLUT的同种型。然后，人们提出疑问：A18和E11是否是GLUT1的特异性抑制剂。为了回答这个问题，选择结肠癌DLD-1野生型和GLUT1基因敲除细胞系作为细胞模型(图4a)。有趣的是，3H-标记的2-脱氧-D-葡萄糖摄入和亚甲蓝细胞生存力测定示出了A18在两种细胞系中仍然有力地抑制葡萄糖转运和增殖。但是，E11在DLD-1 GLUT1基因敲除细胞中没有显示任何抑制，但在野生型细胞中保持抑制活性(图4b和19)。这表明E11而非A18是GLUT1的特异性抑制剂。与癌症最相关的GLUT是Glut1和Glut3。为了获得另外的证据，Glut1和Glut3在HEK 293T细胞中过表达，并再次进行亚甲蓝细胞生存力测定。如预期的，E11实际上在GLUT3过表达细胞中不显示任何抑制，但在GLUT1过表达细胞中保持部分抑制活性(图20和表4)，有力地支持了E11是GLUT1特异性抑制剂的假设。(参见图4、19、20、26；表4)。
[0129] 表4
[0130] A18和E11对HEK293T及其Glut1或Glut3过表达细胞的亚甲蓝测定的效能[0131]
[0132] 鉴于设计rapafucin文库的潜在原则，接下来探索A18或E11对GLUT1的抑制是否依赖于FKBP。FKBP依赖性的标志是：细胞效应将被不具有对于FK506和雷帕霉素示出的生物活性或具有
正交生物活性的另一种不相关的FKBP结合配体拮抗。出于未知原因，FK506和雷帕霉素二者都不能拮抗A18或E11对3H-标记的2-脱氧-D-葡萄糖摄入的抑制作用(图5b)。尽管如此，FKBP的合成配体(SLF)(图5a)显著地影响E11的抑制活性(图5c)，表明E11的活性需要FKBP。
[0133] 在示出GLUT1非常可能是A18和E11的靶之后，然后检查A18和E11对GLUT1的直接相互作用。合成通过不同
位置缀合的一系列生物素或双吖丙啶(diazrine)-炔rapafucin缀合物。葡萄糖摄入测定示出了只有几种缀合物在A549细胞中保持抑制活性(图21)。使用最强效的生物素-缀合物(图22)，进行下拉测定随后是使用抗GLUT1抗体的蛋白质印迹。发现生物素-rapafucin缀合物能够从RBC-衍生的血影细胞裂解物下拉GLUT1(图6)。重要的是，生物素-rapafucin探针与GLUT1的结合被rapafucin竞争。此外，A18探针与GLUT1的结合不被E11竞争，反之亦然，表明两种rapfucin可能具有不同的结合位置。最后，如预期的，rapafucin探针与GLUT1的结合不能被FK506和雷帕霉素竞争。综合考虑，下拉测定示出了A18和E11可以直接结合GLUT1。(图6、21、22和27)
[0134] 研究A18和E11是否通过细胞死亡或不同途径杀死癌细胞。在HEK293T细胞中，不存在
磷酸-p53水平和活性胱天蛋白酶3、7和9的增加，表示A18和E11不诱导DNA损伤或细胞凋亡(图23和24)。尽管如此，流式细胞术分析揭示A18和E11处理导致细胞周期停滞。A18和E11处理导致大约10％更多的细胞处于S期。此发现第一次证明了葡萄糖转运蛋白抑制剂处理引起S期细胞周期停滞。
[0135] 接下来检查A18和E11处理是否影响关键细胞生长信号传导蛋白。蛋白质印迹分析揭示了A18和E11能够诱导AMPK的磷酸化并引起mTOR抑制。但它对于ERK、AKT或JNK的磷酸化没有作用(图7)。如之前报道的，AMPK可能充当ATP减少和随后的癌细胞抑制之间的关键连接。(图7和23-25)。基于此处报道的数据，提出如图8中所概述的A18和E11的工作模型。A18或E11处理后，癌细胞中的葡萄糖供应急剧降低，随后是一些关键糖酵解酶和
代谢物(ATP)降低。这些导致AMPK的磷酸化的上调和S6K的磷酸化的下调。所有这些变化诱导细胞周期停滞、
坏死和衰老，并最终诱导癌细胞抑制。(图8)
[0136] A18和E11二者已经示出了免疫抑制活性，阻断NFAT报道子基因激活和IL-2产生(参见例如图28)。这样，它们可以被用作在治疗器官移植排斥和所有类型的自身免疫疾病中应用的免疫抑制剂。可以被治疗的免疫相关的疾病的实例包括但不限于：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、
艾迪生氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性
肝炎、自身免疫性内
耳病、自身免疫性淋巴增殖综合征(ALPS)、自身免疫性多内分泌/多腺体综合征、自身免疫性血小板减少性紫癜、巴洛病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、
腹腔口炎性疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫失调综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、疤痕性类天疱疮、
乳糜泻、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩氏病、囊性纤维化、Degos病、皮肌炎、糖尿病(I型或青少年发作的)、早发性痴呆、湿疹、内毒素性休克、特发性混合性冷球蛋白血症、家族性地中海热、纤维肌痛、纤维肌炎、Goodpasture综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏甲状腺炎、化脓性汗腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、白血病、扁平苔癣、美尼尔氏病、混合型结缔组织病、多发性硬化、多相播散性脑脊髓炎、重症肌无力、视神经脊髓炎、副肿瘤综合征、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、
风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、斑
块型
银屑病、银屑病性关节炎、雷诺现象、莱特尔综合征、
血管成形术后
再狭窄、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性银屑病、结节病(sarcoidosis)、硬皮病、脓毒症、塞扎里病、舍格伦综合征、僵人综合征、狼疮包括系统性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎(也被称为“巨细胞动脉炎”)、移植或同种移植排斥、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎、白癜风、移植物抗宿主病、脓疱性银屑病和韦格纳肉芽肿病(现在被称为肉芽肿性多血管炎(GPA))、炎性肠病、急性坏死性出血性白质脑炎、无丙种球蛋白血症、斑秃、
淀粉样变性、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经机能障碍、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫
缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性
视网膜病、自身免疫性甲状腺病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、卡斯特尔曼病、乳糜泻、查加斯病、慢性疲劳综合征、慢性
炎症性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、丘-施二氏综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、Cogans综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST病、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征、子宫内膜异位症、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球性肾炎、肉芽肿性多血管炎(GPA)(以前称为韦格纳肉芽肿病)、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgG4的相关性硬化性病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性脉管炎、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆氏病、慢性
显微镜下多血管炎、Mooren溃疡、穆-哈二氏病、肌炎、昏睡病、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(链球菌相关的儿童自身免疫性神经
精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部睫状体炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、外周神经病、静脉周脑脊髓炎、POEMS综合征、I、II、III型自身免疫性多腺体综合征、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮症、单纯红细胞再生障碍、
反应性关节炎、交感反射性营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合征、腹膜后纤维变性、风湿热、施密特综合征、巩膜炎、睾丸精子自身免疫、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、托-亨二氏综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、未分化结缔组织病(UCTD)和水疱性皮肤病。
[0137] 尽管已经参考上述实施例描述了本发明，但是应该理解，
修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由随后的
权利要求限制。
