(一)技术领域

本发明涉及珍珠草提取技术领域，具体地讲是珍珠草植物脂溶性 萃取物与水溶性提取物及以这种物质为活性成分的药物混合组合物以 及在治疗乙型肝炎方面的应用。

(二)背景技术：

肝炎病毒(以下简称为HBV)是一种物异性感染人体的嗜肝DNA系 统病毒(Hepadnaviridae)，其潜伏期为60-110天，经过多种临床期 90-95％感染者可完全恢复。如果患者不能从感染恢复，HBA将被人体肝 细胞DNA基因同化，发展成慢性活动性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病。HBV 引起的慢性肝炎可导致慢性病毒染症，淋巴肿疾患及慢性肾脏障碍，是 一种死亡率极高的疾患。

人类被HBV感染可追溯到史前2000左右。史前的医书中已有关于 黄疸病的技术的记载。1964年Blumberg，B.S.发现了乙型肝炎病毒，且 发现乙型肝炎可诱发肝硬化及肝癌。

目前，世界上有约2亿人口是HBV病毒携带者，其中80％集中在亚 太地区。其中大部分血液中出现乙型肝炎病毒表面抗原(HBSAg)阳性。

尽管1981年之后开发了HBV疫苗并给新生儿及易感染人群实施了 预防接种，但是携带者人数至今并未减少多少。其主要原因为HBV病毒 主要感染途径是垂直性感染(从母体感染到胎儿)。孕妇中，尤其是HbeAg 阳性者，出生的胎儿即使通过胎盘的感染率极低，但出生过程或胎盘损 伤感染HBV或HbeAg时，日后可引发HBV免疫缺陷，结果新生儿变成慢 性HBV携带者的机率极高。已经携带乙型肝炎病毒的女性最晚也要在 20岁之前治愈，至少要驱除血液中的HbeAg。

最近PCR(Polymerase Chain Reaction)技术应用到此领域，比 较容易测定病毒携带者血液中的HBA，因此HbeAg已不是作为乙型肝炎 的唯一指标。在全世界范围内尤其是亚太地区为降低乙型肝炎病毒携带 者的绝对人数，进而抑制乙肝引起的肝硬化及肝癌，一方面要对新生儿 积极实行疫苗接种，另一方面需要急待开发降低乙肝病毒携带者尤其是 孕妇血液中的HBV的DNA量的方法。现在虽然已开发出几种治疗乙型 肝炎病毒的药物，但都没有满意的疗效。Ara-A，Acyclovir等现在使 用的药物因毒性强不能广泛使用。此外，乙膦甲酸盐(phosphonoformate； Foscarnet)，苏拉明)Suramin)，前列腺素(prostaglandin)，2-CDG[环 碳类似物]。

2-脱氧[2-CDG(carbocyc lic analogue of 2-deoxyguanosine)，(Famciclovir)等虽然有望成为有效药物，但是还 需要许多验证。至今在降低和改善乙型肝炎的主要指标HBSAg，HbeAg 的同时无任何副作用药物几乎没有，尤其是达到对产妇、孕妇以及儿童 使用而无副作用药物几乎找不到。

1987年Venkatswaran，1988年Blumberg，B.S.，等人主张使用印度等 地区使用的phyllanthus，属植物(Euphorbiaceae；)治疗乙型肝炎。根 据1991年Unander，D，W等整理的世界各国关于phyllanthus属植物的 用途及生物化学分析资料550种phyllanthus属植物中使用在黄疸病或 肝炎的有p.niruri，p.airy-shawii(amarus)，p.amarus，p.fraternus webster，p.urinaria，p.gasstroemiMuell-Arg及p.thymoides等7 种。P.amarus及p.niruri使用在土拨鼠的乙型病毒性肝炎及鸭子的乙 型病毒性肝炎(Nis，J.，et al.，Effect of phyllanthus amarus on duck hepatitis B virus replification in vitro，J.of Med.Virol.， 32：212-218，1990).并且在各种phyllanthus属植物中p.thymoides在 试管内与HBSAg结合力最强，这是由与HBSAg结合的特定植物凝血素 (Lectin)引起，使用鸭子的生物体实验无效果(Shead，A.et al.， Neutralization but not cure of duck hepatitis B by Australian phyllanthus extracts.Abstract 602 In：Scientific program and Abstracts volume，the 1990 InternationalSymposium on Viral Hepatitis and Liver Disease，April 4-8，1990，Houston，Texas).从 以上内容可知phyllanthus属植物中p.amarus，p.nururi等几种植物 曾使用于治疗黄疸病和肝炎的民间疗法，或在试管内也出现过治疗乙型 肝炎有效的现象，但应用在生物体，尤其是对人体乙型肝炎治疗有效的 技术方案还没有。

(三)发明内容：

本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供珍珠草脂溶性萃 取活性物和水溶性提取活性物的混合物作为珍珠草提取成分。

本发明的另一目的是提供以这种物质为活性成分的药物组合物。

本发明还有一目的是提供这种药物组合物在治疗乙型肝炎方面的应 用。

为了达到上述目的，本发明是这样实现的：珍珠草植物提取物，由 下列工艺过程完成，珍珠草经严格挑选原料，水洗涤干净，通风干燥后 切断其茎到3-5cm；叶和茎经万能粉碎机粉碎，过10目筛，利用20升 超低温、CO2超临界萃取仪在30-45％乙醇比例，300大气压下萃取3-5 小时，收集脂溶性活性物，得珍珠草植物脂溶性萃取物；萃取余物加入 20倍余物重量的纯净水，在93℃下恒加热8-10小时，提取液通过400 目过滤，进行低温真空浓缩，浓缩液在-70℃以下低温快速冷冻24小时 以上，在-15至-75℃下冷冻干燥36小时以上，再用16目粉碎机粉碎过 筛，得珍珠草植物水溶性提取物，与超临界萃取物混合作为珍珠草提取 成分。

为了进一步实现上述目的，以本发明的珍珠草植物提取物为活性成 分的药物组合物，它含有有效量的治疗乙肝的珍珠草植物提取物，还可 以加入药学上可接受的载体。

本发明的以珍珠草植物提取物为活性成分的药物组合物，其所述的 药学上可按受的载体为稀释剂、填充剂、防凝剂、润滑剂、香味剂，常 用的载体为微晶纤维素、羟丙基纤维素、脂酸镁。

本发明的以珍珠草植物提取物为活性成分的药物组合物，可根据纯 化程度及治疗需要制成口服药、皮下注射剂、静脉注射剂等药剂学制剂。

本发明使用的珍珠草是一年生草本植物，原料是云南或贵州的野生 珍珠草，也可为栽培的珍珠草。

本发明是浓缩处理珍珠草植物脂溶性和水溶性活性成分，即对人的 乙型肝炎临床有效的活性成分，并配入相应的辅料，从而制造有效治疗 乙型肝炎的药剂学制剂。

以珍珠草植物提取物为活性成分的药物组合物，用于临床治疗可以 采用口服与非口服两种形式，口服用量一天是100-1000mg/kg(以珍珠 草提取物计)体重，建议较适宜剂量为180-500mg/kg(以珍珠草提取物 计)体重，但在实际临床上可根据患者的病情、症状、年龄、性别、体 重等条件可进行适当调节。

利用HbAg阳性患者血清检验结合能力：

用蒸馏水及乳化剂将药物组合物进行溶解，制成最终浓度为10，5， 2.5，1.25，及0.63mg/ml(以珍珠草提取物计)的溶液，各取上述溶液 400ul与400ul HBsAg阳性血清混合，在20℃反应1小时后，3000rpm离 心10-15分钟。在离心上层中测定HbsAg效价(titer—滴定度)，从而 检测HbsAg的减少程度。以珍珠草植物提取物为活性成分的药物组合物 阻碍血清中HbsAg和HbsAb结合程度如表1所示。

                               表1    植物                珍珠草(Phyllanthus) 药物组合物 (mg/ml)     10     5     2.5     1.25     0.63 对HbsAg和 HbsAb结合 的阻碍作用 程度(％)     98.9     92.5     92.7     90.8     72.0

本发明的以珍珠草植物提取物的脂溶性和水溶性提取物为活性成分 的药物组合物抗病毒效果实验如下：

1、对HBV的作用的电子显微镜观察

将HbsAg及HbeAg阳性的患者血清置于20％蔗糖垫层(sucrose cushion)上的中层，在4℃下，100,000g超速离心4小时(Sorvall)， 获得HBV粒子后，用磷酸盐缓冲液(PBS)把颗粒状物悬浮于其中，使其 量为原量的1/20。把药物组合物的2％(以珍珠草提取物计)水溶液再用 蒸馏水稀释10倍和20倍(0.2及0.1％溶液)最终制成HBV粒子溶液。

药物组合物对HBV失活作用测定是以蒸馏水为对照物，将同量0.2％ 及0.1％(以珍珠草提取物计)药物组合物溶液与所制备的HBV粒子溶液 均匀混合后，在室温静置30分钟，然后用电子显微镜观察HBV粒子的形 态变化。

电子显微镜观察：在载波片(格栅)上滴一滴准备的试剂，用1％磷钨 酸进行负染色，再用PBS洗涤2次，残留在载波片上的水分用精制Wattman No.1滤纸吸干。电子显微镜(Zeiss公司)进行观察，表明药物组合物 在0.1％浓度时导致HBV病毒变性的严重性。

2、对患肝硬化合并症症状的慢性活动性肝炎的乙型HBV肝炎病毒携 带者观察

在肝功能检验中获得了GOT/GPT＝129/184，GOT为谷草转氨酶，GPT 为谷丙转氨酶，HbsAg(+)抗-HbcAb(+)，抗-HbsAb(-)结果，B超检查中 没有肿块，只有轻微的阴影，胸部有网状脉管肿，手心血肿，右肋骨底 下发现明显可触摸到的约2cm左右的较硬的似肝硬化症的现象，检查结 果判定是慢性活动肝炎合并的肝硬化症，确诊干扰素已不适用。

给此患者每天口服200mg/kg(以珍珠草提取物计)体重的药物组合物 治疗剂，血清检验结果变化如表2所示。

表2：药物组合物对慢性活动肝炎合并的肝硬化症的治疗效果                       HBV感染的指标       转氨酶   治疗时间     HbsAg    HBsAg    HBeAg    HBeAb   HBV/DNA     GOT     GPT   治疗前     +    -    +    -   +     269     342   治疗一个月后     +    -    +    -   +     143     242   治疗三个月后     +    (+)    +    -   -     49     112

如表2所示，口服药物组合物3个月后HBV-DNA变成阴性，转氨酶结 果也有相当好转，但是对病人肝硬化并发症需进一步的观察。

从以上实验结果可以得出结论，以珍珠草脂溶性和水溶性提取物为活 性成分的药物组合物可以作为无毒副作用的具有显著有效的乙型肝炎治疗 剂。

本发明的以珍珠草脂溶性和水溶性提取物为活性成分的药物组合物在 临床实验条件下珍珠草提取物显示了令人满意的疗效，对携带HBV的健康 人口服3个月珍珠草提取物制作的药物组合物，血清中HBV DNA实验显示 为阴性，血清中HbsAb显示阳性(采用免疫监测方法)。对怀疑已得轻度慢 性肝炎的HBV携带者病例口服此药物3个月后的HbsAb也显示阳性。

由HBV感染引起的慢性活动性肝炎转化为肝硬化的病例中，口服珍珠 草提取物制作的药物3个月后HBV-DNA转变为阴性，血液中GOT和GPT活 性度有明显改善。

从以上试验结果得以证实，以珍珠草植物提取物为活性成分的药物组 合物是几乎没有毒性和副作用的有效的乙型肝炎治疗剂。

本发明与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，其表现在， 原料丰富，珍珠草脂溶性和水溶性提取物的提取工艺先进，合理可靠，可 操作性强，配入相应的辅料制成的药物组合物在乙型肝炎的治疗中效果显 著，一般情况下3个月后HBV-DNA转变成阴性，转氨酶值也有相当好转， 无毒副作用，是乙型肝炎的有效治疗药物。

(四)具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明。

实施例1，采集野生的珍珠草(Phyllanthus)，珍珠草经严格挑选原 料，水洗涤干净，通风干燥后切断其茎到3-5cm；叶和茎经万能粉碎机粉碎， 过10目筛，利用20升超低温、CO2超临界萃取仪在38％乙醇比例，300大 气压下萃取4小时，得珍珠草植物脂溶性萃取物；萃取余物加入22.5倍余 物重量的纯净水，在93℃下恒加热提取9小时，提取液通过400目过滤， 进行45℃低温真空浓缩，使其浓度达到25Brix；浓缩液在-70℃以下低温 快速冷冻24小时以上，在-40℃下冷冻干燥36小时，再用粉碎机粉碎过16 目筛，得珍珠草植物水溶性提取物，与超临界萃取物混合作为珍珠草活性 提取成分。

实施例2，将实施例1的珍珠草提取物按常规工艺加工制成口服药， 使其含有有效量的治疗乙肝的珍珠草提取物活性成分。

实施例3，采用实施例1的珍珠草提取物，加入辅料量的微晶纤维素， 羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)，硬脂酸镁(magnesium stearate)辅料混合10分钟，制得以珍珠草植物提取物为活性成分的药物 组合物，按常规工艺制成口服药制剂。

实施例3制造的以珍珠草提取物为活性成分的药物组合物显现出与血 清及肝炎疫苗中的HbsAg的很强的结合能力，阻碍了HbsAg和HbsAb的结 合，在血清及肝炎疫苗中既使各自浓度为1.25mg/ml时也有较强的竞争性 抑制效果。

另外，实施例3的药物组合物对HBV-DNA的多聚酶活性度进行抑制， 约在34.1ug/ml以上浓度下，依浓度比来抑制HBV-DNA多聚酶的活性度， 尤其是珍珠草水提取物在0.1％浓度时可导致HBV病毒的变性。

实施例4，采集栽培的珍珠草(Phyllanthus)，珍珠草经严格挑选原料， 水洗涤干净，通风干燥后切断其茎到3-5cm；叶和茎经万能粉碎机粉碎，过 10目筛，利用20升超低温、CO2超临界萃取仪在45％乙醇比例，300大气 压下萃取5小时，得珍珠草植物脂溶性萃取物；萃取余物加入25倍余物重 量的纯净水，在93℃下恒加热10小时，提取液通过400目过滤，进行45 ℃低温真空浓缩，浓缩液在-70℃以下低温快速冷冻24小时以上，在-75℃ 下冷冻干燥36小时以上，再用粉碎机粉碎过16目筛，得珍珠草植物水溶 性提取物，与超临界萃取物混合作为珍珠草提取成分。

实施例5，采用实施例4的珍珠草提取物，加入辅料量的微晶纤维素， 羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)，硬脂酸镁(magnesium stearate)辅料混合10分钟，制得以珍珠草植物提取物为活性成分的药物 组合物，按常规工艺制成口服药制剂。

实施例6，采集珍珠草(Phyllanthus)，珍珠草经严格挑选原料，水洗 涤干净，通风干燥后切断其茎到3-5cm；叶和茎经万能粉碎机粉碎，过10 目筛，利用20升超低温、CO2超临界萃取仪在30％乙醇比例，300大气压下 萃取3小时，得珍珠草植物脂溶性萃取物；萃取余物加入20倍余物重量的 纯净水，在93℃下恒加热8小时，提取液通过400目过滤，进行35℃低温 真空浓缩，使其浓度达到25Brix；浓缩液在-70℃以下低温快速冷冻24小 时，在-15下冷冻干燥36小时，再用粉碎机粉碎过160目筛，得珍珠草植 物水溶性提取物，与超临界萃取物混合作为珍珠草提取成分。

实施例6，采用实施例5的珍珠草提取物，按常规工艺制成皮下注射制 剂。

同时，本发明的以珍珠草提取物为活性成分的治疗乙型肝炎的药物组 合物，不只限制在以上模式，在不离开其技术宗旨的前提下可进行多方面 的变化。