蔬菜提取物及其制备方法和其在人类及兽医学中的应用
专利汇可以提供蔬菜提取物及其制备方法和其在人类及兽医学中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过含以下步骤的方法得到的 生物 活性 植物 提取 物:a)榨压蔬菜材料成浆状;b)将所得浆状物用 水 性或 有机 溶剂 进行冷或 热处理 ;c)去除溶剂直至得到所需的浓度水平;d)选择性地,通过一种或多种下列方法进一步纯化这样得到的提取物:热 凝固 术、用 硫酸 铵纯化、沉淀、在凝胶或离子交换 树脂 上层析。，下面是蔬菜提取物及其制备方法和其在人类及兽医学中的应用专利的具体信息内容。
1．一种生物活性植物提取物，通过含以下步骤的方法得到：
a)榨压蔬菜材料成浆状；
b)将所得浆状物用水性或有机溶剂进行冷或热处理；
c)去除溶剂直至得到所需的浓度水平；
d)选择性地，通过一种或多种下列方法进一步纯化这样得到的提 取物：热凝固术、用硫酸铵纯化、沉淀、在凝胶或离子交换树脂上层析。
2．根据权利要求1所述的提取物，从选自马铃薯、萝卜、芜菁、甜 菜、胡萝卜、洋姜、甘薯、油菜、黄瓜、西葫芦、小西葫芦和西红柿的 蔬菜中得到。
3．生物活性化合物，通过在Q hyper DTM 20-凝胶层析柱上进一 步层析纯化根据权利要求1或2所述的提取物，洗脱柱子并随后收集在 所选洗脱液浓度洗脱的组分得到。
4．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.09M NaCl时洗 脱。
5．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.15M NaCl时洗 脱。
6．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.21M NaCl时洗 脱。
7．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.25M NaCl时洗 脱。
8．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.32M NaCl时洗 脱。
9．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.45M NaCl时洗 脱。
10．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.52M NaCl时洗 脱。
11．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.70M NaCl时洗 脱。
12．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.78M NaCl时洗 脱。
13．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于0.85M NaCl时洗 脱。
14．根据权利要求3所述的生物活性化合物，于1.02M NaCl时洗 脱。
15．生物活性化合物，通过将根据权利要求1或2所述的提取物进 一步上样通过Q hyper DTM 20-凝胶层析柱，随后在QMA-凝胶层 析柱上进一步纯化洗脱物，洗脱柱子并随后收集在所选洗脱液浓度洗脱 的组分得到。
16．根据权利要求15所述的生物活性化合物，于0.05M NaCl时洗 脱。
17．根据权利要求15所述的生物活性化合物，于0.08M NaCl时洗 脱。
18．根据权利要求15所述的生物活性化合物，于0.12M NaCl时洗 脱。
19．根据权利要求15所述的生物活性化合物，于0.20M NaCl时洗 脱。
20．根据权利要求15所述的生物活性化合物，于0.27M NaCl时洗 脱。
21．根据权利要求4-17,9-14,16,17,19和20所述的 生物活性化合物，用作真核细胞的促有丝分裂剂。
22．根据权利要求8和8所述的生物活性化合物，用作细胞生长抑 制剂。
23．根据权利要求6,9和19所述的生物活性化合物，用作刺激代 谢的制剂。
24．根据权利要求4,5,11,13和14所述的生物活性化合物， 用作微生物的促有丝分裂剂。
25．一种或多种根据权利要求4-7,9-14,16,17,19和 20所述的生物活性化合物的组合，用作真核细胞的促有丝分裂剂。
26．一种或多种根据权利要求8和18所述的生物活性化合物的组 合，用作细胞生长抑制剂。
27．一种或多种根据权利要求4,5,11,13和14所述的生物活 性化合物的组合，用作微生物的促有丝分裂剂。
28．一种制备植物提取物的方法，该提取物具有包括影响细胞生长 的生物活性，该方法包括以下步骤：
a)榨压蔬菜材料成浆状；
b)将所得浆状物用水性或有机溶剂进行冷或热处理；
c)去除溶剂直至得到所需的浓度水平；
d)选择性地，通过一种或多种下列方法进一步纯化这样得到的提 取物：热凝固术、用硫酸铵纯化、沉淀、在凝胶或离子交换树脂上层析。
29．根据权利要求28所述的方法，其特征在于：
a)所得浆状物的处理是用冷水进行，
b)这样得到的物质通过离心或过滤浓缩，
c)随后在存在酒清、正辛酸、乙酸和硫酸铵的情况下进行热凝固 术，
d)将这样得到的提取物离心，
e)上清用于超滤以得到提取物。
30．根据权利要求28或29所述的方法，进一步包括将提取物在Q hyper DTM 20-凝胶上层析分离并用NaCl梯度洗脱柱子。
31．根据权利要求28或29所述的方法，进一步包括将提取物上样 通过Q hyper DTM 20-凝胶层析柱并随后在含QMA-凝胶的柱上层 析分离得到的洗脱物并用NaCl梯度洗脱柱子。
32．人类或兽医学使用的药物，包含至少一种下列成分：根据权利 要求1或2所述的提取物，根据权利要求3-24所述的生物活性化合 物或根据权利要求25-27所述的组合。
33．一种培养基，包含至少一种下列成分：根据权利要求1或2所 述的提取物，根据权利要求3-24所述的生物活性化合物或根据要求 要求25-27所述的组合。
本发明涉及新的蔬菜提取物及其制备方法，和这些蔬菜提取物在生 物技术和治疗中的应用，这种应用是由于它们作为细胞生长因子和生长 抑制因子的活性。
植物常常具有不可怀疑的治疗性能或含具治疗性能的活性成分。特 别是对于难于治疗的疾病，如癌症等，植物是潜在的医药来源。
根据本发明，现已出乎意料地发现，具有生物活性的提取物可从植 物，特别是含糖精、蛋白、糖蛋白和萜的植物中制备。为此目的，可使 用的蔬菜是比如马铃薯、萝卜、芜菁、甜菜、胡萝卜、洋姜、甘薯、油 菜、黄瓜、西葫芦、小西葫芦、西红柿等。此目录不是完全列举。
根据本发明的提取物按照以下连续的步骤制备：
-榨压所选蔬菜成浆状；
-将溶剂蒸发直至得到所需的浓度水平；
-选择性地，通过一种或多种下列方法比如热凝固术，用硫酸铵纯 化、沉淀、在凝胶或离子交换树脂上层析进一步纯化这样得到的提取物。
在以BIO MEDIA公司的名义申请的法国专利申请FR-A-2732 347中描述了一种提取方法，用这种方法能得到具确定活性的三个组分。 此处引用此公开文件的内容。
根据本发明，提取物进一步得到纯化，分别得到具分子量5,000、 7,500、10,000、12,000、15,000、20,000、30,000、40,000、 65,000、82,000、105,000,130,000、180,000、200,000、220,000、 250,000道尔顿的16种糖精类、蛋白、糖蛋白、萜和肽分子。所有这些 分子都易溶于水。
这些分子可通过在Q hyper DTM 20-凝胶上层析进一步纯化得 到。由此在0.09M,0.15M,0.21M,0.25M,0.32M,0.45M,0.52M,0.70M, 0.78M,0.85M,1.02M NaCl洗脱得到11种分子。
在洗脱物中低分子量的成分可以通过在以QMA-凝胶为基础的第 二种柱子上层析进一步得到纯化。在0.05M,0.08M,0.12M,0.20M和 0.27M NaCl洗脱得到五种组分。
在这种方法中得到的16种不同成分的活性如实施例中描述的得到 测定。
在实施例中描述的毒理学和药理学研究表明根据本发明的化合物没 有毒性，也表明了它们的显著性能。
根据本发明的具促有丝分裂活性的14种分子每种都可以作为促有 丝分裂活性物质使用或以不同浓度用于不同的目的，如生产用于研究和 诊断的培养基、生产人类或动物医疗中使用的分子和疫苗，或用于化妆 品。
能刺激微生物繁殖的五种分子可以有效地用于发酵培养基领域，这 些发酵培养基用于生产人类和动物治疗、化妆品或农业综合企业所需的 微生物或分子。
对代谢有影响的三种分子将在人类和动物医疗的体重减轻或生长问 题病例中有效施用，或用于细菌诊断学。
具细胞抑制活性的两种分子由于它们的细胞生长抑制能力可有效地 作为抗肿瘤剂和抗癌剂施用。
本发明将在以下非限制性实施例中进一步得到说明。 实施例 实施例1活性物质的分离
将1000g新鲜健康的西葫芦压碎以得到细密的菜泥。用这种方法得 到的菜泥用500g冷水处理2小时。然后将所得的糊状物(E1)离心或 过滤以收集浆状物(E2)。
然后通过含乙醇、正辛酸、乙酸和硫酸铵的热凝固术纯化这样得到 的提取物。离心后收集上清，并且随后用于超滤以除去特定的盐类并得 到滤液的正确浓度。
将这样得到的滤液在Q hyper DTM 20-凝胶上的层析纯化，在 0.09M、0.15M、0.21M、0.25M、0.32M、0.45M、0.52M、 0.70M、0.78M、0.85M、1.02M NaCl洗脱得到11种分子。下面对基 于其洗脱浓度的不同组分进行检测。
当上样时，低分子量在洗脱物中。将它们在第二种QMA-凝胶柱 子上纯化，并在0.05M,0.08M,0.12M,0.20M和0.27M NaCl洗脱。 实施例2活性
除了在Q hyper DTM 20-凝胶上于0.32M和QMA-凝胶上于0. 12M分离的分子具有明显的细胞生长抑制活性之外，在实施例1中分离 的分子表现对所有动物或人体细胞很高的促有丝分裂能力。 实施例3毒理学研究
体内和体外进行的测试都表明根据本发明的活性成分具有低毒性和 良好耐受性。
用中性红和MTT在体外测定细胞毒性。在600μg/ml剂量时，在培 养基中没有检测到毒性。
进行下列体内测试。所有表现促细胞分裂活性的分子在小鼠上进行 测试。此研究证明没有毒性。对24只雌性动物和24只雄性动物两组动 物腹膜内注射0.5ml 100g/l每种这些分子的溶液，7天后不引起任何死 亡。
使用抑制细胞生长的分子，用同样剂量进行相同测试。实验开始在 处理动物中观察到3-4％的平均体重减少。在雌性和雄性中都是这种 结果。注射后4-5天，动物恢复了它们的正常生长，这证明根据本发 明的分子没有毒性。 实施例4药理学研究
此处所报告的药理学测试结果表明了根据本发明的活性成分的显著 性能。 1．促有丝分裂活性
使用带6个加样孔的NUNC平板和HAM F12培养基在CRFK和 VERO细胞株系上进行测试。
将含200,000细胞/ml的培养基铺开。相对于仅含HAM F12和HAM F12+10％胎牛血清(FCS)的对照，在细胞培养物中对以0.025g/l-4g/l 剂量的每种分子进行测试。
对于每种分子，根据活性决定最佳浓度范围。正常的活性在0.05g/l 和0.5g/l之间存在。
依赖于所测分子，即在200,000细胞/ml、600,000-1,000,000细 胞/ml的起始含量，检测到的细胞增殖率在3和5之间变动。增殖率与用 SVF细胞(900,000-1,000,000细胞/ml)得到的数值相同。
随后在超过120个细胞系上测试根据本发明的分子的促有丝分裂能 力，这些细胞从ATCC得到，或来自原始培养物、动物、真核、人类或 二倍体细胞。
除了它们对细胞系的活性，观察到在0.09M,0.15M,0.70M,0.85M 和1.02M洗脱的分子同样表明对微生物的显著扩增能力。在乳杆菌属上 进行的测试表明相对于对照，在24小时中生物物质增加了30％。 2．抑制活性
在同样条件下进行的测试中，在Q Hyper DTM 20-柱上于0.32M 洗脱的分子和在QMA柱上于0.12M洗脱的分子以0.5g/l-1g/l的剂量 产生对细胞生长的完全抑制。
这两种分子同样抑制来自全国癌症研究中心(NCI)的肿瘤细胞所 有实验对象(62个贮备种)的生长。 3．对体内代谢的影响
用在Q Hyper DTM 20-柱上于0.21M,0.45M洗脱的分子和在 QMA-柱上于0.20M洗脱的分子进行此项实验。24只雄性小鼠和24 只雌性小鼠组成的群体分别接受0.5ml 100g/l测试分子的溶液。
相对于只接受0.5ml 100g/l氯化钠溶液注射的对照群体，本发明的 分子在雄性和雌性小鼠中引起8.25％的平均体重增加。
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