Semaphorin4D在预防及治疗骨代谢性疾病中的应用
阅读：795发布：2020-05-12
专利汇可以提供Semaphorin4D在预防及治疗骨代谢性疾病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医学药物领域，公开了骨代谢性 疾病 防治的新靶点——脑 信号 蛋白家族成员Semaphorin 4D蛋白或Sema4d基因，以及该靶点相关的重组蛋白或 抗体 及干扰RNA等在 预防 或 治疗 骨 代谢性疾病 中的应用。，下面是Semaphorin4D在预防及治疗骨代谢性疾病中的应用专利的具体信息内容。
Semaphorin 4D在预防及治疗骨代谢性疾病中的应用
[0001]
技术领域
背景技术
[0003] 在健康的骨骼中，骨改建过程在激素、细胞因子及细胞间相互作用所构成的网络精确调节下进行，简单来说骨骼表面融解破坏骨骼的破骨细胞与促进骨骼形成的成骨细胞均衡发挥作用，维持骨密度、硬度和柔韧性等，如果这种平衡失衡，就会患上骨代谢性疾病，如发生骨量增加（硬化症），但更常出现的是骨丢失（骨质疏松症）等疾病。
[0004] 随着社会老龄化加快，骨质疏松症的发病率日益增高，目前中国60岁以上老年人的发病率就高达56%。骨质疏松基本病理机理是骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，使骨密度逐渐减少，累及全身骨骼，同时存在局部骨折或缺损愈合不良影响治疗效果。因此，如何改善骨质疏松患者的全身及局部状况显得尤为重要。
[0005] 目前抗骨质疏松药物以抑制骨吸收为主，治疗后可伴有骨质硬化、脆性增高，骨折好发等临床特点，不仅加大了骨缺损的治疗难度，而且严重影响老龄化人口的生活质量。因此如何增强骨骼自身的成骨修复能力而不影响破骨活性，让成骨细胞-破骨细胞参与的骨改建循环正常进行，从而再生满足生理机械力学需求的功能化骨成为目前骨质疏松研究中的首要问题。
[0006] 脑信号蛋白（Semaphorins）最初被确定为神经发育过程中控制轴突路径的分子，已经发现超过20多种脑信号蛋白，它们在不同生物学行为中发挥不同功能，包括心脏发育、血管生成、癌变及调节免疫反应等。特别是最近越来越多的研究表明脑信号蛋白参与骨代谢平衡并在骨代谢性疾病中发挥作用。
[0007] 就局部而言，骨重塑过程是由成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用直接进行调节的。因为在同一骨骼位点不能同时出现骨形成和骨吸收两个过程；所以，假设成骨细胞和破骨细胞存在相同的抑制剂，则可使一个特异位点同时存在骨形成和骨吸收。Hiroshi Takayanagi的团队发现了这种相互作用的分子机制，成骨细胞的骨形成作用同时阻碍了破骨细胞的骨吸收。Semaphorin 3A，是成骨细胞产生的一种神经轴突导向因子，可抑制核因子κB配体的受体（RANKL，也称肿瘤坏死因子配体超家族）化导致的骨髓源单核细胞中的破骨细胞生成。他们假设培养的小鼠成骨细胞除了分泌护骨素(强效的破骨细胞抑制剂)，还分泌调节骨代谢的蛋白。作者对培养的成骨细胞(来自护骨素缺陷小鼠)条件性培养基进行分馏，鉴定Semaphorin 3A是一个成骨细胞衍生蛋白，它能抑制破骨细胞的形成。重要的是，该蛋白不仅抑制破骨细胞骨吸收，也增加成骨细胞骨形成。Semaphorin 3A缺陷小鼠骨质减少，静脉注射Semaphorin 3A预防卵巢切除引起的骨丢失。Semaphorin3A通过不同信号途径减少骨吸收，增加骨形成。对骨吸收的抑制作用由semaphorin-3A与神经纤毛蛋白-1结合作用介导，竞争性抑制与神经丛蛋白A1（plexin-A1）的结合，并继而抑制plexin-A1–TREM2–DAP12复合物的产生，通过抑制免疫受体酪氨酸激活基序和RhoA信号途径预防RANKL诱导的破骨细胞分化。当Semaphorin 3A缺乏时，RANKL信号使neuropilin-1快速下调、plexin-A1释放并促进破骨细胞分化。Semaphorin 3A通过使单核细胞处于“待命”状态来抑制破骨细胞的分化，并以此支持骨形成。反之，Semaphorin 3A对骨形成的刺激作用由经典Wnt/β-连环蛋白信号途径的促进作用介导。抗吸收治疗方法抑制骨吸收，同时在一定程度上也抑制骨形成。因此，Semaphorin 3A的作用机制非常罕见，因为它将骨重塑的两个部分分解，对这种治疗优势加以开发研究，可能会带来一类新的双重作用骨质疏松治疗药物。
[0008] 同时研究发现Semaphorin 6D也是Plexin-A1的配体，能够与破骨细胞表面的DAP12-(Trem-1)-(Plexin-1)复合体结合，通过钙振荡促进破骨细胞分化。同时，Semaphorin 6D与Plexin-A1结合也会使胞浆内FARP2活化，进而产生Rac-GTP，从而使破骨细胞伪足重排而影响破骨细胞粘附能力。因此Semaphorin 6D其抗体或通过基因沉默抑制该蛋白的表达有可能作为治疗骨质疏松的靶点，Semaphorin 6D重组蛋白也可能用于骨硬化病的治疗。
[0009] Delorme等人的研究发现Semaphorin 7A能通过整合素β1促进成骨细胞的迁移，同时也能通过促进破骨前提细胞的融合诱导破骨细胞的成熟分化。但体内研究表明，Semaphorin 7A基因多态性能导致绝经期妇女骨密度降低及较高的骨折风险。因此Semaphorin 7A有可能作为治疗骨质疏松的靶点。
[0010] 综上可知，已证实多种脑信号蛋白在参与骨代谢平衡并在骨代谢性疾病中发挥重要作用。
发明内容
[0011] 本发明首次公开了治疗骨代谢性疾病的新靶点----Semaphorin 4D蛋白或Sema4d 基因。该靶点蛋白高表达于RANKL活化的破骨细胞中，在不改变破骨细胞的分化等生物表型基础上，以膜蛋白及分泌蛋白形式作用于成骨细胞表面识别靶点，参与调控成骨细胞分化及迁移，进而抑制成骨作用，分解骨吸收和骨形成偶联过程，在破骨细胞与成骨细胞间的骨代谢平衡中发挥调节作用。
[0012] 本发明公开了脑信号蛋白家族成员Semaphorin 4D靶点相关的重组蛋白、蛋白拮抗剂或抗体及干扰RNA等在维持正常骨代谢平衡、预防或治疗骨代谢性疾病中的应用。更具体的，制备的Semaphorin4D重组蛋白可用于以骨增多为主要表征的骨硬化等疾病的预防或治疗，制备的Semaphorin 4D蛋白拮抗剂或抗体及干扰RNA可用于以骨丢失为主要表征的骨质疏松等疾病的预防或治疗。
[0013] 由于本发明所述Semaphorin4D重组蛋白在促进成骨细胞分化成骨过程中能同时不影响破骨细胞分化，它将骨重塑的两个部分分解，对这种治疗优势加以开发研究，可能会带来一类新的双重作用骨质疏松治疗药物。
[0014] 由于本发明所述Semaphorin 4D拮抗剂或抗体及siRNA在促进成骨细胞分化成骨过程中并未干扰正常破骨细胞破骨活动，因此本发明所述Semaphorin 4D拮抗剂或抗体及siRNA除可应用于骨质疏松的预防与治疗外，还可与其他治疗骨质疏松促进骨生成类药物如阿伦磷酸盐等协同给药，减少药物用量，预防因使用阿伦磷酸盐等引起的骨硬化症。
[0015] 本发明所述重组蛋白不仅包括其全序列长度重组蛋白，也包括相关的抗原结合片段蛋白或多肽衍生物，同时本发明所指可用于骨代谢相关疾病预防或治疗的Semaphorin4D或多肽包括但不局限于上述所指的Semaphorin 4D。
[0016] 本发明所述蛋白拮抗剂或抗体不仅包括可用于骨代谢相关疾病预防或治疗的Semaphorin 4D的拮抗剂或抗体，也包括可用于骨代谢相关疾病预防或治疗的Semaphorin4D在骨代谢相关疾病下游信号转导中所涉及蛋白或多肽的拮抗剂或抗体。
[0017] 本发明所述干扰RNA不仅包括可用于骨代谢相关疾病预防或治疗的Semaphorin4D的干扰RNA，也包括可用于骨代谢相关疾病预防或治疗的Semaphorin 4D在骨代谢相关疾病下游信号转导中所涉及蛋白或多肽的干扰RNA。本发明所述干扰RNA形式包括siRNA，dsRNA及shRNA等。
[0018] 本发明所述针对Sema4d基因的治疗手段除上述干扰RNA外，还包括基因上调或下调等相关基因治疗方案。
[0019] 本发明同时提供合成上述重组蛋白的方法，包括重组DNA或重组RNA的体外方法或体内方法。其一般过程为，应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白（Semaphorin 4D 蛋白）的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。当前主要应用的重组蛋白的表达载体包括原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母、昆虫细胞以及CHO细胞等，重组蛋白的产生尚可利用转基因动物的乳腺或者植物产生。本发明所述重组蛋白包括但并不局限于上述方法所得重组蛋白。优选的，本发明所述重组蛋白基本剂型为注射剂，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径；其改进剂型包括口服给药，外用给药，原位植入，胃肠外给药，局部给药，动脉内注射和用生物可降解的基质递送等。上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持蛋白拮抗剂或抗体分子的活性。
[0020] 本发明同时提供合成上述蛋白拮抗剂或抗体的方法，包括合成单克隆抗体或多克隆抗体等。多克隆抗体基本制备方法包括：①制备抗原，依照上述重组蛋白方法合成或直接提取上述Semaphorin 4D蛋白，②进行动物免疫，选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等采用淋巴结注射法、皮下多点注射法或多途径联合注射法，③试取血检测是否成功免疫，④如果成功免疫则处死实验动物采集全部血清，⑤抗体纯化及鉴定。单克隆抗体基本制备方法包括：①提取合成上述专一性抗体的单个B淋巴细胞，②用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞，③对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体。本发明所述蛋白拮抗剂或抗体基本剂型为注射剂，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径；其改进剂型包括口服给药，外用给药，原位植入，胃肠外给药，局部给药，动脉内注射和用生物可降解的基质递送等。上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持蛋白拮抗剂或抗体分子的活性。
[0021] 本发明同时提供干扰RNA的制备及应用方法，干扰RNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。干扰RNA的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等。出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA 表达框、或者包含siRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。优选的，本发明所述RNA干扰系统基本剂型为注射剂，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射及腔内注射等多种注射途径；其改进剂型包括口服给药，外用给药，原位植入，胃肠外给药，局部给药，动脉内注射和用生物可降解的基质递送等。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持干扰RNA分子的活性。
[0022] 本发明所涉及各种重组蛋白、蛋白拮抗剂或抗体及干扰RNA的有效治疗剂量可能根据各种因素而不同，这些因素包括但不仅限于，所使用化合物的活性、患者体内活性化合物的稳定性、所要缓解的病症的严重程度、所治疗患者的总体重、给药的途径、活性化合物在患者体内吸收的容易程度、分布、排泄，所治疗患者的年龄和敏感性等等，这些对技术人员来说都是显而易见的。摄入量可因各种因素随着时间变化而调整。
[0023] 本发明所指以骨丢失为主要表征的疾病包括但不限于骨质疏松症，比如绝经后骨质疏松症，类固醇或糖皮质激素性骨质疏松症，年龄骨质疏松症，风湿关节炎或癌症诱发的骨质疏松症，骨质软化，特发性骨质疏松，或者佩吉特病。此外，本发明亦可用于治疗或延迟任何局部性骨质流失，比如相关的牙周炎，骨折，假肢周围骨溶解的发生。
[0025] 图1，展示了Sema4d siRNA在转录（a）和翻译（b）水平均成功干扰Semaphorin 4D合成。
[0026] 图2，展示了Sema4d siRNA在干扰沉默Sema4d基因过程中不影响破骨前体细胞的破骨分化能力。
[0027] 图3，展示了破骨细胞在使用Sema4d siRNA干扰Semaphorin 4D合成后能抑制骨髓间充质细胞迁移。
[0028] 图4，展示了Sema4dsiRNA在预防骨质疏松过程中4周后股骨CT三维重建图。
[0029] 图5，展示了Sema4dsiRNA在预防骨质疏松过程中后股骨骨小梁形态及矿化沉积。
[0030] 图6，展示了Sema4dsiRNA在治疗骨质疏松过程中4周后股骨CT三维重建图。
[0031] 图7，展示了Sema4dsiRNA在治疗骨质疏松过程中后股骨骨小梁形态及矿化沉积。
具体实施方式
[0032] 实施例1针对Sema4d mRNA根据Tuschl法筛选合成Sema4d siRNA。
[0034] 分析获得的序列，选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除和其他编码序列/EST同源的序列。
[0035] 实验结果及结论我们设计的Sema4d siRNA序列如下：
正 义 链 : 5- GUGCCUGGAUAAGAGUAAATT-3（SEQ ID No:1）; 反 义 链 :
5-UUUACUCUUAUCCAGGCACTT-3（SEQ ID No:2）。
正 义 链 : 5- GUGCCUGGAUAAGAGUAAATT-3（SEQ ID No:1）; 反 义 链 :
5-UUUACUCUUAUCCAGGCACTT-3（SEQ ID No:2）。
[0036] 我们设计的Sema4d siRNA在转录和翻译水平均成功干扰Sema4D合成（图1）。
[0037] 实施例2研究干扰沉默Sema4d 对破骨细胞分化的影响实验步骤
1.骨髓来源巨噬细胞原代分离及培养
取新鲜取材长骨用含双抗PBS漂洗后，无菌条件下冲净髓腔内骨髓，吹打为单细胞悬液，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，漂洗后用含10ng/ml M-CSF, 10%FBS的DMEM重悬后，密度20000个/孔接种于24孔板中，隔天换液，贴壁细胞中含有丰富的骨髓来源巨噬细胞。
1.骨髓来源巨噬细胞原代分离及培养
取新鲜取材长骨用含双抗PBS漂洗后，无菌条件下冲净髓腔内骨髓，吹打为单细胞悬液，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，漂洗后用含10ng/ml M-CSF, 10%FBS的DMEM重悬后，密度20000个/孔接种于24孔板中，隔天换液，贴壁细胞中含有丰富的骨髓来源巨噬细胞。
[0038] 2.破骨细胞分化诱导接种第三天转染Sema4d siRNA,并更换培养基为破骨诱导培养基（10ng/ml M-CSF,
100ng/ml RANKL, 10%FBS）,隔天换液，第八至第十天观察破骨细胞形成情况。
100ng/ml RANKL, 10%FBS）,隔天换液，第八至第十天观察破骨细胞形成情况。
[0040] 实验结果及结论：Sema4d siRNA在干扰沉默Sema4d过程中不影响破骨前体细胞的破骨分化能力（图2）。
[0041] 实施例3研究干扰沉默Sema4d 的破骨细胞对骨髓间充质细胞迁移分化的影响实验步骤1.Transwell上室为骨髓间充质细胞，下室为转染/不转染Sema4d siRNA的破骨细胞，
6小时候固定染色，进行细胞计数。
6小时候固定染色，进行细胞计数。
[0042] 2.骨髓间充质细胞与转染/不转染Sema4d siRNA的破骨细胞共培养,均添加成骨诱导因子，每三天换液。
[0043] 3.取7天共培养或条件培养细胞进行ALP活性测定。
[0044] 4.取14天共培养或条件培养细胞进行RT-PCR分析RUNX2，COL1及BGLAP表达含量。
[0045] 5.取21天共培养或条件培养细胞进行茜素红染色，并进行定量分析其矿化能力。
[0046] 实验结果及结论1.破骨细胞在使用Sema4d siRNA干扰Semaphorin 4D合成后能抑制骨髓间充质细胞迁移（图3）。
[0047] 2.破骨细胞在使用Sema4d siRNA干扰Semaphorin 4D合成后能促进骨髓间充质细胞成骨分化。
[0048] 实施例4破骨细胞Sema4d 基因干扰用于骨质疏松症的预防与治疗实验步骤a.8周龄昆明小鼠双侧卵巢摘除术（OVX）或假手术（Sham），同期采取预防骨质疏松措施，或4周建立骨质疏松模型成功采取治疗措施，干预实施强度为每周给药1次，干预实施周期为4周。预防与治疗实验均分组情况如下：①Sham组，②OVX组（不采取任何治疗），③OVX+(STR-R8)组（载体），④OVX+ Scrambled siRNA-(STR-R8)组（无义siRNA对照），⑤OVX+Sema4d siRNA-(STR-R8)组（实验组）。并于干预开始三天后及取材前四天分别皮下注射钙黄绿素及茜素红。
[0049] b. 于八周实验开始及实验干预开始后每周，通过活体X光分析其长骨骨干柱密度动态变化。
[0050] c. 干预实施四周后取材双侧股骨、第三腰椎（L3）4%PFA固定后行microCT分析股骨远末端及椎骨松质骨骨量、骨密度及骨微结构变化。
[0051] d. 取材双侧胫腓骨，浸润于生理盐水中，万能力学试验机进行三点弯曲试验测定生物力学强度变化。
[0052] e. 将microCT扫描后股骨一半脱水后硬组织包埋切片，分析骨形成动态指标及骨组织形态学静态参数。
[0053] f．将microCT扫描后股骨另一半脱钙后石蜡包埋切片，免疫组化染色及TRAP染色，观察骨组织形态学情况。
[0054] 实验结果a． Sema4d siRNA-(STR-R8)在预防干预及治疗干预中均能增加骨干柱密度。
[0055] b． Sema4d siRNA-(STR-R8)在预防干预及治疗干预中均能增加股骨远末端及椎骨松质骨骨量、骨密度并维持或修复骨小梁正常结构（图4，和图6）。
[0056] c． Sema4d si RNA-(STR-R8)在预防干预及治疗干预中均能增加实验鼠胫腓骨生物机械力学强度。
[0057] d． Sema4d siRNA-(STR-R8)在预防干预及治疗干预中均能在不影响破骨骨吸收情况下增加成骨（图5和图7）。
[0058] 实验结论Sema4d siRNA-(STR-R8)能成功转染破骨细胞，并沉默Sema4d 靶基因，在不影响破骨骨吸收的情况下促进成骨活动，从而达到预防或治疗骨质疏松的目的。
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