技术领域
[0001] 本
发明涉及一种枸杞炭疽病抗性评价方法，尤其是一种通过室内离体
叶片鉴定途径建立枸杞高效炭疽病抗性评价体系的方法。
背景技术
[0002] 枸杞炭疽病是我国枸杞产区的主要病害之一，一般在湿度高的环境下侵染枸杞植株，可危害枸杞的叶、花和花蕾，主要危害果实，也危害嫩枝，传播范围广，危害大。近几年来，随着枸杞栽培地区连片种植面积扩大，特别是种植
密度与肥
水水平的提高以及全球
气候变暖，导致枸杞炭疽病连续大面积流行。
[0003] 枸杞对炭疽病的抗性属于典型的数量性状。炭疽病抗性育种是枸杞育种发展的重要方向，枸杞炭疽病病菌接种和抗性评价方法是筛选抗炭疽病遗传资源和培育抗病品种的重要前提。在育种过程中，对炭疽病抗性的准确鉴定尤为重要，尤其在分子标记辅助育种过程中，需要对枸杞炭疽病抗性进行准确分级鉴定。目前，由于枸杞炭疽病抗性评价体系的不完善，影响和制约了枸杞炭疽病抗性育种的发展。
[0004] 为了有效防治枸杞炭疽病，已经有研究者对对炭疽菌的侵染途经和传播方式进行了初步研究。西北农学院程廉通过野外调查法对陕西关中地区枸杞炭疽病的发病规律进行了较系统的研究；李岩涛等、邓放等、张锦秀等、邓振荣和陈君等则分别在内蒙和宁夏的枸杞主产区进行了该病的流行规律的调查；Park SK等采用田间自然发病调查和人工接种鉴定研究结果，调查了韩国不同的枸杞地方品种的炭疽病抗病性；邓振荣等调查了内蒙古西部地区的枸杞变种或品种的炭疽病抗病性；陈君等于2001年对宁夏中宁县4个品种的炭疽病发病率进行了田间调查；张国华等在调查了河北省巨鹿县枸杞生产中炭疽病的发病规律；程廉在陕西省蒲城县，采用果实离体接种的方法，对6个品种或变种枸杞进行抗病性测定；李
云翔等采用室内离体果实接种结合田间抗病性调查，对5个枸杞种和1个品种进行了抗炭疽病鉴定。Sun等(2008)通过果实接种法鉴定了不同枸杞品种的炭疽病抗性。Liu等(2016)通过果实接种法研究了枸杞炭疽病的抗性。
[0005] 虽然对枸杞炭疽病抗性的评价已有了初步研究，但主要还存在以下问题：①实验多采用田间调查方法，重复性差且容易受环境影响；②室内鉴定，所选用的鉴定材料为果实，限制了果实产生之前的早期鉴定；③虽然对不同枸杞品种炭疽病抗性做了初步评价，但是对枸杞炭疽病感病性没有明确的分级标准，没有形成完善的评价体系，导致对炭疽病抗性表型鉴定不够准确，不适合应用于分子标记辅助育种。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种枸杞炭疽病抗性评价方法，该方法所获得的结果稳定，重复性好，不受环境影响，且操作步骤简单。
[0007] 一种枸杞炭疽病抗性评价方法，其特别之处在于，包括如下步骤：
[0008] 1)叶片采集：采集生长部位相当、大小基本一致且无病虫的枸杞叶片；
[0009] 2)炭疽病菌培养：将保存的枸杞炭疽病菌株，在超净
工作台接种于PDA固体平板(培养基)，该PDA固体平板包括
马铃薯200克，
葡萄糖20克，琼脂15克，并且加蒸馏水定容至1000毫升后高压
蒸汽灭菌，于28±1℃培养；
[0010] 3)孢子悬液制备：将生长5-7天的菌落划
块接种于液体PDA培养基，该液体PDA培养基包括马铃薯200克，葡萄糖20克，并且加蒸馏水定容至1000毫升后高压蒸汽灭菌，震荡培养5-7天，离心，计数，用灭菌蒸馏水稀释至所需浓度，具体为106个孢子/ml、107个孢子/ml、108个孢子/ml，得到孢子悬液，备用；
[0011] 4)炭疽病菌接种：将枸杞叶片进行表面消毒并清洗后，将叶片置于灭菌培养皿，用灭菌手术刀刀尖在叶片叶脉两侧划2mm伤口，伤口处分别接种10μL配置好的孢子悬液，并进行培养；
[0012] 5)枸杞离体叶片接种后病情调查及统计：于25℃、12h光照/12h黑暗、湿度80％条件培养4天后测量病斑直径，将直径大小作为衡量病害严重程度的评价指标；
[0013] 6)根据分级标准将枸杞材料的炭疽病抗性进行分级，分级标准如下：一级：病斑直径X：0≤X<1mm；二级：病斑直径X：1≤X<2mm；三级：病斑直径X：2≤X<3mm；四级：病斑直径X：3≤X<4mm。
[0014] 其中枸杞炭疽病菌株采用Colletotrichum gloeosporioides Pena.胶胞炭疽菌。
[0015] 其中将枸杞叶片进行表面消毒并清洗具体是指，首先用有效氯浓度为1％的
次氯酸钠溶液将枸杞叶片进行表面消毒，然后用灭菌蒸馏水清洗5-7次。
[0016] 针对
现有技术的不足，本发明以枸杞叶片为材料，利用离体接种法，构建枸杞炭疽病抗性评价体系，重复性好，该方法可以同时适用于多个品种，为进一步进行炭疽病抗性的枸杞分子标记辅助育种奠定了
基础。本发明通过离体室内叶片接种法，构建了枸杞炭疽病抗性评价体系，该方法结果重复性好，且步骤简单，易于实现。另外本发明方法还可以应用于枸杞分子育种中，对枸杞炭疽病抗性关键性状的QTL
定位实施过程中，用于对杂交后代炭疽病抗性进行分级。
附图说明
[0017] 附图1为不同品种枸杞接种106/mL炭疽病菌孢子悬液后病斑直径统计分析图；
[0018] 附图2为不同品种枸杞接种107/mL炭疽病菌孢子悬液后病斑直径统计分析图；
[0019] 附图3为不同品种枸杞接种108/mL炭疽病菌孢子悬液后病斑直径统计分析图。
具体实施方式
[0020] 本发明方法运用室内离体接种法，以枸杞叶片作为接种对象，接种合适浓度的孢子悬液，通过统计分析病斑大小，来实现对枸杞炭疽病抗性实现快速准确鉴定。
[0021] 下边结合附图、附表及具体
实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0022] 实施例1：
[0023] 黑果枸杞、黄果枸杞、宁杞1号、宁杞6号、宁杞7号和宁杞8号的离体叶片炭疽病接种及抗性评价
[0024] (1)炭疽病菌株培养：将保存菌株在超净工作台接种于PDA固体培养基(200g·L-1马铃薯+18g·L-1葡萄糖+18g·L-1琼脂)，培养条件为暗培养，
温度28±1℃。
[0025] (2)孢子悬液制备：将生长7d后的菌落划1cm左右菌块，接于100-200mL PDA液体培养基，在摇床28℃震荡培养，转速180-200rpm/min。该液体PDA培养基包括马铃薯200克，葡萄糖20克，并且加蒸馏水定容至1000毫升后高压蒸汽灭菌。
[0026] (3)孢子浓度测定：将7d的悬浮培养产物移至10mL离心管，在300rpm/min低速离心10s，取上清，在血球计数板测定孢子浓度，灭菌水稀释后备用，接种浓度设置3个，分别为
108个孢子/ml、107个孢子/ml、106个孢子/ml。
[0027] 孢子浓度(个/mL)＝小方格孢子数(均值)*400*10000*稀释倍数。
[0028] (4)叶片采集：在枸杞种质资源圃采集无病虫枸杞叶片，大小基本一致，卷程度较小。
[0029] (5)培养皿灭菌：在培养皿底部垫一层
棉花，铺两层
滤纸，去离子水打湿铺平后于灭菌锅中高压灭菌30min。
[0030] (6)叶片用去离子水洗2次后置于灭菌的15cm培养皿，每个品种5片叶，黑果枸杞15片叶。
[0031] (7)叶片刺伤及接种：在超净工作台用灭菌手术刀刀尖在叶片叶脉两侧划2mm左右伤口，黑果枸杞1个伤口，其他品种4个伤口，在伤口处接10μL配置好的孢子悬液，于25℃、12h光照/12h黑暗、湿度80％条件培养。
[0032] (8)在接种4d后测量病斑直径，通过SPSS单因素方差分析中SNK法(Student-Neuman-Keuls)进行统计分析，数据分析结果见下表1和附图1。
[0033] 表1枸杞不同品种接种炭疽病后病斑直径统计分析
[0034]
[0035] (9)根据统计分析的结果根据差异性，选择107个孢子/mL作为侵染浓度，将枸杞炭疽病抗性分为不同的等级，分级标准如下：
[0036] 一级：病斑直径X：0≤X<1mm；
[0037] 二级：病斑直径X：1≤X<2mm；
[0038] 三级：病斑直径X：2≤X<3mm；
[0039] 四级：病斑直径X：3≤X<4mm；
[0040] (10)根据分级条件，将待测枸杞品种的炭疽病抗性进行分级，结果表明，炭疽病抗性黑果枸杞为一级，宁杞6号为二级，黄果枸杞为三级，宁杞1号、宁杞7号、宁杞8号为四级。
[0041] 本发明采用不同浓度的孢子悬液，对枸杞叶片进行了离体接种，在抗病性程度方面，三种不同浓度取得了一致的试验结果。孢子浓度为106/mL和108/mL时差异显著性性和分级结果不如107/mL，因此在枸杞抗炭疽病种质筛选中，建议采用107/mL的孢子悬液浓度进行筛选。
[0042] 本发明所建立的枸杞炭疽病抗性评价方法能够用于不同种/品种(系)的快速定性鉴定。
[0043] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种
变形和改进，均应落入本发明的
权利要求书确定的保护范围内。
