线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用
阅读：178发布：2020-05-19
专利汇可以提供线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程及生殖医学领域，公开了线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用。该标志物为一些miRNA为线粒体相关miRNA，选自hsa‑miR‑101‑3p、hsa‑miR‑151a‑5p和hsa‑let‑7b‑5p中的多种。该标志物能很好地将严重弱精病例和正常生育对照分开，可用于制备人类严重弱精子症诊断或监测 试剂 盒 。，下面是线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种精浆microRNA标志物在制备人类严重弱精子症诊断或监测试剂中的应用，该精浆microRNA标志物为线粒体相关miRNA，由hsa-miR-101-3p、 hsa-miR-151a-5p和hsa-let-
7b-5p构成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于hsa-miR-101-3p的序列为SEQ ID No.1，hsa-miR-151a-5p的序列为SEQ ID No.2，hsa-let-7b-5p的序列为SEQ ID No.3。
3.一种检测精浆microRNA标志物的引物组合在制备人类严重弱精子症诊断或监测试剂中的应用，该引物组合为检测线粒体相关miRNA hsa-miR-101-3p、 hsa-miR-151a-5p和hsa-let-7b-5p的引物组合。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述引物组合的序列为检测hsa-miR-101-
3p的引物序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，检测hsa-miR-151a-5p的引物序列SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，检测hsa-let-7b-5p的引物序列SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的
标志物及其应用
发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及线粒体相关精浆微小核糖核酸作为人类严重弱精子症发生的标志物及其应用。
背景技术
[0002] 不孕不育一直是生殖健康领域亟待解决的重大科学问题。在我国约有9％的育龄夫妇面临此种困境。由于我国人口基数大，育龄夫妇数量尤为可观，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万。不孕不育症的病因很多，其中由男方因素引起的约占50％。WHO不育症防治专题组的研究表明，生殖内分泌功能紊乱，特别是弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。
[0003] 弱精子症(asthenospermia)是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50％或a级运动的精子小于25％的病症。而严重弱精子症是指b级+c级精子数量<30％，其中a级精子为零。大量研究表明，弱精子症(特别是严重弱精子症)会导致受孕几率显著降低，同时还会引起流产、早产、输精管阻塞等一系列危害。
[0004] 目前，弱精子症的诊断方法主要依靠病史询问、体格检查、精液参数、精浆生化、血性激素检测、B超以及染色体检测等。常规的精子活力分析目前主要依靠计算机辅助精子分析(Computer-aided sperm analysis,CASA)，尚无其他更为有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，即精液参数的检测易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子活力测量不准确；对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。尽管目前国内外研究者正努力探索新的弱精子症诊断生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即精液质量分析结果波动、早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治疗手段，大多数弱精子症病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法满足心理上的需求，而且有可能出现后代的遗传缺陷。
[0005] 目前认为，导致弱精子症的病因主要有：生殖道感染、免疫因素、精索静脉曲张、先天性疾病等。其发病机制主要包括两方面：(1)由遗传或先天因素导致的精子鞭毛超微结构的损伤；(2)由氧化应激、代谢紊乱、抗精子抗体等引起的精子ATP合成减少，活力退化。
[0006] 线粒体(mitochondria)作为“能量工厂”，参与维持多种细胞功能，是细胞发挥功能所需能量的主要来源。ATP是精子活力的首要能量来源，它主要来自两个途径：线粒体的有氧氧化和胞质的无氧酵解。经典的理论认为精子中段线粒体形成的线粒体鞘在精子运动过程中提供所需能量，一切影响ATP生成的因素，如呼吸酶抑制剂等均可直接或间接影响精子活力。精子获能以后代谢活动明显增强，提示精子线粒体中氧化磷酸化产生大量ATP，使得精子出现一种特异的“鞭打样”运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。由此可见，当线粒体功能出现损伤时，将会影响ATP的产生，也必将影响精子活力，导致生育障碍。
[0007] 微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节，并与生物的许多正常生理活动密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。在人类中已发现了2000余种miRNAs，目前，预测miRNA至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。miRNA不编码蛋白质，而是以单链形式与辅酶因子TRBP及PACT形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，再与mRNA的3’端非编码区(3’UTR)结合，从而发挥其调控mRNA转录与蛋白翻译的总开关作用。miRNA在其5’端有一个2-7个碱基组成的互补区，通过与靶mRNA的3’UTR(three prime untranslated regions)的完全或部分靶向互补结合导致其降解或抑制转录后的翻译。作为21世纪生命科学的重大发现，越来越多的研究显示，其参与的细胞转录后调控，在个体发育、细胞胞增殖、分化、代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的调节作用。有大量文献报道，miRNA在男性生殖细胞的增殖以及晚期精子分化的过程中都发挥着非常关键的作用。研究表明，核编码miRNA可以进入线粒体参与线粒体功能的调节，同时，最新研究发现，线粒体自身基因组也可以编码大量非编码RNA，进而发挥多种生物学功能。这些miRNA被称为线粒体相关miRNA(mitochondria-related miRNA)。
[0008] 研究发现血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血浆miRNA的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。而近期又有学者发现，精浆中同样也存在数百种miRNA，且这些miRNA同样具备作为生物标志物的所有特性，如性质稳定、含量丰富、易于检测等。这一发现使我们有理由相信，精浆miRNA作为一类非编码调节性的小分子RNA，其差异表达谱同样也可以作为疾病早期诊断的生物标志物。
[0009] 目前还没有将线粒体相关miRNA应用于严重弱精子症诊断的报道，若能筛选出严重弱精子症易感的线粒体相关miRNA作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对严重弱精子症的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条新的途径。
发明内容
[0010] 本发明的目的是提供与人类严重弱精子症发生相关的线粒体相关精浆miRNA标志物。
[0011] 本发明的第二个目的是提供上述精浆miRNA标志物的引物。
[0012] 本发明的第三个目的是提供含有上述精浆miRNA标志物或其引物的应用。
[0013] 本发明的第四个目的是提供含有上述精浆miRNA标志物或其引物的用于人类严重弱精症诊断或监测的试剂盒。
[0014] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
[0015] 人类严重弱精子症发生相关的精浆miRNA标志物，这些miRNA为线粒体相关miRNA，选自hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p和hsa-let-7b-5p中的多种。
[0016] 所述的精浆miRNA标志物由hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p和hsa-let-7b-5p构成。
[0017] 所述的精浆miRNA标志物，其中hsa-miR-101-3p的序列为UACAGUACUGUGAUAACUGAA(SEQ ID No.1)，hsa-miR-151a-5p的序列为UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU(SEQ ID No.2)，hsa-let-7b-5p的序列为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU(SEQ ID No.3)。
[0018] 所述的精浆miRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引物为SEQ ID No.4，下游引物为SEQ ID No.5；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引物为SEQ ID No.6，下游引物为SEQ ID No.7；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引物为SEQ ID No.8，下游引物为SEQ ID No.9。
[0019] 所述的精浆miRNA标志物或其引物在制备严重弱精子症诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些精浆miRNA标志物在精浆中表达量的试剂。
[0020] 一种人类严重弱精子症诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述精浆miRNA标志物(hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p和hsa-let-7b-5p中的多种)的引物。
[0021] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有下列3对引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
[0022] 试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
[0023] 本发明详细描述如下：
[0024] 本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了TaqMan miRNA Array、qRT-PCR(TaqMan探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。
[0025] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0026] 一、研究对象选择和分组依据
[0027] (1)重复精液质量检测，确诊为严重弱精子症；
[0028] (2)性功能正常，排除具有隐睾症病史、血管外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者；
[0029] (3)与病例年龄匹配的健康男性对照；
[0030] (4)研究对象分组：
[0031] A组：正常生育对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
[0032] B组：严重弱精病例组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
[0033] 二、精液分离及前处理
[0034] (1)新鲜精液3ml，37℃液化30min，12000rpm、4℃离心10min,取上清每100μl分装至洁净1.5ml EP管中
[0035] (2)向EP管中加入900μl TRIzol，充分混匀后，12000rpm离心15min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。
[0036] (3)向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇，充分混匀后转移至离心柱，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
[0037] (4)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。
[0038] (5)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。
[0039] 重复一遍。
[0040] (6)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。
[0041] (7)将离心柱装在一个新的1.5ml的离心管中，并在柱子上加入50μlDEPC处理的水，离心1分钟。
[0042] (8)-70℃保存处理后的样本。
[0043] 本发明实验中使用的离心柱和配套试剂(RWT缓冲液、RPE缓冲液)均来自Qiagen miRNeasy Mini Kit(货号217004)这个试剂盒，下同。
[0044] 三、qRT-PCR方法测量精浆miRNAs表达量
[0045] 1.取经前处理的精浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
[0046] 按下表所示配制反转录体系：
[0047]
[0048] 2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心，冰上放置5分钟。
[0049] 3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：
[0050]
[0051] 反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
[0052] 4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
[0053]
[0054] 预扩增的反应条件如下表所示：
[0055]
[0056] 降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱。
[0057] 5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的qRT-PCR。
[0058] 预扩增产物进行qRT-PCR按下表所示配制反应体系：
[0059]
[0060] 考虑到吸液损失而放量12.5％。
[0061] 6.检测并比较正常生育对照组、严重弱精病例组精浆样本中miRNAs表达量的差异。
[0062] 检测到的存在差异表达的正常生育对照和严重弱精患者精浆miRNAs包括hsa-miR-101-3p(SEQ ID No.1)、hsa-miR-151a-5p(SEQ ID No.2)、hsa-let-7b-5p(SEQ ID No.3)。其中hsa-miR-151a-5p在严重弱精子症患者精浆中的表达量显著高于对照组，而hsa-miR-101-3p和hsa-let-7b-5p在严重弱精子症患者精浆中的表达量显著低于对照组，并且这些miRNAs在精浆中表达具有稳定性。
[0063] 四、qRT-PCR方法验证精浆miRNAs表达量
[0064] 1.设计3条目标miRNAs的引物。
[0065] 2.加入荧光染料进行qRT-PCR反应。检测并比较正常生育对照、严重弱精病例精浆样本中miRNAs表达量的差异(病例和对照各80人)。
[0066] 3.选择独立人群(对照和病例各30人)进行qRT-PCR检测，结果均与芯片结果一致。
[0067] 因此，最终确认为存在差异表达的正常生育对照和严重弱精病例精浆miRNAs包括hsa-miR-101-3p(SEQ ID No.1)、hsa-miR-151a-5p(SEQ ID No.2)、hsa-let-7b-5p(SEQ ID No.3)，具体引物见表1。其中hsa-miR-151a-5p在病例精浆中的表达量显著高于对照组，而hsa-miR-101-3p和hsa-let-7b-5p在病例精浆中的表达量显著低于对照组，同时这些miRNAs在精浆中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3这3个构成的组合可以将对照组、病例组区分开。
[0068] 五、诊断试剂盒制备方法
[0069] 根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于严重弱精子症的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者精浆中稳定存在且可检测的成熟hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p的引物和工具。诊断试剂盒包括一批精浆miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
[0070] 本发明的有益效果：
[0071] 本发明人通过分离和比较正常生育对照和严重弱精病例精浆中的miRNAs，发现了精浆中存在可用于评估是否患有严重弱精症的特异性和敏感性(实施例5的ROC曲线提示具有较好的灵敏度，实施例6对其实际效果进行了验证，即严重弱精患者均被正确检测识别)的miRNA组合，因而提出了严重弱精患者的精浆miRNA标志物组合，以及该精浆miRNA标志物或其引物在制备严重弱精症诊断试剂中的应用，研制出可便于临床应用的严重弱精诊断试剂盒。
[0072] 本发明采用精浆miRNA作为严重弱精症评价的标志物的优越性在于：
[0073] (1)精浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高严重弱精诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为男性生殖系统疾病的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0074] (2)本发明提供的精浆miRNA标志物可用于严重弱精诊断标志物，可避免侵入性诊断，并可在早期通过微创方式辅助诊断严重弱精，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
[0075] (3)本发明采用符合严重弱精病例和健康生育对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。
[0076] (4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种精浆miRNAs，应用qRT-PCR等方法进行二次验证和独立人群验证，采用分层评分系统对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对精浆miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价，保证了该精浆miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。附图说明
[0077] 图1以hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p作为标志物对健康对照和严重弱精病例进行区分。
[0078] 图2个体精浆miRNAs表达水平波动性分析。
[0079] 图3正常对照组和严重弱精病例组之间的ROC曲线。
具体实施方式
[0080] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0081] 实施例1 研究对象选择和分组依据
[0082] 本发明人于2007年7月到2012年10月从南京医科大学生殖医学中心收集符合要求的严重弱精病例及正常生育对照成年男性精液样品，通过对样品资料的整理，从中选择了符合要求的80例正常生育对照(平均年龄：22.15±3.45岁)、80例严重弱精病例(平均年龄：22.32±3.51岁)作为qRT-PCR检测miRNA表达的实验对象。具体的样品归类标准如下：
[0083] (1)重复精液质量检测，确诊为严重弱精子症；
[0084] (2)性功能正常，排除具有隐睾症病史、血管外伤史、睾丸炎、输精管梗阻、输精管切除术、多染色体异常及Y染色体无精子症因子微缺失等具有已知病因的患者
[0085] (3)与病例年龄匹配的健康男性对照
[0086] (4)研究对象分组
[0087] A组：正常生育对照组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
[0088] B组：严重弱精病例组(n＝80，20人芯片筛选，30人一期验证，30人独立人群验证)。
[0089] 实施例2 线粒体相关miRNA TaqMan array筛选
[0090] 制备cDNA样品：a)取100μl精浆；b)加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA。i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟。(若针对不同miRNA则采用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行)
[0091] 逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：
[0092]
[0093] 预扩增的反应条件如下表所示：
[0094]
[0095] 将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。
[0096] 预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：
[0097]
[0098] 考虑到吸液损失而放量12.5％。
[0099] 检测并比较健康对照、严重弱精患者精浆样本中miRNAs表达谱的差异，筛选差异表达的miRNA(4倍以上)，在此基础上，结合生物信息学分析及相关文献报道，筛选与线粒体功能密切相关的miRNAs，最终选定3条作为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-101-3P、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p。
[0100] 实施例3 qRT-PCR方法测量精浆中线粒体相关miRNA表达量
[0101] 设计引物(表1)分别对80例正常生育对照、80例严重弱精病例的精浆进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。
[0102] (1)制备cDNA样品：a)取100μl精浆；b)加入900μl Trizol，振荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃下层废液；c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀，转至离心柱，12000rpm离心15秒，弃下层废液；d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层废液。e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液，10000rpm离心15秒，弃下层液。f)重复e。g)将离心柱加入一个新的2ml的管子，10000rpm离心1分钟，用于去除RPE缓冲液。h)在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离心收集RNA.i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。
逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
逆转录的反应体系包括4μl5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
[0103] (2)qRT-PCR：染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq酶(Takara公司)，1μl 20×EVA GREEN，0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物，0.25μl 10μM通用反向引物(URP)，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara公司)，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。10μl TaqMan universal PCR master Mix，6.6μl H2O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较健康对照、严重弱精症精浆样本中miRNA表达量的变化，各组样品精浆miRNA的表达量比值可用方程2–△G表示，其中△G＝CT group1–CT group2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上都设置了U6，以其表达量作为内参调整计算表达量。
[0104] 从结果分析得出，hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p这三条miRNA在各组间均有显著差别(图1)。非参数的趋势性检验也显示了相同的差异。
[0105] 实施例4 个体精浆中线粒体相关miRNA表达量的稳定性分析
[0106] 采用实施例3的方法对6名成年男性精浆miRNA水平的稳定性进行评价。和实施例1同样的采集方法采集研究对象连续三次精浆(间隔时间为1周，间隔期内无疾病)。结果显示，精浆中hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p这三个线粒体相关miRNA表达水平较稳定(图2)。这些都提示了个体精浆miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断标志物的特性。
[0107] 实施例5 线粒体相关miRNA组合对严重弱精症的判断
[0108] 根据上述qRT-PCR方法，本发明人通过对病例和对照组精浆样品的线粒体相关miRNAs表达水平的分析，以正常生育对照组miRNAs表达量的五分位数为阈值，对hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p进行评分，进一步求得总得分，以此绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这三个miRNAs低表达或高表达对严重弱精症的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p以86.34％的AUC(ROC曲线下面积)将正常生育对照组和严重弱精病例组分开(图3)。
[0109] 在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p能够很好地将严重弱精病例和正常生育对照分开。
[0110] 实施例6 线粒体相关miRNA分层评分和独立人群盲法验证
[0111] 当对hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p这三个标志物的表达水平进行分层评分时(五分位数分层后累加)，能够对是否患有严重弱精症进行评估，表述为积分越高，确认为严重弱精症的风险越高。
[0112] 表3三个miRNAs五分位数得分并求和
[0113]
[0114] 注：每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4，最低的0分，最高的4分，3条miRNA综合可以得分为0～12分，而正常生育组绝大多数得分很低(表达量低，积分按反向计算)，而严重弱精组绝大多数得分很高。举例来说，如有一个样本评分为12分(最高的分值组)，则其不可能为正常对照，而应为严重弱精症。
[0115] 针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入严重弱精组，得低分的归入对照组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分)，对另一组独立采集的人群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例成年男性)同时进行常规诊断分析和精浆样品的miRNA检测，结果显示通过3个miRNA检测评分，可以将严重弱精症患者及正常生育对照很好的区分开(40例随机选择样本中有10例评分较高(≥9分)，其中达到12分(最高分)的有3例，这3例经诊断均为严重弱精症患者，其余评分较低(≤3分)的均为非严重弱精症)，提示这三种线粒体相关miRNA可作为评估严重弱精症的标志物。
[0116] 实施例7 用于严重弱精诊断和监测的线粒体相关miRNA诊断试剂盒的制作
[0117] 该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于qRT-PCR技术。
[0118] 首先通过测序的方法和qRT-PCR方法确定正常成年男性和严重弱精患者精浆中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与严重弱精相关的一类精浆miRNA，作为预测是否患有严重弱精以及诊断的指标。最后筛选出对应的精浆miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批精浆miRNA引物，其中miRNA的引物包括hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-let-7b-5p、U6的正反向引物、U6逆转录引物(见表1)。还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价值在于只需要一次提供少量(3ml)精液，即可检测精浆miRNA标志物的变化趋势，再通过该变化趋势预测严重弱精症发生可能性，并易于进行动态监测和观察治疗效果。
[0119] 具体试剂盒组成如下：
[0120] 试剂盒含有以下三对引物：SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，各10μM 0.25μl。
[0121] 试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×EVA GREEN，1.2μl 25mM MgCl2，1.6μl2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。
[0122] 试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对、U6逆转录引物(见表1)。
[0123] 或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM通用反向引物，10μl TaqMan通用PCR混合液，6.6μl H2O。
[0124] 试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。
[0125] 表1 miRNAs的引物序列
[0126]
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