水疱性口炎病毒的改性基质蛋白
阅读：938发布：2020-05-11
专利汇可以提供水疱性口炎病毒的改性基质蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 水 疱性口炎病毒（VSV）基质（M）蛋白突变体。一种突变体M蛋白包括在位点（21）甘 氨 酸变成谷氨酸，在位点（111）亮氨酸变成丙氨酸以及在位点（51）蛋氨酸变成精氨酸。另一种M蛋白突变体包括在位点（22）甘氨酸变成谷氨酸以及在位点（48）和（51）蛋氨酸变成精氨酸。这些具有所述突变体M的新的rVSV显著地减毒并失去了毒性，所述毒性包括神经毒性，并且能够诱导对相关 抗原 的免疫应答。此外，具有第一次描述的M突变体的rVSV印第安纳血清型在31℃能够有效复制，且在约37℃以上较差复制或者不能复制。，下面是水疱性口炎病毒的改性基质蛋白专利的具体信息内容。
1. 一种水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白，其中该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列：（i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
2.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）的改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，且（ii）的改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
3.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
4.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）中在位点111的A和（ii）中在位点110的A由gca密码子编码。
5.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因编码，且（ii）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
6.一种对水疱性口炎病毒的改性基质蛋白编码的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含选自下面的序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
7.一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV），其中所述rVSV包括对改性基质（M）蛋白编码的核苷酸序列，该核苷酸序列选自下面的序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:
7。
8.一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV），其中所述rVSV包含改性基质（M）蛋白，该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列（：i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
9.权利要求7的rVSV，其中（i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
10.权利要求7的rVSV，其中（i）中在位点111的A和（ii）中在位点110的A由gca密码子编码。
11.权利要求7的rVSV，其中所述rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型
（rVSVInd），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R。
12.权利要求10的rVSV，其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
13.权利要求10的rVSV，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的基因编码。
14.根据权利要求10-12中任一项的rVSV，其中该rVSVInd在容许性温度下能够产生VSVInd颗粒，且在非容许性温度下不能产生VSVInd颗粒。
15.权利要求7的rVSV，其中所述rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：
G22E/L110A/M48R/M51R。
16.权利要求14的rVSV，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的基因编码。
17.权利要求14的rVSV，其中该改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
18.权利要求7-17的rVSV，其中该rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白。
19.权利要求17的rVSV，其中所述病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
20.权利要求7-19的rVSV，其中该rVSV基本上是非胞溶性的和无毒性的。
21.一种疫苗，该疫苗包括水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白，其中该改性M蛋白由包含选自下面的序列的核苷酸序列编码：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:
7。
22.一种疫苗，其中该疫苗包含有效量的一种或多种减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV），该一种或多种减毒的rVSV包含改性基质（M）蛋白，该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列（：i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
23.权利要求22的疫苗，其中该rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型
（rVSVInd），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R。
24.权利要求23的疫苗，其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
25.权利要求23的疫苗，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的基因编码。
26.权利要求23-25中任一项的疫苗，其中该rVSVInd在容许性温度下能够产生VSVInd颗粒，且在非容许性温度下不能产生该颗粒。
27.权利要求23-26的疫苗，其中该rVSVInd是全长rVSVInd。
28.权利要求22的疫苗，其中所述rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型
（rVSVNJ），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R。
29.权利要求28的疫苗，其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
30.权利要求28的疫苗，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的基因编码。
31.权利要求28-30的疫苗，其中该rVSVNJ是全长rVSVNJ。
32.权利要求21-31中任一项的疫苗，其中该rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中所述嵌合体rVSV能够诱导对所述蛋白的免疫应答。
33.权利要求32的疫苗，其中该疫苗包含减毒的嵌合体rVSV的混合物，其中该混合物中的至少两种嵌合体rVSV表达外源病原体的不同蛋白。
34.权利要求32的疫苗，其中该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
35.权利要求32的疫苗，其中该病原体是慢病毒。
36.根据权利要求35的疫苗，其中该慢病毒是HIV，且该外源病原体的蛋白是HIV蛋白。
37.权利要求32的疫苗，其中该病原体是HCV，且该外源病原体的蛋白是HCV蛋白。
38.权利要求22的疫苗，其中（i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
39.权利要求22的疫苗，其中（i）中在位点111的A和（ii）中在位点110的A由gca密码子编码。
40.权利要求21-39中任一项的疫苗，其中所述疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
41.权利要求21-40中任一项的疫苗，其中所述疫苗进一步包含佐剂。
42.一种初免-加强免组合疫苗，其中该初免-加强免组合疫苗包含：（a）有效量的包含一种血清型的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）的疫苗，该一种血清型的减毒的rVSV具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的第一种改性基质（M）蛋白；及（b）有效量的包含另一种血清型的rVSV的疫苗，该另一种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二种改性M蛋白。
43.权利要求42的初免-加强免组合疫苗，其中SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的基因编码。
44.权利要求42的初免-加强免组合疫苗，其中SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且SEQ ID NO: 10由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
45.权利要求42的初免-加强免组合疫苗，其中（a）是初免疫苗，且（b）是加强免疫苗。
46.权利要求42的初免-加强免组合疫苗，其中（b）是初免疫苗，且（a）是加强免疫苗。
47.权利要求42的初免-加强免组合疫苗，其中该两种减毒的rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中该两种嵌合体rVSV能够诱导对该蛋白的免疫应答。
48.权利要求47的初免-加强免组合疫苗，其中该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
49.权利要求47的初免-加强免组合疫苗，其中该病原体是慢病毒。
50.权利要求49的初免-加强免组合疫苗，其中该慢病毒是HIV，且该蛋白是HIV蛋白。
51.权利要求50的初免-加强免组合疫苗，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HIV蛋白的基因插入在该G基因和该L基因之间。
52.权利要求51的初免-加强免组合疫苗，其中该HIV基因选自由env、gag和pol组成的HIV基因群。
53.权利要求49的初免-加强免组合疫苗，其中该病原体是HCV，且该抗原决定基是HCV蛋白。
54.权利要求53的初免-加强免组合疫苗，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HCV蛋白的基因插入在该G基因和该L基因之间。
55.权利要求54的初免-加强免组合疫苗，其中该HCV蛋白是结构性或非结构性HCV蛋白。
56.权利要求47-55中任一项的初免-加强免组合疫苗，其中该两种疫苗的每一种包含该减毒的嵌合体rVSV的混合物，且其中该混合物中的至少两种减毒的嵌合体rVSV具有病原体的不同蛋白。
57.权利要求42-54中任一项的初免-加强免组合疫苗，其中该两种疫苗的每一种能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
58.权利要求42-57中任一项的初免-加强免组合疫苗，其中疫苗（a）的血清型是印第安纳，且疫苗（b）的血清型是新泽西。
59.权利要求42-58中任一项的初免-加强免组合疫苗，其中疫苗（a）和疫苗（b）的每一种进一步包含佐剂。
60.一种试剂盒，其包含：（a）至少一剂有效量的包含重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型（rVSVInd）的疫苗，rVSVInd具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的改性基质（M）蛋白，及（b）至少一剂有效量的包含重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ）的疫苗，rVSVNJ具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的改性M蛋白。
61.权利要求60的试剂盒，其中（a）和（b）在药物可接受的载体中配制。
62.权利要求60的试剂盒，其中SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的基因编码。
63.权利要求60的试剂盒，其中SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且SEQ ID NO: 10由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
64.一种分离的肽，其包含选自列为SEQ ID NO: 4和10的氨基酸序列组的氨基酸序列。
65.一种分离的核苷酸序列，其包含选自组SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:
7的核苷酸序列。
66.一种权利要求21或22的疫苗用于诱导受试主体免疫应答的应用。
67.一种权利要求42的初免-加强免组合疫苗用于诱导受试主体免疫应答的应用。
68.一种诱导受试主体免疫应答的方法，其中该方法包含向该受试主体给药：（a）有效量的包含一种血清型的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）的疫苗，该一种血清型的减毒的rVSV具有第一种改性M蛋白，该第一种改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R；及（b）有效量的包含另一种血清型的减毒的rVSV的另一种疫苗，该另一种血清型的减毒的rVSV具有第二种改性M蛋白，该第二种改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R。
69.权利要求68的方法，其中在向该受试主体给药（b）之前，向受试主体给药（a）。
70.权利要求69的方法，其中在诱导过程中向该受试主体给药（b）超过一次。
71.权利要求68的方法，其中向该受试主体给药（a），且在（a）给药后约三周、八周和十六周后向受试主体给药（b）。
72.权利要求68的方法，其中在向该受试主体给药（a）之前，向受试主体给药（b）。
73.权利要求68的方法，其中在诱导过程中向该受试主体给药（a）超过一次。
74.权利要求72的方法，其中向该受试主体给药（b），且在（b）给药后约三周、八周和十六周后向受试主体给药（a）。
75.权利要求68的方法，其中该两种rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中该两种rVSV能够诱导对该蛋白的免疫应答。
76.权利要求75的方法，其中该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
77.权利要求75的方法，其中该病原体是慢病毒。
78.根据权利要求77的方法，其中该慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV），且该蛋白是HIV蛋白。
79.权利要求78的方法，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HIV蛋白的基因是插入在该G基因和该L基因之间的HIV基因。
80.权利要求79的方法，其中该HIV基因选自由gag、env和pol组成的HIV基因群。
81.权利要求75的方法，其中该病原体是丙型肝炎病毒（HCV），且该蛋白是HCV蛋白。
82.权利要求81的方法，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HCV蛋白的基因插入在rVSV的G基因和L基因之间。
83.权利要求75的方法，其中该两种疫苗包含减毒的嵌合体rVSV的混合物，其中该混合物中的至少两种减毒的嵌合体rVSV表达病原体的不同蛋白。
84.权利要求68-83中任一项的方法，其中该两种疫苗（a）和（b）的每一种诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
85.权利要求68-84中任一项的方法，其中疫苗（a）的一种血清型是印第安纳，且疫苗（b）的另一种血清型是新泽西。
86.权利要求68-85中任一项的方法，其中疫苗（a）和疫苗（b）的每一种进一步包含佐剂。
1.一种水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白，其中该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列：（i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
2.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）的改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，且（ii）的改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
3.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
4.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）中在位点111的A和（ii）中在位点110的A由gca密码子编码。
5.权利要求1的改性M蛋白，其中（i）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因编码，且（ii）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
6.一种对水疱性口炎病毒的改性基质蛋白编码的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含选自下面的序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
7.一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV），其中所述rVSV包括对改性基质（M）蛋白编码的核苷酸序列，该核苷酸序列选自下面的序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:
7。
8.一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV），其中所述rVSV包含改性基质（M）蛋白，该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列（：i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。
9.权利要求8的rVSV，其中（i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
10.权利要求8的rVSV，其中（i）中在位点111的A和（ii）中在位点110的A由gca密码子编码。
11.权利要求8的rVSV，其中所述rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型
（rVSVInd），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R。
12.权利要求11的rVSV，其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
13.权利要求10的rVSV，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的基因编码。
14.根据权利要求11-13中任一项的rVSV，其中该rVSVInd在容许性温度下能够产生VSVInd颗粒，且在非容许性温度下不能产生VSVInd颗粒。
15.权利要求8的rVSV，其中所述rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），且其中该改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：
G22E/L110A/M48R/M51R。
16.权利要求15的rVSV，其中该改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的基因编码。
17.权利要求15的rVSV，其中该改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
18.权利要求8-17的rVSV，其中该rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白。
19.权利要求18的rVSV，其中所述病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
20.权利要求7-19的rVSV，其中该rVSV基本上是非胞溶性的和无毒性的。
21.一种疫苗，该疫苗包括水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白，其中该改性M蛋白由包含选自下面的序列的核苷酸序列编码：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO:
7。
22.一种疫苗，其中该疫苗包含有效量的一种或多种权利要求7-21的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）。
23.权利要求22的疫苗，其中所述疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
24.权利要求21或22的疫苗，其中所述疫苗进一步包含佐剂。
25.一种初免加强免组合疫苗，其中该初免加强免组合疫苗包含：（a）有效量的包含一种血清型的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）的疫苗，该一种血清型的减毒的rVSV具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的第一种改性基质（M）蛋白；及（b）有效量的包含另一种血清型的rVSV的疫苗，该另一种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二种改性M蛋白。
26.权利要求25的初免加强免组合疫苗，其中SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的基因编码。
27.权利要求25的初免加强免组合疫苗，其中SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且SEQ ID NO: 10由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
28.权利要求25的初免加强免组合疫苗，其中（a）是初免疫苗，且（b）是加强免疫苗。
29.权利要求25的初免加强免组合疫苗，其中（b）是初免疫苗，且（a）是加强免疫苗。
30.权利要求25的初免加强免组合疫苗，其中该两种减毒的rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中该两种嵌合体rVSV能够诱导对该蛋白的免疫应答。
31.权利要求30的初免加强免组合疫苗，其中该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
32.权利要求30的初免加强免组合疫苗，其中该病原体是慢病毒。
33.权利要求32的初免加强免组合疫苗，其中该慢病毒是HIV，且该蛋白是HIV蛋白。
34.权利要求33的初免加强免组合疫苗，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HIV蛋白的基因插入在该G基因和该L基因之间。
35.权利要求34的初免加强免组合疫苗，其中该HIV基因选自由env、gag和pol组成的HIV基因群。
36.权利要求32的初免加强免组合疫苗，其中该病原体是HCV，且该抗原决定基是HCV蛋白。
37.权利要求36的初免加强免组合疫苗，其中该一种血清型的rVSV和该另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达该HCV蛋白的基因插入在该G基因和该L基因之间。
38.权利要求37的初免加强免组合疫苗，其中该HCV蛋白是结构性或非结构性HCV蛋白。
39.权利要求30-38中任一项的初免加强免组合疫苗，其中该两种疫苗的每一种包含该减毒的嵌合体rVSV的混合物，且其中该混合物中的至少两种减毒的嵌合体rVSV具有病原体的不同蛋白。
水疱性口炎病毒的改性基质蛋白
技术领域
[0001] 本发明总体上涉及生物技术和免疫学。具体地，本发明涉及水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白、表达该改性M蛋白的减毒的重组体VSV和VSV基初免-加强免疫苗，该初免-加强免疫苗诱导持久的体液、细胞介导和粘膜免疫应答，对抗携带外源基因的重组体VSV所表达的外源抗原。
背景技术
[0002] 水疱性口炎病毒（VSV）是负链RNA病毒，其感染大多数哺乳动物细胞，且在受感染的细胞中表达高达全部蛋白质的60%的病毒蛋白[Kim, G. N., and C. Y. Kang. Virology 357:41, 2007]。实质上，VSV感染猪、牛和马，并且在口和足周围引发水疱性疾病。虽然已经报导了由VSV引起的人感染，但是VSV在人体内没有引起任何严重的症状[Fields, B. N., and K. Hawkins. N Engl J Med 277:989, 1967; Johnson, K. M. et al. Am J Trop Med Hyg 15:244, 1966]。
[0003] VSV编码五种蛋白，核衣壳（nucleocapsid）蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、表面糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）。VSV的N、P和L蛋白是合成正义和负义基因组RNA和mRNA所需要的，其对合成VSV蛋白是必要的。
[0004] 通过VSV基质（M）蛋白阻断宿主细胞蛋白质合成诱导了细胞死亡。将水疱性口炎病毒印第安纳血清型（VSVInd）中M蛋白在位点51的蛋氨酸残基变成精氨酸（M51R），并且将水疱性口炎病毒新泽西血清型（VSVNJ）M基因中在位点48（Met48）和51（Met51）的蛋氨酸变成精氨酸（Arg），能够使VSV M蛋白的这种功能无效（Kim, G. and Kang, C, Virology, 357:41-53, 2007）。尽管在M蛋白质中有这些Met向Arg突变的VSV已经显著地减少了细胞病变效应，但是他们依然在细胞和受感染的动物中复制并产生子代病毒。VSVInd奥尔赛（Orsay）菌株的一种温度敏感的（ts）M基因突变体，tsO23已经在小鼠胶质细胞系在37℃和39℃显示了有限的复制（Rabinowitz, S. et al. Infection and Immunity 33:120-125, 1981）。已经证实，tsO23的温度敏感性是在39℃具有特征性子弹状结构的病毒装配启动不当或缺乏的结果（Flood, E. et al. Virology 278:520-533, 2000; Lyles, D. et al. Virology,
217:76–87, 1996）。此外，即便在直接接种到大脑中后，tsO23在小鼠内也失去它的神经毒性（Rabinowitz, S, et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981）。
217:76–87, 1996）。此外，即便在直接接种到大脑中后，tsO23在小鼠内也失去它的神经毒性（Rabinowitz, S, et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981）。
[0005] 在VSV奥尔赛菌株的野生型M和tsO23的M之间有三个氨基酸差异，这些差异是在第21个氨基酸的甘氨酸（G）对谷氨酸（E）（G21E），在第111个氨基酸的亮氨酸（L）对苯丙氨酸（F）（L111F），以及在第227个氨基酸的组氨酸（H）对酪氨酸（Y）（H227Y）（Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263, 1987）。回复突变体（revertant）中在F111的单一氨基酸回复突变成L表明F111看来像是在tsO23的温度敏感性方面起到了主要作用。然而，其它两种突变可能也有一些作用，因为在第111位点由F向L的单一突变没有完全地使病毒恢复到其野生型显型（Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263, 1987; Li, Y. et al. J. Virol.
62:3729-3737, 1988）。
62:3729-3737, 1988）。
[0006] 考虑到回复突变体中在F111的单一氨基酸回复突变成L，其可能有利于引起既对回复突变较不敏感又在tsO23的温度敏感性方面起作用的突变。
[0007] 目前，研究组已经开发出能复制的、装配缺陷的VSV作为更安全的疫苗载体，该VSV缺失了G糖蛋白（G）基因（△G）或缺失了G和M基因两者（△MG）（Kahn, J. et al. J. Virol. 75:11079-11087, 2001; Schwartz, J. et al., Virology 366:166-73, 2007）。然而，已缺失了G基因，或缺失了M和G基因，VSV载体需要G或M和G两者反式蛋白（proteins in trans）的供应以生产装配缺陷的VSV。为了降低生产疫苗的成本，有必要生成这样的系统，其能够生产能以高滴度（titer）复制的病毒疫苗载体。因此，所需要的是这样的VSV载体系统，其可以是已经失去了它的毒性（无毒性的），并且在31℃仍然能够在体外复制到高滴度的全长VSV载体，在非容许性温度下不能适当地装配，诱导良好的对抗其表达的关注的基因的免疫应答，并且具有较少机会回复到到野生型显型。
[0008] 本发明的进一步的和其它的目的将由以下的发明内容、发明的讨论及其实施方案和实施例实现。
发明内容
[0009] 发明人已经生成了新的水疱性口炎病毒（VSV）的基质（M）蛋白突变体，其包括VSV印第安纳血清型（VSVInd）和VSV新泽西血清型（VSVNJ）。这些具有突变体M蛋白的新的VSV基本上是非胞溶性的的、显著地减毒的和无毒性的的，包括神经毒性（更安全的）。此外，这些新的具有突变体M蛋白的VSV能够诱导对抗关注的抗原或抗原决定部位（epitope）的免疫应答。该免疫应答可以是体液、细胞和粘膜免疫应答。此外，具有M突变体的VSVInd在31℃能够装配且通常地能够从受感染的细胞释放出来，但他们不能在37℃或更高温度下适当地装配，且相对于野生型VSVInd，病毒从受感染的细胞的释放显著地减少了。此外，相对于现有技术已知的M蛋白突变体，本发明的M蛋白突变体对回复突变可能较不敏感。
[0010] 照此，在一个实施方案中，本申请涉及一种水疱性口炎病毒（VSV）的改性基质（M）蛋白。在一个实施方案中，本发明的改性M蛋白包括选自（i）和（ii）的氨基酸序列：（i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3；及（ii）包括至少以下置换：G22E/M48R/M51R的SEQID NO: 8。在本发明的一方面，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R。
[0011] 在本发明的一个实施方案中，（i）的改性M蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 4，且（ii）的改性M蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10。
[0012] 在本发明的一个实施方案中（，i）中在位点21的E和（ii）中在位点22的E由gaa密码子编码，且其中（i）和（ii）中在位点51的R及（ii）中在位点48的R由cga密码子编码。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO: 4的在位点111的A和SEQ ID NO: 10的在位点110的A由gca密码子编码。
[0014] 在本发明的一个实施方案中（，i）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因编码，且（ii）的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的基因编码。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种编码水疱性口炎病毒（VSV）的改性的基质（M）蛋白的核苷酸序列或基因，其中该核苷酸序列或基因包括选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组体VSV（rVSV）。本发明的rVSV，在一个实施方案中，包括核苷酸序列或基因，该核苷酸序列或基因包含选自SEQ ID NO:2、6和7的核苷酸序列。
[0017] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV）。根据前面实施方案中的任一个，本发明的rVSV包括改性基质（M）蛋白。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型（rVSVInd），且改性M蛋白包括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包含至少以下置换：G21E/L111A/M51R。
[0019] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVInd的改性M蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
[0020] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVInd的改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的基因编码。
[0021] 在本发明的另一个实施方案中，rVSVInd在容许性温度下能够产生VSVInd颗粒，且在非容许性温度下不能产生该颗粒。
[0022] 在本发明的另一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），且改性M蛋白包括SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/M48R/M51R。在本实施方案的一个方面，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/L110A/M48R/M51R。
[0023] 在一个实施方案中，rVSVNJ的改性M蛋白由包括SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的基因编码。在一个实施方案中，rVSVNJ的改性M蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10。
[0024] 在本发明的另一个实施方案中，rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白。
[0025] 在本发明的一个实施方案中，该病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
[0026] 在另一个实施方案中，本发明的rVSV基本上是非胞溶性的和无毒性的。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗。该疫苗，在一个实施方案中，包括有效量的改性的基质（M）蛋白，该改性M蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列包含选自下面的序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
[0028] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗。该疫苗，在一个实施方案中，包括有效量的一种或多种减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV），该一种或多种减毒的rVSV包括改性基质（M）蛋白，该改性M蛋白包含选自（i）和（ii）的氨基酸序列（：i）包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3，及（ii）包括至少以下置换：G22E/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。在一方面，SEQ ID NO: 8进一步包括置换L110A。
[0029] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型（rVSVInd），且改性M蛋白包括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R。
[0030] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型（rVSVInd），且改性M蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
[0031] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，改性M蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列的基因编码。
[0032] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVInd在容许性温度下能够产生rVSVInd颗粒，且在非容许性温度下不能产生该颗粒。
[0033] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVInd是全长rVSVInd。
[0034] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），且改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/M48R/M51R。在本实施方案的一个方面，SEQ ID NO: 8进一步包括置换L110A。
[0035] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，rVSV是重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），且其中该改性M蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10。
[0036] 在本发明的疫苗的一个实施方案中，改性M蛋白由具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的基因编码。
[0037] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSVNJ是全长rVSVNJ。
[0038] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中所述嵌合体rVSV能够诱导对所述蛋白的免疫应答。
[0039] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗包含减毒的嵌合体rVSV的混合物，其中该混合物中至少两种嵌合体rVSV表达外源病原体的不同蛋白。
[0040] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
[0041] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，病原体是慢病毒。
[0042] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，慢病毒是HIV，且该外源病原体的蛋白是HIV蛋白。
[0043] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，该病原体是HCV，且该外源病原体的蛋白是HCV蛋白。
[0044] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，（i）中在位点21的E和在位点22的E由gaa密码子编码，且在位点51的R和在位点48的R由cga密码子编码。
[0045] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，在位点111的A和在位点110的A由gca密码子编码。
[0046] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0047] 在本发明的疫苗的另一个实施方案中，疫苗进一步包含佐剂。
[0048] 在一个实施方案中，本发明提供了一种初免-加强免组合疫苗（prime boost combination vaccine）。该初免-加强免组合疫苗，根据一个实施方案，包括：（a）有效量的包含一种血清型的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）的疫苗，该种血清型的减毒的rVSV具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的第一种改性M蛋白；及（b）有效量的包含另一种血清型的rVSV的疫苗，该种血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二种改性M蛋白。
[0049] 在初免-加强免组合疫苗的一个实施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的基因编码。
[0050] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且SEQ ID NO: 10由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
[0051] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，（a）是初免疫苗（priming vaccine），且（b）是加强免疫苗（booster vaccine）。
[0052] 在初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中（，b）是初免疫苗，且（a）是加强免疫苗。
[0053] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，两种减毒的rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中两种嵌合体rVSV能够诱导对该蛋白的免疫应答。
[0054] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
[0055] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是慢病毒。
[0056] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，慢病毒是HIV，且蛋白是HIV蛋白。
[0057] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达HIV蛋白的基因插入在G基因和L基因之间。
[0058] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，其中HIV基因选自由env、gag和pol组成的HIV基因组。
[0059] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，病原体是HCV，且抗原决定部位是HCV蛋白。
[0060] 在本发明的初-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且用于表达HCV蛋白的基因插入在G基因和L基因之间。
[0061] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，HCV蛋白是结构性或非结构性HCV蛋白。
[0062] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，这两种疫苗中的每一种包括减毒的嵌合体rVSV的混合物，且在混合物中至少两种减毒的嵌合体rVSV具有病原体的不同蛋白。
[0063] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，两种疫苗的每一种能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0064] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，疫苗（a）的rVSV的血清型是印第安纳，且疫苗（b）的rVSV的血清型是新泽西。
[0065] 在本发明的初免-加强免组合疫苗的另一个实施方案中，疫苗（a）和疫苗（b）的每一种进一步包含佐剂。
[0066] 根据另一个实施方案，本发明提供了一种试剂盒。该试剂盒，在一个实施方案中，包括：（a）至少一剂有效量的疫苗，其包含重组体水疱性口炎病毒印第安纳血清型（rVSVInd），rVSVInd具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的改性M蛋白，及（b）至少一剂有效量的疫苗，其包含重组体水疱性口炎病毒新泽西血清型（rVSVNJ），rVSVNJ具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的改性M蛋白。
[0067] 在本发明的试剂盒的一个实施方案中（，a）和（b）是在药物可接受的载体中配制。
[0068] 在本发明的试剂盒的在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的基因编码。
[0069] 在本发明的试剂盒的在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因编码，且SEQ ID NO: 10由包含SEQ ID NO: 7的基因编码。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的肽，其包含选自列为SEQ ID NO: 4、9和10的氨基酸序列组的氨基酸序列。在一个实施方案中，分离的肽是以纯化的形式提供。
[0071] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核苷酸序列，其包含选自组SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列。在一个实施方案中，分离的核苷酸序列是以纯化的形式提供。
[0072] 在一个实施方案中，本发明提供了本发明的疫苗用于在受试主体（subject）内诱导免疫应答。
[0073] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的初免-加强免组合疫苗用于在受试主体内诱导免疫应答。
[0074] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种在受试主体内诱导免疫应答的方法。该方法，根据一个实施方案，包括对受试主体的给药；（a）有效量的包含一种血清型的减毒的重组体水疱性口炎病毒（rVSV）的疫苗，该种血清型的减毒的rVSV具有第一种改性M蛋白，该第一种改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少以下置换：G21E/L111A/M51R；及（b）有效量的包含另一种血清型的减毒的rVSV的另一种疫苗，该另一种血清型的减毒的rVSV具有第二种改性M蛋白，该第二种改性M蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少以下置换：G22E/M48R/M51R。在本实施方案的一个方面，SEQ ID NO: 8进一步包括置换L110A。
[0075] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的一个实施方案中，在向受试主体给药（b）之前，向受试主体给药（a）。
[0076] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，在诱导过程中向受试主体给药（b）超过一次。
[0077] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，向受试主体给药（a），且在（a）给药后约三周、八周、十六周向受试主体给药（b）。
[0078] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，在向受试主体给药（a）之前，向受试主体给药（b）。
[0079] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，在诱导过程中向受试主体给药（a）超过一次。
[0080] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，向该受试主体给药（b），且在（b）给药后约三周、八周和十六周向受试主体给药（a）。
[0081] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，两种rVSV是嵌合体rVSV，其表达外源病原体的蛋白，且其中两种rVSV能够对该蛋白诱导免疫应答。
[0082] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，病原体是病毒性、真菌性、细菌性或寄生性病原体。
[0083] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，病原体是慢病毒。
[0084] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV），且蛋白是HIV蛋白。
[0085] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且用于表达HIV蛋白的基因是插入在G基因和L基因之间的HIV基因。
[0086] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，HIV基因选自由gag、env和pol组成的HIV基因群。
[0087] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，病原体是丙型肝炎病毒（HCV），且蛋白是HCV蛋白。
[0088] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，一种血清型的rVSV和另一种血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G）基因和RNA依赖性RNA聚合酶（L）基因，且其中用于表达HCV蛋白的基因插入在rVSV的G基因和L基因之间。
[0089] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，两种疫苗包含减毒的嵌合体rVSV的混合物，且在混合物中至少两种减毒的嵌合体rVSV表达病原体的不同蛋白。
[0090] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，两种疫苗（a）和（b）的每一种诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0091] 在本发明的在受试主体内诱导免疫应答的方法的另一个实施方案中，疫苗（a）的一种血清型是印第安纳，且疫苗（b）的另一种血清型是新泽西。
[0093] 现在将仅通过实施例参照附图描述实施方案，附图中：图1说明M基因中有突变的水疱性口炎病毒（VSV），印第安纳（Ind）血清型的基因组织。
[0094] 图2说明M基因中有突变的水疱性口炎病毒（VSV），新泽西（NJ）的基因组织。
[0095] 图3说明用于将VSV从cDNA恢复的反向遗传学（reverse genetics）系统。
[0096] 图4说明在容许性温度下[板块A）和C）]和在半容许性温度下[板块B）和D）]，rVSVInd的M蛋白中、感染了重组体VSV的幼仓鼠肾（BHK）细胞中[板块A）和B）]和感染了rVSV的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中的突变L111F的裂解量效应（burst size effect）。
[0097] 图5是代表在31℃和37℃下于BHK21细胞中，rVSVNJ的M蛋白中的突变M48R+M51R、G22E、G22E/M48R+M51R、G22E/L110F及G22E/L110F/M48R+M51R的裂解量效应的图表。
[0098] 图6A）是说明rVSVInd 1. WT、2. M51R、3. G21E、4. G21E/M51R、5. G21E/L111F和6. G21E/L111F/M51R的rVSV蛋白表达的水平的蛋白印迹分析（Western blot analysis）。
[0099] 图6B）是说明rVSVNJ 1. WT、2. M48R+M51R、3. G22E、4. G22E/M48R+M51R、5. G22E/L110F和6.G22E/L110F/M48R+M51R的rVSV蛋白表达的水平的蛋白印迹分析。
[0100] 图7包括感染了具有野生型M基因的rVSVIn（d 板块B和I）和感染了在M基因中具有不同突变的rVSVIn（d 板块A、D、E、F、G、H、K、L、M和N）的BHK21细胞的照片，以及未感染的BHK21细胞的照片（板块C和J）。细胞在31℃（板块A至G）或37℃（板块H至N）培养。
[0101] 图8包括感染了rVSVInd的SH-SY5Y细胞的照片和未感染的SH-SY5S细胞（板块B和H）的照片，rVSVInd在M基因中具有不同的突变（板块C、D、E、F、I、J、K和L）或具有野生型M基因（板块A和G）。细胞在31℃（板块A至F）或37℃（板块G至L）培养。
[0102] 图9包括感染了rVSVNJ的BHK21细胞的照片和未感染的BHK21细胞（板块C和J）的照片，rVSVNJ在M基因中具有不同的突变（板块A、D、E、F、G、H、K、L、M和N）或具有野生型M基因（板块B和I）。细胞在31℃（板块A至G）或37℃（板块H至N）培养。
[0103] 图10包括感染了rVSVNJ的SH-SY5Y细胞的照片和未感染的SH-SY5Y细胞（板块C和J）的照片，rVSVNJ在M基因中具有不同的突变（板块A、D、E、F、G、H、K、L、M和N）或具有野生型M基因（板块B和I）。细胞在31℃（板块A至G）或37℃（板块H至N）培养。
[0104] 图11包括说明瑞士韦伯斯特小鼠的神经毒性研究的图表，研究是通过内侧脑室注射（intralateral ventricular injection）进行：A）UV辐照的rVSVIndG21E/L111F/M51R，B）rVSVIndWT，C）rVSVIndM51R及D）rVSVIndG21E/L111F/M51R。
[0105] 图12包括说明瑞士韦伯斯特小鼠的神经毒性研究的图表，研究是通过内侧脑室注射进行：A）rVSVNJWT，B）rVSVNJM48R+M51R，C）rVSVNJG22E/M48R+M51R及D）rVSVNJG22E/L110F/M48R+M51R。
[0106] 图13（SEQ ID NO: 11-15）A）说明HIV-1 Gag-En基因克隆（cloning）到rVSV的cDNA克隆（clone）中。图13 B）是感染了rVSV并在31℃培养的BHK细胞的蛋白印迹分析，rVSV表达Gag-En且具有对M基因不同的突变。图13C）是感染了rVSV并在37℃孵化的BHK细胞的蛋白印迹分析，rVSV表达Gag-En且具有对M基因不同的突变。
[0107] 图14描述接种策略和接种组的表。
[0108] 图15描述用二甲亚砜（DMSO）刺激的肽特异性CD8+IFNγ+T细胞在插图中所示的不同接种组中的频率的图表。
[0109] 图16是说明用VSVN刺激的VSV N肽特异性CD8+IFNγ+T细胞在插图中所示的不同接种组中的频率的图表。
[0110] 图17是说明用HIV-1Gag刺激的HIV-1Gag肽特异性CD8+IFNγ+T细胞在插图中所示的不同接种组中的频率的图表。
[0111] 图18是说明在插图中所示的不同接种组中HIV-1 Gag特异性抗体应答的图表。
[0112] 图19是说明VSV N肽特异性CD8+IFNγ+T细胞在接种表1所示多种剂量rVSV的不同接种组中的频率的图表。
[0113] 图20是说明HIV-1 Gag肽特异性CD8+IFNγ+T细胞在接种表1所示多种剂量rVSV的不同接种组中的频率的图表。
[0114] 图21是说明HIV-1Gag特异性抗体在接种表1所示多种剂量rVSV的不同接种组中的应答的图表。
[0115] 图22（SEQ ID NO: 16 - 26）说明与编码gp120和gp41的人B细胞和T细胞抗原决定部位的核苷酸有联系的HIV-1 gag基因克隆到rVSVIndG21E/L111F/M51R和rVSVNJG22E/M48R+M51R的cDNA克隆中。
[0116] 图23（SEQ ID NO: 11-15和27-31，分别地）说明与编码gp41、nef、gp 120、RT、Tat和Rev的人B细胞和T细胞抗原决定部位的核苷酸有联系的HIV-1 gag基因克隆到rVSVIndG21E/L111F/M51R和rVSVNJG22E/M48R+M51R的cDNA克隆中。它也说明HIV-1 pol和env基因克隆到rVSVIndG21E/L111F/M51R和rVSVNJG22E/M48R+M51R的cDNA克隆中。
[0117] 图24说明感染了表达Gag A、B、C、En和RT的rVSVIndG21E/L111F/M51R并在31℃和37℃培养的BHK21细胞的蛋白印迹分析。
[0118] 图25说明感染了表达Gag A、B、C、En和RT的rVSVNJG22E/M48R+M51R并在31℃和37℃培养的BHK21细胞的蛋白印迹分析。
[0119] 图26说明感染了表达HIV-1 pol基因的rVSVIndG21E/L111F/M51R或rVSVNJG22E/M48R+M51R的BHK21细胞的蛋白印迹分析。
[0120] 图27说明感染了表达HIV-1 gp160mss基因的rVSVIndG21E/L111F/M51R或rVSVNJG22E/M48R+M51R的BHK21细胞的蛋白印迹分析。
[0121] 图28包括说明在表6的不同接种组中的VSV N和HIV-1蛋白肽特异性CD8+T细胞应答的图表，表6的接种组：G1、G2、G3、G4、G5和没有Env P18的G5。
[0122] 图29是说明在表6的接种组G6中的VSV N和HIV-1蛋白肽特异性CD8+T细胞应答的图表。显示出了VSV N肽和来自用于刺激脾细胞的HIV-1蛋白的肽的氨基酸序列（SEQ ID NO: 32-37）。
[0124] 图31描述克隆到rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)中的HCV结构性蛋白基因。
[0125] 图32说明来自rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的HCVCore（板块A）、E1（板块B）、E2（板块C）和NS4B（板块D）蛋白的表达的蛋白印迹分析。
[0126] 图33描述克隆到rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的HCV非结构性蛋白基因。
[0127] 图34来自rVSVInd(GLM)的HCV NS3在37℃和31℃（板块A）、NS5A在37℃（板块B）和NS5B在37℃和31℃（板块C）的表达的蛋白印迹分析。
[0128] 图35证明来自rVSVNJ(GM)的HCV NS3、NS4B、NS5A和NS5B在37℃（板块A）的表达，及HCV NS5AB在37℃（板块B）的表达。该蛋白表达由蛋白印迹分析检测。
[0129] 图36说明rVSVInd(GLM)-new的全长基因组RNA的cDNA质粒的结构。
[0130] 图37说明rVSVNJ(GMM)-new的全长基因组RNA的cDNA质粒的结构。
[0131] 图38说明带有额外的核苷酸变化的rVSVInd(GLM)，显示了与原始的rVSVInd(GLM)-new相同的温度敏感性。
具体实施方式
[0132] 概述除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。并且，除非另有说明，除了在权利要求书内，“或”的使用包括“和”，反之亦然。非限制性术语不会解释为限制性的，除非明确说明或上下文另外明确表示（例如“包括”、“具有”和“包含”通常表示“无限制地包括”）。包括在权利要求书中的单数形式例如“一”、“一种”和“该”（a、an、the）包括复数引用，除非另有明确说明。“基本上由……组成”意味着任何列举的要素都必需包括，会实质上影响所列的要素的基本特性和新颖特性的要素排除在外，且其它要素可以任选地包括在内。“由……组成”意味着排除掉除了所列的那些要素的所有要素。由这些术语中的每个定义的实施方案都在本发明的范围内。所有被引用的出版物和优先权文件并入在此作为参考。
[0133] 包括范围的所有的数字标示，例如尺寸和重量，是近似值，其通常可能改变（+）或（－）增量0.1、1.0或10.0，视情况而定。所有数值标示可以理解为前置术语“约”。
[0134] 术语“给药”包括传送本发明的化合物到受试主体系统中或者传送至受试主体内或其上的特定区域的任何方法，包括药物组合物、疫苗或治疗剂。本文所用的短语“全身给药”、“经全身给药”“外周给药”和“经外周给药”意思是化合物、药物或其它物质的给药，而非直接进入到中枢神经系统，使得它进入病人的系统，因而经受代谢和其它类似的过程，例如皮下给药。“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”意思是通常通过注射的给药方式，而非肠内的和局部的用药，且无限制地包括静脉的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的和胸骨内的注射及输注。
[0135] 术语“氨基酸”是本领域所知的。总体上，本文为标示氨基酸和保护基团使用的缩写是基于IUPAC-IUB生化命名委员会的建议（参见Biochemistry（1972） 11:1726-1732）。对于与本发明有关的氨基酸，标示是：M：蛋氨酸，R：精氨酸，G：甘氨酸，E：谷氨酸，L：亮氨酸，F：苯丙氨酸。在某些实施方案中，本发明申请中所用的氨基酸是在蛋白中发现的自然存在的那些氨基酸，或是含有氨基和羧基基团的这类氨基酸的自然存在的合成代谢或分解代谢产物。特别适合的氨基酸侧链包括选自以下那些氨基酸侧链的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
[0136] 本文所用的术语“抗体”旨在包括例如任何同型的（IgG、IgA、IgM、IgE等）所有的抗体，其包括多克隆的、单克隆的、重组的和人源化的抗体及其片段（fragment），其特异性识别且能够结合（bind）蛋白的抗原决定部位。抗体可以使用常规的技术进行裂解，且片段以相同的方式筛选备用。因此，该术语包括抗体分子的蛋白水解裂解的节段（segment）或重组制备的部分，其能够选择性地与某种蛋白反应。这类蛋白水解的和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab')2、Fab'、Fv和单链抗体（scFv），scFv含有由肽接头连接的V[L]和/或V[H]域。该scFv可以共价或非共价键接以形成有两个或更多结合位点的抗体。
[0137] 本文中使用的术语“抗原决定部位”指代在动物内，优选在哺乳动物内具有抗原性或免疫原性活性的聚肽或蛋白的位点或片段。具有免疫原性活性的抗原决定部位是聚肽或蛋白的位点或片段，其在动物内引起免疫应答。具有抗原性活性的抗原决定部位是抗体免疫特异性结合的聚肽或蛋白的位点或片段，其通过本领域技术人员所熟知的任何方法例如通过免疫测定来确定。
[0138] 如本文中使用，蛋白质因子（proteinaceous agent）的上下文中的术语“片段”指代包含以下连续的氨基酸残基的氨基酸序列的肽或聚肽：至少2个连续的氨基酸残基，至少5个连续的氨基酸残基，至少10个连续的氨基酸残基，至少15个连续的氨基酸残基，至少20个连续的氨基酸残基，至少25个连续的氨基酸残基，至少40个连续的氨基酸残基，至少50个连续的氨基酸残基，至少60个连续氨基酸残基，至少70个连续的氨基酸残基，至少80个连续的氨基酸残基，至少90个连续的氨基酸残基，至少100个连续的氨基酸残基，至少125个连续的氨基酸残基，至少150个连续的氨基酸残基，至少175个连续的氨基酸残基，至少200个连续的氨基酸残基，或至少250个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，全长蛋白的片段保留了全长蛋白的活性，例如免疫原性活性。在另一个实施方案中，全长蛋白的片段没有保留全长蛋白的活性，例如非免疫原性活性。
[0139] 如本文中使用，核酸的上下文中的术语“片段”指代包含核酸序列以下连续的核苷酸的核酸序列的核酸：编码肽、聚肽或蛋白的核酸序列的至少2个连续的核苷酸，至少5个连续的核苷酸，至少10个连续的核苷酸，至少15个连续的核苷酸，至少20个连续的核苷酸，至少25个连续的核苷酸，至少30个连续的核苷酸，至少35个连续的核苷酸，至少40个连续的核苷酸，至少50个连续的核苷酸，至少60个连续的核苷酸，至少70个连续的核苷酸，至少连续的80个核苷酸，至少90个连续的核苷酸，至少100个连续的核苷酸，至少125个连续的核苷酸，至少150个连续的核苷酸，至少175个连续的核苷酸，至少200个连续的核苷酸，至少250个连续的核苷酸，至少300个连续的核苷酸，至少350个连续的核苷酸，或至少380个连续的核苷酸。在优选实施方案中，核酸的片段编码肽或聚肽，其保留了全长蛋白的活性例如免疫原性活性。在另一个实施方案中，全长蛋白的片段没有保留全长蛋白的活性，例如非免疫原性活性。
[0140] 本文中使用的术语“基本上非胞溶性的”表示重组体水疱性口炎病毒（rVSV）没有显著地损伤或杀死它感染的细胞。
[0141] 术语“HIV”是本领域技术人员所知的，指代人类免疫缺陷病毒。有两种类型的HIV：HIV-1和HIV-2。HIV-1有多种不同的菌株。HIV-1的菌株可以分为三个群：“主要”群M、“异常”群O和“新”群N。这三个群可以代表猿免疫缺陷病毒到人类内的三种单独引入。在M群内，有至少十种亚型或分化枝，例如分化枝A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K。“分化枝”是有机体的群组，例如种（species），其成员共享衍生自共同的祖先的同源特征。本申请中对HIV-1的任何参考包括所有的这些菌株。术语“非传染性”表示降低到不存在感染能力。
[0142] 如本文中使用，术语“受试主体”或“病人”可交替地使用。如本文中使用，术语“受试主体”和“受试主体们”指代人或非人类动物。
[0143] 术语“药物输送装置”指代可以用于向受试主体给药一种治疗剂或多种治疗剂的任何装置。药物输送装置的非限制性实例包括皮下注射器、多室注射器、支架、导管、经皮贴片、微针、微摩擦器（microabrader）及可植入控释装置。在一个实施方案中，术语“药物输送装置”指代能够在注射前混合两种化合物的双室注射器。
[0144] 短语“药物可接受的”在本文中用来指代那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在医学判断的有效范围内，适合用于与人和动物的组织接触，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或者其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。
[0145] 本文中使用的短语“药物可接受的载体”表示药物可接受的材料、组合物或媒介物，例如液态或固态填料、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从身体的一个器官或部位携带或运送到身体的另一个器官或部位。从与制剂的其它成分相容且对病人无害的意义上来说，每种载体必须是“可接受的”。能够充当药物可接受的载体的材料的一些实例包括：（1）糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；（2）淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；（3）纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素、乙基纤维素和乙酸纤维素；（4）粉状黄蓍胶；（5）麦芽；（6）明胶；（7）滑石粉；（8）赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；（9）油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；（10）二醇类，如丙二醇；（11）多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇（；12）酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（13）琼脂；（14）缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝（；15）褐藻酸；（16）无热原水；（17）等渗盐水；（18）林格氏试剂（；19）乙醇；（20）pH缓冲溶液；（21）聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐及（22）在药物制剂中使用的其它无毒性的兼容物质。
[0146] 术语“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸”可交替使用以指代任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。以下是多核苷酸的非限制性举例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的位点（locus）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、媒介物、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物（primer）。多核苷酸可以包含改性核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，在聚合物装配之前或之后可以给予对核苷酸结构的改变。非核苷酸成分可以打断核苷酸的序列。多核苷酸可以在聚合后进一步改性，例如通过与标记成分缀合（conjugation）。术语“重组”多核苷酸表示基因组、cDNA、半合成的或合成来源的多核苷酸，其或者在自然界未出现，或者在非自然安排下连接到另一种多核苷酸。“寡核苷酸”指代单链多核苷酸，其具有少于约100个核苷酸，少于约例如75、50、25或10个核苷酸。
[0147] 术语“聚肽”、“肽”和“蛋白”（如果单链）在本文可交替使用来指代氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含改性的氨基酸，且它可以被非氨基酸打断。该术语也包含经改性的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记成分缀合。
[0148] 在某些实施方案中，本发明的聚肽可以化学地、在无细胞系统内核糖体地或在细胞内核糖体地合成。本发明的聚肽的化学合成可以采用各种本领域公认的方法进行，本领域公认的方法包括逐步的固相合成，通过肽片段的构象辅助的重新连接实现的半合成，克隆的或合成肽节段的酶连接，及化学连接。自然化学连接利用两段不受保护的肽节段的化学选择的反应来产生瞬时的硫酯连接的中间体。该瞬时的硫酯连接的中间体然后自发地进行重排以提供全长的连接产物，其在连接位点具有一个自然形成的肽键。全长连接产物与由无细胞合成产生的蛋白是化学性质相同的。全长连接产物可以根据许可被再折叠（refold）和/或氧化，以形成自然含有二硫化物的蛋白分子（参见例如，U.S. Pat. No.
6184344和6174530；及T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p
420; M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616; L. H. Huang, et al., Biochemistry
(1991): vol. 30, p 7402; M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res.
(1992): vol. 40, p 180-193; K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, “Chemical Approaches to Protein Engineering”, in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; L. Abrahmsen, et al.,
Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151; T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548; M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol.,
3256, p 221; and K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33:
184）。
6184344和6174530；及T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p
420; M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616; L. H. Huang, et al., Biochemistry
(1991): vol. 30, p 7402; M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res.
(1992): vol. 40, p 180-193; K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, “Chemical Approaches to Protein Engineering”, in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; L. Abrahmsen, et al.,
Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151; T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548; M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol.,
3256, p 221; and K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33:
184）。
[0149] “VSV”用来指代水疱性口炎病毒。
[0150] “rVSV”用来指代重组体水疱性口炎病毒。
[0151] 术语“印第安纳”和“IND”用来指代VSV血清型印第安纳（VSVInd）。
[0152] 术语“新泽西”和“NJ”用来指代VSV血清型新泽西（VSVNJ）。
[0153] “MWT”、“M（WT）”用来指代野生型M蛋白。VSVInd的野生型M基因的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO: 1所代表的核苷酸序列。VSVInd的野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO: 3所代表的氨基酸序列。VSVNJ的野生型M基因的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO: 5所代表的核苷酸序列。VSVNJ的野生型M蛋白的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO: 8所代表的氨基酸序列。“M51R”用来指代VSVInd中在位点51蛋氨酸变成精氨酸的M（WT）。“G21E”用来指代VSVInd中在位点21甘氨酸变成谷氨酸的M（WT）。“L111A”用来指代VSVInd中在位点111亮氨酸（L）变成丙氨酸（A）的M（WT）。“G22E”用来指代VSVNJ中在位点22甘氨酸（G）变成谷氨酸（E）的M（WT）。“L110A”用来指代VSVNJ中在位点110亮氨酸（L）变成丙氨酸（A）的M（WT）。“M48R+M51R”或“M48R/M51R”用来指代VSVNJ中在位点48和50蛋氨酸（M）变成精氨酸（R）的M（WT）。“rVSVIndM（G21E/L111A/M51R）”或“rVSVInd(GLM)-new”用来指代具有M（WT）的rVSVInd，该M（WT）在位点21甘氨酸变成谷氨酸，在位点111亮氨酸变成丙氨酸，及在位点51蛋氨酸变成精氨酸。
“rVSVNJM（G22E/M48R/M51R）”、“rVSVNJM（G22E/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GM)”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，及在位点48和51有蛋氨酸变成精氨酸。
“rVSVNJ(GM)-new”用来指代本发明的有密码子的rVSVNJ(GM)。“rVSVNJ M（G22E/L110F/M48R/M51R）”或“rVSVNJM（G22E/L110F/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GLM)”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，在位点110亮氨酸变成苯丙氨酸及在位点48和
51蛋氨酸变成精氨酸。“rVSVNJ M（G22E/L110A/M48R/M51R）”、“rVSVNJM（G22E/L110A/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GLM)-new”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，在位点110亮氨酸变成丙氨酸，及在位点48和51蛋氨酸变成精氨酸。
“rVSVNJM（G22E/M48R/M51R）”、“rVSVNJM（G22E/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GM)”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，及在位点48和51有蛋氨酸变成精氨酸。
“rVSVNJ(GM)-new”用来指代本发明的有密码子的rVSVNJ(GM)。“rVSVNJ M（G22E/L110F/M48R/M51R）”或“rVSVNJM（G22E/L110F/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GLM)”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，在位点110亮氨酸变成苯丙氨酸及在位点48和
51蛋氨酸变成精氨酸。“rVSVNJ M（G22E/L110A/M48R/M51R）”、“rVSVNJM（G22E/L110A/M48R+M51R）”或“rVSVNJ(GLM)-new”用来指代具有M（WT）的rVSVNJ，该M（WT）在位点22甘氨酸变成谷氨酸，在位点110亮氨酸变成丙氨酸，及在位点48和51蛋氨酸变成精氨酸。
[0154] 概述发明人生成新颖的M蛋白和能够产生该新颖的M蛋白的新颖的减毒的rVSV。本发明的新颖的M蛋白可以包括：M（G21E/L111A/M51R）和M（G22E/M48R/M51R）。本发明的新颖的减毒的rVSV可以用作蛋白表达和疫苗载体，及用于预防或治疗感染的方法中。本发明的rVSV可以应用于制造针对人类和其它动物的传染病的疫苗，以诱导细胞和体液免疫应答。
[0155] 分离的蛋白和M蛋白在一个实施方案中，本发明涉及分离的蛋白和编码该分离的蛋白的核苷酸序列。照此，在一个实施方案中，本发明涉及一种分离的肽，其包含选自列为SEQ ID NO: 4和9的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及分离的核苷酸序列，其包含选自列为SEQ ID NO: 2和6的多核苷酸的核苷酸序列。该分离的肽和核苷酸序列可以纯化的形式提供。本发明的核苷酸和氨基酸序列可以通过本领域所知的方法人工制造或合成。
[0156] 在一个实施方案中，本发明涉及新颖的VSV M蛋白，其具有至少一种以下的置换：M（G21E/L111A/M51R）、M（G22E/M48R/M51R）或M（G22E/L110A/M48R/M51R）。
[0157] 在位点21或22的E视情形由密码子gaa编码，且在位点48和51的R视情形由密码子cga编码。在位点111的A可以优选地由密码子gca编码。
[0158] 一方面，本发明涉及VSV M蛋白，其包含选自列为SEQ ID NO: 4、9和10的氨基酸序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明涉及核苷酸序列，其对本发明的新颖的VSVM蛋白编码。该核苷酸序列可以选自列为SEQ ID NO: 2、6和7的序列组。
[0159] 预防或治疗感染的方法提供了诱导免疫应答，预防或治疗感染的方法。在一个实施方案中，该方法可以包括对受试主体给药：（a）有效量的疫苗，其包含一种血清型的减毒的rVSV，该一种血清型的减毒的rVSV具有（i）第一改性M蛋白，该第一改性M蛋白包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括以下置换：G21E/L111A/M51R，和（ii）病原体的抗原决定部位；及（b）有效量的另一种疫苗，其包含另一种血清型的减毒的rVSV，该血清型的减毒的rVSV具有（i）第二改性的蛋白，该第二改性的蛋白包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括以下置换：
G22E/M48R/M51R，和（ii）病原体的抗原决定部位。在本发明的实施方案中，该方法可以包括，在免疫-加强疫苗模式下，对受试主体给药（a）有效量的rVSVInd M（G21E/L111A/M51R），及（b）有效量的rVSVNJM（G22E/M48R/M51R）或M（G22E/L110A/M48R/M51R）。在位点21或22的E视情形由密码子gaa编码，且在位点48和51的R视情形由密码子cga编码。在位点111或110的A可以优选地由密码子gca编码。
G22E/M48R/M51R，和（ii）病原体的抗原决定部位。在本发明的实施方案中，该方法可以包括，在免疫-加强疫苗模式下，对受试主体给药（a）有效量的rVSVInd M（G21E/L111A/M51R），及（b）有效量的rVSVNJM（G22E/M48R/M51R）或M（G22E/L110A/M48R/M51R）。在位点21或22的E视情形由密码子gaa编码，且在位点48和51的R视情形由密码子cga编码。在位点111或110的A可以优选地由密码子gca编码。
[0160] 本文中使用的术语“有效量”表示为达到所需要的结果，剂量和必须的时间段有效的量。
[0161] 在某些实施方案中，在向受试主体给药（b）之前，向该受试主体给药（a）。
[0162] 在某些实施方案中，在治疗或预防过程中，向受试主体给药（b）超过一次。
[0163] 在某些实施方案中，在需要（a）时向受试主体给药（a），且在（a）给药后的约三周、八周和十六周，在需要（b）时向受试主体给药（b）。
[0164] 在某些实施方案中，在向受试主体给药（a）之前，向该受试主体给药（b）。
[0165] 在某些实施方案中，在治疗或预防过程中，向受试主体给药（a）超过一次。
[0166] 在某些实施方案中，在需要（b）时向受试主体给药（b），且在（b）给药后的约三周、八周和十六周，在需要（a）时向受试主体给药（a）。
[0167] 重组病毒在某些实施方案中，本发明涉及一种重组体水疱性口炎病毒（rVSV），其可以是全长VSV，基本上是非胞溶性的，无毒性的，能够在受试主体内诱导免疫应答，能够在容许性温度下复制病毒颗粒至高滴度，在半容许性温度下复制病毒颗粒至低滴度；且其在非容许性温度下不可能产生病毒，且其能够表达外源病原体的抗原决定部位。本发明的rVSV可能能够诱导体液、细胞和粘膜免疫应答。
[0168] 在一个实施方案中，本发明涉及rVSVInd和rVSVNJ。该rVSVInd可以是全长的、基本上非胞溶性的rVSVIndM（G21E/L111A/M51R），其能够在约31℃的容许性温度下产生病毒颗粒，且其可能在约37℃的半容许性温度下不能产生病毒颗粒或者产生病毒颗粒能力低，且不能在超过37℃的非容许性温度例如39℃下产生病毒颗粒。在某些实施方案中，该rVSVInd可以包括M（G21E/L111A/M51R）。在某些实施方案中，该rVSVInd可以包括包含核苷酸序列SEQ ID NO: 2的M基因。
[0169] 在某些实施方案中，该rVSV是全长的、基本上非胞溶性的rVSVNJM（G22E/M48R/M51R）或M（G22/L110A/M48R/M51R）。在某些实施方案中，该rVSV是包括M基因的基本上非胞溶性的rVSVNJ，其中M基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
[0170] 本发明的rVSV可以使用本领域所知的技术制备。在一个实施方案中，在适合宿主中的rVSV的复制和表达的条件下，可以将rVSV引入到宿主细胞中。相应地，本发明也提供了一种具有rVSVInd的细胞，其中病毒的M蛋白的氨基酸序列经改性以提供基本上无细胞毒性，其也允许rVSVInd在容许性温度下有效地复制，但在非容许性温度下不可以复制。
[0171] 照此，本发明也涉及具有本发明的一种或多种重组体VSV的细胞。
[0172] 本发明的疫苗或免疫原性组合物本发明进一步描绘了包含本发明的一种或多种rVSV的疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明描绘了包含rVSVInd的疫苗或免疫原性组合物，及包含rVSVNJ的疫苗或免疫原性组合物，如上所述。
[0173] 在一个实施方案中，疫苗可以包括表达病原体的抗原决定部位的rVSV。在另一个实施方案中，该疫苗可以包括表达病原体的不同抗原决定部位的rVSV的混合物或混合药（cocktail）（参见表6，接种组5和6）。
[0174] 本发明的疫苗或免疫原性组合物适合在体内以生物相容形式给药于受试主体。本文中使用的表达“适合体内给药的生物相容形式”表示治疗效果超过毒性效果的所给药的物质的形式。该物质可以给药于任何动物或受试主体，优选人类。本发明的疫苗可以提供为冻干剂型。本发明的疫苗也可以提供为能够冷冻以便于运输的溶液。此外，该疫苗可以含有合适的防腐剂如甘油，或可以不利用防腐剂配制。如果合适（即，对疫苗中的VSV无伤害），疫苗还可以含有合适的稀释剂、佐剂和/或载体。
[0175] 疫苗的剂量可根据诸如下面的因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，及抗体在个体中引起所需的应答的能力。剂量方案可以进行调整以提供最佳的治疗反应。疫苗的剂量也可以随环境而变化以提供最佳的的预防剂量反应。
[0176] 试剂盒本发明提供了试剂盒，例如用于预防或治疗感染。例如，试剂盒可以包含如上所述的一种或多种药物组合物或疫苗，且任选包含其使用说明书。在其它实施方案中，本发明提供了包含一种或多种药物组合物或疫苗以及一种或多种用于完成这类组合物给药的装置的试剂盒。
[0177] 试剂盒成分可以进行包装以实现前述方法的手动或者半自动或全自动化的实施。在涉及试剂盒的其它实施方案中，本发明构思出了包括本发明的组合物，且任选包括其使用说明书的试剂盒。这种试剂盒可以有多种用途，例如包括成像、诊断、治疗和其它应用。
[0178] 本发明的rVSV的优点和独特的特性本发明的新颖的和不同寻常的特性
在容许性温度（约31℃）下rVSVInd M（G21E/L111A/M51）的正常装配和释放，使得有可能在容许性温度下将新突变体rVSV扩增至高滴度，以制作病毒原液（viral stock）。通过在非容许性温度下下显著地减少后代传染病毒的数量，在非容许性温度下（约37℃（体温左右）下rVSVInd M（G21E/L111A/M51）的装配缺陷提高了在人和其它动物内使用rVSV的安全性。这些突变对rVSVInd的M蛋白中原先存在的M51R突变的附加进一步减弱了VSVInd的毒性。
在容许性温度（约31℃）下rVSVInd M（G21E/L111A/M51）的正常装配和释放，使得有可能在容许性温度下将新突变体rVSV扩增至高滴度，以制作病毒原液（viral stock）。通过在非容许性温度下下显著地减少后代传染病毒的数量，在非容许性温度下（约37℃（体温左右）下rVSVInd M（G21E/L111A/M51）的装配缺陷提高了在人和其它动物内使用rVSV的安全性。这些突变对rVSVInd的M蛋白中原先存在的M51R突变的附加进一步减弱了VSVInd的毒性。
[0179] 在本发明之前，包括置换L111A会导致rVSV在容许性温度下具有正常装配而在非容许性温度下具有装配缺陷是未知的。具有L111A置换替代L111F的优点在于前者具有较少的机会回复到野生型形式。
[0180] 可以由密码子gaa编码的在位点21的E及视情形由密码子cga编码的在位点48和51的R，减少了突变体回复到野生型的机会。
[0181] 以前，发明人开发了减毒的rVSVInd，其在M基因中具有G21E、M51R和L111F的突变。该氨基酸变化是通过改变核苷酸完成的。甘氨酸21的核苷酸密码子，GGG变成谷氨酸的GAA，有2个核苷酸变化。蛋氨酸51的核苷酸密码子，ATG变成精氨酸的AGG，有1个核苷酸变化。亮氨酸的核苷酸密码子，TTG变成苯丙氨酸的TTT，有1个核苷酸变化。使M51突变成R及使L111突变成F的最初的核苷酸变化，在每个氨基酸中仅是一。然而，如果我们改变更多核苷酸以改变氨基酸，很可能会减少已改变的氨基酸回复到原始的氨基酸的机会。因此，发明人使M51R的AGG突变成CGA，以使所有3个核苷酸中的核苷酸密码子彻底改变。苯丙氨酸的TTT突变成亮氨酸的GCA，使3个核苷酸完全改变。rVSVInd(GLM)-new M蛋白中作为结果的突变是有GAA（E）/GCA（A）/CGA（R）的核苷酸变化的G21E/L111A/M51R。氨基酸改变的密码子中的更多的核苷酸变化会增加rVSVInd(GLM)中的温度敏感的突变的稳定性。rVSVNJ(GMM)突变体中的M48R和M51R的更多核苷酸也是如此。突变G22E/M48R/M51R的核苷酸密码子中的初始变化为GAA（E）/AGG（R）/AGG（R）。这些核苷酸密码子进一步变成GAA（E）/CGA（R）/CGA（R），使精氨酸的所有三个核苷酸都已改变。
[0182] 以上公开内容概括地描述了本发明。更完整的理解能够通过参考以下具体实施例获得。这些实施例仅为了说明目的进行描述，并不旨在限制本发明的范围。由于环境可能会建议或提供对策，所以预期了形式的变化和等效物的替换。尽管在本文中使用了特定术语，但是这类术语以说明性意义而不是为了限制目的加以解释。实施例
[0183] 本发明通过以下实施例进一步说明，实施例不应视为以任何方式限制。
[0184] 实施例1—将突变引入到rVSVInd和rVSVNJ的M基因中以及通过反向遗传学的重组体VSV的恢复将突变引入到VSVIn（d 图1）和VSVN（J 图2）的M基因中。在每个位点编码氨基酸的核苷酸序列都通过大引物PCR（mega-primer）方法进行突变。每一种突变表现为在特定位点的氨基酸（例如，M51R中的M51）与另一种氨基酸（例如，M51R中的R）的置换。为了进一步减弱VSV的毒性，发明人结合了tsO23中的突变（G21E和L11F）和M基因中蛋氨酸到精氨酸突变（M51R），其减少了M蛋白在细胞蛋白合成方面的抑制活性，此外减少了VSV颗粒在非容许性温度（39℃）和半容许性温度（37℃）下的装配。
[0185] 野生型和突变体重组体水疱性口炎病毒（rVSV）是通过反向遗传学从cDNA质粒恢复回来的（图3）。VSV反向遗传学利用表达噬菌体T7（T7）的DNA依赖性RNA聚合酶的BHK21细胞，编码VSV的全长基因组RNA的质粒（pVSV）以及表达核衣壳蛋白（pN）、磷蛋白（pP）和VSV聚合酶L蛋白（pL）的3种质粒。全长基因组RNA及N、P和L蛋白的信使RNA的转录在T7 RNA聚合酶的控制之下。在每个VSV N、P和L基因上游的内部核糖体进入位点（IRES）增强了蛋白的翻TM 译。利用脂质体（Lipofectamine） 2000将这些质粒转染到BHK-T7细胞中，其中pN浓度为10 μg、pP浓度为10 μg、pL浓度为5 μg、pVSV浓度为15 μg。当细胞显示约50-70%的CPE时，收集转染细胞的培养基。
[0186] 实施例2—突变，M基因中的L111F显著地减少了在半容许性温度37℃下rVSVInd的裂解量恢复的病毒通过蚀斑挑选（plaque picking）纯化3次，且通过MOI为0.1在31℃感染BHK21细胞将恢复的病毒扩增到较大容量的原种病毒（stock virus）。发明人用MOI为3的rVSV感染了BHK21细胞和人神经母细胞瘤细胞，SH-SY5Y。受感染的细胞在容许性温度（31℃）和半容许性温度（37℃，体温）下进行培养，以确定新的M突变体在病毒颗粒的装配中的温度敏感性。每隔两个小时收集受感染细胞的培养基，直到感染后10个小时，且在培养基中感染性病毒颗粒的数量由有Vero E6细胞的蚀斑试验确定。用于蚀斑试验的感染了突变体病毒的细胞在31℃进行培养。在感染的10个小时整个期间，野生型和所有突变体都能够很好的均等地复制且产生相似滴度的传染性病毒（图4A和C）。然而，rVSVInd、rVSVInd-G21E/L111F和rVSVInd-G21E/L111F/M51R的突变体，在37℃以显著地低于rVSVInd的野生型或M51R突变体的滴度进行复制。野生型与新的M突变体rVSVInd-G21E/L111F/M51R之间在产生传染性颗粒方面的差异大到104倍（图4B和D）。图4中的误差棒代表平均值标准误差。在图4B中，通过与rVSVInd-WT的滴度比较而获得的rVSVInd-G21E/L111F/M51R在感染后4小时、6小时、8小时和10小时的病毒滴度的P值为p<0.0001，p=0.0055，p=0.0040以及p=0.0015。在图4B中，通过与rVSVInd-WT的滴度比较而获得的rVSVInd-G21E/L111F在感染后4小时、6小时、8小时和
10小时的病毒滴度的P值为p<0.0001，p=0.0055，p=0.0041以及p=0.0016。图4D中的P值为<
0.005。P值是通过利用双面独立t试验进行计算的。
10小时的病毒滴度的P值为p<0.0001，p=0.0055，p=0.0041以及p=0.0016。图4D中的P值为<
0.005。P值是通过利用双面独立t试验进行计算的。
[0187] 实施例3—rVSVNJ的M基因中的突变，G22E和L110F没有减少rVSVNJ在37℃的裂解量在MOI为3时用rVSVNJ、野生型和M基因突变体感染BHK21细胞，在37℃（半容许性温度）和31℃（容许性温度）进行培养，且在感染后10小时收集培养基。培养基中每种病毒的病毒滴度通过使用Vero E6细胞的蚀斑试验确定。来自重复样本的平均病毒滴度显示在表中。rVSVNJ的野生型和所有M突变体在两个温度31℃和37℃下都能够很好的均等复制（图5），表明G22E和L110F突变引入到rVSVNJ的M基因中未影响病毒在37℃的装配和释放。图5中的误差棒代表平均值标准误差。
[0188] 实施例4—rVSVInd的M基因中因L111F突变在半容许性温度下的装配缺陷没有影响VSV蛋白的表达在MOI为6时BHK21细胞感染了rVSVInd和rVSVNJ，野生型和M基因突变体。受感染的细胞在37℃和31℃培养了6小时。在感染后6小时将受感染的细胞溶解，将5 μg总蛋白加载到SDS-PAGE凝胶，且使用抗VSVInd和VSVNJ的兔抗血清（1:5000稀释）通过蛋白印迹分析检测rVSV蛋白。结果证明，尽管这些突变（G21E/L111F和G21E/L111F/M51R中的L111F）减少了rVSVInd在37℃的裂解量，VSV蛋白表达的水平比得上野生型rVSVIn（d 图6A）。rVSVNJ的野生型和所有M突变体在31℃和37℃两者都水平相似地表达了他们的蛋白（图6B）。
[0189] 实施例5—rVSVInd的M基因中的结合的突变，G21E/L111F/M51R，显著地减少了BHK21细胞和人神经母细胞瘤细胞，SH-SY5Y中的细胞病原性（cytopatthogenicity）为了检验rVSVInd的M基因的突变，L111F和M51R对于细胞病原性的影响，发明人在MOI为0.1时，用rVSVInd感染了BHK21细胞（图7）和人神经母细胞瘤细胞（图8）。因VSV引起的典型的细胞病变效应为受感染细胞圆化（rounding-up）和细胞溶解（cell lysis）。在感染20小时后，将由rVSVInd-G21E/L111F/M51R引起的细胞病变效应与由其它rVSVInd引起的细胞病变效应进行对比。在感染了rVSVInd-G21E/L111F/M51R突变体的20小时内，显示了减少最多的细胞病变效应，在37℃没有或只有少量的圆化细胞，且相比在BHK21和SH-SY5Y细胞中的单突变，突变L111F与M51R的结合（图7N和图8L）进一步减弱了病毒的细胞病原性。
[0190] 实施例6—在BHK21细胞中，由具有M基因突变G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R的rVSVNJ引起的减少的细胞病变效应为了检验rVSVNJ的M基因的突变G22E、L110F和M48R+M51R对于细胞病原性的影响，发明人在MOI为0.1时用rVSVNJ感染了BHK21细胞和人神经母细胞瘤细胞。在感染20小时后，发明人比较了由rVSVNJ野生型和其它M突变体引起的细胞病变效应（细胞圆化和溶解）。在感染了G22E/M48R+M51R突变体和G22E/L110F/M48R+M51R突变体的20小时内，在37℃显示了最少的细胞病变效应，且突变G22E和M48R+M51R的结合进一步减弱了在BHK21（图9L和9N）和SH-SY5Y细胞（图10L和10N）两者中的rVSVNJ的细胞病原性。
[0191] 实施例7—M蛋白具有G21E/L111F/M51R突变的rVSVInd及具有G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突变的rVSVNJ减毒到这样的程度，使得脑中感染了这些病毒的小鼠未显示神经病学体征或任何症状，如体重减轻在通过皮肤擦伤或白蛉或蚊虫叮咬产生的自然感染过程中，VSV在宿主动物中不显示亲神经性。尽管如此，当野生型VSV直接注入到小鼠或猴子的鼻子或脑中时，这些动物会显示出神经病学症状。为了检验VSV的新的M突变体的神经毒性，发明人将1×106PFU的突变体VSV和1×103PFU野生型VSV注射入瑞士韦伯斯特小鼠脑的内侧脑室（intralateral
ventricle）。发明人从查尔斯河实验室（Charles River laboratory）购买了5周龄瑞士韦伯斯特小鼠，其带有内侧脑室植入管（implant）。到达动物设施一周后，对三只小鼠/组注入了病毒。病毒注入后，4周内每两天观察小鼠的神经病学体征并称重。注射后四天内，注射了
1×103PFU的野生型rVSVInd的小鼠死亡（图11B）。注射后6天，注射了1×106PFU的rVSVInd-M51R的两只小鼠（图11C）损失了约20%的体重，且注射后14天体重回升到正常体重。注射了rVSVInd-M51R的一只小鼠在实验过程中没有损失体重。注射了rVSVInd-G21E/L111F/M51R的所有三只小鼠显示无生病迹象，且4周内没有损失他们的体重直至小鼠死亡（图11D），其表明突变G21E/L111F和M51R的结合，显著地使rVSVInd减毒且在小鼠中失去了它的神经毒性。
注射了rVSVNJ-WT的一只小鼠在两条后腿中都显示了麻痹，且它在注射后的第6天死亡（图
12A）。注射了rVSVNJ-WT的其它两只小鼠和注射了rVSVNJ-M48R+M51R、rVSVNJ-G22E/M48R+M51R或rVSVNJ-G22E/L110F/M48R+M51R的小鼠，在注射后4周内显示无生病迹象和体重损失（图12B、12C和12D）。图11和12中的误差棒代表均值标准误差。
ventricle）。发明人从查尔斯河实验室（Charles River laboratory）购买了5周龄瑞士韦伯斯特小鼠，其带有内侧脑室植入管（implant）。到达动物设施一周后，对三只小鼠/组注入了病毒。病毒注入后，4周内每两天观察小鼠的神经病学体征并称重。注射后四天内，注射了
1×103PFU的野生型rVSVInd的小鼠死亡（图11B）。注射后6天，注射了1×106PFU的rVSVInd-M51R的两只小鼠（图11C）损失了约20%的体重，且注射后14天体重回升到正常体重。注射了rVSVInd-M51R的一只小鼠在实验过程中没有损失体重。注射了rVSVInd-G21E/L111F/M51R的所有三只小鼠显示无生病迹象，且4周内没有损失他们的体重直至小鼠死亡（图11D），其表明突变G21E/L111F和M51R的结合，显著地使rVSVInd减毒且在小鼠中失去了它的神经毒性。
注射了rVSVNJ-WT的一只小鼠在两条后腿中都显示了麻痹，且它在注射后的第6天死亡（图
12A）。注射了rVSVNJ-WT的其它两只小鼠和注射了rVSVNJ-M48R+M51R、rVSVNJ-G22E/M48R+M51R或rVSVNJ-G22E/L110F/M48R+M51R的小鼠，在注射后4周内显示无生病迹象和体重损失（图12B、12C和12D）。图11和12中的误差棒代表均值标准误差。
[0192] 实施例8—表达作为一种所关注基因的HIV-1 Gag蛋白的rVSV的生成；HIV-1 Gag蛋白在31℃和37℃均很好地表达新生成的M突变体，rVSVInd的G21E/L111F/M51R突变体及rVSVNJ的G22E/M48R+M51R和G22E/L110F/M48R+M51R突变体，在37℃显示出减少了的细胞病原性和比得上野生型rVSV的蛋白表达。为了用作疫苗载体，rVSV的新的M突变体应该在体内诱导好的免疫应答，体液免疫和细胞免疫应答两者。当HIV-1 gag蛋白在细胞内单独表达时，HIV-1 gag蛋白产生病毒样颗粒，且该病毒样颗粒从细胞分泌出来。因此，gag蛋白是适合于由rVSV的新的M突变体表达以检验细胞免疫应答和体液免疫应答两者的蛋白。此外，在Balb/c小鼠中深入地研究了HIV-1 Gag中的CD8+细胞毒性的T细胞抗原决定部位、H-2Kd-限制性肽（NH2-AMQMLKETI-COOH）（SEQ ID NO: 33）。发明人插入了全长的HIV-1 gag基因，其连接到HIV-1（Gag-En）的gp41、gp120和nef蛋白上保存的（conserved）人CD8+T细胞抗原决定部位。在野生型（WT）及rVSVInd和野生型的G21E/L111F/M51R(GLM)，rVSVNJ的G22E/M48R+M51R(GM)和G22E/L110F/M48R+M51R(GLM)的全长cDNA克隆中，将Gag-En基因插入到G基因和L基因的接合点
（junction）。如图3中所述，通过反向遗传学rVSV由cDNA克隆恢复，并且使用抗HIV-1 p24的单克隆抗体通过蛋白印迹分析检查了rVSV的Gag-En的表达。对于蛋白印迹分析，BHK21细胞在MOI为6时感染了rVSV并在31℃和37℃培养，且在感染后6小时形成了细胞裂解物。5 μg的总蛋白加载到SDS-PAGE以进行蛋白印迹分析。rVSVInd(GLM)-Gag-En、rVSVNJ(GM)-Gag-En和rVSVNJ(GLM)-Gag-En在半容许性温度（37℃，图13C）很好地表达了Gag-En蛋白（64 kDa），且该表达水平与在容许性温度（31℃，图13B）的表达水平相似。
（junction）。如图3中所述，通过反向遗传学rVSV由cDNA克隆恢复，并且使用抗HIV-1 p24的单克隆抗体通过蛋白印迹分析检查了rVSV的Gag-En的表达。对于蛋白印迹分析，BHK21细胞在MOI为6时感染了rVSV并在31℃和37℃培养，且在感染后6小时形成了细胞裂解物。5 μg的总蛋白加载到SDS-PAGE以进行蛋白印迹分析。rVSVInd(GLM)-Gag-En、rVSVNJ(GM)-Gag-En和rVSVNJ(GLM)-Gag-En在半容许性温度（37℃，图13C）很好地表达了Gag-En蛋白（64 kDa），且该表达水平与在容许性温度（31℃，图13B）的表达水平相似。
[0193] 实施例9—小鼠中的rVSV接种策略每组6只Balb/c小鼠按图14中所示的初免-加强策略进行接种。根据疫苗载体类型（野生型对比突变体）和策略对小鼠进行分组，例如利用rVSV的相同血清型初免和加强免，或交替使用两种血清型进行初免和加强免。小鼠在6周龄时，肌肉注射初免接种了5×106PFU的rVSV。初免后三周，小鼠加强免接种了与初免接种相同剂量的rVSV。加强免注射后一周，收集脾细胞和血清以检测HIV-1 gag特异性CD8 + T细胞免疫应答和体液免疫应答。
[0194] 实施例10—用rVSVInd(GLM)-HIV-l Gag-En初免和用rVSVNJ(GLM)-HIV-l Gag-En加强免诱导了抗HIV-1 Gag的最强的CD8+T细胞免疫应答通过与负载了肽的抗原提呈细胞（antigen presenting cells）上的MCH I 分子的交互作用而受激的T细胞加强了干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，其表明了抗原特异性T细胞免疫应答。对于带有增加的细胞内的INF-γ的CD8+T细胞，用FITC-anti-CD8和APC-anti-IFN-γ对脾细胞进行双标记（stain）。为了检验HIV-1 Gag蛋白特异性CD8+T细胞免疫应答，将脾细胞分离出来，且用H-2Kd-限制的HIV-1 Gag肽，NH2-AMQMLKETI-COOH（SEQ ID NO: 33）刺激1×106细胞，对于CD8分子用FITC大鼠抗小鼠CD8（FITC rat anti-mouse CD8）标记细胞，对于细胞内的IFN-γ用APC大鼠抗小鼠IFN-γ（APC rat anti-mouse IFN-γ）标记细胞。在对它们进行标记前，IFN-γ的分泌被BrefeldinA阻断。使用核衣壳特异性肽，IN275: NH2-MPYLIDFGL-COOH（SEQ ID NO: 32）检查了VSV特异性CD8+T细胞免疫应答。用流式细胞仪FACSCalibur计算肽特异性CD8+-IFN-γ+T细胞。用DMSO（肽的溶剂，图15）处理的脾细胞没有刺激CD8+T细胞，表明在图16和图17中用VSV N聚肽和HIV-1 Gag聚肽处理脾细胞特异性地刺激CD8+T细胞。如组1、2、5、6、9和10（图16和图17）所示，与使用用于初免和加强免的rVSV单一血清型的情况相比，通过交替rVSV（WT）或rVSV(GLM)突变体的两种血清型进行的初免和加强免疫诱导了更强的抗VSV以及HIV-1 Gag蛋白的CD8+T细胞免疫应答。随着用新的M突变体或rVSV进行疫苗接种，当小鼠接种了初免用rVSVInd(GLM)-Gag和加强免用rVSVNJ(GLM)-Gag时，比反过来更好地诱导了抗HIV-1 Gag蛋白的CD8+T细胞应答（图17，组6对比组
10）。通过使用双边独立样本试验计算图17中组6的P值，并将结果与组10的结果进行对比。
图16和17中的误差棒代表均值标准误差。
10）。通过使用双边独立样本试验计算图17中组6的P值，并将结果与组10的结果进行对比。
图16和17中的误差棒代表均值标准误差。
[0195] 实施例11—HIV-1 Gag特异性体液免疫应答用加强免疫一周后收集的血清检查HIV-1Gag特异性抗体的生成。通过间接的酶联免疫吸附试验（ELISA）确定Gag特异性抗体滴度。对于ELISA，用125ng/孔浓度的p55重组体包覆
96孔ELISA板。1:100稀释小鼠血清。抗体结合至抗原，用二抗羊抗鼠IgG-HRP检测p55。通过添加底物，过氧化氢和四甲基联苯胺的混合物，检测HRP的酶活性。用酶标仪读出每个样品在450波长的OD。在接种了新的M突变体的小鼠中，很好地诱导了抗HIV-1 Gag的体液免疫应答（抗HIV-1 Gag的抗体的生成），且当rVSV（WT）或rVSV(GLM)的两种血清型交替用于初免和加强免注射时，诱导了最好的抗HIV-1Gag的体液免疫应答（图18，组5、6、9和10）。关于用于诱导抗外源蛋白的体液免疫应答的新的M突变体的使用，用rVSVInd(GLM)-Gag初免且用rVSVNJ(GLM)-Gag加强免比反过来效果更好（图18，组6对比组10）。图18中的误差棒代表均值标准误差。
96孔ELISA板。1:100稀释小鼠血清。抗体结合至抗原，用二抗羊抗鼠IgG-HRP检测p55。通过添加底物，过氧化氢和四甲基联苯胺的混合物，检测HRP的酶活性。用酶标仪读出每个样品在450波长的OD。在接种了新的M突变体的小鼠中，很好地诱导了抗HIV-1 Gag的体液免疫应答（抗HIV-1 Gag的抗体的生成），且当rVSV（WT）或rVSV(GLM)的两种血清型交替用于初免和加强免注射时，诱导了最好的抗HIV-1Gag的体液免疫应答（图18，组5、6、9和10）。关于用于诱导抗外源蛋白的体液免疫应答的新的M突变体的使用，用rVSVInd(GLM)-Gag初免且用rVSVNJ(GLM)-Gag加强免比反过来效果更好（图18，组6对比组10）。图18中的误差棒代表均值标准误差。
[0196] 实施例12—在小鼠体内接种rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的剂量的增加诱导了更强的免疫应答如图17和图18所示，当小鼠初免接种了rVSVInd(GLM)-Gag并加强免接种了rVSVNJ
(GLM)-Gag时，诱导了更强的HIV-1 Gag特异性CD8+T细胞免疫应答和体液免疫应答。然而，该免疫应答不及利用rVSVIn（d WT）-Gag和rVSVN（J WT）-Gag诱导的免疫应答强烈。因此，发明人想要检验如果他们增加rVSVInd(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag的剂量，是否他们可以增强免疫应答。6周龄的Balb/c小鼠，6只/组，接种rVSVInd(GLM)-Gag进行初免且接种rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag进行加强免。因为rVSVNJ(GM)与rVSVNJ(GLM)一样在体外和体内减毒，发明人将rVSVNJ(GM)-Gag列为加强免病毒（booster virus），并将该免疫应答与由rVSVNJ(GLM)-Gag诱导的免疫应答进行了对比。小鼠组接种了各种剂量的rVSVInd(GLM)-Gag、rVSVNJ(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag；5×106PFU/小鼠，5×107PFU/小鼠，5×108PFU/小鼠，及5×
109PFU/小鼠（表1）。
(GLM)-Gag时，诱导了更强的HIV-1 Gag特异性CD8+T细胞免疫应答和体液免疫应答。然而，该免疫应答不及利用rVSVIn（d WT）-Gag和rVSVN（J WT）-Gag诱导的免疫应答强烈。因此，发明人想要检验如果他们增加rVSVInd(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag的剂量，是否他们可以增强免疫应答。6周龄的Balb/c小鼠，6只/组，接种rVSVInd(GLM)-Gag进行初免且接种rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag进行加强免。因为rVSVNJ(GM)与rVSVNJ(GLM)一样在体外和体内减毒，发明人将rVSVNJ(GM)-Gag列为加强免病毒（booster virus），并将该免疫应答与由rVSVNJ(GLM)-Gag诱导的免疫应答进行了对比。小鼠组接种了各种剂量的rVSVInd(GLM)-Gag、rVSVNJ(GLM)-Gag和rVSVNJ(GLM)-Gag；5×106PFU/小鼠，5×107PFU/小鼠，5×108PFU/小鼠，及5×
109PFU/小鼠（表1）。
[0197] 小鼠根据在图14中所示的清单接种，且在加强免接种一周后被处死以，获取脾细胞和血清。对于带有增加的细胞内的INF-γ的CD8+T细胞，用FITC-anti-CD8和APC- anti-IFN-γ对脾细胞进行双标记。为了检验HIV-1 Gag蛋白特异性CD8+T细胞免疫应答，将脾细胞分离出来，且用受H-2Kd-限制的HIV-1Gag肽，NH2-AMQMLKETI-COOH（SEQ ID NO: 33）刺激1×106细胞，对于CD8分子，用FITC大鼠抗小鼠CD8（FITC rat anti-mouse CD8）标记细胞，且对于细胞内的IFN-γ，用APC大鼠抗小鼠IFN-γ标记细胞（APC rat anti-mouse IFN-γ）。在标记他们前，IFN-γ的分泌用Brefeldin A阻断。使用核衣壳特异性肽，IN275: NH2-MPYLIDFGL-COOH（SEQ ID NO: 32），检验VSV特异性CD8+T细胞免疫应答。用FACSCalibur计算肽特异性CD8+-IFN-y+T细胞。
[0198] 在所有接种了不同剂量的rVSVInd(GLM)-Gag、rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag的接种组中，抗VSV N蛋白的CD8+T细胞免疫应答是非常相似的（图19）。当疫苗剂量增加时，初免接种了rVSVInd(GLM)-Gag和加强免接种了rVSVNJ(GLM)-Gag后的HIV-1 Gag特异性CD8+T细胞免疫应答看起来增加了一点点，但是差异在统计学意义上并不显著（图20，组2、3、4、5）。然而，当小鼠初免接种了rVSVInd(GLM)-Gag和加强免接种了rVSVNJ(GM)-Gag时，HIV-1 Gag特异性CD8+T细胞的频率随着剂量增加到5×108PFU而显著地升高。在接种了5×109PFU/小鼠的组中，HIV-1 Gag特异性CD8+T细胞应答是最强的（图20，组6、7、8、9）。通过使用双边独立样本t试验计算图20中的组8和9的P值，将组8的结果与组7的结果进行比较，且将组9的结果与组8的结果进行对比。图19和20中的误差棒代表均值标准误差。
[0199] 随着用于初免的rVSVInd(GLM)-Gag和用于加强免的rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag的剂量的增加，抗HIV-1 Gag蛋白的抗体的生成增加了（图21）。加强免接种rVSVNJ(GLM)-Gag或rVSVNJ(GM)-Gag，在各种剂量的病毒中生成了相似水平的Gag特异性抗体。图21中的误差棒代表均值标准误差。
[0200] 实施例13—表达HIV-1蛋白的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的生成；Gag、Pol、Env和RT对于利用rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)作为疫苗载体的HIV-1疫苗，发明人列入了编码大部分大型多聚蛋白的HIV基因，其裂解成功能性的蛋白Gag和Env及有酶活性的蛋白（pol基因产物）。此外，对于人体内的T细胞和B细胞，HIV-1 gag基因连接到编码肽抗原决定部位的核苷酸。发明人生成了携带编码HIV-1 Gag的表达盒（cassette）的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)，HIV-1 Gag连接到衍生于多个病毒分化枝（clade）的HIV Env蛋白的B-细胞抗原决定部位（图22）。发明人生成了rVSVInd(GLM)-Gag-En和rVSVNJ(GM)-Gag-En，其表达gag基因和来自Nef、Gp120和Gp41的T细胞肽抗原决定部位（图23）。发明人生成了携带HIV-1 Gag-RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)，其编码来自RT、Tat和Rev蛋白的肽抗原决定部位的gag蛋白（图23）。此外，发明人生成了分别带有pol基因和env基因的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM（) 图23）。
此前，发明人已经证明了将HIV-1包膜蛋白的信号肽替换成蜂蜜蜂毒素信号肽大幅度地增加了Gp120表达、糖基化和分泌的比率（Yan Li et al, PNAS, 93: 9606-9611, 1996）。
Gp120的表达和分泌的增加预计会提高抗HIV-1 gp120的T细胞和B细胞免疫应答的诱导。因此，发明人生成了带有HIV-1env基因的rVSV，HIV-1env基因具有蜂毒素信号序列
（gp160mss）。将具有HIV-1蛋白的重组体VSV蚀斑纯化并为原种病毒而扩增。由突变体VSV在
31℃和37℃表达的HIV-1蛋白通过蛋白印迹分析检查。标记了来自各种HIV-1蛋白的T细胞和B细胞抗原决定部位的Gag蛋白在31℃和37℃都由rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)很好地表达了（图24和图25）。在rVSV基因组中的克隆的HIV-1pol基因编码多聚蛋白，其裂解成蛋白酶（PR、P11）、逆转录酶（RT、p66/p51）和整合酶（IN，p31）。发明人检测了RT产物的两个亚基，P66和P51。通过p15在羧基末端的片段的蛋白水解，p51由p66生成。在31℃和37℃，RT产物p66和p51很好地由rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)均等地表达（图26）。env基因编码了糖蛋白Gp160，其被裂解成受体结合蛋白的Gp120和胞浆融合及跨膜蛋白的gp41。GP160由细胞的反式高尔基体（tran-golgi）固有的蛋白酶弗林裂解。在来自rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的BHK21细胞中表达的Gp160没有被裂解成Gp120和Gp41，或该裂解不是非常有效，尽管其在31℃和37℃的表达水平都很好（图27）。我们之前关于Gp160在BHK21细胞中的表达和裂解成Gp120和GP41的数据表明该处理不是非常有效的（Kunyu Wu et al., Journal of general Virol., 90: 1135-1140, 2009）。
此前，发明人已经证明了将HIV-1包膜蛋白的信号肽替换成蜂蜜蜂毒素信号肽大幅度地增加了Gp120表达、糖基化和分泌的比率（Yan Li et al, PNAS, 93: 9606-9611, 1996）。
Gp120的表达和分泌的增加预计会提高抗HIV-1 gp120的T细胞和B细胞免疫应答的诱导。因此，发明人生成了带有HIV-1env基因的rVSV，HIV-1env基因具有蜂毒素信号序列
（gp160mss）。将具有HIV-1蛋白的重组体VSV蚀斑纯化并为原种病毒而扩增。由突变体VSV在
31℃和37℃表达的HIV-1蛋白通过蛋白印迹分析检查。标记了来自各种HIV-1蛋白的T细胞和B细胞抗原决定部位的Gag蛋白在31℃和37℃都由rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)很好地表达了（图24和图25）。在rVSV基因组中的克隆的HIV-1pol基因编码多聚蛋白，其裂解成蛋白酶（PR、P11）、逆转录酶（RT、p66/p51）和整合酶（IN，p31）。发明人检测了RT产物的两个亚基，P66和P51。通过p15在羧基末端的片段的蛋白水解，p51由p66生成。在31℃和37℃，RT产物p66和p51很好地由rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)均等地表达（图26）。env基因编码了糖蛋白Gp160，其被裂解成受体结合蛋白的Gp120和胞浆融合及跨膜蛋白的gp41。GP160由细胞的反式高尔基体（tran-golgi）固有的蛋白酶弗林裂解。在来自rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的BHK21细胞中表达的Gp160没有被裂解成Gp120和Gp41，或该裂解不是非常有效，尽管其在31℃和37℃的表达水平都很好（图27）。我们之前关于Gp160在BHK21细胞中的表达和裂解成Gp120和GP41的数据表明该处理不是非常有效的（Kunyu Wu et al., Journal of general Virol., 90: 1135-1140, 2009）。
[0201] 实施例14—对有rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的小鼠的免疫研究，rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)表达HIV-1蛋白、Gag、Gp160和RT针对新的M突变体rVSV、rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的初步的初免-加强免免疫研究揭示了用rVSVInd(GLM)初免和用rVSVNJ(GM)加强免小鼠，比相反方式更好地诱导了抗外源基因的CD8+T细胞免疫应答（图17）和体液免疫应答（图18）。就rVSVInd(GLM)-Gag初免和rVSVNJ(GM)-Gag加强免而言，每种病毒5×108pfu的剂量比较低剂量更好地诱导了Gag特异性CD8+T细胞应答，尽管抗Gag的B细胞应答与利用较低剂量诱导的免疫应答相似（图20和图21）。发明人选择5×108pfu的剂量进行表达HIV-1蛋白Gag、Gp160和RT的rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的免疫研究。
[0202] 如表6所示，发明人使用表达HIV-1蛋白的rVSVInd(GLM)对Balb/c小鼠进行初免，且在初免后三周内使用表达HIV-1蛋白的rVSVNJ(GM)进行了加强免。发明人检查了单独注射或者混合注射表达单独的蛋白的三种不同病毒是如何引起对单个HIV-1蛋白的免疫应答的。加强免疫一周后，发明人处死了免疫的小鼠以获取其脾细胞和血清。1×106脾细胞受刺激于H-2Kd-限制的HIV-1蛋白特异性肽，其为Gag、Env P18、RT354、RT464和RT472。肽序列如图
29所示。对于细胞表面CD8分子和T细胞的细胞内IFN-γ，用FITC大鼠抗小鼠CD8和APC大鼠抗小鼠IFN-γ双标记受刺激的脾细胞。这个策略，用rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的初免-加强免免疫，诱导了肽特异性CD8+T细胞免疫应答，诱导程度取决于发明人用于刺激的肽。CD8+T细胞抗Env肽平均刺激了最高高达CD8+T细胞的19%-23%的CD8+T细胞（图28，G3和G5）。大约
4.5%或3%的CD8+T细胞对如下小鼠内的Gag蛋白是有应答的，该小鼠单独免疫了表达Gag的rVSV（图28，G2）或混合免疫了表达GagA、GagB和GagC的三种rVSV，其与HIV-1 Gp120和Gp41的各种B和T细胞抗原决定部位连接（图29，G6）。在注射了有pol基因的rVSV的小鼠内约2%的CD8+T细胞中生成了RT特异性CD8+T细胞（图28，G4）。与当对小鼠注射表达单一蛋白的rVSV的混合的rVSV相比（图28，G5），当对小鼠注射表达个体蛋白的单一rVSV时（图28，G2和G4），抗个体HIV -1蛋白、Gag和RT的CD8+T细胞应答更强烈。Env特异性CD8+T细胞应答是最强的，且在单注射和混合注射两者中是相似的。抗Env肽抗原决定部位的CD8+T细胞应答是免疫显性的。目前，发明人不确定为什么混合注射了表达Gag、Env和RT的三种不同rVSV比单一病毒注射诱导了相对较低的抗VSV N、gag和RT的CD8+T细胞应答。有可能是在混合病毒注射中抗原提呈细胞的每种病毒的竞争减弱了对Gag和RT的CD8+T细胞。因为在注射了单一rVSV或混合rVSV的小鼠中，rVSV是HIV-1蛋白常见的载体，所以在混合注射中VSV N预计会诱导相似的或更好的CD8+T细胞应答。然而，当Env如在混合注射中（图28，G5）一样被表达（图28，G3）时，即使采用单一注射，小鼠中抗VSV N的CD8+T细胞应答也更低。因此，它可能是Bal b/c小鼠中Env蛋白的免疫显性的结果，当Env一起表达时其负面地影响了其它蛋白对CD8+T蛋白的提呈。对于小鼠中的联合免疫，在单一部位注射了所有三种rVSV，其可能导致了不同蛋白对同一抗原提呈细胞的抗原提呈作用的竞争。发明人将测试在超过一个注射部位采用混合注射的免疫以诱导CD8+T细胞应答。在细胞中表达的HIV-1 Gag蛋白能够形成病毒样颗粒（VLP），且VLP能够从细胞中释放出来。释放出的VLP能够诱导抗Gag蛋白的体液免疫应答。
HIV-1 env基因编码糖基化的表面糖蛋白，其通过ER-高尔基体网络进行处理以适当地折叠并裂解成跨膜亚基Gp41和表面单元Gp120。Gp41和Gp120通过非共价键缔合，且成熟而形成Gp41和Gp120杂二聚体的三聚体。Gp41和Gp120的成熟的三聚体被输出到细胞表面。由于Gp41和Gp120之间的弱键合，Gp120倾向于从细胞表面掉落。因此，抗Gp120的抗体可以被诱导到细胞表面Gp120或从Gp120上脱落。抗HIV-1 Gag蛋白和Gp120的抗体滴度由ELISA确定。
对于Gag抗体，微板包覆了125 ng/孔重组体p55（Pierce Biotechnology, RP-4921），且对
50 μl小鼠血清稀释1:100、1:200和1:400后进行了试验。Gag抗体在单独注射了rVSVGag-En（图30A，G2）和注射了混合病毒rVSV-Gag A+rVSV Gag B+rVSV Gag C（图30A，G6）的小鼠中产生。对于Gp120 ELISA，96孔微板包覆了250 ng/孔的来自分化枝B（NIH AIDS reagent program, cat# 12026）的HIV-1 SF162 Gp140三聚体。小鼠血清以1:100、1:200、和1:400加以稀释，且将50 μl稀释了的血清添加至ELISA用微板。在单独注射了rVSV-HIV-1 Gp160的小鼠中和注射了表达Gag、Gp160和RT的每种蛋白的混合病毒的小鼠中（图30B，G3和G5），生成了对Gp120特异性的抗体。虽然在统计学意义上并不显著，Gp120抗体的滴度在注射了混合病毒的小鼠中比在注射了表达Gp160的单一病毒的小鼠中稍低。
29所示。对于细胞表面CD8分子和T细胞的细胞内IFN-γ，用FITC大鼠抗小鼠CD8和APC大鼠抗小鼠IFN-γ双标记受刺激的脾细胞。这个策略，用rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的初免-加强免免疫，诱导了肽特异性CD8+T细胞免疫应答，诱导程度取决于发明人用于刺激的肽。CD8+T细胞抗Env肽平均刺激了最高高达CD8+T细胞的19%-23%的CD8+T细胞（图28，G3和G5）。大约
4.5%或3%的CD8+T细胞对如下小鼠内的Gag蛋白是有应答的，该小鼠单独免疫了表达Gag的rVSV（图28，G2）或混合免疫了表达GagA、GagB和GagC的三种rVSV，其与HIV-1 Gp120和Gp41的各种B和T细胞抗原决定部位连接（图29，G6）。在注射了有pol基因的rVSV的小鼠内约2%的CD8+T细胞中生成了RT特异性CD8+T细胞（图28，G4）。与当对小鼠注射表达单一蛋白的rVSV的混合的rVSV相比（图28，G5），当对小鼠注射表达个体蛋白的单一rVSV时（图28，G2和G4），抗个体HIV -1蛋白、Gag和RT的CD8+T细胞应答更强烈。Env特异性CD8+T细胞应答是最强的，且在单注射和混合注射两者中是相似的。抗Env肽抗原决定部位的CD8+T细胞应答是免疫显性的。目前，发明人不确定为什么混合注射了表达Gag、Env和RT的三种不同rVSV比单一病毒注射诱导了相对较低的抗VSV N、gag和RT的CD8+T细胞应答。有可能是在混合病毒注射中抗原提呈细胞的每种病毒的竞争减弱了对Gag和RT的CD8+T细胞。因为在注射了单一rVSV或混合rVSV的小鼠中，rVSV是HIV-1蛋白常见的载体，所以在混合注射中VSV N预计会诱导相似的或更好的CD8+T细胞应答。然而，当Env如在混合注射中（图28，G5）一样被表达（图28，G3）时，即使采用单一注射，小鼠中抗VSV N的CD8+T细胞应答也更低。因此，它可能是Bal b/c小鼠中Env蛋白的免疫显性的结果，当Env一起表达时其负面地影响了其它蛋白对CD8+T蛋白的提呈。对于小鼠中的联合免疫，在单一部位注射了所有三种rVSV，其可能导致了不同蛋白对同一抗原提呈细胞的抗原提呈作用的竞争。发明人将测试在超过一个注射部位采用混合注射的免疫以诱导CD8+T细胞应答。在细胞中表达的HIV-1 Gag蛋白能够形成病毒样颗粒（VLP），且VLP能够从细胞中释放出来。释放出的VLP能够诱导抗Gag蛋白的体液免疫应答。
HIV-1 env基因编码糖基化的表面糖蛋白，其通过ER-高尔基体网络进行处理以适当地折叠并裂解成跨膜亚基Gp41和表面单元Gp120。Gp41和Gp120通过非共价键缔合，且成熟而形成Gp41和Gp120杂二聚体的三聚体。Gp41和Gp120的成熟的三聚体被输出到细胞表面。由于Gp41和Gp120之间的弱键合，Gp120倾向于从细胞表面掉落。因此，抗Gp120的抗体可以被诱导到细胞表面Gp120或从Gp120上脱落。抗HIV-1 Gag蛋白和Gp120的抗体滴度由ELISA确定。
对于Gag抗体，微板包覆了125 ng/孔重组体p55（Pierce Biotechnology, RP-4921），且对
50 μl小鼠血清稀释1:100、1:200和1:400后进行了试验。Gag抗体在单独注射了rVSVGag-En（图30A，G2）和注射了混合病毒rVSV-Gag A+rVSV Gag B+rVSV Gag C（图30A，G6）的小鼠中产生。对于Gp120 ELISA，96孔微板包覆了250 ng/孔的来自分化枝B（NIH AIDS reagent program, cat# 12026）的HIV-1 SF162 Gp140三聚体。小鼠血清以1:100、1:200、和1:400加以稀释，且将50 μl稀释了的血清添加至ELISA用微板。在单独注射了rVSV-HIV-1 Gp160的小鼠中和注射了表达Gag、Gp160和RT的每种蛋白的混合病毒的小鼠中（图30B，G3和G5），生成了对Gp120特异性的抗体。虽然在统计学意义上并不显著，Gp120抗体的滴度在注射了混合病毒的小鼠中比在注射了表达Gp160的单一病毒的小鼠中稍低。
[0203] 最近生成的rVSV、rVSVInd(GLM)和rVSVNJ(GM)的M突变体诱导了抗各种HIV-1蛋白的CD8+T细胞和体液免疫应答，HIV-1蛋白是在对小鼠注射了表达单一病毒的个体病毒或注射了表达各种HIV-1蛋白的混合病毒后由载体表达的。
[0204] 实施例15—具有丙型肝炎病毒结构性蛋白的rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的生成一般地，体液免疫应答是通过适应性免疫应答介导的抗任何病原体的第一道防线。尽管相比于HCV特异性细胞免疫应答，抗HCV的体液免疫应答和它在预防HCV感染中的作用没有深入地研究，但是将其列入能诱导HCV特异性抗体的疫苗是值得的。已经证明，核衣壳蛋白核心及表面糖蛋白E1和E2形成病毒样颗粒（VLP），其能够从细胞释放中被释放出来（Blanchard, E. et al., J. Virol. 76:4073-4079, 2002）。此外，已经证明，HCV蛋白p7，在ER膜中形成离子通道的离子孔道蛋白（viroporin），参与从受感染的细胞释放HCV颗粒（Steinmann, E. et al., PLoS Pathogens 3:962-972, 2007）。另一种HCV跨膜蛋白NS4B形成了膜状网结构，其主要由ER膜组成。由NS4B形成的膜状网是用于生产HCV后代的的微结构。NS4B在HCV的复制中具有的功能并不是众所周知的，但将NS4B列入候选疫苗中是吸引人的，只是因为它形成ER膜状结构的本性，ER中的其它HCV蛋白，尤其是核、E1、E2、P7是局部化的。因此，将核、E1、E2、P7和NS4B一起列入疫苗可以诱导体液和细胞免疫应答。
[0205] 对于使用新的M突变体rVSV的HCV结构性蛋白疫苗，发明人向VSV G基因和L的接合处，插入HCVcore基因、在一起的E1E2P7和NS4B基因（通过VSV基因间的接合序列（junction sequence）连接），及在一起的core E1E2P7和NS4B基因（通过VSV基因间的接合序列连接）（图31）。通过反向遗传学生成了rVSV；rVSVInd(GLM)-FC、rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B、rVSVNJ(GM)-FC和rVSVNJ(GLM)-E1E2P7/NS4B。发明人从质粒DNA生成具有CE1E2P7/NS4B的rVSVNJ(GM)存在困难，因此，发明人移除了核，且将E1E2P7/NS4B克隆到rVSVNJ(GLM)的质粒内，并生成了rVSVNJ(GLM)-E1E2P7/NS4B。通过蛋白印迹分析，使用抗每种蛋白的抗体，检查了在31℃和37℃下重组体VSV对核、E1、E2和NS4B的表达（图32）。在两个温度下，蛋白数量均等地得到表达。核（图32A）、E1（图32B）和E2（图32C）由rVSVInd(GLM)-CE1E2P7/NS4B很好地表达，但NS4B的表达低于其它蛋白（图32D）。
[0206] 实施例16—具有HCV非结构性蛋白的rVSVInd(GLM)、rVSVNJ(GM)和rVSVNJ(GLM)的生成为了对多个蛋白诱导HCV特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫应答，发明人想以大多数的HCV蛋白为目标，其包括核、E1、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。HCV非结构性（NS）蛋白-NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B覆盖了超过一半的HCV多聚蛋白。在NS4A的帮助下，NS3将NS蛋白裂解成个体蛋白。多项研究表明，从急性HCV感染恢复的病人发展了强烈的对抗NS3蛋白中多个抗原决定部位的CD4+T细胞和CD8+T细胞应答（Diepolder, H. M. J. Virol, 71:
6011-6019, 1997; Lamonaca, V, et al. Hepatology 30:1088-1098, 1999; Shoukry, N. H. et al. J. Immunol. 172:483-492, 2004），表明了将NS3列入疫苗候选中对引起成功的抗HCV的细胞免疫应答是重要的。NS3蛋白，丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶与NS4A联接，并且位于ER膜上（Sato, S. et al. J. Virol. 69:4255-4260, 1995; Failla, C. et al. J. Virol. 69:1769-1777, 1995）。NS5A蛋白，一种磷蛋白，据信与NS5B蛋白，RNA依赖性RNA聚合酶，一起参与了HCV RNA合成（Shirota, Y. et al., J. Biol. Chem., 277:11149-
11155, 2002; Shimakami, et al., J. Virol. 78:2738-2748, 2004）。NS5B蛋白是一种RNA依赖性RNA聚合酶，其合成了正义HCV基因组RNA以及中间体（intermediate）负义基因组RNA（Beherens, S. E. EMBO J. 15:12-22, 1996）。NS5B蛋白是一种尾部-瞄定的蛋白并通过它的羧基末端20氨基酸与ER膜联接（Yamashita, T. J. Biol. Chem. 273:15479-
15486, 1998; Hagedorn, C. H. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242:225-260,
2000）。
6011-6019, 1997; Lamonaca, V, et al. Hepatology 30:1088-1098, 1999; Shoukry, N. H. et al. J. Immunol. 172:483-492, 2004），表明了将NS3列入疫苗候选中对引起成功的抗HCV的细胞免疫应答是重要的。NS3蛋白，丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶与NS4A联接，并且位于ER膜上（Sato, S. et al. J. Virol. 69:4255-4260, 1995; Failla, C. et al. J. Virol. 69:1769-1777, 1995）。NS5A蛋白，一种磷蛋白，据信与NS5B蛋白，RNA依赖性RNA聚合酶，一起参与了HCV RNA合成（Shirota, Y. et al., J. Biol. Chem., 277:11149-
11155, 2002; Shimakami, et al., J. Virol. 78:2738-2748, 2004）。NS5B蛋白是一种RNA依赖性RNA聚合酶，其合成了正义HCV基因组RNA以及中间体（intermediate）负义基因组RNA（Beherens, S. E. EMBO J. 15:12-22, 1996）。NS5B蛋白是一种尾部-瞄定的蛋白并通过它的羧基末端20氨基酸与ER膜联接（Yamashita, T. J. Biol. Chem. 273:15479-
15486, 1998; Hagedorn, C. H. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242:225-260,
2000）。
[0207] 发明人克隆了HCV NS基因作为单一蛋白的基因，或2个或3个NS蛋白的多聚蛋白的基因。将NS基因NS3、NS34AB、NS5A、NS5B、NS5AB克隆到pVSVInd(GLM)和pVSVNJ(GM)的G基因和L基因的接合处（图33）。发明人生成了rVSVInd(GLM)-NS3、rVSVInd(GLM)-NS34AB、rVSVInd(GLM)-NS5A、rVSVInd(GLM)-NS5B和rVSVInd(GLM)-NS5AB，并且通过蛋白印迹分析，使用抗每种NS蛋白的抗体检查NS蛋白在31℃和37℃的表达（图34）。发明人生成了rVSVNJ(GM)-NS3、rVSVNJ(GM)-NS4B、rVSVNJ(GM)-NS34AB、rVSVNJ(GM)-NS5A、rVSVNJ(GM)-NS5B和rVSVNJ(GM)-NS5AB。通过蛋白印迹分析，使用抗每种NS蛋白的抗体检查rVSVNJ载体的每种蛋白在37℃的表达（图35）。虽然由rVSVInd和rVSVNJ的NS蛋白表达水平是不同的，但是它已经好到足以将它们用作HCV疫苗。
[0208] 实施例17—将突变引入到rVSVInd和rVSVNJ的M基因中及通过反向遗传学的重组体VSV的恢复将突变引入到VSVInd和VSVNJ的M基因中。通过大引物PCR方法，使在每个位点编码氨基酸的核苷酸序列突变。每种突变表达为在特定位点（例如M51R中的M51）的氨基酸与另一种氨基酸（例如M51R中的R）的置换。为了进一步减弱VSV的毒性，发明人将tsO23中的突变（G21E）与M基因中的蛋氨酸到精氨酸突变（M51R）及L111A结合起来，其降低了M蛋白对细胞蛋白质合成的抑制活性，此外，减少了VSV颗粒在非容许性温度（39℃）和半容许性温度（37℃）下的装配。rVSVInd和rVSVNJ的M基因中的核苷酸序列及氨基酸从野生型到突变体的变化示于表2、3、4和5中。改变的核苷酸密码子是有下划线的，且改变的核苷酸序列和氨基酸序列是粗体的。
[0209] 野生型和突变体重组体水疱性口炎病毒（rVSV）是通过反向遗传学从cDNA质粒恢复得到。VSV反向遗传学利用了表达噬菌体T7（T7）DNA依赖性RNA聚合酶的BHK21细胞、编码VSV（pVSV）的全长基因组RNA的质粒以及表达核衣壳蛋白（pN）、磷蛋白（pP）和VSV聚合酶L蛋白（pL）的3种质粒。全长基因组RNA及N、P和L蛋白的信使RNA的转录在T7 RNA聚合酶的控制之下。在每个VSV N、P和L基因的上游的内部核糖体进入位点（IRES）增强了蛋白的翻译。利用Lipofectamine™ 2000将质粒转染到BHK-T7细胞中，其中pN浓度为10 μg，pP浓度为10 μg，pL浓度为5 μg，及pVSV浓度为15 μg。当细胞显示约50-70%的CPE时，获取来自转染细胞的培养基。
[0210] 图36说明了rVSVInd(GLM)-new的全长基因组RNA的cDNA质粒的结构。
[0211] 首先，通过大引物方法，将prVSVInd(GLM)的M基因中M51R的AGG变成CGA。通过聚合酶链反应，该引物，Ind(GLM)M（F）和Ind(GLM)M（M51R），被用来扩增M基因带有额外的核苷酸变化的部分。第一种PCR产物与Ind(GLM) M（R）一起用作为大引物，以扩增具有核苷酸变化的整个M基因，且在限制性位点Not I将第二种PCR产物克隆到pBluescript II KS载体（Invitrogen）。在确认了M基因克隆中在R51带有CGA的核苷酸变化后，通过大引物PCR方法，使用引物Ind(GLM)M（F）和Ind(GLM)M（L111A）及Ind(GLM)M（R），引入了丙氨酸额外的核苷酸变化GCA。在Not I位点再次将PCR产物克隆到pBluescript II KS载体中。将有GAA（E）/CGA（R）/GCA（A）核苷酸变化的M基因从有限制性酶、Pac I和Not I的pBluescript II KS载体上剪切下来，并克隆到prVSVInd(GLM)中，其M基因通过Pac I和Not I剪切去除。
[0212] 引物：Ind(GLM) M (F); 5'-cgggcggccgcttaattaaactatgaaaaaaagtaacagat -3' [SEQ ID NO:11]
Ind (GLM) M(M51R); 5'-catgagtgtctcgctcgtcaac-3' [SEQ ID NO:12]
Ind (GLM) M(L111A); 5'-aagatcttggcttttgcaggttcttc-3' [SEQ ID NO:13]
Ind(GLM) M (R); 5'-cgggcggccgctagactagctcatttg-3' [SEQ ID NO:14]
图37 说明了rVSVNJ(GMM)-new的全长基因组RNA的cDNA质粒的结构。
Ind (GLM) M(M51R); 5'-catgagtgtctcgctcgtcaac-3' [SEQ ID NO:12]
Ind (GLM) M(L111A); 5'-aagatcttggcttttgcaggttcttc-3' [SEQ ID NO:13]
Ind(GLM) M (R); 5'-cgggcggccgctagactagctcatttg-3' [SEQ ID NO:14]
图37 说明了rVSVNJ(GMM)-new的全长基因组RNA的cDNA质粒的结构。
[0213] 通过大引物PCR方法，改变了rVSVNJ的M基因中的M48R和M51R的核苷酸。使用引物，NJ-M（F）和NJ-M（M48R+M51 R），扩增M基因上有核苷酸变化的部分，PCR产物与引物NJ-G(R)一起作为大引物，来扩增全长NJ M基因和G基因，目的是为了使用限制性酶位点Sac I。利用限制性内切酶Pac I剪切M和G PCR产物，并替换prVSVNJ(GMM)的M和G基因。
[0214] 引物：NJ-M (F); 5'-tccccgcggttaattaagatgaacgatatgaaaaaaact-3' [SEQ ID NO:15]
NJ-M(M48R+M51R); 5'- tatcatataaatctcgatcctctcgtccgaagaagtca-3' [SEQ ID
NO:16]
NJ-G (R); 5'-tccccgcggttaattaatttagcggaagtgagccat-3' [SEQ ID NO:17]
图38表明有额外的核苷酸变化的rVSVInd(GLM)-new（G21E/L111A/M51R）显示了与原始的rVSVInd(GLM（) G21E/L111F/M51R）相同的温度敏感性。
NJ-M(M48R+M51R); 5'- tatcatataaatctcgatcctctcgtccgaagaagtca-3' [SEQ ID
NO:16]
NJ-G (R); 5'-tccccgcggttaattaatttagcggaagtgagccat-3' [SEQ ID NO:17]
图38表明有额外的核苷酸变化的rVSVInd(GLM)-new（G21E/L111A/M51R）显示了与原始的rVSVInd(GLM（) G21E/L111F/M51R）相同的温度敏感性。
[0215] 恢复的病毒通过蚀斑挑选纯化了3次，并通过在31℃下MOI为0.1时感染BHK21细胞扩增为更大量的原种病毒。发明人在MOI为0.1时用rVSVInd(GLM)和rVSVInd(GLM)-new感染BHK21细胞。在容许性温度（31℃）和半容许性温度（37℃，体温）下培养受感染的细胞，以确定在病毒颗粒装配中新的M突变体的温度敏感性。在感染20小时后，收集来自受感染的细胞的培养基。通过Vero E6细胞的蚀斑试验确定培养基中具有传染力的病毒颗粒的数量。用于蚀斑试验的感染了突变体病毒的细胞在31℃培养。rVSVInd(GLM)和rVSVInd(GLM)-new两者在37℃都显示了相同的温度敏感性，表明M基因中额外的核苷酸变化没有改变rVSVInd(GLM)的温度敏感性。突变L111A显示了与L111F相同的温度敏感性，表明突变L111不是沉默突变。
[0216] 发明人进一步证明了新的rVSV载体在37℃（约体温）和在31℃（病毒扩增的温度）（数据没有呈现出来）20次传代后的稳定性。相比旧的GLM突变体（G21E/L110F/M51R），有进一步核苷酸变化（A的密码子gca和R的密码子cga）的新的GLM突变体（G21E/L111A/M51R）在20次传代后没有变回野生型序列（回复突变）。结果证明，新的GLM突变体用于人和其它动物中的接种是更稳定和更安全的。
[0217] 表1.小鼠接种组和策略表2. VSV印第安纳血清型野生型的M基因（SEQ ID NO: 1）和突变体G21E/L111A/M51R的M基因（SEQ ID NO 2）之间的核苷酸序列比较
1 50
SEQ ID NO: 1: ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
SEQ ID NO: 2: ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
51 100
SEQ ID NO: 1: TAAGAAATTA GGGATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
SEQ ID NO: 2: TAAGAAATTA GAAATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
101 150
SEQ ID NO: 1: AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
SEQ ID NO: 2: AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
151 200
SEQ ID NO: 1: ATGGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
SEQ ID NO: 2: CGAGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
201 250
SEQ ID NO: 1: AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
SEQ ID NO: 2: AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
251 300
SEQ ID NO: 1: TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
SEQ ID NO: 2: TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
301 350
SEQ ID NO: 1: AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT TTGGGTTCTT CTAATCTAAA
SEQ ID NO: 2: AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT GCAGGTTCTT CTAATCTAAA
351 400
SEQ ID NO: 1: GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
SEQ ID NO: 2: GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
401 450
SEQ ID NO: 1: ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
SEQ ID NO: 2: ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
451 500
SEQ ID NO: 1: ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
SEQ ID NO: 2: ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
501 550
SEQ ID NO: 1: CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
SEQ ID NO: 2: CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
551 600
SEQ ID NO: 1: AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
SEQ ID NO: 2: AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
601 650
SEQ ID NO: 1: TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
SEQ ID NO: 2: TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
651 700
SEQ ID NO: 1: TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA
SEQ ID NO: 2: TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA
表3.VSV印第安纳血清型野生型的M蛋白（SEQ ID NO: 3）和突变体G21E/L111A/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 4）之间的氨基酸序列比较
1 21 50
SEQ ID NO: 3: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
SEQ ID NO: 4: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL EIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
51 100
SEQ ID NO: 3: MDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
SEQ ID NO: 4: RDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
101 111 150
SEQ ID NO: 3: KRPFYKILAF LGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
SEQ ID NO: 4: KRPFYKILAF AGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
151 200
SEQ ID NO: 3: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
SEQ ID NO: 4: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
201 229 250
SEQ ID NO: 3: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK
SEQ ID NO: 4: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK
表4. VSV新泽西血清型野生型的M基因（SEQ ID NO: 5）与突变体G22E/M48R/M51R（SEQ ID NO: 6）的M基因和G22E/L110A/M48R/M51R的M基因（SEQ ID NO: 7）之间的核苷酸序列比较
1 50
SEQ ID NO: 5: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO: 6: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO: 7: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
51 100
SEQ ID NO: 5 :ATCAAAGAAA CTAGGCTTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO: 6 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO: 7 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
101 150
SEQ ID NO: 5 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG AATGGAGGAT
SEQ ID NO: 6 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG ACGAGAGGAT
SEQ ID NO: 7 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG ACGAGAGGAT
151 200
SEQ ID NO: 5 :ATGGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO: 6 :CGAGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO: 7 :CGAGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
201 250
SEQ ID NO: 5 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO: 6 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO: 7 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
251 300
SEQ ID NO: 5 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO: 6 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO: 7 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
301 350
SEQ ID NO: 5 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO: 6 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO: 7 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTGCA ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
351 400
SEQ ID NO: 5 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO: 6 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO: 7 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
401 450
SEQ ID NO: 5 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO: 6 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO: 7 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
451 500
SEQ ID NO: 5 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO: 6 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO: 7 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
501 550
SEQ ID NO: 5 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO: 6 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO: 7 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
551 600
SEQ ID NO: 5 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO: 6 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO: 7 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
601 650
SEQ ID NO: 5 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO: 6 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO: 7 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
651 700
SEQ ID NO: 5 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
SEQ ID NO: 6 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
SEQ ID NO: 7 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
表5. VSV新泽西血清型野生型的M蛋白（SEQ ID NO: 8）与突变体G22E/M48R/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 9）和G22E/L110A/M48R/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 10）之间的氨基酸序列比较
1 22 48 50
SEQ ID NO: 8 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LGLPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGMED
SEQ ID NO: 9 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED
SEQ ID NO: 10:MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED
51 100
SEQ ID NO: 8 :MDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
SEQ ID NO: 9 :RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
SEQ ID NO: 10:RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
101 110 150
SEQ ID NO: 8 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
SEQ ID NO: 9 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
SEQ ID NO: 10:KRPFYKIIAA IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
151 200
SEQ ID NO: 8 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
SEQ ID NO: 9 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
SEQ ID NO: 10:MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
201 250
SEQ ID NO: 8 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
SEQ ID NO: 9 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
SEQ ID NO: 10:IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
表6.对小鼠抗HIV-1蛋白的宽范围CD8+T细胞免疫应答和体液免疫应答的接种研究
1 50
SEQ ID NO: 1: ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
SEQ ID NO: 2: ATGAGTTCCT TAAAGAAGAT TCTCGGTCTG AAGGGGAAAG GTAAGAAATC
51 100
SEQ ID NO: 1: TAAGAAATTA GGGATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
SEQ ID NO: 2: TAAGAAATTA GAAATCGCAC CACCCCCTTA TGAAGAGGAC ACTAACATGG
101 150
SEQ ID NO: 1: AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
SEQ ID NO: 2: AGTATGCTCC GAGCGCTCCA ATTGACAAAT CCTATTTTGG AGTTGACGAG
151 200
SEQ ID NO: 1: ATGGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
SEQ ID NO: 2: CGAGACACTC ATGATCCGCA TCAATTAAGA TATGAGAAAT TCTTCTTTAC
201 250
SEQ ID NO: 1: AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
SEQ ID NO: 2: AGTGAAAATG ACGGTTAGAT CTAATCGTCC GTTCAGAACA TACTCAGATG
251 300
SEQ ID NO: 1: TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
SEQ ID NO: 2: TGGCAGCCGC TGTATCCCAT TGGGATCACA TGTACATCGG AATGGCAGGG
301 350
SEQ ID NO: 1: AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT TTGGGTTCTT CTAATCTAAA
SEQ ID NO: 2: AAACGTCCCT TCTACAAGAT CTTGGCTTTT GCAGGTTCTT CTAATCTAAA
351 400
SEQ ID NO: 1: GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
SEQ ID NO: 2: GGCCACTCCA GCGGTATTGG CAGATCAAGG TCAACCAGAG TATCACGCTC
401 450
SEQ ID NO: 1: ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
SEQ ID NO: 2: ACTGTGAAGG CAGGGCTTAT TTGCCACACA GAATGGGGAA GACCCCTCCC
451 500
SEQ ID NO: 1: ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
SEQ ID NO: 2: ATGCTCAATG TACCAGAGCA CTTCAGAAGA CCATTCAATA TAGGTCTTTA
501 550
SEQ ID NO: 1: CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
SEQ ID NO: 2: CAAGGGAACG GTTGAGCTCA CAATGACCAT CTACGATGAT GAGTCACTGG
551 600
SEQ ID NO: 1: AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
SEQ ID NO: 2: AAGCAGCTCC TATGATCTGG GATCATTTCA ATTCTTCCAA ATTTTCTGAT
601 650
SEQ ID NO: 1: TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
SEQ ID NO: 2: TTCAGAGATA AGGCCTTAAT GTTTGGCCTG ATTGTCGAGA AAAAGGCATC
651 700
SEQ ID NO: 1: TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA
SEQ ID NO: 2: TGGAGCTTGG GTCCTGGATT CTGTCAGCCA CTTCAAATGA
表3.VSV印第安纳血清型野生型的M蛋白（SEQ ID NO: 3）和突变体G21E/L111A/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 4）之间的氨基酸序列比较
1 21 50
SEQ ID NO: 3: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL GIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
SEQ ID NO: 4: MSSLKKILGL KGKGKKSKKL EIAPPPYEED TNMEYAPSAP IDKSYFGVDE
51 100
SEQ ID NO: 3: MDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
SEQ ID NO: 4: RDTHDPHQLR YEKFFFTVKM TVRSNRPFRT YSDVAAAVSH WDHMYIGMAG
101 111 150
SEQ ID NO: 3: KRPFYKILAF LGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
SEQ ID NO: 4: KRPFYKILAF AGSSNLKATP AVLADQGQPE YHAHCEGRAY LPHRMGKTPP
151 200
SEQ ID NO: 3: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
SEQ ID NO: 4: MLNVPEHFRR PFNIGLYKGT VELTMTIYDD ESLEAAPMIW DHFNSSKFSD
201 229 250
SEQ ID NO: 3: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK
SEQ ID NO: 4: FRDKALMFGL IVEKKASGAW VLDSVSHFK
表4. VSV新泽西血清型野生型的M基因（SEQ ID NO: 5）与突变体G22E/M48R/M51R（SEQ ID NO: 6）的M基因和G22E/L110A/M48R/M51R的M基因（SEQ ID NO: 7）之间的核苷酸序列比较
1 50
SEQ ID NO: 5: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO: 6: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
SEQ ID NO: 7: ATGAGTTCCT TCAAAAAGAT TCTGGGATTT TCTTCAAAAA GTCACAAGAA
51 100
SEQ ID NO: 5 :ATCAAAGAAA CTAGGCTTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO: 6 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
SEQ ID NO: 7 :ATCAAAGAAA CTAGAATTGC CACCTCCTTA TGAGGAATCA AGTCCTATGG
101 150
SEQ ID NO: 5 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG AATGGAGGAT
SEQ ID NO: 6 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG ACGAGAGGAT
SEQ ID NO: 7 :AGATTCAACC ATCTGCCCCA TTATCAAATG ACTTCTTCGG ACGAGAGGAT
151 200
SEQ ID NO: 5 :ATGGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO: 6 :CGAGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
SEQ ID NO: 7 :CGAGATTTAT ATGATAAGGA CTCCTTGAGA TATGAGAAGT TCCGCTTTAT
201 250
SEQ ID NO: 5 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO: 6 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
SEQ ID NO: 7 :GTTGAAGATG ACTGTTAGAG CTAACAAGCC CTTCAGATCG TATGATGATG
251 300
SEQ ID NO: 5 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO: 6 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
SEQ ID NO: 7 :TCACCGCAGC GGTATCACAA TGGGATAATT CATACATTGG AATGGTTGGA
301 350
SEQ ID NO: 5 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO: 6 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTCTG ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
SEQ ID NO: 7 :AAGCGTCCTT TCTACAAGAT AATTGCTGCA ATTGGCTCCA GTCATCTGCA
351 400
SEQ ID NO: 5 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO: 6 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
SEQ ID NO: 7 :AGCAACTCCA GCTGTGTTGG CAGACTTAAA TCAACCAGAG TATTATGCCA
401 450
SEQ ID NO: 5 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO: 6 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
SEQ ID NO: 7 :CACTAACAGG TCGTTGTTTT CTTCCTCACC GACTCGGATT GATCCCACCG
451 500
SEQ ID NO: 5 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO: 6 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
SEQ ID NO: 7 :ATGTTTAATG TGTCCGAAAC TTTCAGAAAA CCATTCAATA TTGGGATATA
501 550
SEQ ID NO: 5 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO: 6 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
SEQ ID NO: 7 :CAAAGGGACT CTCGACTTCA CCTTTACAGT TTCAGATGAT GAGTCTAATG
551 600
SEQ ID NO: 5 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO: 6 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
SEQ ID NO: 7 :AAAAAGTCCC TCATGTTTGG GAATACATGA ACCCAAAATA TCAATCTCAG
601 650
SEQ ID NO: 5 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO: 6 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
SEQ ID NO: 7 :ATCCAAAAAG AAGGGCTTAA ATTCGGATTG ATTTTAAGCA AGAAAGCAAC
651 700
SEQ ID NO: 5 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
SEQ ID NO: 6 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
SEQ ID NO: 7 :GGGAACTTGG GTGTTAGACC AATTGAGTCC GTTTAA
表5. VSV新泽西血清型野生型的M蛋白（SEQ ID NO: 8）与突变体G22E/M48R/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 9）和G22E/L110A/M48R/M51R的M蛋白（SEQ ID NO: 10）之间的氨基酸序列比较
1 22 48 50
SEQ ID NO: 8 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LGLPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGMED
SEQ ID NO: 9 :MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED
SEQ ID NO: 10:MSSFKKILGF SSKSHKKSKK LELPPPYEES SPMEIQPSAP LSNDFFGRED
51 100
SEQ ID NO: 8 :MDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
SEQ ID NO: 9 :RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
SEQ ID NO: 10:RDLYDKDSLR YEKFRFMLKM TVRANKPFRS YDDVTAAVSQ WDNSYIGMVG
101 110 150
SEQ ID NO: 8 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
SEQ ID NO: 9 :KRPFYKIIAL IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
SEQ ID NO: 10:KRPFYKIIAA IGSSHLQATP AVLADLNQPE YYATLTGRCF LPHRLGLIPP
151 200
SEQ ID NO: 8 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
SEQ ID NO: 9 :MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
SEQ ID NO: 10:MFNVSETFRK PFNIGIYKGT LDFTFTVSDD ESNEKVPHVW EYMNPKYQSQ
201 250
SEQ ID NO: 8 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
SEQ ID NO: 9 :IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
SEQ ID NO: 10:IQKEGLKFGL ILSKKATGTW VLDQLSPFK
表6.对小鼠抗HIV-1蛋白的宽范围CD8+T细胞免疫应答和体液免疫应答的接种研究
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用 | 2020-05-22 | 984 |
| 用于初免-加强疫苗的水疱性口炎病毒 | 2020-05-12 | 354 |
| 全基因合成鸡α干扰素基因及蛋白表达 | 2020-05-25 | 585 |
| 用于药用胰腺酶制剂中的病毒灭活的β-丙内酯 | 2020-05-19 | 77 |
| 全基因合成犬α干扰素基因及蛋白表达 | 2020-05-26 | 221 |
| 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用 | 2020-05-18 | 732 |
| 用于检测水疱性口炎病毒的引物、试剂盒及制备方法 | 2020-05-12 | 321 |
| 一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体 | 2020-05-21 | 755 |
| 一种口服禽干扰素融合蛋白及其作为免疫增强剂的应用 | 2020-05-18 | 799 |
| 用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法 | 2020-05-13 | 819 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈