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人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及其应用

阅读：1022发布：2020-07-07

专利汇可以提供人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及应用。一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物，为Hsa-microRNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化测序的特异引物；所述的扩增引物包括3对，所述的甲基化测序检测的特异引物包括miR-145-S2、miR-145-S5、miR-145-S4。本发明对喉鳞癌或者其他人类恶性肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测具有重要的医学价值及临床意义。，下面是人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物组，其特征在于，所述的引物组包括一对Hsa-microRNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的扩增引物及对应的焦磷酸定量甲基化测序的特异引物，所述的引物组可以是下列3组的任意一组：
第一组为：
miR-145-F1：TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT，
miR-145-R1：Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA，
miR-145-S2：AGTTTTGGGGGTGGG；
第二组为：
miR-145-F1：TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT，
miR-145-R1：Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA，
miR-145-S5：TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA；
第三组为：
miR-145-F2：GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT，
miR-145-R2：Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA，
miR-145-S4：TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
2.权利要求1所述的人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物组在制备用于喉鳞癌筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测试剂盒中的应用。

说明书全文

人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种人属微小RNA，具体涉及Hsa-microRNA-145-5p（Hsa-miR-145-5p）启动子区域甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化水平测序的特异性引物，这些引物在肿瘤或其他疾病研究中的应用。背景技术

[0002] 头颈鳞癌为全世界第六位高发肿瘤，位居欧洲男性高发肿瘤的第4位，而喉鳞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，发病率居头颈鳞癌的第2位。据统计，目前全世界范围内喉鳞癌发病略有上升，且年轻化趋势逐渐显现。

[0003] 喉解剖结构局限且黏膜下淋巴管丰富，因此喉鳞癌具有局部侵袭及颈淋巴结转移的恶性生物学特性，成为患者治疗后复发及预后不良的重要风险因素，这也是近30年来喉鳞癌5年生存率并未有明显提升的一个重要因素。在喉鳞癌侵袭转移的过程中势必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的异常表达，如抑癌基因的下调表达，癌基因的上调表达。因此探索这些与喉鳞癌侵袭转移相关的基因表达紊乱的分子生物学机制着重要的临床意义。

[0004] microRNAs（miRNAs）是目前新发现的一类长度约为22nt的内源性非蛋白编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它能够与其相应靶基因信使RNA（mRNA）的3’端非翻译区（3’-UTR区）结合，从而降解mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNAs与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡、恶性间质转化、干细胞分化等方面发挥重要作用。

[0005] 甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 DNA甲基化则是最常见的甲基化修饰方式之一，可引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。其是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG是指由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的一个2个核苷酸的链，当中的p是C和G之间的磷酸，在哺乳动物中CpG以两种形式存在：一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛（CpG island），其是由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重复序列，常位于CATbox附近，可以调控转录的效率。人类基因组中大小为100-1000bp左右，富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

[0006] 由于DNA甲基化与人类肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题。以往研究表明大量抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测、诊断、分级以及预后评估。因此抑癌基因转录区CpG岛的甲基化状态研究已经成为肿瘤领域中表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

[0007] 发明人通过microRNA芯片（Agilent human 8*15k miRNA V12.0）检测了喉鳞癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍（P<0.05）；而Hsa-miR-145-5p表达水平与喉鳞癌患者不良临床参数成负相关，且表达水平越低，喉鳞癌患者的预后越差。因此发明人结合Hsa-miR-145-5p启动子甲基化的思路，探索喉鳞癌中Hsa-miR-145-5p转录抑制的分子生物学机制。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供Hsa-microRNA-145-5p（Hsa-miR-145-5p）启动子区域甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化水平测序的特异性引物。本发明的思路是：发明人基于microRNA芯片（Agilent human 8*15k miRNA V12.0）检测了喉鳞癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍（P<0.05）；而Hsa-miR-145-5p表达水平与喉鳞癌患者不良临床参数成负相关，且表达水平越低，喉鳞癌低表达患者的预后不良越差。因此Hsa-miR-145-5p作为抑癌基因在喉鳞癌中发挥重要生物学作用。为此，本发明在于明确Hsa-miR-145-5p为何在喉鳞癌组织及细胞株Hep-2、TU-177中表达减低，进一步结合DNA甲基化的思路，调取了Hsa-miR-145-5p启动子1425个碱基序列，并进行甲基化生物信息学预测，瞄定了336个碱基中可能有11个高甲基化位点（CpG site），根据这些碱基，设计了3段PCR扩增引物，及相应的经亚硫酸盐修饰后的焦磷酸定量测序引物，以明确这11个位点的甲基化水平，从而试图阐明Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌中转录抑制的表观遗传学机制。

[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0010] 一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物，其中所述的引物为Hsa-microRNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化测序特异引物；所述的PCR扩增引物包括3对，分别为miR-145-F1：TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT，miR-145-R1：Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA；
miR-145-F1 ：TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT，miR-145-R1 ：
Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA；miR-145-F2：GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT，miR-145-R2：Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA；所述的焦磷酸定量甲基化测序特异引物包括miR-145-S2：AGTTTTGGGGGTGGG；miR-145-S5：TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA；miR-145-S4：
TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。

[0011] 上述人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物在制备用于喉鳞癌筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测试剂盒中的用途，尤其应用于喉鳞癌离体组织或喉鳞癌细胞系Hep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p启动子甲基化水平检测。

[0012] 本发明所述焦磷酸定量甲基化测序技术是指PyroMark CpG Assays技术，由QIAGEN公司研发，其是基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)研发的CpG位点甲基化定量分析检测体系。PyroMark CpG Assays基于引物延伸的Pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸（PPi）转化成光信号来监测链的合成过程，通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。

[0013] 与现有技术相比，其可以完全克服BSP法大量挑取单克隆测序的繁琐及较高假阳性率，以及MSP法不能获得定量分析结果的缺点。其具有检测全面、检测准确、检测快速并能将甲基化水平定量化的优点。

[0014] 本发明突出的实质特点和显著的技术效果是：基于焦磷酸定量甲基化测序技术，利用甲基化生物信息学预测手段，针对Hsa-miR-145-5p启动子区域1467碱基中可能存在11个高甲基化点的336个碱基区域。为此，本发明提供了三段特异性PCR引物及焦磷酸测序引物，有效检测出这11个位点的甲基化定量水平，明确了喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p表达下调的表观遗传学机制。这无疑对喉鳞癌或者其他人类恶性肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测具有重要的医学价值及临床意义。
附图说明

[0015] 图1：qRT-PCR检测Hsa-miR-145-5p在Hep-2、TU-177及对照株HOK中的表达；A：miR-145-5p在HOK中相对表达量为6.79±1.29，分别高于其在Hep-2中的相对表达量1.00（P=0.001）及在TU-177中的相对表达量1.17±0.53（P=0.002）；

[0016] 图2：Hsa-mir-145-5p启动子甲基化位点预测结果1（通过MethPrimer -DNA甲基化CpG岛预测及引物设计在线软件预测）；

[0017] 图3：Hsa-mir-145-5p启动子甲基化位点预测结果2（通过CpG Island Searcher预测）；

[0018] 图4：Hep-2、TU-177及HOK三个细胞株 11个位点的甲基化测序定量显示图。

[0019] 图5：Hep-2、TU-177及HOK 11个位点甲基化水平曲线图，灰色框所示为高甲基化的2-7位点；

[0020] 图6：Hep-2、TU-177及HOK中11个位点甲基化平均水平柱状图；

[0021] 图7： Hep-2、TU-177及HOK中2-7位点甲基化平均水平柱状图；

[0022] 图8：实施例PCR反应条件。

具体实施方式

[0023] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。

[0024] 一、实验所需主要试剂、耗材及仪器

[0025]

[0026] 二、实验材料

[0027] 细胞株：人喉鳞癌细胞株Hep-2、TU-177及正常人口腔黏膜角化细胞HOK。

[0028] 喉鳞癌细胞株Hep-2（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）、TU-177（Bioleaf Biotech Co.）、正常人口腔黏膜角化细胞HOK（SCIEN CELL）。

[0029] 其中Hep-2培养条件为RPMI-1640（Hyclone） + 10%胎牛血清（Hyclone），TU-177培养条件为DMEM/F12 （Hyclone）+ 10%胎牛血清（Hyclone），HOK培养条件为OKM（SCIEN CELL，Cat. No. 2611）+ 10%胎牛血清（Hyclone）。

[0030] 所有细胞都在37°C，5% CO2环境下置细胞培养箱中培养。传代用0.25% 含EDTA胰蛋白酶溶液。其中HOK作为对照细胞株。

[0031] 三、实验方法（所有引物为上海生工生物工程股份有限公司合成）[0032] 3.1 qRT-PCR检测

[0033] 3.1.1总RNA抽提

[0034] 1)细胞用DEPC处理过的PBS冲洗3次，加入1mL Trizol溶液（Invitrogen），吹打混匀，使细胞充分裂解，静置5min；

[0035] 2)加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

[0036] 3)4°C下，10000 rpm离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

[0037] 4)沉淀RNA：加入0.5mL异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；

[0038] 5)4°C下，10000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；

[0039] 6)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；

[0040] 7)加入15~60μLDEPC水溶解沉淀。

[0041] 总RNA纯度和完整性检测

[0042] 1)纯度检测：取1μL RNA样品50倍稀释，在艾本德核酸蛋白测定仪（BioPhotometer plus）上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

[0043] 总RNA完整性检测：取RNA样品1μL，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，检测其完整性。

[0044] 茎环法逆转录

[0045] 在去RNase的PCR管中配置以下溶液

[0046]

[0047] 将上述溶液混匀，85°C孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：

[0048]

[0049] 上述溶液混匀后42°C孵育60min；85°C孵育10min灭活逆转录酶。

[0050] 定量PCR

[0051] 内参片段：U6-94bp，上下游引物分别为U6-F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’及U6-R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

[0052] 目的片段：hsa-miR-145-5p-73bp（MIMAT0000437），上下游引物分别为 hsa-miR-145-F：5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3’ 及 miR RNA-R：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

[0053] 反应体系：

[0054]

[0055] 反应条件如图8所示，

[0056] 融解曲线分析：温度60°C-95°C。每样设三个副孔，并重复3次。

[0057] 亚硫酸氢盐处理样本DNA

[0058] 采用Qiagen公司的EpiTect Bisulfite Kit进行，样本的起始量为1ug，按试剂盒说明书进行操作。

[0059] 引物和焦磷酸测序测序引物（标记为S）

[0060] 将预测的含有11个甲基化位点的336个碱基序列分为三段，分别设计PCR引物及焦磷酸测序引物，引物序列如下：

[0061]

[0062] 3.2.2 PCR体系40uL，组成如下：

[0063]

[0064] 3.2.3 PCR反应条件：

[0065]

[0066] 其中片段1和2为56度复性，片段3为52度复性。取40 uL PCR产物经纯化得到单链DNA，与40ul测序buffer混合(其中含0.5 uM测序引物S)，经80度变性2 min后，采用PyroMark ID测序仪进行测序分析。

[0067] 产物预处理操作步骤

[0068] （1）在使用前，保证所有溶液都达到室温；

[0069] （2）在PSQ 96板中预先加入40μL含有0.5μM测序引物的annealing buffer；

[0070] （3）使用 Vertex 混匀 Sepharose beads（streptavidin sepharose HP，GE healthcare）；

[0071] （4）将需要使用的sepharose beads总量（每样本3μL）转移到一个Eppendorf管中；

[0072] （5）在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有40μL的体积，将混合物混匀；

[0073] （6）将以上混合物加入PCR产物（40μL反应体积）中，每样本40μL；

[0074] （7）将PCR产物在常温下混匀5min，使得beads与生物素结合；

[0075] （8）在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和Denaturation buffer；

[0076] （9）打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30sec；

[0077] （10）然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（请在beads与PCR产物结合后3min内完成此操作）；

[0078] （11）拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；

[0079] （12）将vacuum prep tool放入70％乙醇中5sec；

[0080] （13）然后移到denatureation buffer中5sec；

[0081] （14）再移到washing buffer中清洗5－10sec，关掉泵；

[0082] （15）将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads（测序引物也可最后加入）；

[0083] （16）使用高纯水清洗vacuum prep tool；

[0084] （17）将放有样品的PSQ 96板加热到80℃2min，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。

[0085] 实验结果

[0086] 4.1 Hsa-mir-145-5p在三种细胞株中的原始表达水平

[0087] 发明人利用qRT-PCR技术检测了Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌细胞株Hep-2、TU-177及对照株HOK中的表达，发现Hsa-miR-145-5p在Hep-2、TU-177中的相对表达水平明显低于对照株HOK，而FSCN1在Hep-2、TU-177中的相对表达水平明显高于对照株HOK，见图1。

[0088] 启动子调取

[0089] 通过生物信息学网站，我们调取了Hsa-mir-145-5p启动子的序列，共计1467个碱基，序列如SEQ ID NO.1。

[0090] 甲基化预测

[0091] 发明人通过两个甲基化预测软件（Meth Primer -DNA甲基化CpG岛预测及引物设计在线软件，http://www.urogene.org/methprimer/index1.html；CpG Island Searcher，http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx），对这一启动子进行预测，发现并没有明显的甲基化岛（CpG island）的存在。但是却存在一些密集的甲基化点（CpG site）。在这些甲基化点中，发明人选择一些位置临近，相对密集的区域，共有11个位点，跨域碱基为336个，见序列SEQ ID NO.2。

[0092] 发明人再次通过甲基化引物预测软件再次进行预测，亚硫酸盐处理后的序列如下（Y表示C/T），共有12个，但第一个距离密集区较远，因此选择后11个进行焦磷酸测序。待测序的序列见序列SEQ ID NO.3。

[0093] 4.4 甲基化定量测序结果

[0094] 经过焦磷酸甲基化定量测序，发明人检测了三个细胞株11个预测位点的甲基化水平，见图4。发现在Hep-2、TU-177中的11个位点均存在高甲基化水平，其中Hep-2为（82.0±18.0）%，TU-177为（94.0±3.0）%，均高于HOK的（65.0±19.0）%，P<0.05。特别是2-7位点，Hep-2为（83.0±9.0）% ，TU-177为（93.0±3.0）%，均高于HOK的（54.0±16.0）%，P<0.05。见图5-7。

[0095] 综上所述，本发明提供了Hsa-miR-145-5p启动子区域三段特异性PCR引物及焦磷酸测序引物，检测出这11个位点的甲基化定量水平，尤其是2-7位点甲基化水平显著增高，明确了喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p表达下调的表观遗传学机制。这无疑对喉鳞癌或者其他人类恶性肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测具有重要的医学价值及临床意义。

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