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用于蛋白、肽和其他分子的F-18标记的改进方法和组合物

阅读：897发布：2020-08-12

专利汇可以提供用于蛋白、肽和其他分子的F-18标记的改进方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于PET或MRI成像的18F或19F标记分子的组合物以及所述标记分子的合成和使用方法。所述标记分子可以是肽或蛋白，尽管其他类型的分子可以被标记。优选地，通过形成金属复合物以及18F-或19F-金属复合物与螯合部分结合，18F或19F结合至靶向分子。或者，金属可以首先与螯合基团结合，然后18F或19F与所述金属结合。在其他实施方案中，18F或19F标记部分可以包括与靶向疾病相关抗原的双特异性抗体组合使用的可靶向构建体。18F或19F标记的可靶向构建体肽在37℃血清中稳定足以进行PET或MRI成像的时间。，下面是用于蛋白、肽和其他分子的F-18标记的改进方法和组合物专利的具体信息内容。

权利要求

18
1.一种用 F标记分子的方法，该方法包括：
18 18
a)使 F与金属反应以形成金属- F复合物；和
18 18
b)使所述金属- F复合物连接至分子以形成一个或多个待施用至受试者的 F-标记
分子。
18
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属- F复合物连接至所述分子的螯合部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子是蛋白或肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属选自由铝、镓、铟、镥和铊组成的组。
18
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述 F-标记分子在血清中稳定至少4小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述螯合部分选自由DOTA、TETA、NOTA、NETA、C-NETA、L-NETA、S-NETA或NOTA衍生物组成的组。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述肽选自由以下组成的组：IMP 449(NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 460(NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；IMP 461(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP
462(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 465(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 466(NOTA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl)；
IMP 467(C-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2；SEQ IDNO：20)；IMP 469(S-NETA-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)和IMP 470(L-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。
18
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在不使所述 F-标记分子与未标记分子分
18
离的情况下将所述 F-标记分子施用至受试者。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
18 18
c)使所述 F-标记分子与未标记分子分离以产生纯化的 F-标记分子；和
18
d)将所述纯化的 F-标记分子施用至受试者。
18
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述纯化的 F-标记分子在所述方法开始后不到一小时内产生。
18
11.根据权利要求9所述的方法，进一步包括使用PET扫描以成像所述纯化的 F-标
记分子在所述受试者中的分布。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属是铝。
18
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属- F复合物通过在95℃至110℃之间
的温度的水性介质中加热而连接至所述螯合部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中向所述水性介质添加有机溶剂。
18
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属- F复合物通过微波辐射而连接至所述螯合部分。
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16.一种用 F标记分子的方法，该方法包括：
18 18
a)使 F与硼反应以形成硼- F复合物；和
18 18
b)使所述硼- F复合物与分子连接以形成一个或多个待施用至受试者的 F标记分
子。
18
17.一种用 F标记分子的方法，该方法包括：
18
a)将 F添加至金属复合分子；和
18
b)使所述 F结合至所述金属。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述金属被连接至与所述分子结合的螯合部分。
18 18
19.一种 F-标记的蛋白或肽，其包含与所述蛋白或肽连接的金属- F复合物。
18
20.根据权利要求19所述的 F-标记的蛋白或肽，其中所述金属选自由铝、镓、铟、镥和铊组成的组。
18
21.根据权利要求19所述的 F-标记的蛋白或肽，其中所述金属是铝。
18
22.一种通过正电子发射断层摄影(PET)进行 F成像的方法，该方法包括：
18 18
a)使 F与选自由铝、镓、铟、镥或铊组成的组的金属反应以形成金属- F复合物；
18 18
b)使所述金属- F复合物与分子连接以形成一个或多个 F-标记分子；
18
c)将所述 F-标记分子施用至受试者；和
18
d)通过PET扫描成像所述 F-标记分子的分布。
18 18
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子在不使所述 F-标记分子与未标记分子分离的情况下被施用至所述受试者。
24.根据权利要求12所述的方法，进一步包括：
18 18
e)在所述 F-标记分子被施用至所述受试者之前使所述 F-标记分子与未标记分子
18
分离以产生纯化的 F-标记分子。
18
25.根据权利要求22所述的方法，其中被成像的 F-标记分子分布指示疾病的存在或不存在。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：实体癌症(癌、肉瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌)、造血系统癌症(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、自身免疫疾病、神经变性疾病、阿尔茨海默病、心脏病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌坏死、血栓形成、中风、炎症、粥样硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、AIDS和病原体感染。
18
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子用于成像受体。
18
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述受体是血管发生受体，并且所述 F-标记
18
分子是[Al F]结合的RGD-NOTA。
18
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子用于成像肿瘤。
18 18
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述 F-标记分子是 F-标记的铃蟾肽或奥曲肽。
18
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述 F-标记分子是选自由hLL1、hLL2、
hImmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu-9、hMN-3、hMN-15和hL243组成的组的抗体或其片段。
18 18
32.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子是 F-标记的NOTA、C-NETA
18
或赖氨酸-NETA，并且所述 F-标记分子用于成像肾血流。
18
33.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子使用抗体、抗体片段或抗体构建体被靶向目标部位。
18
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述 F-标记分子是使用双特异性抗体被靶向目标部位的可靶向构建体。
35.根据权利要求34所述的方法，进一步包括：
i)将双特异性抗体施用至受试者，所述双特异性抗体具有至少一个可靶向构建体结合部位和至少一个靶向抗原结合部位，其中所述靶向抗原的存在指示疾病或病症；和ii)在施用所述可靶向构建体之前允许足量的时间以使未与靶向抗原结合的双特异性抗体从循环中清除。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶向抗原是肿瘤相关抗原。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述靶向抗原存在于病原生物上。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、酵母或微生物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述病毒选自由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、EB病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒；或者所述细菌选自由以下组成的组：无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产杆菌、结核丝杆菌和破伤风杆菌。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述靶向抗原选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、IGF-1R、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、ED-B纤连蛋白、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、PSMA、EGP-1、EGP-2、AFP、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、和癌基因产物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述双特异性抗体包括选自由hLL1、hLL2、hImmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu-9、hMN-3、hMN-15和hL243组成的组的抗体或其片段。
18
42.一种用于 F标记的试剂盒，该试剂盒包括：
18
a)与 F形成复合物的金属；
18
b)任选地，包含一个或多个螯合部分以结合金属- F复合物的靶向肽。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，进一步包括一种或多种缓冲液。
44.根据权利要求42所述的试剂盒，进一步包括辐射分解保护剂。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述辐射分解保护剂是抗坏血酸。
46.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述肽是IMP 449、IMP 460、IMP461、IMP
462、IMP 465、IMP 466、IMP 467、IMP 468、IMP 469或IMP 470。
47.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述金属是铝、镓、铟、镥或铊。
48.根据权利要求42所述的试剂盒，进一步包括双特异性抗体，所述抗体具有一种针对靶向肽的结合特异性和另一种针对靶抗原的结合特异性。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述靶抗原是肿瘤相关抗原。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、IGF-1R、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、ED-B纤连蛋白、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、PSMA、EGP-1、EGP-2、AFP、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、和癌基因产物。
51.根据权利要求48所述的试剂盒，进一步包括从循环中清除未与所述靶抗原结合的双特异性抗体的清除剂。
19
52.一种用 F标记分子的方法，该方法包括：
19 19
a)使 F与金属反应以形成金属- F复合物；和
19 19
b)使所述金属- F复合物连接至分子以形成一个或多个待施用至受试者的 F-标记
分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述复合物连接至所述分子的螯合部分。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述分子是蛋白或肽。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述金属选自由铝、镓、铟、镥和铊组成的组。
19
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述 F-标记分子在血清中稳定至少4小时。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述螯合部分选自由DOTA、TETA、NOTA、NETA、C-NETA、L-NETA、S-NETA或NOTA衍生物组成的组。
58.根据权利要求54所述的方法，其中所述肽选自由以下组成的组：IMP449(NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 460(NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2；IMP 461(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP
462(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 465(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 466(NOTA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl)；
IMP 467(C-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)；IMP 468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2；SEQ IDNO：20)；IMP 469(S-NETA-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)和IMP 470(L-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。
19
59.根据权利要求52所述的方法，进一步包括在不使所述 F-标记分子与未标记分子
19
分离的情况下将所述 F-标记分子施用至受试者。
60.根据权利要求52所述的方法，进一步包括：
19 19
c)使所述 F-标记分子与未标记分子分离以产生纯化的 F-标记分子；和
19
d)将所述纯化的 F-标记分子施用至受试者。
19
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述纯化的 F-标记分子在所述方法开始后不到一小时内产生。
19
62.根据权利要求60所述的方法，进一步包括使用MRI成像以成像所述纯化的 F-标记分子在所述受试者中的分布。
63.根据权利要求52所述的方法，其中所述金属是铝。
19
64.一种通过核磁共振成像(MRI)对 F进行成像的方法，该方法包括：
19 19
a)使 F与选自由铝、镓、铟、镥或铊组成的组的金属反应以形成金属- F复合物；
19 19
b)使所述金属- F复合物与分子连接以形成一个或多个 F-标记分子；
19
c)将所述 F-标记分子施用至受试者；和
19
d)通过MRI成像所述 F-标记分子的分布。
19
65.根据权利要求61所述的方法，其中被成像的 F-标记分子分布指示疾病的存在或不存在。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：实体癌症(癌、肉瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌)、造血系统癌症(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、自身免疫疾病、神经变性疾病、阿尔茨海默病、心脏病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌坏死、血栓形成、中风、炎症、粥样硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、AIDS和病原体感染。
19
67.根据权利要求64所述的方法，其中所述 F-标记分子用于成像肿瘤。
19 19
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述 F-标记分子是 F-标记的铃蟾肽或奥曲肽。
19
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述 F-标记分子是选自由hLL1、hLL2、
hImmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu-9、hMN-3、hMN-15和hL243组成的组的抗体或其片段。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述靶向抗原是肿瘤相关抗原。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述靶向抗原选自由以下组成的组：结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD66a-d、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD138、HLA-DR、Ia、Ii、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA、EGFR、HER 2/neu受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、生腱蛋白、叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101和MAGE。
72.一种合成NOTA衍生物的方法，该方法包括：
a)生成NOTA二-叔丁基酯；和
b)使用所述NOTA二-叔丁基酯制备NOTA衍生物。
73.一种合成NOTA衍生物的方法，该方法包括：
a)生成琥珀酰四-叔丁基酯C-NETA；和
b)使用所述琥珀酰四-叔丁基酯C-NETA制备NOTA衍生物。
27 19
74.一种组合物，包括与螯合部分复合的 Al F，其中所述复合物在室温下水性介质中稳定。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述螯合部分选自由DOTA、TETA、NOTA、NETA、C-NETA、L-NETA、S-NETA或NOTA衍生物组成的组。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述螯合部分是NOTA。

说明书全文

用于蛋白、肽和其他分子的F-18标记的改进方法和组合物

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请是2008年12月24日提交的美国专利申请序号12/343,655的部分继续，美国专利申请序号12/343,655是2008年4月30日提交的美国专利申请序号12/112,289的部分继续，美国专利申请序号12/112,289是2007年12月19日提交的美国专利申请序号11/960,262的部分继续，美国专利申请序号11/960,262要求2007年1月11日提交的美国临时专利申请号No.60/884,521在35U.S.C.§119(e)下的权益，每一个专利申请在此通过引用整体并入。

技术领域

[0003] 在某些实施方案中，本发明涉及用18F标记肽或其他分子的简单方法，18F用于体内18
成像。优选地，F与铝或另一种金属通过螯合部分连接为结合物[复合物]，所述螯合部分
18
可共价连接至蛋白质、肽或其他分子。在施用至患者时，F-标记的肽/分子的优选比活度为约500至1,000、更优选1,000至2,000、更优选1,000至5,000Ci/mmol。也可以使用100至数万Ci/mmol范围内的比活度。尽管较高比活度对于某些成像应用是优选的，但在其他替代实施方案中，可以使用具有NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸)或另一种螯
18
合剂的金属- F复合物的较低比活度，例如作为肾血流成像剂或心脑成像剂来成像血流。
18
优选地，F标记的完成不需要纯化步骤来分离未标记的肽/分子与标记的肽/分子。更优
18
选地，F-标记的肽或其他分子在体内条件下、例如在人血清中稳定至少数小时。在最优选
18
的实施方案中，F-标记分子可以适合成像研究的形式在一小时或更短时间内制备。使用
18
所公开的方法，分子标记可以在短至5分钟内完成。 F-标记分子用于例如PET成像技术。
19
在替代实施方案中，标记方法可用于其他氟同位素，例如 F，例如用于NMR成像技术。

背景技术

[0004] 正电子发射断层摄影(PET)已经成为诊断医学中最重要的功能成像模式之一，具有极高的灵敏度(fmol)、高分辨率(4-10mm)和可被适当定量的组织增积(Volkow等，1988，18 18
Am.J.Physiol.Imaging 3：142)。尽管[ F]2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖([ F]FDG)是肿瘤学中最广泛使用的功能成像剂(Fletcher等，2008，J.Nucl.Med.49：480)，但在开发功能成像的其他标记化合物以补充或增进解剖成像方法中存在浓厚兴趣(Torigian等，2007，CA Cancer J.Clin.57：206)，特别是目前使用的组合型PET/计算机断层摄影系统。因此，需要具有使放射正电子的放射性核素与各种生物学和药学目标分子结合的简易方法。

[0005] 肽或其他小分子可以用正电子发射体例如18F、64Cu、11C、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、86Y和124
I来标记。同位素核发射的正电子使用不同的能量射出，取决于使用的同位素。当正电子与电子反应时，以相反方向发射两个511keVγ射线。射出正电子的能量决定正电子在撞击电子而被消灭之前的移行距离。发射能量越高，正电子在与电子碰撞之前移行越长。PET同位素的较低发射能量是希望的，以使正电子在产生被PET相机成像的两个511keVγ射线之前从靶位点移行的距离最短。许多发射正电子的同位素在其衰变链中还具有其他发射，例如γ射线、α粒子或β粒子。还希望具有是纯正电子发射体的PET同位素，以使任何剂量问题最小化。

[0006] 同位素的半衰期也是重要的，因为半衰期必须足够长以使同位素连接至靶向分子，分析产物，将其注入患者，并允许产物定位、从非靶组织清除并然后成像。如果半衰期太长，则比活度不足够高以获得足以清晰图像所需的足够光子，而如果半衰期太短，则生产、商业分销和生物分布所需的时间可能不足。因为具有低的正电子发射能量、没有旁发射和18 +
适合的半衰期，F(β635keV 97％，t1/2 110min)是最广泛使用的PET发射同位素之一。

[0007] 产生具有高比活度的18F。当同位素连接至靶向分子时，通常伴随一些未反应的靶向剂，与放射性标记产物相比，其经常以大摩尔过量存在。通常，标记产物和未标记产物可18
以体内竞争相同的靶，因此，冷靶向剂的存在降低了靶向剂的有效比活度。如果 F与具有很高吸收的分子(例如2-氟-2-脱氧葡萄糖(FDG))连接，则有效比活度不是那么重要。然而，如果使用标记肽来靶向受体或者使用有限数目的可用结合部位来进行免疫PET预靶向研究，如果冷靶向剂过量存在，则冷靶向剂可潜在阻碍放射性标记的靶向剂的吸收。

[0008] 常规地，18F通过结合至碳原子而连接至化合物(Miller等，2008，Angew ChemInt Ed 47：8998-9033)，但是也已经报道了连接至硅(Shirrmacher等，2007，BioconjChem 18：2085-89；Hohne等，2008，Bioconj Chem 19：1871-79)和boron(Ting等，2008，Fluorine Chem 129：349-58)。结合至碳通常涉及多步合成，包括多个纯化步骤，这对具有110-min半
18
衰期的同位素而言是有问题的。目前用于肽的 F标记方法通常包括低比活度试剂的标记，试剂的HPLC纯化，然后结合至目标肽。结合物通常在结合后被再次纯化以获得希望的标记肽比活度。

[0009] 一个实例是 Poethko 等 (J.Nucl.Med.2004；45：892-902) 的标记方18
法，其中4-[ F]氟苯甲醛被首先合成并纯化(Wilson等，J.Labeled Compounds
andRadiopharm.1990；XXVIII：1189-1199)，然后结合至肽。然后通过HPLC纯化肽结合物以
18
去除用来促进结合完全的过量肽。其他实例包括用以下物质标记：琥珀酰[ F]氟代苯甲酸酯(SFB)(例如，Vaidyanathan等，1992，Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 19：275)，其他酰基化合物(Tada等，1989，Labeled Compd.Radiopharm.XXVII：1317；Wester等，1996，Nucl.Med.Biol.23：365；Guhlke等，1994，Nucl.MEd.Biol 21：819)，或点击化学加合物(Li等，2007，Bioconjugate Chem.18：1987)。这些方法的总合成和配制时间范围为1-3小时，大部分时
18
间用于标记肽的HPLC纯化以获得体内靶向所需的比活度。如果 F具有长半衰期，则多次
18
反应和纯化将不是问题。然而，如果是2小时半衰期，则使 F与肽连接所需的所有操作是很大的负担。这些方法操作冗长并且需要使用专门设计来产生标记产物的设备和/或需要专门专业化学人员的努力。它们也不利于可常规用于临床环境的试剂盒配制。

[0010] 用于递送标记加合物至肿瘤或其他靶组织的一个替代方法包括预靶向方法(例如，美国专利号7,052,872；7,074,405；7,138,103，每一个在此通过引用并入)。使用双特异性抗体(bsMAb)预靶向程序的在先研究(例如，McBride等，2006，J.Nucl.Med.10：124 18
1678-88)集中于 I的使用，在动物模型中获得了比直接放射性标记片段或 F-FDG更好的
124
对结肠癌异种移植物的靶向。虽然该技术具有令人印象深刻的结果，但是 I不是该成像程序可行的候选物，主要是因为其高成本(每剂量超过$2000)和与其他可选物相比相对差的成像性质。因为许多原因，其他基于抗体的靶向方法必须依赖于放射性碘标记的产物，主要是因为肿瘤/背景比在达到可接受水平之前需要＞6h。然而，预靶向方法可以在1小时内实现可接受的成像条件(Hamacher等，1986，J.Nucl.Med.27：235；Iwata等，2000，Appl.Radiat.Isot.52：87)。

[0011] 需要快速简单的18F标记靶向部分(例如蛋白或肽)的方法，产生具有适合检测和/或成像的比活度的靶向构建体，同时最大限度减少对专门设备或高度培训人员的需求18
并减少操作人员暴露于高水平放射。更优选地，需要制备用于预靶向技术的 F标记的靶向肽。还需要可提供进行这种新方法所需的组合物的预包装试剂盒。

发明内容

[0012] 氟化物实际上与所有其他元素结合，并且那些键中的一些是相对稳定的。已知带有金属结合配体的肽以稳定结合放射性金属并具有非常高的比活度。本发明使用的方法18 18
是首先使 F与金属结合，然后使 F金属复合物与肽上的配体螯合。最初的问题是选择哪种金属。IIIA族金属(铝、镓、铟和铊)是首选。也可以使用镥。使用金属结合配体连接
18
F-金属复合物与蛋白、肽或其他分子也是重要的，因为不同的金属以不同的亲和力结合各种螯合剂，例如NOTA、NETA、DOTA、DTPA和在下文更详细讨论的其他螯合基团。或者，可以
18
首先使金属或其他原子与肽连接，然后添加 F。

[0013] 据报道，氟化铝复合物在体外是稳定的(Martinez等，Inorg.Chem.1999；38：4765-4660；Antonny等J.Biol.Chem.1992；267：6710-6718)。氟化铝结合入骨和牙釉质，因此该复合物在体外也可以是稳定的(Li，Crit.Rev.Oral Biol.Med.2003；14：100-114)。

[0014] 熟练技术人员将发现，实际上任何递送分子可用于连接成像目的的18F，只要其含有可以被修饰而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间配体-受体结合相互作用的可18
衍生化基团。尽管下文实施例关注 F-标记的肽部分，但是许多其他类型的递送分子，例如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调节
18
剂、蛋白、核酸、抗体、抗体片段、药物、白介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等可以被 F-标记并用于成像目的。

[0015] 类似地，可以被成像的疾病或病症的类型仅受用于靶向与疾病或病症相关的细胞或组织的适合递送分子的可用性限制。许多此类递送分子是已知的，例如在下文实施例中示例的。例如，与患病组织或靶(例如癌症)结合的任何蛋白或肽可以通过所公开的方法18
用 F标记并用于检测和/或成像。在某些实施方案中，此类蛋白或肽可以包括但不限于结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体或抗体片段。任何已知的TAA结合抗体或片段可以通过所描
18
述的方法用 F标记并用于肿瘤的成像和/或检测，例如通过PET扫描或其他已知技术。

[0016] 在下文的某些实施例中，示例性的18F-标记的肽可在使用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中作为可靶向构建体而用于成像目的。在这种情况下，抗体或片段将包括疾病或病症相关靶的一个或多个结合部位，所述靶例如肿瘤相关抗原或自身免疫疾病相关抗原或病原生物产生或展示的抗原，所述病原生物例如病毒、细菌、真菌或其他微生物。第二结合部位将特异性结合至可靶向构建体。使用双特异性或多特异性抗体进行预靶向的方法是本领域公知的(参见例如，美国专利号6,962,702，其实施例部分在此通过引用并入)。类似地，结合可靶向构建体的抗体或其片段也是本领域公知的(同上)，例如与HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体。一般在预靶向方法中，双特异性或多特异性抗体首先被施用并被允许结合至细胞或组织靶抗原。在未结合抗体从循环中清除适18
量时间之后，例如 F-标记的可靶向构建体被施用至患者并结合至集中于靶细胞或组织的抗体，然后例如通过PET扫描进行成像。

[0017] 在替代的示例性实施方案中，非肽受体靶向剂(例如叶酸)可以结合至NOTA或另18
一种螯合部分，然后用例如与NOTA结合的 F-金属复合物标记。这种非肽受体靶向剂可以包括例如TA138，一种整联蛋白αvβ3受体的非肽拮抗剂(Liu等，2003，Bioconj.Chem.14：
18
1052-56)。可以与DOTA、NOTA或 F-金属复合物的另一种螯合剂结合的本领域已知的类似的非肽靶向剂可用于要求保护的方法中。其他受体靶向剂是本领域已知的，例如促生长
18
素抑制素受体靶向剂In-DTPA奥曲肽如下文讨论的，F-金属复合物可能使用
18
DTPA被螯合并用于成像目的。NODAGATOC肽可用Al F标记用于促生长素抑制素受体靶向(Eisenwiener等Bioconj.Chem.2002，13(3)：530-41)。使用金属螯合剂受体靶向成像的其他方法是本领域已知的并且可用于实施要求保护的方法(参见例如，Andre等，2002，J.Inorg.Biochem.88：1-6；Pearson等，1996，J.Med.，Chem.39：1361-71)。

[0018] 通过PET扫描用于18F成像的成像技术和设备也是本领域公知的(参见例如，美国专利号6,358,489；6,953,567；Page等，Nuclear Medicine And Biology，21：911-919，1994；Choi等，Cancer Research 55：5323-5329，1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.，33：
575-582，1992)，并且可以使用任何此类已知的PET成像技术活设备。

[0019] 尽管下文实施例说明使用18F-金属复合物用于PET成像，但熟练技术人员将发现，27 19
稳定的金属-氟化物复合物，例如非放射性 Al和 F复合物也可以结合至NOTA或其他螯合剂并连接至用作MRI造影剂的肽或其他靶向剂。[AlF]-螯合剂复合物也可连接至聚合物用于MRI成像。AlF-螯合剂衍生物可用作PARACESTMRI成像剂(Woessner等Magn.Reson.Med.2005，53：790-99)。
附图说明

[0020] 附图被包括以示例说明本发明的特定实施方案并且不意味着限制要求保护的主题的范围。

[0021] 图1.111In和18F标记的IMP 449在小鼠中生物分布的对比，有或没有TF2双特异性抗体。

[0022] 图2.18F-标记的物质在肿瘤携带裸小鼠中的生物分布，通过显微PET成像。在每个左肋携带小的皮下LS174T肿瘤的3只裸小鼠在注射以下任一个之后的冠状切片：(A)18 18 18
[ F]FDG、(B)用抗-CEA x抗-HSG bsMAb预靶向的Al[ F]IMP449、(C)单独的Al[ F]IMP
449(未用bsMAb预靶向)。在成像期结束时给出从动物取出的组织的生物分布数据，表示为每克百分比注射剂量(％ID/g)。缩写：B，骨髓；H，心脏；K，肾；T，肿瘤。

[0023] 图3.给至在上肋携带35-mg LS174T人结肠直肠癌异种移植物的裸小鼠的预靶向18
Al[ F]IMP 449的动态成像研究。上方三个图板分别显示冠状、径向和横向截面，经120分钟的成像期在6个不同的5分钟间隔取自集中于肿瘤外周位置的身体区域。每个剖视图中左侧第一个图像显示十字线交叉处肿瘤的定位，由箭头突出显示。动物在成像期间向其右侧部分倾斜。下方2个图板显示其他冠状和径向截面，定位于冠状截面更前方的平面以突出显示在肝和肠中的分布，而径向视图在身体中更中心地交叉。缩写：Cor，冠状；FA，前臂；
H，心脏；K，肾；Lv，肝；Sag，径向；Tr，横向；UB，膀胱。

[0024] 图4.四叔丁基C-NETA-琥珀酰的合成。

[0025] 图5.四叔丁基C-NETA-琥珀酰的合成细节。

[0026] 图6.二叔丁基NOTA的合成。

[0027] 图7.四叔丁基L-NETA的合成。

[0028] 图8.C-NETA和L-NETA之间的结构差异。

[0029] 图9.S-NETA的合成方案。

[0030] 图10.18F-标记的IMP 468铃蟾肽类似物的体内组织分布。

[0031] 图11.NOTA衍生物。(A)IMP 467的NOTA配体，(B)NOTA的亚氨基二乙酸衍生物。

[0032] 图12.示例性的NOTA亚氨基二乙酸衍生物(A)一个亚氨基二乙酸从环氮引出。(B)一个亚氨基二乙酸从氮引出，一个亚氨基二乙酸连接至碳。(C)两个亚氨基二乙酸从碳引出。

[0033] 图13.在p.i.2h，AR42J肿瘤携带小鼠(n＝5)中18F-IMP 466和68Ga-IMP 466的生物分布对比。作为对照，单独组的小鼠(n＝5)接收过量未标记的奥曲肽以证明受体特异性。

[0034] 图14.在p.i.2h，颈部具有a s.c.AR42J肿瘤的小鼠中18F-IMP 466和68Ga-IMP466的PET/CT扫描的冠状截面。清晰可见肿瘤和肾中的累积。

[0035] 图15.在用递增剂量的TF2预靶向之后，0.01nmol 111In-IMP 288的生物分布。值被给出为平均值±标准偏差(n＝5)。

[0036] 图16.在i.v.注射68Ga-IMP 288后1小时，具有皮下LS174T和SK-RC52肿瘤的125 68
BALB/c裸小鼠中6.0nmol I-TF2(0.37MBq)和0.25nmol Ga-IMP 288(5MBq)的生物分布。
值被给出为平均值±标准偏差(n＝5)。

[0037] 图17.在用6.0nmol TF2预靶向之后i.v.注射后1小时，5MBq FDG和5MBq68Ga-IMP288(0.25nmol)的生物分布。值被给出为平均值±标准偏差(n＝5)。

[0038] 图18.在右后腿具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)(亮箭头)并且在左大腿肌肉具有18
炎症(暗箭头)的BALB/c裸小鼠的PET/CT图像，所述小鼠接收了5MBq F-FDG并且在一天
68 18
后以16小时的间隔接收了6.0nmol TF2和5MBq Ga-IMP288(0.25nmol)。动物在 F-FDG
68
和 Ga-IMP 288注射后一小时被成像。图板显示FDG-PET扫描的3D体积透视(A)、肿瘤区域的横截面(B)，以及预靶向免疫PET扫描的3D体积透视(C)、肿瘤区域的横截面(D)。

[0039] 图 19. 在之前 16 小时 6.0nmol TF2，i.v. 注射后 1 小时，0.25nmol18 18 18
Al F-IMP449(5MBq)的生物分布，没有预靶向的Al F-IMP 449的生物分布，或Al[ F]的生物分布。值被给出为平均值±标准偏差。

[0040] 图20.以16小时的间隔静脉内接收6.0nmol TF2和0.25nmol Al18F-IMP449(5MBq)的、在右侧具有皮下LS174T肿瘤(0.1g)(箭头)的BALB/c裸小鼠的静态PET/
18
CT成像研究。动物在注射Al F-IMP 449之后被成像。图板显示3D体积透视(A)后视图，以及在肿瘤区域的横截面(B)冠状、(C)径向。

具体实施方式

[0041] 提供下述定义以帮助理解本文公开内容。未明确定义的术语根据其明显且普通的含义使用。

[0042] 本文使用的术语“一”或“一个”可以表示一个或超过一个的项目。

[0043] 本文使用的术语“和”和“或”可以用来表示合取或析取。即，除非另有说明，否则两个术语都应该被理解为等价于“和/或”。

[0044] 本文使用的“约”表示在数字的+％或-10％之内。例如，“约100”指90和110之间的任何数字。

[0045] 本文使用的“肽”指长度为2至100氨基酸残基、更优选长度为2至10、更优选在2至6氨基酸的天然存在或非天然存在氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。

[0046] 如本文使用，当标记分子与未标记分子部分或完全分离时，标记分子是“纯化的”，使得标记分子级分与起始混合物相比是富集的。“纯化的”标记分子可以包括几乎任何比例的标记分子和未标记分子，包括但不限于约5∶95；10∶90；15∶85；20∶80；25∶75；30∶70；40∶60；50∶50；60∶40；70∶30；75∶25；80∶20；85∶15；90∶10；95∶5；
97∶3；98∶2；99∶1和100∶0。

[0047] 本文使用的术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒、寄生虫和细菌，包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳房肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、EB病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilis influenzae B)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产杆菌(Brucella abortus)、结核丝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风杆菌(Chlostridium tetani)。

[0048] 本文使用的“辐射分解保护剂”指北添加至18F-标记的复合物或分子以增加18F-标记的复合物或分子被辐射分解的分解速率。可以使用任何已知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。

[0049] 18F标记技术的对比

[0050] 用18F标记分子的许多技术是已知的。表1列出了几种较普遍报道的氟化程序的18
性质。通过碳的肽标记经常包括通过亲核取代 F-结合至辅基，通常以2或3个步骤，其中所述辅基被标记并纯化，连接至化合物，然后再次纯化。该通用方法已经用于经酰胺键、醛和“点击化学”连接辅基(Marik等，2006，BioconjugChem 17：1017-21；Poethko等，2004，J Nucl Med 45：892-902；Li等，2007，BioconjugChem 18：989-93)。最常见的酰胺键形成试
18 18
剂是4- F-氟代苯甲酸N-琥珀酰亚氨酯( F-SFB)，但是已经测试了许多其他基团(Marik
18
等，2006)。在一些情况下，例如当使用 F-标记的活性酯酰胺形成基团时，可能有必要在偶
18
联反应期间保护肽上的某些基团，之后切除它们。该 F-SFB试剂的合成以及随后与肽的结合需要许多合成步骤并耗费约2-3小时。

[0051] Poethko等(2004)开发了一种更简单、更有效的18F-肽标记技术，其中4-18F-氟代苯甲醛试剂通过肟键合在约75-90min内结合至肽，包括离心干燥(dry-down)步骤。更18
新的“点击化学”方法在铜催化剂存在下用乙炔或叠氮化物将 F-标记分子连接至肽(Li等，2007；Glaser和Arstad，2007，Bioconjug Chem18：989-93)。叠氮化物与乙炔基团之间的反应形成三唑连接，该连接是非常稳定的并且在肽上非常有效地形成而无需保护基。使
18
用离心干燥步骤，点击化学在约75-90min内以良好收率(～50％)产生 F-标记的肽。

[0052] 表1.选择的18F-肽标记方法的概述

[0053]

[0054] a包括离心干燥时间

[0055] b衰减校正后

[0056] 18F结合至硅的最近方法使用同位素交换来用18F代替19F(Shirrmacher等，2007)。在室温下10min内进行，该反应产生具有高比活度(225-680GBq/μmol；6,100-18,400Ci/
18
mmol)的 F-醛辅基，并且在40min(包括离心干燥)内以～55％收率获得纯化的标记的肽。该方法后来通过在标记反应之前将硅结合入肽而被调整为一步过程(Hohne等，2008)。
18
然而，使用 F-硅-铃蟾肽衍生物在小鼠中的生物分布研究显示，骨吸收随时间增加(0.5h
18
的1.35±0.47％注射剂量(ID)/g与4.0h的5.14±2.71％ID/g)，表明 F从肽释放，因为
18 18
已知未结合的 F集中在骨中(Hohne等，2008)。尿的HPLC分析显示空隙体积中大量的 F
18 18
活度，推测这是由于从肽释放的 F-氟离子。因此，似乎 F-硅标记分子在血清中不稳定。
18
还报道了大量的肝胆排泄，归因于 F-硅-结合底物的亲脂性，因此需要未来的衍生物是
18
更亲水性的。还研究了使 F连接至硼的方法；然而，现有方法产生具有低比活度的结合物(Ting等，2008)。

[0057] 抗体和肽与放射性金属常规偶联，通常在15分钟内并具有定量收率(Meares等，1984，Acc Chem Res 17：202-209；Scheinberg等，1982，Science 215：1511-13)。为64 68
了PET成像，Cu和更近期 Ga通过螯合剂被结合至肽，并已经显示相当好的PET-成像
性质(Heppler等，2000，Current Med Chem 7：971-94)。因为氟化物结合大部分金属，
18
我们寻求确定 F-金属复合物是否能够结合至靶向分子上的螯合剂(Tewson，1989，Nucl Med Biol.16：533-51；Martin，1996，Coordination Chem Rev141：23-32)。我们关注于
18
Al F复合物的结合，因为氟化铝可以相对地体内(Li，2003，Crit Rev Oral Biol Med 14：
100-114；Antonny等，1992，J Biol Chem267：6710-18)。我们报道了最初的研究，显示该
18
方法制备使用双特异性抗体(bsMAb)预靶向系统体内靶向癌症的 F-标记的肽的可行性，
18
这是一种高度灵敏和特异性的定位癌症的技术，在一些情况下好于 F-FDG(氟代脱氧葡萄糖)(McBride等，2008，J Nucl Med(增刊)49：97P；Wagner，2008，J Nucl Med49：23N-24N；
Karacay等，2000，Bioconj Chem 11：842-54；Sharkey等，2008，CancerRes 68；5282-90；
Gold 等，2008，Cancer Res 68：4819-26；Sharkey 等，2005，NatureMed 11：1250-55；
Sharkey等，2005，Clin Cancer Res 11：7109s-7121s；McBride等，2006，J Nucl Med 47：
18
1678-88；Sharkey等，2008，Radiology 246：497-508)。这些研究揭示，Al F复合物可以稳定结合至1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)，但是收率低。

[0058] 在下文实施例中，检验了新的标记条件和几种新的NOTA衍生物，其使收率从约18
10％提高至约80％，提供了 F标记用于PET成像的肽和其他分子的可行方法。

[0059] 可靶向构建体肽

[0060] 在某些实施方案中，18F-标记的部分可以包括肽或其他可靶向构建体。18F-标记的肽(或蛋白)可以被选择直接结合至靶向细胞、组织、病原生物或用于成像和/或检测的18
其他靶。在其他实施方案中，F-标记的肽可以被选择直接结合，例如使用具有一个或多个可靶向构建体肽结合部位和一个或多个疾病或病症相关靶抗原结合部位的双特异性抗体。
双特异性抗体可以例如用于预靶向技术，其中抗体可以首先被施用至受试者。可以提供足够的时间来使双特异性抗体结合至靶抗原并使未结合抗体从循环中清除。然后，可靶向构
18
建体(例如 F-标记的肽)可以被施用至受试者并被允许结合至双特异性抗体并集中于患
18
病细胞或组织，之后，可以通过PET扫描或其他已知技术确定 F-标记的可靶向构建体的分布。

[0061] 此类可靶向构建体可以具有多种结构并且根据以高亲和力结合至可靶向构建体的抗体或片段的可用性以及当用于预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体时快速体内清除来选择。疏水剂在引发强免疫应答方面是最好的，而亲水剂是快速体内清除所优选的。因此，建立疏水特征和亲水特征之间的平衡。这可以部分通过使用亲水螯合剂来抵消许多有机部分的固有疏水性来实现。而且，可以选择具有相反溶液性质的可靶向构建体的亚基，例如含有一些疏水性氨基酸和一些亲水性氨基酸的肽。除了肽以外，还可以使用碳水化合物。

[0062] 具有少至2个氨基酸残基、优选2至10个残基的肽可以被使用并且可以被偶联至其他部分，例如螯合剂。接头应该是低分子量结合物，优选具有小于50,000道尔顿、有利地小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量，包括螯合剂中的金属离子。更通常地，可靶向构建体肽具有四个或更多个残基，例如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO：1)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮杂环十二烷1，4，7，10-四乙酸，并且HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基团。或者，DOTA可以被NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-1，4，7-三乙酸)、TETA(p-溴代乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)、NETA([2-(4，7-二羧基甲基[1，4，7]三氮杂环壬-1-基-乙基]-2-羧基甲基-氨基]乙酸)或其他已知螯合部分
所替代。

[0063] 可靶向构建体还可以在主链结构中包括非天然氨基酸，例如，D-氨基酸，以增加肽在体内的稳定性。在替代实施方案中，可以使用其他主链结构，例如从非天然氨基酸或类肽构建的那些。

[0064] 用作可靶向构建体的肽适宜使用固相载体和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动肽合成仪上合成。在后来用于螯合剂结合的肽中的游离氨基有利地使用标准保护基(例如Boc基团)封闭，而N-末端残基可以被乙酰化以提高血清稳定性。这种保护基是技术人员公知的。参见Greene and Wuts ProtectiveGroups in Organic Synthesis，1999(John Wiley and Sons，N.Y.)。当肽被制备以后来用于双特异性抗体系统时，它们有利地从树脂被切除以产生相应的C-末端酰胺，以抑制体内羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公开于下文实施例中。

[0065] 免疫原的半抗原包括识别部分，例如化学半抗原。使用化学半抗原，优选HSG半抗原，表现出接头对抗体的高特异性。针对HSG半抗原而产生的抗体是已知的(例如679抗体)并且可以被轻易结合入适当的双特异性抗体(参见例如，美国专利号6,962,702；7,138,103和7,300,644，实施例部分在此通过引用并入)。因此，接头与连接的半抗原的结合将是抗体或抗体片段高特异性的。然而，其他抗原和与其结合的抗体是本领域已知的并且可以被使用，例如In-DTPA和734抗体(例如，美国专利申请公布号20050002945)。

[0066] 螯合剂部分

[0067] 在一些实施方案中，18F-标记分子可以包括一个或多个亲水性螯合剂部分，其可以结合金属离子并且还可以帮助确保快速体内清除。螯合剂可以根据其特定的金属结合性质来选择，并且可以容易地交换。

[0068] 特别有用的金属-螯合剂组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。诸如NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-1，4，7-三乙酸)、DOTA、TETA(p-溴代乙酰氨基-苄基-四18
乙胺四乙酸)和NETA等大环螯合剂也可与可能用作 F结合的配体的多种金属一起使用。

[0069] 其中配体包括硬碱螯合功能例如羧酸酯或胺基的DTPA和DOTA-型螯合剂最有效用于螯合硬酸阳离子，特别是IIa族和IIIa族金属阳离子。此类金属-螯合剂复合物可以通过根据目标金属来调整环尺寸而成为非常稳定。其他环类型螯合剂(例如大环聚酯)因为稳定结合核素而令人关注。卟啉螯合剂可用于多种金属复合物。超过一种类型的螯合剂可以被结合至载体以结合多个金属离子。例如美国专利号5,753,206中公开的那些螯合剂，特别是缩氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和缩氨基硫脲基-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂被有利地用于结合与软碱配体紧密结合的Tc、Re、Bi和其他过渡金属、镧系元素和锕系元素的软酸阳离子。将超过一种类型的螯合剂与肽连接可能是有用的。因为-DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet等，美国专利号5,256,395)并且可以被容易地偶联至靶向抗体以形成双特异性抗体，在预靶向方案中可能使用具有冷二DTPA螯合剂和另18
一种用于结合 F复合物的螯合剂的肽半抗原。此类肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQ ID NO：2)。其他的硬酸螯合剂(例如DOTA、TETA和类似物)可以取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且对它们特异性的MAb可以使用与用于产生抗-二-DTPA MAb的技术类似的技术来产生。

[0070] 另一种有用的螯合剂可以包括NOTA-型部分，例如Chong等(J.Med.Chem.，2008，51：118-25，在此通过引用并入)中公开的。Chong等公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA
177 205/206
配体的产生和用途，当与 Lu或 Bi复合时显示在血清中达14天的稳定性。所述螯合
剂不是限制性的，并且本领域已知和/或下文实施例中描述的螯合剂的这些和其他实例可用于实施本发明。

[0071] 应理解，两种不同的硬酸或软酸螯合剂可以被结合入可靶向构建体，例如具有不同螯合剂环尺寸，以优选结合两种不同的硬酸或软酸阳离子，归因于阳离子的不同尺寸、螯合合剂环的几何形状和优选的阳离子复合离子结构。这将允许两种不同的金属(其一种或18
两者都可以连接至 F)被结合入可靶向构建体以最终被预靶向双特异性抗体捕获。

[0072] 施用方法

[0073] 在各种实施方案中，双特异性抗体和可靶向构建体可用于成像正常或患病组织和器官(参见例如美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；
5,101,827；和4,735,210，每个的实施例部分在此通过引用并入)。

[0074] 双特异性抗体(bsAb)和18F-标记的可靶向构建体的施用可以在施用可靶向构建体之前某个时间通过施用bsAb抗体来进行。试剂剂量和施用时间可以由技术人员容易地确定，并且取决于使用的试剂的具体性质。如果首先给予bsAb-F(ab’)2衍生物，则在施用可靶向构建体之前等待24-72小时(或者48-96小时)是适当的。如果IgG-Fab’bsAb结合物是初级靶向载体，则需要在施用可靶向构建体之前等待更长时间，范围在3-10天。bsAb18
靶向患病组织经过足够时间后，施用 F-标记的可靶向构建体。在施用可靶向构建体之后，可以进行成像。

[0075] 某些实施方案涉及使用多价靶结合蛋白，其具有至少三个不同的靶结合部位，如专利申请序号60/220,782中所描述的。通过经由化学接头交联几种Fab样片段，制备了多价靶结合蛋白。参见美国专利号5,262,524；5,091,542和Landsdorp等Euro.J.Immunol.16：679-83(1986)。还通过共价连接几个单链Fv分子(scFv)以形成单个多肽，制备了多价靶结合蛋白。参见美国专利号5,892,020。基本上是scFv聚集体的多价靶结合蛋白已经公开于美国专利号6,025,165和5,837,242。包括三个scFv分子的三价靶结合蛋白已经描述于Krott等ProteinEngineering 10(4)：423-433(1997)。

[0076] 或者，已经证明在下文更详细描述的称为“对接锁定(dock-and-lock)”(DNL)的技术用于简单且可重现构建多种多价复合物，包括包含两个或多个不同抗体或抗体片段的复合物。(参见例如，2006年3月24提交的美国专利申请序号11/389,358；2006年3月28提交的11/391,584；2006年6月29提交的11/478,021；2006年12月5提交的11/633,729；和2007年10月26提交的11/925,408，每一个的实施例部分在此通过引用并入)。此类构建体还用于实施本文描述的要求保护的方法和组合物。

[0077] 可以使用清除剂，其在双特异性抗体(bsAb)和可靶向构建体剂量之间给予。可以使用具有新机制作用的清除剂，即，靶向针对bsAb的疾病靶向臂的糖基化抗独特型Fab’片段。在一个实例中，抗CEA(MN-14Ab)x抗肽bsAb被给予并被允许在疾病靶中累积至其最大程度。为了从循环中清除残留的bsAb，给予MN-14的抗独特型Ab(称为WI2)，优选作为糖基化Fab’片段。清除剂以单价方式结合至bsAb，而其附加的糖基残基指导完整复合物至18
肝，其中发生快速代谢。然后，F-标记的可靶向构建体被给至受试者。针对bsAb的MN-14臂的WI2具有高亲和力，并且清除机制不同于其他已公开的机制(参见Goodwin等，同上)，因为其涉及交联，因为WI2-Fab’是单价部分。然而，替代的方法和清除剂组合物是已知的并且可以使用任何此类已知的清除剂。

[0078] 配制和施用

[0079] 可以配制18F-标记分子以获得包括一种或多种药学可接受赋形剂、一种或多种其他成分或这些的某种组合的组合物。这些可通过制备药学有用剂量的已知方法来完成，藉18
此活性成分(即，F-标记分子)与一种或多种药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其他适合的赋形剂是本领域技术人员已知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。

[0080] 本文描述的组合物的优选施用途径是胃肠外注射。注射可以是静脉内、动脉内、淋巴管内、鞘内或腔内(即，胃肠外)。在胃肠外施用中，组合物以可注射的单位剂量形式配制，例如溶液、悬浮液或乳状液，与药学可接受的赋形剂组合。此类赋形剂本身是无毒且无治疗性的。此类赋形剂的实例有盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克斯溶液。也可以使用非水性赋形剂，例如固定油和油酸乙酯。优选的赋形剂是5％右旋糖的盐水溶液。赋形剂可以含有小量添加剂，例如提高等渗性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。还包括其他施用方法，包括口服施用。

[0081] 包含18F-标记分子的配制的组合物可用于通过例如弹丸注射或连续输注来静脉内施用。用于注射的组合物可以单位剂量形式提供于例如安瓿瓶或多剂量容器中，具有添加的防腐剂。组合物还可采取诸如在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，组合物可以是粉末形式，在使用前用适合介质(例如无菌无热原的水)重构。

[0082] 组合物可以溶液施用。溶液pH范围应该是pH 5至9.5、优选pH 6.5至7.5。其制剂应该是具有适合的药学可接受缓冲剂的溶液，所述缓冲剂例如磷酸盐、TRIS(羟基甲基)氨基甲烷-HCl或柠檬酸盐及类似物。缓冲剂浓度范围应该是1至100mM。配制的溶液可以含有浓度为50至150mM的盐，例如氯化钠或氯化钾。还可以包括有效量的稳定剂，例如甘油、白蛋白、球蛋白、去污剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。组合物可以皮下、静脉内、肌内或通过其他胃肠外途径施用至哺乳动物。而且，施用可以通过连续输注或通过单次或多次浓注。

[0083] 当施用双特异性抗体时，例如在预靶向技术中，被施用于人的抗体的剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医疗情况和之前医疗史等因素而变化。通常，对于成像目的，希望为接收者提供范围约1mg至200mg的双特异性抗体剂量作为单次静脉内输注，但也可以根据环境要求施用更低或更高的剂量。通常，对于典型成人，希望为接收者提供范围从约10mg/平方米体表面积或17至18mg抗体的剂量，但也可以根据环境要求施用更低或更高的剂量。可以为成像目的而被施用至人类受试者的双特异性抗体的剂量实例是1至200mg、更优选1至70mg、最优选1至20mg，但是也可以使用更高或更低的剂量。

[0084] 一般而言，待施用的18F标记的剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般18
医疗情况和之前医疗史等因素而变化。优选地，F-标记分子的饱和剂量被施用至患者。对
18 18
于 F-标记分子的施用，可以通过毫居里测量剂量。 F成像研究的典型范围在5至10mCi。

[0085] 肽的施用

[0086] 要求保护的方法和/或组合物的各种实施方案可能涉及待施用至受试者的一种18
或多种 F-标记的肽。施用可以通过本领域已知的任何途径而发生，包括但不限于口服、鼻内、口、吸入、直肠、阴道、局部、正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉内注射。
18
例如，当 F-标记的肽在预靶向方案中施用时，所述肽优选i.v.施用。

[0087] 口服施用至受试者的未修饰肽可以在消化道内降解并根据序列和结构可以表现出差的跨肠壁吸收。然而，化学修饰肽以使它们对内源蛋白酶降解较不敏感或更可通过消化道吸收的方法是公知的(参见例如，Blondelle等，1995，Biophys.J.69：604-11；Ecker和Crooke，1995，Biotechnology 13：351-69；Goodman和Ro，1995，BURGER’S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY，VOL.I，ed.Wollf，John Wiley & Sons；Goodman和Shao，1996，Pure & Appl.Chem.68：1303-08)。用于制备肽类似物文库的方法也已经被描述并
18
可以用于构建适合口服施用至受试者的基于肽的 F-标记分子，所述肽类似物，例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽，例如插烯类肽。

[0088] 在某些实施方案中，标准肽键键合可以被一个或多个替代的连接基团所取代，所述替代的连接基团例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH＝CH、CO-CH2、CHOH-CH2和类似物。用于制备肽模拟物的方法是公知的(例如，Hruby，1982，Life Sci 31：189-99；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-04；Jennings-White等，1982，Tetrahedron Lett.23：
2533；Almquiest等，1980，J.Med.Chem.23：1392-98；Hudson等，1979，Int.J.Pept.Res.14：
177-185；Spatola等，1986，Life Sci38：1243-49；美国专利号5,169,862；5,539,085；
5,576,423，5,051,448，5,559,103)。肽模拟物可以表现出与其肽类似物相比增强的稳定性和/或体内吸收。

[0089] 或者，肽可以通过口服递送来施用，使用N-末端和/或C-末端加帽以防止肽链端解酶活性。例如，C-末端可以使用酰胺肽加帽并且N-末端可以通过肽的乙酰化而被加帽。肽还可以被环化以阻断肽链端解酶，例如通过形成环酰胺、二硫化物、醚、硫化物及类似物。

[0090] 肽稳定化可以通过用D-氨基酸取代天然存在的L-氨基酸而发生，特别是在其中已知肽链端解酶起作用的位置。肽链端解酶结合和裂解顺序是本领域已知的，已经描述了制备和使用结合了D-氨基酸的肽的方法(例如，美国专利申请公布号20050025709，McBride等，filed June 14，2004年6月14日提交，其实施例部分在此通过引用并入)。在某些实施方案中，肽和/或蛋白可以通过与蛋白酶和/或肽酶抑制剂共配制来口服施用。

[0091] 用于口服递送治疗性肽的其他方法公开于Mehta(“Oral deliveryandrecombinant production of peptide hormones，”2004 年 6 月，
BioPharmInternational)。肽以使用调节肠蛋白水解活性并增强肽跨肠壁转运的赋形剂的肠溶包衣固体剂型施用。使用该技术的完整肽的相对生物利用率范围是施用剂量的1％至
10％。胰岛素已经使用胆酸钠和蛋白酶抑制剂肠溶包衣的微胶囊在狗中成功施用(Ziv等，
1994，J.Bone Miner.Res.18(增刊.2)：792-94。使用酰基肉毒碱作为渗透增强剂和肠溶包衣进行了肽的口服施用(Eudragit L30D-55，RohmPharma Polymers，参见Mehta，2004)。
用于口服施用肽的赋形剂一般可以包括肠蛋白酶/肽酶以及去污剂或提高肽的溶解度或吸收的其他物质，其可以包装在肠溶包衣的胶囊或片剂中(Mehta，2004)。有机酸可以包括在胶囊中以酸化肠并在胶囊溶在肠中溶解时抑制肠蛋白酶活性(Mehta，2004)。口服递送肽的另一替代方法包括与基于聚乙二醇(PEG)的两亲寡聚物结合，增加吸收和对酶降解的抗性(Soltero和Ekwuribe，2001，Pharm.Technol.6：110).

[0092] 产生抗体的方法

[0093] 肽主链的Ab可以通过用于Ab产生的公知方法产生。例如，注射在完全弗氏佐剂中的免疫原，例如(肽)n-KLH，其中KLH是钥孔血蓝蛋白并且n＝1-30，随后将悬浮于不完全弗氏佐剂中的相同免疫原两次连续注射入免疫活性动物，在i.v.加强抗原后三天，进行脾细胞收集。然后将收集的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，使用直接结合ELISA分析得到的克隆的培养上清液的抗肽反应性。可以通过使用最初免疫原的肽片段分析产生的Ab的特异性。这些片段可以使用自动化肽分析仪容易地制备。对于Ab产生，酶缺陷杂交瘤被分离以实现融合细胞系的选择。该技术还可以用于针对包括可靶向构建体的螯合剂的一种或多种(例如In(III)-DTPA螯合剂)来产生抗体。In(III)-二-DTPA的小鼠单克隆抗体是已知的(Barbet‘395同上)。

[0094] 例如用作双特异性抗体组分的靶向抗体可以是对作为标志物的多种细胞表面或细胞内肿瘤相关抗原特异性的。这些标志物可以是肿瘤产生的物质，或者可以是在肿瘤部位、肿瘤细胞表面或肿瘤细胞内聚集的物质，不论是在细胞质中、核中还是在各种细胞器或亚细胞结构中。此类肿瘤相关标志物包括以下公开的那些：Herberman，“Immunodiagnosis of Cancer”，Fleisher 编，“The ClinicalBiochemistry of Cancer”，347 页 (American Association of Clinical Chemists，1979)和美国专利号4,150,149；4,361,544；和4,444,744，每一个的实施例部分在此通过引用并入。最近有关肿瘤相关抗原(TAA)的报道包括Mizukami等，(2005，Nature Med.11：992-97)；Hatfield等，(2005，Curr.Cancer Drug Targets 5：229-48)；Vallbohmer等(2005，J.Clin.Oncol.23：3536-44)；和Ren等(2005，Ann.Surg.242：55-63)，每一个中有关鉴定的TAA在此通过引用并入。

[0095] 肿瘤相关标志物已经被Herberman(同上)分类入多种类别，包括抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、肿瘤相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原及其变体。偶尔地，肿瘤相关标志物的亚基有利地用于产生具有较高肿瘤特异性的抗体，例如，人类慢性促性腺激素(HCG)的β-亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激对非肿瘤物质的交叉反应性大大降低的抗体产生，如美国专利号4,361,644和4,444,744中公开的。

[0096] 另一种目标标志物是跨膜激活剂和CAML-交互作用剂(TACI)。参见Yu等Nat.Immunol.1：252-256(2000)。简言之，TACI是B-细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的标志物。而且已知，TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)被肿瘤坏死因子同系物-增殖诱导配体(APRIL)结合。APRIL体外刺激原代B细胞和T细胞的增殖并由于B细胞体内累积而增加脾重量。
APRIL还与TALL-I(还称为BLyS或BAFF)竞争受体结合。可溶性BCMA和TACI特异性预
防APRIL的结合并阻断APRIL-刺激的原代B细胞增殖。BCMA-Fc还抑制小鼠中针对钥孔血蓝蛋白和肺炎疫苗Pneumovax的抗体产生，表明经由BCMA和/或TACI的APRIL和/或
TALL-I 信号传导是产生体液免疫性所需要的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与刺激B和T细胞功能的两个配体-两个受体途径。

[0097] 用于成像诸如恶性疾病、心血管疾病、感染疾病、炎症疾病、自身免疫疾病或神经系统疾病的各种疾病或病症的示例性靶抗原可以包括碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、以及癌基因产物。

[0098] 当成像或检测涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫疾患时，靶向抗原可以选自由以下组成的组：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。

[0099] 在最初针对免疫原产生抗体后，抗体可以被测序并随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。例如，人源化单克隆抗体的产生是通过将小鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移至人可变结构域中，然后取代鼠对应部分的构架区中的人残基。源自人源化单克隆抗体的抗体组分的使用预防了与鼠恒定区免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的通用技术描述于例如Orlandi等的出版物，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)，在此通过引用并入。产生人源化MAb的技术描述于例如Jones等，Nature 321：522(1986)，Riechmann等，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)，Carter等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，和Singer等，J.Immun.150：2844(1993)，每一个在此通过引用并入。

[0100] 或者，完全人抗体可从转基因非人动物获得。参见例如Mendez等，NatureGenetics，15：146-156(1997)；美国专利号5,633,425。例如，人抗体可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠获得。小鼠体液免疫系统通过失活内源性免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化。人免疫球蛋白基因座是极其复杂的，并且包括大量离散片段，其总共占据人类基因组的近0.2％。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体成分，人类重链和轻链基因座的大部分必须被引入小鼠基因组。这是以逐步过程实现的，开始于形成酵母人工染色体(YAC)，在种系构型中含有人类重链或轻链免疫球蛋白基因座。因为每个插入序列大小约1Mb，YAC构建需要免疫球蛋白基因座的重复片段的同源重组。一个含有重链基因座且一个含有轻链基因座的两个YAC分别通过含有YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合而被引入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆显微注射入小鼠胚泡中。根据其经其种系传递YAC的能力来筛选得到的嵌合雄性，并与鼠抗体产生缺陷的小鼠杂交。杂交两个转基因品系，一个含有人类重链基因座，另一个含有人类轻链基因座，得到响应于免疫而产生人抗体的子代。

[0101] 未重排的人免疫球蛋白基因也可通过微细胞介导的染色体转移(MMCT)被引入小鼠胚胎干细胞中。参见例如Tomizuka等，Nature Genetics，16：133(1997)。在该方法中，含有人类染色体的微细胞与小鼠胚胎干细胞融合。转移的染色体被稳定保留，成年嵌合体表现出适当的肿瘤特异性表达。

[0102] 作为替代，抗体或抗体片段可以源自从组合免疫球蛋白文库分离的人抗体片段。参见例如Barbas等，METHODS：A Companion to Methods in Enzymology 2：119(1991)，和Winter等，Ann.Rev.Immunol.12：433(1994)，其在此通过引用并入。与通过B细胞永生化产生单克隆抗体相关的许多困难可以通过使用噬菌体展示在大肠杆菌中改造并表达抗体片段来克服。

[0103] 可以使用类似的策略来获得高亲和力的scFv。参见例如Vaughn等，Nat.Biotechnol.，14：309-314(1996)。具有大量组成成分的scFv文库可以通过从非免疫的人类供体分离V基因来构建，使用对应于所有已知的VH、Vκ和V80基因家族的PCR引物。扩增之后，Vκ和Vλ库被组合形成一个库。这些片段被连接入噬菌粒载体。然后将scFv接头、(Gly4，Ser)3(SEQ ID NO：21)连接入VL片段的噬菌粒上游。VH和接头-VL片段被扩增并组装在JH区。得到的VH-接头-VL片段被连接入噬菌粒载体。噬菌粒文库可以如上所述使用过滤器或使用免疫管淘选。可以通过从人源化兔的淋巴细胞
或脾细胞构建重组免疫球蛋白文库并在毕赤酵母中表达scFv构建体来实现类似的结果。
参见例如Ridder等，Biotechnology，13：255-260(1995)。此外，分离适当的scFv之后，具有较高结合亲和力和较低解离速率的抗体片段可以通过亲和成熟过程而获得，所述亲和成熟过程例如CDR3诱变和链改组。参见例如，Jackson等，Br.J.Cancer，78：181-188(1998)；
Osbourn等，Immunotechnology，2：181-196(1996)。

[0104] 抗体片段的另一种形式是编码单个CDR的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得。此类基因例如通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备。参见例如Larrick等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106(1991)；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter 等 ( 编 )，166-179 页 (Cambridge University Press1995)；和Ward等，“Genetic Manipulationand Expression of Antibodies，”MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLESAND APPLICATIONS，Birch等，( 编 )，137-185页 (Wiley-Liss，Inc.1995)。

[0105] 嵌合抗体是含有源自啮齿类动物抗体的可变结构域和互补决定区的重组抗体，同时抗体分子的其余部分源自人抗体。人源化抗体是重组蛋白，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经从鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移至与人恒定区序列连接的人可变结构域中。

[0106] 通过将编码小鼠轻链可变结构域和重链可变结构域的cDNA片段与编码人抗体C结构域的片段连接来构建嵌合Ab。因为C结构域不促进抗原结合，嵌合抗体将保留与原始小鼠Ab相同的抗原特异性，但是在序列上与人抗体更接近。嵌合Ab依然含有一些小鼠序列，然而可以依然是免疫原性的。人源化Ab仅含有那些识别抗原所必需的小鼠氨基酸。该产物通过将来自小鼠互补决定区的氨基酸构建入人抗体构架来构建。

[0107] 用于产生双特异性抗体的其他最近方法包括具有额外的半胱氨酸残基的改造的重组Ab，使得它们比更常见的免疫球蛋白同种型更强地交联。参见例如FitzGerald等，Protein Eng.10：1221-1225，1997。另一种方法是改造连接两个或多个不同单链抗体或抗体片段区段的重组融合蛋白具有需要的双重特异性。参见例如，Coloma等，Nature Biotech.15：159-163，1997。可以使用分子工程来产生多种双特异性融合蛋白。在一种形式中，双特异性融合蛋白是单价的，由例如具有一个抗原的单结合部位的scFv和具有第二抗原的单结合部位的Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是二价的，由例如具有一个抗原的两个结合部位的IgG和具有第二抗原的两个结合部位的两个scFv组成。

[0108] 功能性双特异性单链抗体(bscAb)还称为双抗体，可以使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。参见例如Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：7021-7025，1995。

[0109] 优选的双特异性抗体是结合了MAb Mu-9的Fv和MAb 679的Fv或者MAbMN-14的Fv和MAb 679的Fv的那些双特异性抗体以及其人类嵌合或人源化的对应物。MN-14以及其嵌合和人源化的对应物公开于美国专利号5,874,540。还优选的是结合了Mu-9或679的CDR的一个或多个的双特异性抗体。抗体还可以是结合III类抗CEA抗体和679的Fv的融合蛋白或双特异性抗体。III类抗体，包括III类抗CEA，在美国专利号4,818,709中详细讨论。

[0110] 技术人员将发现，双特异性抗体可以结合具有靶抗原结合特异性的本领域已知的任何抗体或片段，已知所述靶抗原与疾病状态或病症相关。此类已知的抗体包括但不限于hR1(抗-IGF-1R，美国临时专利申请序号61/145,896，1/20/09提交)、hPAM4(抗-MUC1，美国专利号7,282,567)、hA20(抗-CD20，美国专利号7,251,164)，hA19(抗-CD19，美国专利号7,109,304)，hIMMU31(抗-AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1(抗-CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗-CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗-CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗-HLA-DR，美国专利申请号11/368,296)、hMN-14(抗-CEA，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗-CEA，美国专利申请号10/672,278)、hRS7(抗-EGP-1，美国专利号7,238,785)和hMN-3(抗-CEA，美国专利申请序号10/672,278)，每一个所引用的专利或申请的实施例部分在此通过引用并入。第二MAb也可选自本领域已知的任何抗-半抗原抗体，包括但不限于h679(美国专利号7,429,381)和734(美国专利申请序号10/776,470)，每一个的实施例部分在此通过引用并入。

[0111] 使用的各种其他抗体是本领域已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；
6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；
7,300,655；7,312,318；和美国专利申请公布号20040185053；20040202666；20050271671；
20060193865；20060210475；20070087001；每一个在此通过引用并入)。此类已知的抗体用于检测和/或成像多种疾病状态或病症(例如，hMN-14或TF2 bsMAb(表达CEA的癌)、hA20 bsMab(TF-4-淋巴瘤)、hPAM4(TF-10胰腺癌)、RS7 bsMAb(肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌)、hMN-15或hMN3 bsMAb(炎症)、人类gp120和/或gp41 bsMAb(HIV)、抗-血小板bsMab和抗-凝血酶bsMAb(凝块成像)、抗-肌球蛋白bsMAb(心肌坏死))。

[0112] 使用的抗体可商业途径获自多种已知来源。例如，多种分泌抗体的淋巴瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。针对各种疾病靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的大量抗体已经保藏在ATCC和/或具有公开的可变区序列并且可用于要求保护的方法和组合物。参见例如美国专利号7,312,318；7,282,567；
7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；
7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；
6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；
6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；
6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；
6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；
6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；
6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；
6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；
6,733,981；6,730,307 ；6,720,15；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；
6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；
6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；
6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；
6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；
6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；
6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040，6,451,310；
6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；
6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；
6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；
6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；
6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；
5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；
5,677,136；5,587,459；5,443,953，5,525,338。这些仅是示例性的，并且多种其他抗体及其杂交瘤是本领域已知的。熟练技术人员将发现，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤可通过ATCC、NCBI和/或USPTO数据库对针对选定的目标疾病相关靶的抗体的简单检索而获得。克隆抗体的抗原结合结构域可以被扩增、剪切、连接入表达载体、转染进适应的宿主细胞并用于蛋白产生，使用本领域公知的标准技术。

[0113] 候选抗-HIV抗体包括Johansson等(AIDS.2006 Oct 3；20(15)：1911-5)描述的抗包膜抗体以及Polymun(Vienna，Austria)描述并出售以及在美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等，AIDS 2007；21(16)：2161-2170和Joos等，Antimicrob.Agens Chemother.2006；50(5)：1773-9中描述的抗HIV抗体，全部在此通过引用并入。

[0114] 在某些实施方案中，bsAb F-18标记的可靶向构建体可用于手术内、血管内和/或内窥镜检查的肿瘤和损伤检测、活组织检查和疗法，如美国专利号6,096,289中所描述的。

[0115] 抗体克隆和构建的通用技术

[0116] 各种技术，例如产生嵌合或人源化抗体，可以包括抗体克隆和构建的程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得，例如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠MAb的细胞的MAb的V基因可以通过PCR扩增被克隆并被测序。为了证实其可靠性，克隆的VL和VH基因可以作为嵌合Ab在细胞培养物中表达，如Orlandi等，(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：3833(1989))所描述。基于V基因序列，人源化MAb则可如Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所描述来设计并构建。

[0117] cDNA可通过通用分子克隆技术从任何已知产生鼠MAb的杂交瘤细胞系或转染的细胞系制备(Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版
(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等，1989)或者Leung
等(BioTechniques，15：286(1993))所述的延伸引物集来扩增。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等，1989)或Leung等(Hybridoma，13：469(1994))所述的退火至鼠IgG恒定区的引物来扩增。

[0118] 含有 10μl 第一链 cDNA 产物、10μl 10X PCR 缓冲液 [500mM KCl、100mMTris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2 和 0.01 ％ (w/v) 明胶 ](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、250μM各dNTP、200nM引物和5单位Taq DNA聚合酶(PerkinElmer Cetus)的PCR反应混合物可以经历30个PCR循环。每个PCR循环优选由以下组成：94℃下变性
1min，50℃下退火1.5min，和72℃下聚合1.5min。扩增的Vκ和VH片段可以在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，CA)上纯化。人源化V基因可以通过长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建，如Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所描述。

[0119] Vκ的PCR产物可以被亚克隆入分期载体，例如基于pBR327的分期载体，VKpBR，含有Ig启动子、信号肽序列和适宜的限制酶切位点以促进VκPCR产物的框内连接。VH的PCR产物可以被亚克隆入类似的分期载体，例如基于pBluescript的VHpBS。含有相应PCR产物的个体克隆可以通过例如Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977))的方法进行测序。

[0120] 含有Vκ和VH序列的表达盒与启动子和信号肽序列一起可以通过双限制酶消化分别从VKpBR和VHpBS切除为HindIII-BamHI片段。Vκ和VH表达盒可以被分别连接入适当的表达载体，例如pKh和pG1g(Leung等，Hybridoma，13：469(1994))。表达载体可以被共转染进入适当的细胞，例如骨髓瘤Sp2/0-Ag14(ATCC，VA)，根据潮霉素抗性选择集落，并通过例如ELISA分析监测上清液中嵌合、人源化或人类MAb的产生。或者，分别地，Vκ和VH表达盒可以被组装在修饰的分期载体VKpBR2和VHpBS2中，作为XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段被切除，并亚克隆进入一个表达载体，例如pdHL2，如Gillies等(J.Immunol.Methods125：191(1989)所述并且还显示于Losman等，Cancer，80：2660(1997))。有用的另一种载体是GS载体，如Barnes等，Cytotechnology 32：109-123(2000)所述。其他适当的哺乳动物表达系统描述于Werner等，Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II)，Nr.8，870-880(1998)。

[0121] 共转染和通过ELISA分析分泌抗体的克隆可以如下进行。约10μg VKpKh(轻链表达载体)和20μg VHpG1g(重链表达载体)可用于通过电穿孔(BioRad，Richmond，CA)6
转染5X10 SP2/0骨髓瘤细胞，根据Co等，J.Immunol.，148：1149(1992)。转染后，细胞在
37℃，5％CO2在完全HSFM培养基(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中培养于
96孔微量滴定板。可以在两天后通过添加潮霉素终浓度为500单位/ml的潮霉素选择培养基(Calbiochem，San Diego，CA)开始选择过程。集落通常在转然后2-3周出现。然后将培养物扩增以进一步分析。嵌合、人源化或人类重链的分泌呈阳性的转染瘤克隆可以通过ELISA分析来鉴定。

[0122] 抗体可如下从细胞培养基中分离。转染瘤培养物适应无血清培养基。为了产生嵌合抗体，使用HSFM，细胞作为500ml培养物在滚瓶中生长。培养物被离心并通过0.2μ膜过滤上清液。经过滤的培养基以1ml/min的流速通过蛋白A柱(1x3cm)。然后用约10个柱体积的PBS洗涤树脂，蛋白A结合抗体用含有10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.5)从柱洗脱。1.0ml的级分被收集在含有10μl 3M Tris(pH 8.6)的管中，通过在280/260nm的吸光度确定蛋白浓度。峰级分被收集，用PBS透析，抗体例如用Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)浓缩。抗体浓度通过ELISA确定，并使用PBS将其浓度调节至约1mg/ml。叠氮化钠0.01％(w/v)作为防腐剂被适宜地添加至样品中。

[0123] 在替代实施方案中，表达载体可以被转染入已经在无血清培养基中预适应转染、生长和表达的宿主细胞中。可以使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如，美国专利申请序号11/187,863；11/253,666；11/487,215和11/877,728；每一个的实施例部分在此通过引用并入)。这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤细胞系，用突变的Bcl-EEE基因转染，暴露于氨甲喋呤以扩增转染的基因序列并预适应无血清，可以利用蛋白表达的细胞系，例如Sp2/0、Sp2/0衍生物、NSO、YB2/0、CHO、HEK 293、COS-1、COS-7、HepG2、BHK21、P3X3Ag8.653或BSC-1。

[0124] 双特异性和多特异性抗体

[0125] 双特异性抗体可以那个过本领域已知的技术制备，例如，抗-CEA肿瘤Ab和抗-肽Ab两者单独使用胃蛋白酶消化为其各自的F(ab’)2片段。抗-CEA-Ab-F(ab’)2用半胱氨酸还原以产生Fab’单体单元，其进一步与交联剂双(马来酰亚胺)己烷反应以产生Fab’-马来酰亚胺部分。抗-肽Ab-F(ab’)2用半胱氨酸还原，纯化回收的抗-肽Fab’-SH与抗-CEA-Fab’-马来酰亚胺反应以产生Fab’x Fab’双特异性Ab。或者，抗-肽Fab’-SH片段可以与抗-CEA F(ab’)2偶联产生F(ab’)2x Fab’构建体，或者与抗-CEA IgG偶联产生IgG x Fab’双特异性构建体。在一个实施方案中，IgG x Fab’构建体可以通过将抗肽Fab’硫醇基与已经用高碘酸氧化的抗-CEA IgG重链碳水化合物连接而以位点特异性方式制备，并随后通过与商业途径可获得的酰肼-马来酰亚胺交联剂反应而被活化。使用的组成Ab可以通过已知技术嵌合或人源化。双特异性或多特异性抗体可以结合具有治疗用途的任何已知抗体，如上载之前部分中讨论的。

[0126] 产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的，如公开于例如2/11/2004提交的美国专利申请公布号20050002945，其实施例部分在此通过引用并入。双特异性抗体可以通过细胞杂交瘤方法产生，该方法包括两个不同杂交瘤的融合，每个杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature，1983；305：537-540)。

[0127] 产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联剂来化学栓系两个不同的单克隆抗体(Staerz，等Nature.1985；314：628-631；Perez，等Nature.1985；316：354-356)。双特异性抗体的产生还可通过将两个母体单克隆抗体的每一个还原为其各自的半分子，然后所述半分子被混合并允许再氧化以获得杂合结构(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986；83：1453-1457)。另一种替代方法包括使用适当的接头化学交联两个或三个单独纯化的Fab’片段。(参见例如，欧洲专利申请0453082)。

[0128] 其他方法包括提高产生杂交杂交瘤的效率，通过将不同选择性标记基因经由逆转录病毒源穿梭载体转移入各自的母体杂交瘤，其随后被融合(DeMonte，等Proc Natl Acad Sci U S A.1990，87：2941-2945)；或者用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系。

[0129] 同源VH和VL结构域可以用具有适当组成和长度(通常由超过12个氨基酸残基组成)的肽接头连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。生产scFv的方法公开于美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405，在此通过引用并入。肽接头长度减少至小于12个氨基酸残基，防止相同链上VH和VL结构域的配对并促进VH和VL结构域与其他链上的互补结构域配对，导致功能性多聚体的形成。与3至12个氨基酸残基的接头连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0至2个氨基酸残基的接头，有利于形成三聚体(称为三链抗体)和四聚体(称为四链抗体)，但是寡聚的确切模式取决于V-结构域的组成和方向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)以及接头长度。

[0130] 用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术表现出在技术的低收率、必须纯化、低稳定性或劳动密集等方面的各种困难。最近，已经利用称为“对接锁定”(DNL)的技术(在下文更详细描述)来产生实际上任何所需抗体、抗体片段和其他效应分子的组合(参见例如，美国专利申请公布号20060228357；20060228300；20070086942；20070140966和20070264265，每一个的实施例部分在此通过引用并入)。DNL技术允许单特异性、双特异性或多特异性抗体的组装，作为裸抗体部分或与多种其他效应分子组合，所述效应分子例如免疫调节剂、酶、化学治疗剂、趋化因子、细胞因子、诊断剂、治疗剂、放射性核素、成像剂、抗血管生成剂、生长因子、寡核苷酸、激素、肽、毒素、促凋亡剂或其组合。本领域已知用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实施本文要求保护的方法。

[0131] 对接锁定(DNL)

[0132] 在优选实施方案中，双特异性或多特异性抗体或其他构建体可以使用对接锁定技术产生(参见例如，美国专利申请序号11/389,358；11/391,584；11/478,021；11/633,729和11/925,408，每一个的实施例部分在此通过引用并入)。DNL方法利用cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等，FEBSLetters.2005；579：3264.Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA在研究最充分的通过第二信使cAMP与R亚基结合而触发的信号转导途径之一中起重要作用，在1968年首次从兔骨骼肌中分离(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶结构由两个催化亚基组成，通过R亚基保持为非活性形式(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，每种类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。
已经分离仅作为稳定二聚体的R亚基，并且已经显示二聚化结构域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚基的结合导致广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述亚基经由其与AKAP对接通过PKA区域化而定向于选定的底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。

[0133] 自从1984年表征了首个AKAP，微管相关蛋白-2(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，已经在范围从酵母到人类的物种中鉴定了具有多样结构的超过50种AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、核、线粒体和内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。AKAP针对PKA的AD是14-18残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。个体AKAP中AD的氨基酸序列有很大不同，对RII二聚体报道的结合亲和力范围为2至90nM(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP将仅结合二聚体R亚基。对于人类RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人类RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位于同一N-末端44氨基酸序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBO J.2001；20：1651)，其在本文称为DDD。

[0134] 我们已经开发了利用人类RIIα的DDD和AKAP的AD作为优良的接头模块对用于将在下文称为A和B的两个实体对接成非共价复合物的平台技术，所述非共价复合物可以通过将半胱氨酸残基在策略位置引入DDD和AD以促进二硫键形成而被进一步锁定成稳定栓系的结构。“对接锁定”方法的通用方法如下。实体A通过将DDD序列与A前体连接而被构建，产生在下文称为a的第一组分。因为DDD序列将影响二聚体的自动形成，因此A由a2构成。实体B通过将AD序列与B的前体连接而被构建，产生在下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚体基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，从而促进a2和b的迅速缔合以形成由a2b构成的二组分三聚体复合物。该结合事件通过随后反应以经由二硫桥共价束缚两个实体而成为不可逆的，这基于有效局部浓度的原理而非常有效地发生，因为最初的结合相互作用将使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chimura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以位点特异性地连接。使用接头、适应模块和前体的各种组合，可以产生并使用不同化学计量的多种DNL构建体，包括但不限于二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体DNL构建体(参见例如，美国专利申请序号11/389,358；
11/391,584；11/478,021；11/633,729和11/925,408，每一个的实施例部分在此通过引用并入)。

[0135] 通过连接原理两个前体官能团的DDD和AD，这种位点特异性连接也预期保留两个前体的原始活性。该方法性质上是模块的，并且可能被应用以位点特异性且共价地连接多种物质，包括肽、蛋白、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应部分。利用下文实施例中描述的构建AD和DDD结合的效应物的融合蛋白方法，可以将实际上任何蛋白或肽结合入DNL构建体。然而，该技术不是限制性的并且可以利用其他结合方法。

[0136] 已知许多方法用于制备融合蛋白，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可以通过标准分子生物学技术被插入用于产生融合蛋白的表达载体(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可以连接至效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将发现，AD或DDD部分与效应部分的连接位点可以改变，取决于效应部分的化学性质以及效应部分中参与其生理活性的部分。多种效应部分的位点特异性连接可以使用本领域已知的技术进行，例如使用二价交联试剂盒/或其他化学结合技术。

[0137] 预靶向

[0138] 双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术。预靶向是多步骤过程，最初被发展来解决直接靶向抗体缓慢的血液清除，这种缓慢的血液清除促成对正常组织(例如骨髓)的不希望的毒性。使用预靶向，放射性核素或其他治疗剂与小的递送分子(可靶向构建体)连接，其在数分钟内从血液中清除。具有可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体被首先施用，允许自由抗体从循环中清除，然后施用可靶向构建体。

[0139] 预靶向方法公开于例如Goodwin等，美国专利号4,863,713；Goodwin等，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich 等，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr 等，J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov 等，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn 等，J.Nucl.Med.30：66，
1989；Kalofonos 等，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter 等，Int.J.Cancer 48：167，
1991；Paganelli 等，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli 等，Nucl.Med.Commun.12：
211，1991；美国专利号5,256,395；Stickney等，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利号6,077,499；U.S.Ser.No.09/597,580；U.S.序号
10/361,026；U.S.序号09/337,756；U.S.序号09/823,746；U.S.序号10/116,116；U.S.序号09/382,186；U.S.序号10/150,654；美国专利号6,090,381；美国专利号6,472,511；
U.S.序号10/114,315；美国临时申请号60/386,411；美国临时申请号60/345,641；美国临时申请号60/3328,835；美国临时申请号60/426,379；U.S.序号09/823,746；U.S.序号
09/337,756；美国临时申请号60/342,103；和美国专利号6,962,702，每一个在此通过引用并入。

[0140] 治疗或诊断受试者中疾病或疾患的预靶向方法可以被提供为：(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段；(2)任选地向受试者施用清除组合物，并允许组合物从循环清除抗体；和(3)向受试者施用可靶向构建体，含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。

[0141] 氨基酸取代

[0142] 在某些实施方案中，公开的方法和组合物可以包括产生和使用具有一个或多个氨基酸残基取代的蛋白或肽。例如，用于制备DNL构建体的DDD和/或AD序列可以被进一步优化以例如提高DDD-AD结合亲和力。DDD或AD序列中的潜在序列变化讨论于下文实施例。

[0143] 技术人员将意识到，一般而言，氨基酸取代通常涉及一种氨基酸用具有相对类似性质的另一种氨基酸取代(即，保守的氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对蛋白结构和功能的影响已经是广泛研究的主题并且是本领域已知的。

[0144] 例如，可以考虑氨基酸的疏水指数(Kyte & Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成产生的蛋白的二级结构，其反过来确定蛋白与其他分子的相互作用。基于其疏水性和电荷特征，每个氨基酸已经被分配一个疏水指数(Kyte & Doolittle，1982)，这些是：异亮氨酸(+4.5)；赖氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在进行保守取代时，疏水指数在±2之内的氨基酸的使用是优选的，在±2之内是更优选的，并且在±0.5之内是更优选的。

[0145] 氨基酸取代还可以考虑氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已经为氨基酸残基分配了亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；赖氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有相似亲水性的其他氨基酸替换氨基酸是优选的。

[0146] 其他考虑因素包括氨基酸侧链的大小。例如一般不优选用具有庞大侧链的氨基酸(例如色氨酸或酪氨酸)替代具有小型侧链的氨基酸(例如甘氨酸或丝氨酸)。各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响也是考虑因素。通过经验研究，不同氨基酸残基对蛋白结构域采用α-螺旋、β-片层或回折二级结构的趋势的影响已经被确定并且是本领域已知的(参见例如，Chou & Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。

[0147] 基于此类考虑因素和广泛的经验研究，保守氨基酸取代表已经被构建并且是本领域已知的。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。或者：Ala(A)leu，ile，val；Arg(R)gln，asn，lys；Asn(N)his，asp，lys，arg，gln；Asp(D)asn，glu；Cys(C)ala，ser；Gln(Q)glu，asn；Glu(E)gln，asp；Gly(G)ala；His(H)asn，gln，lys，arg；Ile(I)val，met，ala，phe，leu；Leu(L)val，met，ala，phe，ile；Lys(K)gln，asn，arg；Met(M)phe，ile，leu；Phe(F)leu，val，ile，ala，tyr；Pro(P)ala；Ser(S)，thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe，tyr；Tyr(Y)trp，phe，thr，ser；
Val(V)ile，leu，met，phe，ala。

[0148] 氨基酸取代的其他考虑因素包括残基是否位于蛋白内部或者是否为溶剂暴露的。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；
Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见例如，PROWL网站rockefeller.edu)。对于溶剂暴露的残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；
Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)。各种矩阵已经被构建以帮助选择氨基酸取代，例如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。

[0149] 在确定氨基酸取代时，还可以考虑分子间或分子内键的存在，例如正电残基(例如His、Arg、Lys)与负电残基(例如Asp、Glu)之间离子键(盐桥)或靠近的半胱氨酸残基之间二硫键的形成。

[0150] 任何氨基酸取代编码蛋白序列中任何其他氨基酸的方法是公知的，并且在技术人员的常规实验范围内，例如通过定点突变技术或者通过合成和组装编码氨基酸取代的寡核苷酸并间接入表达载体构建体。

[0151] 使用标记分子成像

[0152] 使用标记分子成像的方法是本领域公知的，并且任何此类已知技术可用本文公开18
的 F-标记分子来施用。参见例如，美国专利号6,241,964；6,358,489；6,953,567和公开的美国专利申请公布号20050003403；20040018557；20060140936，每一个的实施例部分在此通过引用并入。还参见Page等，NuclearMedicine And Biology，21：911-919，1994；Choi等，Cancer Research 55：5323-5329，1995；Zalutsky等，J.Nuclear Med.，33：575-582，
1992；Woessner等Magn.Reson.Med.2005，53：790-99。

[0153] 在某些实施方案中，18F-标记分子可以用于成像正常或患病的组织或器官，例如使用以下中描述的方法：美国专利号6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；
5,128,119；5,101,827；和4,735,210，每一个在此通过引用并入本文。其他方法描述于美国申请序号1999年6月22日提交的09/337,756和2001年4月3日提交的美国申请序
18
号09/823,746。此类成像可以通过适当靶向分子的直接 F标记或者通过以下所述预靶向方法来进行：Goldenberg等(2007，UpdateCancer Ther.2：19-31)；Sharkey等(2008，Radiology 246：497-507)；Goldenberg 等 (2008，J.Nucl.Med.49：158-63)；Sharkey 等(2007，Clin.Cancer Res.13：5777s-5585s)；McBride等(2006，J.Nucl.Med.47：1678-88)；
Goldenberg等(2006，J.Clin.Oncol.24：823-85)，还参见美国专利公布号20050002945、
20040018557、20030148409和20050014207，每一个在此通过引用并入。

[0154] 使用标记的肽或MAb诊断成像的方法是公知的。例如，在免疫闪烁成像技术中，配体或抗体用γ-发射放射性同位素标记并被引入患者。使用γ相机来检测γ-发射放射性同位素的定位和分布。参见例如Srivastava(编)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING ANDTHERAPY(Plenum Press 1988)，Chase，″Medical Applications of Radioisotopes，″REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Gennaro等(编)，pp.624-652(Mack Publishing Co.，1990)，和Brown，″Clinical Use of MonoclonalAntibodies，″BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto等(编)(Chapman & Hall18
1993)。还优选使用正电子发射放射性核素(PET同位素)，例如具有511keV能量，例如 F、
68 64 124
Ga、Cu和 I。此类放射性核素可以通过公知的PET扫描技术来成像。

[0155] 在优选实施方案中，18F-标记的肽、蛋白和/或抗体用于癌症成像。癌症实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更特定实例在下文提出并包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃的癌或胃癌，包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝癌；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾的癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移至不同于原始恶性肿瘤或肿瘤部位的受试者体内部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，源于转移的那些，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于原始肿瘤部位的继发部位)。

[0156] 癌症或恶性肿瘤的其他实例包括但不限于：儿童急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓细胞样白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓细胞样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性淋巴瘤、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、胰腺内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞肿瘤、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇及口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性疾患、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮细胞瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、骨髓增生性疾患、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、怀孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨-/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节肉瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行性肾盂和输尿管癌、滋养层细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、特发性巨球蛋白血症、威尔姆斯肿瘤、以及除了肿瘤以外的位于上列器官系统中的任何其他过度增殖疾病。

[0157] 本文描述和要求保护的方法和组合物可以用于检测或诊断恶性或恶性前病症。此类用途指示在进展至瘤形成或癌症之前已知或怀疑的病症，特别是其中已经发生由增生组成的非肿瘤细胞生长、组织转化或更特别地发育异常(关于此类异常生长病症的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976))。

[0158] 发育异常经常是癌症的先兆，并且主要发现于上皮。这是非肿瘤细胞生长的最混乱形式，涉及个体细胞均一性和细胞建筑方向中的缺失。发育异常在存在慢性刺激或炎症时特征性地发生。可以被检测的发育异常疾患包括但不限于：无汗性外胚层发育异常、前面发育异常、窒息性胸廓发育异常、心房手指发育异常、支气管肺发育异常、大脑发育异常、宫颈发育异常、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育异常、先天性外胚叶发育异常、颅骨骨干发育异常、颅腕跖骨发育异常、颅骨干骺端发育异常、牙本质发育异常、骨干发育异常、外胚层发育异常、牙釉质发育异常、脑性眼球发育异常、偏侧骨骺发育异常、多发性骨骺发育异常、亨纳曼氏综合征、上皮发育异常、面-指-生殖器发育异常、家族性颌骨纤维异常增殖症、家族性白色折叠发育异常、纤维肌性发育异常、纤维性骨发育异常、旺盛骨性发育不良、遗传性肾-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚叶发育异常、淋巴细胞减少胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌面发育异常、干骨后端发育异常、Mondini发育异常、单骨性纤维发育异常、粘膜上皮发育异常、多骨骺发育异常、眼-耳-脊椎发育异常、眼-牙-指发育异常、眼-脊椎发育异常、生牙性发育异常、opthalmonmandibulomelic发育异常、根尖牙骨质发育异常、多骨纤维发育异常、假性软骨脊柱骨骺发育异常、视网膜发育异常、视隔发育异常、脊柱骨骺发育异常室桡骨发育异常。

[0159] 可以被检测的其他肿瘤前病患包括但不限于：良性异常增生疾患(例如，良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食管癌前发育异常)、吸烟斑、角化病、博文病、农民皮肤、日光性唇炎和日光性角化病。

[0160] 其他过度增殖性疾病、疾患和/或病症包括但不限于恶性肿瘤的进展和/或转移以及相关疾患，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、重链疾病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。

[0161] 可以被检测、诊断和/或成像的上列示例性病症不是限制性的。技术人员将理解，已知抗体、抗体片段或靶向肽用于多种病症，例如自身免疫疾病、心血管疾病、神经变性疾病、代谢疾病、癌症、感染性疾病和过度增殖性疾病。可以通过本文所述方法制备和使用的18
F-标记分子(例如蛋白或肽)所针对的任何此类病症可以如本文所述被成像、诊断和/或检测。

[0162] 试剂盒

[0163] 各种实施方案可能涉及含有适合通过18F PET成像检测、诊断和/或成像患者患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有抗体、片段或融合蛋白，例如在本文所述预靶向方法中使用的双特异性抗体。其他组分可以包括与此类双特异性抗体一起使用的可18
靶向构建体。优选地，可靶向构建体与螯合剂预先结合，所述螯合剂可用于连接Al F复合
18
物或 F与不同金属的复合物。然而，在替代实施方案中，预期螯合剂可以被单独包括以在
18 18
Al F-螯合部分与可靶向构建体或其他靶向肽、蛋白或其他分子结合之前连接至Al F复合物。尽管下文实施例中描述的某些优选实施方案在预靶向方法中使用了双特异性抗体和
18
F-标记的可靶向构建体，但是技术人员将发现，在其他实施方案中，本文公开并要求保护
18
的 F标记方法可以与非抗体靶向蛋白、肽或其他分子一起使用。

[0164] 试剂盒可以含有其他试剂和其他组分，用于使新鲜制备的Al18F或18F-金属连接至18
可靶向构建体或其他靶向分子和/或任选地从未标记靶向分子、未结合的 F和混合物的其
18
他组分部分或完全纯化 F-标记的靶向分子。然而，技术人员将理解，在某些优选实施方案中，结合和标记效率以及标记的构建体的比放射性足够高，使得如本文所述制备的未纯化
18
的 F-标记的靶向分子可以用于PET成像。在最优选的实施方案中，试剂盒可以含有制备
18
和使用 F-标记的蛋白、肽或用于PET成像的其他分子所需的所有组分，不同于可以从商业
18
来源获得的新鲜制备的 F。

[0165] 如果含有含有施用组分的组合物未被配制为经消化道递送，例如通过口服递送，则可以包括能够通过一些其他途径递送试剂盒组分的装置。诸如胃肠外递送应用的一种类型的装置是注射器，用于将组合物注射入受试者体内。吸入装置也可用于某些应用。

[0166] 试剂盒组分可以被包装在一起或者分开在两个或多个容器中。在一些实施方案中，容器可以是管形瓶，含有适合重构的组合物的无菌冻干制剂。试剂盒还可以含有适合重构和/或稀释其他试剂的一种或多种缓冲液。可以使用的其他容器包括但不限于袋、盘、盒、管或类似物。试剂盒组分可以被无菌包装或维持在容器内。可以被包括的另一种组分是给使用试剂盒的人的使用说明书。

[0167] 实施例

[0168] 实施例1.肽IMP 272的18F标记

[0169] 第一个被制备并被18F-标记的肽是IMP 272：

[0170] DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2 MH+1512

[0171] 乙酸盐缓冲溶液-将1.509g乙酸稀释于～160mL水中，并通过添加1MNaOH来调节pH，然后稀释至250mL以制备pH 4.03的0.1M溶液。

[0172] 乙酸铝缓冲溶液-通过将0.1028g AlCl3六水合物溶解于42.6mL DI水中来制备铝溶液。4mL小份的铝溶液与16mL pH 4的0.1M NaOAc溶液混合以提供2mM Al储液。

[0173] IMP 272乙酸盐缓冲溶液-0.0011g肽、7.28x10-7mol IMP 272溶解于364μL 0.1M pH 4乙酸盐缓冲溶液以获得2mM肽的储液。

[0174] IMP 272的F-18标记-3μL小份的铝储液放入REACTI-VIALTM中并与50μL18F(按原样)和3μL IMP 272溶液混合。溶液在加热器中以110℃加热15min并通过反相HPLC18
分析。HPLC图谱(未显示)显示93％游离 F和7％与肽结合。将额外10μL IMP 272溶
液添加至反应并再次加热并通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC图谱显示死体积时8％
18
F和92％与肽连接的活度。其余肽溶液在室温下与150μL PBS孵育～1hr，然后通过反相
18
HPLC检查。HPLC(未显示)显示58％ F未结合，并且42％依然连接至肽。数据显示，当与
18
磷酸盐混合时，F-Al-DTPA复合物可能是不稳定的。

[0175] 反相HPLC-反相HPLC分析在下述条件下进行：

[0176] 柱： XTERRATM MS C18 5μm，4.6x250mm

[0177] 流速：1mL/min

[0178] 梯度缓冲液：缓冲液C，0.1％NH4OAc于DI水中，缓冲液D，90％乙腈、10％水和0.1％NH4OAc

[0179] 梯度：100％缓冲液C至100％缓冲液D，使用经30min的线性梯度。

[0180] 运行时间：30min

[0181] 尺寸排阻HPLC-尺寸排阻HPLC在下述条件下进行：

[0182] 柱： BIO-SILTM SEC 250，300x7.8mm

[0183] 梯度：等梯度

[0184] 洗脱缓冲液：0.2M磷酸盐pH 6.8

[0185] 流速：1mL/min

[0186] 运行时间：30min

[0187] 使用PERKIN 610Tr监测18F发射来获得所有放射计量图谱。表2-4是数据的表格展示。

[0188] 表2.18F+IMP 272+AlCl3在110℃加热15min，随后通过反相HPLC分析。

[0189] 区：18F 检测器：FSA

[0190]

[0191] 表3.18F+过量IMP 272+AlCl3在110℃加热15min，随后通过反相HPLC分析。

[0192] 区：18F 检测器：FSA

[0193]18

[0194] 表4.室温下在PBS中磷酸盐激发90min。小份 F+过量IMP 272+AlCl3在110℃加热15min，随后通过反相HPLC分析。18

[0195] 区：F 检测器：FSA

[0196]名称开始结束保留高面积％ROI ％总计
(min) (min) (min) (CPM) (CPM) (％) (％)
Bkg 1 2.00 2.10 2.00 350.0
区1 2.40 3.30 2.70 81930.0 162403.6 58.23 62.44
Bkg 2 4.20 4.30 4.20 410.0
Bkg 3 7.50 7.60 7.50 780.0
区2 7.80 8.60 8.40 2110.0 5564.7 2.00 2.14
区3 8.60 9.80 8.90 44590.0 110942.0 39.78 42.66
Bkg 4 10.50 10.60 10.50 460.0
3个峰 278910.3 100.00 107.24

[0197]

[0198] 通过将标记的肽溶液施加至1cc(30mg) HLB柱(料号186001879)并用300μL水洗涤以除去未结合的F-18。通过用2x100μL 1∶1EtOH/H2O洗涤柱来洗脱肽。
18
纯化的肽在水中25℃孵育并通过反相HPLC分析(未显示)。HPLC分析显示，F-标记的
18
IMP 272在水中不稳定。在水中孵育40min后，约17％的 F从肽释放，而83％被保留(未显示)。
18

[0199] 实施例2. F IMP 272的免疫反应性18

[0200] 肽(16μL 2mM IMP 272，48μg)用 F标记并通过尺寸排阻HPLC分析抗体结合。尺寸排阻HPLC显示，肽结合hMN-14x679，但不结合无关的双特异性抗体hMN-14x734(未显示)。
18

[0201] 实施例3.用其他金属IMP272 F标记-9 18

[0202] ～3μL小份的金属储液(6x10 mol)被放入聚丙烯锥形瓶并与75μL F(按原样)-8混合，在室温下孵育～2min，然后与20μL 2mM(4x10 mol)IMP 272在0.1M NaOAc pH 4缓冲液中的溶液混合。溶液在加热器中100℃加热15min，并通过反相HPLC分析。IMP 272用铟(24％)、镓(36％)、镐(15％)、镥(37％)和钇(2％)标记(未显示)。这些结果证明，
18
F金属标记技术不限于铝配体，而是还可以利用其他金属。对于不同的金属配体，可以利用不同的螯合部分来优化F-18-金属结合物的结合。
18 18

[0203] 实施例4.用于根据Al- F结合筛选其他抗体的标准 F肽标记条件18

[0204] 3μL小份的2mM铝储液被放入聚丙烯锥形瓶并与50μL F(按原样)混合，在室温下孵育～2min，然后与16至20μL 2mM肽在0.1M NaOAc pH 4缓冲液中的溶液混合。溶液TM在加热器中100℃加热15min，并通过反相HPLC(PHENOMENEX ， 5μC-18，110A，
250x4.6mm HPLC柱)分析。

[0205] 测试的肽+

[0206] IMP 272：DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2 MH1512+

[0207] IMP 288 DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 MH1453

[0208] IMP 326 DTPA-ITC-NH-NH-Phe-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1477

[0209] IMP 329 Deferoxamine-NH-CS-NH-NH-Ph-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(+HSG)-NH2 MH1804

[0210] IMP 331 NTA-iAsp-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1240

[0211] IMP 332 EDTADpr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lsy(HSG)-NH2 MH+1327

[0212] IMP 333 DTPA-Dpr(DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1845[0213] IMP 334 (H2O3P)2-C(OH)-(CH2)3-NH-Gly-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1192

[0214] IMP 337 Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)+-NH2 MH1291

[0215] IMP 338 Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1126[0216] IMP 345 DTPA-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1459[0217] IMP 349 DTPA-D-Cys((H2O3P)2-CH-CH2-S)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG+)-NH2 MH1583

[0218] IMP 361 DTPA-Dpr(BrCH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1498

[0219] IMP 366 DTPA-Dpr(Ph-S-CH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1528

[0220] IMP 368 Sym-DTPA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1292

[0221] IMP 369 Sym-DTPA-NH-CH(2-Br-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys+(HSG)-NH2 MH1517

[0222] IMP 370 Sym-DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Ly+s(HSG)-NH2 MH1484

[0223] IMP 371 DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HS+G)-NH2 MH1484

[0224] IMP 372 DTPA-Dpr(Ser)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1465[0225] IMP 373 DTPA-Dpr(Sym-DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1753

[0226] IMP 374 DTPA-Dpr(Cl-CH2CO-Cys(Et)-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG+)-NH2 MH1585

[0227] IMP 375 DTPA-Dpr(2-Br-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys+(HSG)-NH2 MH1603

[0228] IMP 376 DTPA-Cys(HO3S-S)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1558

[0229] IMP 379 DTPA-Dpr(2-H2N-Phe-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1497

[0230] IMP 382 DTPA-Dpr(H)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1378[0231] IMP 383 DTPA-Dpr(Gla-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1507[0232] IMP 384 DTPA-Dpr(2-HO-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys+(HSG)-NH2 MH1541

[0233] IMP 385 DTPA-Dpr(Dpr)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1464[0234] IMP 386 DTPA-Dpr(2-pyridyl-CH2-CHNH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Ly+s(HSG)-NH2 MH1526

[0235] IMP 387 DTPA-Dpr(D-9-anthrylalanine)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HS+G)-NH2 MH1625

[0236] IMP 389 DTPA-Dpr(2-carboxy piperizinyl)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys+(HSG)-NH2 MH1490

[0237] IMP 422

[0238] IMP 422 MH+1657

[0239]

[0240] IMP 426

[0241] IMP 426 MH+1596

[0242]

[0243] IMP 428

[0244] IMP 428 MH+1716

[0245]

[0246] IMP 449 NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1459[0247] IMP 460 NODA-GA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1366

[0248] 在NOTA型配体的替代构型中。NOTA部分可以从D或L对硝基苯丙氨酸制备，并且亚氨基二乙酸部分可以来自二氨基丙酸，其可以是D或L。而且，乙烯桥的位置可以与二氨基丙酸转换以产生配体上基团的不同构型。所有这些修饰可以影响随后形成的复合物的结68 18
合动力学和稳定性。或者，NODA-Ga肽可以用例如 Ga或 F标记。

[0249] 在某些实施方案中，替代螯合部分可用于结合金属-18F复合物。一些示例性的潜在螯合部分基于NETA的结构。如上所讨论的，Chong等(2007)报道，NETA配体与各种金属18
复合时可以显示提高的血清稳定性。螯合剂设计还可以被优化以增加肽对金属- F的结合亲和力。

[0250] 肽标记筛选研究的结果

[0251] 大部分DTPA衍生物显示与IMP 272标记相当的标记。存在例外，在半胱氨酸侧链18
携带二膦酸基团的IMP 349标记得很差。DOTA配体未结合Al F。IMP326的ITC DTPA配
18 18
体未结合Al F以及DTPA。IMP 331的NTA配体未结合Al F。IMP 332的EDTA配体结合了
18 18
Al F，但是DTPA没有。对称的DTPA配体未结合Al F。测试的膦酸和磷酸基团在测试条件
18
下未很好地结合Al F。

[0252] 筛选确实显示，在DTPA附近连接的基团可以影响Al18F-DTPA复合物的稳定性。筛选显示，IMP 375标记得更好并且形成比IMP 272显著更稳定的复合物。IMP 375标记得很好并且在水中稳定，在25℃5小时后显示95.4％保持结合(未显示)。对于体内应用，具有18 18
高血清稳定性的肽将是优选的。肽标记筛选研究仅考察了Al F的结合。未用Al F很好标
18
记的一些肽可以用与 F结合的另一种金属更好地标记。

[0253] 肽合成

[0254] 使用Fmoc策略通过固相肽合成来合成肽。通过使用允许差异化脱保护的Fmoc/Aloc保护基将基团添加至二氨基氨基酸侧链。通过Dangles等(J.Org.Chem.1987，52：4984-4993)的方法去除Aloc基团，除了哌啶以与使用的乙酸1∶1的比例添加。不对
称的四叔丁基DTPA如McBride等(美国专利申请公布号US2005/0002945 A1，申请号
10/776,470，其实施例部分在此通过引用并入)所述制备。

[0255] 三叔丁基DOTA、对称的四叔丁基DTPA、ITC-苄基 DTPA、p-SCN-Bn-NOTA和 TACN 获自 (Dallas，TX)。DiBocTACN、NODA-GA(tBu)3 和
NO2AtBu购自CheMatech(Dijon，France)。Aloc/Fmoc赖氨酸和Dap(二氨基丙酸衍
生物(还Dpr))获自 (Louisville，KY)或 (Torrance，
CA)。Sieber酰胺树脂获自 (San Diego，CA)。其余的Fmoc氨
基酸获自 (Burlington，MA)、
EMD (San Diego，CA)、CHEM (Wood Dale，IL) 或
六水合氯化铝购自SIGMA- (Milwaukee，WI)。其余溶
剂和试剂购自FISHER (Pittsburgh，PA)或Sigma- (Milwaukee，
18
WI)。 F由IBA (Somerset，NJ)提供。

[0256] IMP 272如(McBride等，美国专利申请公布号20040241158 A1，申请号10/768,707，其实施例部分在此通过引用并入)所述合成。IMP 288如所述制备(McBride等，J.Nucl.Med.2006，47：1678-1688)。

[0257] IMP 326 肼肽(IMP 319)使用Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(OBut)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H以该顺序在Sieber酰胺树脂上形成。4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H通过向二氧杂环己烷氢氧化钠溶液中的4-肼基苯甲酸添加二碳酸Boc来制备。

[0258] 在添加Boc-酰肼之后，Aloc基团侧链被去除，并将三苯甲基-HSG-OH基团添加至赖氨酸侧链。然后用TFA将肽从树脂分离并通过HPLC纯化以获得期望的肼bis-HSG肽IMP319(MH+1201)。然后将肼肽(0.0914g)与在3mL 0.1M磷酸钠pH 8.2中的0.0650g ITC-苄基DTPA混合。溶液pH用1M NaOH调节以保持pH在pH8.2。在肽与ITC-苄基DTPA之间反
应完全之后，通过HPLC纯化肽结合物。

[0259] IMP329 The通过在10mL 1∶1甲醇/水中混合1.0422g甲磺酸去铁胺-3 -3
(1.59x10 mol)与0.2835g(1.59x10 mol)硫代羰基二咪唑来制备异硫氰酸去铁胺。添加+
0.23mL三乙胺，在2.5h后通过反相HPLC纯化反应以获得异硫氰酸去铁胺MNa625。

[0260] 肼肽，IMP 319(0.0533g，4.4x10-5mol，MH+1201)在pH 8.1磷酸钠缓冲液中与0.0291g异硫氰酸去铁胺混合两小时，然后通过HPLC纯化以提供期望的产物MH+1804。

[0261] IMP 331下述氨基酸以所示顺序连接至Sieber酰胺树脂(0.58mmol/g)：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH。除去Aloc基团并将Trt-HSG-OH添加至赖氨酸侧链。除去Fmoc，然后Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Asp-OBut以该顺序被添加(0.5g树脂)。除去Fmoc，Asp的氮用在3.4mLNMP中的3mL溴乙酸叔丁酯和
3.6mL二异丙基乙胺烷基化过夜。使用TFA肽被从树脂分离并通过反相HPLC纯化以获得期+
望的肽MH1240。

[0262] IMP 332在3g Sieber酰胺树脂上制备肽(0.58mmol/g)。下述氨基酸以所示顺序被添加至树脂：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH。将树脂分成部分用于随后合成。取出1克树脂，从二氨基丙酸除去Fmoc基团。肽用3mL溴乙酸叔丁酯、3.6mL二异丙基乙基胺和3.4mL NMP烷基化过夜。然后除去侧链Aloc基团，并添加Trt-HSG-OH基团。然后肽被从树脂分离并+通过HPLC纯化以获得产物MH1327。

[0263] IMP 333使用1g与制备IMP 332使用的树脂相同的树脂制备肽。DTPA四-叔丁基酯(美国公布号20050002945)被添加至Dpr基团的胺两者。然后除去Aloc基团并添加+Trt-HSG-OH。然后肽被分离并通过HPLC纯化以获得期望的产物MH1845。

[0264] IMP 334使用1g Rink酰胺树脂制备肽(0.7mmol/g)，下述氨基酸以所示顺序添加：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Ser(But)-OH。去除Aloc基团并添加三苯甲基-HSG-OH。使用TFA从树脂分离肽。粗制肽通过从乙醚沉淀而被收集并干燥。0.33g高碘酸钠被溶解于15mL水。粗制肽被溶解于
1mL 0.5M磷酸钠(pH 7.6)、3mL水和1mL高碘酸钠溶液。另外3mL高碘酸以1毫升增量经～
2添加。然后混合物通过反相HPLC纯化并冻干以获得醛IMP 289 HCO-CO-D-Lys(HSG)-D-+
Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH959。阿伦膦酸盐(0.0295g， )被溶解于150μL
0.1MNaOAc pH 4。肽IMP 289，(0.0500g)被溶解于100μL 13％异丙醇水溶液。添加氰基+
硼氢化钠并通过HPLC纯化混合物以提供期望的产物MH1192。

[0265] IMP 337 & IMP 338在Sieber酰胺树脂上制备肽，使用以所示顺序添加的氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Ac2O。去除Aloc基团并添加Trt-HSG-OH基团至赖氨酸的侧链。肽被从树脂分离并通过HPLC纯化以获得希望的产物：+ +
IMP 337 MH1291和IMP 338 MH1126。

[0266] IMP 345在Sieber酰胺树脂上制备肽，使用以所示顺序添加的氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、
Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和四叔丁基DTPA。去除Aloc基团并添加Trt-HSG-OH基团至+
赖氨酸的侧链。肽被从树脂分离并通过HPLC纯化以获得希望的产物：IMP 345 MH1459。

[0267] IMP 349在Sieber酰胺树脂上制备肽IMP 347DTPA-D-Cys-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2，使用以所示顺序添加的氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc被切除，Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH被添加，Aloc被切除，Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和四叔丁基DTPA被添加。肽被从树脂分离并通+ -5过HPLC纯化以获得希望的产物：IMP 347 MH1395。肽IMP 347，0.0446g(3.2x10 mol)-3
与0.4605g(2.4x10 mol)亚乙烯基二(膦酸)(Degenhardt等，J.Org.Chem.1986，51：
3488-3490)在3mL水中混合，溶液用逐滴添加的1M NaOH调节至pH 6.5。反应被搅拌过夜，通过添加过量亚乙烯基二(膦酸)调节反应溶液至pH 1.49。混合物在室温下搅拌过夜，然+
后通过HPLC纯化以获得希望的肽IMP 349 MH1583。

[0268] IMP 361在Sieber酰胺树脂上制备肽，使用以所示顺序添加的氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc被切除，Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH被添加，Aloc被切除，Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Dap(Aloc)-OH和四叔丁基DTPA被添加。Dap侧链上的Aloc被去除并使用溴乙酸酐添加溴乙酰基。粗制产物通过HPLC纯化+
以获得期望的肽IMP 361(MH1498)。

[0269] IMP 366通过与IMP 361相同的方法制备肽，最后添加苯基硫代乙酸。粗制产物通+过HPLC纯化以提供产物IMP 366MH1528。

[0270] IMP 368如针对IMP 349所述制备肽，除了未添加半胱氨酸残基，并且使用四叔丁基DTPA 代替不对称的DTPA以在纯化后获得期望的产物IMP 368+
MH1292。

[0271] IMP 369如针对IMP 349所述制备肽，添加Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴代丙基)丙酸替代D-Cys，并添加对称的四叔丁基DTPA替代DTPA四-叔丁基酯的不对称形式。粗制肽+被纯化以获得期望的产物MH1517。

[0272] IMP 370如针对IMP 369所述制备肽，除了添加Fmoc-R-3-氨基-3-(2-硝基苯基)+丙酸替代溴。通过HPLC纯化后获得期望的产物MH1484。

[0273] IMP 371如针对IMP 370所述制备肽，除了使用不对称四叔丁基DTPA替代对称形+式的四叔丁基DTPA。通过HPLC纯化后获得期望的产物MH1484。

[0274] IMP 372如针对IMP 361所述制备肽，使用Fmoc-Ser(But)-OH连接Ser至Dap侧+链。除去Fmoc，肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1465。

[0275] IMP 373如针对IMP 361所述制备肽，使用对称的四叔丁基酯DTPA连接Sym-DTPA+至Dap侧链。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1753。

[0276] IMP 374如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-S-乙基半胱氨酸添加至Dap侧链，随后经由氯乙酸酐添加氯乙酰(在半胱氨酸氮上)。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的+产物MH1585。

[0277] IMP 375如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴代丙基)丙酸+添加至Dap侧链，随后切除Fmoc基团。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1603。

[0278] IMP 376如针对IMP 361所述制备肽，在第二个丙氨酸之后添加Fmoc-D-Tyr(But)-OH，随后是Fmoc-Cys(SO3H)和四叔丁基DTPA。肽从树脂被分离并纯化以+获得期望的产物MH1558。

[0279] IMP 379如针对IMP 361所述制备肽，将Boc-2-Abz-OH添加至Dap侧链。肽从树+脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1497。

[0280] IMP 382如针对IMP 361所述制备肽，从Dap侧链去除Aloc。肽从树脂被分离并+纯化以获得期望的产物MH1378。

[0281] IMP 383如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-Gla(OBut)2-OH添加至Dap侧链。肽+从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH-CO2 1507

[0282] IMP 384如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-Boc-S-3-氨基-3-(2-羟基苯基)+丙酸添加至Dap侧链。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1541。

[0283] IMP 385如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH添加至Dap侧链。肽+从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1464。

[0284] IMP 386如针对IMP 361所述制备肽，将Boc-D-2-吡啶基丙氨酸-OH添加至Dap+侧链。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1526。

[0285] IMP 387如针对IMP 361所述制备肽，将Fmoc-D-9-蒽基丙氨酸-OH添加至Dap侧+链。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1625。

[0286] IMP 389如针对IMP 361所述制备肽，将双-Boc-哌嗪-2-羧酸酯添加至Dap侧+链。肽从树脂被分离并纯化以获得期望的产物MH1664。

[0287] 实施例5.用于制备和分离18F-标记的肽的替代方法

[0288] 在某些实施方案中，使用加热来使Al18F复合进入NOTA螯合基团。或者，ITC苄基18
NOTA 可以用Al F标记，然后在标记之后被结合至其他热敏感分
子，例如蛋白。如果需要高比活度，则ITC苄基NOTA复合物可以被纯化而不含冷配体。

[0289] Al3+被添加至肽[IMP-449]并且其HPLC特征与未复合的NOTA肽和Al18F肽相当。18
对于IMP 449，Al肽和Al F肽实际上具有相同的HPLC保留时间(tR)，未标记的肽tR多～TM
1min。在PHENOMENEX 整体C-18 100x4.5mm柱上纯化肽，使用3mL/min的流速。
缓冲液A是0.1％TFA水溶液，且缓冲液B是90％CH3CN 10％水和0.1％TFA。线性梯度经
18
15min从100％缓冲液A运行至75∶25 A/B。因为Al复合物与Al F复合物共洗脱，添加
3+ 18
的Al 和 F将决定比活度。

[0290] IMP 449根据下文实施例6制备并如下标记。18F被接收在含有15mCi 18F的～325μL水溶液的2.0mL 离心管形瓶(02-681-374)中。3μL的2mMAlCl3在0.1M
18
pH 4 NaOAc中的溶液被添加至 F溶液，然后涡旋。约4min后，添加10μL的0.05M IMP
449在pH 4 0.5M NaOAc中的溶液样品被再次涡旋并在102℃加热器中加热17min。然后使反应快速冷却，然后去除管形瓶内容物，如上所述通过HPLC纯化。

[0291] 单独地，洗脱条件根据 ALLIANCETM分析系统来确定，标记的肽在7.5至8.5min被洗脱。分析型HPLC显示，标记的肽含有[AlF]IMP 449(UV220nm)并且不含有未复合的肽，导致比活度提高。

[0292] 肽在水中稀释，然后压力经过 OASIS PLUS HLBTM提取柱。标记的肽用3mL 1∶1EtOH/H2O洗脱。洗脱液的HPLC分析证实，所述柱有效捕获标记的肽，其允许乙腈
18
和TFA从肽被洗掉。HPLC还显示，1∶1EtOH/H2O洗脱液含有在溶剂中不含游离 F的期望的产物，在稀释后适合注射。在HPLC纯化后，标记收率为5-20％。HPLC纯化的肽的比活度估计在约500至1300Ci/mmol的范围内(未显示)。我们随后发现，使用该衍生物的放射性标记收率可以通过使反应体积减少三分之一而被提高2到4倍至44％。

[0293] 实施例6.血清稳定的18F-标记的肽IMP 449的产生和使用

[0294] 在Sieber酰胺树脂上制备肽IMP 448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 +MH1009，通过以所示顺序将下述氨基酸添加至树脂：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc被切除，Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，Aloc被切除，Fmoc-D-Ala-OH，最后切除Fmoc以制备期望的肽。然后肽从树脂被分离并通过HPLC纯化-5
以产生IMP 448，其然后被偶联至ITC-苄基NOTA。肽IMP 448，0.0757g(7.5x10 mol)与-5
0.0509g(9.09x10 mol)ITC苄基NOTA混合并溶解于1mL水。然后将无水碳酸钾(0.2171g)缓慢添加至搅拌的肽/NOTA溶液。在添加所有碳酸盐之后，反应溶液为pH 10.6。使反应在室温搅拌过夜。14小时后，反应用1M HCl小心猝灭，并通过HPLC纯化以获得48mg IMP
449。

[0295] IMP 449的18F标记

[0296] 肽IMP 449(0.002g，1.37x10-6mol)被溶解于686μL(2mM肽溶液)0.1MNaOAc pH18
4.02。3毫升2mM Al在pH 4乙酸盐缓冲液中的溶液与15μL，1.3mCi F混合。然后溶液与20μL 2mM IMP 449溶液混合，并在105℃下加热15min。反相HPLC分析显示，35％的活度(tR～10min)连接至肽，并且65％的活度以柱的死体积洗脱(3.1min，未显示)，表明活度的主要部分与肽结合。粗制的标记混合物(5μL)与收集的人血清混合并在37℃下孵育。
15min后取出小份并通过HPLC分析。HPLC显示，9.8％的活度依然与肽连接(35％以下)。1小时后取出另一小份并通过HPLC分析。HPLC显示，7.6％活度依然连接至肽(35％以下)，这基本上与15min图谱相同(数据未显示)。

[0297] 高剂量18F标记

[0298] 使用纯化的IMP 449的进一步研究证明，18F-标记的肽在37℃人类血清中高度稳定(91％，未显示)至少1小时，并且在37℃人类血清中部分稳定(76％，未显示)至少4小时。进行其他研究，其中IMP 449在作为稳定剂的抗坏血酸存在下制备。在那些研究中18
(未显示)，金属- F-肽复合物在37℃血清中4小时后显示没有可检测的分解。在注射
18 18
F-标记的肽后30min，发现小鼠尿含有与肽结合的 F(未显示)。这些结果证明，本文公
18 18
开的 F-标记的肽在用于 F成像研究的适当体内条件下表现出足够的稳定性。

[0299] 对于不存在抗坏血酸的研究，～21mCi18F的～400μL水溶液与9μL的2mMAlCl3-7在0.1M pH 4NaOAc中的溶液混合。添加肽IMP 449，60μL(0.01M，6x10 mol在0.5NaOH pH
4.13中)，溶液被加热至110℃持续15min。然后通过将反应溶液放入1cc HLB
18 18
柱桶中并用水洗脱以除去未结合的 F，随后用1∶1 EtOH/H2O洗脱 F-标记的肽，纯化粗制的标记肽。粗制反应溶液压力经过柱进入废管形瓶，柱用3x1mL部分水洗涤(18.97mCi)。
然后将HLB柱放在新的管形瓶上，并用2x200μL 1∶1EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽
18
(1.83mCi)。在所有洗脱完成后，柱保留0.1mCi的活度。小份的纯化的 F-标记的肽(20μL)与200μL收集的人类血清混合并在37℃加热。小份通过反相HPLC分析(如上所述)。结
18
果显示 F-标记的纯化的IMP 449在37℃人类血清中孵育0时、1小时(91％标记的肽)、2
18
小时(77％标记的肽)和4小时(76％标记的肽)的相对稳定性(未显示)。还发现，F-标记的IMP 449在TFA溶液中是稳定的，其在反相HPLC色谱中偶尔使用。观察本文所述示例
18
性 F-标记分子，似乎在TFA中的稳定性和在血清中的稳定性之间存在一般相关。这些结
18
果说明，根据本文公开的方法产生的 F-标记的肽显示在人类血清中足够的稳定性，以成功用于体内标记和成像研究，例如，使用PET扫描来检测标记的细胞或组织。最后，由于IMP
449肽含有对放射分解敏感的硫脲键合，通过RP-HPLC观察到了几种产物。然而，当抗坏血酸被添加至反应混合物时，产生的副产物被显著减少。

[0300] 质谱

[0301] 肽的Al和Al19F复合物被制备，使得所述复合物可以通过HPLC并通过质谱分析以19
帮助确定形成的复合物的性质。两种Al F复合物被形成，保留时间与在相似条件下检查的
18 19 +
F复合物相当。[Al F]IMP 449 MH1502.6588的质量(C66H93N19O17S1Al1F1理论1502.6589)
19
与复合物一致，其中Al F结合至NOTA羧基的两个，第三个羧基依然被质子化。已知铝结合NOTA以形成至三个氮和三个羧基的六齿键(Andre等，2002，J Inorg Biochem 88：1-6)。因
19
此，似乎Al F复合物具有与NOTA的五齿结合，铝的第六个结合位点被氟离子占据。

[0302] 实施例7.SCID小鼠中18F-标记的IMP 449的体内生物分布

[0303] 18F-标记的IMP 449如上所述制备。物质在 HLB柱(Milford，MA)上纯化。未结合的物质用水洗出，与柱结合的标记肽用1∶1EtOH/H2O混合物洗脱。两个级分通过反相C18 HPLC分析。纯化的肽被洗脱为反相HPLC柱上的几个峰(未显示)。从柱上未结合的级分显示从C18柱差的回收，7％(未显示)。

[0304] “未结合”的级分和纯化的[Al18F]IMP 449被注射进入SCID小鼠，小鼠之前被注射18
sc SU-DHL6淋巴瘤细胞。仅少数小鼠具有可见的肿瘤。生物分布数据显示，“未结合”F级
18
分和纯化[Al F]IMP 449之间的显著差异。数据显示在下表5-7。注意，在该研究中，在标
18
记肽之前没有对动物施用预靶向双特异性抗体。这些结果说明标记肽与游离 F在体内的分布。

[0305] 未结合的18F显示在体内高水平分布至骨组织。在注射后20分钟，如所预期的，发现吸收主要在骨(脊骨)中，具有约12-15％注射剂量/克(ID/g)，随后是肾，约4％ID/g。18
F标记至骨组织的集中通过与靶向肽的结合而显著减少。当结合至IMP 449时，骨中的吸收在注射后20分钟减少至～1％ID/g，在注射后1小时减少至0.3％，而肾吸收在20分钟
18
为11％并且在1小时为3.3％ID/g。单独肽的肾吸收与预靶向的[Al F]IMP 449肽相似(参见下述实施例)，表明其吸收是肽的功能，而不是动物在之前18h给予bsMAb的结果。与
18 18
未结合的 F相比，F-标记的肽在脊骨和股骨中发现相对低的非特异性吸收。

[0306] 表5.注射后20分钟18F“未结合”分数：％ID/g平均值和个体动物。

[0307]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3
肿瘤 1 -- -- 0.902 -- --
肝 3 2.056 0.244 1.895 2.338 1.937
脾 3 1.869 0.434 1.677 2.366 1.564
肾 3 4.326 0.536 3.931 4.936 4.111
肺 3 2.021 0.149 1.903 2.188 1.972
血液 3 2.421 0.248 2.355 2.696 2.212
胃
3 0.777 0.409 0.421 1.224 0.687
小肠 3 2.185 0.142 2.042 2.325 2.187
大肠 3 1.403 0.069 1.482 1.356 1.372
股骨 3 11.688 1.519 11.502 13.292 10.270
脊骨 3 14.343 2.757 17.506 13.072 12.452
肌肉 3 1.375 0.160 1.191 1.457 1.478

[0308]18 -8

[0309] 表6.纯化的[Al F]IMP 449，80μCi，1x10 mol，在注射后20min：％ID/g平均值和个体动物

[0310]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 1 -- -- 0.891 -- -- -- --
肝 5 2.050 0.312 1.672 1.801 2.211 2.129 2.440
脾 5 1.297 0.259 0.948 1.348 1.144 1.621 1.425
肾 5 12.120 4.128 8.354 7.518 12.492 15.535 16.702
肺 5 2.580 0.518 2.034 2.103 2.804 2.678 3.278
血液 5 3.230 0.638 2.608 2.524 3.516 3.512 3.992
胃
5 1.017 0.907 0.805 0.775 0.344 0.557 2.605
小肠 5 1.212 0.636 0.896 0.921 0.927 0.967 2.349
大肠 5 0.709 0.220 0.526 0.568 0.599 0.793 1.057
股骨 5 0.804 0.389 0.314 0.560 1.280 0.776 1.087
脊骨 5 3.915 6.384 0.819 0.923 1.325 1.177 15.330#
肌肉 5 0.668 0.226 0.457 0.439 0.960 0.673 0.814
#

[0311] 通过重新计算证实动物#5中高脊骨吸收。18 -8

[0312] 表7.纯化的[Al F]IMP 449，80μCi，1x10 mol，在注射后1h：％ID/g平均值和个体动物

[0313]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4
肿瘤 1 0.032 0.064 0.000 0.127 0.000 0.000
肝 4 0.883 0.308 1.103 0.632 0.604 1.191
脾 4 1.061 0.702 1.598 0.631 0.301 1.713
肾 4 3.256 0.591 3.606 2.392 3.362 3.666
肺 4 0.324 0.094 0.411 0.232 0.256 0.399
血液 4 0.285 0.104 0.378 0.153 0.250 0.358
胃
4 0.152 0.082 0.225 0.041 0.199 0.142
小肠 4 1.290 0.228 1.124 1.247 1.166 1.624
大肠 4 0.115 0.035 0.167 0.091 0.094 0.109
股骨 4 1.006 0.876 2.266 0.448 0.939 0.374
脊骨 4 0.314 0.076 0.423 0.257 0.268 0.306
肌肉 4 0.591 0.946 0.205 0.077 2.008 0.075

[0314]

[0315] 这些结果证明，18F-标记的肽显示足以进行标记和成像研究的体内稳定性。

[0316] 实施例8.通过预靶向18F标记的DNL构建体的制备

[0317] 在各种形式中，DNL技术可以用于制备二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等，包括实际上任何抗体或其片段或其他效应部分。对于某些优选实施方案，IgG抗体或Fab抗体片段可以被制备为含有DDD或AD序列的融合蛋白。双特异性抗体可以通过组合第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白来形成。或者，构建体可以制备为组合了18
IgG-AD融合蛋白与Fab-DDD融合蛋白。为了 F检测的目的，含有与待成像的靶组织(例如肿瘤)相关的抗原结合位点的抗体或片段可以与第二抗体或片段组合，所述第二抗体或片
18
段结合可与金属- F连接的可靶向构建体(例如IMP 449)的半抗原。双特异性抗体(DNL
18
构建体)被施用至受试者，允许循环的抗体从血液中清除并集中于靶组织，并且 F-标记的可靶向构建体被添加并结合集中的抗体以成像。

[0318] 可以为每个Fab或IgG融合蛋白开发独立转染的细胞系。一经产生，模块可以按需要被纯化或保持在细胞培养上清液中。产生后，任何DDD2-融合蛋白模块可以与任何AD-融合蛋白模块组合以产生双特异性DNL构建体。对于不同类型的构建体，可以利用不同的AD或DDD序列。

[0319] DDD1：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：3)

[0320] DDD2：CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：4)[0321] AD1：QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：5)

[0322] AD2：CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：6)

[0323] 质粒载体pdHL2已经用于产生许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。二-顺反子哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。载体序列对于许多不同的IgG-pdHL2构建体而言大部分相同，而仅在可变结构域(VH和VL)序列中存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，这些IgG表达载体可以被转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和人类RIIα的前44个残基(称为DDD1)的序列替代。为了产生Fab-AD表达载体，IgG的铰链、CH2和CH3的序列用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和称为AKAP-IS的17个残基的合成AD(称为AD1)的序列替代，其使用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto，等Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。

[0324] 设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体转变为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。

[0325] CH1的制备

[0326] 使用pdHL2质粒载体作为模板通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)末端和SacII限制核酸内切酶位点组成，其时CH1编码序列的5’。右侧引物由编码铰链(PKSC)的前4个残基的序列、随后四个甘氨酸和丝氨酸以及包括Bam HI限制位点的最后两个密码子(GS)组成。410bp PCR扩增子被克隆入pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)并且根据T7(5’)方向插入序列来筛选克隆。

[0327] (G4S)2DDD1的构建(公开为SEQ ID NO：22的(G4S)2)

[0328] 命名为(G4S)2DDD1的双链体寡核苷酸(公开为SEQ ID NO：22的(G4S)2)由Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成以编码DDD1的氨基酸序列，之前有11个残基的接头肽，以及包括BamHI限制位点的前两个密码子。终止密码子和EagI限制位点附于3’末端。下面显示了编码的多肽序列。

[0329] GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO：7)[0330] 在其3’末端重叠30个碱基对的命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下的两个寡核苷酸被合成(Sigma Genosys)并被组合以包括174bp DDD1序列的中心154个碱基对。寡核苷酸被退火并经历Taq聚合酶的引物延伸反应。引物延伸之后，双链体通过PCR扩增。扩增子被克隆入pGemT并根据T7(5’)方向的插入序列来筛选。

[0331] (G4S)2-AD1的构建(公开为SEQ ID NO：22的(G4S)2)

[0332] 命名为(G4S)2-AD1的双链体寡核苷酸(公开为SEQ ID NO：22的(G4S)2)被合成(Sigma Genosys)以编码AD1的氨基酸序列，之前有11个残基的接头肽，以及包括BamHI限制位点的前两个密码子。终止密码子和EagI限制位点附于3’末端。下面显示了编码的多肽序列。

[0333] GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：8)

[0334] 命名为AKAP-IS上和AKAP-IS下的编码上述肽序列的两个互不重叠寡核苷酸被合成并退火。双链体通过PCR扩增。扩增子被克隆入pGemT载体并根据T7(5’)方向的插入序列来筛选。

[0335] 连接DDD1与CH1

[0336] 编码DDD1序列的190bp片段用BamHI和NotI限制酶从pGemT切离，然后连接入CH1-pGemT中的相同位点以产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。

[0337] 连接AD1与CH1

[0338] 含有AD1序列的110bp片段用BamHI和NotI从pGemT切离，然后连接入CH1-pGemT中的相同位点以产生穿梭载体CH1-AD1-pGemT。

[0339] 将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的载体

[0340] 使用该模块设计，CH1-DDD1或CH1-AD1可以被结合入pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过从pdHL2去除SacII/EagI限制片段(CH1-CH3)并用从各自的pGemT穿梭载体切离的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段替代它，将完整的重链恒定结构域替换为上述构建体之一。

[0341] h679-Fd-AD1-pdHL2的构建

[0342] h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生h679 Fab的表达载体，AD1经由14个氨基酸构成的柔性Gly/Ser肽间隔序列偶联至Fd的CH1结构域的羧基末端。含有h679的可
变结构域的基于pdHL2的载体可以通过用CH1-AD1片段替换SacII/EagI片段而转变为
h679-Fd-AD1-pdHL2，用CH1-AD1片段用SacII和EagI从CH1-AD1-SV3穿梭载体切离。

[0343] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建

[0344] C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生包括两个拷贝的融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，其中DDD1经由柔性肽间隔序列在CH1的羧基末端连接至hMN-14 Fab。已经用于产生hMN-14 IgG的质粒载体hMN14(I)-pdHL2被转变为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2，通过用SacII和EagI限制核酸内切酶消化以除去CH1-CH3结构域并插入使用SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体切离的CH1-DDD1片段。

[0345] 已经使用相同的技术产生用于多种已知抗体的Fab表达的质粒，例如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其他。一般而言，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体中，并且该表达载体如上所述被转变用于产生AD-或DDD-融合蛋白。将包括任何此类抗体的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以每一个AD-融合蛋白两个DDD-融合蛋白的适当比例组合，以产生包括第一抗体的两个Fab片段和第二抗体的一个Fab片段的三聚体DNL构建体。

[0346] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2

[0347] C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有DDD2的二聚化和对接结构域序列，其经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附于hMN-14的Fd的羧基末端。分泌的融合蛋白由两个相同拷贝的hMN-14Fab构成，两个相同拷贝的hMN-14 Fab由DDD2结构域的非共价相互作用固定在一起。

[0348] 表达载体被如下改造。合成制备了两个重叠的互补寡核苷酸，包括部分接头肽(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO：9)和DDD2的残基1-13的编码序列。寡核苷酸被退火并用T4PNK磷酸化，在5′和3′末端产生突出端，分别适合与用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接。

[0349] 双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化而制备的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接，以产生穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。507bp片段用SacII和EagI从CH1-DDD2-pGemT切离，并与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2连接。最终的表达构建体被命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已经使用类似的技术来产生许多人源化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。

[0350] H679-Fd-AD2-pdHL2

[0351] h679-Fab-AD2被设计为作为B 与作为 A的 C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，h679-Fab-AD2具有经由经由14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附于CH1结构域的羧基末端的AD2的锚定结构域序列。AD2具有在AD1锚定结构域序列前的一个半胱氨酸残基以及在AD1锚定结构域序列后的一个半胱氨酸残基。

[0352] 表达载体被如下改造。合成制备了两个重叠的互补寡核苷酸(AD2上和AD2下)，其包括AD2和部分接头序列的编码序列。寡核苷酸被退火并用T4 PNK磷酸化，在5′和3′末端产生突出端，分别适合与用限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接。

[0353] 双链体DNA被连接入通过用BamHI和SpeI消化而制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT，以产生穿梭载体CH1-AD2-pGemT。含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段用SacII和EagI限制酶从穿梭载体切离并被连接入使用那些相同酶消化而制备的h679-pdHL2载体。最终的表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。

[0354] TF2的产生

[0355] 命名为TF2的三聚体DNL构建体通过C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应而获得。以＞90％的收率如下产生试验批次的TF2。蛋白L纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4∶1摩尔比混合。在含有1mM EDTA的PBS中的总蛋白浓度是1.5mg/ml。随后步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP 291亲和色谱。在添加TCEP之前，SE-HPLC未显示a2b形成的任何迹象。添加5mM TCEP快速导致a2b复合物形成，与二元结构所预期的157kDa蛋白一致。通过IMP 291亲和色谱，TF2被纯化至接近均一(未显示)。IMP 291是合成的肽，含有679Fab结合的HSG半抗原(Rossi等，2005，Clin Cancer Res 11：7122s-29s)。IMP 291未结合级分的SE-HPLC分析证明a4、a2和游离κ链从产物去除(未显示)。

[0356] 非还原SDS-PAGE分析证明，大部分TF2作为大的共价结构存在，具有与IgG接近的相对迁移率(未显示)。其他键表明在实验条件下二硫化物形成不完全(未显示)。还原SDS-PAGE显示在非还原凝胶中明显的任何其他条带是产物相关的(未显示)，因为代表TF2组成多肽的唯一条带是明显的。然而，四种多肽的每一个的相对迁移率太接近以致于无法分辨。MALDI-TOF质谱(未显示)揭示了156，434Da的单峰，其在TF2计算质量(157，319Da)的99.5％之内。

[0357] TF2的功能性通过BIACORE分析确定。TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原的a2和b组分的对照样品)被稀释至1μg/ml(总蛋白)并穿过固定有HSG的传感器芯片。对TF2的响应是
两种对照样品的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分结合并保留在传感器芯片上。
随后注射WI2 IgG，hMN-14的一种抗-独特型抗体，证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密结合的DDD-Fab-hMN-14组分，如通过其他信号响应所指示的。WI2与固定于传感器芯片上的TF2的结合产生的响应单位的额外增加对应于两个完全功能性结合位点，每一个由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基贡献。这由TF2与WI2的两个Fab片段结合的能力证实(未显示)。

[0358] TF10双特异性抗体的产生

[0359] 使用类似方案产生三聚体TF10 DNL构建体，包括两个拷贝的C-DDD2-Fab-hPAM4和一个拷贝的C-AD2-Fab-679。TF10中的癌症靶向抗体组分衍生自hPAM4，一种已经作为放射性标记MAb被详细研究的人源化抗-胰腺癌粘蛋白MAb(例如，Gold等，Clin.Cancer Res.13：7380-7387，2007)。半抗原结合组分衍生自h679，一种上文讨论的人源化抗-组胺基-琥珀酰-甘氨酸(HSG)MAb。TF10双特异性([hPAM4]2xh679)抗体使用如上所述用于产生(抗CEA)2x抗HSG bsAb TF2所公开的方法产生。TF10构建体带有两个人源化PAM4 Fab和一个人源化679 Fab。

[0360] 两个融合蛋白(hPAM4-DDD和h679-AD2)被独立表达在稳定转染的骨髓瘤细胞中。合并组织培养上清液，导致两倍摩尔过量的hPAM4-DDD。反应混合物使用1mM还原的谷胱甘肽在温和还原条件在室温孵育24小时。还原后，DNL反应使用2mM氧化的谷胱甘肽通过温和氧化来完成。TF10通过使用IMP 291-亲和凝胶树脂的亲和色谱来分离，所述树脂以高特异性结合h679 Fab。

[0361] 已经针对正进入临床试验的hPAM4 IgG和抗-CEA x抗-HSG bsMAb检查了全面的组织组织学和血液细胞结合板。在1/3样本中，hPAM4结合被限制为非常弱的结合至膀胱和胃(没有发现体内结合)，而对正常组织无结合归因于抗-CEAx抗-HSG bsMAb。而且，针对携带H1和H2组胺受体的细胞系的体外研究显示，IMP 288二-HSG肽没有拮抗或激动活性，两个不同物种的动物研究显示，在比成像所用剂量高20,000倍的剂量下没有与组胺组分相关的肽的药理活性。因此，HSG-组胺衍生物不具有药理活性。

[0362] 实施例9.DNL的序列变体

[0363] 在某些优选实施方案中，被结合入细胞因子-MAb DNL复合物的AD和DDD序列包括如下所示的AD2和DDD2的氨基酸序列。

[0364] DDD2

[0365] CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：4)

[0366] AD2

[0367] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：6)

[0368] 然而，在替代实施方案中，AD和/或DDD部分的序列变体可以用于构建DNL复合物。AD和DDD结构域的结构-功能关系已经成为考察的主题。(参见例如，Burns-Hamuro等，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等，2001，J Biol Chem276：17332-38；Alto等，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50；Hundsrucker等，2006，Biochem J 396：297-306；
Stokka等，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等，2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等，2006，Mol Cell 24：397-408，每一个的全部内容在此通过引用并入)。

[0369] 例如，Kinderman等(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人类DDD序列含有许多对于二聚体形成或AKAP结合而言重要的保守氨基酸残基，在下文SEQ ID NO：3中加下划线。(参Kinderman等，2006的图1，在此通过引用并入)。技术人员将发现，在设计DDD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而可以对二聚化和AKAP结合不太重要的残基进行保守的氨基酸取代。

[0370] 来自蛋白激酶A的人类DDD序列

[0371] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：3)

[0372] Alto等(2003)进行各种AKAP蛋白的AD序列的生物信息分析以设计称为AKAP-IS(SEQ ID NO：5)的RII选择性AD序列，对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列被设计为AKAP结合至PKA德肽拮抗剂。当取代趋向于增加对DDD结合的AKAP-IS序列中的残基在SEQ ID NO：5中加下划线。技术人员将发现，在设计AD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而可以对DDD结合不太重要的残基进行保守的氨基酸取代。

[0373] AKAP-IS序列

[0374] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：5)

[0375] Gold(2006)利用了结晶学和肽筛选来开发超级AKAP-IS序列(SEQ IDNO：10)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置，所述氨基酸取代增加了对RIIα的DDD部分的结合。在该序列中，N末端Q残基被编号为残疾号4，而C末端A残基是残基号20。可以被取代以影响对RIIα亲和力的残基是残基8，11，15，16，18，19和20(Gold等，2006)。在某些替代实施方案中，预期超级AKAP-IS序列可以被取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。可以取代AKAP-IS AD序列的其他替代序列显示于SEQ ID NO：11-13。相对于AKAP-IS序列的取代被加下划线。与SEQ ID NO：6中显示的AD2序列一样，预期AD部分还可以包括其他N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸，如SEQ ID NO：6所示。

[0376] 超级AKAP-IS

[0377] QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：10)

[0378] 替代的AKAP序列

[0379] QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：11)

[0380] QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：12)

[0381] QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：13)

[0382] Stokka等(2006)还开发了AKAP与PKA结合的肽竞争剂，示于SEQ IDNO：14-16。肽拮抗剂被命名为Ht31(SEQ ID NO：14)、RIAD(SEQ ID NO：15)和PV-38(SEQ ID NO：16)。
Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型更大的亲和力，而RIAD和PV-38显示对RI更大的亲和力。

[0383] Ht31

[0384] DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：14)

[0385] RIAD

[0386] LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：15)

[0387] PV-38

[0388] FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：16)

[0389] Hundsrucker等(2006)还开发了AKAP与PKA结合的其他肽竞争剂，对PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗肽的序列提供于Hundsrucker等的表1(在此通过引用并入)。不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO：5)加下划线来指示。残基与Alto等(2003)观察到的相同，添加了C末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4，在此通过引用并入)。对RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列显示于SEQ ID NO：17-19。

[0390] AKAP-IS

[0391] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：5)

[0392] AKAP7δ-wt-pep

[0393] PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：17)

[0394] AKAP7δ-L304T-pep

[0395] PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：18)

[0396] AKAP7δ-L308D-pep

[0397] PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：19)

[0398] Carr等(2001)检查了来自人和非人蛋白的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度和DDD序列中鉴定的在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些在下文通过参考人类PKA RIIαDDD序列SEQ ID NO：3加下划线来指示。特别保守的残基通过斜体来进一步指示。与Kinderman等(2006)提出的那些重叠但不相同的残基对于AKAP蛋白的结合是重要的。技术人员将发现，在设计DDD序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体表示)，而可以考虑对未加下划线也未斜体表示的残基进行保守的氨基酸取代。

[0399] SHIQ P TE Q Y V Q P VE VE TR REA A(SEQIDNO：3)
18

[0400] 实施例10.使用预靶向抗体和 F-标记的肽的体内研究18

[0401] 18F-标记的IMP 449如下制备。 F(54.7mCi于～0.5mL中)与3μL 0.1MNaOAc pH 4缓冲液中的2mM Al混合。3min后，添加10μL 0.5M pH 4NaOAc缓冲液中的0.05M IMP449，反应在96℃加热器加热器中加热15min。反应内容物用注射器去除。然后通过HPLC在C18柱上纯化粗制标记肽。流速为3mL/min。缓冲液A是水中0.1％TFA，并且缓冲液B是含有0.1％TFA的水中的90％乙腈。梯度是经15min从100％A至75/25 A∶B。首先被洗
脱的标记肽与未标记肽之间存在约1min的保留时间(tR)差异。以0.5min(mL)级分收集HPLC洗脱液。标记的肽具有6至9min的tR，取决于使用的柱。HPLC纯化的肽样品通过使目标级分在水中稀释两倍并将溶液放入1cc HLB柱桶中而被进一步加工。柱
18
筒用3x1mL水洗脱以除去乙腈和TFA，随后通过400μL 1∶1EtOH/H2O以洗脱 F-标记的
18
肽。纯化的[Al F]IMP 449在分析型HPLC C18柱上作为单峰被洗脱(未显示)。

[0402] 携带四个缓慢生长的sc CaPan1异种移植物的Taconic裸小鼠被用于体内研究。18
三只小鼠被注射TF10(162μg)，随后在18h后注射[Al F]IMP 449。TF10是用于肿瘤成像研究的人源化双特异性抗体，对PAM-4限定的肿瘤具有二价结合，而对HSG具有单价结合(参见例如，Gold等，2007，J.Clin.Oncol.25(18S)：4564)。小鼠被注射单独的肽。所有小鼠在肽注射后1h进行解剖。组织被立即计数。动物#2显示在股骨中的高计数。股骨被转移入新的管形瓶并与旧的空管形瓶一起被再次计数。再计数指示，计数在组织上。该股骨被破碎并具有大条与其连接的肌肉。平均值分布对比显示在肿瘤靶向双特异性抗体存在下
18
集中于肿瘤的 F-标记的肽比任何正常组织中明显更高的水平。

[0403] 组织吸收在给予单独[Al18F]IMP 449的动物或预靶向环境中是类似的(表8)。与单独肽相比较，在1h时，在预靶向动物中人类胰腺癌异种移植物CaPan1的吸收增加5倍(4.6±0.9％ID/g与0.89％ID/g)。此时达到罕见的肿瘤/非肿瘤比值(例如，肿瘤/血液和肝的比值分别是23.4±2.0和23.5±2.8)。

[0404] 表8.在肽注射后1h的组织吸收，平均值和个体动物：

[0405]

[0406]

[0407] 实施例11.具有预靶向抗体的111In-IMP 449与[Al18F]IMP 449的生物分布对比[0408] 研究目标是对比在用双特异性抗体TF2预靶向之后在携带sc LS174 T异种移植111 18
物的裸小鼠中 In-IMP 449和[Al F]IMP 449的生物分布。TF2抗体通过对接锁定方法制备并含有CEA肿瘤抗原和HSG半抗原的结合位点(参见例如，Sharkey等，Radiology 2008，
246：497-507；Rossi等，PNAS USA 2006，103：6841-46)。因为具有肿瘤的小鼠在一个时间数量不足，所以研究在不同的2周期间进行。

[0409] 111In-IMP 449：111In标记使用与用于标记IMP 288的程序类似的程序，除了以较低的比活度。ITLC和C-18 RP-HPLC显示～30％未结合(未显示)。标记的肽在HLB柱上纯化(1mL，30mg)。纯化产物的再次分析显示33％未结合，通过在饱和氯化钠中展开的ITLC(未显示)。RP-HPLC显示在纯化之前和之后的多重峰(未显示)。纯化后的SE-HPLC显示，当与20x摩尔过量的TF2混合时，47％的活度转向高MW(未显示)。

[0410] [Al18F]IMP 449：标记如上所述进行，除了18F在标记之前在QMA柱上纯化，如Kim等(Applied Radiation and Isotopes 61，2004，1241-46)所述。简言之，用10mL 0.4M TMKHCO3冲洗，然后用10mL DI水洗涤，来准备 LIGHT ACCELL Plus
18
QMA柱。2mL水中的 F(42mCi)被上样至QMA柱。柱用10mL DI水洗脱以除去杂质。柱然后用1mL 0.4M KHCO3以200μL级分洗脱。级分编号2含有大部分活度，33mCi。然后使用
18 18
10μL冰乙酸调节 F溶液的pH。然后级分#2的 F与3μL 0.1M pH 4NaOAc缓冲液中的
2mMAl混合。然后样品与10μL 0.5M NaOAc缓冲液(pH 4)中的0.05M IMP 449混合，反应
18
溶液在94℃添加15min。[Al F]IMP 449通过RP-HPLC纯化。含有产物的级分穿过HLB柱以交换缓冲液。柱在上样样品后用水洗涤。产物用400μL 1∶1 EtOH∶H2O洗脱。产物的RP-HPLC显示一个具有肩峰的主要峰(未显示)。因为收率低，所以比活度低，并将更多的肽注射入小鼠，造成bsMAb∶肽比为6.9∶1而不是10∶1。

[0411] 结果

[0412] IMP 449用In-111标记导致多种产物。可能一些产物可以是双核复合物。111 111
In-IMp 449显示高肾吸收和高血液浓度。然而，甚至作为多个物类， In-IMP449显示当用TF2预靶向时集中于肿瘤(图1)。

[0413] 图1显示111In和18F标记的IMP 449在小鼠中的对比生物分布。在双特异性TF2抗体存在下，两个标记的肽都显示相似高水平的集中于肿瘤组织。在存在或不存在TF2抗111 18
体时，In-标记的物类在肾中显示比 F-标记的物类更高的浓度。数据概述于下表9-12中。

[0414] 表9.小鼠被i.v.注射TF2(163.2μg，1.035x10-9mol)，随后在16h后注射111InIMP -10449(1.035x10 mol)。在肽注射后1h的肽组织吸收(％ID/g)显示如下。

[0415]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 9.18 1.02 9.22 8.47 8.04 9.45 10.70
肝 5 1.15 0.09 1.03 1.25 1.20 1.21 1.08
脾 5 0.48 0.06 0.43 0.49 0.58 0.50 0.42
肾 5 6.63 1.38 8.81 6.21 7.03 5.85 5.23
肺 5 1.03 0.14 0.92 1.14 1.18 1.04 0.86
血液 5 0.99 0.15 1.04 1.13 1.12 0.83 0.83
胃
5 0.16 0.05 0.25 0.17 0.16 0.13 0.12
小肠 5 2.33 0.65 2.21 2.51 2.01 3.33 1.59
大肠 5 0.20 0.04 0.21 0.25 0.18 0.21 0.14
股骨 5 1.45 0.87 0.59 1.30 0.71 2.02 2.62
脊骨 5 1.18 1.23 0.89 3.35 0.76 0.47 0.43
脑 5 0.14 0.16 0.05 0.06 0.13 0.04 0.43
肌肉 5 0.83 0.66 0.25 1.30 0.23 0.65 1.73
体重 5 25.49 1.41 27.89 24.14 25.27 25.10 25.06

[0416]

[0417] 表10.一组2只小鼠被注射111In IMP 449(1.035x10-10mol)，而无预靶向抗体。肽注射后1h的肽组织吸收(％ID/g)显示如下。

[0418]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2
肿瘤 2 0.922 0.195 0.784 1.060
肝 2 1.033 0.048 0.999 1.067
脾 2 0.409 0.067 0.362 0.456
肾 2 6.046 0.449 5.729 6.364
肺 2 0.695 0.032 0.672 0.717
血液 2 0.805 0.182 0.934 0.676
胃
2 0.290 0.055 0.251 0.329
小肠 2 2.234 0.594 1.814 2.654
大肠 2 0.237 0.022 0.253 0.222
股骨 2 1.210 1.072 1.968 0.453
脊骨 2 1.463 1.213 2.320 0.605
脑 2 0.133 0.091 0.068 0.197
肌肉 2 1.005 1.148 1.817 0.193
体重 2 26.65 3.19 28.90 24.39

[0419] 表11.小鼠被i.v.注射TF2(163.2μg，1.035x10-9mol)，随后在16h后注射[Al18F]-10IMP 449(1.5x10 mol)。肽注射后1h的肽组织吸收(％ID/g)显示如下。

[0420]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 7.624 3.080 5.298 7.848 12.719 5.118 7.136
肝 5 0.172 0.033 0.208 0.143 0.196 0.131 0.180
脾 5 0.142 0.059 0.239 0.081 0.132 0.118 0.140
肾 5 2.191 0.125 2.313 2.141 2.154 2.319 2.027
肺 5 0.315 0.094 0.474 0.230 0.300 0.305 0.265
血液 5 0.269 0.143 0.431 0.395 0.132 0.126 0.260
胃
5 0.218 0.341 0.827 0.041 0.098 0.054 0.070
小肠 5 0.351 0.313 0.903 0.185 0.297 0.170 0.198
大肠 5 0.069 0.028 0.076 0.043 0.111 0.073 0.042
股骨 5 0.625 0.358 0.869 0.146 0.811 0.957 0.344
脊骨 5 0.585 0.569 0.159 0.119 0.493 1.526 0.626
脑 5 0.029 0.005 0.033 0.021 0.035 0.026 0.028
肌肉 5 0.736 0.970 0.190 0.064 0.494 2.438 0.496
体重 5 24.69 1.20 23.05 26.36 24.45 24.48 25.11

[0421] 表12.小鼠被注射[Al18F]IMP 449(1.5x10-10mol)，而无预靶向抗体。肽注射后1h的肽组织吸收(％ID/g)显示如下。

[0422]组织 n 平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5
肿瘤 5 0.472 0.201 0.256 0.344 0.533 0.447 0.779
肝 5 0.177 0.035 0.141 0.200 0.141 0.185 0.217
脾 5 0.118 0.027 0.098 0.094 0.101 0.144 0.151
肾 5 2.727 0.367 2.430 2.452 2.500 3.080 3.173
肺 5 0.246 0.082 0.206 0.209 0.156 0.301 0.358
血液 5 0.167 0.072 0.110 0.135 0.104 0.217 0.267
胃
5 0.114 0.083 0.149 0.241 0.037 0.067 0.074
小肠 5 0.277 0.081 0.407 0.286 0.206 0.213 0.271
大肠 5 0.072 0.029 0.061 0.052 0.047 0.083 0.118
股骨 5 0.100 0.032 0.080 0.144 0.110 0.109 0.059
脊骨 5 0.305 0.268 0.104 0.647 0.099 0.132 0.545
脑 5 0.034 0.025 0.018 0.018 0.022 0.034 0.077
肌肉 5 0.088 0.022 0.087 0.069 0.069 0.122 0.092
体重 5 25.34 1.72 25.05 26.88 26.40 25.88 22.51

[0423]

[0424] 该研究显示，本文描述的简单可重现方法和组合物产生适合用于体内成像多种疾18
病状态的 F-标记的靶向肽。技术人员将发现，上述公开的双特异性抗体是非限制性的，但是可以包括针对多种疾病或病原体靶抗原的任何已知抗体。而且所述方法不限于用双特异性抗体预靶向。在其他实施方案中，直接结合待成像的靶细胞、组织或有机体的分子或复合
18
物可以使用本文公开的方法用 F标记并被施用至受试者以PET成像(参见下文实施例)。

[0425] 由IMP 449示例的Al18F-标记的肽在体内条件下足够稳定以在已知成像方案(例18
如PET扫描)中使用。而且，要求保护的方法导致准备在制备后1小时内注射的 F-标记
18
的靶向肽制剂，完全在 F的衰变时间之内以允许进行适合的成像程序。最后，与制备用于
18
成像研究的 F-标记的化合物的已知方法相比，所描述和要求保护的方法导致操作人员对放射性同位素暴露的最小暴露。

[0426] 实施例12.18F标记试剂盒

[0427] 18F标记试剂盒通过混合8.0mg IMP 449与0.1549g抗坏血酸来制备。两种试剂溶解于10.5mL水，并且溶液悬浮于分成10个管形瓶的1.0mL小份。调整pH。溶液被冷冻，冻干并真空密封。冷冻冻干的管形瓶被再水合并用于IMP 449肽的研究。

[0428] 实施例13.使用18F-标记的肽体内成像并与18F[FDG]方法对比

[0429] 使用双特异性抗体和标记的靶向肽预靶向的体内成像技术被用于成功检测相对小尺寸的肿瘤。

[0430] 18F根据文献程序在 ACCELLTM Plus QMA Light柱上纯化，其中所述柱18
用10mL 0.4M KHCO3洗涤，随后用DI水10mL洗涤。2mL水中 F被穿过柱，然后用10mL水
18
洗涤。 F然后用0.4M KHCO3以5x200μL小份从柱被洗脱。大部分活度被洗脱在第二级分
3+ 18
中。第二级分中的活度与3μL pH 4乙酸盐缓冲液中2mM Al 混合，然后将Al F溶液注入抗坏血酸IMP 449标记管形瓶中并被加热至105℃15min。反应溶液被冷却并与0.8mL DI水混合。反应内容物被放在 1cc HLB柱上并被洗脱入废管形瓶中。柱
用3x1mL DI水洗涤。柱被转移至含有抗坏血酸的制剂管形瓶。柱用2x200μL 1∶1EtOH/H2O洗涤以洗脱标记的肽。

[0431] 重组的人源化的tri-Fab bsMAb，TF2如上所述制备。TF2二价结合至癌胚抗原(CEA)并单价结合至合成的半抗原HSG(组胺-琥珀酰-甘氨酸)。使用尺寸排阻HPLC方法，bsMAb对CEA和二价-HSG NOTA-肽IMP 449具有＞95％免疫反应性。

[0432] 生物分布和显微PET成像

[0433] 六周大的NCr nu-m雌性裸小鼠被s.c.移植人类慢性癌细胞系LS174T(ATCC，Manassas，VA)。当肿瘤被显影建立时，预靶向的动物被静脉内注射162μg(～1nmol/0.1mL)TF2或 TF10( 对照非靶向 tri-Fab bsMAb)，然后在 16-18h后，～
18 18
0.1nmol[Al F]IMP 449(84μCi，3.11MBq/0.1mL)被静脉内注射。[Al F]IMP 449的浓度
18
通过假设100％回收添加的铝来确定。其他非预靶向对照动物接收单独的 F(150μCi，
18 18
5.5MBq)、单独的Al F复合物(150μCi，5.55MBq)、单独的[Al F]IMP 449肽(84μCi，
18 18 18
3.11MBq) 或 [ F]FDG(150μCi，5.55MBq)。 F 和 [ F]FDG 在使用当天获自 IBA
18
Molecular(Somerset，NJ)。接收[ F]FDG的动物被禁食过夜，但是水被随意提供。

[0434] 在放射性示踪剂注射后1.5h，动物被麻醉，心门内取血并被解剖。组织被称重并与18
从各自产物的每一个制备的标准稀释液一起计数。由于 F的短的物理半衰期，标准物间插在来自每个动物的组织的每一个组之间。组织中的吸收被表示为每克计数除以总注射活度以得到每克百分比注射剂量(％ID/g)。

[0435] 进行两种类型的成像研究。在一组中，携带小LS174T皮下肿瘤的3只裸小鼠接18 18
收预靶向的[Al F]IMP 449、单独的[Al F]IMP 449(未被预靶向)(都是135μCi(5MBq；
18
0.1nmol))或[ F]FDG(135μCi，5MBq)。在静脉内放射性示踪剂注射后2h，动物用O2/N2O和异氟烷(2％)混合物麻醉并在扫描期间保持温暖。小鼠以仰卧位置被放在动
物PET 扫描仪(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)的扫描床上。该扫描仪
18 18
具有1.5mm的固有空间分辨率。获得经15min[ F]FDG或30min([Al F]IMP 449)的发射扫描。扫描使用 Acquisition Workplace 软件(IAW，版本1.2)重建，使用有序集
期望最大化3D/最大验后(OSEM3D/MAP)算法，具有下述参数：基质256x256x159，像素大小
0.43x0.43x0.8mm3和先验MAP 0.5mm。

[0436] 显示了大致位于肿瘤中心的平面的代表性冠状横截面(0.8mm厚)，强度被调整直至像素饱和出现在机体任何区(除了膀胱)并无背景调整。

[0437] 在单独的动态成像研究中，在16h前给予TF2 bsMAb的携带单一LS174T的裸小鼠用O2/N2O和异氟烷(2％)的混合物麻醉，仰卧放在照相床上，然后静脉内注射
18
219μCi(8.1MBq)[Al F]IMP 449(0.16nmol)。立即开始经120分钟时段的数据获取。数据以每个5分钟的24 帧绘制直方图。扫描使用OSEM3D/MAP重建，使用与上述相同的参数。
24-图像时帧的每一个被检查。为了展示，对每个横截面(冠状、径向和横向)展示在5、15、
30、60、90和120min结束的时帧(即，从0时至5分钟的时段的5-min图像)。对于含有肿瘤的截面，在每个间隔，调整图像强度直至像素饱和首先出现在肿瘤中。图像强度按需要随时间增加以维持肿瘤内的像素饱和。在相同间隔得到的没有肿瘤的冠状和径向横截面被调整至与含有肿瘤的横截面相同的强度。背景活度未被调整。

[0438] 结果

[0439] 虽然单独的18F和[Al18F]复合物在所有组织中具有相似的吸收，但是当复合物被18
螯合至IMP 449时发现显著差异(表13)。最显著差异发现于骨中的吸收，其中非螯合的 F
18
在肩胛骨60至100倍更高并且在脊骨中～200倍更高。因为已知 F或甚至金属-氟化物复合物在骨中累积(Franke等1972，Radiobiol.Radiother.(Berlin)13：533)，预期该分布。
18
还在肿瘤和肠中以及肌肉和血液中观察到更高的吸收。螯合的[Al F]IMP 449在除了肾的所有组织中具有显著更低的吸收，说明螯合剂-复合物通过尿排泄而从机体被有效去除的
18
能力。使用TF2抗-CEAbsMAb预靶向[Al F]IMP 449使吸收转移至肿瘤，使其从0.20±0.05
18
增加至1.5h的6.01±1.72％每克注射剂量，而正常组织中的吸收与单独的[Al F]IMP 449类似。血液、肝、肺和肾中的肿瘤/非肿瘤比值分别是146±63、59±24、38±15和2.0±1.0，
18 18
此时其他肿瘤/组织比值＞100∶1。尽管单独的 F和单独的[Al F]在肿瘤中都具有比
18
螯合[Al F]IMP 449更高的吸收，分别产生6.7±2.7和11.0±4.6与5.1±1.5的肿瘤/
血液比值，但是肿瘤吸收和肿瘤/血液比值被预靶向显著提高(所有P值＜0.001)。

[0440] 生物分布与靶向组织的最常用肿瘤成像剂[18F]FDG相当，具有高葡萄糖消耗和代18
谢活性。其在除了肾以外的所有正常组织中的吸收比[Al F]IMP 449明显更高。对于预靶
18 18 18
向的[Al F]IMP 449和[ F]FDG而言，肿瘤吸收类似，但是因为[ F]FDG在大部分正常组
18
织中较高的累积，[ F]FDG的肿瘤/非肿瘤比值显著低于预靶向动物中的那些(所有P值＜0.001)。

[0441] 表13.

[0442] TF2-预靶向的[Al18F]IMP 449和其他对照18F-标记的物质在携带LS 174T人类18
结肠异种移植物的裸小鼠中的生物分布。为了预靶向，动物在注射[Al F]IMP449之前16h给予TF2。所有注射被静脉内施用。

[0443] 在注射后1.5h的每克百分比注射剂量(平均值±SD)

[0444]

[0445] 几只动物被成像以进一步分析单独[Al18F]IMP 449或TF2预靶向的[Al18F]IMP18
449以及[ F]FDG的生物分布。在注射放射性之后2.0h开始的静态图像证实了之前的组织分布数据，显示几乎完全在肾中的吸收(图2)。21-mg肿瘤在预靶向动物中容易显影，而给
18
予单独[Al F]IMP 449的动物未能定位肿瘤，仅具有肾吸收。没有观察到骨增生的证据，表
18
明Al F被牢固结合至IMP449。这在经历动态成像研究的另一只预靶向动物中被证实，所述
18 18
动态成像研究监测[Al F]IMP 449在120分钟内以5-min间隔的[Al F]IMP 449分布(图
3)。冠状和径向切片显示在前5分钟主要的心脏、肾和一些肝吸收，但在接下来的10分钟心脏和肝获得明显下降，而肾在整个研究中保持突出。在整个120分钟扫描中，没有肠或骨中活度的证据。首先在15分钟到30分钟观察到35-mg LS174T肿瘤中的吸收，该信号从背景被非常清晰地描绘，强肿瘤活度在整个120分钟扫描期间是突出的。

[0446] 在对比中，给予[18F]FDG的动物的静态图像显示了之前在骨、心肌和脑中观察到的预期的放射性模式(McBride等，2006，J.Nucl.Med.47：1678；Sharkey等，2008，Radiology 246：497)，在机体中明显更高的背景活度(图2)。在静态成像研究结束时解剖18
的3只动物中测量的组织吸收证实在所有组织中高得多的组织 F放射性。虽然在该动物
18
中[ F]FDG的肿瘤吸收比预靶向动物中高，但是肿瘤/血液比更有利于预靶向；并且在机体中具有少得多的残基活度，肿瘤显影通过预靶向被增强。

[0447] 这些研究证明，预靶向成像中使用的生物分子(该例中是半抗原-肽)可用18F快速标记(60min的总制备时间)，通过简单形成氟化铝复合物，然后氟化铝复合物被适合的18
螯合剂结合并被结合入半抗原-肽。这可以通过将[Al F]-螯合剂简单偶联至可连接至螯合部分的任何分子并随后被纯化而更普遍地制备。在优选实施方案中，标记物的百分比结
18
合以及被标记化合物的比活度是足够的，以致于不必纯化标记分子。我们还能够将 F结合至已经结合至螯合剂的Al(数据未显示)。

[0448] 这是描述将18F经由铝结合物结合至各种化合物的直接、简易和快速方法的首次18 18
报道。此类产物例如[Al F]的稳定性取决于用于将 F连接至目标分子的螯合剂的性质。
螯合剂可以被选择具有正确构型以优化金属结合和随后的稳定性。当被基于NOTA的螯合
18 18
剂结合时，[Al F]肽在体外和体内是稳定的。收率在使用常规 F标记程序发现的范围内。
18
这些结果进一步证明使用与多种靶向分子螯合的金属 F进行PET成像的可行性。

[0449] 实施例14.IMP 460的制备并用Al-18F标记

[0450] IMP 460 NODA-Ga-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 如上针对IMP361所述以类似方式合成。NODA-Ga配体购自并像其他氨基酸一样被连接至肽合成仪。肽在Sieber酰胺树脂上合成，使用以下述顺序添加的氨基
酸和其他物质：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Ala-OH和NODA-GA(tBu)3。然后肽被+
切离并通过HPLC纯化以提供产物。HRMS C61H92N18O18MH 计算1365.6909实测1365.6912.[0451] IMP 460的放射性标记

[0452] IMP 460(0.0020g)溶解于732μL，pH 4，0.1M NaOAc。18F如上所述被纯化，用冰乙酸中和并与Al溶液混合。然后添加20μL肽溶液，溶液在99℃加热25min。然后在18
HLB柱上纯化粗制产物。[Al F]标记的肽在1∶1EtOH/H2O柱洗脱液中。在
0.1％TFA缓冲液中反相HPLC图谱显示在预期位置标记肽的清晰的HPLC单峰(未显示)。

[0453] 实施例15.IMP 461和IMP 462 NOTA-结合肽的合成和标记

[0454] 最简单可能的NOTA配体(为了肽合成而被保护)被制备并结合入两个用于靶向的肽-IMP 461和IMP 462。

[0455] 二-叔丁基NOTA的合成(图6)

[0456] NO2AtBu(0.501g 1.4x10-3mol)溶解于5mL无水乙腈。苄基-2-溴乙酸酯-3
(0.222mL，1.4x10 mol)被添加至溶液，随后添加0.387g无水K2CO3。使反应在室温下搅拌过夜。反应混合物被过滤并浓缩以获得0.605g(86％收率)的苄基酯结合物。然后粗制产物溶解于50mL异丙醇，与0.2g 10％Pd/C(Ar下)混合并置于50psi H2持续3天。然后产-
物被过滤并真空下浓缩以获得0.462g期望的产物ESMS MH415。

[0457] IMP 461的合成

[0458] 肽在Sieber酰胺树脂上合成，使用以下述顺序添加的氨基酸和其他物质：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、
Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Ala-OH和Bis-叔丁基NOTA-OH。
然后肽被切离并通过HPLC纯化以提供产物IMP 461 ESMSMH+1294(NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。

[0459] IMP462的合成

[0460] 肽在Sieber酰胺树脂上合成，使用以下述顺序添加的氨基酸和其他物质：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 去除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、
Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc去除、Fmoc-D-Asp(But)-OH 和二- 叔丁基NOTA-OH。然后肽被切离并通过HPLC纯化以提供产物IMP 462 ESMSMH+1338(NOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。NOTA酯呗添加至肽合成仪上的肽。

[0461] 肽的18F标记(IMP461 & IMP462)

[0462] 肽被溶解于pH 4.13，0.5M NaOAc以制备0.05M肽溶液，其被贮存在冷藏器中直至TM需要时。F-18被接收在2mL水中并被捕获在 Light， ACCELL Plus
QMA柱上，该柱事先经5mL 0.4M KHCO3和随后5mL水洗液洗涤。柱用5mL DI水洗涤以从
18 18
F去除不期望的污染物。 F然后用200μL小份0.4M KHCO3从柱上被洗脱，大部分活度在第二个小份中。通过在添加活度之前添加10μL冰乙酸至管形瓶而将小份的碳酸氢盐中和
18
至～pH 4。100μL小份的纯化 F溶液被去除并与3μL pH 4，0.1M NaOAc中的2mM Al混合。10μL(0.05M)被添加，并且溶液在～100℃被加热15min。粗制反应混合物用700μL DI水稀释并放在HLB柱上，然后通过柱将液体抽入废管形瓶中。反应管形瓶用额外1mL DI水冲洗并通过HLB柱(真空下)。HLB柱用额外2x1mL部分的DI水洗涤。将柱移至空管形
18
瓶并用2x100μL 1∶1 EtOH/H2O洗脱以获得纯化的 F-标记的肽。

[0463] 实施例16.IMP467的制备和18F标记

[0464] 合成

[0465] IMP 467 C-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2，MW 1528.7

[0466] 四叔丁基C-NETA-琥珀酰根据图4被产生。叔丁基{4-[2-(二-(叔丁氧基羰基)甲基-3-(4-硝基苯基)丙基]-7-叔丁氧基羰基[1，4，7]三氮杂壬-1-基}如Chong
等(J.Med.Chem.2008，51：118-125)所述制备。更普遍的合成方案显示于图5。配体3通过高效液相色谱(HPLC)纯化，使用配有 Prep C18反相柱(30x150mm，5μm)的
PrepLC 4000系统。使用经50min以45mL/min流速的100％A(0.1％TFA)至
100％B(90％乙腈，10％水，0.1％TFA)的线性梯度实现色谱分离，在220nm检测吸光度。

[0467] 肽IMP 467 C-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1527.87在Sieber酰胺树脂上制备，通过以所示顺序向树脂添加下述氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被切除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc被切除、{4-[二-(叔丁氧基羰基甲基)氨基)-3-(4-琥珀酰氨基苯基)丙基]-7-叔丁氧基羰基甲基[1，4，7]三氮杂壬-1-基}乙酸叔丁酯3。然后肽从树脂被切离并通过RP-HPLC纯化以产生6.3mg IMP 467。还获得了分子量为1034.84且保留时间8.470min的约30.6mg产物(TFA酰胺)。

[0468] 粗制肽通过高效液相色谱(HPLC)被纯化，使用C18柱。使用经80min以45mL/min流速的100％A(0.1％TFA)至80％ A：20％B(90％乙腈，10％水，0.1％TFA)的线性梯度实现色谱分离，在220nm检测吸光度。

[0469] 放射性标记

[0470] 2mM的IMP 467溶液在pH 4，0.1M NaOAc中制备。18F、139mCi被接收在2mL于注TM射器中。活度通过 ACCELL 加 Light QMA柱被洗脱并用5mL水洗
18
涤以除去任何金属离子污染物。然后用1mL 0.4MKHCO3以下述级分洗脱 F：

[0471] 表14.从 QMA的18F洗脱级分

[0472]级分体积μL 活度mCi
1 200 19.7
2 50 38.0
3 50 31.5
4 50 15.1
5 50 6.81
6 200 8.67
7 400 2.69

[0473] 标记的IMP 467通过HLB RP-HPLC分析被纯化，根据0325段。RP-HPLC显示两个18
洗脱峰(未显示)，认为其是Al F IMP 467的非对映体。支持该假设，当IMP 467在37℃孵育时，两个HLB峰之间似乎存在一些互变(未显示)。在如下讨论的预靶向技术中，因为
18 18
Al F-螯合剂复合物不是抗体结合的半抗原位点，非对映体的存在似乎不影响 F-标记的肽对患病组织的靶向。

[0474] 放射性标记肽的收率对比

[0475] 在试图提高标记收率而同时保持体内稳定性时，合成了预靶向肽的三个新的NOTA衍生物(IMP 460、IMP 461和IMP 467)。这些中，IMP 467是其他肽标记收率的近二倍(表15)。表15中所有的标记研究以相同摩尔数的肽和铝进行。表15所示的结果代表每个肽的示例性标记实验。

[0476] 为了产生表15的数据，三毫升2mM Al3+储液被添加至60μL18F(44MBq)，随后添加在10μL pH 4.1，0.5M NaOAc中的0.05M肽溶液。四种反应混合物被配制并放入103℃加热器持续19min。反应混合物如0325段所述通过HLB柱纯化以确定放射性化学反应收率。

[0477] 当仅使用40nmol(比IMP 449少～13倍)、1.3GBq(35mCi)18F时，IMP 467的18F-标18
记收率为～70％，表明该配体提高了Al F复合物的结合性质。通过增强配体结合的动力学，相对于IMP 449(520nmol，44％收率)，收率被明显提高(平均65-75％收率)，而使用较少摩尔的IMP 467(40nmol)。

[0478] 表15.含有不同NOTA的肽的收率对比

[0479]肽收率
IMP 449 44％
IMP 460 5.8％
IMP 461 31％
IMP 467 87％
18

[0480] 实施例17.使用 F-标记的IMP 467在携带LS174T肿瘤的裸小鼠中的预靶向生物分布18

[0481] 以0328段所述相同方式制备的 F-标记的IMP 467肽被稀释用于注射入携带18
LS174T肿瘤的裸小鼠。Al F-IMP 467被制备并注射入裸小鼠，该小鼠在1.5h后被解剖。表
18
16和17对比了 F-标记的IMP 467的生物分布，使用TF2预靶向方案(表16)，与单独肽
18 18
相比较(表17)。如表17所示，与IMP 449类似，肽从血液和机体快速清除。与 F或Al F
18
相比在骨中的低吸收说明Al F螯合剂的稳定性及其适合预靶向。与IMP 449一样，使用TF2双特异性抗体和标记IMP467的预靶向分布主要限于肿瘤和肾，对骨或其他正常组织具
18
有非常少的分布。 F-标记的IMP 467的成像研究报告如下。数据表明AlF-18 IMP 467在体内是稳定的，并且肽靶向肿瘤表面的抗体。

[0482] 表16.携带LS174T肿瘤的裸小鼠中TF2预靶向的生物分布：

[0483]

[0484] 表17.携带LS174T肿瘤的裸小鼠中单独肽的生物分布：

[0485]

[0486]

[0487] 实施例18.影响IMP 467标记的收率和稳定性的因素

[0488] 肽浓度

[0489] 为了检查各种肽浓度对收率的影响，在恒定体积(63μL)中测定了Al18F与肽结合的量，使用恒定量的Al3+(6nmol)和18F，但是添加的肽量不同。将3毫升2mM Al3+储液添加至40μL18F(24MBq)，随后分别添加5、10、15或20μL 0.1mMpH 4.1乙酸盐缓冲液中2mM IMP467和15、10、5或0μL水。反应溶液被加热至99℃持续15min，然后如上所述通过HLB柱纯化以确定分离的放射性化学收率。标记的肽IMP 467的收率随如下递减的肽浓度而下降：
40nmol肽(82％收率)；30nmol(79％收率)；20nmol(75％收率)；10nmol(49％收率)。因此，在20至40nmol之间改变肽量对IMP 467收率影响很小。然而，在标记混合物中10nmol肽开始观察到下降的收率。

[0490] 铝浓度

[0491] 当IMP 467在递增量的Al3+(0、5、10、15、20μL pH 4乙酸盐缓冲液中2mMAl，并保持总体积恒定)存在下被标记时，分别达到3.5％、80％、77％、78％和74％的收率。这些结果表明，(a)在Al3+缺乏下，18F对该肽的非特异性结合最小，(b)10nmol Al3+足以实现最大的18F-结合，并且(c)更高量的Al3+不显著减少结合，表明在该肽浓度下足够的螯合能力。

[0492] Al18F IMP 467放射性标记的动力学

[0493] 将3毫升2mM Al3+储液与40μL18F混合，随后添加20μL 0.1mM pH 4乙酸盐缓冲液中2mM IMP 467。四种反应溶液被配制并放入107℃加热器持续5、10、15和30min。粗制产物分别在Waters HLB 1cc(30mg)Flangeless柱上纯化。简言之，向反应溶液添加200μL水，其然后通过移液管被移出并加至HLB柱。反应溶液被吸入柱中。反应容器用1mL水冲洗，其然后被转移并吸入柱中。柱用2x200μL部分的1∶1 EtOH/H2O洗脱，产物被分离在含有15mg抗坏血酸的3-mL管形瓶中，所述抗坏血酸被调节至pH 6并事先被冻干。通过测量留在反应容器中、保留在HLB柱上、水洗液中和1∶1 EtOH/H2O中的活度来确定收率。1∶1 EtOH/H2O级分中的活度量除以来自其他级分的总活度，得出分离的放射性化学
18
收率。然后通过RP-HPLC分析放射性标记的肽，其显示未结合的 F在所有情况下被去除。

[0494] 动力学研究显示，结合在107℃5min内完成(5min，68％；10min，61％；15min，71％；和30min，75％)，而反应时间长达30min时分离的收率仅适度增加。

[0495] 50℃下进行的IMP 467的放射性标记反应显示，在较低温度下未实现结合。

[0496] IMP 467的高剂量放射性标记

[0497] 将5毫升2mM Al3+储液与50μL18F 1.3GBq(35mCi)混合，随后添加20μL0.1mM pH 4.1乙酸盐缓冲液中2mM IMP 467。反应溶液被加热至104℃持续15min，然后如上所述在HLB柱上纯化(～10min)，以69％放射性化学收率分离0.68GBq(18.4mCi)纯化肽，比活度为17GBq/μmol(460Ci/mmol)。反应时间为15min并且纯化时间为12min。反应18 18
在1.3GBq(35mCi) F被纯化之后10min开始，所有从分离 F到纯化的终产物的总时间是
37min，未校正衰减的收率是52％。

[0498] 人血清稳定性测试

[0499] 小份的HLB纯化肽(～30μL)用200μL人血清(之前被冷冻)稀释并放入37℃HPLC样品室中。在不同时间点取出小份并通过HPLC分析。HPLC分析显示，血清中
18 18
F-标记的肽在37℃至少5小时非常高的稳定性(未显示)。 F-标记的肽在血清中孵育
5小时后没有可检测的分解(未显示)。

[0500] IMP 461和IMP 462配体具有可用于结合铝的两个羧基，而IMP 467中的NOTA配体具有四个羧基。血清稳定性研究显示，与IMP 467的复合物在模拟体内使用的条件下在18
血清中是稳定的。而且，对标记IMP 467的体内生物分布研究显示，F-Al标记肽在实际的体内条件下是稳定的。

[0501] 肽可以通过形成Al18F复合物用18F快速(30min)且高收率地标记，Al18F复合物18
可以结合至肽上的NOTA配体，比活度为至少17GBq/μmol，无需HPLC纯化。Al F NOTA-肽在血清中和体内是稳定的。NOTA配体的修饰可以导致收率和比活度的提高，而依然保持
18
Al F-NOTA复合物的期望的体内稳定性，并在肽的肾清除中与亲水接头助剂连接。而且，该
18 18
方法避免了用 F标记肽所常用的离心干燥步骤。如下实施例所示，该新的 F-标记方法适用于标记范围广泛的靶向肽。

[0502] 实施例19.IMP 470的合成和标记

[0503] IMP 467的结果促使我们评估C-NETA的一个更容易可及的双功能形式(图8)。四叔丁基L-NETA 7的合成途径(示于图7)开始于使用TFA对1进行Boc脱保护，随后用溴乙酸叔丁酯对2进行双烷基化以产生醇3。3与PPh3/NBS反应产生溴化物4。CH3CN中双取代的TACN 5与4使用K2CO3偶联，提供大环6。使用Pd/C氢化，叔丁基保护的L-NETA 7通过2-Cl-Z脱保护以近定量的收率获得。

[0504] 该7的游离胺可以被进一步转化为异硫氰酸酯、马来酰亚胺、溴代乙酰基或琥珀酰，使其成为适合结合至肿瘤靶向肽或抗体或多种其他潜在靶向部分的基团。

[0505] IMP 470 L-NETA-琥珀酰-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 MH+1494.68[0506] 肽IMP 470在Sieber酰胺树脂上制备，通过以所示顺序将下述氨基酸添加至树脂：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、Aloc 被切除、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH。去除Aloc之后获得的游离胺与琥珀酸酐反应以在N末端产生羧酸基团，羧酸基团使用DMF中的DIC活化并随后与叔丁基保护的L-NETA 7偶联。
肽然后从树脂被切除并通过RP-HPLC纯化以产生16.4mg IMP 470。还获得了对应于肽的分子量为1037.15的产物，无L-NETA且保留时间为9.001min。

[0507] 为了RP-HPLC分析，配有 GEMINITM C18反相柱(4.6x250mm)的 2695HPLC系统，使用经30min以1mL/min流速的100％A(0.1％TFA)至
100％B(90％乙腈，10％水，0.1％TFA)的线性梯度，在220nm检测吸光度。放射性通过PERKIN 610TR Radiomatic Flow ScintillationAnalyzer测量。

[0508] 为了制备IMP 470 的 2mM 溶液，2.5mg(1.67μmol)IMP 470(F.W.1494.68)GG23-116-13溶解于836μL 0.1M NaOAc，pH 4.02。

[0509] 为了18F标记，向3μL 2mM AlCl3溶液添加40μL F-18溶液[1.736mCi的18F]，随后添加20μL(40nmol)2mM IMP 470溶液，并加热至101℃持续15分钟。反相HPLC分析显示在26.10％(RT 8.90min)和47.29％(RT 9.30min)的两个放射性标记的肽峰，并且26.61％的活度以柱的死体积洗脱(2.70min)(未显示)。

[0510] 表18.[Al18F]IMP 470

[0511]

[0512] 通过将反应溶液转移至1cc HLB柱并用水洗脱以除去未结合的18F，随18
后通过EtOH/H2O洗脱 F-标记的肽，纯化了粗制标记的肽。粗制反应溶液穿过HLB柱进入
5mL管形瓶，柱用3x1mL水级分洗涤(365μCi)。然后HLB柱被放在新的3mL管形瓶上并用
2×200μL 1∶1 EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(790μCi)。反应容器保留11.93μCi，而柱保留33.2μCi的活度。收集的790μCi代表标记肽65.83％的回收率。

[0513] 小份的HLB纯化的18F-标记的肽通过RP-HPLC分析。两种产物被检测-8.90min18
44.93％，9.20min 55.07％( F在死体积中未被检测)。

[0514] 表19.HLB纯化的AlF-18 IMP 470

[0515]

[0516]

[0517] 18F-标记的IMP 470在37℃的血清稳定性：

[0518] 6μL HLB柱纯化的18F-标记的肽与100μL人类血清混合，样品在整个RP-HPLC分析期间保持在37℃。

[0519] 表20.AlF-18IMP470的血清稳定性，t＝0

[0520]

[0521] 表21.AlF-18IMP470的血清稳定性，t＝4小时37℃

[0522]

[0523] 表22.AlF-18IMP470的血清稳定性，t＝4小时37℃

[0524]

[0525] 表23.AlF-18IMP 470的血清稳定性概述

[0526]孵育时间/R.T. 8.90min 9.30min
0 36.33％ 63.67％
1h 22.97％ 77.03％
4h 21.07％ 78.93％

[0527]

[0528] 总之，含有与具有大环NOTA和相邻双(羧甲基)胺的双功能配体L-NETA连接的18 18
肽(IMP 470)的HSG用Al F成功标记。使用40nmol IMP 470的 F结合是65.83％，HLB
柱纯化的肽在37℃下人类血清中稳定4h。在相似的标记条件下，40nmol IMP 467的放射性化学收率是75.34％。

[0529] 实施例20.IMP469的合成

[0530] 已经使用图9所示合成方案制备了S-NETA结合的靶向肽IMP 469。合成途径开始于1与溴乙酸叔丁酯的双烷基化以产生醇2。2与PPh3/NBS反应生成溴化物3。CH3CN中双取代的TACN 4与3使用DIEA偶联，提供大环5。使用Pd/C氢化，叔丁基保护的S-NETA 6通过苄基脱保护以近定量的收率获得。

[0531] (t-BuO-CO-CH2)2-Ser-OBzl：

[0532] 在0℃，经2h，向4.7945g(20.70)H-Ser-OBzl.HCl在DMF(100mL)中的溶液逐滴添加二异丙基乙胺(50mL)和溴乙酸叔丁酯(9mL，90.90mmol)。得到的混合物在0℃下搅拌2h，并在室温搅拌4天。蒸发溶剂，粗品溶解于EtOAc。EtOAc提取物用ABS pH 5.3，NaHCO3溶液、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以提供8.962g黄色油。

[0533] (t-BuO-CO-CH2)2-β-溴-Ala-OBzl：

[0534] 在0℃向6.493g(15.33mmol)(t-BuO-CO-CH2)-Ser-OBzl在无水CH2Cl2(100mL)中的溶液经1h分小份添加三苯基膦(4.0319g，15.37mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(2.7694g，15.56mmol)。反应混合物在0℃搅拌30min，并在室温搅拌3h。溶剂被蒸发，使用柱色谱(硅胶，230-400目)纯化棕色油，使用10％EtOAc的己烷溶液洗脱以提供4.778g棕色油。

[0535] (t-BuO-CO-CH2)2-α(NOTA)-OBzl：

[0536] 向85.8mg(0.240mmol)NO2AtBu的CH3CN(3mL)溶液添加100μL二异丙基乙胺和2
154mg(0.317mmol)(t-BuO-CO-CH2)-β-溴-Ala-OBzl，得到的溶液在室温搅拌。31h后，蒸发溶剂，通过制备型RP-HPLC纯化粗品以产生167.8mg期望产物。

[0537] t-BuO-CO-CH2)2-α(NOTA)：

[0538] 向167.9mg(0.220mmol)(t-BuO-CO-CH2)-α(NOTA)-OBzl 在2- 内醇 (50mL) 中的溶液添加10％Pd/C催化剂(146.8mg)。得到的溶液通过在Parr加氢装置中室温下用H2(g)在50psi下搅拌5h而氢解。反应混合物经硅藻土过滤，滤液被浓缩以产生黑棕色油(115.4mg)。

[0539] 实施例21.替代的NOTA衍生物螯合部分

[0540] IMP 467含有与Chong等(2002，J Med Chem 45：3458-64；2008a，J Med Chem51：118-25；2008b，J Med Chem 51：2208-15)中公开的类似的NOTA衍生物螯合部分，其具有从氮引出的亚氨基二乙酸基团(图11A)。因为IMP 467似乎表现出与上述检查的其他肽相比
18 18
改善的对Al F的结合动力学，其他NOTA衍生物被合成并检查其Al F结合性质。检查了多个亚氨基二乙酸基团或替代位置的亚氨基二乙酸基团的存在(图11B)。示例性衍生物示于图12，含有一个从氮引出的亚氨基二乙酸基团(图12A)，两个亚氨基二乙酸基团-一个从氮引出，一个连接至碳(图12B)，以及两个从碳引出的亚氨基二乙酸基团(图12C)。当基团从碳引出时，可以使用氨基酸的D形式或L形式来调整以使基团相对彼此是顺式或反式。此外，用于连接NOTA于肽的羧基可以被本领域已知的其他连接剂替代。连接剂可以按所示通过氮连接(图11B)，或者像IMP 449通过NOTA上的碳原子连接。其他结合增强基团(非亚氨基二乙酸)可以被连接至配体以改善金属-氟化物复合物的结合或增强氟化物与已经在配体中的金属结合。配体的其他金属结合增强基团的一些实例已经由以下公开：
Kimura等(1987，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1712-14；1986，Pure & Appl.Chem.58(11)，
1461-66；1990，Inorg.Chem.29，4991-96；1987，J.Am.Chem.Soc.109，5528-29；1984，Inorg.Chem.23，4181-88；1989，Pure & Appl.Chem.61(5)，823-8。

[0541] 实施例22.通过将18F添加至与铝预孵育的肽来标记

[0542] 含有与铝复合的大环NOTA连接的肽(IMP 465，NOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D18
-Lys(HSG)-NH2)的HSG用F-18成功标记。使用40nmol IMP 465的 F结合是13.20％。如上所述制备中间体肽IMP 461。然后25.7mg IMP 461溶解于2mL DI水，向其中添加10.2mg AlCl3.3H2O，得到的溶液被加热至100℃持续1h。粗制反应混合物通过RP-HPLC纯化以产生
19.6mg IMP 465。RP-HPLC分析如上所述进行。

[0543] 为了制备 IMP 465，1.5mg(1.14μmol)的2mM溶液，IMP 465(F.W.1318.44)GG23-026-8溶解于569μL 0.1M NaOAc，pH 4.18。

[0544] 为了18F标记，50μL18F溶液[0.702mCi18F]和20μL(40nmol)2mM IMP 465溶液被加热至101℃持续17分钟。反相HPLC分析显示15.38％(RT约8.60min)的活度连接至肽并且84.62％的活度在柱死体积洗脱(2.60min)。

[0545] 表24.[Al18F]IMP 465

[0546]

[0547] 通过将反应溶液转移入1cc水HLB柱并用水洗脱以除去未结合的18F随后通过18
1∶1 EtOH/H2O洗脱 F-标记的肽，制备了粗制标记肽(377μCi)。粗制反应溶液通过HLB柱进入5mL管形瓶，柱用3x1mL部分水洗涤(284μCi)。然后将HLB柱放在新的3mL管形瓶上，并用2x200μL 1∶1 EtOH/H2O洗脱以收集标记的肽(44.4μCi，13.2％标记的肽)。
在进行所有洗脱之后，反应容器保留4.54μCi活度，而柱保留3.39μCi活度。

[0548] 在单独实验中，18F-标记的肽的百分比收率可以通过改变添加的肽的量而被提高。18
在该实验中，反应全部用相同量的 F以63μL总体积进行。IMP 465观察到的百分比收率在10nmol肽时是0.27％，在20nmol肽时是1.8％，并且在40nmol肽时是49％。

[0549] IMP 467显示当肽在暴露于18F之前与铝预孵育时，收率比IMP 461更高。IMP 467在室温下与铝孵育，然后冷冻并冻干。添加用于预孵育的铝的量是变化的。

[0550] 表25.添加18F之前与铝预孵育的IMP 467的标记

[0551] 预混合、冷冻和冻干的IMP 467+Al 分离的标记收率

[0552] 40nmol IMP 467+10nmol Al预混合 82％

[0553] 40nmol IMP 467+20nmol Al预混合* 64％

[0554] 40nmol IMP 467+30nmol Al预混合 74％

[0555] 40nmol IMP 467+6nmol Al正常标记(首先混合Al+18F) 77％

[0556] 收率与当通过添加Al18F复合物标记IMP 467而获得的那些相当。因此，通过向铝18 18 18
已经结合至螯合部分的肽添加 F的 F标记是在添加螯合部分之前预孵育金属与 F的可行的替代方法。

[0557] 实施例23.IMP 468铃蟾肽的合成与标记

[0558] 如上所讨论，18F标记的靶向部分不限于抗体或抗体片段，而是可以包括特异性或18 18
选择性结合至与可通过 F PET成像的疾病或其他病症相关的或诊断可通过 F PET成像的疾病或其他病症的细胞靶的任何分子。铃蟾肽是与神经调节肽B和胃泌素释放肽以及诸如肺癌和胃癌的癌症以及成神经细胞瘤的肿瘤标志物同源的14氨基酸肽。IMP 468(NOTA-NH-(CH2)7CO-Gln-Trp-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2；SEQ IDNO：20)作为铃蟾肽类
18
似物被合成并用 F标记以靶向胃泌素释放肽受体。

[0559] 肽通过基于Fmoc的固相肽合成在Sieber酰胺树脂上合成，使用文献(Prasanphanich等，2007，PNAS USA 104：12463-467)报道的合成方案的变体形式。合成的不同在于，二叔丁基NOTA配体在树脂上肽合成过程中添加至肽。相反，Prasanphanich的
2007报告说明：肽首先被制备，然后结合至水溶液中的未保护的NOTA。

[0560] IMP 468(0.0139g，1.02x10-5mol)溶解于203μL 0.5M pH 4.13 NaOAc缓冲液。肽溶解但静置形成凝胶，因此肽凝胶用609μL 0.5M pH 4.13 NaOAc缓冲液和406μL乙醇稀-3 18 18释以产生8.35x10 M肽溶液。 F在OMA柱上纯化并用0.4M KHCO3以200μL级分洗脱。 F
18
碳酸氢钠级分的每一个用10μL冰乙酸中和。纯化的 F(40μL，1.13mCi)与3μL pH 4，-7 18
0.1M NaOAc缓冲液中2mM AlCl3的混合。IMP 468(59.2μL，4.94x10 mol)被添加至Al F溶液并放入108℃加热器持续15min。粗制产物用水稀释并放在 30mg，1cc注
射器筒，HLB柱上。溶液被洗脱入真空下的卷边密封管形瓶。反应管形瓶用1mL水冲洗，然后被添加至HLB柱。然后，柱用3x1mL水冲洗。柱被移至空的管形瓶并用2x200μL 1∶1
18
EtOH/H2O洗脱以获得纯化的 F-标记的肽(34％收率)。

[0561] 表26.HLB纯化后的[Al18F]IMP 468

[0562]

[0563]

[0564] 总计面积：21465.5CPM

[0565] 平均背景：59.0CPM

[0566] 未分配面积：-16179.1CPM

[0567] 为了体内靶向研究，标记肽可以通过HPLC纯化以通过从[Al18F]标记肽分离过量冷肽来提高比活度。

[0568] 冷[Al19F]标记肽还被制备用于受体结合竞争研究。0.02M AlCl3溶液-5
(604μL，1.208x10 mol，于0.5M NaOAc中，pH 4) 与130μL0.5M NaOAc pH 4中 0.1M -5 19 -5
NaF(1.30x10 mol)混合。Al F溶液在室温下孵育12min，然后添加至0.0165g，1.21x10 mol IMP 468。溶液在103℃加热器加热16min。粗制产物的分析型HPLC显示两个主要产物，+ 19
一个0.0034g在13.8min(Al-IMP 468MH1391)，另一个0.0060g在14.8min([Al F]IMP +
468MH1411，数据未显示)。

[0569] 实施例24.使用18F标记的铃蟾肽成像肿瘤

[0570] 如上所述制备NOTA-结合的铃蟾肽衍生物(IMP 468)。我们开始测试其阻断放射性标记铃蟾肽与PC-3细胞结合的能力，如Prasanphanich等(PNAS104：12462-12467，2007)所进行的。我们的初始实验是确定IMP 468是否能够特异性阻断铃蟾肽与PC-3细
6
胞结合。我们使用IMP 333作为非特异性对照。在该实验中，3x10 PC-3细胞暴露于恒定
125
量(～50,000cpm)的 I-铃蟾肽(Perkin-Elmer)，向其中添加递增量的IMP 468或IMP
333。56至0.44nM的范围被用作我们的抑制浓度。

[0571] 结果显示，我们可以用IMP 468阻断125I-BBN的结合，但是用对照肽(IMP333)不能(未显示)，因此说明了IMP 468的特异性。Prasanphanich指示其肽的IC50为3.2nM，这比用IMP 468所发现的(21.5nM)低大约7倍。

[0572] 该实验使用可商业途径获得的BBN肽重复。我们增加了抑制肽的量至250至2nM125
的范围以阻断 I-BBN与PC-3细胞的结合。我们发现IMP 468和BBN阳性对照非常类似的IC50值，IC50值(35.9nM)比之前报道的(3.2nM)高，但是接近BBN对照所达到的(24.4nM)。

[0573] 为了检查体内靶向，在携带scPC3前列腺癌异种移植物的雄性裸小鼠中检查18
了Al F IMP 468的分布；单独与用铃蟾肽阻断。为了放射性标记，氯化铝(10μL，2mM)，
18
51.9mCi F(来自QMA cartridge)、乙酸和60μL IMP 468(8.45mM于乙醇/NaOAc中)
在100℃加热15min。反应混合物在反相HPLC上纯化，每0.25min收集级分。级分40和
41(3.56，1.91mci)被收集并加至HLB柱以溶剂交换。产物以800μL(3.98mCi)被洗脱，
910μCi保留在柱上。饱和NaCl中展开的ITLC显示0.1％未结合的活度。

[0574] 一组6只携带肿瘤的小鼠被注射[Al18F]IMP 468(167μCi，～9x10-10mol)并在18 -8
1.5h后解剖。另一组6只小鼠在施用[Al F]IMP 468之前18min用100μg(6.2x10 mol)
18
铃蟾肽iv注射。第二组也在注射后1.5h被解剖。数据显示[Al F]IMP 468对肿瘤的特异
18
性预靶向(图10)。当铃蟾肽在[Al F]IMP 468之前18min给予时，肽的肿瘤吸收被减少
18
(图10)。生物分布数据指示[Al F]IMP 468至少1.5h得体内稳定性。单独肽组中动物#1显示略微提高的脊骨和肌肉吸收，可能是由于污染。铃蟾肽阻断组中动物#2显示与该组中其他小鼠相比在几种组织中更高的肽吸收。

[0575] 表27.单独[Al18F]IMP 468(167μCi，～9x10-10mol)，注射后1.5h的％ID/g：

[0576]18

[0577] 较大肿瘤显示[Al F]IMP 468的较高吸收，可能由于大肿瘤中较高的受体表达。-8 18

[0578] 表28.铃蟾肽(100μg，6.2x10 mol)→18min→[Al F]IMP 468(167μCi，～-109x10 mol)，注射后1.5h的％ID/g

[0579]组织平均值 SD 动物1 动物2 动物3 动物4 动物5 动物6
肿瘤 1.053 0200 0.842 0.998 1.220 1.296 1.147 0.814
肿瘤重量 0.479 0.160 0.275 0.284 0.508 0.577 0.607 0.623
肝 1.005 0.553 0.939 1.244 1.982 0.813 0.428 0.627
脾 0.187 0.101 0.354 0.086 0.226 0.085 0.164 0.207
肾 1.613 0.450 2.184 1.965 1.841 1.432 1.067 1.189
肺 0.114 0.035 0.125 0.084 0.149 0.083 0.086 0.159
血液 0.033 0.006 0.029 0.043 0.031 0.032 0.037 0.025
胃 0.413 0.223 0.356 0.736 0.387 0.617 0.159 0.225
小肠 13.890 3.024 16.266 12.387 11.312 18.805 13.249 11.321
大肠 1.359 2.452 0.556 0.352 0.264 0.235 6.359 0.388
肩胛骨 0.092 0.077 0.033 0.228 0.071 0.059 0.135 0.025
脊骨 0.208 0.187 0.296 0.551 0.073 0.086 0.153 0.089
肌肉 0.604 1.081 0.127 0.546 0.061 2.777 0.073 0.040
脑 0.063 0.111 0.019 0.291 0.012 0.018 0.023 0.019
体重 29.36 1.45 29.72 31.85 29.02 27.38 29.09 29.08

[0580] 上述生物分布数据显示在与Prasanphanich等报道的有关用68Ga标记的相同肽的18 18
相同范围内的[Al F]IMP 468肿瘤靶向。结果说明，F肽标记方法可用于体内靶向在肿瘤中未调节的受体，使用除了抗体以外的靶向分子。在这种情况下，IMP 468靶向利用天然存在的配体-受体相互作用。肿瘤靶向是显著的，P值为P＝0.0013。许多此类配体-受体
18
对是已知的，并且任何此类靶向相互作用可以形成使用本文描述的方法 F-成像的基础。

[0581] 实施例25.促生长素抑制素类似物IMP 466的合成和标记

[0582] 促生长素抑制素是用于成像促生长素抑制素受体蛋白分布的另一种非抗体靶向123
肽。 I-标记的奥曲肽是促生长素抑制素类似物，已经用于成像表达促生长素抑制素受体的肿瘤(例如，Kvols等，1993，Radiology 187：129-33；Leitha等，1993，J Nucl Med 34：
123
1397-1402)。然而， I还未广泛用于成像，因为其昂贵、短的物理半衰期和难以制备放射性
18
标记化合物。本文描述的 F-标记方法对于表达促生长素抑制素受体的肿瘤是优选的。

[0583] IMP 466 NOTA-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Throl MH+1305

[0584] NOTA-结合的衍生物促生长素抑制素类似物奥曲肽(IMP 466)通过如上述实施例所述的标准的基于Fmoc的固相肽合成来制备，产生线性肽。C末端Throl残基是苏氨酸醇(threoninol)。该肽通过用DMSO处理过夜而被环化。

[0585] 0.0073g，5.59x10-6mol肽溶于111.9μL 0.5M pH 4 NaOAc缓冲液以制备IMP 466的0.05M溶液。溶液随时间形成凝胶，因此，其通过添加更多的0.5MNaOAc缓冲液被稀释至0.0125M。

[0586] 18F用QMA柱纯化并浓缩以提供200μL在0.4M KHCO3中的18F。碳酸氢盐溶液18
用10μL冰乙酸中和。40μL小份中和的 F洗脱液与3μL 2mM AlCl3混合，随后添加
40μL 0.0125M IMP 466溶液。混合物在105℃加热17min。反应然后在Waters 1cc(30mg)
18
HLB柱上纯化，通过将反应溶液上样至柱并用水(3mL)洗掉未结合的 F，然后用2x200μL
1∶1EtOH水洗脱放射性标记的肽。HLB纯化后放射性标记的肽的收率是34.6％。放射性标记的肽含有两个放射计量峰，其具有与未标记IMP 466的保留时间接近的HPLC保留时间(未显示)。

[0587] 冷的Al19F肽被制备用于体外竞争分析。放射性标记的HPLC和冷Al19F肽都显示19
形成了两种Al F产物。这些可能是非对映体。

[0588] 冷Al19F溶液通过混合356μL 0.5M pH 4 NaOAc中的0.02M AlCl3(7.13x10-6mol)-6 19与71.3μL 0.5M pH 4 NaOAc中的0.1M，7.13x10 mol NaF来制备。Al F溶液然后与肽-6
IMP 466(0.0093g，7.13x10 mol)混合并在103℃加热17min。反应给出三个主要的HPLC峰，一个较短保留时间峰(13.5min)和两个较长保留时间峰(14.8min和14.9min)(未显示)。IMP 466的保留时间是14.7min。反应混合物通过C18反相HPLC纯化。较短的保留+
时间(13.5min)产物对应于肽+铝MH1329。

[0589] 较长的保留时间产物14.8和14.9min(0.0037g)对应于Al19F肽，MH+1349。两个18 19
Al F产物以放射计量痕量形成，其对应于冷肽的两个Al F产物。

[0590] 表29.HLB纯化的[Al18F]IMP 466

[0591]

[0592]

[0593] 实施例26.用18F-标记的IMP 466和68Ga-标记的IMP 466成像神经内分泌肿瘤[0594] 进行研究以对比使用18F-标记的促生长素抑制素类似物肽与68Ga-标记的促生长素抑制素类似物肽并直接靶向表达促生长素抑制素受体的肿瘤而获得的PET图像。

[0595] 方法

[0596] 18F标记-如上实施例所述，IMP 466被合成并18F-标记，除了改变IMP 466肽的18 68
量(100-500μg)。 F-标记的IMP 466的分布与 Ga-标记的IMP 466相对比。

[0597] 68Ga标记-使用0.1M超纯HCl(J.T.Baker，Deventer，The Netherlands)从基于68 68 68
TiO2的1,110MBq Ge/ Ga生成器(Cyclotron Co.Ltd.，Obninsk，Russia)洗脱的 GaCl3标记IMP 466。五个1mL级分被收集并且第二个级分的小份用于标记肽。IMP 466溶解于
68
1.0M HEPES缓冲液，pH 7.0。添加四体积 Ga洗脱液(120-240MBq)，混合物在95℃加热
68 3+ 68
20min。然后添加50mM EDTA至终浓度5mM以复合非结合的 Ga 。 Ga-标记的IMP 466在Oasis HLB柱上纯化并用50％乙醇洗脱。

[0598] HPLC分析-放射性标记的IMP 466肽通过RP-HPLC在Agilent 1200系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)上分析。以2mL/min的流速使用C18柱(Onyx monolithic，4.6x100mm，Phenomenex，Torrance，CA，USA)，使用下述缓冲液系统：缓冲液A：0.1％v/v TFA水溶液。缓冲液B：0.1％v/v TFA乙腈溶液。梯度：0-5min 97％缓冲液A，5-35min 80％缓冲液B至75％缓冲液A。使用串联的NaI放射检测器(Raytest GmbH，Straubenhardt，Germany)监测洗脱液的放射性。使用Gina-star软件(版本2.18，Raytest GmbH，Straubenhardt，Germany)分析洗脱谱。

[0599] 辛醇-水分配系数(log P辛醇/水)-为了确定放射性标记肽的亲油性，大约50,000dpm的放射性标记肽被稀释于0.5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)。添加等体积的辛醇以获得双相系统。涡旋系统2min后，通过离心(100xg，5min)分离两个层。从每层取三个100μL样品，在井型γ计数器(Wallac Wizard 3”，Perkin-Elmer，Waltham，MA)中测量放射性。

[0600] 稳定性-10μL18F-标记的IMP 466在500μL新鲜收集的人类血清中孵育并在37℃下孵育4h。添加乙腈，混合物被涡旋，随后以1000xg离心5min以沉淀血清蛋白。如上所述在RP-HPLC上分析上清液。

[0601] 细胞培养-AR42J鼠胰腺肿瘤细胞系在补充有4500mg/L D-葡萄糖、10％(v/v)胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)培养基(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)中培养。细胞在5％CO2加湿环境中37℃下培养。

[0602] IC50测定-测定IMP 466对在6孔板中DMEM培养基，4500mg/L D-葡萄糖，10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素中培养的AR42J细胞的50％抑制浓度(IC50)。细胞在37℃下在结合缓冲液(HEPES-缓冲的RPMI，含有1％BSA)中
111
孵育10min，以范围0.01-10nmol的终浓度添加未标记的IMP 466以及 In-DOTA-octreotate(50,000dpm/2ml)。为了防止内化，细胞在冰上孵育4h。细胞用结合缓冲液洗涤两次，细胞用棉塞收集并在γ-计数器中测定细胞相关活度。

[0603] 生物分布研究-雄性BALB/c裸小鼠(6-8周)用0.2mL AR42J细胞悬浮液(107细胞/mL)在右肋腹皮下注射。在肿瘤细胞孵育后大约两周，此时肿瘤直径为5-8mm，370kBq18 68
F-标记的IMP 466或 Ga-标记的IMP 466被静脉内施用(n＝5)。单独的组(n＝5)用
18
1,000倍摩尔过量的未标记IMP 466注射。一组三只动物被注射未螯合的[Al F]。所有小鼠在注射后2h通过CO2/O2窒息(p.i.)被杀死。收集目标器官、称重并在γ计数器中计数。计算每个组织的每克组织注射剂量(％ID/g)的百分比。动物实验由当地动物福利委员会批准并根据国家法规进行。

[0604] PET/CT成像-s.c.AR42J肿瘤的小鼠被静脉内注射10MBq Al18F-IMP 466或68
Ga-IMP 466。肽注射后1小时和2小时，小鼠在Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens
Preclinical Solutions，Knoxville，TN)上扫描，固有的空间分辨率为1.5mm(Visser等，JNM，2009)。动物以仰卧位置放入扫描仪中。经15分钟获得PET发射扫描，随后CT扫描用于解剖参考(空间分辨率113μm，80kV，500μA)。使用Inveon Acquisition Workplace软件版本1.2(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)重建扫描，使用有序集预期最大化-3D/最大验后(OSEM3D/MAP)算法，具有下述参数：矩阵256x256x159，像素大小
3
0.43x0.43x0.8mm 和先验MAP 0.5mm。

[0605] 统计分析-所有平均值被给出±标准偏差(S.D.)。使用Welch’s校正未配对t检验或单向方差分析进行统计分析，使用GraphPad InStat软件(版本4.00，GraphPad Software)。显著性水平设为p＜0.05。

[0606] 结果

[0607] 缓冲液的影响-考察了缓冲液对IMP 466标记效率的影响。IMP 466以10mg/mL(7.7mM)溶解于柠檬酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)或4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液。所有缓冲液的摩尔浓度是1M，pH是4.1。向
200μg(153nmol)IMP 466添加100μL Al-F-18(pH 4)并在100℃孵育15min。使用RP-HPLC确定放射性标记收率和比活度。当使用乙酸钠(MES或HEPES)时，放射性标记收率分别是
49％、44％和46％。柠檬酸钠存在时，没有观察到标记(＜1％)。当标记反应在乙酸钠缓冲液中进行时，制剂的比活度是10,000GBq/mmol，而在MES和HEPES缓冲液中分别获得
20,500和16,500GBq/mmol的比活度。

[0608] AlCl3浓度的影响-制备了AlCl3在乙酸钠中的三种储液pH 4.1：0.2、2.0和20mM。18 18
从这些溶液中，将3μL添加至200μL F以形成[Al F]。向这些样品中，添加153nmol肽并在100℃下孵育15min。以6nmol AlCl3的终浓度孵育后放射性标记收率是49％，。与
0.6nmol AlCl3和60nmol AlCl3孵育导致放射性标记收率显著下降：分别是10％和6％。

[0609] 肽量的影响-考察了肽量对标记效率的影响。IMP 466以7.7mM(10mg/mL)的浓18
度溶解于乙酸钠缓冲液pH 4.1，并且将38、153或363nmol IMP 466添加至200μL[Al F](581-603MBq)。放射性标记收率随递增的肽量而增加。在38nmol时放射性标记收率范围
4-8％，在153nmol时收率增加至42-49％，并且在最高浓度时放射性标记收率为48-52％。

[0610] 辛醇-水分配系数-为了确定18F和68Ga-标记的IMP 466的亲油性，测定了辛18 68
醇-水分配系数。Al F-IMP 466的log P辛醇/水值是-2.44±0.12，并且 Ga-IMP 466的log
18
P辛醇/水值是-3.79±0.07，表明 F-标记的IMP 466亲水性略低。

[0611] 稳定性-18F-标记的IMP 466不显示在人血清中37℃孵育4h后的18F释放，表明18
Al F-NOTA复合物的优良稳定性。

[0612] 生物分布研究-在具有s.c.AR42J肿瘤的BALB/c裸小鼠中研究注射后2h的18 68 18 18
Al F-IMP 466和 Ga-IMP 466两者的生物分布(图13)。Al F作为对照被包括。 F-IMP
466的肿瘤靶向高，在注射后2h累积28.3±5.7％ID/g。在过量未标记IMP 466存在下的吸收是8.6±0.7％ID/g，表明肿瘤吸收是受体介导的。血液水平非常低(0.10±0.07％ID/g，2h pi)，导致肿瘤-血液比为299±88。器官中的吸收低，在表达受体的器官(例如肾上
18 18
腺、胰腺和胃)中特异性吸收。Al F-IMP466的骨吸收与非螯合Al F相比可忽略不计(注
18
射后2h分别是0.33±0.07与36.9±5.0％ID/g)，表明 F-标记的NOTA-肽的良好体内稳
定性。

[0613] Al18F-IMP 466的生物分布与68Ga-IMP 466的生物分布相比较(图13)。68Ga-IMP18 68
466(29.2±0.5％ID/g，2h pi)的肿瘤吸收类似于Al F-IMP 466(p＜0.001)。 Ga-IMP
18
466的肺吸收比 F-IMP 466高两倍(分别是4.0±0.9％ID/g与1.9±0.4％ID/g)。此外，
68 18
Ga-IMP 466的肾保留比Al F-IMP 466略高(分别是16.2±2.86％ID/g与9.96±1.27％
ID/g)。

[0614] 合并的PET和CT扫描示于图14。PET扫描证实了生物分布数据。Al18F-IMP466和68
Ga-IMP 466显示在肿瘤中的高吸收和在肾中的保留。肾中的活度主要集中在肾皮质。再
18
次，Al F证明被NOTA螯合剂稳定螯合，因为没有观察到骨吸收。

[0615] 图14清楚显示，促生长素抑制素(奥曲肽)的18F-标记的类似物的分布模拟68
Ga-标记的促生长素抑制类似物的分布。这些结果是显著的，因为已经显示在具有神经内
68
分泌肿瘤的人受治疗者中的 Ga-标记的奥曲肽PET成像与常规促生长素抑制素受体闪烁扫描术和诊断CT相比具有显著更高的检出率，灵敏度97％，特异性92％和准确度96％(例
68
如，Gabriel等，2007，J Nucl Med 48：508-18)。据报道，Ga-标记的奥曲肽的PET成像优
111
于 In-标记的奥曲肽的SPECT分析，并对检测甚至小的脑膜瘤高度灵敏(Henze等，2001，
68 18 18
J Nucl Med 42：1053-56)。因为 Ga与 F相比具有更高的能量，预期基于 F的PET成像
68 18
将显示甚至比基于 Ga的PET成像更好的空间分辨率。这通过比较使用 F-标记的IMP
68
466(图14，左)与 Ga-标记的IMP 466(图14，右)获得的肾图像而在图14中说明。使
68 18
用 Ga获得的PET图像显示比用 F获得图像更发散的边缘和更低的分辨率。这些结果证
18
明了使用本文所述方法和组合物制备的 F-标记的靶向部分获得的优质图像，并证实了所
18
述 F标记技术用于非抗体靶向肽的实用性。

[0616] 实施例27.使用预靶向68Ga和18F PET成像的对比

[0617] 我们比较了使用如上所述制备的双特异性TF2抗体预靶向的68Ga-或18F-标记68 18
的肽获得的PET图像。 Ga(t1/2＝68分钟)和 F(t1/2＝110分钟)的半衰期符合放射性
68
标记肽的药物代谢动力学，因为其肿瘤中数小时内达到最大累积。而且，Ga可容易获自
68 68 18
Ge/ Ga生成器，而 F是在PET中最普遍使用和广泛可得的放射性核素。

[0618] 方法

[0619] 具有s.c.表达CEA的LS174T肿瘤的小鼠静脉内接收TF2(6.0nmol；0.94mg)和68 18
5MBq Ga-标记的IMP 288(0.25nmol)或 F-标记的IMP 449(0.25nmol)，双特异性抗体和放射性标记肽注射之间间隔16小时。注射放射性标记肽之后1小时或2小时，获得PET/CT图像并确定放射性标记肽的生物分布。LS174T肿瘤中的吸收与s.c.CEA-阴性SK-RC 52肿瘤中的吸收相比较。预靶向免疫PET成像与具有s.c.LS174T肿瘤和对侧感染大腿肌肉的
18
小鼠中的 F-FDG-PET成像相比较。

[0620] 预靶向-如上所述通过DNL方法制备双特异性TF2抗体。TF2是包含来自h679抗体的HSG结合Fab片段和两个来自hMN-14抗体的CEA结合Fab片段的三价双特异性抗体。在固定的LS174T细胞上Lindmo分析(Lindmo等，1984，J Immunol Methods 72：77-89)中测定的TF2结合CEA的免疫反应性分数为85％。DOTA结合的含有HSG的肽IMP 288如上所述被合成并纯化。如上所述被合成的IMP 449肽含有1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸
18
(NOTA)螯合部分以促进用 F标记。作为抗体组分的示踪剂，TF2通过iodogen方法(Fraker
125
和Speck，1978，Biochem Biophys Res Comm 80：849-57)用 I(Perkin Elmer，Waltham，
125
MA)标记TF2至比活度为58MBq/nmol。 I-标记的TF2通过用PBS，0.5％w/v牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemicals，St.Louis，MO，USA)在PD-10柱(GE HealthcareBio-sciences AB，Uppsala，Sweden)上洗脱反应混合物来纯化。

[0621] IMP 288的标记-在严格的无金属条件下以32MBq/nmol的比活度用111 111
In(Covidien，Petten，The Netherlands)标记IMP 288，用于生物分布研究。将11MBq In添加至溶解于无金属管形瓶中0.25M乙酸铵(NH4Ac)缓冲液，pH 5.6中的12μg IMP 288之后，混合物在95℃下在加热器中孵育20min。随后，添加10μL50mM四乙酸乙二胺(EDTA)以
111 68 68
复合游离 In。用使用0.1M超纯HCl从基于TiO的1,110MBq Ge/ Ga生成器(Cyclotron
68
Co.Ltd.，Obninsk Russia)洗脱的 Ga标记IMP 288。五个1ml级分被收集，第二个级分被用于标记肽。一个体积的1.0M HEPES缓冲液，pH 7.0被添加至3.4nmol IMP 288。添加五
68
个体积的 Ga洗脱液(380MBq)，混合物被加热至95℃持续20min。然后添加50mMEDTA至终
68 3+ 68
浓度为5mM以复合非螯合的 Ga 。Ga-标记的IMP 288肽在1-mLOasis HLB-柱(Waters，
68
Milford，MA)上纯化。在用水洗涤柱后，肽用25％乙醇洗脱。用 Ga标记IMP 288的程序在45分钟内进行，制剂准备用于体内应用。

[0622] IMP 449的标记-IMP 449如上所述用18F标记。555-740MBq 18F(B.V.Cyclotron VU，Amsterdam，The Netherlands)用0.4M KHCO3从QMA柱洗脱。四个200-μL级分被收集在含有3μL 0.1M乙酸钠缓冲液，pH 4中2mM AlCl3的管形瓶内。使用具有最高活度的级18
分。Al F活度被添加至含有肽(230μg)和抗坏血酸(10mg)的管形瓶。混合物在100℃孵育15min。反应混合物在PhenomenexOnyx monolithic C18柱(Torrance，CA，USA)上通过RP-HPLC纯化，用30min内97％A至100％B(缓冲液A：0.1％TFA水溶液；缓冲液B：0.1％TFA乙腈溶液，流速：3mL/min)的线性梯度洗脱。在添加一体积水之后，肽在1-mL Oasis
18
HLB柱上纯化。在用水洗涤之后，放射性标记的肽用50％乙醇洗脱。 F-IMP 449在60分钟内制备，制剂准备用于体内应用。

[0623] 放射性标记制剂的质量控制-放射化学纯度使用快速薄层色谱(ITLC)在硅胶条(Pall Life Sciences，Ann Arbor，MI)上测定，使用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH6.0作为流动相。放射性标记肽的胶体含量通过ITLC-SG来测定，使用0.15MNH4Ac，pH
111 68 18
5.5∶MeOH的1∶1v/v溶液作为流动相。 In-IMP 288、Ga-IMP 288和 F-IMP 449通
过RP-HPLC(Agilent 1100 series，Agilent Technologies，PaloAlto，CA)在RP C18柱(Alltima，5μm，4.6x250mm，Alltech，Deerfield，IL，USA)上分析。柱用97％A和3％至
100％B经15分钟的线性梯度以1.0ml/min的流速洗脱，缓冲液A：0.1％TFA水溶液，缓冲
125 111 18
液B：0.1％TFA乙腈溶液。研究中使用的 I-TF2、In-和68Ga-IMP 288和Al F-IMP 449的放射化学纯度经常超过95％。

[0624] 动物实验-实验在体重20-25克的雄性BALB/c裸小鼠(6-8周龄)中进行。小鼠6
接收了用0.2mL的1x10LS174T细胞悬浮液的皮下注射，LS174T细胞是一种表达CEA的人类结肠癌细胞系(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA)。当肿瘤达到约0.1-0.3g的尺寸时(肿瘤接种后10-14天)，开始研究。

[0625] TF2和IMP 288注射之间的间隔是16小时，因为该时段足以从循环中清除未结合125 111 68
的TF2。在一些研究中， I-TF2(0.4MBq)与未标记的TF2共注射。IMP 288用 In或 Ga
18 68
标记。IMP 449用 F标记。小鼠静脉内接收TF2和IMP 288(0.2mL)。 Ga-标记的肽注射
18
后1小时和 F-IMP 449注射后2小时，小鼠通过CO2/O2安乐死，并且通过心脏穿刺获得血液并解剖组织。

[0626] 使用Inveon动物PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN)获得PET图像，固有空间分辨率为1.5mm(16)。动物以仰卧姿势放入扫描仪。获取15分钟的PET发射扫描，之前通过CT扫描用于解剖参考(空间分辨率113μm，80kV，500μA，暴露时间300msec)。扫描使用Inveon AcquisitionWorkplace软件(版本1.2，Siemens Preclinical Solutions，Knoxville，TN，USA)重建，使用3D有序子集预期最大化-/最大3
验后(OSEM3D/MAP)算法，具有下述参数：矩阵256x256x159，像素大小0.43x0.43x0.8mm 和先验MAPβ0.5.

[0627] 成像后，解剖肿瘤和目标器官，称重并在γ计数器中计数，针对125I、111In、68Ga或18
F具有适当的能量窗。计算每克组织百分比注射剂量(％ID/g)。

[0628] 统计分析-使用非参数双尾Mann Whitney检验进行统计分析，使用GraphPad InStat软件(版本4.00，GraphPad Software)。显著性水平设为p＜0.05。

[0629] 结果

[0630] 在1小时内，预靶向的免疫PET导致68Ga-IMP 288在肿瘤中的高且特异性靶向(10.7±3.6％ID/g)，在正常组织中(例如，肿瘤/血液69.9±32.3)、CEA-阴性肿瘤中(0.35±0.35％ID/g)和炎症肌肉中(0.72±0.20％ID/g)非常低的吸收。未用TF2预靶向
68 18
的肿瘤也具有低 Ga-IMP 288吸收(0.20±0.03％ID/g)。[ F]FDG在肿瘤(7.42±0.20％ID/g)以及在炎症肌肉(4.07±1.13％ID/g)和许多正常组织中有效累积，因此预靶向的
68 68
Ga-IMP 288提供了更好的特异性和灵敏度。在用TF2预靶向之后接收 Ga-IMP 288或
18
F-标记的IMP 449的小鼠的相应PET/CT图像清楚显示放射性标记肽在皮下LS174T肿瘤
18
中的有效靶向，而炎症肌肉未显影。相反，使用[ F]FDG，肿瘤以及炎症被清楚描绘。

[0631] 剂量优化-确定了TF2 bsMAb剂量对固定0.01nmol(15ng)剂量的IMP 288的肿瘤靶向的影响。五只小鼠的组用0.10、0.25、0.50或1.0nmol TF2(分别是16、40、80或125 111
160μg)静脉内注射，用痕量 I(0.4MBq)标记。注射 In-IMP 288(0.01nmol，0.4MBq)后
1小时，确定放射性标记的生物分布。

[0632] TF2从血液和正常组织快速清除。注射后18小时，所有测试的TF2剂量下的血液浓度小于0.45％ID/g。TF2在肿瘤中的靶向在注射后2h为3.5％ID/g，并且不依赖于TF2111 111
剂量(数据未显示)。 In-IMP 288吸收的结果总结于图15。在所有TF2剂量下， In-IMP
111
288在肿瘤中有效累积。在较高的TF2剂量下，观察到肿瘤中提高的 In-IMP 288吸收：在
1.0nmol TF2剂量，达到IMP 288的最大靶向(26.2±3.8％ID/g)。因此在0.01nmol肽剂量，在1.0nmol的最高TF2剂量达到最大的肿瘤靶向和肿瘤-血液比(TF2∶IMP 288摩尔
111
比＝100∶1)。在正常组织中，肾具有最高的 In IMP 288吸收(1.75±0.27％ID/g)，并且肾中的吸收不受TF2剂量的影响。所有其他正常组织具有非常低的吸收，导致极高的肿瘤-非肿瘤比，在所有测试的TF2剂量下超过50∶1。

[0633] 对于使用68Ga-标记的IMP 288的PET成像，需要较高的肽剂量，因为如果PET成68 68
像在注射后1h进行，则需要对每只小鼠注射5-10MBq Ga的最小活度。 Ga-IMP 288制剂的比活度在注射时是50-125MBq/nmol。因此，对于PET成像，必须施用至少0.1-0.25nmol IMP 288。以0.1nmol IMP 288剂量测试了相同的TF2∶IMP 288摩尔比。LS 174T肿瘤通过注射1.0、2.5、5.0或10.0nmol TF2(160、400、800或1600μg)而被预靶向。与较低肽
111
剂量的结果相反，肿瘤中 In-IMP 288吸收不受TF2剂量的影响(在所有测试剂量下15％ID/g，数据未显示)。在较高剂量，根据％ID/g，肿瘤中的TF2靶向下降(3.21±0.61％ID/g与1.16±0.27％ID/g，分别以1.0nmol和10.0nmol的注射剂量)(数据未显示)。肾吸
收也不依赖于bsMAb剂量(2％ID/g)。根据这些数据，我们选择6.0nmol的bsMAb剂量用于靶向0.1-0.25nmol IMP 288至肿瘤。

[0634] PET成像-为了证明预靶向免疫PET成像用TF2和68Ga-IMP 288成像表达CEA的肿瘤的效力，在五只小鼠中诱导皮下肿瘤。在右肋腹诱导s.c.LS174T肿瘤，同时在相同
6
小鼠的左肋腹中接种1x10SK-RC 52细胞以诱导CEA阴性肿瘤。十四天后，当肿瘤尺寸为
125
0.1-0.2g时，用6.0nmol I-TF2静脉内预靶向小鼠。16小时后，小鼠接收相同量的单独
68 68
Ga-IMP 288，未用TF2预靶向。在注射 Ga-IMP 288后1h，获得小鼠的PET/CT扫描。

[0635] 小鼠中125I-TF2和68Ga-IMP 288的生物分布示于图16。再次观察到bsMAb(2.17±0.50％ID/g)和肽(10.7±3.6％ID/g)在肿瘤中的高吸收，在正常组织中
68
具有非常低的吸收(肿瘤-血液比：64±22)。CEA阴性肿瘤SK-RC 52中 Ga-IMP 288的
68
靶向非常低(0.35±0.35％ID/g)。同样，未用TF2靶向的肿瘤具有低的 Ga-IMP288吸收(0.20±0.03％ID/g)，表明IMP 288在表达CEA的LS174T肿瘤中的特异性累积。

[0636] 68Ga-IMP 288在用TF2预靶向的表达CEA的肿瘤中的特异性吸收在注射68Ga-标记的肽后1h获得的PET图像中清晰显影(未显示)。通过对目标区域绘图来定量评价肿瘤68
吸收，使用50％最大强度阈值。腹部区域用作背景区。接收TF2和 Ga-IMP 288的小鼠的图像中肿瘤-背景比是38.2。

[0637] 然后，我们检查了[18F]FDG预靶向的免疫PET。在两组五只小鼠中，在右后腿诱导s.c.LS174T肿瘤，并通过肌肉内注射50μL松节油诱导左大腿肌肉的炎症病灶(18)。注射68
松节油后3天，一组小鼠接收6.0nmol TF2，16h后接收5MBq Ga-IMP 288(0.25nmol)。其
18
他组接收[ F]FDG(5MBq)。小鼠在注射前10小时期间禁食并被麻醉并在37℃保持温暖直至注射后1h安乐死。

[0638] 68Ga-IMP 288在炎症肌肉中的吸收很低，而在相同动物肿瘤中吸收高(0.72±0.20％ID/g与8.73±1.60％ID/g，p＜0.05，图17)。在炎症肌肉中的吸收在
与肺、肝和脾中的吸收相同的范围内(分别是0.50±0.14％ID/g、0.72±0.07％ID/g、
68
0.44±0.10％ID/g)。 Ga-IMP 288在这些小鼠中的肿瘤-血液比为69.9±32.3；炎症肌
18
肉-血液比为5.9±2.9；肿瘤-炎症肌肉比为12.5±2.1。在其他组小鼠中，F-FDG在
18
肿瘤中有效累积(7.42±0.20％ID/g，肿瘤-血液比6.24±1.5，图4)。 F-FDG还在炎症肌肉中明显累积(4.07±1.13％ID/g)，炎症肌肉-血液比3.4±0.5，肿瘤-炎症肌肉比
1.97±0.71。

[0639] 用TF2预靶向后接收68Ga-IMP 288的小鼠的相应PET/CT图像清晰显示放射性标18
记肽在肿瘤中的有效累积，而炎症肌肉未显影(图18)。相反，接收 F-FDG的小鼠图像上，
68
肿瘤以及炎症是可见的(图18)。在接收 Ga-IMP 288的小鼠中，肿瘤-炎症组织比是5.4；
18
肿瘤-背景比是48；炎症肌肉-背景比是8.9。[ F]FDG吸收具有0.83的肿瘤-炎症肌肉比；肿瘤-背景比是2.4；炎症肌肉-背景比是2.9。

[0640] 使用Al18F-标记的IMP 449测试预靶向免疫PET成像方法。五只小鼠接收6.0nmol18 18
TF2，16h小时后接收5MBq Al F-IMP 449(0.25nmol)。三只额外的小鼠接收5MBq Al F-IMP
18
449，之前不施用TF2，而两只对照小鼠注射[Al F](3MBq)。该实验的结果总结于图19。
18
用TF2预靶向的肿瘤中Al F-IMP 449的吸收高(10.6±1.7％ID/g)，而其在非预靶向小
18
鼠中很低(0.45±0.38％ID/g)。[Al F]在骨中累积(50.9±11.4％ID/g)，而放射性标
18
记IMP 449肽在骨中的吸收很低(0.54±0.2％ID/g)，表明Al F-IMP 449在体内是稳定
18
的。Al F-IMP 449在具有s.c.LS 174T肿瘤的TF2预靶向小鼠中的生物分布高度类似于
68
Ga-IMP 288。

[0641] 用Al18F-IMP 449的预靶向免疫PET的PET图像显示与用68Ga-IMP 288相同的肿18 68 18
瘤中强度，但是 F-图像的分辨率优于 Ga-图像的分辨率(图20)。Al F-IMP 449信号的肿瘤-背景比是66。

[0642] 结论

[0643] 本研究显示，用与68Ga-或18F-标记的二-HSG-DOTA-肽组合的抗-CEA x抗-HSG双特异性抗体TF2预靶向免疫PET是用于表达CEA的肿瘤的PET成像的快速且特异性技术。

[0644] 用与68Ga-IMP 288或Al18F-IMP 449组合的TF2预靶向免疫PET包括两次静脉内施用。输注bsMAb和放射性标记肽之间的间隔使用16h。16h后，大部分TF2从血液中清除(血液浓度＜1％ID/g)，防止了循环中TF2与IMP的复合。

[0645] 对于这些研究，用68Ga标记IMP 288的程序被优化，产生一步标记技术。我们发现，68 68
需要在C18/HLB柱上纯化以除去 Ga胶体，Ga胶体在肽在95℃下以超过150GBq/nmol的
68
特定活度标记时形成。如果制剂含有小百分比的胶体并静脉内施用，则 Ga胶体在单核吞
68
噬细胞系统(肝、脾和骨髓)的组织中聚集，损害图像质量。 Ga-标记的肽可以在C18-柱上快速纯化。放射性标记和纯化以施用可以在45分钟内完成。

[0646] 68Ga的半衰期符合IMP 288肽在预靶向系统中的动力学：在肿瘤中的最大累积在68 68 68
1h内达到。Ga可以在一天从 Ge/ Ga生成器洗脱两次，避免了对现场回旋加速器的需要。
68
然而，Ga(1.9MeV)发射的正电子的高能量限制获得图像的空间分辨率为3mm，而显微PET系统的固有分辨率低至1.5mm。

[0647] PET中最普遍使用的放射性核素18F具有更有利于预靶向PET成像的半衰期(t1/218 68
＝110min)。NOTA-结合肽IMP 449如上所述用 F标记。类似于用 Ga标记，其是一步程
18 68
序。获得了高达50％的标记收率。Al F-IMP 449的生物分布高度类似于 Ga-标记的IMP
18
288，表明对于该标记方法，F是剩余场化的放射性核素。

[0648] 与FDG-PET相反，预靶向放射免疫检测是肿瘤特异性成像模式。尽管已经在患者中报道了FDG-PET在检测复发性结肠直肠癌损伤中的高灵敏度和特异性(Huebner等，2000，J Nucl Med 41：11277-89)，但是FDG-PET图像可以导致在区分恶性损伤与良性损伤
68 18
中的诊断困境，如对炎症观察到的高标记水平所指示的。相反，使用TF2 Ga-或 F-标记的肽的预靶向免疫PET的CEA阳性肿瘤的高肿瘤-背景比和清晰显影支持了所述方法临床成像癌症和其他病症的用途。除了检测转移和区分CEA阳性肿瘤与其他损伤以外，预靶向免疫PET还可用于在预靶向放射免疫疗法之前评估递送至肿瘤和正常组织的放射剂量。因为TF2是人源化抗体，其具有低免疫原性，开辟了多成像或治疗循环的道路。

[0649] 实施例28.叶酸NOTA结合物的合成

[0650] 叶酸如所述被活化(Wang等Bioconjugate Chem.1996，7，56-62.)并结合至Boc-NH-CH2-CH2-NH2。结合物通过色谱纯化。然后通过用TFA处理而除去Boc基团。氨基叶酸衍生物然后与p-SCN-Bn-NOTA(Macrocyclics)在碳酸盐缓冲液中混合。然后产物通过18 18
HPLC纯化。叶酸NOTA衍生物如之前实施例所述用Al F标记，然后HPLC纯化。 F-标记的叶酸被i.v.注射入受试者并成功用于成像叶酸受体在例如癌症或炎症疾病中的分布(参见例如，Ke等，Advanced DrugDelivery Reviews，56：1143-60，2004)。

[0651] 实施例29.人中预靶向的PET成像

[0652] 具有怀疑复发的肿瘤的患者(1.7m2体表面积)被注射17mg双特异性单克隆抗体18
(bsMab)。允许bsMab定位于靶并从血液清除。当99％bsMab从血液清除时，F-标记的肽-9
(5-10mCi 5.7x10 mol)被注射。PET成像显示微转移肿瘤的存在。

[0653] 实施例30.通过18F标记对血管发生受体成像

[0654] 标记的Arg-Gly-Asp(RGD)肽已经用于例如缺血组织中血管发生的成像，其中涉及αvβ3整联蛋白。(Jeong等，J.Nucl.Med.2008，4月15日电子公开)。RGD根据Jeong18
等(2008)等结合至SCN-Bn-NOTA。[Al F]如上所述连接至NOTA-衍生的RGD肽，通过将
18
铝储液与 F和衍生的RGD肽混合并在110℃加热15min，使用过量肽驱使标记反应完成。
18
F标记的RGD肽用于体内生物分布和PET成像，如Jeong等(2008)所公开。RGD-NOTA的
18
[Al F]结合物被吸收入缺血组织并提供血管发生的PET成像。

[0655] 实施例31.18F-标记的NOTA用于肾血流成像

[0656] 铝储液(20μL 0.05M于pH 4NaOAc缓冲液中)与200μL QMA纯化的18F混合。18
然后将[Al F]溶液与500μL pH 4，0.2M NOTA混合并加热15min。然后样品被稀释于5mL
18
PBS用于注射。 F标记的NOTA直接用于成功的肾血流成像。

[0657] 实施例32.碳水化合物标记

[0658] NOTA氨基硫脲衍生物通过使p-SCN-Bn-NOTA与肼反应、然后通过HPLC纯化配体18 18
来制备。[Al F]如在之前实施例所述来制备，并且将[Al F]添加至NOTA氨基硫脲并加热
18 18
15min。任选地，[Al F]NOTA氨基硫脲复合物通过HPLC纯化。[Al F]NOTA氨基硫脲通过
18
已知方法与氧化的碳水化合物结合。 F-标记的碳水化合物成功用于使用PET扫描的成像研究。

[0659] 实施例33.脂质标记

[0660] 包含醛的脂质结合至实施例32的[Al18F]NOTA氨基硫脲，18F-标记的配体用于使用PET扫描的成功的成像研究。

[0661] 在替代实施方案中，含有氨基的脂质与p-SCN-Bn-NOTA反应。NOTA-标记的脂质如18 18
上述实施例中所述与[Al F]反应。 F-标记的脂质用于使用PET扫描的成功的成像研究。

[0662] 实施例34.适体标记

[0663] 包含醛的适体结合至实施例32的[Al18F]NOTA氨基硫脲。18F-标记的适体被施用至受试者并用于使用PET扫描的成功的成像研究。

[0664] 实施例35.有机溶剂对F-18标记的影响

[0665] 螯合部分(例如NETA和NOTA)对铝的亲和力比铝对18F的亲和力高得多。Al对18
F亲和力受诸如溶液离子强度等因素的影响，因为其他抗衡离子的存在趋于彼此屏蔽带正电荷的铝和带负电荷的氟离子并因此降低了离子结合的强度。因此，低离子强度介质应增
18
加Al和 F的有效结合。认为可能向介质添加降低介质的亲水性的有机溶剂还可能增加离子结合强度。

[0666] 发现向18F反应添加乙醇的初始研究提高了放射性标记肽的收率。IMP 461根据实施例15制备。

[0667] 表30.IMP461在乙醇中的18F标记

[0668]

[0669] *HLB柱纯化后的收率，在微波炉中，Rxn#1、2和4被加热至101℃持续5分钟，Rxn#3被加热1分钟。18

[0670] 初步结果显示，向反应混合物添加乙醇使 F-标记的肽收率提高两倍多。表30还18
显示，微波辐射可以用于替代加热以促进[Al F]结合入IMP 461的螯合部分。60秒的微波辐射(#3)似乎比加热至101℃持续5分钟(#1)有效性低(18％)。
19

[0671] 检查了其他试剂对肽的 F标记的影响。在每种情况下，反应物的浓度相同而仅改19
变溶剂。反应条件包括混合25μL Na F+20μL AlCl3+20μL IMP-461+60μL溶剂，随后在
19
101℃加热5min。表31显示溶剂的存在确实显著提高了[Al F]IMP-461(IMP 473)的收率。
19

[0672] 表31.在各种溶剂中IMP 461的 F标记

[0673]溶剂 H2O MeOH EtOH CH3CN
Al-IMP-461 2.97 3.03 2.13 1.54
IMP-465 52.46 34.19 31.58 24.58
IMP-473 14.99 30.96 33.00 37.48
IMP-473 15.96 31.81 33.29 36.40
IMP-461 13.63 - - -

[0674]

[0675]溶剂 IPA 丙酮 THF 二氧杂环己烷
Al-IMP-461 2.02 2.05 2.20 16.67
IMP-465 32.11 28.47 34.76 10.35
IMP-473 27.31 34.35 29.38 27.09
IMP-473 27.97 35.13 29.28 11.62
IMP-461 10.58 - 4.37 34.27

[0676]溶剂 DMF DMSO tR(min)
Al-IMP-461 - - 9.739
IMP-465 19.97 37.03 10.138
IMP-473 27.77 31.67 11.729
IMP-473 27.34 31.29 11.952
IMP-461 - - 12.535
19

[0677] [Al F]IMP 461＝IMP 473TM

[0678] RP-HPLC分析：配有 GEMINI C18反相柱(4.6x250mm，5μm，)的 2695HPLC系统，使用流速为1mL/min的5分钟内100％A(0.1％
TFA)至90％A、16分钟内90％A至20％B(90％乙腈，10％水，0.1％TFA)的线性梯度，使用PDA 2996检测器在220nm检测吸光度。(运行时间：20分钟)。

[0679] 实施例36.用碳酸氢盐洗脱18F

[0680] 18F(10.43mCi)以2mL被接收到注射器中。溶液穿过 Light，TM 18
ACCELL Plus QMA柱。然后将柱用5mL DI水洗涤。 F用0.4MKHCO3洗脱，级
分显示如下。

[0681]管形瓶乙酸体积μL 0.4M KHCO3体积μL 活度mCi
1 7.5 150 0.0208
2 10 200 7.06
3 5 100 1.653
4 25 500 0.548

[0682]18

[0683] 检查了其他溶剂(CH3CN)的量对IMP-461的 F标记的影响。在每种情况下，18
反应物的浓度相同并且仅改变溶剂量。反应条件包括混合10μL AlCl3+20μL F+20μL IMP-461+CH3CN，随后在101℃加热5min。表32显示在过量溶剂存在下，标记效率开始提高并随后降低。

[0684] 表32.使用不同量的CH3CN对IMP461进行18F标记

[0685]CH3CN(μL) F-18mCi tR 2.70min(％) tR 8.70min(％) RCY％(HLB)
0 0.642 13.48 86.52 50.7
100 0.645 1.55 98.45 81.8*
200 0.642 2.85 97.15 80.8
400 0.645 14.51 85.49 57.8

[0686] *水洗液含有标记的肽。RCY＝HLB纯化后的放射化学收率

[0687] 实施例37.IMP 461的高剂量放射性标记

[0688] 18F(163mCi)以2mL被接收到注射器中。溶液穿过 Light，TM 18
ACCELL Plus QMA柱。然后将柱用5mL DI水洗涤。 F用0.4MK2CO3洗脱，级分显示于表
33。

[0689] 表33.高剂量标记

[0690]管形瓶乙酸体积μL 0.4M K2CO3体积μL 活度mCi
1 18.5 185 5.59
2 5 50 35.8
3 5 50 59.9
4 5 50 20.5
5 5 50 5.58
6 50 500 4.21

[0691] 氯化铝溶液(10μL，2mM pH 4，2mM NaOAc)被添加至表33的第3号管形瓶。肽(20μL，2mM pH 4，2mM NaOAc)被添加至管形瓶，随后添加170μLCH3CN。溶液在103℃加热10min，用6mL水稀释。溶液被吸入10mL注射器并注射至串联设置的两个 HLB
18
Plus柱。然后用8mL水洗涤柱。然后用10mL 1∶1 EtOH/H2O洗脱放射性标记的肽Al F IMP 461，30.3mCi，63.5％收率，比活度750Ci/mmol。

[0692] 通过HPLC，标记的肽不含未结合的18F。总反应和纯化时间为20min。

[0693] 实施例38.19F标记肽的制备

[0694] 含有27Al和/或19F的产物用于某些应用如NMR成像。开发了用于制备[Al19F]标19
记化合物的改进方法。IMP 461如实施例15所述制备并用 F标记。IMP 461与AlCl3+NaF反应导致形成三个产物(未显示)。然而，通过IMP 461与AlF3.3H2O反应，我们获得了更
19
高的[Al F]IMP 461收率。

[0695] IMP 473 的合成：([Al19F]IMP 461) 向 (14.1mg，10.90μmol)IMP 461 在2mLNaOAc(2mM，pH 4.18)中的溶液添加(4.51mg，32.68μmol)AlF3.3H2O和500μL乙醇。使用3μL 1N NaOH调节溶液pH至4.46，并在废水浴中加热30分钟。粗制反应混合物通过制+
备型RP-HPLC纯化以产生4.8mg(32.9％)IMP 473。HRMS(ESI-TOF)MH 预期1337.6341；实测1337.6332。

[0696] 配有 GEMINITM C18反相柱(4.6x250mm，5μm， )的2695HPLC系统，使用流速为1mL/min的20分钟内100％A(0.1％TFA)至20％
B(90％乙腈，10％水，0.1％TFA)的线性梯度，使用 PDA2996检测器在220nm检
18
测吸光度。在分析型RP-HPLC上观察两个接近洗脱的峰，表明对其他[Al F]标记肽观察到的非对映体的存在。
19 19 19

[0697] 这些结果证明，F标记分子可以通过形成金属- F复合物并将金属- F结合至螯18
合部分来制备，如上对 F标记所讨论的。本实施例显示，用于预靶向检测、诊断和/或成像的靶向肽可以使用本方法制备。
18 19

[0698] 实施例39.使用Al F或Al F的其他辅基标记方法

[0699] 在某些实施方案中，氟化铝标记方法可以使用对热敏感的分子的辅基标记方法进行。对于热敏感分子，辅基结合可以在较低温度下进行。18 19

[0700] 辅基NOTA如上所述用 F或 F标记，然后其连接至靶向分子。在一个非限制性实施例中，这使用醛NOTA进行，然后醛NOTA与靶向分子上的氨基-氧基化合物连接。或者，氨基-氧基马来酰亚胺与醛反应，然后马来酰亚胺与靶向分子上的半胱氨酸连接(Toyokuni等，2003，Bioconj Chem 14：1253)。

[0701] 在另一个替代方案中，AlF-螯合剂复合物通过点击化学与靶向分子连接。首先配18 19
体如上所述用Al F或Al F标记。然后AlF-螯合剂如下所公开通过点击化学与靶向分子结合。例如，炔NOTA根据Marik和Stucliffe(2006，Tetrahedron Lett47：6681)标记并结合至含有叠氮化物的靶向剂。

[0702]

[0703] 在另一个替代实施方案中，叠氮化物在螯合剂部分上，并且炔在靶向剂上(Glaser和Arstad，2007，Bioconj Chem 18：989)。

[0704]

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