开发动物模型的方法
阅读：741发布：2020-05-14
专利汇可以提供开发动物模型的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及开发突变动物的方法，其包括基因改造和那些携带自发突变的动物，来作为人类 疾病 模型。本发明具体提供了完整的技术，包括严格的特化和 质量 控制，来开发在 生物 医学研究和开发人类 治疗 剂使用的、用作活体分析系统的动物模型。，下面是开发动物模型的方法专利的具体信息内容。
1.建立突变动物系的方法，其包含如下步骤：
(a)在性不成熟突变起始动物(G0)中诱导超数排卵；
(b)使超数排卵的性不成熟突变起始动物受精；
(c)通过完成妊娠过程得到第一代突变动物(F1)；
(d)在第一代突变动物中确认突变的稳定性，基因型及遗传背景的同一 性；且如果需要，
(e)用突变动物的一或多代后代重复步骤(a)-(d)，
其中在每步骤中监视所有动物的遗传和环境因素并严格保证其相同。
2.权利要求1的所述方法，其中所述受精通过自然交配进行。
3.权利要求1的所述方法，其中所述受精通过如下进行：
(b.1)使从超数排卵的未成熟突变起始动物获得的卵母细胞体外受精；
(b.2)将所述受精的卵母细胞体外培养到早期胚胎阶段；并
(b.3)将所述胚胎引入受体动物。
4.权利要求3的所述方法，其中在步骤(b.2)中的受精的卵母细胞被培养 到两细胞胚阶段。
5.权利要求3的所述方法，其中所述早期胚胎在引入受体动物前被储藏 在胚胎库。
6.权利要求5的所述方法，其中所述早期胚胎被储藏在液氮温度。
7.权利要求1的所述方法，其中所述突变动物是转基因动物。
8.权利要求7的所述方法，其中所述转基因动物是小鼠。
9.权利要求8的所述方法，其中所述转基因起始动物在实现超数排卵时 是3-4周龄。
10.权利要求8的所述方法，其中所述转基因起始动物在实现超数排卵 时是4周龄。
11.权利要求8的所述方法，其中所述超数排卵是通过怀孕的纯血清促 性腺激素(PMSG)和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)来诱导的。
12.权利要求7的所述方法，其中步骤(d)中的基因型通过如下来确定：
(d1)对分离自转基因和相应的非-转基因动物的基因组DNA进行PCR 反应，使用如下PCR引物：(i)染色体特异性引物和转基因特异性引物，其以 相反方向结合到5′转基因/基因组接点附近的染色体和转基因，来确认所述 5′转基因/基因组接点；和(ii)两种转基因特异性引物，其以相反方向结合到 5′末端附近的转基因的片段来确认转基因/转基因接点，
(d2)根据大小或信号不同分离扩增的PCR产物，并
(d3)基于所述扩增的PCR产物的大小或信号类型来确定基因型，其中 所述PCR产物的大小或信号类型表明整合的转基因的拷贝数。
13.权利要求12的所述方法，其还包括在步骤(d1)中使用转基因特异性 引物和染色体特异性引物，其以相反方向，结合到3′转基因/基因组接点附 近的转基因和基因组，来确认所述3′转基因/基因组接点。
14.权利要求13的所述方法，其还包括在步骤(d1)中使用两种染色体特 异性引物，其以相反方向结合染色体/转基因接点附近的染色体，来确认所述 预整合位点。
15.权利要求12的所述方法，其中所述大小或信号类型通过Southern 印迹来确定。
16.权利要求1的所述方法，其中所述每代突变动物接受有计划的遗传 监视及抽查。
17.权利要求16的所述方法，其中所述遗传监视包括监视遗传背景中的 一或多种基因。
18.权利要求17的所述方法，其中所述遗传监视包括确保每代中突变动 物的遗传背景与起始动物的遗传背景相同。
19.权利要求1的所述方法，其中所述每代突变动物接受对其环境因素 的有计划监视及抽查。
20.权利要求19的所述方法，其中所述环境因素包括发育环境和周围环 境的因素。
21.权利要求11的所述方法，其中在突变动物的后代的产生过程中，只 包括只有具有与起始动物相同的基因型，表型和演出型的动物。
22.权利要求1的所述方法，其中对所述F1突变动物的背景品系的选 择根据所述品系对靶疾病的敏感性及生殖指数来进行。
23.权利要求22的所述方法，其中所述遗传背景被拓宽以便使遗传多样 性更广泛。
24.权利要求22的所述方法，其中对所选择的背景品系在构建靶疾病的 模型中的有用性在最终选择前要予以确认。
25.用权利要求1所述的方法产生的突变动物。
26.用权利要求1所述的方法产生的转基因动物。
27.用权利要求12所述的方法产生的转基因动物。
28.权利要求27所述的转基因动物，其为小鼠。
29.权利要求28所述的转基因小鼠，其为携带人c-Ha-ras转基因的 Tg-rasH2小鼠。
30.权利要求29所述的转基因小鼠，其可用于毒理学和致癌性的实验。
31.权利要求28所述的转基因小鼠，其为携带人类脊髓灰质炎病毒受 体(PVR)基因的TgPVR21小鼠。
32.权利要求31所述的转基因小鼠，其可用于评估3型或2型口服脊 髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的神经毒力。
技术领域
本发明涉及开发突变动物作为人类疾病模型的方法，所述动物包括被基 因改造的动物和携带自发突变的那些动物。本发明特别提供完整技术，包括 严格的说明和质量控制，用来开发在生物医学研究和开发人类治疗剂中可用 的活体分析系统的动物模型。
背景技术
突变动物，包括基因改造的动物例如转基因小鼠，和带有自发突变的动 物，它们最初在分子生物学领域用作动物模型。近年来，这种动物的用途已 经扩展到很多生命科学的其它分支，包括鉴定并研究疾病相关性基因，并且 开发靶向这些基因的药物。
尽管生物学的基础研究者在过去二十年已经产生并广泛应用了超过 10,000种基因操纵的动物，如转基因小鼠，敲除(knock-out)小鼠和敲入 (knock-in)小鼠，绝大多数的基因改造的动物作为研究工具和药物开发工具具 有严重缺陷。大多情况下，基因改造动物的生产者不能使所述动物通过全面 的，严格的并且可靠的确认过程，结果是不能确保所述动物在遗传和微生物 学方面上相同。这是个严重问题，因为转基因动物的遗传背景以及它们所暴 露的环境因素的不同，对它们的体内行为影响很大。每项遗传或环境不同都 导致所述基因改造动物的整体特征的很大不同。另外，因为基于专业知识选 择并确定遗传和微生物学控制，通常不由了解所述受试的人的疾病的专家来 操作，基因改造的动物作为可靠疾病模型的用途受限。
尽管生物学的基础研究者在过去二十年已经产生并广泛应用了超过 10,000种基因操纵的动物，如转基因小鼠，敲除(knock-out)小鼠和敲入 (knock-in)小鼠，绝大多数的基因改造的动物作为研究工具和药物开发工具具 有严重缺陷。大多情况下，基因改造动物的生产者不能使所述动物通过全面 的，严格的并且可靠的确认过程，结果是不能确保所述动物在遗传和微生物 学方面上相同。这是个严重问题，因为转基因动物的遗传背景以及它们所暴 露的环境因素的不同，对它们的体内行为影响很大。每项遗传或环境不同都 导致所述基因改造动物的整体特征的很大不同。另外，因为基于专业知识选 择并确定遗传和微生物学控制，通常不由了解所述受试的人的疾病的专家来 操作，基因改造的动物作为可靠疾病模型的用途受限。
发明内容
本发明一方面涉及的方法建立突变动物系(line)，其包含如下步骤：
(a)在性不成熟突变起始(founder)动物(G0)中诱导超数排卵 (superovulation)；
(b)使所述超数排卵的性不成熟突变起始动物受精；
(c)完成妊娠过程来传送第一代突变动物(F1)；
(d)确认第一代突变动物中所述突变的稳定性，基因型，以及遗传背景 的同一性；并且如果需要，
(e)对突变动物的一或多代后代重复步骤(a)-(d)，
其中在每步骤中监视所有动物的遗传和环境因素并严格保证其相同。
在一实施方案中，通过自然交配进行受精。
在其它实施方案中，受精通过如下进行：
(b.1)使从所述超数排卵的未成熟突变起始动物获得的卵母细胞在体外 受精；
(b.2)体外培养所述受精的卵母细胞到早期胚胎阶段；并且
(b.3)将所述胚胎引入受体动物。
在优选实施方案中，在上述步骤(b.2)中，将所述受精的卵母细胞培养到 两细胞胚(two-cell embryo)阶段。所述早期胚胎在引入受体动物前，通常以液 氮温度储藏在胚胎库中。
本发明不限于任何具体突变动物，并具体包括，不限于，所有非人突变 哺乳动物，包括小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，豚鼠及其它通常用于实验室试 验的动物。所述优选突变动物为突变小鼠，包括转基因的，敲入的，敲除的 和自发突变小鼠。在优选实施方案中，所述突变动物为转基因小鼠。
常见方案中(但不限于)，所述起始动物在实现超数排卵时为三到四周龄。 超数排卵可用任何传统方法诱导，所述方法包括，例如，使用怀孕的纯(mere) 血清促性腺激素(PMSG)和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)。
在优选实施方案中，在前述方法的步骤(d)中如下确定基因型：
(d1)用从转基因和相应的非-转基因动物分离的基因组DNA进行PCR 反应，所用PCR引物如下：(i)染色体特异性引物及转基因特异性引物，其 以相反方向结合到5′转基因/基因组接点(junction)附近的染色体及转基因， 来确认所述5′转基因/基因组接点；和(ii)两转基因特异性引物，其以相反方 向结合到5′末端附近的转基因片段来确认转基因/转基因的接点，
(d2)根据大小分离所述扩增的PCR产物，并且
(d3)基于所述扩增的PCR产物的大小类型来确定基因型，其中所述 PCR产物的大小类型表明整合的转基因拷贝数。
所述方法还可包含在步骤(d1)中，用转基因特异性引物及染色体特异性 引物，以相反方向，结合到3′转基因/基因组接点附近的所述转基因及基因 组，来确认所述3′转基因/基因组接点。
在其它实施方案中，所述方法还可包含在步骤(d1)中，用两染色体特异 性引物，以相反方向，结合到染色体/转基因接点附近的染色体，来确认所述 预整合位点。
在常见方案中，所述突变例如转基因的动物的每代都受到计划的 (scheduled)遗传监视和抽查。优选，遗传监视包括监视遗传背景中的一或多 基因。
优选，突变动物的每代受到环境因素的计划的监视和抽查，其中所述环 境因素包括发育和周围环境的因素。最优选地，只有与起始动物具有相同基 因型，表型及演出型(dramatype)的动物被包括在突变的，例如转基因的动物 的后代的生产中。
在另一方面，本发明涉及由前述方法产生的突变动物。所述突变动物能 例如，为转基因小鼠，如携带人c-Ha-ras转基因的Tg-rasH2小鼠，或携带 人类脊髓灰质炎病毒受体(PVR)基因的TgPVR21小鼠。
附图简述
图1是图示了影响动物试验结果的主要因素。
图2图示了本发明遗传和环境因素的控制。
图3显示在开发本发明动物试验系统作为部分质量保证实验(quality assurance test)进行控制的因素。
图4图示了本发明的“超速”同类系(congenic)方法。
图5根据所述目标阐述两种遗传质量实验。
图6显示通过双链(duplex)PCR对转基因动物的基因分型(genotyping)。
图7显示由FISH方法确定整合到N15和N20的Tg-rasH2小鼠的转基 因的染色体定位。在两种情况下在染色体15E3区域观察到指示转基因位置 的成对荧光信号。所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以仅在一对姐妹染色单 体中发现所述杂交信号。
图8显示整合到Tg-rasH2小鼠的转基因的Southern印迹分析(Southern blot analysis)的结果。(A)Tg-rasH2小鼠中的转基因(人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段)的限制酶切图谱和结构。开放的盒子表示四种编码人c-Ha-ras 蛋白质的外显子(Ex1到Ex4)。识别XbaI的上游区域的DIG-标记的5′-探针 用开放的圈和柱表示。(B)来自N15和N20的非-转基因和Tg-rasH2小鼠的 基因组DNA用BamHI消化，在0.6％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜。 所述膜与DIG-标记的随机引物探针杂交。从非-转基因小鼠(第1道)，N15 的Tg-rasH2小鼠(第2和3道)及N20的Tg-rasH2小鼠(第4和5道)获得DNA 样品。(C)用限制性核酸内切酶消化来自N20的Tg-rasH2小鼠的基因组DNA (第1道；BamHI，2；HpaI，3；XhoI，4；XbaI，5；NcoI，6；BglII，7；SacI，8； HindIII)，在0.6％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。所述膜与DIG- 标记的5′-探针杂交。所述信号用化学发光碱性磷酸酶底物并在X-射线相片 上检测。
图9显示Tg-rasH2小鼠的整合的Northern印迹分析(Northern blot analysis)结果。在N15和N20的人c-Ha-ras mRNA在Tg-rasH2小鼠表达。 在福尔马林-琼脂糖凝胶上分级分离10微克总RNA样品(B，L和F分别表 示脑，肺和前胃)，并将其转移到尼龙膜。所述膜与[α-32P]-dCTP标记的人 c-Ha-ras基因(c-Ha-ras)探针杂交，然后与[α-32P]-dCTP标记的人甘油醛-3- 磷酸脱氢酶cDNA(GAPDH)探针再次杂交。nTg和Tg显示分别从非-转基因 和Tg-rasH2小鼠获得的样品。在X-射线相片上检测所述信号。
图10显示Southern印迹杂交的结果，其确定整合到Tg-rasH2小鼠的人 c-Ha-ras基因的精确拷贝数。用BamHI(第1道)和HindIII(第2道)完全消 化来自N20的Tg-rasH2小鼠的基因组DNA。将HindIII消化的基因组DNA 用多种浓度的BamHI(第3-5道)进一步消化。然后将消化后的DNA在0.4％ 琼脂糖凝胶上电泳该并转移到尼龙膜上。所述膜与DIG-标记的随机引物探 针杂交。用化学发光的碱性磷酸酶底物并在X-射线相片上检测所述信号。 标记泳道的M，Expand TM DNA分子量标记物(molecular weight marker)(Roche Diagno stics GmbH)。
图11说明PCR确认基因组/转基因接点的结果。(A)用如下引物组进行 来自Tg-rasH2(T)和非-转基因(N)小鼠的基因组DNA的PCR：确认5’基因组/ 转基因接点；确认3′转基因/基因组接点的染色体特异性引物A和转基因特 异性引物C；鉴定预整合位点的转基因特异性引物D和染色体特异性引物 B；确认转基因/转基因接点的染色体特异性引物A和B；转基因特异性引 物D和C。(B)用限制性核酸内切酶BamHI消化用D和C引物产生的PCR 产物，来确认转基因/转基因接点的完整性。用100-bp DNA梯(ladder)作为 DNA大小标记物。(C)三个转基因在小鼠基因组上的间断位点。所述人 c-Ha-ras转基因以从头至尾的串联排列存在(实心盒子显示外显子)。箭头指 示了所用寡核苷酸的位置和方向，箭头尖端表示所述寡核苷酸的3′末端。
图12表示在Tg-rasH2小鼠的基因组/转基因接点的序列分析结果。也显 示非-转基因小鼠DNA及注射的DNA的对应区域用来比较。星号表示相同 的核苷酸，盒子的区域表示与在重组位点的核苷酸的同一性。水平箭头表示 拓扑异构酶I共同序列(5′-A/T-G/C-T/A-T-3′)。
图13从微生物控制和有计划生产方面说明胚胎库设备(facility)。
图14解释说明了替代的微生物学控制方法(Alternative Microbiological Control Method)。
图15图示说明了本发明的有计划的生产和供给系统(Blanned Production and Supply System)。
图16显示整合到TgPVR21小鼠的PVR转基因的FISH分析和染色体定 位的结果。
图17显示TgPVR21小鼠的PVR转基因Southern印迹分析的结果。
图18表示RNA印迹，RT-PCR和直接序列分析的结果，其来确定PVR mRNA在TgPVR21小鼠中的基因表达的图谱。
图19表示PVR-α，-β，和-γmRNA的结构，和探针，引物及测序的位 点。
图20表示TgPVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的结构。
图21表示TgPVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的限制性酶切图 谱。
图22表示TgpVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的测序结果。
图23显示相对于克隆2833685确定TgPVR21小鼠中所述转基因/小鼠 基因组接点区域的上游位点的结构。
图24用图说明本发明的生产和确认系统。
图25表示N-甲基-N-硝基脲(MNU)阳性对照的肿瘤发病率；前胃乳头状 瘤(单次腹腔内注射(i.p.)/75mg/kg)。
图26表示MNU阳性对照的肿瘤发病率；恶性淋巴癌(单次腹腔内注 射/75mg/kg)。
表A是表示用于本申请试验的材料和方法的图表。
(a)在性不成熟突变起始(founder)动物(G0)中诱导超数排卵 (superovulation)；
(b)使所述超数排卵的性不成熟突变起始动物受精；
(c)完成妊娠过程来传送第一代突变动物(F1)；
(d)确认第一代突变动物中所述突变的稳定性，基因型，以及遗传背景 的同一性；并且如果需要，
(e)对突变动物的一或多代后代重复步骤(a)-(d)，
其中在每步骤中监视所有动物的遗传和环境因素并严格保证其相同。
在一实施方案中，通过自然交配进行受精。
在其它实施方案中，受精通过如下进行：
(b.1)使从所述超数排卵的未成熟突变起始动物获得的卵母细胞在体外 受精；
(b.2)体外培养所述受精的卵母细胞到早期胚胎阶段；并且
(b.3)将所述胚胎引入受体动物。
在优选实施方案中，在上述步骤(b.2)中，将所述受精的卵母细胞培养到 两细胞胚(two-cell embryo)阶段。所述早期胚胎在引入受体动物前，通常以液 氮温度储藏在胚胎库中。
本发明不限于任何具体突变动物，并具体包括，不限于，所有非人突变 哺乳动物，包括小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，豚鼠及其它通常用于实验室试 验的动物。所述优选突变动物为突变小鼠，包括转基因的，敲入的，敲除的 和自发突变小鼠。在优选实施方案中，所述突变动物为转基因小鼠。
常见方案中(但不限于)，所述起始动物在实现超数排卵时为三到四周龄。 超数排卵可用任何传统方法诱导，所述方法包括，例如，使用怀孕的纯(mere) 血清促性腺激素(PMSG)和人类绒毛膜促性腺激素(hCG)。
在优选实施方案中，在前述方法的步骤(d)中如下确定基因型：
(d1)用从转基因和相应的非-转基因动物分离的基因组DNA进行PCR 反应，所用PCR引物如下：(i)染色体特异性引物及转基因特异性引物，其 以相反方向结合到5′转基因/基因组接点(junction)附近的染色体及转基因， 来确认所述5′转基因/基因组接点；和(ii)两转基因特异性引物，其以相反方 向结合到5′末端附近的转基因片段来确认转基因/转基因的接点，
(d2)根据大小分离所述扩增的PCR产物，并且
(d3)基于所述扩增的PCR产物的大小类型来确定基因型，其中所述 PCR产物的大小类型表明整合的转基因拷贝数。
所述方法还可包含在步骤(d1)中，用转基因特异性引物及染色体特异性 引物，以相反方向，结合到3′转基因/基因组接点附近的所述转基因及基因 组，来确认所述3′转基因/基因组接点。
在其它实施方案中，所述方法还可包含在步骤(d1)中，用两染色体特异 性引物，以相反方向，结合到染色体/转基因接点附近的染色体，来确认所述 预整合位点。
在常见方案中，所述突变例如转基因的动物的每代都受到计划的 (scheduled)遗传监视和抽查。优选，遗传监视包括监视遗传背景中的一或多 基因。
优选，突变动物的每代受到环境因素的计划的监视和抽查，其中所述环 境因素包括发育和周围环境的因素。最优选地，只有与起始动物具有相同基 因型，表型及演出型(dramatype)的动物被包括在突变的，例如转基因的动物 的后代的生产中。
在另一方面，本发明涉及由前述方法产生的突变动物。所述突变动物能 例如，为转基因小鼠，如携带人c-Ha-ras转基因的Tg-rasH2小鼠，或携带 人类脊髓灰质炎病毒受体(PVR)基因的TgPVR21小鼠。
附图简述
图1是图示了影响动物试验结果的主要因素。
图2图示了本发明遗传和环境因素的控制。
图3显示在开发本发明动物试验系统作为部分质量保证实验(quality assurance test)进行控制的因素。
图4图示了本发明的“超速”同类系(congenic)方法。
图5根据所述目标阐述两种遗传质量实验。
图6显示通过双链(duplex)PCR对转基因动物的基因分型(genotyping)。
图7显示由FISH方法确定整合到N15和N20的Tg-rasH2小鼠的转基 因的染色体定位。在两种情况下在染色体15E3区域观察到指示转基因位置 的成对荧光信号。所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以仅在一对姐妹染色单 体中发现所述杂交信号。
图8显示整合到Tg-rasH2小鼠的转基因的Southern印迹分析(Southern blot analysis)的结果。(A)Tg-rasH2小鼠中的转基因(人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段)的限制酶切图谱和结构。开放的盒子表示四种编码人c-Ha-ras 蛋白质的外显子(Ex1到Ex4)。识别XbaI的上游区域的DIG-标记的5′-探针 用开放的圈和柱表示。(B)来自N15和N20的非-转基因和Tg-rasH2小鼠的 基因组DNA用BamHI消化，在0.6％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜。 所述膜与DIG-标记的随机引物探针杂交。从非-转基因小鼠(第1道)，N15 的Tg-rasH2小鼠(第2和3道)及N20的Tg-rasH2小鼠(第4和5道)获得DNA 样品。(C)用限制性核酸内切酶消化来自N20的Tg-rasH2小鼠的基因组DNA (第1道；BamHI，2；HpaI，3；XhoI，4；XbaI，5；NcoI，6；BglII，7；SacI，8； HindIII)，在0.6％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜上。所述膜与DIG- 标记的5′-探针杂交。所述信号用化学发光碱性磷酸酶底物并在X-射线相片 上检测。
图9显示Tg-rasH2小鼠的整合的Northern印迹分析(Northern blot analysis)结果。在N15和N20的人c-Ha-ras mRNA在Tg-rasH2小鼠表达。 在福尔马林-琼脂糖凝胶上分级分离10微克总RNA样品(B，L和F分别表 示脑，肺和前胃)，并将其转移到尼龙膜。所述膜与[α-32P]-dCTP标记的人 c-Ha-ras基因(c-Ha-ras)探针杂交，然后与[α-32P]-dCTP标记的人甘油醛-3- 磷酸脱氢酶cDNA(GAPDH)探针再次杂交。nTg和Tg显示分别从非-转基因 和Tg-rasH2小鼠获得的样品。在X-射线相片上检测所述信号。
图10显示Southern印迹杂交的结果，其确定整合到Tg-rasH2小鼠的人 c-Ha-ras基因的精确拷贝数。用BamHI(第1道)和HindIII(第2道)完全消 化来自N20的Tg-rasH2小鼠的基因组DNA。将HindIII消化的基因组DNA 用多种浓度的BamHI(第3-5道)进一步消化。然后将消化后的DNA在0.4％ 琼脂糖凝胶上电泳该并转移到尼龙膜上。所述膜与DIG-标记的随机引物探 针杂交。用化学发光的碱性磷酸酶底物并在X-射线相片上检测所述信号。 标记泳道的M，Expand TM DNA分子量标记物(molecular weight marker)(Roche Diagno stics GmbH)。
图11说明PCR确认基因组/转基因接点的结果。(A)用如下引物组进行 来自Tg-rasH2(T)和非-转基因(N)小鼠的基因组DNA的PCR：确认5’基因组/ 转基因接点；确认3′转基因/基因组接点的染色体特异性引物A和转基因特 异性引物C；鉴定预整合位点的转基因特异性引物D和染色体特异性引物 B；确认转基因/转基因接点的染色体特异性引物A和B；转基因特异性引 物D和C。(B)用限制性核酸内切酶BamHI消化用D和C引物产生的PCR 产物，来确认转基因/转基因接点的完整性。用100-bp DNA梯(ladder)作为 DNA大小标记物。(C)三个转基因在小鼠基因组上的间断位点。所述人 c-Ha-ras转基因以从头至尾的串联排列存在(实心盒子显示外显子)。箭头指 示了所用寡核苷酸的位置和方向，箭头尖端表示所述寡核苷酸的3′末端。
图12表示在Tg-rasH2小鼠的基因组/转基因接点的序列分析结果。也显 示非-转基因小鼠DNA及注射的DNA的对应区域用来比较。星号表示相同 的核苷酸，盒子的区域表示与在重组位点的核苷酸的同一性。水平箭头表示 拓扑异构酶I共同序列(5′-A/T-G/C-T/A-T-3′)。
图13从微生物控制和有计划生产方面说明胚胎库设备(facility)。
图14解释说明了替代的微生物学控制方法(Alternative Microbiological Control Method)。
图15图示说明了本发明的有计划的生产和供给系统(Blanned Production and Supply System)。
图16显示整合到TgPVR21小鼠的PVR转基因的FISH分析和染色体定 位的结果。
图17显示TgPVR21小鼠的PVR转基因Southern印迹分析的结果。
图18表示RNA印迹，RT-PCR和直接序列分析的结果，其来确定PVR mRNA在TgPVR21小鼠中的基因表达的图谱。
图19表示PVR-α，-β，和-γmRNA的结构，和探针，引物及测序的位 点。
图20表示TgPVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的结构。
图21表示TgPVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的限制性酶切图 谱。
图22表示TgpVR21转基因小鼠中5′基因组/转基因接点的测序结果。
图23显示相对于克隆2833685确定TgPVR21小鼠中所述转基因/小鼠 基因组接点区域的上游位点的结构。
图24用图说明本发明的生产和确认系统。
图25表示N-甲基-N-硝基脲(MNU)阳性对照的肿瘤发病率；前胃乳头状 瘤(单次腹腔内注射(i.p.)/75mg/kg)。
图26表示MNU阳性对照的肿瘤发病率；恶性淋巴癌(单次腹腔内注 射/75mg/kg)。
表A是表示用于本申请试验的材料和方法的图表。
发明内容
定义
术语“突变”动物以最宽的范围使用，并具体包括基因改造的(基因操 纵的)动物，如转基因，敲除和敲入动物，以及携带自发突变和人工诱变产 生的一或多种基因突变的动物。
术语“遗传改造的”和“基因操纵的”互换使用，并指转基因，敲入和 敲除动物。
本文术语“卵”在对于哺乳动物的卵时，指被透明带和大量丘细胞(滤 泡细胞)及其相伴的蛋白聚糖所包围的卵母细胞。术语“卵”指从卵巢中的 滤泡腔回收的卵(这些卵包含未成熟卵母细胞)，以及已经从滤泡腔(破裂的滤 泡)释放的卵。
本文术语“卵母细胞”指雌性配子细胞并包括初级卵母细胞，次级卵母 细胞和成熟的、未受精的卵子。卵母细胞是具有为卵细胞质所包围的大细胞 核(即生发泡(germinal vesicle))的大细胞。所述卵细胞质包含无核胞浆内容 物，包括mRNA，核糖体，线粒体，卵黄蛋白质等。所述卵母细胞的膜在本 文称为“浆膜”。
术语“半合子”对于转基因动物指所述转基因动物携带野生型基因的单 倍体和转基因的单倍体(或在整合了超过一个拷贝的转基因时，指转基因组 (set)的单倍体)。
术语“生殖体”指性染色体。在哺乳动物，X和Y染色体确定个体的 性别。雌性有两条X染色体，而雄性有一条X和一条Y染色体。
术语“半合子的”对于遗传修饰的，如转基因的本文的动物来说，指对 于所述基因如转基因是半合子。
术语“纯合子”指二倍体基因型，其中给定基因的两个等位基因相同。 对于转基因动物，该术语指所述动物携带二倍体的所述转基因(或当整合了 所述转基因的一个拷贝以上时，为转基因的组的二倍体)。
术语“杂合子”指二倍体基因型，其中给定基因的两个等位基因不同。
术语“转基因动物”指经人类干预通过引入重组DNA而改变的动物。 这包括具有可遗传的种系DNA的改变的动物，及带有体细胞非-遗传性改变 的动物。术语“转基因”指核酸(DNA)，其(1)被引入体细胞细胞，或(2)稳定 整合到其动物宿主品系的种系，并可传递至后代。
术语“基因型”指所有生物体携带的“内部编码的，可遗传的信息”。 此储存的信息被用作“蓝本(blueprint)”或用于构建并维持活生物体的指令组。 差不多在所有细胞(“内部”部分)内发现这些指令，其以编码语言(遗传密码) 记录，它们在细胞分裂或繁殖时复制，并从一代传到下一代(“可遗传的”)。 这些指令与细胞或生物体的生命的所有方面有密切关系。所述“基因型”控 制从蛋白质大分子形成到代谢及合成的调节的任何事。
术语“表型”指生物体的“外向，物理表现”。这些是物理部分，原子， 分子，大分子，细胞，结构，代谢，能量利用，组织，器官，反射和行为的 总和；是生物体的可观察结构，功能或行为的任何部分。
术语“演出型”指在试验动物的单次生理反应中的行为表现类型。所述 反应的变异是两种因素的共同产物：表型自身，和检测动物的周围环境状况， 如，温度，湿度，饮食，研究者和动物保护人员等。对于同样的演出型，检 测动物的环境状况必须严格控制。
术语“同类系动物”指通过与近交(背景)的品系重复回交(back-cross)，选 择来自供体品系的具体标记物产生的动物品系(strain)。
术语“杂种动物”指动物，例如小鼠或大鼠，它是两个近交品系的后代， 在相同方向杂交(cross)，它在遗传上是相同的，并用两个亲代的大写缩写来 命名(先列母本(maternal)品系，然后是F1。
术语“有计划的监控”指规律进行的检查，并且通过标准方法来确保已 经限定的动物的遗传和微生物学的质量在整个时间内是稳定的。这通过比较 所限定的小鼠及相应的近交品系的遗传和微生物学图谱来完成。此种有计划 的监控提供的信息不仅关于保持动物健康而且关于保持特定的质量。结果 是，试验动物可视为“活体测量工具”。它们的独特性在于，与物理化学测 量所用的工具相反，它们天天都在改变。所以，监控试验动物的质量对它们 的目的用途是必需的。此需要与宠物或养殖(farm)动物无关。
术语“抽查”指非计划性的动物检查，它以不规律的间隔进行来确定所 述动物是否已经经历任何感染或遗传污染。
术语“两层(layer)监控”指将有计划的监控和抽查结合起来的监控系统。
术语“悉生生物”指衍生自无菌外科手术或从卵无菌孵化的动物品系， 它用无菌技术在隔离器环境饲养并保持，并且其中相关的动物志和菌群组分 (如果有的话)，用可接受的现有方法完全限定。
术语“突变”动物以最宽的范围使用，并具体包括基因改造的(基因操 纵的)动物，如转基因，敲除和敲入动物，以及携带自发突变和人工诱变产 生的一或多种基因突变的动物。
术语“遗传改造的”和“基因操纵的”互换使用，并指转基因，敲入和 敲除动物。
本文术语“卵”在对于哺乳动物的卵时，指被透明带和大量丘细胞(滤 泡细胞)及其相伴的蛋白聚糖所包围的卵母细胞。术语“卵”指从卵巢中的 滤泡腔回收的卵(这些卵包含未成熟卵母细胞)，以及已经从滤泡腔(破裂的滤 泡)释放的卵。
本文术语“卵母细胞”指雌性配子细胞并包括初级卵母细胞，次级卵母 细胞和成熟的、未受精的卵子。卵母细胞是具有为卵细胞质所包围的大细胞 核(即生发泡(germinal vesicle))的大细胞。所述卵细胞质包含无核胞浆内容 物，包括mRNA，核糖体，线粒体，卵黄蛋白质等。所述卵母细胞的膜在本 文称为“浆膜”。
术语“半合子”对于转基因动物指所述转基因动物携带野生型基因的单 倍体和转基因的单倍体(或在整合了超过一个拷贝的转基因时，指转基因组 (set)的单倍体)。
术语“生殖体”指性染色体。在哺乳动物，X和Y染色体确定个体的 性别。雌性有两条X染色体，而雄性有一条X和一条Y染色体。
术语“半合子的”对于遗传修饰的，如转基因的本文的动物来说，指对 于所述基因如转基因是半合子。
术语“纯合子”指二倍体基因型，其中给定基因的两个等位基因相同。 对于转基因动物，该术语指所述动物携带二倍体的所述转基因(或当整合了 所述转基因的一个拷贝以上时，为转基因的组的二倍体)。
术语“杂合子”指二倍体基因型，其中给定基因的两个等位基因不同。
术语“转基因动物”指经人类干预通过引入重组DNA而改变的动物。 这包括具有可遗传的种系DNA的改变的动物，及带有体细胞非-遗传性改变 的动物。术语“转基因”指核酸(DNA)，其(1)被引入体细胞细胞，或(2)稳定 整合到其动物宿主品系的种系，并可传递至后代。
术语“基因型”指所有生物体携带的“内部编码的，可遗传的信息”。 此储存的信息被用作“蓝本(blueprint)”或用于构建并维持活生物体的指令组。 差不多在所有细胞(“内部”部分)内发现这些指令，其以编码语言(遗传密码) 记录，它们在细胞分裂或繁殖时复制，并从一代传到下一代(“可遗传的”)。 这些指令与细胞或生物体的生命的所有方面有密切关系。所述“基因型”控 制从蛋白质大分子形成到代谢及合成的调节的任何事。
术语“表型”指生物体的“外向，物理表现”。这些是物理部分，原子， 分子，大分子，细胞，结构，代谢，能量利用，组织，器官，反射和行为的 总和；是生物体的可观察结构，功能或行为的任何部分。
术语“演出型”指在试验动物的单次生理反应中的行为表现类型。所述 反应的变异是两种因素的共同产物：表型自身，和检测动物的周围环境状况， 如，温度，湿度，饮食，研究者和动物保护人员等。对于同样的演出型，检 测动物的环境状况必须严格控制。
术语“同类系动物”指通过与近交(背景)的品系重复回交(back-cross)，选 择来自供体品系的具体标记物产生的动物品系(strain)。
术语“杂种动物”指动物，例如小鼠或大鼠，它是两个近交品系的后代， 在相同方向杂交(cross)，它在遗传上是相同的，并用两个亲代的大写缩写来 命名(先列母本(maternal)品系，然后是F1。
术语“有计划的监控”指规律进行的检查，并且通过标准方法来确保已 经限定的动物的遗传和微生物学的质量在整个时间内是稳定的。这通过比较 所限定的小鼠及相应的近交品系的遗传和微生物学图谱来完成。此种有计划 的监控提供的信息不仅关于保持动物健康而且关于保持特定的质量。结果 是，试验动物可视为“活体测量工具”。它们的独特性在于，与物理化学测 量所用的工具相反，它们天天都在改变。所以，监控试验动物的质量对它们 的目的用途是必需的。此需要与宠物或养殖(farm)动物无关。
术语“抽查”指非计划性的动物检查，它以不规律的间隔进行来确定所 述动物是否已经经历任何感染或遗传污染。
术语“两层(layer)监控”指将有计划的监控和抽查结合起来的监控系统。
术语“悉生生物”指衍生自无菌外科手术或从卵无菌孵化的动物品系， 它用无菌技术在隔离器环境饲养并保持，并且其中相关的动物志和菌群组分 (如果有的话)，用可接受的现有方法完全限定。
发明内容
本发明涉及完整的生产及供给系统来设计并使突变体如基因改造的动 物或带有自发突变的动物发育，其能用作生物医学研究和药物开发的可靠工 具。如上所述，所述突变的试验动物必须所有性状完全相同，哪怕是多种遗 传和/或环境因素的最轻微的不同也会显著影响动物试验的结果。具体的是， 所有动物必须具有相同的基因型，表型和演出型，并必须经历相同的发育环 境(母体影响)及周围环境。显著影响动物试验结果的这些因素的说明见图1。 为了实现这个目标，已经开发了新的生产和确认系统来使突变例如基因改造 的动物模型发育，它可被看作活体分析系统(体内试验系统)，正像完备建立 的物理化学分析系统一样是可再现的(reproducible)。图24图示了新的生产和 确认系统。在此系统中，所有影响所述动物性状的因素被严格控制。这包括 了对该动物自身的严格控制(例如，种，品系，及它们的混合生殖以产生杂 交动物，性别，年龄，窝(litter)大小，及体重)，它们的生境(habitat)(例如， 垫料(bedding)，动物室等)，物理化学因素(例如，气味，光照，噪音)，气候 (例如，流速，湿度，温度)，营养(例如，饮食，水，暴露于致癌物质)，微 生物(例如，感染，正常菌群的质量)，及人类因素(例如，动物看管者，研究 者等)。另外，试验动物学的专家和受试动物疾病的专家已经设计、选择并 确定了遗传控制的背景品系和遗传多样性之间的平衡。这些因素见图2图示。
开始开发用作“活体实验工具”的标准化的实验动物，其第一步骤是根 据同样的遗传和微生物学质量说明制备参照(reference)动物，之后第二步骤 是通过建立有计划的生产系统来获得足够数量的相同动物，来评估它们在任 何具体的动物试验中的可用性和局限性。在此步骤后，可建立成百或者甚至 上千标准化的动物，并使其接受全面评估来确定它们在建立基因改造的动物 模型之前用作模型系统的可用性和局限性。在标准化的基因改造的动物模型 的实际开发中重要的第三步骤，涉及使用特征明确的可靠动物模型来建立完 整的“体内试验系统”，来使基因改造的动物，如转基因小鼠被用作人类疾 病或生物医学和药理研究的其它领域的可靠模型。通常，实验动物学家对第 一步骤负责，医学或药理研究者用所述动物模型完成第三步骤，而两组研究 者都参与第二步骤。尽管参照转基因动物来说明此系统，本发明不应如此受 限。本发明方法对其它突变动物，包括所有类型的基因改造的(基因操纵的) 动物以及携带一或多种自发突变的动物是同样适用的。
步骤1：用同样的遗传和微生物学质量标准制备参照动物
传统上，开发转基因动物包括如下步骤：(1)通过显微注射将DNA引入 小鼠的卵，或通过逆转录病毒载体或其它方法引入胚胎干细胞(ES细胞)；(2) 用可靠的基因型分析检测，例如通过PCR或Southern印迹(起始动物)来确认 所述转基因已被整合并转移；(3)通过克隆或有性生殖来增殖；以及(4)质量 控制，其包括遗传质量控制(遗传图谱监控)，所述质量控制使用生物化学标 记物和微生物质量控制，之后是微生物监控系统。因为即使是小的变化也可 使动物在实验室试验中如何表现产生显著不同，所以监控并保证每步骤的质 量，以及保持这些繁殖群体(breeding colony)的优异，对于突变的例如基因改 造的动物模型的可靠性都是必需的。本发明在此整体过程的每个步骤中有明 显改进。
本发明特别提供了群的规范(specification)，其包括在开发用于体内试验 的实验动物过程中的(1)遗传质量保证(超速同类系方法)以及(2)微生物学保 证(两层监控)。生殖过程的此部分被称为“群(population)阶段”。另外，本 发明提供了“有计划的生产和供给系统”，其包括(1)实时(ongoing)监控突变 体例如转基因的稳定性和功能，(2)风险管理系统(大量保存(bulk preservation))，(3)增殖性改造技术，及(4)为所述模型的具体目的选择背景品 系，并且如果必要，拓宽遗传背景来使遗传多样性变宽但可再现并可重复。
遗传质量保证(开发同类系动物的超速方法)
本发明的遗传质量保证步骤，包括用相同的遗传和微生物学质量标准， 以及加速(speed)同类系的方法和技术，制备并确认参照突变的如转基因的动 物，例如小鼠，之后通过在有计划的基础上的遗传监控，来确保保持所期望 的质量。在此步骤中，本发明不仅确保在转基因动物的情况下适当插入所述 转基因，而且确保所述小鼠或其它突变动物的背景基因的同一性。确保突变 动物的遗传背景也是相同的，其重要性在于在遗传背景不是100％同一时， 所述突变动物可能失去亲代动物的表型。例如，p53+/-小鼠由于此原因已经 显示了复杂的表型。本发明此步骤所带来的主要改进在于使该过程加速，即 缩短建立同类系动物所必需的时间，而且应用了两层遗传监控系统。
开发新的如转基因，敲除或敲入的突变动物系通常需要小心地回交至少 5代，更常见至少9代，通常多到12代来在具体的近交(in-bread)动物，如小 鼠品系中建立遗传操纵或自发突变。此方法的结果是在数代后，在固定的遗 传背景下，建立例如转基因，敲除或敲入的突变动物模型，称为“同类系的”。 接受体外受精的动物通常至少大约两月龄，并且怀孕期是19天，这表示每 代的生产需要差不多三个月。所以，建立同类系动物品系是很长的过程，它 通常需数年。本发明提供了建立同类系动物种系的高速方法。根据本发明， 处理每代雌性动物例如小鼠来使其超数排卵，并在大约4周龄接受体外受精。 通常给16日龄的雌性小鼠注射PMSG之后在第28天注射hCG来使其超数 排卵。第29天，所述小鼠自然交配或接受体外受精。第30天，收集两细胞 胚并移植到假孕受体。因为怀孕周期是19天，所以在第49天出现分娩。可 以容易地看到，在每代使用非典型性幼龄(约4周)的动物会显著缩短建立同 类系种系所需要的时间。此方法用图4图示，并更具体地在实施例1中对其 进行描述。
类似方法可用于从表现为低排卵能力的种系生产同类系动物。
微生物学质量保证-替代的微生物质量控制方法
所述微生物环境是影响实验动物演出型的主要因素之一。公知的事实是 爆发微生物感染改变了实验动物的健康，结果是实验结果如生殖及血液化学 表现(Nornura，T.Genetic and microbiological control.In：Immune-Deficient Animals(Sordat，B.等著)，S.Karger AG，Basel，1984.；Itoh，T.等，Expr.Anim.， 30：491-495，1981；Itoh，T.等，Jpn.J.Vet.Sci.40：615-618，1978；Iwai，H.等， Expr.Anim.26：205-212，1977)。并且Narushima等(Narushima等，Exp Anim 47(2)：111-7(1998))阐述肠细菌在转基因rasH2小鼠中改变对致癌物质的反 应。这些发现强有力地表明严格控制微生物环境对于确保实验动物演出型质 量是不可缺少的。另外，应特别注意遗传改造的动物的微生物质量控制，因 为动物的遗传改变可导致免疫感受态(competence)的修饰。也存在表现为裸 鼠独特的(peculiar)感染。所以，严格的微生物控制是开发实验动物模型的必 需部分。
根据上述发明，使精制的(refined)肠细菌菌群在动物即小鼠中建群，并 在严格屏障系统中饲养所述小鼠。如果动物来自其它研究所(institution)，其 中动物被保留在传统设施中而无严格控制的微生物监控，那么所述动物必须 用替代的微生物质量控制方法(AMQCM)来清洁，该方法是本发明的一个完 整部分。通过应用所述AMQCM，可以显著减少动物模型开发阶段的微生物 控制的花费和时间。进行所述两层监控来确保此微生物质量。
本发明相应地提供了计划性生产遗传改造动物并严格确保它们的肠细 菌菌群的微生物质量的新方法。体外受精(IVF)，胚胎深低温保藏，胚胎转移， 由受体和/或代孕母亲喂养的步骤都包含在本方法中。
具体地，对来自疑似有微生物感染的动物的卵子和精子进行IVF来获得 无菌胚胎。将所述胚胎转移到受体小鼠的子宫。来自感染小鼠的精子和卵子 的IVF-胚胎的乳鼠(Pup)在微生物学上是洁净的。严格控制的小鼠原种(stock) 提供了受体和代孕母亲小鼠，其中精制的肠细菌菌群在所述原种小鼠中(AC 原种)建群，从而使乳鼠在哺乳阶段具有相同的菌群。
在替代的微生物质量控制方法中，除了顺序的(ordinal)屏障动物饲养系 统如乙烯基隔离器(vinyl isolator)，还使用一种现代的新设计的胚胎库设备。 所述胚胎库设备包含三个单元1)检疫单元(QU)，2)胚胎操纵及冷冻单元 (EMFU)，和3)回收单元(RU)。所述胚胎库设备的实施例以图13图示。此 QU包含暂存(moor)微生物上不确定的供体的动物室，及收集配子(gamate)(卵 子和精子)的无菌仪器。所述EMFU包括提供给微生物上洁净的供体的动物 室，为收集配子的无菌设备，无菌的IVF和冷冻设备，及存放液氮罐(tank) 的室。所述RU包括给受体，胚胎转移，喂养并饲养的室。所述EMFU和 RU装备了用QU隔离的屏障系统(过滤的正压(positive)气体调节，高压灭菌 (autoclave)，更衣室，等)。在带有过滤正压气体调节的QU中使用乙烯基隔 离器或负压动物饲养仪器。在RU的每个室之间，以及屏障区外部(outside) 与RU每个室之间装备无菌锁以便于转移受体和代孕母亲，胚胎等。在配子 收集及IVF设备之间装备传递(Pass)盒子，以及便于转移无菌管。
除了这些设备，还为无菌和悉生生物动物装备了隔离系统，其中精制的 肠细菌菌群在这些动物(AC原种)中建群。用乙烯基隔离系统将这些动物通 过无菌锁带入RU。
所述替代的微生物质量控制方法见图14图示。将疑似爆发或微生物上 不确定的动物即小鼠置于QU，而将微生物学上确定的动物即SPF(无特殊病 原体(Specific Pathogen Fee))保存在EMFU中。处死供体小鼠并灭菌小鼠表 面。在无菌条件收集卵子和精子，并通过传递盒子转移到IVF设备。进行无 菌IVF并培养成为两细胞胚。在液氮中冷冻所述胚胎，或直接用其移植。将 所述两细胞胚通过无菌锁转移到RU，并无菌移植到受体小鼠。
分娩的乳鼠由受体母亲天然喂养。有时，通过剖腹产分娩的乳鼠由代孕 母亲喂养。在这两种情况，都在喂养时使肠细菌菌群(AC原种)在乳鼠的肠 道建群。
在实施例2中进一步说明此方法。
遗传质量检验(testing)
为用突变的如基因改造的动物如小鼠作为动物模型，必须生产大量遗传 上同源的动物。据此目的，图4说明了两种遗传质量检验。如果此目的是为 明确所述基因改造动物的遗传特征，那么要进行抽查来在具体时间更加具体 地确定给定品系的遗传特征。另一方面，保证稳定的遗传质量需要监控所述 动物，包括周期性检验预先确定的一套质量标准来确认质量无变化。
大多文献中，所述转基因和/或其整合位点的分子分析通常包括不超过五 代。对整合到小鼠宿主基因组的转基因的种系转移稳定性从未做过具体研 究。关于转基因整合和稳定性的观察报道是相互矛盾的，并表现为基因特异 性的。明显的是，所述整合的转基因的广泛分子分析不仅对于确认稳定整合， 而且对消除或防止遗传不稳定性都是必要的。
所述遗传改变的动物(对于转基因是纯合子或半合子)的基因型通常和同 品系的培育者对(breeder pair)的基因型不同。本发明提供新的方法来监控不 同代的转基因稳定性，以及转基因整合位点周围的基因组结构。本发明所述 “早期基因检测方法”通常能在两天内区分纯合子和半合子转基因动物例 如小鼠。与此相反，依赖于同胞交配(sibling mating)的传统方法通常需要超 过一个月。
检测任何一代中的转基因的遗传稳定性通常从确定染色体位置开始，例 如使用荧光原位杂交(FISH)方法。(Matsuda等，Cytogenet.Cell.genet. 61：282-285(1992)；Evans EP.Standard G-banded karyotype，In：Lyon MF， Rastan S.，Bround SDM，eds.，Gene Variations and Stains of the Laboratory Mouse.New York：Oxford University Press；1996，p.1446-1449)。通常其后是 Southern印迹分析来制备整合的转基因位点周围的限制性片段图谱，它提供 了关于转基因结构的重要信息。所述转基因的表达可通过Northern印迹分析 来确认。最后，通过对插入基因和周围基因的逆转录PCR(RT-PCR)直接测 序来完成此分析，例如来鉴定可能出现在所述转基因动物下一代的点突变。
根据本发明，用新的和有效的PCR方法来对转基因动物作基因分型。 设计基因特异性PCR引物，使其从相反方向结合到靶DNA的互补链上，该 靶DNA从所述转基因动物和相应的非-转基因(野生型)动物分离。如图6具 体说明，用分离自转基因和非-转基因动物的基因组DNA进行PCR，其所用 引物对如下：(1)染色体特异性引物A和转基因特异性引物C，来确认5’转 基因/基因组接点；(2)转基因特异性引物D和染色体特异性引物B，来确认3’ 转基因/基因组接点；(3)染色体特异性引物A和B，来鉴定预整合位点；并且 (4)转基因特异性引物C和D，来确认转基因-转基因接点。用这些引物对生 产的PCR扩增产物可根据大小分离，例如在琼脂糖凝胶上，根据其提供的 带型鉴定任何具体动物的基因型。因此，半合子会产生两条带，一条对应于 野生型等位基因，另一条对应于转基因。与此相对，纯合子只显示对应于转 基因的带。另外，由染色体特异性引物对A和B得到的PCR产物的不同会 表明动物遗传背景的不同。
可选或者另外，也可用信号区分来分离或分辨所述PCR产物，如根据 荧光染料标记的产物颜色来区分。例如，当所述转基因特异性引物用FITC 荧光染料标记，染色体特异性引物用HEX染料标记时，转基因特异性引物 的产物会呈发绿的颜色而染色体特异性产物呈发红的颜色，并能根据此性质 用荧光成像探测器(fluorescence imaging detector)来分辨。在此具体实施例中， 来自半合子DNA的所述产物被检测为带由绿和红结合而得的发黄的颜色。
步骤2：有计划的生产和供给系统
另外，本发明提供了有计划的生产和供给系统，其包括(1)实时监控转基 因的稳定性和功能，(2)风险管理系统(大量保藏)，(3)增殖性改造技术，及(4) 使遗传背景加宽来拓宽遗传多样性(见图15)。所述有计划的生产在如上四个 步骤后进行。所述过程用核(nuclear)，扩展(expansion)，和生产集群(colonies) 来实现逐步生产，并冷冻保藏胚胎。使用集群对于风险管理是重要的。对于 提供足够数量的试验动物(生产系)来评估它们在指定的靶人类疾病或生理功 能中的可用性和局限性上，逐步扩展生产是必要的。
在核集群(nuclear colony)阶段，通过深低温保藏来保藏同胞交配 (sib-mating)的受精卵。在扩展和/或生产阶段，所述卵子在体外受精后深低温 冷冻成批保藏。从多只雌性小鼠收集卵子，而从成批保藏的一只雄性小鼠收 集精子。通常需数十个月来通过自然受孕(impregnation)建立生产集群。核集 群中谱系(pedigree line)的深低温保藏系统，以及在扩展和生产集群中的成批 保藏系统都降低了偶然的风险，如有计划的生产中的污染，或其它使生产间 断的问题。
应用本发明的新方法时，通过有计划的生产和供给系统，可在比通常更 短的时程中，建立核集群并确定所述动物的基因型。事实上，在一天内检查 每代的转基因稳定性和基因型。因此，根据使用者说明书，本发明可快速提 供任何期望体重或年龄的试验动物。这比提供婴儿(infant)动物很困难的传统 方法有了显著改进。
步骤3：评估所述动物模型的可用性和局限性
必须限定对于人类疾病真正有用的动物模型，只有符合如下需要的动物 才被认为是限定的动物模型：与人类相象的生理或病理表型必须有与人类相 同的遗传原因，并且必须限定所述动物模型的可用性和局限性。这些要求等 同地用到用作人类疾病的动物模型的所有基因改造的动物。
证明此步骤重要性的一个实施例是一种已经在日本开发的的动物模型， 其用作Duchénne-型肌营养不良的模型。项目开始时，收集了差不多在全世 界用作肌营养不良模型的所有动物并将其提供给临床研究组来作评估(见例 如，Gordon等，PNAS USA 77：7350-7384(1980)；Sugita和Nonaka，Animal Model utilized in research on muscular diseases in Japan，p.271-286 in：J. Kawamata and E.C.Melby(ed.)，Animal Model：assessing the scope of their use in Biomedical research.Alan R.Liss，Inc.，New York；Bulfield等，PNAS USA 81：1189-1192(1984)；Tanabe等，Acta Neuropathol.69：91-95(1986))。来自自发 突变体的这些肌营养不良模型对于澄清所述疾病的病因十分有用，但在 Duchénne-型肌营养不良的研究中用处很少。随研究进展发现，这些患有疾 病的模型只表现出与人类肌营养不良相似的那些病征。在评估所有基因改造 的动物模型(包括转基因，敲除和敲入动物)的可用性上进行类似考虑。更多 细节见，例如，Nomura，Laboratory Animal Science 47：113-117(1997)。
将在解释人类疾病机制中其可用性和局限性已被评估的动物定义为人 类疾病的动物模型。以携带脊髓灰质炎病毒受体基因的转基因小鼠(TgPVR 小鼠)为例，将TgPVR小鼠对脊髓灰质炎病毒的神经毒力的易感性 (susceptibility)与人类疾病脊髓灰质炎(polio)的脊髓灰质炎病毒神经毒力相比 较，来确定它们是否相同。将在解释靶疾病中其可用性和局限性(例如对脊 髓灰质炎病毒神经毒力/脊髓灰质炎的易感性)已被评估的动物定义为可用于 解释该疾病的人类疾病模型。
用如下非限制性实施例来说明本发明更多细节。实施例1图示了超速同 类系方法。实施例2说明了本发明的替代的微生物质量控制(AMQCM)。实 施例3和4分别阐述了在Tg-rasH2和TgPVR21转基因小鼠中确定转基因的 稳定性。实施例5描述了分析转基因/小鼠基因组接点位点的本发明的新方 法。实施例6说明了本发明拓宽转基因动物遗传背景来使遗传多样性变宽的 方法。本发明提供了实施例7-9来通过检测不同转基因动物模型确认本发明 的技术。
实施例1
超速同类方法
所述超速同类方法在图4图示。已经发现性早熟的幼鼠(不成熟小鼠)对 外源性促性腺激素敏感。因此，通过注射促性腺激素可诱导这些不成熟小鼠 超数排卵。使用超数排卵法来生产动物的方法与基于自然交配的传统方法相 比，显著缩短了将所述突变小鼠如转基因(Tg)小鼠的遗传背景变为其它近交 品系的遗传背景所需要的过程。在此研究中，研究了适合诱导实现超数排卵 的条件和不成熟小鼠体外受精后排出的卵母细胞的发育能力。
材料和方法
让不成熟的C57BL/6N雌性小鼠(3-4周龄)接受超数排卵过程，并将同品 系的成熟雄性用作体外受精(IVF)的精子供体。
分别用1.25，2.5，5，10，或20IU怀孕的纯血清促性腺激素(PMSG)和 5IU人类绒毛膜促性腺激素(hCG)以48h间隔分开注射，来诱导23，24，25， 26和27日龄的不成熟雌性小鼠实现超数排卵。在hCG后17-20小时估计每 组排出的卵母细胞数。来自28日龄的小鼠的一些卵母细胞经过IVF过程并 体外培养到2细胞阶段。在成熟的Jcl:MCH(ICR)雌性小鼠假孕第1天，将所 得的2细胞阶段胚转移到其输卵管来评估所述胚胎的胚胎发育。
结果及讨论
被诱导排卵的小鼠比例和排卵的卵母细胞数与所检测小鼠的年龄无关。 在注射了1.25-10IU PMSG时，75-100％小鼠被诱导排卵。每组注射5IU PMSG获得最多的排卵的卵母细胞数(均值52.3-76.3卵母细胞/小鼠)。注射 15或20IU PMSG诱导排卵的效果不如其它剂量的效果。
为评估排卵的卵母细胞的正常性，让来自28日龄小鼠的卵母细胞接受 IVF过程。所述结果显示超过95％的卵母细胞受精并发育到2细胞阶段。胚 胎转移到受体小鼠后，超过50％的所得胚胎产出后代，这提示来自不成熟小 鼠的卵母细胞具有正常的发育能力。
这些结果表明通过注射PMSG和hCG，从约4周龄的不成熟小鼠可得 到正常的卵母细胞，其中来自不成熟小鼠的卵母细胞数是来自成熟小鼠的 3-4倍，并且其卵母细胞具有正常胚胎发育的能力。用此过程，开始用Tg 小鼠与其它品系回交来建立新的同类系小鼠品系。如上所述，用不成熟小鼠 可每48天进行一次回交。
实施例2
替代的微生物质量控制方法(AMQCM)
材料和方法
小鼠：用C57BL/6N小鼠(10周龄)作病毒感染；用JCL:MCH(ICR)小鼠 (10-15周龄)作受体。病毒：用仙台病毒(Sendai病毒)(HVJ MN毒株)和小鼠 肝炎病毒(MHV Nu-67毒株)。血清学检测：对于HVJ进行酶联免疫吸附测定 (ELISA)和血细胞凝集抑制(HI)实验，而对于MHV进行ELISA和补体结合 (complement fixation)(CF)实验。通过小鼠的鼻子使C57BL/6N小鼠感染此病 毒(在第0天，试验的当天开始)。将PMSG(第2天)和hCG(第4天)注射到病 毒感染的C57BL/6N小鼠来使其排卵。在体外受精(IVF)第5天从所述感染的 小鼠收集卵子和精子，并将两细胞胚转移到JCL:MCH(ICR)小鼠的输卵管。 在分娩(在25天)后，由代孕母亲喂养乳鼠直到断奶(wean)(第53天)。饲养断 奶的小鼠到第81天，并对其进行血清学检测。也对受体小鼠和病毒感染的 供体小鼠进行血清学检测。
结果
IVF和胚胎转移：从五只HVJ感染的C57BL/6N小鼠总共收集60个卵 子(平均：12.0个卵子/小鼠)，并且使44个卵子(73.3％)发育成2细胞卵。将 四十个2细胞胚转移到受体并且生出了22只乳鼠(55.0％)，最后使20只小 鼠断奶(90.9％)。另一方面，从五只HVJ感染的C57BL/6N小鼠总共收集163 个卵子(平均：16.3个卵子/小鼠)，并且使145个卵子(89.0％)发育成2细胞 卵。将八十个2细胞胚转移到受体并且生出了45只乳鼠(56.3％)，最后39 只小鼠断奶(86.7％)。
病毒检测：HVJ感染的供体小鼠(一只雄性和5只雌性)接受了ELISA和 HI实验。所有被测样品在ELISA中显示了超标(over-scaled)光密度；在CF 实验滴度超过1∶160(1∶320-160)。MHV感染的供体小鼠(一只雄性和5只雌 性)接受了ELISA和CF实验。ELISA中所有被测样品都显示了超标的光密 度；CF实验中滴度超过1∶20(1∶160-20)。这些证实了供体小鼠确实感染了所 述病毒。而来自HVJ感染供体和来自MHV感染的供体的受体小鼠转移的胚 胎(每种3只)接受了血清学检测。另外，来自HVJ感染的和MHV感染的供 体的精子和卵子的乳鼠(每种5只)接受了血清学检测。受体小鼠和乳鼠在任 何血清学检测中都没有检测出阳性实验结果。
实施例3
作为短期致癌性实验(carcinogenicity testing)的动物模型的rasH2小鼠 的转基因稳定性和特性
材料和方法
动物
通过连接人的活化的c-Ha-ras基因的每个正常部分来构建所述转基 因，其在第12个密码子或第61个密码子有单个点突变，然后亚克隆到 pSV2-gpt质粒的BamHI位点(Sekiya T，等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81： 4771-4775；Sekiya T等，Jpn J Cancer Res 1985；76：851-855)。生产本研究 所用的转基因小鼠见上述(Saitoh等，Oncogene1990；5：1195-1200)。通过使雄 性半合子rasH2转基因小鼠和雌性近交C57BL/6JJic小鼠回交获得 C57BL/6JJic-TgN(RASH2)(Tg-rasH2)小鼠，来保持所述转基因小鼠的起始 集群(foundation coloring)。此研究中，5周龄雄性Tg-rasH2小鼠与N20和得 自深低温保藏的胚胎的N15的Tg-rasH2小鼠自然交配(mate with N20 and Tg-rasH2 mice at N15 obtained from cryopreserved embryos)，并使用了12周 龄雄性C57BL/6JJic(非转基因)小鼠。根据日本实验动物中央研究所(Central Institute for Experimental Animals)建立的指南处理所有使用的动物。
DNA探针
将一等分试样的微注射的DNA(7.0kb BamHI片段)亚克隆到pBlueScript II KS+(pBSII：Stratagene，La Jolla，CA)质粒的BamHI位点。用CsCl平衡离 心之后在Sepharose CL6B柱(Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Buckinghamshire，UK)通过凝胶过滤来纯化所述质粒。用BamHI消化从质粒 切割的包含人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段并从琼脂糖凝胶回收它。 根据生产商说明书(DIG-标记的随机引物探针)，用DIG DNA标记试剂盒 (Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)用洋地黄毒苷(digoxigenin) (DIG)-11-dUTP标记所述7.0kb的BamHI片段。以所述7.0kb的BamHI片段 作为模板DNA，用正向引物；5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCT CAG-3′(SEQ ID NO：1 )，和反向引物；5′-ACCAGGGGCTGCAGCCAGCCCT ATC-3′(SEQ ID NO：2)，用PCR DIG引物合成试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)制备所述DIG-标记的5′-探针(从位置1,793到2,400)。
荧光原位杂交分析
用荧光原位杂交(FISH)方法(Matsuda等，Cytogenet Cell genet，见上文； Evans EP，见上文)确定所述转基因的染色体位置。用人c-Ha-ras基因的生物 素-16-dUTP-标记的7.0kb BamHI片段分析得自N15和N20的Tg-rasH2小 鼠的有丝分裂原(mitogen)活化的二十个处于细胞中期的脾细胞。用抗-生物 素山羊抗体(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)和异硫氰酸荧光素标记 的抗-山羊免疫球蛋白G(Nordic Immunological Laboratories，Capistrano Beach， CA)来显示所述生物素-标记的DNA，然后用碘化丙锭(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，Germany)复染。用MICROPHOTO-FXA(NIKON CORPORATION，Tokyo，Japan)进行观察，并根据G显带(banding)标准物 (Evans EP，见上文)来鉴定有荧光信号的染色体。
Southern印迹分析
根据标准方案(Sambrook J，Russell DW.Molecular Cloning，Third Edition： A Laboratory Manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2001)， 通过用蛋白酶K过夜温育，之后用苯酚：氯仿提取并用乙醇沉淀，来从 Tg-rasH2小鼠和非转基因小鼠的尾部活检制备基因组DNA。在37℃用3U 限制酶/每毫克DNA消化基因组DNA(通常10μg)过夜，并在-20℃用乙醇沉 淀。沉淀后，在10μl TE缓冲液(10mM Tris，pH7.5，1mM EDTA)重新溶解 所述基因组DNA样品并在0.6％琼脂糖凝胶过夜电泳。所述凝胶顺序地在75 mM HCl中脱嘌呤，在1.5M NaCl/0.5M NaOH中变性，并在pH7.5的1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl中中和。在25mM pH7.0的磷酸钠缓冲液中，通过毛细 管转移将DNA从所述凝胶过夜转移到尼龙膜(Hybond-N+，Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。对所述空气进行干燥和紫外交联。在2×标准柠檬酸 盐水溶液(SSC；0.3M NaCl和30mM柠檬酸钠，pH7.0)中简单清洗所述膜后， 在杂交箱的Church杂交缓冲液中在42℃预杂交所述膜6小时(Church GM， 等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81：1991-1995)。煮5分钟变性所述探针并 将其加入新鲜的Church杂交溶液中的印迹。在42℃杂交所述印迹过夜，再 在50℃用2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸钠洗涤两次，并在65℃用 0.2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸钠洗涤两次。根据生产商说明书用DIG发光检 测试剂盒(Luminescent Detection Kit)(Roche Diagnostics GmbH)检测所述杂 交的探针。为检测化学发光信号，让所述印迹暴露于ECL-Plus X-射线胶片 (Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。
Northern印迹分析
用TRIzol(Life Technologies Inc.Gaithersburg，MD)提取总细胞RNA。根 据生产商方案用DNase I(Life Technologies Inc.)处理所述RNA溶液。在1％ 琼脂糖/6％甲醛凝胶分级分离所述RNA(10μg)，并将其转移到Hybond-N+尼 龙膜上。对所述印迹进行空气干燥，紫外交联并如上述(Maruyama等， Oncol Rep 2001；8：233-237)杂交。用随机引物DNA标记试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)用[α-32P]-dCTP标记鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA和人 c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段并将其用作杂交探针。使所述膜暴露于 Kodak AR胶片。
克隆基因组/转基因接点区域
为克隆基因组/转基因接点，用限制酶HindIII加BamHI完全消化 Tg-rasH2小鼠的100μg基因组DNA，然后用标准方法用苯酚：氯仿提取并 沉淀(Sambrook J，等，见上文)。通过在蔗糖密度梯度上超速离心分级分离双 消化的DNA的6-9kb的片段，并将该片段连接到pBSII质粒的相同位点。 用与载体连接的基因组DNA作为模板用重组Taq DNA聚合酶(TaKaRa Inc. Shiga，Japan)根据生产商说明书进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR引物， pBSII-rev(5′-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGC-3′(SEQ ID NO：3)) 和C(5′-GACCGGAGCCGAGCTCGGGGTTGCTCGAGG-3′(SEQ ID NO：4)) 用于扩增5’基因组/转基因接点；pBSII-rev和D (5′-ATCTCTGGACCTGCCTCTTGGTCATTACGG-3′(SEQ ID NO：5))用于扩 增3′转基因/基因组接点。在ABI PCR2400(Applera Corporation，Applied Biosystems，Foster City，CA)中，将反应混合物加热到94℃2分钟，然后以 94℃30秒，66℃30秒和72℃3分钟扩增35个循环，之后将所述混合物在 ABIPCR2400(Applera Corporation，Applied Biosystems，Foster City，CA)中 保存在72℃5分钟。用ABI PRISM310基因分析仪(Applera Corporation)用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反应试剂盒 (Applera Corporation)确定HindIII邻近区域的核苷酸序列。为分离所述基因 组/转基因接点，基于所述通过PCR克隆方法确定的序列来设计两种新的引 物，A(5′-GGGTCCTCTGGAGCTGGAGTTACAGACTAC-3′(SEQ ID NO：6)) 和B(5′-GCTTGGCTTAAGATACAGCAGCTATCCTG-3′(SEQ ID NO：7))。 以Tg-rasH2小鼠基因组DNA作为模板，用引物C加A(对于5′基因组/转基 因接点)，和D加B(3′转基因/基因组接点)进行PCR扩增。为克隆转基因/ 转基因接点，用Tg-rasH2小鼠DNA和引物D及C进行PCR扩增。为明确 所述整合过程及由转基因插入带来的可能的位置效应，从非转基因和 Tg-rasH2的小鼠DNA用引物A和B扩增所述预整合位点。PCR条件与上 述相同。
测序整合的人c-Ha-ras基因
从N20的Tg-rasH2通过PCR获得覆盖整个整合的人c-Ha-ras基因的五 种重叠的PCR产物，其中所用引物为引物D(见上)加E(5′-CACGCACCCAA ATTAGAAGCTGCTGGGTCG-3′(SEQ ID NO：8))，
F(5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCTCAG-3′)加G(5′-CACA CGGGAAGCTGGACTCTGGCCATCTCG-3′(SEQ ID NO：9))，
H(5′-AAACCCTGGCCAGACCTGGAGTTCAGGAGG-3′(SEQ ID NO： 10))加I(5′-AACCTCCCCCTCCCAAAGGCTATGGAGAGC-3′(SEQ ID NO： 11))，以及
J(5′-TGCGCGTGTGGCCTGGCATGAGGTATGTCG-3′(SEQ ID NO：12)) 加K(5′-GTGCTGGGCCCTGACCCCTCCACGTCTGTC-3′(SEQ ID NO： 13))。
用UltraClean PCR Clean-up DNA纯化试剂盒(Mo Bio Laboratories Inc.， Solana Beach，CA)纯化PCR产物，并通过引物步测(primer walking)法确定核 苷酸序列。
结果
检测Tg-rasH2 小鼠中转基因稳定性
如图8A所示，通过显微注射包含人c-Ha-ras基因7.0kb的构建体 (BamHI片段)，Saitoh等在1990建立所述转基因小鼠系rasH2。原来产生的 生成小鼠是杂交(C57BL/6J×DBA/2J)系，并与C57BL/6JJic回交，来生成遗 传上同源的群。因为回交已经进行至超过N20，并已经生产了30,000只以上 的转基因小鼠。在经过很多代的大规模繁殖中，已经检测了整合到所述 Tg-rasH2小鼠基因组的转基因的遗传稳定性。通过FISH方法确定在N15和 N20的Tg-rasH2小鼠中所述整合的转基因的染色体定位。表示所述转基因 位置的成对的荧光信号在两种情况下(图7)都可在染色体15E3区域观察到。 所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以只在一对姐妹染色单体检测到所述杂交 信号。
进行Southern印迹分析来制备整合的转基因位点周围的限制性酶切片 段图谱，它为转基因结构提供了重要信息。用BamHI消化Tg-rasH2小鼠DNA 产生了三条与DIG-标记的随机引物探针杂交的带(7.0kb和两条分子量更高 的带)(图8B)。在N15(图8B，第2和3道)和N20(图8B，第4和5道)的Tg-rasH2 小鼠的杂交带型没观察到不同。用BamHI消化的非转基因小鼠DNA与相同 的探针(图8B，第1道)没产生任何杂交带。BamHI-消化的Tg-rasH2小鼠DNA 与DIG-标记的5′-探针(图8C，第1道)或DIG-标记的3’-探针(位置从6,024 到6,712；数据未示)杂交也显示与DIG-标记的随机引物探针获得的杂交带型 相同。我们通过Northern印迹分析确认所述转基因的表达。在Tg-rasH2小 鼠的脑(B)，而不是在非转基因小鼠中观察到所述人c-Ha-ras基因的表达。 除了脑，在每代(N15和N20)Tg-rasH2小鼠(图9)的肺(L)和前胃(F)都表达所 述转基因。逆转录PCR(PT-PCR)直接测序分析表明在Tg-rasH2小鼠的任何 一代都看不到在人c-Ha-ras基因的密码子12和61优先出现的点突变。除 了突变热点(hot spot)，在编码区域看不到核苷酸改变(数据未示)。
在Tg-rasH2小鼠确定转基因方向(Orientation)和拷贝数
为清楚所述整合的转基因结构，用数种限制酶(HpaI，XhoI，XbaI，NcoI， NglII)消化Tg-rasH2小鼠基因组DNA并进行Southern印迹分析，其中所述 限制酶切割所述转基因的已知单个位点。如果所述整合的转基因以头-y-尾 (head-y-tail)构型串联存在，这些限制酶会产生7kb的片段。用XbaI消化直 接重复转基因拷贝会产生7kb的片段，而反向重复会产生9.1kb(尾-对-尾) 或4.9kb(头-对-头)的片段。事实上，用XbaI消化的在N20的Tg-rasH2小鼠 的基因组DNA产生和DIG-标记的5’-探针(图8C，第4道)的7kb的杂交带。 切割所述转基因的已知单个位点的所有其它限制酶也产生与DIG-标记的5’- 探针杂交的7kb带(图8C，第2，3，5和6道)。这些结果表明所述整合的转 基因的数个拷贝以头-对-尾构型串联存在。在N15的Tg-rasH2小鼠中也观察 到相同的杂交带型(数据未示)。
为确定所述整合的转基因的拷贝数，用HindIII完全消化Tg-rasH2小鼠 DNA，然后用多种浓度的BamHI限制酶部分消化所述等分试样。在0.4％琼 脂糖凝胶上，对所述消化的DNA进行电泳来清楚分辨分子量高的DNA样 品。见图10所示，用DIG-标记的随机引物探针作Southern印迹分析。当用 HindIII完全消化基因组DNA时，只有22.2kb的带与DIG-标记的随机引物 探针杂交(图10，第2道)。所述22.2kb的片段最多包含三个拷贝的7.0kb的 转基因。HindIII和BamHI双消化产生与DIG-标记的随机引物探针(图10，第 5道)杂交的8kb和多个7kb的片段。当HindIII消化的基因组DNA用BamHI (图10，第3道)进一步部分消化时，除了22.2，8和7kb的带，14.2和15kb 的带也与DIG-标记的随机引物探针杂交。这些结果表明Tg-rasH2小鼠在它 们的基因组中包含三个拷贝的所述转基因。
克隆并测序基因组/转基因接点和它们的相应的预整合位点
从Southern印迹分析获得的结果表明用HindIII和BamHI双消化 Tg-rasH2基因组DNA得到的7和8kb的片段包括基因组/转基因和/或转基 因/基因组接点区域。为研究Tg-rasH2小鼠基因组中所述基因组/转基因接点 的精细结构，用超速离心在蔗糖密度梯度上分级分离的6-9kb的 HindIII-BamHI双消化的片段连接到pBSII质粒的相同位点。用使用合适引 物(pBSII-rev和C；用于扩增5’基因组/转基因接点，pBSII-rev和D；用于扩 增3′转基因/基因组接点)通过PCR(第1次PCR)来扩增两PCR引物之间的 序列(GenBank登录号AB072334)，并且用PCR-直接测序来分析。为消除所 述扩增的DNA片段为所述PCR-克隆过程的人工产物(artifact)的可能性，所 述基因组/转基因接点的每一端通过第2次PCR用如下引物组(C加A和D加 B，图11C)从Tg-rasH2小鼠基因组DNA进行重新克隆。用引物组C加A， 和D加B扩增的每种PCR产物只见于Tg-rasH2小鼠，且具有分别为867-bp (图11A，第1道)和804-bp(图10A，第3道)的预测大小。所述第2次PCR 产物的核苷酸序列与第1次PCR产物的核苷酸序列一样。这些结果表明通 过PCR-克隆获得的基因组/转基因接点序列确实存在于Tg-rasH2小鼠基因 组。
从非转基因和Tg-rasH2小鼠DNA用PCR方法扩增之后并克隆预整合 位点。在位于所述转基因插入位点的侧翼的特定序列内用引物A和B扩增 所述预整合位点。引物组A加B在非转基因小鼠和Tg-rasH2小鼠产生2.2kb 的PCR产物(图11A，第5和6道)。另外，也可从DBA/2J小鼠的DNA获 得所述2.2kb的PCR产物(数据未示)。本试验中，我们使用C57BL/6JJic小 鼠作为非转基因对照来确定所述预整合位点。然而，原来的rasH2小鼠是 在C57BL/6J×DBA/2J杂交品系产生的，所以我们不能排除所述微注射的人 c-Ha-ras基因整合到所述DBA/2J等位基因的可能性。所述Tg-rasH2小鼠是 半合子并且有一个野生型等位基因。发现所述2.2kb的片段包含小鼠基因组 DNA序列，而该序列可能已经从Tg-rasH2小鼠基因组缺失了。通过PCR- 直接测序，我们确定了所述2.2kb片段的核苷酸序列(GenBank登录号 AB072335)，并将其与所述转基因/基因组接点的序列(GenBank登录号 AB072334)和微注射的DNA比较。DNA测序分析表明当所述微注射的人 c-Ha-ras基因被整合到小鼠宿主基因组时，1,820-bp的序列已经缺失。
图12将所述5’基因组/转基因接点(5’J)和3′转基因/基因组接点(3′J)序列 与所述宿主基因组和注射的DNA序列作以比较。两接点共同的显著特点是 在亲本序列间存在短同源序列。在整个(Spanning)5′J，在所注射的序列的5′ 末端有148-bp的缺失，并且在所述亲本序列之间的4-bp同源序列(CCAG) 存在于最终整合体(integrant)的5′末端。在整个3′J，在一段序列(stretch)内有 90％的同源性，其中在3′末端缺失24-bp的转基因整合体的3′末端序列和 亲本序列之间，有10bp(TCCTgCTGCC；所述小写字表示错配位置)是同源 的。我们的结果支持短的同源性配对(pairing)可能对染色体的整合事件有贡 献作用的假设。发现哺乳动物的拓扑异构酶I的切割位点的共有序列在宿主 基因组的5′J和3′J的附近。此序列也出现在5′J和3′J位点附近的注射的 DNA中。
对所述转基因构建体及在Tg-rasH2小鼠中的整合的人c-Ha-ras基因的 序列分析
用PCR-限制性片段长度多态性和PCR-直接测序来分析在多联体内的转 基因/转基因接点。用引物D和C扩增的PCR产物只在Tg-rasH2小鼠观察 到其为预料的大小即1.4kb(图11A，第7道，和图11B，第1道)。扩增的 1.4kb的片段用BamHI消化分为两个大小为0.7kb的片段(图11B，第2道)。 所述PCR-直接测序也表明转基因/转基因接点保留了Tg-rasH2小鼠基因组的 BamHI识别序列，并且在这些接点无序列丢失或重排。
对所述转基因构建体及在Tg-rasH2 小鼠内整合的人c-Ha-ras基因的序 列分析
通过连接来自人类黑素瘤和膀胱癌细胞系的c-Ha-ras基因的每个正常 部分制备7.0kb的构建体(Sekiya等，PNAS USA 81：4771-4775(1984)；Sekiya 等，Jpn Cancer Res 76：851-855(1985))。这些细胞系中的c-Ha-ras基因的核苷 酸序列已经在公共数据库注册(GenBank登录号M30539和V00574)。所述 7.0kb的构建体是嵌合的和人工的ras基因，所以我们不知道用于显微注射 的此构建体的精确核苷酸序列。因此，我们重新确认等分剂量的微注射的 DNA的核苷酸序列。我们确定了嵌合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列(＝7.0 kb的BamHI片段，6,992-bp)。当此序列与来自黑素瘤和膀胱癌细胞系的人 c-Ha-ras基因序列相比时，在所述嵌合的人c-Ha-ras基因可见数种次要的不 同。然而，我们在每个外显子中不能检测到任何变化。我们也确定了所述整 合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列。使用合适引物(见材料和方法)通过PCR 获得覆盖了整个整合的人c-Ha-ras转基因的五种重叠的PCR产物，并通过 PCR-直接测序(GenBank登录号AB072334)进行分析。对于从N20的Tg-rasH2 小鼠和微注射的DNA获得的核苷酸序列，除了所述串联排列的转基因两末 端的小缺失外，我们不能检测到任何差异。
讨论
原来的rasH2小鼠(C57BL/6J×DBA/2J的杂种)已与C57BL/6JJic品系回 交来生产遗传上同源的群。现在，回交已进行至超过N20。看起来此转基因 系的遗传背景已差不多被C57BL/6JJic的背景取代(约99.9998％)，(Silver LM， Experimental Mouse.In：Silver LM ed.，Mouse Genetics，Concepts and Applications，New York：Oxford University Press；1995，p.46-48)。重要的是考 虑用于致癌实验的动物遗传背景，这是因为自发和化学诱导的肿瘤发病率在 小鼠品系是不同的。对于短期致癌实验，我们推荐使用通过雌性BALB/cByJ 小鼠和雄性Tg-rasH2小鼠繁殖获得的F1杂种rasH2转基因小鼠 (CB6F1-Tg-rasH2)。此独特的繁殖系统有两项优点：其一是可能获得对化学 化合物的较宽多样性反应，并且另一个是可能使用同胞非转基因 (CB6F1-NonTg)小鼠作为检查的对照。
此研究中，我们发现在Tg-rasH2小鼠中整合的人c-Ha-ras基因逐代稳定 传递。微注射到培养的细胞或小鼠受精卵的DNA分子通常整合到宿主基因 组中的单个位点，并且当这些转基因以多个拷贝存在时，它们主要以头-对- 尾串联而较少以头-对-头或尾-对-尾方向排列(Filger等，Mol Cell Biol 2：1372-1387(1982)；Gordon和Ruddle，Gene 33：121-136(1985)；Palmiter和 Brinster，Annu Rev genet 20：465-499(1986))。已知Tg.AC转基因小鼠有对阳 性对照化合物12-O-十四烷酰佛波醇13-醋酸酯(tetradecanoylphorbol 13-acetate)无反应的群体(Thompson等，Toxicol Pathol 26：548-555(1998)； Weaver等，Toxicol Pahthol 26：532-540(1998)；B1anchard等，Toxicol Pathol 26：541-547(1998))，并且此无反应群显示所述反向重复的头-对-头接点顶部 附近的基因缺失(Thompson等，Toxicol Pathol见上文；Honchel等， Mol Carcinog 30：99-110(2001)。多项研究表明转基因中带有回纹结构的反 向重复序列使所述基因不稳定(Akgun等，Mol Cell Biol 17：5559-5570 (1997)；Collick等，EMBO J.15：1163-1171(1996)；Ford和Fried，Cell 45：425-430(1986))。幸运的是，在Tg-rasH2小鼠基因组中串联排列的人 c-Ha-ras转基因无回纹结构，但我们不知道在大规模繁殖经过很多代时是否 会出现转基因重排。Aigner等观察了七个系的酪氨酸酶基因转基因小鼠，认 为繁殖计划(program)可持续很多代而在建立的纯合子转基因系中不再需要 严格的分子分析(Aigher等，见上文)。然而，他们指出极少的个体在它们的 试验中受转基因拷贝丢失的影响。我们这里要说明在Tg-rasH2小鼠整合的 所述转基因逐代并在大规模繁殖时稳定传递(图7和8)。在450只Tg-rasH2 小鼠的Southern印迹分析中，我们在个体DNA样品中没发现任何不同(未公 布数据)。然而，我们相信定期间隔检查用于致癌实验的Tg-rasH2小鼠中的 基因型和表型是需要的，因为起始集群中的无反应者突变体可能造成的污染 会影响致癌实验结果的可靠性。因此，我们通过仔细的分子遗传分析应确认 每代亲本Tg-rasH2(C57BL/6JJic-TgN(RASH2))小鼠的完整性，所述分析包括 对所表达的人c-Ha-ras基因的Southern和Northern印迹和PCR-直接测序(近 来在N23的结果无明显变化，未公布数据)。另外，实际实验模 型CB6F1-Tg-rasH2小鼠应接受N-甲基-N-硝基脲作为阳性对照化合物的致 癌实验。
Southern印迹分析结果表明所述整合的转基因的拷贝数。通常，难以确 定整合的转基因的确切拷贝数，因为微注射的DNA被重复(reiterate)来形成 每个位点从大约100-700个拷贝的串联或反向排列。在Tg-rasH2小鼠，所述 微注射的人c-Ha-ras基因的序列没有任何HindIII识别位点。因此，所述转 基因整合位点用HindIII消化从Tg-rasH2小鼠基因组切出，并用Southern印 迹分析检出为单个22.2kb的带。如果所述完整的7kb的人c-Ha-ras基因被 整合到Tg-rasH2小鼠基因组，所述整合的转基因不会超过三个拷贝。另外， BamHI消化会产生与覆盖整个所述7kb的人c-Ha-ras基因的随机引物探针 杂交的三条带，这表明所述整合的转基因最少有三个拷贝。然而，如果它已 经以环形存在，那么通过整合所述基因的两个拷贝，可能获得类似的带型。 如果这样，当用覆盖7kb的人c-Ha-ras基因的位置1,793-2,400的5′-探针(图 8C，第1道)或覆盖位置6,024-6,712的3′-探针(未公布数据)进行杂交时， BamHI消化会产生两条杂交带。所述两个区域特异性探针都杂交并产生三条 带，所述带与那些随机引物探针产生的那些带类似。这些结果表明所述整合 的转基因有三个拷贝。在两端存在基因组/转基因接点的序列(图12)也不可能 以环形整合。
因为不知道当所述微注射DNA整合到小鼠基因组时，所述转基因拷贝 是否表现任何缺失或重排，我们从Tg-rasH2小鼠DNA克隆所述基因组/转 基因及转基因/基因组接点，并从所述非转基因小鼠克隆它们的相应预整合位 点。已经报道所述微注射DNA的末端序列相对保守，并通过在转基因小鼠 中缺失或插入最多数个核苷酸来被修饰(Pawlik等，Gene 165：173-181(1995)； Hamada等，Gene 128：1978-202(1993)；McFarlane和Wilson，Transgene Res 5：171-177(1996))。从Southern印迹分析结果，我们怀疑在Tg-rasH2小鼠基 因组中串联排列的转基因拷贝的两个(5′和3′)末端有一些缺失。如果所述串联 转基因被完整整合，所述整合的转基因拷贝在它们的接点就会有保守的 BamHI位点，并经BamHI消化会产生仅7.0kb的单体片段。比对所述转基 因/基因组接点和所述微注射的DNA的序列表明，Tg-rasH2小鼠在在转基因 整合的5′末端有148-bp的缺失并在3′末端有24-bp的缺失(GenBank登录号 AB072334)。在两末端可见的这些缺失提示所述转基因多联体整合前以线性 而不是环形存在，并且所述线性多联体的游离末端是重组的优选位点。所述 转基因的整合基因座的核苷酸序列分析表明，在整合接点所述亲本序列之间 存在短同源序列(在5’末端的4-bp和在3’末端的10-bp中的9bp)。在转染的 成纤维细胞和转基因小鼠系已经观察到位于整合接点和宿主基因组的转基 因之间的这些短同源序列(Hamada等，Gene 128：197-202(1993)；McFarln\ana 和Wilson，Transgene Res 5：171-177(1996))。另外，DNA拓扑异构酶I似 乎在微注射DNA的整合中起重要作用。据发现，所述哺乳动物拓扑异构酶 I切割位点的共有序列(Been和Burgess，Nucleic Acids Res 12：3097-3114 (1984))在多个转基因系(Hamada等，见上文，McFarlane和Wilson等，见上文) 和Tg-rasH2小鼠的整合的转基因位点附近(图12)。
在转基因插入处，视具体情况而定出现宿主基因组的缺失或重排。当所 述微注射的人c-Ha-ras基因整合到小鼠宿主基因组时，Tg-rasH2的宿主基因 组出现核苷酸缺失(1,820-bp)。用BLAST2程序比较Tg-rasH2小鼠缺失的核 苷酸序列(GenBank登录号AB072335)和GenBank数据库的那些序列，来鉴 定可能的同源性。所述缺失序列与数据库中的已知功能性基因没有任何同源 性。然而，发现所述缺失区域携带与人DNA序列同源的序列，所述序列来 自包含RPL7(60S核糖体蛋白质L7，GenBank登录号AL031589)假基因的染 色体22上的克隆RP6-11O7。所述缺失区域序列的312-bp(位置698-1,009) 表明与人DNA克隆RP6-11O7(位置9,023-9,334)88％的同源性，但在RPL7 的编码区没观察到序列同源性。在所述缺失序列用多种框架和方向翻译成为 相应的氨基酸序列时，没观察到氨基酸水平的序列同源性。尽管我们确定的 缺失序列可能位于内含子或启动子区域，将所述人c-Ha-ras基因插入到宿主 小鼠基因组不会产生插入突变。基础基因表达不受插入Tg-rasH2小鼠的转 基因的影响。此结论得到表达图谱方法的初步证据的支持。我们在比较了 9,514个单基因(unigene)的基础基因表达后未发现Tg-rasH2小鼠的肝和非转 基因小鼠的肝之间有显著不同(数据未公不布)。
Tg-rasH2转基因小鼠是一个遗传上同源的群体，它已经用分子生物分 析包括转基因结构和改变宿主基因组序列来精制，应为短期致癌试验的有用 的啮齿动物模型。
实施例4
作为神经毒力实验(NVT)动物模型的TgPVR21小鼠的转基因稳定性
Nomoto(PNAS，88：951-955，1991)制造了携带人脊髓灰质炎病毒受体 (PVR)基因的转基因小鼠。已经开发此小鼠作为神经毒力实验(NVT)的动物 模型，来替代日本实验动物中央研究所的猴神经毒力实验(MNVT)。所述转 基因的稳定性是确保该TgPVR21转基因小鼠作为NVT动物模型的生殖质量 的关键因素。为检测所述转基因在TgPVR21小鼠的稳定性，在对IQI品系 的同类系过程中在不同代中分析所述转基因的分子结构。
材料和方法
在对IQI品系的回交数为N3，N15和N20时，分析在TgPVR21小鼠的 转基因结构(表A)。如下述，用标准方法进行FISH，Southerrn和Northern印 迹，以及RT-PCR分析(表A)。也确定了所述转基因编码区的核苷酸序列。
结果
FISH(图16)
用生物素-标记的HC5克隆作为探针进行FISH分析并通过抗生物素蛋 白-FITC方法观察。如图16所示，在N15的转基因纯合子和N20的半合子 的第13条染色体(位置13B3)分别见到两个双生斑(twin spot)和一个双生斑。 此分析中观察到的转基因的染色体定位与以前的结果一致(Nomoto，1991，见 上文)。
Southern印迹分析(图17)
用BamHI消化10微克从转基因纯合子的N15小鼠和半合子的N20小 鼠获得的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。将DNA转移到膜上。所述膜与图 17所示的探针杂交(PVR-α的编码区)。在两只小鼠和对照的HC5克隆中发现 杂交带大小为1.2，1.3和10kb。这些发现与以前的结果一致，这表明未出 现重排，并且所述转基因在TgPVR21品系的同类系过程中是稳定的。
基因表达分析
进行Northern印迹，PT-PCR和直接测序来检测TgPVR21品系的基因 表达图谱(图18)。整合的转基因基因的结构，及基因剪接产生的三种mRNA 产物，Northern分析的探针，引物和部分测序见图19所示。将总细胞RNA 进行凝胶电泳并转移到膜上。所述膜与图17所示的探针(PVR-α mRNA的 cDNA)杂交。在N15和N20的TgPVR21品系检测到单一3.3k的带。这里 所得数据与之前的结果一致(Nomoto，1991，见上文)。从N3，N15和N20的 TgPVR21小鼠的脑，肾和肠获得的RNA进行了PT-PCR分析。用旁路剪接 得到的来自整合的PVR基因的三种RNA产物(PVR-α，-β，和-γ)经检测为预 期的大小(149，173和308bp)。用得自N15小鼠脑的RNA获得的cDNA来 进行PCR直接方法测序。结果确认所述整合的转基因产生与所述PVR基因 的编码区(1,254bp，起始密码子ATG到终止密码子TGA)极好匹配的RNA。
实施例5
分析转基因/小鼠基因组接点的位点
已确认根据本发明的生产方法能稳定地逐代传递转基因。此事实可开发 新方法来对所述小鼠作基因分型。所述转基因的整合位点包括所述转基因/ 小鼠的基因组接点区域。克隆并分析新的转基因小鼠品系(TgPVR21小鼠- 见上实施例4，和rasH2小鼠-上述实施例3)来用这些品系说明新的基因分 型方法。该新的基因分型方法的一般概念见图6说明。此图中，较暗的箭头 指示了设计用来检测野生型的PCR引物，而亮的箭头指示了设计用来检测 所述小鼠的转基因型的PCR引物。用此方法，可清楚容易地辨别多种基因 型，例如野生型纯合子，半合子(或杂合子)和转基因纯合子。从TgPVR21 小鼠的转基因纯合子获得DNA。
Southern印迹分析
进行Southern印迹分析来获得所述转基因/小鼠基因组接点位点的`5区 的限制酶图谱。用BamHI，EcoRI，BglII，NcoI，HindII和XbaI作DNA 消化。用所述转基因的载体部分的700bp的片段作为Southern印迹分析的 探针(图20)。
Southern印迹分析的结果见图21A所示。计算每条带的大小并如图21B 所示。通过带的大小信息获得所述限制酶图谱，并见图21C说明。所述图谱 提供了如下有价值的信息。首先，所述转基因/小鼠基因组接点的点(point) 的不对称模式表明所述转基因没有头-对-头构型。第二，每个限制酶消化步 骤仅获得单一条带的事实表明所述转基因的单拷贝应整合到TgPVR21转基 因小鼠的小鼠基因组。
克隆并测序所述转基因/小鼠基因组接点的5′区域
用BglII完全消化TgPVR21的转基因纯合子的基因组DNA。在蔗糖密 度梯度用超速离心分离包含2.9kb片段的DNA并进行自身连接(图22A)。 用连接的DNA进行反向PCR来扩增所述5′基因组/转基因接点(图22B)。直 接测序所述PCR产物来获得所述接点位点(第一次PCR)的核苷酸序列信息。 然后，用第一次PCR产物作为探针从基因组DNA克隆包含所述转基因/小 鼠基因组接点区的DNA片段(图22C)。用所克隆的DNA作为模板进行第二 次PCR，并扩增预期为1.5kb的PCR产物(图22D)。最后，用步测引物进行 PCR直接测序来得到转基因/小鼠基因组接点处上游1kb的基因组信息(图 22E)。
用所述转基因/小鼠基因组接点位点获得的小鼠基因组信息进行BLAST 检索。该BLAST检索得到注册的克隆号2833685，它与克隆的片段(PVR基 因)的200bp完全同源，并且所述转基因/小鼠基因组接点区域的上游位点结 构如图23确定。
实施例6拓宽遗传背景来使遗传多样性变宽
如果将实验动物用于安全试验(safety test)，拓宽(扩展)它们的遗传背景 来使遗传多样性变宽是十分需要的，然后会导致敏感范围更宽，行为表现多 样化并且表现型和演出型方面的谱(spectrum)更宽。另外，如果不确认此动 物持续的遗传一致性(equity)/稳定性，就不能保证此系统的再现性。为确保 遗传背景变宽和持续的遗传质量/稳定性，从选择的近交(并且完全同类)的品 系生产杂种动物。当需要进一步扩展遗传多样性时，杂种品系可与其它杂种 品系交配来生产多交(multi-cross)杂种。这样，通过杂种-交配确保了遗传多 样性变宽，而通过遗传监控每个选择的品系确保了持续的遗传同一性/稳定 性。此方法的第一个步骤是选择第一代(F1)动物的最适背景品系。因为不同 的品系表现出对靶疾病不同的敏感性，谱和性能(performance)，所述选择包 括综述多种品系与靶疾病相关的信息。此信息可得自，例如，Jackson Laboratory database(Bar Harbor，Maine，U.S.A.)，和此靶疾病的专家。选择背 景品系的第二部分是综述可得的关于多种品系的生殖系数的信息。此信息可 得自日本实验动物中央研究所(CIEA)的生殖系数数据库(Reproductive Index Database)。
通常，从若干近交系选择F1的目标是保持所述靶疾病的多样性(例如癌 症的发病率和谱)，所述多样性与在人类患者观察到的多样性类似，并且提 供稳定的生殖比率，从而可以更好计划所需动物的数量。
多种近交小鼠品系的生殖数据见下表B说明。
表B 品系 出生率％ 同胞均数 (Average of sib) 断奶比率 生殖系数 C57BL/6J 84.8 6.2 92.3 4.8 BALB/cByJ 88.6 6.4 95.3 5.3 AKR/J 45.3 4.9 75.2 1.7 C3H/HeN 52.0 5.6 89.6 2.6 DBA/2J 88.9 4.6 91.7 3.7 C57BL/6J- TgrasH2 43.2 6.0 89.0 2.3 C3H/HeJ 88.4 5.7 93.5 4.7 DBA/2N 80.5 4.5 93.4 3.9
CIEA和日本CLEA
出生率＝母鼠数与交配的亲代小鼠数之比的％。同胞均数＝同胞总数与分 娩的母鼠数之比。断奶比率＝断奶的同胞数与同胞总数之比。生殖系数＝断奶 的同胞数与交配的亲代小鼠数之比。
表C X 出生率％ 同胞均数 断奶比率 生殖系数 BALB/cByJ×C57BL/6J CB6F1 89.6 8.2 95.2 7.0 BALB/cByJ ×C57BL/6J-TgrasH2 CB6F1-TgrasH2 44.5 7.5 96.4 3.2 C57BL/6J×DBA/2J BDF1 76.6 9.1 96.2 6.7 C57BL/6J×C3H/eJ B6C3F1 95.6 8.2 95.8 7.5
表B和C列出的数据结合于下表D内。
表D C57B L/6J BALB/ cByJ AK R/J C3H/ HeN DBA/ 2J B6J-Tgr asH2 C3H/ HeJ DBA /2N C57BL/6 J 4.8 7.5 6.7 2.3 BALB/c ByJ 7.0 5.3 3.2 AKR/J 1.7 C3H/He N 2.6 DBA/2J 3.7 B6J-Tgr asH2 C3H/HeJ 4.7 DBA/2N 3.9
实施例7
Tg PVR21
因为只有灵长类对脊髓灰质炎病毒易感，已经在猴神经毒力实验(MNVT) 中用传统方法测定了口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的神经毒力安全性和一 致性。开发携带人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)基因的转基因(Tg)小鼠后，评 估了这些小鼠用于取代OPV实验中猴的适合性。检验了两个系的Tg小鼠， TgPVR1和TgPVR21。在其中进行脊髓接种的TgPVR21小鼠在辨别那些已 经通过和未通过所述猴神经毒力实验的成批的3型和2型OPV上和猴子一 样敏感。用聚合酶链式反应的新的分子分析和限制酶切割结果显示，每批 OPV包含病毒基因组中很少量的神经毒性回复体(revertant)。所有未通过猴 神经毒力实验的比通过此实验的3型OPV有更高百分比的472-C回复体。 分析多批3型OPV也显示在472-C回复体的含量和TgPVR21小鼠实验的结 果之间有好的相关性。大量数据总结表明所述TgPVR21小鼠模型适合评估 3型和2型OPV。现正在考虑用TgPVR小鼠试验检测1型OPV，三个Sabin 品系中的最稳定的一个，的神经毒力的必要性。
只有灵长类对脊髓灰质炎病毒的所有三个血清型易感，所以已经在神经 毒力实验(MNVT)(1)中检验了所述口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的安全性 及其一致性。每批三价的疫苗用大约100只猴。在数个国家进行两次MNVT， 一次是由生产者进行，另一次是由国家控制机关进行。除了高成本之外，得 自野外的猴通常得自可能将外来疾病传递给人。我们描述了替代动物系统的 状态-转基因小鼠对脊髓灰质炎病毒易感。
两组科学家通过将编码脊髓灰质炎病毒的细胞受体的人类基因引入小 鼠基因组来衍生携带人类脊髓灰质炎病毒受体(TgPVR)的转基因小鼠(Ren 等， Cell 63：353-362，1990；Koike等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955， 1991)。与对猴的观察类似，当TgPVR小鼠感染了脊髓灰质炎病毒时，它发 作了弛缓性麻痹，之后一些小鼠死亡，并且在中枢神经系统有组织学损伤。 所述TgPVR小鼠已经广泛用于研究试验诱导的脊髓灰质炎的病因和脊髓灰 质炎病毒减毒的多种方面(Ren等， Cell 63：353-362，1990；Koike等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955，1991；Ren etal.， J.Virol.65：1377-1382，1991； Ren等， J.Virol.66”296-304，1992；Racaniello等， Develop.Biol.Stand. 78：109-116，1993；Koike等， Develop.Biol.Stand 78：101-107.1993；Horie等， J.Virol.68：681-688，1994；Koike等， Arch.Virol.139：351-362，1994)。在1992， 世界卫生组织(WHO)推荐用有不同程度神经毒力的3型脊髓灰质炎病毒品 系(世界卫生组织， Bull.W.H.O..21：233-237，1992)来比较TgPVR小鼠(Koike 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955，1991)和猴的敏感性。美国食物和 药品管理局(FDA)对脑内接种的TgPVR1小鼠系进行的研究显示，此小鼠系 统能区分野生型Leon/37品系，Sabin 3疫苗品系和从粪便分离的疫苗病毒 的基本上去减毒(de-attenuated)的克隆(Dragunsky等， Biologicals 21：233-237， 1993)。然而，脑内接种的TgPVR1小鼠不能区分通过和没通过MNVT的成 批OPV。后来Horie等(Horie等， J.Virol.68：681-688，1994)发现此小鼠系 统不能辨别对于猴有相对低但不同水平的神经毒力的3型脊髓灰质炎病毒品 系；成批OPV不包括在它们的研究中。因为TgPVR1小鼠系统不适合检验 OPV，我们开始注意到其它小鼠系即TgPVR21。如在MNVT中一样将病毒 样品接种到小鼠脊髓。在MNVT中决定疫苗通过/没通过是基于对猴中枢神 经系统的组织学损伤的评分(世界卫生组织， WHO Tech.Rep.Ser.800； Appendix 3，annex 1，1990)。通过比较，由于评估脊髓灰质炎的临床症状而使 在TgPVR21小鼠检测那些未通过MNVT的成批OPV的实验成为可能。此 令人鼓舞的结果导致了WHO在1993开始了合作研究(世界卫生组织， WHO/MIM/PVD/94.1世界卫生组织，Geneva，1993)。此研究的目的是评价 TgPVR21小鼠替代猴用在MNVT中的合适性，该研究首先用于3型OPV。 实验动物中央研究所的研究者成功将TgPVR21小鼠从有限的研究工具开发 成为大量可得并且限定质量标准的可靠动物来源(Hioki等， Exp.Anim. 42：300-303(日文)，1993)。在对人类病毒易感的转基因小鼠的WHO备忘录 (memorandum)(世界卫生组织， Bull.W.H.O..71：497-502，1993)中给出维护， 保存(containment)，及运输TgPVR小鼠的建议。所述接种步骤，临床评分 方法，和统计学分析的原理都被描述(Abe等， Virology 206：1075-1083，1995； Abe等， Virology 210：160-166，1995；Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)。在那些研究中用的病毒样品首先在MNVT中试验，然后利用FDA开 发的非常灵敏的分子分析通过聚合酶链式反应和限制酶切割检查在病毒基 因组的神经毒性回复体丰度(Chumakoc等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：199-203，1991)。后一种方法在每批单价的3型OPV中检测位置472(U→C) 处很少量的回复体并检测位置249(C→U)处较多量的回复体。在3型OPV 的所述472-C回复突变(reversion)已经被记载为提高MNVT中的神经毒力的 关键促进物。未通过成批MNVT的疫苗包含＞1％的这些回复体。发现在1 型和2型OPV批号也有与3型OPV的位置472处的回复突变 (Back-mutation)，但它们对神经毒力的促进作用不那么强(Rezapkin等， Virology 202：370-378，1994；Taffs等， Virology 209：366-373，1995)。在所述1 型和2型Sabin病毒的基因组中可能有其它导致神经毒力的突变。
为确定TgPVR21小鼠是否能检测未通过成批MNVT的3型疫苗，所述 WHO研究包括对一个包含3％的472-C回复体的一批疫苗和包含0.5％的 472-C回复体的参照疫苗WHO/III进行比较。来自所有参与实验室的结果显 示，TgPVR21小鼠清楚辨别了所述两种疫苗(Wood，D.J.， Vaccine(印刷中)， 1996)。当用出现感染的临床症状的天数(即未通过时间(failure time))和临床评 分作为标准时，会辨别得更好。50％的麻痹剂量和50％的致死剂量不太令 人满意。大部分未通过MNVT的所述3型OPV制品包含＜3％的472-C回复 体，其中大多数含＜2％。为简便起见，后一种疫苗被称为“边缘的(marginal)”。 在FDA一同检验了三支边缘疫苗(1.3，1.4和1.7％)以及WHO/III和NC-2(分 别0.5和0.8％的472-C回复体)(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。 所有三批边缘疫苗均未通过所述小鼠实验，它们有高概率值的两个神经毒力 的主要指示物，即临床评分和未通过时间。发现另一批只包含1.4％的472-C 回复体的疫苗通过了MNVT却未通过所述小鼠实验，这可能表明所述小鼠 实验比MNVT有更高的敏感性。
一个有趣的问题是疫苗或试验样品中2493-U回复体的含量和其在猴和 TgPVR21小鼠中的神经毒力之间的关系。报道这些回复体在猴的神经毒力 中的作用是互相矛盾的(Tatem等， J.Virol.66：3194-3197，1992；Chumakov 等， J.Virol.66：966-970，1992)。第一篇报道认为此位置的回复突变在提高猴 的神经毒力中最重要，而第二篇文献的发现却认为相反。此位置的突变比 在位置472的那些出现得更快。因此，472-C的百分比有些增加的成批疫苗 通常2493-U含量很高，最多达100％。一些生产者生产的疫苗衍生自所述 Sabine 3的克隆，该克隆有100％的2493-U回复体并且472-C的含量很低 (0.3％)。无数据显示这些疫苗对人类的安全性低于2493-U回复体含量低的 疫苗。其中之一，在MNVT中与WHO/III和NC-2参照物比较的参照疫苗 F313不比所述两种疫苗毒力更强(16，Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)。然而，在TgPVR21小鼠，F313比WHO/III和NC-2的神经毒力水平 都高(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。确定是否TgPVR21小鼠实 验能辨别F313及其472-C回复体含量提高的衍生物变得必要，因为所述衍 生物会模拟“不好的”疫苗。因此，相对于亲本F313疫苗在小鼠中检验，来 自F313疫苗的并且包含1.8和2.4％的472-C的两份试验传代样品。所述 TgPVR21小鼠实验区分这些样品(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。 Abe等(Abe等， Virology 210：160-166，1995)接种的TgPVR21小鼠和 WHO/III和F313参照物，并将它们与在38℃生长的两份F313-衍生的制备 物进行比较。他们观察了所述MNVT和小鼠实验结果的紧密相关性。不幸 的是，该两种在38℃生长的病毒制备物并不被认为与不好的疫苗类似，因 为它们包含78％和94％的472-C回复体，并使减毒的体外温度敏感性标记 物从rct40-改变到rct40+。这表明在生产条件下在疫苗中可出现较高的神经 毒力。根据OPV生产的需要(世界卫生组织， WHO Tech.Rep.Ser.800：46-49， 1990)，疫苗病毒在细胞培养中的生长必须不能超过35.5±0.5℃。较高温度 使更多神经毒性病毒颗粒选择性生长。
在TgPVR21小鼠的OPV-3研究中，所有试验中辨别最好的病毒剂量是 3.5和4.5log10 50％组织培养感染剂量(TCID50)。据发现，可靠地辨别边缘疫 苗也能只用这两种剂量来实现，但用每个剂量接种的小鼠数增加。除了每组 的小鼠数要足够外，其它因素对成功也很重要；MNVT的接种体(inocula)的 病毒含量的1.0log10 TCID50不同并不重要(Contrearas等， J.Biol.Stand. 16：195-205，1988)。通过比较，小鼠实验中较强的剂量依赖性和所述接种体 的较小体积(0.5μl)是所述小鼠和猴实验之间差异最可能的原因。为达到必要 的精密度并使实验室间的结果协调，推荐遵守WHO指南描述的滴定分析方 法(世界卫生组织， Document WHO/BLG/95.1，Chap.9，p.67-74，世界卫生组 织，Geneva，1995)。
在FDA用2型OPV进行的试验中(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)，用三种通过MNVT的成批疫苗和两种未通过MNVT的成批疫苗，和 2型参照疫苗WHO/II接种TgPVR21小鼠。另外，三种试验样品来自“好的” 成批疫苗。一种样品通过MNVT并且两种未通过MNVT。此结果表明MNVT 和TgPVR21小鼠实验的相关性良好。
因为没有1型OPV批号反复未通过MNVT，FDA使用一个成批疫苗和 有一次未通过MNVT试验但在重复实验中通过的实验传代制备物 (Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。用所述成批疫苗和未其传代样品 接种TgPVR21小鼠的脊髓不能辨别这两种制备物和美国参照疫苗。此阴性 结果更可能由于1型OPV的独特性。首先，所述Sabin 1品系是三种血清型 中最稳定的一种，并且可能在小鼠试验中无“不好的”1型成批OPV。有时， 所述1型疫苗批号未通过MNVT，但在重复实验时，它会通过(Marsden等， J. Biol.Stand.8：303-309，1980；Lovenbook，I.， 未公布数据)。一些专家甚至质疑 所述1型OPV的对猴试验的必要性。Abe等(16)通过使所述病毒在38℃生 长获得了1型OPV样品。这些制备物未通过MNVT和TgPVR21小鼠实验， 并且所述rct40标记物从阴性变为阳性，这再次表明，如它们在用3型所进 行的工作一样(Abe等， Virology 210：160-166，1995)，所述样品比对任何不好 的疫苗所期望的神经毒力要高。对于这些制备物，MNVT和TgPVR21小鼠 实验之间有相关性的事实支持了一种观点，那就是1型OPV未通过TgPVR21 小鼠实验可能不是由于所述小鼠模型不适合，而是因为所述Sabin 1品系在 生产条件下生长的稳定性。
在过去数年积累的数据的大体上的总结表明脊髓(spinal core)接种的 TgPVR21小鼠提供了评估3型和2型OPV的神经毒力的合适模型。此小鼠 模型可被认为是猴的可能替代物。此1型OPV的小鼠实验的实用性仍在研 究中。已建立的TgPVR小鼠生产，它们无病原体健康状况，和相对猴的较 低开支使它们对于OPV的神经毒力实验更有吸引力。
实施例8
Tg cHa-ras
用转基因(Tg)小鼠人类原型c-HRAS基因，即 BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2或CB6F1-HRAS2小鼠进行快速致癌 性实验。进行此研究的第一个步骤是评估CB6F1-HRAS2小鼠作为快速致癌 性实验系统的模型。多种基因毒性致癌物的短期实验结果显 示CB6F1-HRAS2小鼠对这些致癌物比对照非-Tg小鼠更易感。根据第一个 步骤的评估研究，在用多种基因毒性致癌物处理后，预期CB6F1-HRAS2小 鼠与对照非-Tg小鼠相比更可能以更高的发病率更快发生更恶性的肿瘤。所 述CB6F1-HRAS2小鼠看起来是作为开发快速致癌性实验系统的动物模型的 有希望的侯选物。
尽管通过基础和临床医学的途径以及公共健康的途径，已经作了持续的 努力来攻克癌症，癌症在很多国家仍为头号致死原因。很多人类癌症被认为 是由接触环境化学致癌物造成的。为降低此风险，已经作了大量努力来鉴定 并去除致癌物。用试验动物的流行病学研究和致癌实验被用来鉴定人致癌 物。尽管流行病学研究十分有希望的并且可能是唯一确认人类致癌物的方 法，该途径还是极为回顾性的，所以只有在出现了很多牺牲品后才能鉴定出 致癌物。
当一个人在开发过程中评估药物安全性并且当其在鉴定环境致癌物时， 致癌性实验必不可少。现在使用试验动物的致癌性实验不总是和人类风险评 估有关；通常用小鼠和大鼠是因为它们的寿命短并且体积小。因为啮齿类致 癌性实验延续＞2年并需要大量的动物，所以动物实验需要大的空间，大量 实验室技术员和巨额开支。当在致癌性实验中获得了阳性结果时，人们通常 不会意识到开发新药物中已经浪费的时间，努力和开支。另外我们的环境中 还有很多化学品没有被试验过，而每年却合成了数千种新的化学品。很明显 需改进鉴定致癌物的过程从而能评估更多化学品。所以，开发能在短的阶段 评估致癌性的快速致癌性实验系统对提高开发新药物并鉴定环境致癌物的 有效性是必要的。
为开发快速致癌性实验系统，对致癌物易感的动物是必不可少的。预计 有原癌基因的转基因(Tg)动物和/或缺少肿瘤抑制基因的动物会比正常动物 对多种致癌物更易感，因为致癌作用是由易感细胞中的遗传和外遗传 (epigenetic)损害作用的多阶段过程，所述细胞获得选择性生长优势，并经过 克隆扩增，其可能是活化原癌基因和/或灭活肿瘤抑制基因的结果。
所述ras家族基因参与调控细胞增殖，并被多种人类肿瘤(Lowy等， Annu.Rev.Biochem.62：851-891，1993；Bos，J.L.， Cancer Res.49：4682-4689， 1989；Anderson等， Environ.Health Perspect 98：13-24，1992)及试验动物模型 (Anderson等， Environ.Health Perspect 98：13-24，1992；Guerrero等， Mutat. Res.185：293-308，1987)的体细胞点突变活化。通过点突变活化ras家族基因 见于约30％的人类肿瘤。因此，携带人类c-HRAS基因的Tg小鼠可以是快 速致癌性实验动物模型的候选物。
合作评估携带人c-HRAS基因的Tg小鼠作为快速致癌性实验动物模型 的可用性和局限性的研究正在我们研究所，几个日本制药公司和美国国家环 境卫生研究中心(National Institute of Environmental Health Sciences)(NIEHS) (Drs.R.R.Maronpot和R.W.Tennant)开展。为评估Tg小鼠的可用性和局限 性，用于大规模生产并提供遗传和微生物学上限定的Tg小鼠的系统是必不 可少的。在综述中，我们介绍了我们现在的评估研究和2年的生物分析结果， 我们的研究是通过调查携带所述c-HRAS基因的Tg小鼠对多种致癌物的致 癌物反应(corcinogenic response)，并将所述反应与对照非转基因(non-Tg)小鼠 比较进行的。
携带所述人类原型c-HRAS基因的Tg小鼠的特征：所述携带人类原型 c-HRAS基因的Tg小鼠最初由Katsuki和其同事在实验动物中央研究所 (CIEA)建立(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)；所述小鼠携带此基因及 该基因自己的启动子区域，所述基因编码了不能转化NIH3T3细胞(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)的原型c-HRAS基因产物(即，p21)。人c-HRAS 基因的五或六个拷贝以串联排列整合到每只Tg小鼠的基因组中(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。转基因在肿瘤和正常组织表达，并且Tg小鼠 中用免疫印迹分析检测的p21总量比非-Tg小鼠高两到三倍(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。没有在Tg小鼠的正常组织未检测到所述转基 因的突变(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。约50％的rasH2小鼠 (C57BL/6×BALB/cF2)在出生后18个月内患自发肿瘤(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。约60％的患有肿瘤的小鼠患血管肉瘤 (angiosarcoma)(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。肺腺癌，皮肤乳头 状瘤，哈氏腺腺癌(Harderian gland adenocarcinoma)，和淋巴瘤也见于18月 龄，但发病率低很多(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。然而，肿瘤和 癌前病变(preneoplastic lesion)在6月龄的rasH2小鼠的F2转基因后代都未观 察到(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。
用于此研究中的CB6F1-HRAS2小鼠的遗传背景是转基因雄性 C57BL/6J和雌性BALB/cByJ小鼠的F1。通过使rasH2小鼠与C57BL/6J小 鼠回交八倍以上建立转基因雄性C57BL/J6小鼠是。携带所述转基因 的C57BL/6J雄性与BALB/cByJ雌性小鼠杂交。对所述F1后代进行聚合酶 链式反应或Southern印迹分析筛选存在的人类原型c-HRAS基因。携带所述 人c-HRAS基因的F1小鼠，即在CIEA生产的 BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2(CB6F1-HRAS2)小鼠，在7-9周龄时 被用于致癌性实验。在同窝幼鼠中，用不携带所述人c-HRAS基因的小鼠 (CB6F1)作为非-Tg对照。因为本研究中需要大量标准化实验动物形式的 的CB6F1-HRAS2小鼠，所以实用型开发是必需的。此开发所用的概念和系 统由Nomura本期(issue)的第一综述中详述。
雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠的体重是相应非-Tg小鼠的80-90％。对 于所试验的器官(脑，甲状腺，心，肺，肝，脾，肾，肾上腺，睾丸和卵巢)， 所述Tg小鼠与非-Tg小鼠的器官与体重的比率相似。Tg和非-Tg小鼠的血 液生物化学和血液学数据没有显著性差别。雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠 在77周龄的存活率分别是53％和32％。约50％的CB6F1-HRAS2小鼠死于 血管肉瘤，约20％的死亡动物患有肺腺癌和/或肺腺瘤，这与之前rasH2小鼠 的结果一致(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。此研究中对 于CB6F1-HRAS2小鼠在6个月的致癌性试验中只观察到有一些自发的肺腺 瘤却无其它自发的肿瘤，所述实验最迟在35周龄时终止(CB6F1-HRAS2小 鼠在35周龄的存活率为≥95％)。自发的肿瘤在CB6F1-HRAS2小鼠中的低发 病率使我们用此小鼠作为快速致癌性实验的工具。
快速致癌性实验：我们研究所和几个日本制药公司已经做了这些快速致 癌性实验的研究(表1)。
表1.在日本用CB6F1-HRAS2小鼠进行的快速致癌性实验结果 恶性肿瘤 检验的化学品 剂量 给药途径 基因毒性 (沙门氏菌) Tg小鼠的 快速肿瘤反 应 肿瘤发病率和/ 或多样性 (multiplicity) Tg 非-Tg 4NQO1，a 15mg/kg×1 皮下(s.c.) + + Tg＞ 非-Tg + - MNNG2，a 2.5mg×1 管饲法 (Gavage) + + Tg＞ 非-Tg + - MNU3，a 75mg/kg×1 或 15mg/kg×5 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg + - 乙烯氨基甲 酸酯(vinyl carbamate)1，6，b 60mg/kg×1 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg ++ + Den4，A 90mg/kg×1 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg + - MAM5，a 20mg/kg×1/ 周6周 皮下 + +c Tg＞ 非-Tgc + - 环磷酰胺1，a 30mg/kg×2/ 周25周 管饲法 + +c Tg÷ 非-Tg + - 4HAQO5，b 10/20mg/kg× 1 静脉内(i.v. + + Tg＞ 非-Tg ++ + 乙烯硫脲 (Ethylene thiourea)1，b 0.3％ 喂食 - +c Tg÷ 非-Tg + +
4NQO＝4-硝基喹啉(Nitroquinoline)-1-氧化物；MNNG＝N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍 (nitrosoguanidine)；MNU＝N-甲基-N′-硝基脲；DEN＝N-甲基-N′-硝基脲；MAM＝甲基氧化 偶氮甲醇(methylazoxymethanol)；4HAQO＝4-羟基氨基喹啉(Hydroxyaminoquinoline)-1-氧 化物。
1日本国立药品食品卫生研究所(National Institute of Health Sciences)(NIHS)。2Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd。3Chugai Pharamceutical Co.，Ltd。4Sankyo Co.，Ltd。 5CIEA。6美-日共同研究。
a对比文献9；b未公布数据；c统计学上无显著性。
4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)是水溶性基因毒性致癌物，已知它在小鼠 中诱导皮肤(Nakahara等， Gann 48：129-136，1957)和口腔(Hawkins等， Head Neck 16：424-432，1994)的鳞状细胞(squamous cell)癌，和肺肿瘤(Inayama，Y.， Jpn.J.Cancer Res.77：345-350，1986)。约90％的4NQO-处理的CB6F1-HRAS2 小鼠(雄性和雌性)在单次皮下(s.c.)注射15mg的4NQO/kg体重后16周出现 皮肤乳头状瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在 4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是对照非-Tg小鼠观察到皮肤的鳞状 细胞癌。在4NQO-处理的非-Tg小鼠和载体-处理的动物未观察到皮肤肿瘤。 4NQO也诱导肺肿瘤。只在4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是相应的 非-Tg小鼠观察到肺腺癌(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。 在4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺瘤的发病率也比相应的非-Tg小 鼠中的发病率更高(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。 环磷酰胺是抗肿瘤药，它在啮齿类和人类致癌(国际癌症研究组织 (International Agency for Research on Cancer))， IARC vol 26，p165-202，Lyon， France，1981)。主要的靶器官是膀胱，肺，乳腺，和淋巴系统(国际癌症研究 组织， IARC vol 26，p165-202，Lyon，France，1981)。一周两次慢性口服给药10 或30mg的环磷酰胺/kg持续25周来诱导CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠的肺 肿瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在一只环磷酰胺- 处理的雄性CB6F1-HRAS2小鼠而不是相应的非-Tg小鼠或载体-处理的动 物中观察到腺癌。环磷酰胺-处理的CB6F1-HRAS2小鼠和相应的非-Tg小鼠 的肺腺瘤发病率无显著不同。在其它器官如膀胱，乳腺，和淋巴系统观察不 到肿瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。
N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是烷化剂，并且在多种动物包括小 鼠中致癌(国际癌症研究组织， IARC vol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。前 胃和食管(esophagus)是口服给药MNNG后的靶器官(国际癌症研究组织， IARC vol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。单次口服给药2.5mg MNNG/每只 小鼠在100％的雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠诱导前胃乳头状瘤，而只有 11％的雌性和0％的雄性非-Tg小鼠在用MNNG处理后13周出现乳头状瘤 (Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。甚至在MNNG给药后 26周，只在MNNG-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而未在相应的非-Tg小鼠观 察到鳞状细胞癌(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。
N-甲基-N-硝基脲(MNU)在多种动物致癌，并且在多个位置如皮肤，前 胃，淋巴系统和肺诱导肿瘤(国际癌症研究组织， IARC vol 17，p117-255，Lyon， France，1978)。以剂量75mg/kg一次或以剂量为15mg/kg、五次(每天一次连 续5天)腹腔内注射MNU，从在CB6F1-HRAS2小鼠诱导多种肿瘤(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。与相应的非-Tg小鼠相 比，CB6F1-HRAS2小鼠在MNU处理后可见皮肤乳头状瘤的发病率明显变 高(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。在至少14周的观察 中，MNU以高发病率诱导CB6F1-HRAS2小鼠的皮肤乳头状瘤，但不诱导 非-Tg小鼠的皮肤乳头状瘤和增生。所述MNU-处理的CB6F1-HRAS2小鼠 也以高发病率患前胃乳头状瘤，而MNU-处理的非-Tg小鼠不出现乳头状瘤 (Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在MNU-处理 的CB6F1-HRAS2小鼠而不是非-Tg小鼠见到前胃鳞状细胞癌。Ando等 (Ando，等， Cancer Res.52：978-982，1992)报道单次腹腔内注射MNU后，与相 应的非-Tg小鼠相比，rasH2小鼠的前胃和皮肤乳头状瘤的发病率更高。与 相应的非-Tg小鼠的反应相比(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461， 1996)，在用75mg的MNU/kg处理一次的雄性CB6F1-HRAS2小鼠中，淋 巴瘤的发病率更高。
N，N-二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine)(DEN)在多个动物种类中致癌(国 际癌症研究组织， IARC vol 17，p83-124，Lyon，France，1978)。DEN的主要靶 器官是肝，肺和前胃(国际癌症研究组织， IARC vol 17，p 83-124，Lyon，France， 1978)。早在DEN给药3个月，单次腹腔内注射90mg的DEN/kg仅 在CB6F1-HRAS2小鼠造成前胃鳞状细胞癌和肺腺癌(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。DEN给药后六个月， 在CB6F1-HRAS2小鼠两种恶性肿瘤的发病率显著增加(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。在6个月的观察过程中，在DEN-处 理的非-Tg小鼠中从未观察到这些肿瘤。在DEN给药后3个 月，CB6F1-HRAS2小鼠的肺腺瘤发病率与非-Tg小鼠的发病率类似。对应 于在CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺癌发病率的增加(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)，DEN给药后六个月时，非-Tg小鼠腺 瘤发病率明显比CB6F1-HRAS2小鼠更高。
乙烯氨基甲酸酯是氨基甲酸乙酯的代谢物，已知它诱导肺和肝肿瘤 (neoplasm)(Massey等， Carcinogenesis 16：1065-1069，1996；Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。在给药致癌物后16周，单次腹腔内注射60mg 的乙烯氨基甲酸酯/kg在100％和50％的CB6F1-HRAS2小鼠中分别诱导肺腺 瘤和腺癌(Maronpot等，制备手稿)。尽管非-Tg小鼠也以＞90％的发病率患肺 腺瘤，其肿瘤增殖比相应的CB6F1-HRAS2小鼠低。非-Tg小鼠的肺腺癌发 病率比CB6F1-HRAS2小鼠低很多。后者约90％患有脾血管肉瘤，但非-Tg 小鼠不患有脾血管肉瘤。
甲基氧化偶氮甲醇(MAM)在啮齿类中致癌，并且诱导结肠肿瘤(Reddy 等， J.Natl.Cancer Inst.71：1181-1187，1984；Deschner等， J.Cancer Res.Clin. Oncol.115：335-339，1989)，肺肿瘤(Reddy等， J.Natl.Cancer Inst. 71：1181-1187，1984)，和肛周鳞状细胞癌(Kumagai等， Gann 73：358-364， 1982)。首次MAM给药后24周，每周一次皮下注射20mg的MAM/kg持 续6周使CB6F1-HRAS2小鼠但不使非-Tg小鼠(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)出现皮肤乳头状瘤，结肠腺瘤样息肉 病(colon adenomatous polyps)，直肠鳞状细胞癌，和胃乳头状瘤。皮肤乳头 状瘤限于肛门和阴囊，与以前对不同品系的非-Tg小鼠的报道一致(Kumagai 等， Gann 73：358-364，1982)。在用MAM处理的CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠 中观察到类似的肺腺瘤发病率。
在致癌物处理后至少26周内，单次静脉内(i.v.)给药基因毒性致癌物4- 羟基氨基喹啉-1-氧化物(4HAQO，10或20mg/kg)在CB6F1-HRAS2小鼠中 诱导前胃和皮肤乳头状瘤，但在非-Tg小鼠几乎观察不到这些肿瘤。尽管所 述发病率低，只在Tg小鼠观察到其它肿瘤(例如，白血病和胸腺瘤 (thymoma))。4HAQO-处理的Tg和非-Tg小鼠在胰腺的外分泌部分(已知该处 是此致癌物的靶组织)都不出现肿瘤(Rao等， Int.J. Pancreatol.2：1-10，1987)。 这些快速致癌性实验的结果见上表1总结，并且用于快速致癌性实验的化学 品列表见表2所示。
表2.快速致癌性实验的化学品列表 沙门氏菌(Salmonella)诱变分析-阳性致癌物(种间(trans-species)) 4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)a 环磷酰胺a N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)a N-甲基-N′-硝基脲(MNU)a N，N-二乙基亚硝胺(DEN)a 甲基氧化偶氮甲醇(MAM)a 乙烯氨基甲酸酯b 4-羟基氨基喹啉-1-氧化物(4HAQO)c 甲基苄肼(Procarbazine)c 噻替哌(Thiotepa)c 3-(N-甲基-N-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)c 非那西丁(Phenacetein)c 4，4′-二氨基二苯硫醚(Thiodianiline)c 4-乙烯基-1-环己烯双环氧化合物(cyclohexene diepoxide)c 2-甲氧基-5-甲基苯胺(p-Cresidine)b N-亚硝基苯胲胺(Cupferron)c 苯丙氨酸氮芥(Melphalan)b 沙门氏菌诱变分析-阴性致癌物(种间) 乙烯硫脲 1，4-二噁烷(Dioxane)c 丙烯酸乙酯c 环孢霉素b，c 糠醛(Furfural)c 苯酚c 二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)c 沙门氏菌诱变分析-阳性非致癌物 p-茴香胺(Anisidine)b 8-羟基喹啉c 4-硝基-o-苯二胺(phenylenediamine)c 2-氯甲基吡啶盐酸盐(2-Chloromethylpyridine hydrochloride)(2-氯化吡啶甲基 盐酸盐(2-Picolyl chloride hydrochloride))c 沙门氏菌诱变分析-阴性非致癌物 间苯二酚(Resorcinol)b 鱼藤酮(rotenone)(小鼠)c 二甲苯(Xylenes)(混合)c 二硫代四乙基秋兰姆c
黑体化学品＝已完成或现在正进行的快速致癌性实验
a参考文献9；b美-日共同研究；c在CIEA进行或要进行的快速致癌性实验
在美国国家环境健康卫生研究中心的国家毒理学项目(National Toxicology program) Environ.Health Perspect.101：264-266，1993)中，已知沙门 氏菌诱变分析-阴性致癌物乙烯硫脲在大鼠和小鼠诱导甲状腺肿瘤。只有雌 性小鼠用于致癌性实验。喂食小鼠包含0.1或0.3％的乙烯硫脲持律28周。 浓度0.1％的乙烯硫脲不在CB6F1-HRAS2小鼠或非-Tg小鼠诱导甲状腺肿 瘤，而0.3％的乙烯硫脲分别在26％和20％的Tg和非-Tg小鼠诱导甲状腺腺 瘤。甲状腺腺癌的发病率也类似(Tg9％和非-Tg小鼠4％)，并且在Tg和非-Tg 小鼠观察不到明显不同。
已知DEN(Ando，等， Cancer Res.52：978-982，1992)和乙烯氨基甲酸酯 (Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)是肝肿瘤可能的诱导物。然而， 用这些化合物处理的CB6F1-HRAS2小鼠和对照非-Tg小鼠不患肝肿瘤。已 经报道多个遗传位点控制了小鼠肝肿瘤(Gariboldi等， Cancer Res. 53：209-211，1993；Manenti等， Genomics 23：118-124，1994)。与C3H小鼠这一 个对致肝癌作用非常易感的品系相比(Diwan等， Carcinogenesis 7：215-220， 1986；Dragani等， Cancer Res.51：6299-6303，1991)，所述C57BL/6小鼠对化 学诱导致肝癌作用的易感性相对低(Diwan等， Carcinogenesis 7：215-220，1986； Stanley等 Carcinogenesis 13：2427-2433，1992)。已知BALB/c小鼠对致肝癌 作用十分抵抗，雌性C57BL/6和雄性BALB/c小鼠的F1杂种对致肝癌作用 的敏感性低(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995，Stanley 等 Carcinogenesis 13：2427-2433，1992)。所以，雄性C57BL/6和雌性BALB/c 小鼠的F1杂种，CB6F1小鼠很可能对致肝癌作用的易感性相对较低。 通常在一些小鼠品系如C3H和B6C3F1的肝肿瘤中检测到HRAS基因 活化(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。然而，在DEN或乙烯氨 基甲酸酯诱导的B6CF1小鼠的肝肿瘤中HRAS突变的频率很低(Maronpot 等， Toxicology 101：125-156，1995)。所述HRAS的突变可能显著导致对致肝癌 作用高敏感性的小鼠品系而不是低敏感性品系中肝肿瘤的诱导(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。
在CB6F1-HRAS2小鼠中能清楚观察到皮肤乳头状瘤/鳞状细胞癌，前胃 乳头状瘤/鳞状细胞癌和一些其它肿瘤类型的快速肿瘤反应，然而在不考虑致 癌物类型的情况下，由环磷酰胺，MNU，DEN或MAM在CB6F1-HRAS2小鼠 诱导的肺腺瘤的发病率和多样性并不明显高于用相应的致癌物在非-Tg小鼠 中诱导的肿瘤的发病率和多样性。接触致癌物后多个小鼠品系的肺肿瘤发病 率有明显不同(Malkinson，A.M.， Toxicology 54：241-271，1989)。A/J(对肺癌发 生易感)和C57BL/6J(对肺癌发生抵抗)的重组近交系的遗传研究结果表明三 个遗传位点促进这些品系对肺肿瘤发生的易感性的不同(Malkinson等， J. Natl.Cancer Inst.75：971-974，1985)。已经认为癌基因Ki-ras是这些易感性位 点之一(You等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5804-5808，1992；Chen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1589-1593，1994)，并且每个小鼠品系对肺腺瘤 的易感性(例如，A/J是易感型的，BALB/c是中间型的，C57BL/6是抵抗型的) 与Ki-ras基因的多态性相关良好(Chen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1589-1593，1994)。此研究中所用的CB6F1小鼠可能有相对高的肺腺瘤易 感性。另一方面，只有CB6F1-HRAS2小鼠患肺腺癌而非-Tg小鼠对多种致癌 物反应时没有或很少患肺腺癌，这表明CB6F1-HRAS2小鼠与对照的CB6F1 小鼠相比有另外的能力来加快肺腺瘤的恶性进展。
这些导致表明在用多种基因毒性致癌物处理后，预期CB6F1-HRAS2小 鼠比对照非-Tg小鼠更可能以更高的发病率更快发生更恶性的肿瘤。这些最 初的评估研究显示CB6F1-HRAS2小鼠似乎是开发快速致癌性实验系统的动 物模型的有希望的侯选物。
前景(Perspective)：尽管诱变性(mutagenicity)是致癌性的主要机制决定 因素，它对致癌性既不是足够的也不是必要的。约三分之一的非诱变的化学 化学品已经显示是致癌性的，并且约三分之一的诱变化学品在2年的啮齿类 生物实验中不致癌(Ashby等， Mutat.Res.257：229-306，1992；Zeiger etal， Environ.Mol.Mutagen 16(Suppl.18)：1-14，1990)。已经提出在两个啮齿种类中 诱导肿瘤的化学品与只在一个种类中诱导肿瘤的化学品相比受到不同种类 之间的遗传变异性的影响较少(Tennant，R.W.， Mutat.Res.286：111-118， 1993)。所以种间的致癌物对人似乎比单个种的致癌物更有害。
对于种间的致癌物，我们要么完成要么已经启动了15种沙门氏菌诱变分 析-阳性致癌物(4NQO，环磷酰胺，MNNG，MNU，DEN，乙烯氨基甲酸酯， MAM，4HAQO，甲基苄肼，噻替哌，NNK，非那西丁，4，4’-二氨基二苯硫 醚，4-乙烯基-1-环己烯双环氧化合物，和2-甲氧基-5-甲基苯胺)以及六种沙 门氏菌诱变分析-阴性致癌物(乙烯硫脲，1，4-二噁烷，丙烯酸乙酯，环孢霉素， 糠醛，和苯酚的快速致癌性实验(表2)。这些致癌物中，环磷酰胺，甲基苄肼， 噻替哌，非那西丁，环孢霉素，和苯酚被分类为人致癌物(第1组)或在人可能 致癌(第2A组)。我们计划再进行至少两种沙门氏菌-阳性种类间的致癌物(N- 亚硝基苯胲胺和苯丙氨酸氮芥)和再一种沙门氏菌-阴性致癌物(二乙基己烯 雌酚)的实验(表2)。苯丙氨酸氮芥和二乙基己烯雌酚被分类为人致癌物。这 些致癌物的6个月致癌性实验可进一步评估此CB6F1-HRAS2小鼠是否可用 作快速和准确鉴定基因毒性和/或非基因毒性致癌物的动物模型。
因为人类致癌物鉴定的假阳性错误会阻碍合适的药物开发并可能造成 社会不安，应尽可能地避免过分估计致癌性。因此，必须明确是否所 述CB6F1-HRAS2小鼠对非致癌物的反应是阴性的。一种沙门氏菌诱变分析- 阳性非致癌物(p-茴香胺)和一种沙门氏菌诱变分析-阴性非致癌物(间苯二酚) 的快速致癌性实验现在正在进行(表2)。其后，我们应对沙门氏菌-阳性和沙 门氏菌-阴性非致癌物更关注。我们计划在CIEA用至少四种沙门氏菌-阳性非 致癌物(8-羟基喹啉，4-硝基-o-苯二胺，和2-氯甲基吡啶)和三种沙门氏菌-阴 性非致癌物(鱼藤酮，二甲苯，二硫代四乙基秋兰姆)进行研究(表2)。上述化 学品中的六种已经或将在日本和美国同时进行实验(表3)。
表3.美国-日本共同研究用CB6F1-HRAS2小鼠做短期(26周)致癌性实验 研究所 化学品 剂量和给药途径 日本 美国 状态 乙烯氨基甲 60mg/kg×1，腹腔内 NIHS NIE 完成 酸酯 HS 2-甲氧基-5- 甲基苯胺 0.25％，0.5％，喂食 NIHS NIE HS 完成 环孢霉素 5mg/kg，10mg/kg，25mg/kg，× 5/W 26周 管饲法 CIEA NIE HS 正进行 间苯二酚 225mg/kg，×5/周24周 管饲 法 产业1 NIE HS 正进行 苯丙氨酸氮 芥 0.3mg/kg，1.5mg/kg×1/周25 周，腹腔内 产业2 NIE HS 要做 p-茴香胺 0.225％，0.45％，喂食 NIHS NIE HS 正进行
产业1＝Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd.产业2＝Kyowa Hakko Kogyo Co.
在欧盟，美国和日本现有评估化学品致癌可能性的管理(regulatory)要求 规定要在两种啮齿类进行长期啮齿类致癌性研究。因为长期生物分析的开支 大，使用大量动物，机制基础缺乏和与人风险评估的相对低的相关性，人用 药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use)(ICH)已经考虑用两种啮齿类的2年致癌性实验的需要是否能够降低而不 危及人类的安全性。近来Tennant及其同事在NIEHS已经研究了使用p53-敲除 小鼠或TG.AC小鼠(v-Ha-ras转基因小鼠)作为鉴定致癌物的短期生物分析模 型的可行性(validation)(Tennant等， Environ.Health Perspect.103：942-950， 1995)。因为已经积累了相当数量的显示可能的可用性的数据，所以现在在 多种转基因动物中，p53-敲除小鼠，CB6F1-HRAS2小鼠和TG.AC小鼠似乎是 鉴定化学致癌物的短期生物分析模型的最有希望的的侯选物。尽管还未完全 评估用Tg小鼠的快速致癌性实验系统的可用性和局限性，用Tg小鼠检测可能 致癌物是部分ICH指南的讨论话题。现在将用一种啮齿类，可能是大鼠进行2 年的实验，加上短期生物分析和机理性研究来取代用两种啮齿类的2年致癌 性实验。
实施例9
rasH2小鼠中再现和可重复的致癌物反应
为确认rasH2小鼠模型在演出型水平具有再现和可重复的行为表现，在 多个研究所检查对一些致癌物的致癌物反应，并在研究所间比较患肿瘤的发 病率。
材料和方法
致癌物：N-甲基-N-硝基脲(MNU)是烷化剂和基因毒性致癌物，它被用 作阳性对照致癌物。用75mg/kg溶于柠檬酸盐缓冲盐水(pH4.5)的MNU以单次 腹腔内注射给予阳性对照组中的小鼠。基于以前的剂量探索研究确定75 mg/kg的剂量。
小鼠：在1997年，使rasH2品系的核集群中的小鼠与C57BL/6回交并且回 交代超过N14。本研究中使用了在1997-1999年中在实验动物中央研究所 (CIEA)产生的CB6F1-Tg-rasH2小鼠。
研究所：将小鼠提供给11个不同的研究所(Sankyo，Tanabe，Eisai， Teikoku-Zoki，Daiichi，Shionogi，Dainippon，Mitsubishi，Fujisawa，Wyeth，and Shinyaku)。每个研究所的所有工作作为ILSI，ACT项目(国际生命科学学会 (International Life Science Institute)，致癌性实验)由CIEA的Usui进行的取代实 验。
结果
在MNU-处理的rasH2小鼠中，诸如前胃，皮肤和阴道的鳞状细胞肿瘤， 哈氏腺中的癌，肺的腺瘤，和恶性淋巴瘤的肿瘤发病率增加。在研究所间观 察到前胃肿瘤(图25)和恶性淋巴瘤(图26)发病率高而且一致。基于多个研究 所得到的肿瘤特征谱的定性和定量的一致的和强的阳性反应，判断rasH2小 鼠对作为阳性对照的MNU的致癌物反应的整体表现是足够的(Usui，T.，等， Toxicologic Pathology 29(Suppl.)：90-108，2001)。
所有本说明书通篇引用的参考文献和其中所引用的参考文献都引入作 为参考。本发明已经参考具体实施方案进行了描述，本发明技术人员应该理 解，只要不违背本发明的真实精神和范围，可作多种改变和等价替换。另外， 可作多种修改来适应具体条件，材料，物质组成，过程等等。所有此类修改 都在附带的权利要求书范围内。
序列表
<110>野村达次(Nomura，Tatsuji)
<120>开发动物模型的方法
<130>APGI.001A
<160>13
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag 30
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
accaggggct gcagccagcc ctatc 25
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与pBKS II克隆载体同源的合成引物
<400>3
ggaaacagct atgaccatga ttacgc 26
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
gaccggagcc gagctcgggg ttgctcgagg 30
<210>5
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg 30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>鼠(Murine)
<400>6
gggtcctctg gagctggagt tacagactac 30
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>7
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
<400>13
gtgctgggcc ctgacccctc cacgtctgtc 30
<110>健康及生物科学促进中心(CENTER FOR THE ADVANCEMENT OF HEALTH AND BIOSCIENCE)
野村达次(NOMURA，Tatsuji)
<120>开发动物模型的方法
<130>39764-0001PCT
<140>未指定的
<141>2003-06-23
<150>10/179639
<151>2002-06-24
<160>13
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
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<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
accaggggct gcagccagcc ctatc 25
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工引物
<220>
<223>与pBKS II克隆载体同源的合成引物
<400>3
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<210>4
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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<213>鼠(Murine)
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<213>小鼠(Mus musculus)
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开始开发用作“活体实验工具”的标准化的实验动物，其第一步骤是根 据同样的遗传和微生物学质量说明制备参照(reference)动物，之后第二步骤 是通过建立有计划的生产系统来获得足够数量的相同动物，来评估它们在任 何具体的动物试验中的可用性和局限性。在此步骤后，可建立成百或者甚至 上千标准化的动物，并使其接受全面评估来确定它们在建立基因改造的动物 模型之前用作模型系统的可用性和局限性。在标准化的基因改造的动物模型 的实际开发中重要的第三步骤，涉及使用特征明确的可靠动物模型来建立完 整的“体内试验系统”，来使基因改造的动物，如转基因小鼠被用作人类疾 病或生物医学和药理研究的其它领域的可靠模型。通常，实验动物学家对第 一步骤负责，医学或药理研究者用所述动物模型完成第三步骤，而两组研究 者都参与第二步骤。尽管参照转基因动物来说明此系统，本发明不应如此受 限。本发明方法对其它突变动物，包括所有类型的基因改造的(基因操纵的) 动物以及携带一或多种自发突变的动物是同样适用的。
步骤1：用同样的遗传和微生物学质量标准制备参照动物
传统上，开发转基因动物包括如下步骤：(1)通过显微注射将DNA引入 小鼠的卵，或通过逆转录病毒载体或其它方法引入胚胎干细胞(ES细胞)；(2) 用可靠的基因型分析检测，例如通过PCR或Southern印迹(起始动物)来确认 所述转基因已被整合并转移；(3)通过克隆或有性生殖来增殖；以及(4)质量 控制，其包括遗传质量控制(遗传图谱监控)，所述质量控制使用生物化学标 记物和微生物质量控制，之后是微生物监控系统。因为即使是小的变化也可 使动物在实验室试验中如何表现产生显著不同，所以监控并保证每步骤的质 量，以及保持这些繁殖群体(breeding colony)的优异，对于突变的例如基因改 造的动物模型的可靠性都是必需的。本发明在此整体过程的每个步骤中有明 显改进。
本发明特别提供了群的规范(specification)，其包括在开发用于体内试验 的实验动物过程中的(1)遗传质量保证(超速同类系方法)以及(2)微生物学保 证(两层监控)。生殖过程的此部分被称为“群(population)阶段”。另外，本 发明提供了“有计划的生产和供给系统”，其包括(1)实时(ongoing)监控突变 体例如转基因的稳定性和功能，(2)风险管理系统(大量保存(bulk preservation))，(3)增殖性改造技术，及(4)为所述模型的具体目的选择背景品 系，并且如果必要，拓宽遗传背景来使遗传多样性变宽但可再现并可重复。
遗传质量保证(开发同类系动物的超速方法)
本发明的遗传质量保证步骤，包括用相同的遗传和微生物学质量标准， 以及加速(speed)同类系的方法和技术，制备并确认参照突变的如转基因的动 物，例如小鼠，之后通过在有计划的基础上的遗传监控，来确保保持所期望 的质量。在此步骤中，本发明不仅确保在转基因动物的情况下适当插入所述 转基因，而且确保所述小鼠或其它突变动物的背景基因的同一性。确保突变 动物的遗传背景也是相同的，其重要性在于在遗传背景不是100％同一时， 所述突变动物可能失去亲代动物的表型。例如，p53+/-小鼠由于此原因已经 显示了复杂的表型。本发明此步骤所带来的主要改进在于使该过程加速，即 缩短建立同类系动物所必需的时间，而且应用了两层遗传监控系统。
开发新的如转基因，敲除或敲入的突变动物系通常需要小心地回交至少 5代，更常见至少9代，通常多到12代来在具体的近交(in-bread)动物，如小 鼠品系中建立遗传操纵或自发突变。此方法的结果是在数代后，在固定的遗 传背景下，建立例如转基因，敲除或敲入的突变动物模型，称为“同类系的”。 接受体外受精的动物通常至少大约两月龄，并且怀孕期是19天，这表示每 代的生产需要差不多三个月。所以，建立同类系动物品系是很长的过程，它 通常需数年。本发明提供了建立同类系动物种系的高速方法。根据本发明， 处理每代雌性动物例如小鼠来使其超数排卵，并在大约4周龄接受体外受精。 通常给16日龄的雌性小鼠注射PMSG之后在第28天注射hCG来使其超数 排卵。第29天，所述小鼠自然交配或接受体外受精。第30天，收集两细胞 胚并移植到假孕受体。因为怀孕周期是19天，所以在第49天出现分娩。可 以容易地看到，在每代使用非典型性幼龄(约4周)的动物会显著缩短建立同 类系种系所需要的时间。此方法用图4图示，并更具体地在实施例1中对其 进行描述。
类似方法可用于从表现为低排卵能力的种系生产同类系动物。
微生物学质量保证-替代的微生物质量控制方法
所述微生物环境是影响实验动物演出型的主要因素之一。公知的事实是 爆发微生物感染改变了实验动物的健康，结果是实验结果如生殖及血液化学 表现(Nornura，T.Genetic and microbiological control.In：Immune-Deficient Animals(Sordat，B.等著)，S.Karger AG，Basel，1984.；Itoh，T.等，Expr.Anim.， 30：491-495，1981；Itoh，T.等，Jpn.J.Vet.Sci.40：615-618，1978；Iwai，H.等， Expr.Anim.26：205-212，1977)。并且Narushima等(Narushima等，Exp Anim 47(2)：111-7(1998))阐述肠细菌在转基因rasH2小鼠中改变对致癌物质的反 应。这些发现强有力地表明严格控制微生物环境对于确保实验动物演出型质 量是不可缺少的。另外，应特别注意遗传改造的动物的微生物质量控制，因 为动物的遗传改变可导致免疫感受态(competence)的修饰。也存在表现为裸 鼠独特的(peculiar)感染。所以，严格的微生物控制是开发实验动物模型的必 需部分。
根据上述发明，使精制的(refined)肠细菌菌群在动物即小鼠中建群，并 在严格屏障系统中饲养所述小鼠。如果动物来自其它研究所(institution)，其 中动物被保留在传统设施中而无严格控制的微生物监控，那么所述动物必须 用替代的微生物质量控制方法(AMQCM)来清洁，该方法是本发明的一个完 整部分。通过应用所述AMQCM，可以显著减少动物模型开发阶段的微生物 控制的花费和时间。进行所述两层监控来确保此微生物质量。
本发明相应地提供了计划性生产遗传改造动物并严格确保它们的肠细 菌菌群的微生物质量的新方法。体外受精(IVF)，胚胎深低温保藏，胚胎转移， 由受体和/或代孕母亲喂养的步骤都包含在本方法中。
具体地，对来自疑似有微生物感染的动物的卵子和精子进行IVF来获得 无菌胚胎。将所述胚胎转移到受体小鼠的子宫。来自感染小鼠的精子和卵子 的IVF-胚胎的乳鼠(Pup)在微生物学上是洁净的。严格控制的小鼠原种(stock) 提供了受体和代孕母亲小鼠，其中精制的肠细菌菌群在所述原种小鼠中(AC 原种)建群，从而使乳鼠在哺乳阶段具有相同的菌群。
在替代的微生物质量控制方法中，除了顺序的(ordinal)屏障动物饲养系 统如乙烯基隔离器(vinyl isolator)，还使用一种现代的新设计的胚胎库设备。 所述胚胎库设备包含三个单元1)检疫单元(QU)，2)胚胎操纵及冷冻单元 (EMFU)，和3)回收单元(RU)。所述胚胎库设备的实施例以图13图示。此 QU包含暂存(moor)微生物上不确定的供体的动物室，及收集配子(gamate)(卵 子和精子)的无菌仪器。所述EMFU包括提供给微生物上洁净的供体的动物 室，为收集配子的无菌设备，无菌的IVF和冷冻设备，及存放液氮罐(tank) 的室。所述RU包括给受体，胚胎转移，喂养并饲养的室。所述EMFU和 RU装备了用QU隔离的屏障系统(过滤的正压(positive)气体调节，高压灭菌 (autoclave)，更衣室，等)。在带有过滤正压气体调节的QU中使用乙烯基隔 离器或负压动物饲养仪器。在RU的每个室之间，以及屏障区外部(outside) 与RU每个室之间装备无菌锁以便于转移受体和代孕母亲，胚胎等。在配子 收集及IVF设备之间装备传递(Pass)盒子，以及便于转移无菌管。
除了这些设备，还为无菌和悉生生物动物装备了隔离系统，其中精制的 肠细菌菌群在这些动物(AC原种)中建群。用乙烯基隔离系统将这些动物通 过无菌锁带入RU。
所述替代的微生物质量控制方法见图14图示。将疑似爆发或微生物上 不确定的动物即小鼠置于QU，而将微生物学上确定的动物即SPF(无特殊病 原体(Specific Pathogen Fee))保存在EMFU中。处死供体小鼠并灭菌小鼠表 面。在无菌条件收集卵子和精子，并通过传递盒子转移到IVF设备。进行无 菌IVF并培养成为两细胞胚。在液氮中冷冻所述胚胎，或直接用其移植。将 所述两细胞胚通过无菌锁转移到RU，并无菌移植到受体小鼠。
分娩的乳鼠由受体母亲天然喂养。有时，通过剖腹产分娩的乳鼠由代孕 母亲喂养。在这两种情况，都在喂养时使肠细菌菌群(AC原种)在乳鼠的肠 道建群。
在实施例2中进一步说明此方法。
遗传质量检验(testing)
为用突变的如基因改造的动物如小鼠作为动物模型，必须生产大量遗传 上同源的动物。据此目的，图4说明了两种遗传质量检验。如果此目的是为 明确所述基因改造动物的遗传特征，那么要进行抽查来在具体时间更加具体 地确定给定品系的遗传特征。另一方面，保证稳定的遗传质量需要监控所述 动物，包括周期性检验预先确定的一套质量标准来确认质量无变化。
大多文献中，所述转基因和/或其整合位点的分子分析通常包括不超过五 代。对整合到小鼠宿主基因组的转基因的种系转移稳定性从未做过具体研 究。关于转基因整合和稳定性的观察报道是相互矛盾的，并表现为基因特异 性的。明显的是，所述整合的转基因的广泛分子分析不仅对于确认稳定整合， 而且对消除或防止遗传不稳定性都是必要的。
所述遗传改变的动物(对于转基因是纯合子或半合子)的基因型通常和同 品系的培育者对(breeder pair)的基因型不同。本发明提供新的方法来监控不 同代的转基因稳定性，以及转基因整合位点周围的基因组结构。本发明所述 “早期基因检测方法”通常能在两天内区分纯合子和半合子转基因动物例 如小鼠。与此相反，依赖于同胞交配(sibling mating)的传统方法通常需要超 过一个月。
检测任何一代中的转基因的遗传稳定性通常从确定染色体位置开始，例 如使用荧光原位杂交(FISH)方法。(Matsuda等，Cytogenet.Cell.genet. 61：282-285(1992)；Evans EP.Standard G-banded karyotype，In：Lyon MF， Rastan S.，Bround SDM，eds.，Gene Variations and Stains of the Laboratory Mouse.New York：Oxford University Press；1996，p.1446-1449)。通常其后是 Southern印迹分析来制备整合的转基因位点周围的限制性片段图谱，它提供 了关于转基因结构的重要信息。所述转基因的表达可通过Northern印迹分析 来确认。最后，通过对插入基因和周围基因的逆转录PCR(RT-PCR)直接测 序来完成此分析，例如来鉴定可能出现在所述转基因动物下一代的点突变。
根据本发明，用新的和有效的PCR方法来对转基因动物作基因分型。 设计基因特异性PCR引物，使其从相反方向结合到靶DNA的互补链上，该 靶DNA从所述转基因动物和相应的非-转基因(野生型)动物分离。如图6具 体说明，用分离自转基因和非-转基因动物的基因组DNA进行PCR，其所用 引物对如下：(1)染色体特异性引物A和转基因特异性引物C，来确认5’转 基因/基因组接点；(2)转基因特异性引物D和染色体特异性引物B，来确认3’ 转基因/基因组接点；(3)染色体特异性引物A和B，来鉴定预整合位点；并且 (4)转基因特异性引物C和D，来确认转基因-转基因接点。用这些引物对生 产的PCR扩增产物可根据大小分离，例如在琼脂糖凝胶上，根据其提供的 带型鉴定任何具体动物的基因型。因此，半合子会产生两条带，一条对应于 野生型等位基因，另一条对应于转基因。与此相对，纯合子只显示对应于转 基因的带。另外，由染色体特异性引物对A和B得到的PCR产物的不同会 表明动物遗传背景的不同。
可选或者另外，也可用信号区分来分离或分辨所述PCR产物，如根据 荧光染料标记的产物颜色来区分。例如，当所述转基因特异性引物用FITC 荧光染料标记，染色体特异性引物用HEX染料标记时，转基因特异性引物 的产物会呈发绿的颜色而染色体特异性产物呈发红的颜色，并能根据此性质 用荧光成像探测器(fluorescence imaging detector)来分辨。在此具体实施例中， 来自半合子DNA的所述产物被检测为带由绿和红结合而得的发黄的颜色。
步骤2：有计划的生产和供给系统
另外，本发明提供了有计划的生产和供给系统，其包括(1)实时监控转基 因的稳定性和功能，(2)风险管理系统(大量保藏)，(3)增殖性改造技术，及(4) 使遗传背景加宽来拓宽遗传多样性(见图15)。所述有计划的生产在如上四个 步骤后进行。所述过程用核(nuclear)，扩展(expansion)，和生产集群(colonies) 来实现逐步生产，并冷冻保藏胚胎。使用集群对于风险管理是重要的。对于 提供足够数量的试验动物(生产系)来评估它们在指定的靶人类疾病或生理功 能中的可用性和局限性上，逐步扩展生产是必要的。
在核集群(nuclear colony)阶段，通过深低温保藏来保藏同胞交配 (sib-mating)的受精卵。在扩展和/或生产阶段，所述卵子在体外受精后深低温 冷冻成批保藏。从多只雌性小鼠收集卵子，而从成批保藏的一只雄性小鼠收 集精子。通常需数十个月来通过自然受孕(impregnation)建立生产集群。核集 群中谱系(pedigree line)的深低温保藏系统，以及在扩展和生产集群中的成批 保藏系统都降低了偶然的风险，如有计划的生产中的污染，或其它使生产间 断的问题。
应用本发明的新方法时，通过有计划的生产和供给系统，可在比通常更 短的时程中，建立核集群并确定所述动物的基因型。事实上，在一天内检查 每代的转基因稳定性和基因型。因此，根据使用者说明书，本发明可快速提 供任何期望体重或年龄的试验动物。这比提供婴儿(infant)动物很困难的传统 方法有了显著改进。
步骤3：评估所述动物模型的可用性和局限性
必须限定对于人类疾病真正有用的动物模型，只有符合如下需要的动物 才被认为是限定的动物模型：与人类相象的生理或病理表型必须有与人类相 同的遗传原因，并且必须限定所述动物模型的可用性和局限性。这些要求等 同地用到用作人类疾病的动物模型的所有基因改造的动物。
证明此步骤重要性的一个实施例是一种已经在日本开发的的动物模型， 其用作Duchénne-型肌营养不良的模型。项目开始时，收集了差不多在全世 界用作肌营养不良模型的所有动物并将其提供给临床研究组来作评估(见例 如，Gordon等，PNAS USA 77：7350-7384(1980)；Sugita和Nonaka，Animal Model utilized in research on muscular diseases in Japan，p.271-286 in：J. Kawamata and E.C.Melby(ed.)，Animal Model：assessing the scope of their use in Biomedical research.Alan R.Liss，Inc.，New York；Bulfield等，PNAS USA 81：1189-1192(1984)；Tanabe等，Acta Neuropathol.69：91-95(1986))。来自自发 突变体的这些肌营养不良模型对于澄清所述疾病的病因十分有用，但在 Duchénne-型肌营养不良的研究中用处很少。随研究进展发现，这些患有疾 病的模型只表现出与人类肌营养不良相似的那些病征。在评估所有基因改造 的动物模型(包括转基因，敲除和敲入动物)的可用性上进行类似考虑。更多 细节见，例如，Nomura，Laboratory Animal Science 47：113-117(1997)。
将在解释人类疾病机制中其可用性和局限性已被评估的动物定义为人 类疾病的动物模型。以携带脊髓灰质炎病毒受体基因的转基因小鼠(TgPVR 小鼠)为例，将TgPVR小鼠对脊髓灰质炎病毒的神经毒力的易感性 (susceptibility)与人类疾病脊髓灰质炎(polio)的脊髓灰质炎病毒神经毒力相比 较，来确定它们是否相同。将在解释靶疾病中其可用性和局限性(例如对脊 髓灰质炎病毒神经毒力/脊髓灰质炎的易感性)已被评估的动物定义为可用于 解释该疾病的人类疾病模型。
用如下非限制性实施例来说明本发明更多细节。实施例1图示了超速同 类系方法。实施例2说明了本发明的替代的微生物质量控制(AMQCM)。实 施例3和4分别阐述了在Tg-rasH2和TgPVR21转基因小鼠中确定转基因的 稳定性。实施例5描述了分析转基因/小鼠基因组接点位点的本发明的新方 法。实施例6说明了本发明拓宽转基因动物遗传背景来使遗传多样性变宽的 方法。本发明提供了实施例7-9来通过检测不同转基因动物模型确认本发明 的技术。
实施例1
超速同类方法
所述超速同类方法在图4图示。已经发现性早熟的幼鼠(不成熟小鼠)对 外源性促性腺激素敏感。因此，通过注射促性腺激素可诱导这些不成熟小鼠 超数排卵。使用超数排卵法来生产动物的方法与基于自然交配的传统方法相 比，显著缩短了将所述突变小鼠如转基因(Tg)小鼠的遗传背景变为其它近交 品系的遗传背景所需要的过程。在此研究中，研究了适合诱导实现超数排卵 的条件和不成熟小鼠体外受精后排出的卵母细胞的发育能力。
材料和方法
让不成熟的C57BL/6N雌性小鼠(3-4周龄)接受超数排卵过程，并将同品 系的成熟雄性用作体外受精(IVF)的精子供体。
分别用1.25，2.5，5，10，或20IU怀孕的纯血清促性腺激素(PMSG)和 5IU人类绒毛膜促性腺激素(hCG)以48h间隔分开注射，来诱导23，24，25， 26和27日龄的不成熟雌性小鼠实现超数排卵。在hCG后17-20小时估计每 组排出的卵母细胞数。来自28日龄的小鼠的一些卵母细胞经过IVF过程并 体外培养到2细胞阶段。在成熟的Jcl:MCH(ICR)雌性小鼠假孕第1天，将所 得的2细胞阶段胚转移到其输卵管来评估所述胚胎的胚胎发育。
结果及讨论
被诱导排卵的小鼠比例和排卵的卵母细胞数与所检测小鼠的年龄无关。 在注射了1.25-10IU PMSG时，75-100％小鼠被诱导排卵。每组注射5IU PMSG获得最多的排卵的卵母细胞数(均值52.3-76.3卵母细胞/小鼠)。注射 15或20IU PMSG诱导排卵的效果不如其它剂量的效果。
为评估排卵的卵母细胞的正常性，让来自28日龄小鼠的卵母细胞接受 IVF过程。所述结果显示超过95％的卵母细胞受精并发育到2细胞阶段。胚 胎转移到受体小鼠后，超过50％的所得胚胎产出后代，这提示来自不成熟小 鼠的卵母细胞具有正常的发育能力。
这些结果表明通过注射PMSG和hCG，从约4周龄的不成熟小鼠可得 到正常的卵母细胞，其中来自不成熟小鼠的卵母细胞数是来自成熟小鼠的 3-4倍，并且其卵母细胞具有正常胚胎发育的能力。用此过程，开始用Tg 小鼠与其它品系回交来建立新的同类系小鼠品系。如上所述，用不成熟小鼠 可每48天进行一次回交。
实施例2
替代的微生物质量控制方法(AMQCM)
材料和方法
小鼠：用C57BL/6N小鼠(10周龄)作病毒感染；用JCL:MCH(ICR)小鼠 (10-15周龄)作受体。病毒：用仙台病毒(Sendai病毒)(HVJ MN毒株)和小鼠 肝炎病毒(MHV Nu-67毒株)。血清学检测：对于HVJ进行酶联免疫吸附测定 (ELISA)和血细胞凝集抑制(HI)实验，而对于MHV进行ELISA和补体结合 (complement fixation)(CF)实验。通过小鼠的鼻子使C57BL/6N小鼠感染此病 毒(在第0天，试验的当天开始)。将PMSG(第2天)和hCG(第4天)注射到病 毒感染的C57BL/6N小鼠来使其排卵。在体外受精(IVF)第5天从所述感染的 小鼠收集卵子和精子，并将两细胞胚转移到JCL:MCH(ICR)小鼠的输卵管。 在分娩(在25天)后，由代孕母亲喂养乳鼠直到断奶(wean)(第53天)。饲养断 奶的小鼠到第81天，并对其进行血清学检测。也对受体小鼠和病毒感染的 供体小鼠进行血清学检测。
结果
IVF和胚胎转移：从五只HVJ感染的C57BL/6N小鼠总共收集60个卵 子(平均：12.0个卵子/小鼠)，并且使44个卵子(73.3％)发育成2细胞卵。将 四十个2细胞胚转移到受体并且生出了22只乳鼠(55.0％)，最后使20只小 鼠断奶(90.9％)。另一方面，从五只HVJ感染的C57BL/6N小鼠总共收集163 个卵子(平均：16.3个卵子/小鼠)，并且使145个卵子(89.0％)发育成2细胞 卵。将八十个2细胞胚转移到受体并且生出了45只乳鼠(56.3％)，最后39 只小鼠断奶(86.7％)。
病毒检测：HVJ感染的供体小鼠(一只雄性和5只雌性)接受了ELISA和 HI实验。所有被测样品在ELISA中显示了超标(over-scaled)光密度；在CF 实验滴度超过1∶160(1∶320-160)。MHV感染的供体小鼠(一只雄性和5只雌 性)接受了ELISA和CF实验。ELISA中所有被测样品都显示了超标的光密 度；CF实验中滴度超过1∶20(1∶160-20)。这些证实了供体小鼠确实感染了所 述病毒。而来自HVJ感染供体和来自MHV感染的供体的受体小鼠转移的胚 胎(每种3只)接受了血清学检测。另外，来自HVJ感染的和MHV感染的供 体的精子和卵子的乳鼠(每种5只)接受了血清学检测。受体小鼠和乳鼠在任 何血清学检测中都没有检测出阳性实验结果。
实施例3
作为短期致癌性实验(carcinogenicity testing)的动物模型的rasH2小鼠 的转基因稳定性和特性
材料和方法
动物
通过连接人的活化的c-Ha-ras基因的每个正常部分来构建所述转基 因，其在第12个密码子或第61个密码子有单个点突变，然后亚克隆到 pSV2-gpt质粒的BamHI位点(Sekiya T，等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81： 4771-4775；Sekiya T等，Jpn J Cancer Res 1985；76：851-855)。生产本研究 所用的转基因小鼠见上述(Saitoh等，Oncogene1990；5：1195-1200)。通过使雄 性半合子rasH2转基因小鼠和雌性近交C57BL/6JJic小鼠回交获得 C57BL/6JJic-TgN(RASH2)(Tg-rasH2)小鼠，来保持所述转基因小鼠的起始 集群(foundation coloring)。此研究中，5周龄雄性Tg-rasH2小鼠与N20和得 自深低温保藏的胚胎的N15的Tg-rasH2小鼠自然交配(mate with N20 and Tg-rasH2 mice at N15 obtained from cryopreserved embryos)，并使用了12周 龄雄性C57BL/6JJic(非转基因)小鼠。根据日本实验动物中央研究所(Central Institute for Experimental Animals)建立的指南处理所有使用的动物。
DNA探针
将一等分试样的微注射的DNA(7.0kb BamHI片段)亚克隆到pBlueScript II KS+(pBSII：Stratagene，La Jolla，CA)质粒的BamHI位点。用CsCl平衡离 心之后在Sepharose CL6B柱(Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Buckinghamshire，UK)通过凝胶过滤来纯化所述质粒。用BamHI消化从质粒 切割的包含人c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段并从琼脂糖凝胶回收它。 根据生产商说明书(DIG-标记的随机引物探针)，用DIG DNA标记试剂盒 (Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)用洋地黄毒苷(digoxigenin) (DIG)-11-dUTP标记所述7.0kb的BamHI片段。以所述7.0kb的BamHI片段 作为模板DNA，用正向引物；5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCT CAG-3′(SEQ ID NO：1 )，和反向引物；5′-ACCAGGGGCTGCAGCCAGCCCT ATC-3′(SEQ ID NO：2)，用PCR DIG引物合成试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)制备所述DIG-标记的5′-探针(从位置1,793到2,400)。
荧光原位杂交分析
用荧光原位杂交(FISH)方法(Matsuda等，Cytogenet Cell genet，见上文； Evans EP，见上文)确定所述转基因的染色体位置。用人c-Ha-ras基因的生物 素-16-dUTP-标记的7.0kb BamHI片段分析得自N15和N20的Tg-rasH2小 鼠的有丝分裂原(mitogen)活化的二十个处于细胞中期的脾细胞。用抗-生物 素山羊抗体(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)和异硫氰酸荧光素标记 的抗-山羊免疫球蛋白G(Nordic Immunological Laboratories，Capistrano Beach， CA)来显示所述生物素-标记的DNA，然后用碘化丙锭(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，Germany)复染。用MICROPHOTO-FXA(NIKON CORPORATION，Tokyo，Japan)进行观察，并根据G显带(banding)标准物 (Evans EP，见上文)来鉴定有荧光信号的染色体。
Southern印迹分析
根据标准方案(Sambrook J，Russell DW.Molecular Cloning，Third Edition： A Laboratory Manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2001)， 通过用蛋白酶K过夜温育，之后用苯酚：氯仿提取并用乙醇沉淀，来从 Tg-rasH2小鼠和非转基因小鼠的尾部活检制备基因组DNA。在37℃用3U 限制酶/每毫克DNA消化基因组DNA(通常10μg)过夜，并在-20℃用乙醇沉 淀。沉淀后，在10μl TE缓冲液(10mM Tris，pH7.5，1mM EDTA)重新溶解 所述基因组DNA样品并在0.6％琼脂糖凝胶过夜电泳。所述凝胶顺序地在75 mM HCl中脱嘌呤，在1.5M NaCl/0.5M NaOH中变性，并在pH7.5的1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl中中和。在25mM pH7.0的磷酸钠缓冲液中，通过毛细 管转移将DNA从所述凝胶过夜转移到尼龙膜(Hybond-N+，Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。对所述空气进行干燥和紫外交联。在2×标准柠檬酸 盐水溶液(SSC；0.3M NaCl和30mM柠檬酸钠，pH7.0)中简单清洗所述膜后， 在杂交箱的Church杂交缓冲液中在42℃预杂交所述膜6小时(Church GM， 等，Proc Natl Acad Sci USA 1984；81：1991-1995)。煮5分钟变性所述探针并 将其加入新鲜的Church杂交溶液中的印迹。在42℃杂交所述印迹过夜，再 在50℃用2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸钠洗涤两次，并在65℃用 0.2×SSC/0.1％的十二烷基硫酸钠洗涤两次。根据生产商说明书用DIG发光检 测试剂盒(Luminescent Detection Kit)(Roche Diagnostics GmbH)检测所述杂 交的探针。为检测化学发光信号，让所述印迹暴露于ECL-Plus X-射线胶片 (Amersham Pharmacia Biotech Inc.)。
Northern印迹分析
用TRIzol(Life Technologies Inc.Gaithersburg，MD)提取总细胞RNA。根 据生产商方案用DNase I(Life Technologies Inc.)处理所述RNA溶液。在1％ 琼脂糖/6％甲醛凝胶分级分离所述RNA(10μg)，并将其转移到Hybond-N+尼 龙膜上。对所述印迹进行空气干燥，紫外交联并如上述(Maruyama等， Oncol Rep 2001；8：233-237)杂交。用随机引物DNA标记试剂盒(Roche Diagnostics GmbH)用[α-32P]-dCTP标记鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA和人 c-Ha-ras基因的7.0kb BamHI片段并将其用作杂交探针。使所述膜暴露于 Kodak AR胶片。
克隆基因组/转基因接点区域
为克隆基因组/转基因接点，用限制酶HindIII加BamHI完全消化 Tg-rasH2小鼠的100μg基因组DNA，然后用标准方法用苯酚：氯仿提取并 沉淀(Sambrook J，等，见上文)。通过在蔗糖密度梯度上超速离心分级分离双 消化的DNA的6-9kb的片段，并将该片段连接到pBSII质粒的相同位点。 用与载体连接的基因组DNA作为模板用重组Taq DNA聚合酶(TaKaRa Inc. Shiga，Japan)根据生产商说明书进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR引物， pBSII-rev(5′-GGAAACAGCTATGACCATGATTACGC-3′(SEQ ID NO：3)) 和C(5′-GACCGGAGCCGAGCTCGGGGTTGCTCGAGG-3′(SEQ ID NO：4)) 用于扩增5’基因组/转基因接点；pBSII-rev和D (5′-ATCTCTGGACCTGCCTCTTGGTCATTACGG-3′(SEQ ID NO：5))用于扩 增3′转基因/基因组接点。在ABI PCR2400(Applera Corporation，Applied Biosystems，Foster City，CA)中，将反应混合物加热到94℃2分钟，然后以 94℃30秒，66℃30秒和72℃3分钟扩增35个循环，之后将所述混合物在 ABIPCR2400(Applera Corporation，Applied Biosystems，Foster City，CA)中 保存在72℃5分钟。用ABI PRISM310基因分析仪(Applera Corporation)用 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反应试剂盒 (Applera Corporation)确定HindIII邻近区域的核苷酸序列。为分离所述基因 组/转基因接点，基于所述通过PCR克隆方法确定的序列来设计两种新的引 物，A(5′-GGGTCCTCTGGAGCTGGAGTTACAGACTAC-3′(SEQ ID NO：6)) 和B(5′-GCTTGGCTTAAGATACAGCAGCTATCCTG-3′(SEQ ID NO：7))。 以Tg-rasH2小鼠基因组DNA作为模板，用引物C加A(对于5′基因组/转基 因接点)，和D加B(3′转基因/基因组接点)进行PCR扩增。为克隆转基因/ 转基因接点，用Tg-rasH2小鼠DNA和引物D及C进行PCR扩增。为明确 所述整合过程及由转基因插入带来的可能的位置效应，从非转基因和 Tg-rasH2的小鼠DNA用引物A和B扩增所述预整合位点。PCR条件与上 述相同。
测序整合的人c-Ha-ras基因
从N20的Tg-rasH2通过PCR获得覆盖整个整合的人c-Ha-ras基因的五 种重叠的PCR产物，其中所用引物为引物D(见上)加E(5′-CACGCACCCAA ATTAGAAGCTGCTGGGTCG-3′(SEQ ID NO：8))，
F(5′-CCGACCTGTTCTGGAGGACGGTAACCTCAG-3′)加G(5′-CACA CGGGAAGCTGGACTCTGGCCATCTCG-3′(SEQ ID NO：9))，
H(5′-AAACCCTGGCCAGACCTGGAGTTCAGGAGG-3′(SEQ ID NO： 10))加I(5′-AACCTCCCCCTCCCAAAGGCTATGGAGAGC-3′(SEQ ID NO： 11))，以及
J(5′-TGCGCGTGTGGCCTGGCATGAGGTATGTCG-3′(SEQ ID NO：12)) 加K(5′-GTGCTGGGCCCTGACCCCTCCACGTCTGTC-3′(SEQ ID NO： 13))。
用UltraClean PCR Clean-up DNA纯化试剂盒(Mo Bio Laboratories Inc.， Solana Beach，CA)纯化PCR产物，并通过引物步测(primer walking)法确定核 苷酸序列。
结果
检测Tg-rasH2 小鼠中转基因稳定性
如图8A所示，通过显微注射包含人c-Ha-ras基因7.0kb的构建体 (BamHI片段)，Saitoh等在1990建立所述转基因小鼠系rasH2。原来产生的 生成小鼠是杂交(C57BL/6J×DBA/2J)系，并与C57BL/6JJic回交，来生成遗 传上同源的群。因为回交已经进行至超过N20，并已经生产了30,000只以上 的转基因小鼠。在经过很多代的大规模繁殖中，已经检测了整合到所述 Tg-rasH2小鼠基因组的转基因的遗传稳定性。通过FISH方法确定在N15和 N20的Tg-rasH2小鼠中所述整合的转基因的染色体定位。表示所述转基因 位置的成对的荧光信号在两种情况下(图7)都可在染色体15E3区域观察到。 所述Tg-rasH2小鼠是半合子，所以只在一对姐妹染色单体检测到所述杂交 信号。
进行Southern印迹分析来制备整合的转基因位点周围的限制性酶切片 段图谱，它为转基因结构提供了重要信息。用BamHI消化Tg-rasH2小鼠DNA 产生了三条与DIG-标记的随机引物探针杂交的带(7.0kb和两条分子量更高 的带)(图8B)。在N15(图8B，第2和3道)和N20(图8B，第4和5道)的Tg-rasH2 小鼠的杂交带型没观察到不同。用BamHI消化的非转基因小鼠DNA与相同 的探针(图8B，第1道)没产生任何杂交带。BamHI-消化的Tg-rasH2小鼠DNA 与DIG-标记的5′-探针(图8C，第1道)或DIG-标记的3’-探针(位置从6,024 到6,712；数据未示)杂交也显示与DIG-标记的随机引物探针获得的杂交带型 相同。我们通过Northern印迹分析确认所述转基因的表达。在Tg-rasH2小 鼠的脑(B)，而不是在非转基因小鼠中观察到所述人c-Ha-ras基因的表达。 除了脑，在每代(N15和N20)Tg-rasH2小鼠(图9)的肺(L)和前胃(F)都表达所 述转基因。逆转录PCR(PT-PCR)直接测序分析表明在Tg-rasH2小鼠的任何 一代都看不到在人c-Ha-ras基因的密码子12和61优先出现的点突变。除 了突变热点(hot spot)，在编码区域看不到核苷酸改变(数据未示)。
在Tg-rasH2小鼠确定转基因方向(Orientation)和拷贝数
为清楚所述整合的转基因结构，用数种限制酶(HpaI，XhoI，XbaI，NcoI， NglII)消化Tg-rasH2小鼠基因组DNA并进行Southern印迹分析，其中所述 限制酶切割所述转基因的已知单个位点。如果所述整合的转基因以头-y-尾 (head-y-tail)构型串联存在，这些限制酶会产生7kb的片段。用XbaI消化直 接重复转基因拷贝会产生7kb的片段，而反向重复会产生9.1kb(尾-对-尾) 或4.9kb(头-对-头)的片段。事实上，用XbaI消化的在N20的Tg-rasH2小鼠 的基因组DNA产生和DIG-标记的5’-探针(图8C，第4道)的7kb的杂交带。 切割所述转基因的已知单个位点的所有其它限制酶也产生与DIG-标记的5’- 探针杂交的7kb带(图8C，第2，3，5和6道)。这些结果表明所述整合的转 基因的数个拷贝以头-对-尾构型串联存在。在N15的Tg-rasH2小鼠中也观察 到相同的杂交带型(数据未示)。
为确定所述整合的转基因的拷贝数，用HindIII完全消化Tg-rasH2小鼠 DNA，然后用多种浓度的BamHI限制酶部分消化所述等分试样。在0.4％琼 脂糖凝胶上，对所述消化的DNA进行电泳来清楚分辨分子量高的DNA样 品。见图10所示，用DIG-标记的随机引物探针作Southern印迹分析。当用 HindIII完全消化基因组DNA时，只有22.2kb的带与DIG-标记的随机引物 探针杂交(图10，第2道)。所述22.2kb的片段最多包含三个拷贝的7.0kb的 转基因。HindIII和BamHI双消化产生与DIG-标记的随机引物探针(图10，第 5道)杂交的8kb和多个7kb的片段。当HindIII消化的基因组DNA用BamHI (图10，第3道)进一步部分消化时，除了22.2，8和7kb的带，14.2和15kb 的带也与DIG-标记的随机引物探针杂交。这些结果表明Tg-rasH2小鼠在它 们的基因组中包含三个拷贝的所述转基因。
克隆并测序基因组/转基因接点和它们的相应的预整合位点
从Southern印迹分析获得的结果表明用HindIII和BamHI双消化 Tg-rasH2基因组DNA得到的7和8kb的片段包括基因组/转基因和/或转基 因/基因组接点区域。为研究Tg-rasH2小鼠基因组中所述基因组/转基因接点 的精细结构，用超速离心在蔗糖密度梯度上分级分离的6-9kb的 HindIII-BamHI双消化的片段连接到pBSII质粒的相同位点。用使用合适引 物(pBSII-rev和C；用于扩增5’基因组/转基因接点，pBSII-rev和D；用于扩 增3′转基因/基因组接点)通过PCR(第1次PCR)来扩增两PCR引物之间的 序列(GenBank登录号AB072334)，并且用PCR-直接测序来分析。为消除所 述扩增的DNA片段为所述PCR-克隆过程的人工产物(artifact)的可能性，所 述基因组/转基因接点的每一端通过第2次PCR用如下引物组(C加A和D加 B，图11C)从Tg-rasH2小鼠基因组DNA进行重新克隆。用引物组C加A， 和D加B扩增的每种PCR产物只见于Tg-rasH2小鼠，且具有分别为867-bp (图11A，第1道)和804-bp(图10A，第3道)的预测大小。所述第2次PCR 产物的核苷酸序列与第1次PCR产物的核苷酸序列一样。这些结果表明通 过PCR-克隆获得的基因组/转基因接点序列确实存在于Tg-rasH2小鼠基因 组。
从非转基因和Tg-rasH2小鼠DNA用PCR方法扩增之后并克隆预整合 位点。在位于所述转基因插入位点的侧翼的特定序列内用引物A和B扩增 所述预整合位点。引物组A加B在非转基因小鼠和Tg-rasH2小鼠产生2.2kb 的PCR产物(图11A，第5和6道)。另外，也可从DBA/2J小鼠的DNA获 得所述2.2kb的PCR产物(数据未示)。本试验中，我们使用C57BL/6JJic小 鼠作为非转基因对照来确定所述预整合位点。然而，原来的rasH2小鼠是 在C57BL/6J×DBA/2J杂交品系产生的，所以我们不能排除所述微注射的人 c-Ha-ras基因整合到所述DBA/2J等位基因的可能性。所述Tg-rasH2小鼠是 半合子并且有一个野生型等位基因。发现所述2.2kb的片段包含小鼠基因组 DNA序列，而该序列可能已经从Tg-rasH2小鼠基因组缺失了。通过PCR- 直接测序，我们确定了所述2.2kb片段的核苷酸序列(GenBank登录号 AB072335)，并将其与所述转基因/基因组接点的序列(GenBank登录号 AB072334)和微注射的DNA比较。DNA测序分析表明当所述微注射的人 c-Ha-ras基因被整合到小鼠宿主基因组时，1,820-bp的序列已经缺失。
图12将所述5’基因组/转基因接点(5’J)和3′转基因/基因组接点(3′J)序列 与所述宿主基因组和注射的DNA序列作以比较。两接点共同的显著特点是 在亲本序列间存在短同源序列。在整个(Spanning)5′J，在所注射的序列的5′ 末端有148-bp的缺失，并且在所述亲本序列之间的4-bp同源序列(CCAG) 存在于最终整合体(integrant)的5′末端。在整个3′J，在一段序列(stretch)内有 90％的同源性，其中在3′末端缺失24-bp的转基因整合体的3′末端序列和 亲本序列之间，有10bp(TCCTgCTGCC；所述小写字表示错配位置)是同源 的。我们的结果支持短的同源性配对(pairing)可能对染色体的整合事件有贡 献作用的假设。发现哺乳动物的拓扑异构酶I的切割位点的共有序列在宿主 基因组的5′J和3′J的附近。此序列也出现在5′J和3′J位点附近的注射的 DNA中。
对所述转基因构建体及在Tg-rasH2小鼠中的整合的人c-Ha-ras基因的 序列分析
用PCR-限制性片段长度多态性和PCR-直接测序来分析在多联体内的转 基因/转基因接点。用引物D和C扩增的PCR产物只在Tg-rasH2小鼠观察 到其为预料的大小即1.4kb(图11A，第7道，和图11B，第1道)。扩增的 1.4kb的片段用BamHI消化分为两个大小为0.7kb的片段(图11B，第2道)。 所述PCR-直接测序也表明转基因/转基因接点保留了Tg-rasH2小鼠基因组的 BamHI识别序列，并且在这些接点无序列丢失或重排。
对所述转基因构建体及在Tg-rasH2 小鼠内整合的人c-Ha-ras基因的序 列分析
通过连接来自人类黑素瘤和膀胱癌细胞系的c-Ha-ras基因的每个正常 部分制备7.0kb的构建体(Sekiya等，PNAS USA 81：4771-4775(1984)；Sekiya 等，Jpn Cancer Res 76：851-855(1985))。这些细胞系中的c-Ha-ras基因的核苷 酸序列已经在公共数据库注册(GenBank登录号M30539和V00574)。所述 7.0kb的构建体是嵌合的和人工的ras基因，所以我们不知道用于显微注射 的此构建体的精确核苷酸序列。因此，我们重新确认等分剂量的微注射的 DNA的核苷酸序列。我们确定了嵌合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列(＝7.0 kb的BamHI片段，6,992-bp)。当此序列与来自黑素瘤和膀胱癌细胞系的人 c-Ha-ras基因序列相比时，在所述嵌合的人c-Ha-ras基因可见数种次要的不 同。然而，我们在每个外显子中不能检测到任何变化。我们也确定了所述整 合的人c-Ha-ras基因的核苷酸序列。使用合适引物(见材料和方法)通过PCR 获得覆盖了整个整合的人c-Ha-ras转基因的五种重叠的PCR产物，并通过 PCR-直接测序(GenBank登录号AB072334)进行分析。对于从N20的Tg-rasH2 小鼠和微注射的DNA获得的核苷酸序列，除了所述串联排列的转基因两末 端的小缺失外，我们不能检测到任何差异。
讨论
原来的rasH2小鼠(C57BL/6J×DBA/2J的杂种)已与C57BL/6JJic品系回 交来生产遗传上同源的群。现在，回交已进行至超过N20。看起来此转基因 系的遗传背景已差不多被C57BL/6JJic的背景取代(约99.9998％)，(Silver LM， Experimental Mouse.In：Silver LM ed.，Mouse Genetics，Concepts and Applications，New York：Oxford University Press；1995，p.46-48)。重要的是考 虑用于致癌实验的动物遗传背景，这是因为自发和化学诱导的肿瘤发病率在 小鼠品系是不同的。对于短期致癌实验，我们推荐使用通过雌性BALB/cByJ 小鼠和雄性Tg-rasH2小鼠繁殖获得的F1杂种rasH2转基因小鼠 (CB6F1-Tg-rasH2)。此独特的繁殖系统有两项优点：其一是可能获得对化学 化合物的较宽多样性反应，并且另一个是可能使用同胞非转基因 (CB6F1-NonTg)小鼠作为检查的对照。
此研究中，我们发现在Tg-rasH2小鼠中整合的人c-Ha-ras基因逐代稳定 传递。微注射到培养的细胞或小鼠受精卵的DNA分子通常整合到宿主基因 组中的单个位点，并且当这些转基因以多个拷贝存在时，它们主要以头-对- 尾串联而较少以头-对-头或尾-对-尾方向排列(Filger等，Mol Cell Biol 2：1372-1387(1982)；Gordon和Ruddle，Gene 33：121-136(1985)；Palmiter和 Brinster，Annu Rev genet 20：465-499(1986))。已知Tg.AC转基因小鼠有对阳 性对照化合物12-O-十四烷酰佛波醇13-醋酸酯(tetradecanoylphorbol 13-acetate)无反应的群体(Thompson等，Toxicol Pathol 26：548-555(1998)； Weaver等，Toxicol Pahthol 26：532-540(1998)；B1anchard等，Toxicol Pathol 26：541-547(1998))，并且此无反应群显示所述反向重复的头-对-头接点顶部 附近的基因缺失(Thompson等，Toxicol Pathol见上文；Honchel等， Mol Carcinog 30：99-110(2001)。多项研究表明转基因中带有回纹结构的反 向重复序列使所述基因不稳定(Akgun等，Mol Cell Biol 17：5559-5570 (1997)；Collick等，EMBO J.15：1163-1171(1996)；Ford和Fried，Cell 45：425-430(1986))。幸运的是，在Tg-rasH2小鼠基因组中串联排列的人 c-Ha-ras转基因无回纹结构，但我们不知道在大规模繁殖经过很多代时是否 会出现转基因重排。Aigner等观察了七个系的酪氨酸酶基因转基因小鼠，认 为繁殖计划(program)可持续很多代而在建立的纯合子转基因系中不再需要 严格的分子分析(Aigher等，见上文)。然而，他们指出极少的个体在它们的 试验中受转基因拷贝丢失的影响。我们这里要说明在Tg-rasH2小鼠整合的 所述转基因逐代并在大规模繁殖时稳定传递(图7和8)。在450只Tg-rasH2 小鼠的Southern印迹分析中，我们在个体DNA样品中没发现任何不同(未公 布数据)。然而，我们相信定期间隔检查用于致癌实验的Tg-rasH2小鼠中的 基因型和表型是需要的，因为起始集群中的无反应者突变体可能造成的污染 会影响致癌实验结果的可靠性。因此，我们通过仔细的分子遗传分析应确认 每代亲本Tg-rasH2(C57BL/6JJic-TgN(RASH2))小鼠的完整性，所述分析包括 对所表达的人c-Ha-ras基因的Southern和Northern印迹和PCR-直接测序(近 来在N23的结果无明显变化，未公布数据)。另外，实际实验模 型CB6F1-Tg-rasH2小鼠应接受N-甲基-N-硝基脲作为阳性对照化合物的致 癌实验。
Southern印迹分析结果表明所述整合的转基因的拷贝数。通常，难以确 定整合的转基因的确切拷贝数，因为微注射的DNA被重复(reiterate)来形成 每个位点从大约100-700个拷贝的串联或反向排列。在Tg-rasH2小鼠，所述 微注射的人c-Ha-ras基因的序列没有任何HindIII识别位点。因此，所述转 基因整合位点用HindIII消化从Tg-rasH2小鼠基因组切出，并用Southern印 迹分析检出为单个22.2kb的带。如果所述完整的7kb的人c-Ha-ras基因被 整合到Tg-rasH2小鼠基因组，所述整合的转基因不会超过三个拷贝。另外， BamHI消化会产生与覆盖整个所述7kb的人c-Ha-ras基因的随机引物探针 杂交的三条带，这表明所述整合的转基因最少有三个拷贝。然而，如果它已 经以环形存在，那么通过整合所述基因的两个拷贝，可能获得类似的带型。 如果这样，当用覆盖7kb的人c-Ha-ras基因的位置1,793-2,400的5′-探针(图 8C，第1道)或覆盖位置6,024-6,712的3′-探针(未公布数据)进行杂交时， BamHI消化会产生两条杂交带。所述两个区域特异性探针都杂交并产生三条 带，所述带与那些随机引物探针产生的那些带类似。这些结果表明所述整合 的转基因有三个拷贝。在两端存在基因组/转基因接点的序列(图12)也不可能 以环形整合。
因为不知道当所述微注射DNA整合到小鼠基因组时，所述转基因拷贝 是否表现任何缺失或重排，我们从Tg-rasH2小鼠DNA克隆所述基因组/转 基因及转基因/基因组接点，并从所述非转基因小鼠克隆它们的相应预整合位 点。已经报道所述微注射DNA的末端序列相对保守，并通过在转基因小鼠 中缺失或插入最多数个核苷酸来被修饰(Pawlik等，Gene 165：173-181(1995)； Hamada等，Gene 128：1978-202(1993)；McFarlane和Wilson，Transgene Res 5：171-177(1996))。从Southern印迹分析结果，我们怀疑在Tg-rasH2小鼠基 因组中串联排列的转基因拷贝的两个(5′和3′)末端有一些缺失。如果所述串联 转基因被完整整合，所述整合的转基因拷贝在它们的接点就会有保守的 BamHI位点，并经BamHI消化会产生仅7.0kb的单体片段。比对所述转基 因/基因组接点和所述微注射的DNA的序列表明，Tg-rasH2小鼠在在转基因 整合的5′末端有148-bp的缺失并在3′末端有24-bp的缺失(GenBank登录号 AB072334)。在两末端可见的这些缺失提示所述转基因多联体整合前以线性 而不是环形存在，并且所述线性多联体的游离末端是重组的优选位点。所述 转基因的整合基因座的核苷酸序列分析表明，在整合接点所述亲本序列之间 存在短同源序列(在5’末端的4-bp和在3’末端的10-bp中的9bp)。在转染的 成纤维细胞和转基因小鼠系已经观察到位于整合接点和宿主基因组的转基 因之间的这些短同源序列(Hamada等，Gene 128：197-202(1993)；McFarln\ana 和Wilson，Transgene Res 5：171-177(1996))。另外，DNA拓扑异构酶I似 乎在微注射DNA的整合中起重要作用。据发现，所述哺乳动物拓扑异构酶 I切割位点的共有序列(Been和Burgess，Nucleic Acids Res 12：3097-3114 (1984))在多个转基因系(Hamada等，见上文，McFarlane和Wilson等，见上文) 和Tg-rasH2小鼠的整合的转基因位点附近(图12)。
在转基因插入处，视具体情况而定出现宿主基因组的缺失或重排。当所 述微注射的人c-Ha-ras基因整合到小鼠宿主基因组时，Tg-rasH2的宿主基因 组出现核苷酸缺失(1,820-bp)。用BLAST2程序比较Tg-rasH2小鼠缺失的核 苷酸序列(GenBank登录号AB072335)和GenBank数据库的那些序列，来鉴 定可能的同源性。所述缺失序列与数据库中的已知功能性基因没有任何同源 性。然而，发现所述缺失区域携带与人DNA序列同源的序列，所述序列来 自包含RPL7(60S核糖体蛋白质L7，GenBank登录号AL031589)假基因的染 色体22上的克隆RP6-11O7。所述缺失区域序列的312-bp(位置698-1,009) 表明与人DNA克隆RP6-11O7(位置9,023-9,334)88％的同源性，但在RPL7 的编码区没观察到序列同源性。在所述缺失序列用多种框架和方向翻译成为 相应的氨基酸序列时，没观察到氨基酸水平的序列同源性。尽管我们确定的 缺失序列可能位于内含子或启动子区域，将所述人c-Ha-ras基因插入到宿主 小鼠基因组不会产生插入突变。基础基因表达不受插入Tg-rasH2小鼠的转 基因的影响。此结论得到表达图谱方法的初步证据的支持。我们在比较了 9,514个单基因(unigene)的基础基因表达后未发现Tg-rasH2小鼠的肝和非转 基因小鼠的肝之间有显著不同(数据未公不布)。
Tg-rasH2转基因小鼠是一个遗传上同源的群体，它已经用分子生物分 析包括转基因结构和改变宿主基因组序列来精制，应为短期致癌试验的有用 的啮齿动物模型。
实施例4
作为神经毒力实验(NVT)动物模型的TgPVR21小鼠的转基因稳定性
Nomoto(PNAS，88：951-955，1991)制造了携带人脊髓灰质炎病毒受体 (PVR)基因的转基因小鼠。已经开发此小鼠作为神经毒力实验(NVT)的动物 模型，来替代日本实验动物中央研究所的猴神经毒力实验(MNVT)。所述转 基因的稳定性是确保该TgPVR21转基因小鼠作为NVT动物模型的生殖质量 的关键因素。为检测所述转基因在TgPVR21小鼠的稳定性，在对IQI品系 的同类系过程中在不同代中分析所述转基因的分子结构。
材料和方法
在对IQI品系的回交数为N3，N15和N20时，分析在TgPVR21小鼠的 转基因结构(表A)。如下述，用标准方法进行FISH，Southerrn和Northern印 迹，以及RT-PCR分析(表A)。也确定了所述转基因编码区的核苷酸序列。
结果
FISH(图16)
用生物素-标记的HC5克隆作为探针进行FISH分析并通过抗生物素蛋 白-FITC方法观察。如图16所示，在N15的转基因纯合子和N20的半合子 的第13条染色体(位置13B3)分别见到两个双生斑(twin spot)和一个双生斑。 此分析中观察到的转基因的染色体定位与以前的结果一致(Nomoto，1991，见 上文)。
Southern印迹分析(图17)
用BamHI消化10微克从转基因纯合子的N15小鼠和半合子的N20小 鼠获得的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。将DNA转移到膜上。所述膜与图 17所示的探针杂交(PVR-α的编码区)。在两只小鼠和对照的HC5克隆中发现 杂交带大小为1.2，1.3和10kb。这些发现与以前的结果一致，这表明未出 现重排，并且所述转基因在TgPVR21品系的同类系过程中是稳定的。
基因表达分析
进行Northern印迹，PT-PCR和直接测序来检测TgPVR21品系的基因 表达图谱(图18)。整合的转基因基因的结构，及基因剪接产生的三种mRNA 产物，Northern分析的探针，引物和部分测序见图19所示。将总细胞RNA 进行凝胶电泳并转移到膜上。所述膜与图17所示的探针(PVR-α mRNA的 cDNA)杂交。在N15和N20的TgPVR21品系检测到单一3.3k的带。这里 所得数据与之前的结果一致(Nomoto，1991，见上文)。从N3，N15和N20的 TgPVR21小鼠的脑，肾和肠获得的RNA进行了PT-PCR分析。用旁路剪接 得到的来自整合的PVR基因的三种RNA产物(PVR-α，-β，和-γ)经检测为预 期的大小(149，173和308bp)。用得自N15小鼠脑的RNA获得的cDNA来 进行PCR直接方法测序。结果确认所述整合的转基因产生与所述PVR基因 的编码区(1,254bp，起始密码子ATG到终止密码子TGA)极好匹配的RNA。
实施例5
分析转基因/小鼠基因组接点的位点
已确认根据本发明的生产方法能稳定地逐代传递转基因。此事实可开发 新方法来对所述小鼠作基因分型。所述转基因的整合位点包括所述转基因/ 小鼠的基因组接点区域。克隆并分析新的转基因小鼠品系(TgPVR21小鼠- 见上实施例4，和rasH2小鼠-上述实施例3)来用这些品系说明新的基因分 型方法。该新的基因分型方法的一般概念见图6说明。此图中，较暗的箭头 指示了设计用来检测野生型的PCR引物，而亮的箭头指示了设计用来检测 所述小鼠的转基因型的PCR引物。用此方法，可清楚容易地辨别多种基因 型，例如野生型纯合子，半合子(或杂合子)和转基因纯合子。从TgPVR21 小鼠的转基因纯合子获得DNA。
Southern印迹分析
进行Southern印迹分析来获得所述转基因/小鼠基因组接点位点的`5区 的限制酶图谱。用BamHI，EcoRI，BglII，NcoI，HindII和XbaI作DNA 消化。用所述转基因的载体部分的700bp的片段作为Southern印迹分析的 探针(图20)。
Southern印迹分析的结果见图21A所示。计算每条带的大小并如图21B 所示。通过带的大小信息获得所述限制酶图谱，并见图21C说明。所述图谱 提供了如下有价值的信息。首先，所述转基因/小鼠基因组接点的点(point) 的不对称模式表明所述转基因没有头-对-头构型。第二，每个限制酶消化步 骤仅获得单一条带的事实表明所述转基因的单拷贝应整合到TgPVR21转基 因小鼠的小鼠基因组。
克隆并测序所述转基因/小鼠基因组接点的5′区域
用BglII完全消化TgPVR21的转基因纯合子的基因组DNA。在蔗糖密 度梯度用超速离心分离包含2.9kb片段的DNA并进行自身连接(图22A)。 用连接的DNA进行反向PCR来扩增所述5′基因组/转基因接点(图22B)。直 接测序所述PCR产物来获得所述接点位点(第一次PCR)的核苷酸序列信息。 然后，用第一次PCR产物作为探针从基因组DNA克隆包含所述转基因/小 鼠基因组接点区的DNA片段(图22C)。用所克隆的DNA作为模板进行第二 次PCR，并扩增预期为1.5kb的PCR产物(图22D)。最后，用步测引物进行 PCR直接测序来得到转基因/小鼠基因组接点处上游1kb的基因组信息(图 22E)。
用所述转基因/小鼠基因组接点位点获得的小鼠基因组信息进行BLAST 检索。该BLAST检索得到注册的克隆号2833685，它与克隆的片段(PVR基 因)的200bp完全同源，并且所述转基因/小鼠基因组接点区域的上游位点结 构如图23确定。
实施例6拓宽遗传背景来使遗传多样性变宽
如果将实验动物用于安全试验(safety test)，拓宽(扩展)它们的遗传背景 来使遗传多样性变宽是十分需要的，然后会导致敏感范围更宽，行为表现多 样化并且表现型和演出型方面的谱(spectrum)更宽。另外，如果不确认此动 物持续的遗传一致性(equity)/稳定性，就不能保证此系统的再现性。为确保 遗传背景变宽和持续的遗传质量/稳定性，从选择的近交(并且完全同类)的品 系生产杂种动物。当需要进一步扩展遗传多样性时，杂种品系可与其它杂种 品系交配来生产多交(multi-cross)杂种。这样，通过杂种-交配确保了遗传多 样性变宽，而通过遗传监控每个选择的品系确保了持续的遗传同一性/稳定 性。此方法的第一个步骤是选择第一代(F1)动物的最适背景品系。因为不同 的品系表现出对靶疾病不同的敏感性，谱和性能(performance)，所述选择包 括综述多种品系与靶疾病相关的信息。此信息可得自，例如，Jackson Laboratory database(Bar Harbor，Maine，U.S.A.)，和此靶疾病的专家。选择背 景品系的第二部分是综述可得的关于多种品系的生殖系数的信息。此信息可 得自日本实验动物中央研究所(CIEA)的生殖系数数据库(Reproductive Index Database)。
通常，从若干近交系选择F1的目标是保持所述靶疾病的多样性(例如癌 症的发病率和谱)，所述多样性与在人类患者观察到的多样性类似，并且提 供稳定的生殖比率，从而可以更好计划所需动物的数量。
多种近交小鼠品系的生殖数据见下表B说明。
表B 品系 出生率％ 同胞均数 (Average of sib) 断奶比率 生殖系数 C57BL/6J 84.8 6.2 92.3 4.8 BALB/cByJ 88.6 6.4 95.3 5.3 AKR/J 45.3 4.9 75.2 1.7 C3H/HeN 52.0 5.6 89.6 2.6 DBA/2J 88.9 4.6 91.7 3.7 C57BL/6J- TgrasH2 43.2 6.0 89.0 2.3 C3H/HeJ 88.4 5.7 93.5 4.7 DBA/2N 80.5 4.5 93.4 3.9
CIEA和日本CLEA
出生率＝母鼠数与交配的亲代小鼠数之比的％。同胞均数＝同胞总数与分 娩的母鼠数之比。断奶比率＝断奶的同胞数与同胞总数之比。生殖系数＝断奶 的同胞数与交配的亲代小鼠数之比。
表C X 出生率％ 同胞均数 断奶比率 生殖系数 BALB/cByJ×C57BL/6J CB6F1 89.6 8.2 95.2 7.0 BALB/cByJ ×C57BL/6J-TgrasH2 CB6F1-TgrasH2 44.5 7.5 96.4 3.2 C57BL/6J×DBA/2J BDF1 76.6 9.1 96.2 6.7 C57BL/6J×C3H/eJ B6C3F1 95.6 8.2 95.8 7.5
表B和C列出的数据结合于下表D内。
表D C57B L/6J BALB/ cByJ AK R/J C3H/ HeN DBA/ 2J B6J-Tgr asH2 C3H/ HeJ DBA /2N C57BL/6 J 4.8 7.5 6.7 2.3 BALB/c ByJ 7.0 5.3 3.2 AKR/J 1.7 C3H/He N 2.6 DBA/2J 3.7 B6J-Tgr asH2 C3H/HeJ 4.7 DBA/2N 3.9
实施例7
Tg PVR21
因为只有灵长类对脊髓灰质炎病毒易感，已经在猴神经毒力实验(MNVT) 中用传统方法测定了口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的神经毒力安全性和一 致性。开发携带人脊髓灰质炎病毒受体(PVR)基因的转基因(Tg)小鼠后，评 估了这些小鼠用于取代OPV实验中猴的适合性。检验了两个系的Tg小鼠， TgPVR1和TgPVR21。在其中进行脊髓接种的TgPVR21小鼠在辨别那些已 经通过和未通过所述猴神经毒力实验的成批的3型和2型OPV上和猴子一 样敏感。用聚合酶链式反应的新的分子分析和限制酶切割结果显示，每批 OPV包含病毒基因组中很少量的神经毒性回复体(revertant)。所有未通过猴 神经毒力实验的比通过此实验的3型OPV有更高百分比的472-C回复体。 分析多批3型OPV也显示在472-C回复体的含量和TgPVR21小鼠实验的结 果之间有好的相关性。大量数据总结表明所述TgPVR21小鼠模型适合评估 3型和2型OPV。现正在考虑用TgPVR小鼠试验检测1型OPV，三个Sabin 品系中的最稳定的一个，的神经毒力的必要性。
只有灵长类对脊髓灰质炎病毒的所有三个血清型易感，所以已经在神经 毒力实验(MNVT)(1)中检验了所述口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)的安全性 及其一致性。每批三价的疫苗用大约100只猴。在数个国家进行两次MNVT， 一次是由生产者进行，另一次是由国家控制机关进行。除了高成本之外，得 自野外的猴通常得自可能将外来疾病传递给人。我们描述了替代动物系统的 状态-转基因小鼠对脊髓灰质炎病毒易感。
两组科学家通过将编码脊髓灰质炎病毒的细胞受体的人类基因引入小 鼠基因组来衍生携带人类脊髓灰质炎病毒受体(TgPVR)的转基因小鼠(Ren 等， Cell 63：353-362，1990；Koike等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955， 1991)。与对猴的观察类似，当TgPVR小鼠感染了脊髓灰质炎病毒时，它发 作了弛缓性麻痹，之后一些小鼠死亡，并且在中枢神经系统有组织学损伤。 所述TgPVR小鼠已经广泛用于研究试验诱导的脊髓灰质炎的病因和脊髓灰 质炎病毒减毒的多种方面(Ren等， Cell 63：353-362，1990；Koike等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955，1991；Ren etal.， J.Virol.65：1377-1382，1991； Ren等， J.Virol.66”296-304，1992；Racaniello等， Develop.Biol.Stand. 78：109-116，1993；Koike等， Develop.Biol.Stand 78：101-107.1993；Horie等， J.Virol.68：681-688，1994；Koike等， Arch.Virol.139：351-362，1994)。在1992， 世界卫生组织(WHO)推荐用有不同程度神经毒力的3型脊髓灰质炎病毒品 系(世界卫生组织， Bull.W.H.O..21：233-237，1992)来比较TgPVR小鼠(Koike 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：951-955，1991)和猴的敏感性。美国食物和 药品管理局(FDA)对脑内接种的TgPVR1小鼠系进行的研究显示，此小鼠系 统能区分野生型Leon/37品系，Sabin 3疫苗品系和从粪便分离的疫苗病毒 的基本上去减毒(de-attenuated)的克隆(Dragunsky等， Biologicals 21：233-237， 1993)。然而，脑内接种的TgPVR1小鼠不能区分通过和没通过MNVT的成 批OPV。后来Horie等(Horie等， J.Virol.68：681-688，1994)发现此小鼠系 统不能辨别对于猴有相对低但不同水平的神经毒力的3型脊髓灰质炎病毒品 系；成批OPV不包括在它们的研究中。因为TgPVR1小鼠系统不适合检验 OPV，我们开始注意到其它小鼠系即TgPVR21。如在MNVT中一样将病毒 样品接种到小鼠脊髓。在MNVT中决定疫苗通过/没通过是基于对猴中枢神 经系统的组织学损伤的评分(世界卫生组织， WHO Tech.Rep.Ser.800； Appendix 3，annex 1，1990)。通过比较，由于评估脊髓灰质炎的临床症状而使 在TgPVR21小鼠检测那些未通过MNVT的成批OPV的实验成为可能。此 令人鼓舞的结果导致了WHO在1993开始了合作研究(世界卫生组织， WHO/MIM/PVD/94.1世界卫生组织，Geneva，1993)。此研究的目的是评价 TgPVR21小鼠替代猴用在MNVT中的合适性，该研究首先用于3型OPV。 实验动物中央研究所的研究者成功将TgPVR21小鼠从有限的研究工具开发 成为大量可得并且限定质量标准的可靠动物来源(Hioki等， Exp.Anim. 42：300-303(日文)，1993)。在对人类病毒易感的转基因小鼠的WHO备忘录 (memorandum)(世界卫生组织， Bull.W.H.O..71：497-502，1993)中给出维护， 保存(containment)，及运输TgPVR小鼠的建议。所述接种步骤，临床评分 方法，和统计学分析的原理都被描述(Abe等， Virology 206：1075-1083，1995； Abe等， Virology 210：160-166，1995；Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)。在那些研究中用的病毒样品首先在MNVT中试验，然后利用FDA开 发的非常灵敏的分子分析通过聚合酶链式反应和限制酶切割检查在病毒基 因组的神经毒性回复体丰度(Chumakoc等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：199-203，1991)。后一种方法在每批单价的3型OPV中检测位置472(U→C) 处很少量的回复体并检测位置249(C→U)处较多量的回复体。在3型OPV 的所述472-C回复突变(reversion)已经被记载为提高MNVT中的神经毒力的 关键促进物。未通过成批MNVT的疫苗包含＞1％的这些回复体。发现在1 型和2型OPV批号也有与3型OPV的位置472处的回复突变 (Back-mutation)，但它们对神经毒力的促进作用不那么强(Rezapkin等， Virology 202：370-378，1994；Taffs等， Virology 209：366-373，1995)。在所述1 型和2型Sabin病毒的基因组中可能有其它导致神经毒力的突变。
为确定TgPVR21小鼠是否能检测未通过成批MNVT的3型疫苗，所述 WHO研究包括对一个包含3％的472-C回复体的一批疫苗和包含0.5％的 472-C回复体的参照疫苗WHO/III进行比较。来自所有参与实验室的结果显 示，TgPVR21小鼠清楚辨别了所述两种疫苗(Wood，D.J.， Vaccine(印刷中)， 1996)。当用出现感染的临床症状的天数(即未通过时间(failure time))和临床评 分作为标准时，会辨别得更好。50％的麻痹剂量和50％的致死剂量不太令 人满意。大部分未通过MNVT的所述3型OPV制品包含＜3％的472-C回复 体，其中大多数含＜2％。为简便起见，后一种疫苗被称为“边缘的(marginal)”。 在FDA一同检验了三支边缘疫苗(1.3，1.4和1.7％)以及WHO/III和NC-2(分 别0.5和0.8％的472-C回复体)(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。 所有三批边缘疫苗均未通过所述小鼠实验，它们有高概率值的两个神经毒力 的主要指示物，即临床评分和未通过时间。发现另一批只包含1.4％的472-C 回复体的疫苗通过了MNVT却未通过所述小鼠实验，这可能表明所述小鼠 实验比MNVT有更高的敏感性。
一个有趣的问题是疫苗或试验样品中2493-U回复体的含量和其在猴和 TgPVR21小鼠中的神经毒力之间的关系。报道这些回复体在猴的神经毒力 中的作用是互相矛盾的(Tatem等， J.Virol.66：3194-3197，1992；Chumakov 等， J.Virol.66：966-970，1992)。第一篇报道认为此位置的回复突变在提高猴 的神经毒力中最重要，而第二篇文献的发现却认为相反。此位置的突变比 在位置472的那些出现得更快。因此，472-C的百分比有些增加的成批疫苗 通常2493-U含量很高，最多达100％。一些生产者生产的疫苗衍生自所述 Sabine 3的克隆，该克隆有100％的2493-U回复体并且472-C的含量很低 (0.3％)。无数据显示这些疫苗对人类的安全性低于2493-U回复体含量低的 疫苗。其中之一，在MNVT中与WHO/III和NC-2参照物比较的参照疫苗 F313不比所述两种疫苗毒力更强(16，Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)。然而，在TgPVR21小鼠，F313比WHO/III和NC-2的神经毒力水平 都高(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。确定是否TgPVR21小鼠实 验能辨别F313及其472-C回复体含量提高的衍生物变得必要，因为所述衍 生物会模拟“不好的”疫苗。因此，相对于亲本F313疫苗在小鼠中检验，来 自F313疫苗的并且包含1.8和2.4％的472-C的两份试验传代样品。所述 TgPVR21小鼠实验区分这些样品(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。 Abe等(Abe等， Virology 210：160-166，1995)接种的TgPVR21小鼠和 WHO/III和F313参照物，并将它们与在38℃生长的两份F313-衍生的制备 物进行比较。他们观察了所述MNVT和小鼠实验结果的紧密相关性。不幸 的是，该两种在38℃生长的病毒制备物并不被认为与不好的疫苗类似，因 为它们包含78％和94％的472-C回复体，并使减毒的体外温度敏感性标记 物从rct40-改变到rct40+。这表明在生产条件下在疫苗中可出现较高的神经 毒力。根据OPV生产的需要(世界卫生组织， WHO Tech.Rep.Ser.800：46-49， 1990)，疫苗病毒在细胞培养中的生长必须不能超过35.5±0.5℃。较高温度 使更多神经毒性病毒颗粒选择性生长。
在TgPVR21小鼠的OPV-3研究中，所有试验中辨别最好的病毒剂量是 3.5和4.5log10 50％组织培养感染剂量(TCID50)。据发现，可靠地辨别边缘疫 苗也能只用这两种剂量来实现，但用每个剂量接种的小鼠数增加。除了每组 的小鼠数要足够外，其它因素对成功也很重要；MNVT的接种体(inocula)的 病毒含量的1.0log10 TCID50不同并不重要(Contrearas等， J.Biol.Stand. 16：195-205，1988)。通过比较，小鼠实验中较强的剂量依赖性和所述接种体 的较小体积(0.5μl)是所述小鼠和猴实验之间差异最可能的原因。为达到必要 的精密度并使实验室间的结果协调，推荐遵守WHO指南描述的滴定分析方 法(世界卫生组织， Document WHO/BLG/95.1，Chap.9，p.67-74，世界卫生组 织，Geneva，1995)。
在FDA用2型OPV进行的试验中(Dragunsky等， Biologicals 24：77-86， 1996)，用三种通过MNVT的成批疫苗和两种未通过MNVT的成批疫苗，和 2型参照疫苗WHO/II接种TgPVR21小鼠。另外，三种试验样品来自“好的” 成批疫苗。一种样品通过MNVT并且两种未通过MNVT。此结果表明MNVT 和TgPVR21小鼠实验的相关性良好。
因为没有1型OPV批号反复未通过MNVT，FDA使用一个成批疫苗和 有一次未通过MNVT试验但在重复实验中通过的实验传代制备物 (Dragunsky等， Biologicals 24：77-86，1996)。用所述成批疫苗和未其传代样品 接种TgPVR21小鼠的脊髓不能辨别这两种制备物和美国参照疫苗。此阴性 结果更可能由于1型OPV的独特性。首先，所述Sabin 1品系是三种血清型 中最稳定的一种，并且可能在小鼠试验中无“不好的”1型成批OPV。有时， 所述1型疫苗批号未通过MNVT，但在重复实验时，它会通过(Marsden等， J. Biol.Stand.8：303-309，1980；Lovenbook，I.， 未公布数据)。一些专家甚至质疑 所述1型OPV的对猴试验的必要性。Abe等(16)通过使所述病毒在38℃生 长获得了1型OPV样品。这些制备物未通过MNVT和TgPVR21小鼠实验， 并且所述rct40标记物从阴性变为阳性，这再次表明，如它们在用3型所进 行的工作一样(Abe等， Virology 210：160-166，1995)，所述样品比对任何不好 的疫苗所期望的神经毒力要高。对于这些制备物，MNVT和TgPVR21小鼠 实验之间有相关性的事实支持了一种观点，那就是1型OPV未通过TgPVR21 小鼠实验可能不是由于所述小鼠模型不适合，而是因为所述Sabin 1品系在 生产条件下生长的稳定性。
在过去数年积累的数据的大体上的总结表明脊髓(spinal core)接种的 TgPVR21小鼠提供了评估3型和2型OPV的神经毒力的合适模型。此小鼠 模型可被认为是猴的可能替代物。此1型OPV的小鼠实验的实用性仍在研 究中。已建立的TgPVR小鼠生产，它们无病原体健康状况，和相对猴的较 低开支使它们对于OPV的神经毒力实验更有吸引力。
实施例8
Tg cHa-ras
用转基因(Tg)小鼠人类原型c-HRAS基因，即 BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2或CB6F1-HRAS2小鼠进行快速致癌 性实验。进行此研究的第一个步骤是评估CB6F1-HRAS2小鼠作为快速致癌 性实验系统的模型。多种基因毒性致癌物的短期实验结果显 示CB6F1-HRAS2小鼠对这些致癌物比对照非-Tg小鼠更易感。根据第一个 步骤的评估研究，在用多种基因毒性致癌物处理后，预期CB6F1-HRAS2小 鼠与对照非-Tg小鼠相比更可能以更高的发病率更快发生更恶性的肿瘤。所 述CB6F1-HRAS2小鼠看起来是作为开发快速致癌性实验系统的动物模型的 有希望的侯选物。
尽管通过基础和临床医学的途径以及公共健康的途径，已经作了持续的 努力来攻克癌症，癌症在很多国家仍为头号致死原因。很多人类癌症被认为 是由接触环境化学致癌物造成的。为降低此风险，已经作了大量努力来鉴定 并去除致癌物。用试验动物的流行病学研究和致癌实验被用来鉴定人致癌 物。尽管流行病学研究十分有希望的并且可能是唯一确认人类致癌物的方 法，该途径还是极为回顾性的，所以只有在出现了很多牺牲品后才能鉴定出 致癌物。
当一个人在开发过程中评估药物安全性并且当其在鉴定环境致癌物时， 致癌性实验必不可少。现在使用试验动物的致癌性实验不总是和人类风险评 估有关；通常用小鼠和大鼠是因为它们的寿命短并且体积小。因为啮齿类致 癌性实验延续＞2年并需要大量的动物，所以动物实验需要大的空间，大量 实验室技术员和巨额开支。当在致癌性实验中获得了阳性结果时，人们通常 不会意识到开发新药物中已经浪费的时间，努力和开支。另外我们的环境中 还有很多化学品没有被试验过，而每年却合成了数千种新的化学品。很明显 需改进鉴定致癌物的过程从而能评估更多化学品。所以，开发能在短的阶段 评估致癌性的快速致癌性实验系统对提高开发新药物并鉴定环境致癌物的 有效性是必要的。
为开发快速致癌性实验系统，对致癌物易感的动物是必不可少的。预计 有原癌基因的转基因(Tg)动物和/或缺少肿瘤抑制基因的动物会比正常动物 对多种致癌物更易感，因为致癌作用是由易感细胞中的遗传和外遗传 (epigenetic)损害作用的多阶段过程，所述细胞获得选择性生长优势，并经过 克隆扩增，其可能是活化原癌基因和/或灭活肿瘤抑制基因的结果。
所述ras家族基因参与调控细胞增殖，并被多种人类肿瘤(Lowy等， Annu.Rev.Biochem.62：851-891，1993；Bos，J.L.， Cancer Res.49：4682-4689， 1989；Anderson等， Environ.Health Perspect 98：13-24，1992)及试验动物模型 (Anderson等， Environ.Health Perspect 98：13-24，1992；Guerrero等， Mutat. Res.185：293-308，1987)的体细胞点突变活化。通过点突变活化ras家族基因 见于约30％的人类肿瘤。因此，携带人类c-HRAS基因的Tg小鼠可以是快 速致癌性实验动物模型的候选物。
合作评估携带人c-HRAS基因的Tg小鼠作为快速致癌性实验动物模型 的可用性和局限性的研究正在我们研究所，几个日本制药公司和美国国家环 境卫生研究中心(National Institute of Environmental Health Sciences)(NIEHS) (Drs.R.R.Maronpot和R.W.Tennant)开展。为评估Tg小鼠的可用性和局限 性，用于大规模生产并提供遗传和微生物学上限定的Tg小鼠的系统是必不 可少的。在综述中，我们介绍了我们现在的评估研究和2年的生物分析结果， 我们的研究是通过调查携带所述c-HRAS基因的Tg小鼠对多种致癌物的致 癌物反应(corcinogenic response)，并将所述反应与对照非转基因(non-Tg)小鼠 比较进行的。
携带所述人类原型c-HRAS基因的Tg小鼠的特征：所述携带人类原型 c-HRAS基因的Tg小鼠最初由Katsuki和其同事在实验动物中央研究所 (CIEA)建立(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)；所述小鼠携带此基因及 该基因自己的启动子区域，所述基因编码了不能转化NIH3T3细胞(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)的原型c-HRAS基因产物(即，p21)。人c-HRAS 基因的五或六个拷贝以串联排列整合到每只Tg小鼠的基因组中(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。转基因在肿瘤和正常组织表达，并且Tg小鼠 中用免疫印迹分析检测的p21总量比非-Tg小鼠高两到三倍(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。没有在Tg小鼠的正常组织未检测到所述转基 因的突变(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。约50％的rasH2小鼠 (C57BL/6×BALB/cF2)在出生后18个月内患自发肿瘤(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。约60％的患有肿瘤的小鼠患血管肉瘤 (angiosarcoma)(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。肺腺癌，皮肤乳头 状瘤，哈氏腺腺癌(Harderian gland adenocarcinoma)，和淋巴瘤也见于18月 龄，但发病率低很多(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。然而，肿瘤和 癌前病变(preneoplastic lesion)在6月龄的rasH2小鼠的F2转基因后代都未观 察到(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。
用于此研究中的CB6F1-HRAS2小鼠的遗传背景是转基因雄性 C57BL/6J和雌性BALB/cByJ小鼠的F1。通过使rasH2小鼠与C57BL/6J小 鼠回交八倍以上建立转基因雄性C57BL/J6小鼠是。携带所述转基因 的C57BL/6J雄性与BALB/cByJ雌性小鼠杂交。对所述F1后代进行聚合酶 链式反应或Southern印迹分析筛选存在的人类原型c-HRAS基因。携带所述 人c-HRAS基因的F1小鼠，即在CIEA生产的 BALB/cByJ×C57BL/6JF1-TgN(HRAS)2(CB6F1-HRAS2)小鼠，在7-9周龄时 被用于致癌性实验。在同窝幼鼠中，用不携带所述人c-HRAS基因的小鼠 (CB6F1)作为非-Tg对照。因为本研究中需要大量标准化实验动物形式的 的CB6F1-HRAS2小鼠，所以实用型开发是必需的。此开发所用的概念和系 统由Nomura本期(issue)的第一综述中详述。
雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠的体重是相应非-Tg小鼠的80-90％。对 于所试验的器官(脑，甲状腺，心，肺，肝，脾，肾，肾上腺，睾丸和卵巢)， 所述Tg小鼠与非-Tg小鼠的器官与体重的比率相似。Tg和非-Tg小鼠的血 液生物化学和血液学数据没有显著性差别。雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠 在77周龄的存活率分别是53％和32％。约50％的CB6F1-HRAS2小鼠死于 血管肉瘤，约20％的死亡动物患有肺腺癌和/或肺腺瘤，这与之前rasH2小鼠 的结果一致(Saitoh等， Oncogene 5：1195-1200，1990)。此研究中对 于CB6F1-HRAS2小鼠在6个月的致癌性试验中只观察到有一些自发的肺腺 瘤却无其它自发的肿瘤，所述实验最迟在35周龄时终止(CB6F1-HRAS2小 鼠在35周龄的存活率为≥95％)。自发的肿瘤在CB6F1-HRAS2小鼠中的低发 病率使我们用此小鼠作为快速致癌性实验的工具。
快速致癌性实验：我们研究所和几个日本制药公司已经做了这些快速致 癌性实验的研究(表1)。
表1.在日本用CB6F1-HRAS2小鼠进行的快速致癌性实验结果 恶性肿瘤 检验的化学品 剂量 给药途径 基因毒性 (沙门氏菌) Tg小鼠的 快速肿瘤反 应 肿瘤发病率和/ 或多样性 (multiplicity) Tg 非-Tg 4NQO1，a 15mg/kg×1 皮下(s.c.) + + Tg＞ 非-Tg + - MNNG2，a 2.5mg×1 管饲法 (Gavage) + + Tg＞ 非-Tg + - MNU3，a 75mg/kg×1 或 15mg/kg×5 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg + - 乙烯氨基甲 酸酯(vinyl carbamate)1，6，b 60mg/kg×1 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg ++ + Den4，A 90mg/kg×1 腹腔内 + + Tg＞ 非-Tg + - MAM5，a 20mg/kg×1/ 周6周 皮下 + +c Tg＞ 非-Tgc + - 环磷酰胺1，a 30mg/kg×2/ 周25周 管饲法 + +c Tg÷ 非-Tg + - 4HAQO5，b 10/20mg/kg× 1 静脉内(i.v. + + Tg＞ 非-Tg ++ + 乙烯硫脲 (Ethylene thiourea)1，b 0.3％ 喂食 - +c Tg÷ 非-Tg + +
4NQO＝4-硝基喹啉(Nitroquinoline)-1-氧化物；MNNG＝N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍 (nitrosoguanidine)；MNU＝N-甲基-N′-硝基脲；DEN＝N-甲基-N′-硝基脲；MAM＝甲基氧化 偶氮甲醇(methylazoxymethanol)；4HAQO＝4-羟基氨基喹啉(Hydroxyaminoquinoline)-1-氧 化物。
1日本国立药品食品卫生研究所(National Institute of Health Sciences)(NIHS)。2Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd。3Chugai Pharamceutical Co.，Ltd。4Sankyo Co.，Ltd。 5CIEA。6美-日共同研究。
a对比文献9；b未公布数据；c统计学上无显著性。
4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)是水溶性基因毒性致癌物，已知它在小鼠 中诱导皮肤(Nakahara等， Gann 48：129-136，1957)和口腔(Hawkins等， Head Neck 16：424-432，1994)的鳞状细胞(squamous cell)癌，和肺肿瘤(Inayama，Y.， Jpn.J.Cancer Res.77：345-350，1986)。约90％的4NQO-处理的CB6F1-HRAS2 小鼠(雄性和雌性)在单次皮下(s.c.)注射15mg的4NQO/kg体重后16周出现 皮肤乳头状瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在 4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是对照非-Tg小鼠观察到皮肤的鳞状 细胞癌。在4NQO-处理的非-Tg小鼠和载体-处理的动物未观察到皮肤肿瘤。 4NQO也诱导肺肿瘤。只在4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而不是相应的 非-Tg小鼠观察到肺腺癌(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。 在4NQO-处理的CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺瘤的发病率也比相应的非-Tg小 鼠中的发病率更高(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。 环磷酰胺是抗肿瘤药，它在啮齿类和人类致癌(国际癌症研究组织 (International Agency for Research on Cancer))， IARC vol 26，p165-202，Lyon， France，1981)。主要的靶器官是膀胱，肺，乳腺，和淋巴系统(国际癌症研究 组织， IARC vol 26，p165-202，Lyon，France，1981)。一周两次慢性口服给药10 或30mg的环磷酰胺/kg持续25周来诱导CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠的肺 肿瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在一只环磷酰胺- 处理的雄性CB6F1-HRAS2小鼠而不是相应的非-Tg小鼠或载体-处理的动 物中观察到腺癌。环磷酰胺-处理的CB6F1-HRAS2小鼠和相应的非-Tg小鼠 的肺腺瘤发病率无显著不同。在其它器官如膀胱，乳腺，和淋巴系统观察不 到肿瘤(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。
N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是烷化剂，并且在多种动物包括小 鼠中致癌(国际癌症研究组织， IARC vol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。前 胃和食管(esophagus)是口服给药MNNG后的靶器官(国际癌症研究组织， IARC vol 4，p183-195，Lyon，France，1974)。单次口服给药2.5mg MNNG/每只 小鼠在100％的雄性和雌性CB6F1-HRAS2小鼠诱导前胃乳头状瘤，而只有 11％的雌性和0％的雄性非-Tg小鼠在用MNNG处理后13周出现乳头状瘤 (Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。甚至在MNNG给药后 26周，只在MNNG-处理的CB6F1-HRAS2小鼠而未在相应的非-Tg小鼠观 察到鳞状细胞癌(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。
N-甲基-N-硝基脲(MNU)在多种动物致癌，并且在多个位置如皮肤，前 胃，淋巴系统和肺诱导肿瘤(国际癌症研究组织， IARC vol 17，p117-255，Lyon， France，1978)。以剂量75mg/kg一次或以剂量为15mg/kg、五次(每天一次连 续5天)腹腔内注射MNU，从在CB6F1-HRAS2小鼠诱导多种肿瘤(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。与相应的非-Tg小鼠相 比，CB6F1-HRAS2小鼠在MNU处理后可见皮肤乳头状瘤的发病率明显变 高(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。在至少14周的观察 中，MNU以高发病率诱导CB6F1-HRAS2小鼠的皮肤乳头状瘤，但不诱导 非-Tg小鼠的皮肤乳头状瘤和增生。所述MNU-处理的CB6F1-HRAS2小鼠 也以高发病率患前胃乳头状瘤，而MNU-处理的非-Tg小鼠不出现乳头状瘤 (Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。只在MNU-处理 的CB6F1-HRAS2小鼠而不是非-Tg小鼠见到前胃鳞状细胞癌。Ando等 (Ando，等， Cancer Res.52：978-982，1992)报道单次腹腔内注射MNU后，与相 应的非-Tg小鼠相比，rasH2小鼠的前胃和皮肤乳头状瘤的发病率更高。与 相应的非-Tg小鼠的反应相比(Yamamoto等， Carcinogenesis 17：2455-2461， 1996)，在用75mg的MNU/kg处理一次的雄性CB6F1-HRAS2小鼠中，淋 巴瘤的发病率更高。
N，N-二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine)(DEN)在多个动物种类中致癌(国 际癌症研究组织， IARC vol 17，p83-124，Lyon，France，1978)。DEN的主要靶 器官是肝，肺和前胃(国际癌症研究组织， IARC vol 17，p 83-124，Lyon，France， 1978)。早在DEN给药3个月，单次腹腔内注射90mg的DEN/kg仅 在CB6F1-HRAS2小鼠造成前胃鳞状细胞癌和肺腺癌(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。DEN给药后六个月， 在CB6F1-HRAS2小鼠两种恶性肿瘤的发病率显著增加(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)。在6个月的观察过程中，在DEN-处 理的非-Tg小鼠中从未观察到这些肿瘤。在DEN给药后3个 月，CB6F1-HRAS2小鼠的肺腺瘤发病率与非-Tg小鼠的发病率类似。对应 于在CB6F1-HRAS2小鼠中肺腺癌发病率的增加(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)，DEN给药后六个月时，非-Tg小鼠腺 瘤发病率明显比CB6F1-HRAS2小鼠更高。
乙烯氨基甲酸酯是氨基甲酸乙酯的代谢物，已知它诱导肺和肝肿瘤 (neoplasm)(Massey等， Carcinogenesis 16：1065-1069，1996；Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。在给药致癌物后16周，单次腹腔内注射60mg 的乙烯氨基甲酸酯/kg在100％和50％的CB6F1-HRAS2小鼠中分别诱导肺腺 瘤和腺癌(Maronpot等，制备手稿)。尽管非-Tg小鼠也以＞90％的发病率患肺 腺瘤，其肿瘤增殖比相应的CB6F1-HRAS2小鼠低。非-Tg小鼠的肺腺癌发 病率比CB6F1-HRAS2小鼠低很多。后者约90％患有脾血管肉瘤，但非-Tg 小鼠不患有脾血管肉瘤。
甲基氧化偶氮甲醇(MAM)在啮齿类中致癌，并且诱导结肠肿瘤(Reddy 等， J.Natl.Cancer Inst.71：1181-1187，1984；Deschner等， J.Cancer Res.Clin. Oncol.115：335-339，1989)，肺肿瘤(Reddy等， J.Natl.Cancer Inst. 71：1181-1187，1984)，和肛周鳞状细胞癌(Kumagai等， Gann 73：358-364， 1982)。首次MAM给药后24周，每周一次皮下注射20mg的MAM/kg持 续6周使CB6F1-HRAS2小鼠但不使非-Tg小鼠(Yamamoto 等， Carcinogenesis 17：2455-2461，1996)出现皮肤乳头状瘤，结肠腺瘤样息肉 病(colon adenomatous polyps)，直肠鳞状细胞癌，和胃乳头状瘤。皮肤乳头 状瘤限于肛门和阴囊，与以前对不同品系的非-Tg小鼠的报道一致(Kumagai 等， Gann 73：358-364，1982)。在用MAM处理的CB6F1-HRAS2和非-Tg小鼠 中观察到类似的肺腺瘤发病率。
在致癌物处理后至少26周内，单次静脉内(i.v.)给药基因毒性致癌物4- 羟基氨基喹啉-1-氧化物(4HAQO，10或20mg/kg)在CB6F1-HRAS2小鼠中 诱导前胃和皮肤乳头状瘤，但在非-Tg小鼠几乎观察不到这些肿瘤。尽管所 述发病率低，只在Tg小鼠观察到其它肿瘤(例如，白血病和胸腺瘤 (thymoma))。4HAQO-处理的Tg和非-Tg小鼠在胰腺的外分泌部分(已知该处 是此致癌物的靶组织)都不出现肿瘤(Rao等， Int.J. Pancreatol.2：1-10，1987)。 这些快速致癌性实验的结果见上表1总结，并且用于快速致癌性实验的化学 品列表见表2所示。
表2.快速致癌性实验的化学品列表 沙门氏菌(Salmonella)诱变分析-阳性致癌物(种间(trans-species)) 4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)a 环磷酰胺a N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)a N-甲基-N′-硝基脲(MNU)a N，N-二乙基亚硝胺(DEN)a 甲基氧化偶氮甲醇(MAM)a 乙烯氨基甲酸酯b 4-羟基氨基喹啉-1-氧化物(4HAQO)c 甲基苄肼(Procarbazine)c 噻替哌(Thiotepa)c 3-(N-甲基-N-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)c 非那西丁(Phenacetein)c 4，4′-二氨基二苯硫醚(Thiodianiline)c 4-乙烯基-1-环己烯双环氧化合物(cyclohexene diepoxide)c 2-甲氧基-5-甲基苯胺(p-Cresidine)b N-亚硝基苯胲胺(Cupferron)c 苯丙氨酸氮芥(Melphalan)b 沙门氏菌诱变分析-阴性致癌物(种间) 乙烯硫脲 1，4-二噁烷(Dioxane)c 丙烯酸乙酯c 环孢霉素b，c 糠醛(Furfural)c 苯酚c 二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)c 沙门氏菌诱变分析-阳性非致癌物 p-茴香胺(Anisidine)b 8-羟基喹啉c 4-硝基-o-苯二胺(phenylenediamine)c 2-氯甲基吡啶盐酸盐(2-Chloromethylpyridine hydrochloride)(2-氯化吡啶甲基 盐酸盐(2-Picolyl chloride hydrochloride))c 沙门氏菌诱变分析-阴性非致癌物 间苯二酚(Resorcinol)b 鱼藤酮(rotenone)(小鼠)c 二甲苯(Xylenes)(混合)c 二硫代四乙基秋兰姆c
黑体化学品＝已完成或现在正进行的快速致癌性实验
a参考文献9；b美-日共同研究；c在CIEA进行或要进行的快速致癌性实验
在美国国家环境健康卫生研究中心的国家毒理学项目(National Toxicology program) Environ.Health Perspect.101：264-266，1993)中，已知沙门 氏菌诱变分析-阴性致癌物乙烯硫脲在大鼠和小鼠诱导甲状腺肿瘤。只有雌 性小鼠用于致癌性实验。喂食小鼠包含0.1或0.3％的乙烯硫脲持律28周。 浓度0.1％的乙烯硫脲不在CB6F1-HRAS2小鼠或非-Tg小鼠诱导甲状腺肿 瘤，而0.3％的乙烯硫脲分别在26％和20％的Tg和非-Tg小鼠诱导甲状腺腺 瘤。甲状腺腺癌的发病率也类似(Tg9％和非-Tg小鼠4％)，并且在Tg和非-Tg 小鼠观察不到明显不同。
已知DEN(Ando，等， Cancer Res.52：978-982，1992)和乙烯氨基甲酸酯 (Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)是肝肿瘤可能的诱导物。然而， 用这些化合物处理的CB6F1-HRAS2小鼠和对照非-Tg小鼠不患肝肿瘤。已 经报道多个遗传位点控制了小鼠肝肿瘤(Gariboldi等， Cancer Res. 53：209-211，1993；Manenti等， Genomics 23：118-124，1994)。与C3H小鼠这一 个对致肝癌作用非常易感的品系相比(Diwan等， Carcinogenesis 7：215-220， 1986；Dragani等， Cancer Res.51：6299-6303，1991)，所述C57BL/6小鼠对化 学诱导致肝癌作用的易感性相对低(Diwan等， Carcinogenesis 7：215-220，1986； Stanley等 Carcinogenesis 13：2427-2433，1992)。已知BALB/c小鼠对致肝癌 作用十分抵抗，雌性C57BL/6和雄性BALB/c小鼠的F1杂种对致肝癌作用 的敏感性低(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995，Stanley 等 Carcinogenesis 13：2427-2433，1992)。所以，雄性C57BL/6和雌性BALB/c 小鼠的F1杂种，CB6F1小鼠很可能对致肝癌作用的易感性相对较低。 通常在一些小鼠品系如C3H和B6C3F1的肝肿瘤中检测到HRAS基因 活化(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。然而，在DEN或乙烯氨 基甲酸酯诱导的B6CF1小鼠的肝肿瘤中HRAS突变的频率很低(Maronpot 等， Toxicology 101：125-156，1995)。所述HRAS的突变可能显著导致对致肝癌 作用高敏感性的小鼠品系而不是低敏感性品系中肝肿瘤的诱导(Maronpot等， Toxicology 101：125-156，1995)。
在CB6F1-HRAS2小鼠中能清楚观察到皮肤乳头状瘤/鳞状细胞癌，前胃 乳头状瘤/鳞状细胞癌和一些其它肿瘤类型的快速肿瘤反应，然而在不考虑致 癌物类型的情况下，由环磷酰胺，MNU，DEN或MAM在CB6F1-HRAS2小鼠 诱导的肺腺瘤的发病率和多样性并不明显高于用相应的致癌物在非-Tg小鼠 中诱导的肿瘤的发病率和多样性。接触致癌物后多个小鼠品系的肺肿瘤发病 率有明显不同(Malkinson，A.M.， Toxicology 54：241-271，1989)。A/J(对肺癌发 生易感)和C57BL/6J(对肺癌发生抵抗)的重组近交系的遗传研究结果表明三 个遗传位点促进这些品系对肺肿瘤发生的易感性的不同(Malkinson等， J. Natl.Cancer Inst.75：971-974，1985)。已经认为癌基因Ki-ras是这些易感性位 点之一(You等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5804-5808，1992；Chen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1589-1593，1994)，并且每个小鼠品系对肺腺瘤 的易感性(例如，A/J是易感型的，BALB/c是中间型的，C57BL/6是抵抗型的) 与Ki-ras基因的多态性相关良好(Chen等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1589-1593，1994)。此研究中所用的CB6F1小鼠可能有相对高的肺腺瘤易 感性。另一方面，只有CB6F1-HRAS2小鼠患肺腺癌而非-Tg小鼠对多种致癌 物反应时没有或很少患肺腺癌，这表明CB6F1-HRAS2小鼠与对照的CB6F1 小鼠相比有另外的能力来加快肺腺瘤的恶性进展。
这些导致表明在用多种基因毒性致癌物处理后，预期CB6F1-HRAS2小 鼠比对照非-Tg小鼠更可能以更高的发病率更快发生更恶性的肿瘤。这些最 初的评估研究显示CB6F1-HRAS2小鼠似乎是开发快速致癌性实验系统的动 物模型的有希望的侯选物。
前景(Perspective)：尽管诱变性(mutagenicity)是致癌性的主要机制决定 因素，它对致癌性既不是足够的也不是必要的。约三分之一的非诱变的化学 化学品已经显示是致癌性的，并且约三分之一的诱变化学品在2年的啮齿类 生物实验中不致癌(Ashby等， Mutat.Res.257：229-306，1992；Zeiger etal， Environ.Mol.Mutagen 16(Suppl.18)：1-14，1990)。已经提出在两个啮齿种类中 诱导肿瘤的化学品与只在一个种类中诱导肿瘤的化学品相比受到不同种类 之间的遗传变异性的影响较少(Tennant，R.W.， Mutat.Res.286：111-118， 1993)。所以种间的致癌物对人似乎比单个种的致癌物更有害。
对于种间的致癌物，我们要么完成要么已经启动了15种沙门氏菌诱变分 析-阳性致癌物(4NQO，环磷酰胺，MNNG，MNU，DEN，乙烯氨基甲酸酯， MAM，4HAQO，甲基苄肼，噻替哌，NNK，非那西丁，4，4’-二氨基二苯硫 醚，4-乙烯基-1-环己烯双环氧化合物，和2-甲氧基-5-甲基苯胺)以及六种沙 门氏菌诱变分析-阴性致癌物(乙烯硫脲，1，4-二噁烷，丙烯酸乙酯，环孢霉素， 糠醛，和苯酚的快速致癌性实验(表2)。这些致癌物中，环磷酰胺，甲基苄肼， 噻替哌，非那西丁，环孢霉素，和苯酚被分类为人致癌物(第1组)或在人可能 致癌(第2A组)。我们计划再进行至少两种沙门氏菌-阳性种类间的致癌物(N- 亚硝基苯胲胺和苯丙氨酸氮芥)和再一种沙门氏菌-阴性致癌物(二乙基己烯 雌酚)的实验(表2)。苯丙氨酸氮芥和二乙基己烯雌酚被分类为人致癌物。这 些致癌物的6个月致癌性实验可进一步评估此CB6F1-HRAS2小鼠是否可用 作快速和准确鉴定基因毒性和/或非基因毒性致癌物的动物模型。
因为人类致癌物鉴定的假阳性错误会阻碍合适的药物开发并可能造成 社会不安，应尽可能地避免过分估计致癌性。因此，必须明确是否所 述CB6F1-HRAS2小鼠对非致癌物的反应是阴性的。一种沙门氏菌诱变分析- 阳性非致癌物(p-茴香胺)和一种沙门氏菌诱变分析-阴性非致癌物(间苯二酚) 的快速致癌性实验现在正在进行(表2)。其后，我们应对沙门氏菌-阳性和沙 门氏菌-阴性非致癌物更关注。我们计划在CIEA用至少四种沙门氏菌-阳性非 致癌物(8-羟基喹啉，4-硝基-o-苯二胺，和2-氯甲基吡啶)和三种沙门氏菌-阴 性非致癌物(鱼藤酮，二甲苯，二硫代四乙基秋兰姆)进行研究(表2)。上述化 学品中的六种已经或将在日本和美国同时进行实验(表3)。
表3.美国-日本共同研究用CB6F1-HRAS2小鼠做短期(26周)致癌性实验 研究所 化学品 剂量和给药途径 日本 美国 状态 乙烯氨基甲 60mg/kg×1，腹腔内 NIHS NIE 完成 酸酯 HS 2-甲氧基-5- 甲基苯胺 0.25％，0.5％，喂食 NIHS NIE HS 完成 环孢霉素 5mg/kg，10mg/kg，25mg/kg，× 5/W 26周 管饲法 CIEA NIE HS 正进行 间苯二酚 225mg/kg，×5/周24周 管饲 法 产业1 NIE HS 正进行 苯丙氨酸氮 芥 0.3mg/kg，1.5mg/kg×1/周25 周，腹腔内 产业2 NIE HS 要做 p-茴香胺 0.225％，0.45％，喂食 NIHS NIE HS 正进行
产业1＝Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd.产业2＝Kyowa Hakko Kogyo Co.
在欧盟，美国和日本现有评估化学品致癌可能性的管理(regulatory)要求 规定要在两种啮齿类进行长期啮齿类致癌性研究。因为长期生物分析的开支 大，使用大量动物，机制基础缺乏和与人风险评估的相对低的相关性，人用 药品注册技术要求国际协调会(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use)(ICH)已经考虑用两种啮齿类的2年致癌性实验的需要是否能够降低而不 危及人类的安全性。近来Tennant及其同事在NIEHS已经研究了使用p53-敲除 小鼠或TG.AC小鼠(v-Ha-ras转基因小鼠)作为鉴定致癌物的短期生物分析模 型的可行性(validation)(Tennant等， Environ.Health Perspect.103：942-950， 1995)。因为已经积累了相当数量的显示可能的可用性的数据，所以现在在 多种转基因动物中，p53-敲除小鼠，CB6F1-HRAS2小鼠和TG.AC小鼠似乎是 鉴定化学致癌物的短期生物分析模型的最有希望的的侯选物。尽管还未完全 评估用Tg小鼠的快速致癌性实验系统的可用性和局限性，用Tg小鼠检测可能 致癌物是部分ICH指南的讨论话题。现在将用一种啮齿类，可能是大鼠进行2 年的实验，加上短期生物分析和机理性研究来取代用两种啮齿类的2年致癌 性实验。
实施例9
rasH2小鼠中再现和可重复的致癌物反应
为确认rasH2小鼠模型在演出型水平具有再现和可重复的行为表现，在 多个研究所检查对一些致癌物的致癌物反应，并在研究所间比较患肿瘤的发 病率。
材料和方法
致癌物：N-甲基-N-硝基脲(MNU)是烷化剂和基因毒性致癌物，它被用 作阳性对照致癌物。用75mg/kg溶于柠檬酸盐缓冲盐水(pH4.5)的MNU以单次 腹腔内注射给予阳性对照组中的小鼠。基于以前的剂量探索研究确定75 mg/kg的剂量。
小鼠：在1997年，使rasH2品系的核集群中的小鼠与C57BL/6回交并且回 交代超过N14。本研究中使用了在1997-1999年中在实验动物中央研究所 (CIEA)产生的CB6F1-Tg-rasH2小鼠。
研究所：将小鼠提供给11个不同的研究所(Sankyo，Tanabe，Eisai， Teikoku-Zoki，Daiichi，Shionogi，Dainippon，Mitsubishi，Fujisawa，Wyeth，and Shinyaku)。每个研究所的所有工作作为ILSI，ACT项目(国际生命科学学会 (International Life Science Institute)，致癌性实验)由CIEA的Usui进行的取代实 验。
结果
在MNU-处理的rasH2小鼠中，诸如前胃，皮肤和阴道的鳞状细胞肿瘤， 哈氏腺中的癌，肺的腺瘤，和恶性淋巴瘤的肿瘤发病率增加。在研究所间观 察到前胃肿瘤(图25)和恶性淋巴瘤(图26)发病率高而且一致。基于多个研究 所得到的肿瘤特征谱的定性和定量的一致的和强的阳性反应，判断rasH2小 鼠对作为阳性对照的MNU的致癌物反应的整体表现是足够的(Usui，T.，等， Toxicologic Pathology 29(Suppl.)：90-108，2001)。
所有本说明书通篇引用的参考文献和其中所引用的参考文献都引入作 为参考。本发明已经参考具体实施方案进行了描述，本发明技术人员应该理 解，只要不违背本发明的真实精神和范围，可作多种改变和等价替换。另外， 可作多种修改来适应具体条件，材料，物质组成，过程等等。所有此类修改 都在附带的权利要求书范围内。
序列表
<110>野村达次(Nomura，Tatsuji)
<120>开发动物模型的方法
<130>APGI.001A
<160>13
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
ccgacctgtt ctggaggacg gtaacctcag 30
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
accaggggct gcagccagcc ctatc 25
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与pBKS II克隆载体同源的合成引物
<400>3
ggaaacagct atgaccatga ttacgc 26
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
gaccggagcc gagctcgggg ttgctcgagg 30
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg 30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>鼠(Murine)
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<110>健康及生物科学促进中心(CENTER FOR THE ADVANCEMENT OF HEALTH AND BIOSCIENCE)
野村达次(NOMURA，Tatsuji)
<120>开发动物模型的方法
<130>39764-0001PCT
<140>未指定的
<141>2003-06-23
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