一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用
阅读：1029发布：2020-07-29
专利汇可以提供一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一株莫哈韦芽孢杆菌BacillusmojavensisQLY002菌株，保藏编号为CGMCCNo.8905。本发明还提供该菌株的 微 生物 菌剂、其制备方法及在 马 铃薯病原菌抑菌和对马铃薯促生作用中的应用。本发明的菌株和菌剂能够作为微生物 农药 和 肥料 使用，能够抑制马铃薯坏疽病菌、马铃薯早疫病原菌、马铃薯干腐病菌和马铃薯 炭疽病 菌，其抑菌率在61%以上；对马铃薯有促进作用，可以作为马铃薯专用微 生物农药 和微 生物肥料 使用，从而可以克服 现有技术 中 化学农药 环保性差、易产生抗药性和安全性差的 缺陷 ，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。，下面是一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一株莫哈韦芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述莫哈韦芽孢杆菌菌株Bacillus mojavensis QLY002的保藏编号为：CGMCC No.8905。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，其特征在于：所述菌体为莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：在每毫升所述微生物菌剂中，莫哈
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韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905的活菌数为4.12×10 -1.59×10 CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基的组分和含量包括：氯化铵10-18.5g/L，玉米粉14-24g/L，马铃薯180-280g/L；pH值为7.2-8.2，溶剂为蒸馏水或无离子水；作为优选，所述培养基的组分和含量包括：氯化铵14.25g/L，玉米粉19g/L，马铃薯230g/L；pH值为7.7，溶剂为蒸馏水或无离子水。
5.根据权利要求2-4任一所述的微生物菌剂，其特征在于：在微生物菌剂中，所述菌体的质量百分比含量为5-11%，其余为培养基。
6.权利要求2-5任一所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：将莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905接种至培养基中，在温度为26-30℃、转速为150-210r/min和溶氧量为50%-70%的条件下，进行液体发酵32-40h，制得发酵液，即得到微生物菌剂；优选地，是在接种量为8%、温度为28℃、转速为180r/min和溶氧量为60%的条件下，进行液体发酵36h，制得发酵液，得到微生物菌剂。
7.权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株和权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制备马铃薯专用微生物农药中的应用。
8.权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株和权利要求2-5任一所述的微生物菌剂在制备马铃薯专用微生物肥料中的应用。
9.一种微生物农药，其含有权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或权利要求2-5任一所述的微生物菌剂。
10.一种微生物肥料，其含有权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或权利要求2-5任一所述的微生物菌剂。
一株莫哈韦芽孢杆菌菌株、微生物菌剂及其制备方法和应
用
技术领域
背景技术
[0002] 随着化学农药的大量、频繁使用，环境污染、农药残留和增加抗性等问题也越来越严重，植物病害的生物防治成为了研究热点，其中尤以植物内生菌作为拮抗菌的研究得到众多学者的观注。植物内生细菌是指生活在植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，但对植物没有任何实质性伤害的细菌，其具有多种生物学功能，特别是抑菌功能成为生防菌资源的有力支撑。研究发现植物内生菌对植物有促进生长的作用，这些促生作用主要体现在内生细菌通过产IAA、固氮作用和通过解磷或溶磷作用使植物能够尽可能的得到养分的补充，从而使植物对生物量进行了积累；植物内生细菌也可以通过分泌抑菌物质、与病原菌竞争营养空间及诱导植物获得抗病性阻止或降低病原菌对植物的侵染或造成的危害。以内生细菌为菌种资源研制的微生物农药不易产生抗药性，不伤害天敌，且能利用农副产品甚至工业废水广泛生产，应用于农业生产后为生产绿色或无公害农产品提供了一个新的途径。
[0003] 大量使用化学氮肥、磷肥和钾肥会导致重金属在土体中累积、资源与能源大量消耗、环境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在农田中流失或挥发，对地下水资源、土壤和空气造成了严重污染，使农畜产品的有毒物质超标，给人类健康带来了极大的危害，同时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构，造成土壤板结，肥力下降。
[0004] 微生物肥料作为一种新型肥料，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能固定大气中的氮素、释放土壤中固定态的磷、钾元素，使得环境的养分潜力得以充分发挥，并为作物生长营造一个良好的土壤微生物环境，在减少化肥用量、降低环境污染、提高农作物品质等方面具有重要意义。尤其是集抑菌、固氮、解磷、解钾和作物生长素于一身的复合微生物肥料的研发，在农业可持续发展中有举足轻重的作用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中化学农药和化肥环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，提供一株莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002菌株，利用所述内生细菌莫哈韦芽孢杆菌的广谱杀菌活性和促生能力，来制备环保性好、不易产生抗药性和安全性好的内生细菌莫哈韦芽孢杆菌微生物菌剂。
[0006] 本发明从高寒草地珠芽蓼(Polygonum viviparum)、紫花针茅(Stipa purpurca Griseb)，线叶嵩(Kobreasia Capillifolia)，秦艽(Gentiana macrophy pall)和乳白香青(Anaphalis Lactea Maxin)等的内生细菌中筛选获得一株对马铃薯病原菌具有抑菌和对马铃薯具促生作用的内生细菌：莫哈韦芽孢杆菌菌株，该菌株的拉丁文名称为Bacillus mojavensis QLY002，并对其生物学功能进行了研究，优化了其培养条件及发酵条件，并进行了防治试验，提供了一株生物防治和生物菌肥的菌种资源和其菌剂的制备方法。本申请人将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8905，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位简称：CGMCC，保藏日期为2014年03月10日。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体为莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905。
[0008] 优选地，在每毫升所述微生物菌剂中，莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905的活菌10 11
数为4.12×10 -1.59×10 CFU。
数为4.12×10 -1.59×10 CFU。
[0010] 最优选地，所述培养基的组分和含量包括：氯化铵14.25g/L，玉米粉19g/L，马铃薯230g/L；pH值为7.7，溶剂为蒸馏水或无离子水。
[0011] 优选地，在微生物菌剂中，所述菌体的质量百分比含量为5-11％，其余为培养基。
[0012] 本发明通过以下试验来确定莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的最适培养基。
[0013] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)分别接种于标号依次为A、B、C、D、E、F和G的培养基中，观测莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在这7种培养基中的生长能力。
[0014] 经观测，发现莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在这7种培养基中均能生长，但活菌数有差异。其中，对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在这7种培养基中活菌数的测定结果参见图1。
[0015] 在图1中，“A”表示营养琼脂(Nutrient Agar，简称NA)培养基，在NA培养基中，包括牛肉胨5.0g、蛋白胨10.0g、蔗糖20.0g和蒸馏水/去离子水1000mL；“B”表示PDA培养基，在PDA培养基中，包括马铃薯200.0g、蛋白胨10.0g、蔗糖20.0g和蒸馏水/去离子水1000mL；“C”表示营养肉汤(Nutrient Broth，简称NB)培养基，在NB培养基中，包括牛肉胨3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL；“D”表示酵母葡萄糖固体(即NYDA)培养基，在NYDA培养基中，包括牛肉胨8.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10.0g和蒸馏水/去离子水1000mL；“E”表示第一玉米淀粉培养基，在第一玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉2.5g、(NH4)2SO4 10.0g、蔗糖10.0g和蒸馏水/去离子水1000mL；“F”表示第二玉米淀粉培养基，在第二玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉3.0g、(NH4)2SO410.0g、KH2PO4 15.0g、蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“G”表示蛋白胨培养基，在蛋白胨培养基中，包括蛋白胨10.0g、酵母浸膏5.0g、NaCl 10.0g和蒸馏水/去离子水1000mL。
[0016] 由图1可知，在相同的条件下，选择7种不同的培养液培养莫哈韦芽孢杆菌CGMCC9
No.8905，其活菌量有明显差异。B培养液中活菌数1.045×10CFU/mL，培养液E和F中活菌
3
数均低于3×10CFU/mL，培养液A，C，D和G活菌数显著低于B培养液。可见，培养液B较为理想，因此，马铃薯200.0g、蛋白胨10.0g、蔗糖20.0g、水1000mL为莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的基础培养基。
No.8905，其活菌量有明显差异。B培养液中活菌数1.045×10CFU/mL，培养液E和F中活菌
3
数均低于3×10CFU/mL，培养液A，C，D和G活菌数显著低于B培养液。可见，培养液B较为理想，因此，马铃薯200.0g、蛋白胨10.0g、蔗糖20.0g、水1000mL为莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的基础培养基。
[0017] 在确定PDA培养基为最适合莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)生长的培养基的基础上，进一步利用正交法对PDA培养基中碳氮源含量和pH值进行优化。
[0018] 1、碳源的优化：
[0019] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)以5％的接种量，以玉米粉、马铃薯、玉米淀粉、白砂糖和不加碳源为处理，以150r/min的转速，在28℃的温度条件下发酵24h后，测定发酵液中的活菌数。
[0020] 经综合测定，用4种不同的碳源培养，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis9
QLY002(CGMCC No.8905)活菌量有明显差异，而以玉米粉处理中的活菌量为5.5×10 CFU/mL显著高于其他碳源。因此，玉米粉为筛选出的较优碳源。
QLY002(CGMCC No.8905)活菌量有明显差异，而以玉米粉处理中的活菌量为5.5×10 CFU/mL显著高于其他碳源。因此，玉米粉为筛选出的较优碳源。
[0021] 2、氮源的优化：
[0022] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)以5％的接种量，以硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、黄豆粉和不加氮源为处理，以150r/min的转速，在28℃的温度条件下发酵24h后，测定发酵液中的活菌数。
[0023] 经综合测定，用4种不同的氮源培养，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis10
QLY002(CGMCC No.8905)活菌量有明显差异，当氮源为氯化铵时活菌数为1.41×10 CFU/mL，显著高于其他氮源所对应的活菌数，因此，选取氯化铵作为最优培养基的氮源。
QLY002(CGMCC No.8905)活菌量有明显差异，当氮源为氯化铵时活菌数为1.41×10 CFU/mL，显著高于其他氮源所对应的活菌数，因此，选取氯化铵作为最优培养基的氮源。
[0024] 3、pH值的优化：
[0025] 通过培养基及碳氮源筛选，确定基础培养液的主要成分为氯化铵、玉米粉和马铃薯，培养液的pH为7，对各因子取不同水平的值(参见表1)。根据响应曲面法(Box-Behnken)设计，试验设计与结果见表2，利用Design-Expert 7.0软件进行二次多项回归拟合，得出菌株QLY002(CGMCC No.8905)的活菌数对氯化铵、玉米粉、马铃薯及pH的动态响应模型：
[0026] Y＝
[0027] 2.503×1010+5.939×109X1+5.569×109X2+6.165×107X3+3.905×108X4-1.151×19 9 8 9 9 9 2
0X1X2+2.918×10X1X3+6.576×10X1X4-7.193×10X2X4+2.507×10X3X4-7.751×10X1-4.6-
9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2
69×10X2-1.689×10X3-2.059×10X4-6.144×10X1X2+3.103×10X1X3+2.774×10X1X2
9 2
+1.541×10X2X4
0X1X2+2.918×10X1X3+6.576×10X1X4-7.193×10X2X4+2.507×10X3X4-7.751×10X1-4.6-
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69×10X2-1.689×10X3-2.059×10X4-6.144×10X1X2+3.103×10X1X3+2.774×10X1X2
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[0028] R2＝0.9714，矫正决定系数Adj-R2＝0.9273，式中Y为莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905活菌数的预测值。由矫正决定系数可以认为回归模型拟合程度较好；氯化铵、玉米粉、马铃薯及pH对活菌数的影响显著，该模型(P>F)P<0.0001，表明回归方程的拟合度极显著，矢拟项(P>F)P＝0.196，表明该模型在实际拟合中所占的非正常误差较小；因此，可通过回归模型预测菌株莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的最佳培养条件。该模型预测当氯化铵、玉米粉和马铃薯的添加量分别为14.25g/L、19g/L、230g/L；培养液pH为7.7时，莫哈韦10
芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的活菌数有最大值3.27×10 CFU/mL；经在该培养条件下验
10
证，莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的活菌数可达3.48×10 CFU/mL，与预测值差异不显著。说明莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的最佳培养液配方为氯化铵14.25g/L、玉米粉19g/L、马铃薯230g/L，pH7.7。
芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的活菌数有最大值3.27×10 CFU/mL；经在该培养条件下验
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证，莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的活菌数可达3.48×10 CFU/mL，与预测值差异不显著。说明莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌株的最佳培养液配方为氯化铵14.25g/L、玉米粉19g/L、马铃薯230g/L，pH7.7。
[0029] 表1：响应曲面设计试验各因子取值范围
[0030]
[0031] 表2：响应曲面设计和试验结果
[0032]
[0033] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在上述优化后的培养基(氯化铵10-18.5g/L，玉米粉14-24g/L，马铃薯180-280g/L；pH值为7.2-8.2，溶剂为蒸馏水/去离子水)中发酵，发酵液中活菌数可以达到3.03×109CFU/mL～1.59×1011CFU/mL。另外，将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在包含氯化铵14.25g/L、玉米粉19g/L、马铃薯230g/L，pH7.7，蒸馏水/去离子水
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1000mL的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到1.59×10 CFU/mL。
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1000mL的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到1.59×10 CFU/mL。
[0034] 本发明的第三个目的是提供上述微生物菌剂的制备方法，步骤如下：将莫哈韦芽孢杆菌菌株CGMCC No.8905接种至培养基中，在温度为26-30℃、转速为150-210r/min和溶氧量为50％-70％的条件下，进行液体发酵32-40h，制得发酵液，即得到微生物菌剂。
[0035] 优选地，是在接种量为8％、温度为28℃、转速为180r/min和溶氧量为60％的条件下，进行液体发酵36h，制得发酵液，得到微生物菌剂。
[0036] 在上述已确定的莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)最适培养基的基础上，将保存在斜面培养基中的莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)，在营养琼脂(Nutrient Agar，简称NA)培养基的平皿上培养活化24h后，接种于营养肉汤(Nutrient Broth，简称NB)培养基中；培养24h之后，以5％的接种量接入种子发酵罐中培养24h；之后，转接种于10L的发酵罐中进行发酵，以发酵液中活菌数为指标，分别对溶氧量、转速、pH值和接种量进行优化，最终莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在10L发酵罐中的最适发酵条件为：温度26-30℃，接种量5％-11％，pH7.2-8.2，溶氧量50％-70％，转速150-210r/min，培养时间为32-40h，活
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菌数为4.12×10 CFU/mL-1.59×10 CFU/mL。
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菌数为4.12×10 CFU/mL-1.59×10 CFU/mL。
[0037] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在上述发酵条件的发酵罐中发酵，即可制得到具有良好促生能力和抑菌能力的微生物菌剂。其中，在温度为28℃，接种量为8％，pH值为7.7，溶氧量60％，转速为180r/min和培养时间为36h的发11
酵条件下，发酵液中活菌数可以达到1.59×10 CFU/mL，此时的促生能力和抑菌能力达到最佳。
酵条件下，发酵液中活菌数可以达到1.59×10 CFU/mL，此时的促生能力和抑菌能力达到最佳。
[0038] 下面对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂的质量检测方法进行验证。
[0039] 平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度，比浊法用于测定平板菌落中活菌体的个数。这里，分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度和个数，测定结果基本一致，即平板菌落上活菌体的密度越大、个数越多，紫外分光光度计测定OD600nm处的吸收值越高。
[0040] 可见，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测，也可以采用比浊法检测。
[0041] 本发明的第四个目的是提供上述菌株和微生物菌剂在在制备马铃薯专用微生物农药中的应用。
[0042] 其中，所述马铃薯病原菌为马铃薯坏疽病菌、马铃薯早疫病原菌、马铃薯干腐病菌和马铃薯炭疽病菌。抑菌率分别为：对马铃薯坏疽病菌(Phoma foveata)的抑菌率为71.83％；对马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes)抑菌率为74.92％；对马铃薯干腐病菌(Fusarium oxysporum)具有抑制作用，抑菌率为61.42％；对马铃薯早疫病原菌(Alternaria solani)具有抑制作用，抑菌率为64.30％。
[0043] 本发明的第五个目的是提供上述菌株和微生物菌剂在制备马铃薯专用微生物肥料和在马铃薯促生作用中的应用。
[0044] 本发明的第六个目的是提供一种微生物农药，其含有上述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或上述的微生物菌剂。
[0045] 本发明的第七个目的是提供一种微生物肥料，其含有上述的莫哈韦芽孢杆菌菌株或上述的微生物菌剂。
[0046] 综上所述，本发明提供一种莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)菌株、微生物菌剂、制备方法及应用，即将具有生物活性的莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)按照接种量为5-11％，接种于最适培养基中进行液体发酵，得到的发酵液可以直接作为莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂使用，该莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂具有抑菌作用和促生作用，能够作为微生物农药和肥料使用，能够抑制马铃薯坏疽病菌(Phoma foveata)、马铃薯早疫病原菌(Alternaria solani)、马铃薯干腐病菌(Fusarium oxysporum)和马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes)，其抑菌率在61％以上；对马铃薯有促生作用，可以作为微生物农药和微生物肥料使用，从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。附图说明
[0048] 图1为应用不同培养液培养对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)活菌数的影响；字母表示水平差异显著，小写：P<0.05；大写：P<0.01；
[0049] 图2为内生细菌莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis(CGMCC No.8905)的光学显微镜照片；其中A为菌体形态；B为菌落形态。
具体实施方式
[0050] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0051] 实施例1 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的获得和鉴定
[0052] 一、莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的获得[0053] 本发明从高寒草地珠芽蓼(Polygonum viviparum)、紫花针茅(Stipa purpurca Griseb)，线叶嵩(Kobreasia Capillifolia)，秦艽(Gentiana macrophy pall)和乳白香青(Anaphalis Lactea Maxin)等的内生细菌中，利用对峙培养法即培养皿中央接入病原菌，四周2.5厘米处等距离接种内生细菌，培养5-7天后十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，以抑菌率为依据筛选获得一株对马铃薯病原菌具有抑菌和对马铃薯具促生作用的内生细菌：莫哈韦芽孢杆菌菌株，该菌株的拉丁文名称为Bacillus mojavensis QLY002，本申请人将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.8905，保藏时间为2014年03月10日。
[0054] 二、莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的鉴定。
[0055] (1)对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的形态鉴定。
[0056] 将Bacillus mojavensis QLY002接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，28℃培养3d的培养性状为：菌落大小为4-6 mm，中间有山脊状隆起，边缘整齐，不透明，米黄色；Bacillus mojavensis QLY002呈革兰氏阳性，芽孢中生到次端生，菌体大小为0.45～
0.75μm×1.55～3.20μm。
0.75μm×1.55～3.20μm。
[0057] (2)对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的16S rDNA基因序列鉴定。
[0058] 将Bacillus mojavensis QLY002的16S rDNA基因序列在Genebank中与Bacillus amylolique-faciens(KC250199.1)，Bacillus subtilis(JN584217.1)比对，与Bacillus methylotrophicus(JN661700.1)和Bacillus mojavensis(JX126863.1)等多株芽孢杆菌属的种同源性在99％以上；将Bacillus mojavensis QLY002鉴定为芽孢杆菌属的菌株。
[0059] (3)对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的gyrB基因序列鉴定。
[0060] Bacillus mojavensis QLY002的gyrB基因序列在Genebank中与Bacillus mojavensis(DQ309297.1)等菌株的同源性在99％以上，用Mega(4.0)软件邻接法构建系统发育树，Bacillus mojavensis QLY002与B.mojavensis一致性最高，再结合培养性状、形态特征和16S rDNA基因序列比较结果，鉴定为芽孢杆菌属中的莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis。
[0061] 实施例2 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂的制备
[0062] 本发明的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.89055％和培养基余量。
[0063] 培养基的组份和含量包括：氯化铵10g,玉米粉14g,马铃薯180g，pH值7.2，蒸馏水/去离子水1000mL。
[0064] 微生物菌剂的制备方法为：将莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905按比例接种于培养基中，在温度为26℃、转速为150r/min和溶氧量50％的条件下，进行液体发酵32h，得到的发酵液即为微生物菌剂。
[0065] 经测定，上述发酵液中莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的活菌数可以达到10
4.12×10 CFU/mL。
4.12×10 CFU/mL。
[0066] 实施例3 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂的制备
[0067] 本发明的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.89058％和培养基余量。
[0068] 培养基的组份和含量包括：氯化铵14.25g,玉米粉19g,马铃薯230g，pH值7.7，蒸馏水/去离子水1000mL。
[0069] 微生物菌剂的制备方法为：将莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905按比例接种于培养基中，在温度为28℃、转速为180r/min和溶氧量60％的条件下，进行液体发酵36h，得到的发酵液即为微生物菌剂。
[0070] 经测定，上述发酵液中莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的活菌数可以达到11
1.59×10 CFU/mL。
1.59×10 CFU/mL。
[0071] 实施例4 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)微生物菌剂的制备
[0072] 本发明的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.890511％和培养基余量。
[0073] 培养基的组份和含量包括：氯化铵18.5g,玉米粉24g,马铃薯280g，pH值8.2，蒸馏水/去离子水1000mL。
[0074] 微生物菌剂的制备方法为：将莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905按比例接种于培养基中，在温度为30℃、转速为210r/min和溶氧量70％的条件下，进行液体发酵40h，得到的发酵液即为微生物菌剂。
[0075] 经测定，上述发酵液中莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905的活菌数可以达到11
1.51×10 CFU/mL。
1.51×10 CFU/mL。
[0076] 实施例5 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)的室内抑菌活性和田间防治效果
[0077] 试验一：莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)室内抑菌活性测定。
[0078] 首次筛选出莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于实施例3所述的培养基中进行培养；同时，将指示菌株(马铃薯坏疽病菌(Phoma foveata)、马铃薯早疫病原菌(Alternaria solani)、马铃薯干腐病菌(Fusarium oxysporum)和马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes))接种于马铃薯葡萄糖琼脂(即PDA)培养基中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径为6mm的菌饼。选取指示菌株的菌饼一块，置于PDA培养基中；具体的，可以将该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置(平皿直径9cm)；再选取由拮抗菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为
2.5cm的圆周上。将该培养皿在28℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。
2.5cm的圆周上。将该培养皿在28℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。
[0079] 莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表3。
[0080] 表3：莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905对部分病原菌抑菌能力的测定结果[0081]
[0082] 由表3可知，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)对表1中4种常见马铃薯病菌的抑制率至少可以达到61.42％，开发前景较好。
[0083] 试验二：莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)菌剂对马铃薯贮藏期坏疽病的防治效果测定。
[0084] 在甘肃省定西市马铃薯入库贮藏时选择来自于重病田的200个均匀一致的薯块，将实施例4制备的莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌剂配制成1：10倍液喷于薯块表面，分别用10％氟硅唑5000倍液和50％醚菌酯3000倍液作药剂对照，以清水为空白对照，于2011年11月15日喷药，2012年3月23日调查发病率，并计算防效。结果表明，清水对照马铃薯坏疽病的发病率为38.60％，莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌剂处理后发病率为
13.77％，其防效为64.31％，比5000倍液10％氟硅唑的防效低22.62个百分点，但比3000倍液50％醚菌酯高11.83个百分点(表4)，说明本发明的莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌剂在贮藏库中对马铃薯坏疽病(P.foveata)具有良好防治效果。
13.77％，其防效为64.31％，比5000倍液10％氟硅唑的防效低22.62个百分点，但比3000倍液50％醚菌酯高11.83个百分点(表4)，说明本发明的莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌剂在贮藏库中对马铃薯坏疽病(P.foveata)具有良好防治效果。
[0085] 表4：莫哈韦芽孢杆菌CGMCC No.8905菌剂对马铃薯坏疽病的防效
[0086]
[0087] 注：数值后小写字母表示在0.05水平差异显著，“±”表示平均误差。
[0088] 实施例6对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)产生吲哚乙酸能力及其微生物菌剂的促生性能的检测。
[0089] 试验一：对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)产生吲哚乙酸(IAA)能力的测定。
[0090] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)接种于含有100mg/L色氨酸(或者不含色氨酸)的金氏(King)培养液培养12天后对菌悬浮液和空白对照离心10min，转速为10000r/min，取上清液4mL分别加入等量比色液，黑暗中静置30min后立即用分光光度计测定OD530值，莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)在含有色氨酸(100mg/L)和不含色氨酸的金氏培养基中分泌IAA的量分别为
12.17mg/L和9.75mg/L。
12.17mg/L和9.75mg/L。
[0091] 试验二：对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)室内促生能力测定。
[0092] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)菌株接种于本发明实施例3所述的培养液中，置28℃下培养36h后，用无菌水稀释成浓度比1：10、1:20和1：30的菌液分别拌种马铃薯种子，以相同时间用清水拌种为对照，种植于花盆中，并按土壤质量与菌剂体积比为35:1进行灌根。温室下管理55天后，测定马铃薯根茎的长度、干湿重及茎直径，并计算干湿重根冠比。结果表明，对马铃薯进行拌种后盆栽，根、茎及叶绿素含量等均比对照高，其中经10倍液处理后，根长与干、湿重分别增加8cm、0.75g和5.07g，株高、茎粗及茎干、湿重分别增加2.74cm、0.27cm、0.52g和5.73g，干湿根冠比分别增加0.214和0.094(表5)，叶绿素含量增加0.54mg/g(表6)。该结果可以看出莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)对马铃薯的促生作用明显。
[0093] 表5：莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)处理马铃薯后其生物量测定
[0094]
[0095] 注：数值后“±”表示平均误差。
[0096] 表6：莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)处理马铃薯后其叶片叶绿素含量测定
[0097]
[0098] 注：字母表示水平差异显著，小写：P<0.05；大写：P<0.01
[0099] 试验三：对莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)大田促生能力测定。
[0100] 将莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)菌株接种于本发明实施例3所述的培养液中，置28℃下培养36h后，用无菌水稀释成浓度比1:20的菌液分别拌种马铃薯种子，以相同时间用清水浸种为对照，6个小区，每小区20m2，3次重复，收获时测产和计算增产率。结果表明，1:20的菌悬液处理后，马铃薯商品薯率提高36.29％。该结果可以看出莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis QLY002(CGMCC No.8905)对马铃薯的促生作用明显。
[0101] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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