发明背景

多年以来，人们只清楚红细胞生成素的生理作用是控制红细胞 的产生。近年来，一些证据表明，红细胞生成素作为细胞因子超家 族成员，具有通过与红细胞生成素受体(红细胞生成素-R)相互作用介 导的其它重要生理功能。这些作用包括有丝分裂发生、钙流入平滑 肌细胞和神经细胞的调节、红细胞的产生、超活化血小板、凝血细 胞的产生和对中间代谢的影响。据信，红细胞生成素提供用于改善 含氧量低的细胞微环境以及调节由代谢应激引起的程序性细胞死亡 的补偿反应。虽然研究已确定，颅内注射红细胞生成素能保护神经 元免遭含氧量低的神经元伤害，但是，颅内给药对于治疗应用、尤 其是对正常个体来说是不切实际的，也是不可接受的给药途径。此 外，以前对贫血患者给予红细胞生成素的研究已有结论，即外周给 予红细胞生成素不会输送到脑部(Marti等，1997，Kidney Int.51：416-8； Juul等，1999，Pediatr.Res.46：543-547；Buemi等，2000，Nephrol.Dial. Transplant.15：422-433)。

已经描述了具有针对改进所述分子红细胞生成活性的活性的红 细胞生成素的各种修饰形式，例如在其羧基端具有改变的氨基酸的 修饰形式，描述于美国专利5,457,089和美国专利4,835,260；每个分 子中具有不同数目的唾液酸残基的红细胞生成素同种型，例如描述 于美国专利5,856,298；多肽，描述于美国专利4,703,008；激动剂， 描述于美国专利5,767,078；与红细胞生成素受体结合的肽，描述于 美国专利5,773,569和5,830,851；和小分子模拟物，描述于美国专利 5,835,382。

本发明涉及由红细胞生成素化学修饰所产生的组织保护性细胞 因子及其它们在原位和离体保护、维持、增强或恢复红细胞生成素- 效应细胞和相关细胞、组织和器官中的用途，以及为了保护和增强 离开血管系统的红细胞生成素-效应细胞和相关细胞、组织和器官的 目的而递送组织保护性细胞因子穿越内皮细胞屏障或者携带相关分 子穿越内皮细胞屏障的用途。

                     发明概述

在一个方面，本发明涉及组织保护性细胞因子即缺乏红细胞生 成素对骨髓的一方面或多方面影响的化学修饰红细胞生成素的如下 用途：用于保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞及其相关细 胞、组织和器官的功能或活力的药用组合物的制备。在一个具体的 方面，所述哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织或器官因为紧密 的内皮细胞屏障而离开血管系统。在另一个具体的方面，所述细胞、 组织、器官或其它机体部分是从哺乳动物体内分离的，例如预期用 于移植或再附着的部分。作为非限制性实例，所述效应细胞或组织 可以是神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细 胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细 血管内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、骨细胞、皮肤细 胞或子宫内膜细胞或组织。此外，效应细胞的非限制性实例包括感 光细胞(杆细胞和锥细胞)、神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长 突细胞、米勒(Müeller)细胞、心肌细胞、起搏细胞、窦房结细胞、窦 房结细胞、窦结细胞、结合组织细胞、房室结细胞、房室束细胞、 肝细胞、星形细胞、肝巨噬细胞、系膜细胞、肾上皮细胞、管状肠 细胞、杯状细胞、肠腺细胞(crypt)、肠细胞、内分泌细胞、肾小球细 胞、束状细胞(fasciculate)、网状细胞、嗜铬细胞、外膜细胞、间质细 胞、滋养细胞、精细胞、成熟滤泡细胞(Graffian follicles)、原始滤泡 细胞、胰岛、α-细胞、β-细胞、γ-细胞、F-细胞、骨原细胞、破骨细 胞、成骨细胞、子宫内膜基质细胞、子宫内膜细胞、干细胞和内皮 细胞。效应细胞的这些实例仅仅是说明性的。在一个方面，所述效 应细胞或其相关细胞、组织或器官既不是可兴奋细胞、组织或器官， 占优势的也不包含可兴奋细胞或组织。在一个具体的实施方案中， 使用了上述组织保护性细胞因子的哺乳动物细胞、组织或器官是在 至少一种不利于所述细胞、组织或器官的活力的条件下已经度过或 即将度过一段时间的细胞。所述条件包括创伤性原位低氧或代谢功 能障碍、手术诱导的原位低氧或代谢功能障碍或原位毒素暴露；后 者可能与化疗或放疗有关。在一个实施方案中，所述不利条件是例 如用于某些外科手术的心肺分流术(心肺机)的结果。

本文的组织保护性细胞因子可用于以下人类疾病的治疗性治疗 和预防性治疗：主要具有神经病学症状或精神病学症状的CNS疾病 或周围神经系统疾病、以及眼病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道 疾病、肾病、尿道疾病和生殖道疾病、胃肠道疾病和内分泌异常和 代谢异常和炎症。

本发明也涉及包含给予哺乳动物、最好是人类的特定的组织保 护性细胞因子的药用组合物。所述药用组合物可配制成供口服、鼻 内或胃肠外给药用，或者以用于维持离体细胞、组织或器官活力的 灌注液形式。

用于前述目的的组织保护性细胞因子和药用组合物包括与天然 红细胞生成素、最好与天然人红细胞生成素相比至少被一个修饰所 改变的红细胞生成素。所述至少一个修饰可以是红细胞生成素分子 上至少一个氨基酸的改变，或者是红细胞生成素分子上至少一个糖 的改变。当然，用于本文的目的的组织保护性细胞因子分子与天然 分子相比，可以有多个修饰，例如所述分子氨基酸部分的多个修饰、 所述分子糖部分的多个修饰、或所述分子氨基酸部分的至少一个修 饰、所述分子糖部分的至少一个修饰。组织保护性细胞因子分子虽 然保留其保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞的功能或活力 的能力，但是，与天然红细胞生成素相比，所述红细胞生成素与前 述所需特性无关的一个或多个特性可以丧失。在一个优选的实施方 案中，组织保护性细胞因子缺乏红细胞生成素对骨髓的作用，即增 加血细胞比容(红细胞发生)、血管收缩(高血压)、增加血压、超活化 血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。更优选组织保护性细 胞因子缺乏红细胞发生作用；最优选组织保护性细胞因子缺乏红细 胞生成素对骨髓的所有作用。

作为实例，本发明的组织保护性细胞因子可以是脱唾液酸红细 胞生成素。在另一个实例中，本发明的组织保护性细胞因子可以是 红细胞生成素或脱唾液酸红细胞生成素，所述红细胞生成素或脱唾 液酸红细胞生成素已与一种或多种修饰天然红细胞生成素或脱唾液 酸红细胞生成素的一个或多个氨基酸的氨基的试剂反应。在一个优 选的实施方案中，组织保护性细胞因子是非红细胞生成的。

在一个实施方案中，所述组织保护性细胞因子是没有唾液酸部 分的红细胞生成素。在一个优选的实施方案中，所述组织保护性细 胞因子是脱唾液酸红细胞生成素，最优选人脱唾液酸红细胞生成素。 在另一个实施方案中，所述组织保护性细胞因子具有1个、2个、3 个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12或13个 唾液酸部分。这样的部分脱唾液酸的红细胞生成素在本文中称为低 唾液酸红细胞生成素(hyposialoerythropoietin)。它们可以通过天然红 细胞生成素的化学修饰或酶促修饰来制备，或者可以通过在红细胞 生成素不完全唾液酸化或只部分唾液酸化的系统中表达而得到。无 论采用什么方法制备的脱唾液酸红细胞生成素和低唾液酸红细胞生 成素，都包括在本发明中。

在另一个优选的实施方案中，所述组织保护性细胞因子包含红 细胞生成素分子的至少一个或多个修饰赖氨酸残基或N端氨基的修 饰，所述修饰是由赖氨酸的ε氨基或N端氨基与一种或多种氨基修饰 试剂反应而来。还可以用化学方法还原修饰的赖氨酸残基或修饰的 N端氨基。在一个优选的实施方案中，红细胞生成素在一个或多个 赖氨酸基团或在N端上被生物素化、氨甲酰化、琥珀酰化或乙酰化。 在另一个优选的实施方案中，赖氨酸与醛或还原糖反应，形成亚胺， 随后任选通过化学还原(例如通过采用氰基硼氢钠)形成N-烷基化赖 氨酸残基例如葡萄糖醇基赖氨酸而稳定，或者在还原糖的情况下可 以通过Amadori或Heyns重排形成α-脱氧-α-氨基糖(例如α-脱氧-α-果 糖基赖氨酸)而稳定。在另一个优选的实施方案中，赖氨酸或N端氨 基例如通过与氰酸根离子反应而被氨甲酰化，通过分别与烷基-异氰 酸盐、芳基-异氰酸盐或芳基异硫氰酸盐反应而被烷基-氨甲酰化、芳 基-氨甲酰化或芳基-硫代氨甲酰化，或者可以例如通过与乙酸酐、琥 珀酸酐或邻苯二甲酸酐反应被活性烷基羧酸或芳基羧酸衍生物所酰 化。至少一个赖氨酸基团或N端氨基也可以通过与三硝基苯磺酸、 或者最好与其盐反应而被三硝基苯基修饰。在另一个实施方案中， 赖氨酸残基可以通过与乙二醛反应(例如与乙二醛、甲基乙二醛或3- 脱氧葡糖醛酮反应)形成相应的α-羧基烷基衍生物而被修饰。

在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子可以通过使用亲电 子试剂、通过修饰红细胞生成素的至少一个酪氨酸残基而产生，所 述修饰例如但不限于被硝化或碘化所修饰，以修饰一个芳环位置。

如上所述，用于本文目的的组织保护剂可具有至少一个上述修 饰，但也可以具有一个以上的上述修饰。作为在其分子的氨基酸部 分具有一个修饰并且任选在其分子的糖部分具有修饰的组织保护性 细胞因子的实例，组织保护性细胞因子是氨甲酰红细胞生成素、氨 甲酰脱唾液酸红细胞生成素、氨甲酰低唾液酸红细胞生成素、乙酰 红细胞生成素、乙酰脱唾液酸红细胞生成素、乙酰次脱唾液酸红细 胞生成素、琥珀酰红细胞生成素、琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素、 琥珀酰低唾液酸红细胞生成素、生物素红细胞生成素、生物素脱唾 液酸红细胞生成素、生物素低唾液酸红细胞生成素、碘红细胞生成 素、碘脱唾液酸红细胞生成素、碘低唾液酸红细胞生成素、N-ε-羧甲 基红细胞生成素、N-ε-羧甲基红细胞生成素、N-ε-羧甲基低唾液酸红 细胞生成素和葡萄糖醇基红细胞生成素、葡萄糖醇基脱唾液酸红细 胞生成素、葡萄糖醇基脱唾液酸次红细胞生成素。这些化合物仅仅 是本发明的修饰红细胞生成素的实例。上述俗名仅仅是天然红细胞 生成素分子修饰的代表，而且如上文所述，氨基的修饰可以是在一 个或多个赖氨酸残基的ε氨基上或N端氨基上的修饰，或者，在硝基 修饰的或碘代修饰的红细胞生成素的情况下是在一个或多个酪氨酸 残基上的修饰。上述任何组合都包括在本文中。本发明也包括组合 物，所述组合物包括药用组合物，所述药用组合物包含一种或多种 上述的组织保护性细胞因子。所述组合物的任一种也包括天然红细 胞生成素。

在本发明的另一方面，提供用于保护、维持、增强或恢复哺乳 动物效应细胞及其相关细胞、组织和器官的功能或活力的方法，即 给予有效量的一种或多种上述组织保护性细胞因子。在该方法的一 个具体的方面，哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织或器官因为 紧密的内皮细胞屏障而离开血管系统。在另一个具体的方面，细胞、 组织、器官或其它机体部分是从哺乳动物体内分离的，例如预期用 于移植或再附着的部分。作为非限制性实例，效应细胞或组织可以 是神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、骨细胞或 子宫内膜细胞或组织。效应细胞的这些实例仅仅是说明性的。在一 个具体的实施方案中，所述效应细胞或其相关细胞、组织或器官既 不是可兴奋细胞、组织或器官，占优势的也不包含可兴奋细胞或组 织。在另一个具体的实施方案中，给予上述组织保护性细胞因子的 哺乳动物细胞、组织或器官在至少一种不利于所述细胞、组织或器 官的活力的条件下已经度过或即将度过一段时间。所述条件可包括 创伤性原位低氧或代谢功能障碍、手术诱导的原位低氧或代谢功能 障碍或原位毒素暴露；后者可能与化疗或放疗有关。在一个实施方 案中，本发明防止由心肺分流术产生的不利条件。

在本发明的另一个方面，任何上述组织保护性细胞因子都可为 了保护、维持、增强或恢复哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织 和器官的功能或活力的目的，而用于细胞、组织和器官的离体处理 的药用组合物的制备。所述离体处理可用于例如供移植用的细胞、 组织或器官的保存，不管是自体移植还是异体移植。所述细胞、组 织或器官可以浸在包含组织保护性细胞因子的溶液中，或者所述灌 注液可以通过血管系统或其它方式滴注到所述器官中，在所述细胞、 组织或器官不与供体或受体的血管系统整合期间维持细胞功能。可 以在器官收获之前，将灌注液给予供体，以及给予收获的器官和受 体。此外，当细胞、组织或器官与个体血管系统分离并因此必须离 体存在一段时间时，可以使用任何组织保护性细胞因子的上述用途， 术语分离是指限制或钳制细胞、组织、器官或机体部分的血管系统， 或通向细胞、组织、器官或机体部分的血管系统，例如可以在手术 中、尤其是在心肺分流手术中进行；分流细胞、组织、器官或机体 部分的血管系统；从哺乳动物体内取出细胞、组织、器官或机体部 分，这些可以在异体移植之前或者在自体移植之前或期间进行；或 者在细胞、组织、器官或机体部分的创伤性切断术中进行。因此， 本发明的该方面涉及用组织保护性细胞因子进行原位和离体灌注。 可以在细胞、组织或器官保存液中离体提供红细胞生成素。对于任 一方面来说，暴露可以通过连续灌注、脉冲灌注、输注、浸泡、注 射或插管等方式进行。

在又一方面，本发明涉及用于保护、维持、增强或恢复哺乳动 物细胞、组织、器官或机体部分(包含效应细胞或组织)的活力的方法， 其中所述细胞、组织、器官或机体部分是从哺乳动物体内分离的。 所述方法包括在一段时间内至少将分离的哺乳动物细胞、组织、器 官或机体部分暴露给一定量的上述组织保护性细胞因子，以达到有 效地保护、维持、增强或恢复上述活力。在非限制性实例中，分离 是指限制或钳制细胞、组织、器官或机体部分的血管系统，或通向 细胞、组织、器官或机体部分的血管系统，例如可以在手术中、尤 其是在心肺分流手术中进行；分流细胞、组织、器官或机体部分的 血管系统；从哺乳动物体内取出细胞、组织、器官或机体部分，这 些可以在异体移植之前或在自体移植之前或期间进行；或者在细胞、 组织、器官或机体部分的创伤性切断术中进行。因此，本发明的该 方面涉及用组织保护性细胞因子进行原位和离体灌注。可以在细胞、 组织或器官保存液中离体提供所述组织保护性细胞因子。对于任一 方面来说，暴露可以通过连续灌注、脉冲灌注、输注、浸泡、注射 或插管等方式进行。

作为非限制性实例，上述离体效应细胞或组织可以是或者可以 包括神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、 肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管 内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、骨细胞、 骨髓细胞、脐带血细胞或子宫内膜细胞或组织。效应细胞的这些实 例仅仅是说明性的。

所有上述方法和用途最好是用于人类，但也可用于任何哺乳动 物，例如但不限于陪伴动物、驯养动物、家畜和动物园动物。上述 药用组合物的给药途径包括口服、静脉内、鼻内、局部、管腔内、 吸入或胃肠外给药，后者包括静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜 内、粘膜下或皮内。对于离体应用来说，最好是灌注液或浸泡液。 这包括原位灌注血管结构的分离部分。

在本发明的再一个方面，任何上述组织保护性细胞因子用于制 备供恢复有功能障碍的细胞、组织或器官功能用的药用组合物，在 引起功能障碍的疾病或病症发作后给药。作为非限制性实例，在先 前具有脑创伤的动物中，给予包含组织保护性细胞因子的药用组合 物能恢复认知功能，甚至当所述创伤已经消退以后很久(例如3天、5 天、1周、1月或更长时间)给药时。

在再一个实施方案中，本发明提供上述组织保护性细胞因子的 使用方法，所述方法当在引起所述功能障碍的疾病或病症发作之后 给药时，供恢复有功能障碍的细胞、组织或器官功能用。作为非限 制性实例，在先前具有脑创伤的动物中，包含组织保护性细胞因子 的药用组合物的给药方法能恢复认知功能，甚至当所述创伤已经消 退以后很久(例如3天、5天、1周、1月或更长时间)给药时。用于所 述方法的组织保护性细胞因子包括任何具体的上述修饰的红细胞生 成素。

在本发明的又一方面，提供用于促进哺乳动物体内的分子穿越 内皮细胞屏障的胞转作用的方法，即通过给予与上述组织保护性细 胞因子缔合的分子的组合物。待转运分子和所述组织保护性细胞因 子间的缔合可以是例如不稳定的共价键、稳定的共价键或与所述分 子结合位点的非共价缔合。内皮细胞屏障可以是血-脑屏障、血-眼屏 障、血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通过本发明方法转运的 合适分子包括激素例如生长激素、神经生长因子(NGF)、脑衍生神经 营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)、 转化生长因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3和白介素 6、AZT、抗肿瘤坏死因子的抗体、抗病毒药和环孢菌素等免疫抑制 药。此外，染料或标记可以连接到红细胞生成素上或本发明的组织 保护性细胞因子上，以便为了诊断目的在脑和其它屏障器官内显现 细胞、组织或器官。

本发明的另一方面提供一种用于促进哺乳动物体内的分子穿越 内皮细胞屏障的胞转作用的组合物，所述组合物包含与上述组织保 护性细胞因子缔合的分子。所述缔合可以是例如不稳定的共价键、 稳定的共价键或与所述分子结合位点的非共价缔合。内皮细胞屏障 可以是血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。 通过本发明方法转运的合适分子包括激素例如生长激素、神经生长 因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子 (CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGFβ 1)、转化生长因子β2(TGFβ2)、转化生长因子β3(TGFβ3)、白介素1、 白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗肿瘤坏死因子的抗体、抗 病毒药和环孢菌素等免疫抑制药。此外，染料或标记可以连接到红 细胞生成素上或本发明的组织保护性细胞因子上，以便为了诊断目 的在脑和其它屏障器官内显现细胞、组织或器官。

在本发明的再一方面，任何上述组织保护性细胞因子可用于制 备促进哺乳动物体内的分子穿越内皮细胞屏障的胞转作用的药用组 合物。所述缔合可以是例如不稳定的共价键、稳定的共价键或与所 述分子结合位点的非共价缔合。内皮细胞屏障可以是血-脑屏障、血- 眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-胎屏障。通过本发明方法转 运的合适分子包括激素例如生长激素、抗生素、抗病毒药、染料、 标记物和抗癌药，作为少数非限制性实例。

在一个实施方案中，本发明的药用组合物包含治疗有效量的组 织保护性细胞因子、至少一种抗炎药和药学上可接受的载体。在一 个相关的实施方案中，所述抗炎药选自皮质类固醇、糖皮质激素、 类固醇、非甾体抗炎药、β-激动剂、抗胆碱能药、甲基黄嘌呤、金注 射剂、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成药、氨苯砜、补骨脂素、 抗疟药、抗病毒药和抗生素。

在一个实施方案中，本发明提供包含治疗有效量的组织保护性 细胞因子、至少一种抗炎药和/或至少一种免疫调节剂和药学上可接 受的载体的本发明药用组合物，条件是所述抗炎药或免疫调节剂不 是αMSH或抗TNF。在一个相关的实施方案中，所述抗炎药或免疫 调节剂不是抗体。

在一个实施方案中，本发明提供基本由治疗有效量的组织保护 性细胞因子组成并且包含至少一种抗炎药和/或至少一种免疫调节剂 和药学上可接受的载体的本发明药用组合物。

本发明提供包含治疗有效量的组织保护性细胞因子、至少一种 免疫调节剂和药学上可接受的载体的药用组合物。在一个相关的实 施方案中，所述抗炎药选自甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷 酰胺制剂、Immuran、环孢菌素A、二甲胺四环素、硫唑嘌呤、抗生 素、甲泼尼龙、皮质类固醇、类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素、 咪唑立宾、脱氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(malononitriloaminde)、 T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。

本发明也提供一种上述的药用组合物，其中所述组织保护性细 胞因子选自i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)缺乏N联糖或缺 乏O联糖的红细胞生成素；iii)通过用至少一种糖苷酶处理天然红细 胞生成素而具有降低糖含量的红细胞生成素；iv)具有至少一个或多 个氧化糖的红细胞生成素；v)包含至少一个或多个经化学还原的氧化 糖的红细胞生成素；vi)包含至少一个或多个修饰精氨酸残基的红细 胞生成素；vii)包含至少一个或多个修饰赖氨酸残基或该红细胞生成 素分子的一个N端氨基修饰的红细胞生成素；viii)包含至少一个修饰 酪氨酸残基的红细胞生成素；ix)包含至少一个修饰天冬氨酸或一个 谷氨酸残基的红细胞生成素；x)包含至少一个修饰色氨酸残基的红细 胞生成素；xi)至少去除一个氨基的红细胞生成素；xii)在红细胞生成 素分子内包含至少一个胱氨酸键的至少一个口的红细胞生成素；和xiii) 截短的红细胞生成素。

在一个实施方案中，一种用于治疗包含效应细胞、组织和/或器 官的哺乳动物的炎症的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种包含 治疗有效量的组织保护性细胞因子和药学上可接受的载体的药用组 合物。在一个相关的实施方案中，所述组织保护性细胞因子缺乏选 自以下的至少一种活性：增加血细胞比容、血管收缩、超活化血小 板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。

在另一个实施方案中，一种用于治疗包含效应细胞、组织和/或 器官的哺乳动物的炎症的方法，所述方法包括给予有需要的哺乳动 物一种包含预防有效量或治疗有效量的组织保护性细胞因子和药学 上可接受的载体的药用组合物，并且给予所述哺乳动物预防有效量 或治疗有效量的一种或多种抗炎药或免疫调节剂。在一个实施方案 中，所述抗炎药选自皮质类固醇、糖皮质激素、类固醇、非甾体抗 炎药、β-激动剂、抗胆碱能药、甲基黄嘌呤、金注射剂、柳氮磺吡啶、 青霉胺、抗血管形成药、氨苯砜、补骨脂素、抗疟药、抗病毒药和 抗生素。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗包含效应细胞、 组织和/或器官的哺乳动物的炎症的方法，所述方法包括给予有需要 的哺乳动物一种包含预防有效量或治疗有效量的组织保护性细胞因 子和药学上可接受的载体的药用组合物，并且给予所述哺乳动物预 防有效量或治疗有效量的一种或多种抗炎药或免疫调节剂，条件是 所述抗炎药或免疫调节剂不是αMSH或抗TNF。在一个相关的实施 方案中，所述抗炎药或免疫调节剂不是抗体。

在另一个实施方案中，所述免疫调节剂选自蛋白质药物、肽模 拟物、抗体、核酸分子、小分子、有机化合物、无机化合物、甲氨 蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷酰胺制剂、Immuran、环孢菌素A、 二甲胺四环素、硫唑嘌呤、抗生素、甲泼尼龙(MP)、皮质类固醇、 类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素、咪唑立宾、脱氧精胍菌素、 布喹那、丙二腈酰胺、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。

本发明提供一种上述方法，其中所述组织保护性细胞因子是i) 缺乏唾液酸部分的红细胞生成素；ii)缺乏N联糖或缺乏O联糖的红 细胞生成素；iii)通过用至少一种糖苷酶处理天然红细胞生成素而具 有降低糖含量的红细胞生成素；iv)具有至少一个或多个氧化糖的红 细胞生成素；v)包含至少一个或多个经化学还原的氧化糖的红细胞生 成素；vi)包含至少一个或多个修饰精氨酸残基的红细胞生成素；vii) 包含至少一个或多个修饰赖氨酸残基或该红细胞生成素分子的一个 N端氨基修饰的红细胞生成素；viii)包含至少一个修饰酪氨酸残基的 红细胞生成素；ix)包含至少一个修饰天冬氨酸或一个谷氨酸残基的 红细胞生成素；x)包含至少一个修饰色氨酸残基的红细胞生成素；xi) 至少去除一个氨基的红细胞生成素；xii)在红细胞生成素分子内包含 至少一个胱氨酸键的至少一个口的红细胞生成素；和xiii)截短的红细 胞生成素。

在一个实施方案中，上述组合物和方法的组织保护性细胞因子 是脱唾液酸红细胞生成素或苯基乙二醛-红细胞生成素。在另一个实 施方案中，所述组织保护性细胞因子能够穿越内皮细胞屏障。所述 内皮细胞屏障可选自血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏 障和血-子宫屏障。

在一个实施方案中，作为本发明药用组合物和方法的目标的哺 乳动物的效应细胞、组织和/或器官选自神经元细胞、肌细胞、心细 胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、肾上 腺髓质细胞、毛细血管细胞、内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、子 宫内膜细胞和干细胞。在另一个实施方案中，所述哺乳动物效应细 胞还包括选自以下的细胞：感光细胞、神经节细胞、双极细胞、水 平细胞、无长突细胞、米勒细胞、心肌细胞、起搏细胞、窦房结细 胞、窦房结细胞、窦结细胞、房室结细胞、房室束细胞、肝细胞、 星形细胞、肝巨噬细胞、系膜细胞、杯状细胞、肠腺细胞、肠内分 泌细胞、肾小球细胞、束状细胞、网状细胞、嗜铬细胞、外膜细胞、 间质细胞、滋养细胞、精细胞、成熟滤泡细胞、原始滤泡细胞、子 宫内膜基质细胞和子宫内膜细胞。

本发明也提供一种用于治疗哺乳动物的炎症的上述药用组合物 和方法，其中所述组织保护性细胞因子是脱唾液酸红细胞生成素。 在优选的实施方案中，所述脱唾液酸红细胞生成素是人脱唾液酸红 细胞生成素。所述组织保护性细胞因子最好是不含N联糖的红细胞 生成素。所述组织保护性细胞因子最好是不含O联糖的红细胞生成 素。在一个实施方案中，所述组织保护性细胞因子是用至少一种糖 苷酶处理的红细胞生成素。在另一个实施方案中，所述组织保护性 细胞因子是高碘酸盐氧化的红细胞生成素。所述高碘酸盐氧化的红 细胞生成素最好是被氰基硼氢钠化学还原。在一个实施方案中，组 织保护性细胞因子是在一个或多个精氨酸残基上包含R-乙二醛部分 的红细胞生成素，其中R为芳基或烷基部分。所述红细胞生成素最 好是苯基乙二醛红细胞生成素。在另一个实施方案中，所述组织保 护性细胞因子是其中至少一个精氨酸残基通过与选自2，3-丁二酮和环 己二酮的连二酮反应而被修饰的红细胞生成素。在又一个实施方案 中，本发明的组织保护性细胞因子是其中至少一个精氨酸残基与3- 脱氧葡糖醛酮反应的红细胞生成素。在再一个实施方案中，所述组 织保护性细胞因子是包含至少一个生物素化赖氨酸或N端氨基的红 细胞生成素分子。所述红细胞生成素分子可以是生物素化红细胞生 成素。

本发明也提供一种用于治疗哺乳动物的炎症的药用组合物和方 法，所述组合物包含组织保护性细胞因子，所述组织保护性细胞因 子是葡萄糖醇基赖氨酸红细胞生成素或果糖基赖氨酸红细胞生成 素。

在一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性细 胞因子是具有至少一个氨甲酰化赖氨酸残基的红细胞生成素。在另 一个实施方案中，所述氨甲酰化红细胞生成素选自α-N-氨甲酰红细 胞生成素；N-ε-氨甲酰红细胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰红细 胞生成素；α-N-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；N-ε-氨甲酰脱唾液酸 红细胞生成素；α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；α- N-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素；N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成 素；和α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素。

在一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性细 胞因子是其中至少一个赖氨酸残基被酰化的红细胞生成素。在另一 个实施方案中，所述红细胞生成素的一个赖氨酸残基被乙酰化。在 再一个实施方案中，所述乙酰化红细胞生成素选自α-N-乙酰红细胞 生成素；N-ε-乙酰红细胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰红细胞生成素； α-N-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；N-ε-乙酰脱唾液酸红细胞生成素； α-N-乙酰，N-ε-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；α-N-乙酰低唾液酸红细 胞生成素；N-ε-乙酰低唾液酸红细胞生成素；和α-N-乙酰，N-ε-乙酰 低唾液酸红细胞生成素。

在一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性细 胞因子是包含一个琥珀酰化赖氨酸残基的红细胞生成素。在一个实 施方案中，所述红细胞生成素选自α-N-琥珀酰红细胞生成素；N-ε-琥 珀酰红细胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰红细胞生成素；α-N-琥 珀酰脱唾液酸红细胞生成素；N-ε-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；α- N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；α-N-琥珀酰低唾液酸 红细胞生成素；N-ε-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素；和α-N-琥珀酰， N-ε-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素。

在一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性细 胞因子是至少一个赖氨酸残基被2，4，6-三硝基苯磺酸盐修饰的红细胞 生成素。在本发明的一个方面，所述盐是2，4，6-三硝基苯磺酸钠。

在另一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性 细胞因子是其中至少一个酪氨酸残基被硝化和/或碘化的红细胞生成 素。

在又一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性 细胞因子是其中天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基与碳二亚胺反应后再 与胺反应的红细胞生成素。在本发明的一个方面，所述胺是甘氨酰 胺。

在一个实施方案中，上述本发明的药用组合物和方法的组织保 护性细胞因子用于治疗疾病或创伤引起的炎症。在一个实施方案中， 所述创伤选自脉管炎、慢性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性 关节炎、肾小球性肾炎、视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横 贯性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎和坏死性小肠 结肠炎。

在一个实施方案中，本发明药用组合物和方法的组织保护性细 胞因子抑制由神经胶质细胞产生的细胞因子引起的炎症。在另一个 实施方案中，所述炎症由细胞凋亡触发。

根据本发明的一个方面，组织保护性细胞因子可用于制备药用 组合物，所述组合物用于治疗包含效应细胞、组织和/或器官的哺乳 动物的炎症。根据某些方面，所述组织保护性细胞因子缺乏至少一 种选自以下的活性：增加血细胞比容、血管收缩、超活化血小板、 促凝血活性和增加凝血细胞的产生。在一个实施方案中，所述炎症 是由疾病或创伤引起的。

在另一个实施方案中，所述创伤是由以下引起：癫痫、多发性 硬化、中风、低血压、心搏停止、局部缺血、心肌梗塞、年龄相关 认知功能减退、辐射损伤、大脑麻痹、神经变性性疾病、早老性痴 呆(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亚急性坏死性 脑脊髓病(Leigh disease)、艾滋病性痴呆、记忆力减退、肌萎缩性侧 索硬化、醇中毒、心境障碍、焦虑症、注意力不集中、孤独症、传 染性海绵样脑病(Creutzfeld-Jakob disease)、脑创伤、脊髓创伤、脑缺 血、脊髓缺血、心肺分流术、慢性心力衰竭、黄斑变性、糖尿病性 神经病、糖尿病性视网膜病、青光眼、视网膜缺血或视网膜创伤。

本发明提供一种组织保护性细胞因子在制备用于治疗在包含效 应细胞、组织和/或器官的哺乳动物的炎症的药用组合物中的用途， 其中所述药用组合物包含治疗有效量的组织保护性细胞因子；至少 一种抗炎药或免疫调节剂；和药学上可接受的载体。在一个实施方 案中，所述组织保护性细胞因子是i)缺乏唾液酸部分的红细胞生成 素；ii)缺乏N联糖或缺乏O联糖的红细胞生成素；iii)通过用至少一 种糖苷酶处理天然红细胞生成素而具有降低糖含量的红细胞生成 素；iv)具有至少一个或多个氧化糖的红细胞生成素；v)包含至少一个 或多个经化学还原的氧化糖的红细胞生成素；vi)包含至少一个或多 个修饰精氨酸残基的红细胞生成素；vii)包含至少一个或多个修饰赖 氨酸残基或该红细胞生成素分子的一个N端氨基修饰的红细胞生成 素；viii)包含至少一个修饰酪氨酸残基的红细胞生成素；ix)包含至少 一个修饰天冬氨酸或一个谷氨酸残基的红细胞生成素；x)包含至少一 个修饰色氨酸残基的红细胞生成素；xi)至少去除一个氨基的红细胞 生成素；xii)在红细胞生成素分子内包含至少一个胱氨酸键的至少一 个口的红细胞生成素；和xiii)截短的红细胞生成素。

通过参考如下附图和详述将会更好地理解本发明的这些方面和 其它方面。

                     附图简述

图1显示在用抗红细胞生成素抗体染色的薄切片中，红细胞生 成素受体在正常人脑中的分布。

图2是图1的更高放大倍数的图像。

图3显示使用金标记的第二抗体，红细胞生成素受体的超显微 分布。

图4，按类似图3的方法制备，显示人脑毛细血管管腔表面和反 面的高密度红细胞生成素受体。

图5比较红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素对血清饥饿的 P19细胞活力的体外功效。

图6是比较红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素对血清饥饿 的P19细胞活力的体外功效的另一个实验。

图7显示红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素在大鼠局灶性 脑缺血模型中的保护作用。

图8显示比较人红细胞生成素和人脱唾液酸红细胞生成素在局 部缺血性中风模型的中脑动脉闭塞中的功效的剂量反应。

图9显示碘化红细胞生成素在P19测定中的活性。

图10显示生物素化红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素在 P19测定中的效应。

图11比较红细胞生成素和苯基乙二醛修饰的红细胞生成素对血 清饥饿的P19细胞活力的体外功效。

图12显示在水中毒测定中组织保护性细胞因子的效应。

图13描述胃肠外给予的红细胞生成素向脑脊液中的转运。

图14显示红细胞生成素对为移植准备的心脏功能的维护。

图15显示暂时性血管闭塞后红细胞生成素保护心肌细胞防止局 部缺血性损伤。

图16A-图16D描述了红细胞生成素在大鼠青光眼模型中的治疗 效果。

图17显示红细胞生成素在大鼠青光眼模型中对视网膜功能的保 护程度。

图18描述脑创伤后5天开始给予红细胞生成素对由脑创伤引起 的认知功能的恢复。

图19描述脑创伤后30天开始给予红细胞生成素对由脑创伤引 起的认知功能的恢复。

图20描述人脱唾液酸红细胞生成素在脑毒性红藻氨酸模型中的 功效。

图21描述组织保护性细胞因子在大鼠脊髓损伤模型中的功效。

图22显示组织保护性细胞因子在兔脊髓损伤模型中的功效。

图23A-图23C显示苏木精和伊红染色的大脑皮层冠状冠状切 片。

图24A-图24C显示用GFAP抗体染色的邻近梗塞区前皮层的冠 状冠状切片。

图25A和图25B显示用OX-42抗体染色的大脑皮层的冠状冠状 切片。

图26A和图26B显示用OX-42抗体染色的邻近梗塞区的大脑皮 层冠状冠状切片。

图27显示红细胞生成素在EAE模型中的抗炎效果。

图28比较了地塞米松和红细胞生成素在EAE模型中的抗炎效 果。

图29A和图29B显示红细胞生成素抑制与神经元死亡相关的炎 症。

                     发明详述

本发明的方法提供了在各种正常和不利条件下对哺乳动物体内 的细胞、组织和器官的局部或全身保护或增强作用，或者提供对预 定移植(relocation)到另一哺乳动物体内的细胞、组织或器官的保护作 用。另外，也提供功能障碍的恢复或再生。如上所述，红细胞生成 素穿越紧密的内皮细胞屏障并对离开血管系统的效应细胞(以及其它 类型的细胞)发挥积极作用的能力，提供了预防以及治疗各种病症和 疾病的潜能(否则所述病症和疾病在包括人在内的动物中引起明显的 细胞损害和组织损伤)，而且也使得迄今为止未经尝试的、传统上认 为风险大于利益的外科手术获得成功。

红细胞生成素是糖蛋白激素，在人体内的分子量约为34kDa。 其成熟蛋白包含165个氨基酸，而且糖残基约占分子量的40％。红 细胞生成素可市售获得，例如，得自Ortho Biotech Inc.，Raritan，NJ， 商标为PROCRIT，以及得自Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA，商标 为EPOGEN。此外，多种宿主系统可用于重组红细胞生成素的表达 和产生，所述系统包括但不限于细菌细胞系统、酵母细胞系统、昆 虫细胞系统、植物细胞系统和包括人细胞在内的哺乳动物细胞系统。 例如，细菌产生的产物没有糖基化或唾液酸化的重组红细胞生成素 可用于产生红细胞生成素的非糖基化形式。或者，重组红细胞生成 素可以在包括人类细胞在内的其它进行糖基化的系统例如植物中产 生。用于本发明实践的红细胞生成素的形式包括人和其它哺乳动物 红细胞生成素的天然存在形式、合成形式和重组形式的化学修饰和/ 或表达系统介导的糖基化修饰。

“效应细胞”是指其功能或活力可以通过暴露给红细胞生成素 而维持、促进、增强、再生或以其它任何方式获益的哺乳动物细胞。 所述细胞的非限制性实例包括神经元细胞、视网膜细胞、肌细胞、 心细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、 肾上腺髓质细胞、毛细血管内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰腺 细胞、皮肤细胞、骨细胞和子宫内膜细胞。具体地讲，效应细胞包 括但不限于神经元细胞；视网膜细胞：感光细胞(杆细胞和锥细胞)、 神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和米勒细胞；肌细 胞；心细胞：心肌细胞、起搏细胞、窦房结细胞、窦房结细胞、窦 结细胞和结合组织细胞(房室结和房室束)；肺细胞；肝细胞：肝细胞、 星形细胞和肝巨噬细胞；肾细胞：系膜细胞、肾上皮细胞和管状肠 细胞；小肠细胞：杯状细胞、肠腺细胞(crypts)和肠内分泌细胞；肾 上腺皮质细胞：肾小球细胞、束状细胞和网状细胞；肾上腺髓质细 胞：嗜铬细胞；毛细血管细胞：外膜细胞；睾丸细胞：间质细胞、 滋养细胞和精细胞及其原始细胞；卵巢细胞：成熟滤泡细胞和原始 滤泡细胞；子宫内膜细胞：子宫内膜基质细胞和子宫内膜细胞；胰 腺细胞：胰岛、α-细胞、β-细胞、γ-细胞和F-细胞；皮肤细胞；骨细 胞：骨原细胞、破骨细胞和成骨细胞；以及存在于以上列出的器官 中的干细胞和内皮细胞。此外，所述效应细胞和由红细胞生成素提 供的益处可以扩大到为并非直接效应的其它细胞、或含有所述非效 应细胞的组织或器官提供间接的保护或增强作用。这些从作为细胞、 组织或器官的一部分而存在的效应细胞的增强作用而间接获益的其 它细胞或组织或器官为“相关”细胞、组织和器官。因此，组织或 器官中存在少量或小比例的效应细胞可提供本文所述的红细胞生成 素的益处，所述效应细胞例如存在于所述组织中的可兴奋组织或神 经元组织，或产生睾酮的睾丸中的间质细胞。一方面，效应细胞或 其相关细胞、组织或器官既不是可兴奋细胞、组织或器官，占优势 的也不包含可兴奋细胞或组织。

为了最终益处而引起的有目的的不利条件的持续时间和程度， 例如高剂量化疗和放疗、延长的离体移植存活期和延长的手术诱导 局部缺血周期，可以通过本发明的优点来克服。然而，本发明并不 限于此，作为本发明的一方面还包括其中靶效应细胞因为内皮细胞 屏障和内皮紧密连接而离开血管系统的方法或组合物。一般而言， 本发明涉及可从通过暴露给红细胞生成素而获益的任何效应细胞和 相关细胞、组织和器官。此外，细胞、组织或器官功能障碍可以在 急性不利事件(例如创伤)后通过暴露给红细胞生成素而恢复或再生。

因此，本发明总的来讲涉及红细胞生成素在制备用于上述目的 的药用组合物中的用途，其中细胞功能被维持、促进、增强、再生 或以任何方式获益。本发明也涉及通过给予哺乳动物有效量的如本 文所述的红细胞生成素以维持、增强、促进或再生细胞功能的方法。 本发明还涉及通过将细胞、组织或器官暴露给红细胞生成素以维持、 促进、增强或再生离体细胞功能的方法。本发明也涉及包含红细胞 生成素的、用于器官或组织保存的灌注液组合物。

本发明的各种方法使用这样的种药用组合物：所述组合物至少 包括用于具体的暴露途径和持续时间的有效量的红细胞生成素，使 得对哺乳动物体内或来自哺乳动物体内的效应细胞发挥积极作用或 益处。当预期治疗的靶细胞、组织或器官需要红细胞生成素穿越内 皮细胞屏障时，所述药用组合物包括其浓度在穿越内皮细胞屏障后 能对效应细胞发挥其所需效应的红细胞生成素。在本文中能与红细 胞生成素受体相互作用并调节该受体活性的分子是指红细胞生成素 或红细胞生成素受体活性调节剂，所述分子用于本发明。这些分子 可以是例如上述红细胞生成素分子的天然存在形式、合成形式和重 组形式，或者是除了如本文所述调节红细胞生成素效应细胞活性之 外未必可以以任何方式与红细胞生成素相似的其它分子。

除了以上鉴定的组织保护性特征之外，红细胞生成素更经常与 其对骨髓的效应相关，也就是说，增加血细胞比容(红细胞发生)、血 管收缩(高血压)、超活化血小板、促凝血活性和增加凝血细胞的产生。 然而，这些对骨髓的效应在慢性和急性给予红细胞生成素以治疗如 上讨论的细胞、组织或器官功能障碍中可能会带来一定的风险。因 此，本发明总的来讲涉及由优选缺乏红细胞生成素对骨髓的一个或 多个效应的化学修饰红细胞生成素组成的组织保护性细胞因子的用 途。更优选所述组织保护性细胞因子缺乏红细胞发生；最优选所述 组织保护性细胞因子缺乏红细胞生成素对骨髓的所有效应。在另一 个实施方案中，所述组织保护性细胞因子缺乏任意两个上述效应， 或任意三个上述效应。

此外，如本文所述用途所需的组织保护性细胞因子可以通过如 下方法产生：胍化(guanidination)、酰胺化、氨甲酰化、三硝基苯基 化、乙酰化、琥珀酰化、硝化，或者在其它方法例如有限蛋白酶解、 氨基的去除中对精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基 或羧基的修饰，和/或通过分子生物学技术对红细胞生成素的精氨酸、 赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基进行突变取代。这些化学 修饰最好影响4个典型特征性受体区-VLQRY(SEQ ID NO：1)、 TKVNFYAW(SEQ ID NO：2)、SGIRSLTTL(SEQ ID NO：3)或SNFLRG (SEQ ID NO：4)。更优选这些本来是碱性的受体区通过这些区内碱性 氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的化学修饰而被修饰。此外，这些受体区周 围分子区域可以被化学修饰并影响所述分子的动力学特性或受体结 合特性。这产生维持特定器官和组织的适当活性水平、但不维持其 它器官和组织(例如红细胞)活性水平的组织保护性细胞因子(例如 Satake等；1990，Biochim.Biophys.Acta 1038：125-9；所述文献通过引 用全部结合到本文中)。一个如下所述的非限制性实例是通过与诸如 苯基乙二醛等的乙二醛反应来修饰红细胞生成素精氨酸残基(按照 Takahashi，1977，J Biochem.81：395-402中的方案)。正如下面将会看 到的，所述组织保护性细胞因子分子完全保留其神经营养效应。所 述组织保护性细胞因子分子完全包括在本文所述的各种用途和组合 物中。

红细胞生成素和红细胞生成素样分子的活性(以单位计)通常根据 其在啮齿动物模型中刺激红细胞产生的效力来定义(也作为红细胞生 成素的国际标准的来源)。通常红细胞生成素(MW为～34,000)的一个 单位(U)约为8ng蛋白(1mg蛋白约为125,000U)。然而，因为对红 细胞发生的效应伴随着本文所需活性，并且不一定是本发明的某些 组织保护性细胞因子的可检测特性，所以根据红细胞生成活性来定 义本发明的某些组织保护性细胞因子的活性是不适当的。因此，本 文所用的红细胞生成素或组织保护性细胞因子的活性单位定义为在 神经细胞系统或其它效应细胞系统引起与WHO国际标准红细胞生成 素在同一系统中引起的相同活性所需的蛋白量。技术人员根据本文 的指导将会容易地确定非红细胞发生的红细胞生成素或相关组织保 护性细胞因子分子的单位。

除了上述组织保护性细胞因子以外，以下讨论详细描述了本发 明的各种组织保护性细胞因子。

本发明的组织保护性细胞因子可由至少没有唾液酸部分的红细 胞生成素组成，称为脱唾液酸红细胞生成素。本发明的组织保护性 细胞因子最好是人脱唾液酸红细胞生成素。它们可以通过用唾液酸 酶将红细胞生成素脱唾液酸化而制备，例如由ProZyme Inc.，San Leandro，California的唾液酸酶A生产商包装上所描述的方法。通常， PROZYME GLYCOPRO测序级唾液酸酶ATM(N-乙酰神经氨酸糖 基水解酶，EC 3.2.1.18)用于从复杂糖和糖蛋白例如红细胞生成素中切 割所有非还原端唾液酸残基。它也会切割支化唾液酸(连接内部残 基)。唾液酸酶A是从产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的克隆中 分离出来的。

在上述方法的非限制性实施例中，红细胞生成素可用唾液酸酶 (0.025U/mg EPO)于37℃处理3小时进行脱唾液酸，然后可以将红细 胞生成素脱盐并浓缩。通过使用AKTAPRIMETM系统(Amersham Pharmacia Biotech)的离子交换柱后，用所选缓冲液洗脱，选择用免疫 电泳(在IEF凝胶上在pI～8.5和～7.9进行电泳)鉴定的只含最上两个 条带的流分。在这个组织保护性细胞因子制剂中没有检测到明显的 唾液酸含量。

在替代实施方案中，本发明的组织保护性细胞因子可以是通过 上述方法被部分脱唾液酸化的具有至少1个、2个、3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12或13个唾液酸残基 的红细胞生成素。红细胞生成素的部分脱唾液酸化的这些组织保护 性细胞因子在本文中也可以称为低唾液酸红细胞生成素，并且可以 是例如每个红细胞生成素分子只有2个唾液酸的均一组合物，或者 可以是各种不同程度的唾液酸化的、或者例如每个红细胞生成素上 平均具有少数例如约1个至约4个唾液酸分子、或者在另一个实例 中更多数目例如每个红细胞生成素分子上平均有约10个至13个唾 液酸的不均一混合物。所述混合物可包括脱唾液酸红细胞生成素或 红细胞生成素。

用于上述用途的红细胞生成素可具有至少一个或多个修饰精氨 酸残基。例如，修饰红细胞生成素可以包含在一个或多个精氨酸残 基上的R-乙二醛部分，其中R可以是芳基、杂芳基、低级烷基、低 级烷氧基或环烷基，或α-脱氧糖醇基。本文所用的术语低级“烷基” 是指最好含有1-6个碳原子的直链或支链饱和脂族烃基。代表性的所 述基团是甲基、乙基、异丙基、异丁基、丁基、戊基、己基等。术 语“烷氧基”是指通过氧连接所述分子其余部分的上述低级烷基。 烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基等。术语“环 烷基”是指3个至至多约8个碳的环烷基，包括例如环丙基、环丁 基、环己基等。术语芳基是指苯基和萘基。术语杂芳基是指含有4-10 个环原子和1-3个选自氧、氮和硫的杂原子的杂环基。实例包括但不 限于异唑基、苯基异唑基、呋喃基、嘧啶基、喹啉基、四氢喹 啉基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、1，2，4-三唑基、噻唑基、噻吩基 等。R基团可以被取代，例如3-脱氧葡糖醛酮的2，3，4-三羟丁基。R- 乙二醛化合物的典型实例是乙二醛、甲基乙二醛、3-脱氧葡糖醛酮和 苯基乙二醛。优选的R-乙二醛化合物是甲基乙二醛或苯基乙二醛。 使用苯基乙二醛进行所述修饰的示例性方法可见于Werber等，1975， Isr.J.Med.Sci.11(11)：1169-70。

在另一个实例中，最好在约50毫摩尔的硼酸盐缓冲液中，在pH 8-9，可以通过与例如2，3-丁二酮或环己二酮等连二酮反应，修饰至 少一个精氨酸残基。用2，3-丁二酮的后一个修饰方法可以按照Riordan， 1973，Biochemistry 12(20)：3915-3923的方法进行；而用环己酮的方 法可以按照Patthy等，1975，J.Biol.Chem 250(2)：565-9的方法进行。

本发明的组织保护性细胞因子可以包含至少一个或多个修饰赖 氨酸残基或该红细胞生成素的一个N端氨基修饰，所述修饰例如来 自赖氨酸残基与氨基改性剂反应所得到的修饰。例如，红细胞生成 素或上述脱唾液酸红细胞生成素或低唾液酸红细胞生成素可以通过 乙酰化、氨甲酰化、琥珀酰化、氧化和随后在其它方法中的羧甲基 赖氨酸反应而被修饰，从而修饰氨基。

在非限制性实施例中，组织保护性细胞因子可以通过红细胞生 成素的氨甲酰化而产生，或通过脱唾液酸化红细胞生成素例如脱唾 液酸红细胞生成素与硼酸盐缓冲液中重结晶的氰酸钾而产生，然后 彻底透析。

同样，上述红细胞生成素可以通过与琥珀酸酐反应而琥珀酰化， 接着通过透析，形成本发明的组织保护性细胞因子。

在再一个实施方案中，组织保护性细胞因子可以通过将红细胞 生成素与乙酸酐在磷酸缓冲液中反应、将红细胞生成素乙酰化而产 生。该反应可以通过对水透析而终止。该方法描述于Satake等，(1990). Chemical modification of erythropoietin：an increase in in-vitro activity by guanidination(红细胞生成素的化学修饰：通过胍化增加体外活性). Biochimica et Biophysica Acta.1038：125-129。

在另一个实施方案中，所述组织保护性细胞因子是来自红细胞 生成素或脱唾液酸红细胞生成素的Nε-(羧甲基)赖氨酸(CML)加合物， 是通过在磷酸钠缓冲液中与乙醛酸和NaBH3CN反应、接着通过透析 而制备。Akhtar等，(1999).Conformational study of Nε-(carboxymethyl) lysine adducts of recombinant a-crystallins(重组a-晶体蛋白的Nε-(羧甲 基)赖氨酸加合物的构象研究).Current Eye Research，18：270-276。

在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子是如下产生的：通 过与例如乙二醛、甲基乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮等乙二醛衍生物反 应形成α-羧基烷基衍生物而修饰红细胞生成素的赖氨酸残基。实例包 括与乙二醛的反应以形成羧甲基赖氨酸残基，如在Glomb和Monnier， 1995，J.Biol.Chem.270(17)：10017-26中，或者与甲基乙二醛反应以 形成(1-羧乙基)赖氨酸残基，如在Degenhardt等，1998，Cell.Mol.Biol. (Noisy-le-grand)44(7)：1139-45中。修饰的赖氨酸残基还可被化学还 原。例如，红细胞生成素可以通过赖氨酸基团被生物素化，例如按 照实施例2描述的方法，其中D-生物素酰-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰 亚胺酯与红细胞生成素反应，接着按照如下文献的描述通过在 Centricon 10柱上凝胶过滤除去未反应的生物素：Wojchowski和 Caslake，1989，Blood 74(3)：952-8。在该文献中，作者使用了红细胞 生成素生物素化的3种不同方法，每种方法都可用来制备用于本文 用途的组织保护性细胞因子。生物素可以加入到(1)唾液酸部分(2)羧 基或(3)氨基上。

在另一个优选实施方案中，所述赖氨酸可以与醛或还原糖反应 形成亚胺，所述亚胺可以通过被氰基硼氢钠还原形成N-烷基化赖氨 酸残基例如葡萄糖醇基赖氨酸而稳定，或者在还原糖的情况下可以 通过Amadori或Heyns重排以在红细胞生成素分子中形成α-脱氧-α- 氨基糖例如α-脱氧-α-果糖基赖氨酸残基而稳定。作为实例，通过与 0.5M葡萄糖的磷酸钠缓冲液(pH7.4)保温60天，可以制备果糖基赖 氨酸修饰的蛋白，该方法描述于Makita等，1992，J.Biol.Chem.267： 5133-5138。在另一个实例中，赖氨酸基团可以例如通过与氰酸根离 子反应而被氨甲酰化，或者与烷基-异氰酸盐或芳基-异氰酸盐、烷基 -异硫氰酸盐或芳基-异硫氰酸盐反应而被烷基-氨甲酰化或芳基-氨甲 酰化或烷基-硫代氨甲酰化或芳基-硫代氨甲酰化，或者可以通过活性 烷基羧酸衍生物或芳基羧酸衍生物而被乙酰化，例如通过与乙酸酐 或琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐反应。实例是用4-磺苯基异硫氰酸盐或 乙酸酐修饰赖氨酸基团，这两者都描述于Gao等，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91(25)：12027-30。赖氨酸基团也可以通过与三硝基苯磺酸、 或者最好与其盐反应而被三硝基苯基修饰。该方法描述于以下实施 例2。

红细胞生成素的至少一个酪氨酸残基可以通过亲电子试剂在芳 环位置内被例如硝化或碘化而修饰，产生组织保护性细胞因子。作 为非限制性实例，红细胞生成素可以与四硝基甲烷反应(Nestler等， 1985，J.Biol.Chem.260(12)：7316-21；或者如实施例3所述被碘化。 例如，可以在磷酸钠缓冲液中用红细胞生成素或脱唾液酸红细胞生 成素来完成与NaI和IODO-GEN预先包被的碘化管(Pierce，28601)的 碘化反应。

红细胞生成素的至少一个天冬氨酸残基或一个谷氨酸残基可以 例如通过与碳二亚胺反应后再与胺(例如但不限于甘氨酰胺)反应而修 饰。

在另一个实例中，红细胞生成素的一个色氨酸残基可以例如通 过与正溴琥珀酰亚胺或正氯琥珀酰亚胺反应、接着通过例如描述于 Josse等，Chem Biol Interact 1999 May 14；119-120的方法而修饰。

在再一个实例中，组织保护性细胞因子可以通过除去天然红细 胞生成素的至少一个氨基而制备，这可以通过与茚三酮反应后再与 硼氢化物反应还原随后产生的羰基而完成。

在又一个实例中，提供在红细胞生成素分子中至少一个胱氨酸 键具有至少一个口的组织保护性细胞因子，其中红细胞生成素分子 通过与例如二硫苏糖醇等还原剂反应，接着通过随后产生的巯基与 碘乙酰胺、碘乙酸或另一种亲电子试剂反应，从而阻止二硫键重新 形成。如上所述，可以通过以下两种方法之一或两法联用来消除二 硫键，即改变参与实际交联的半胱氨酸分子、或至少一个导致红细 胞生成素不能形成至少一个天然分子中存在的二硫键的其它氨基酸 残基。

可以通过对红细胞生成素进行靶向特定残基的有限化学蛋白酶 解(例如在色氨酸残基后切割)而制备组织保护性细胞因子。所得红细 胞生成素片断包括在本文中。

如上所述，用于本文目的的组织保护性细胞因子可具有至少一 个上述修饰，但也可具有不止一个以上修饰。作为实例的在其分子 的糖部分具有一个修饰和在其氨基部分具有一个修饰组织保护性细 胞因子，组织保护性细胞因子可以是脱唾液酸红细胞生成素并且其 赖氨酸残基被生物素化或氨甲酰化。

此外，化学修饰的红细胞生成素还可以通过红细胞生成素的至 少一个氨基酸突变而被进一步修饰。所述突变可包括取代、包括内 部缺失在内的缺失、包括产生融合蛋白的添加在内的添加或者在氨 基酸序列内或其附近的氨基酸残基的保守取代，但是所述保守取代 导致产生功能等同的红细胞生成素的“沉默”变化。保守氨基酸取 代可以在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/ 或两亲性的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和 甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨 酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨 酸。或者，非保守氨基酸的变化以及较大的插入和缺失可用于产生 功能改变的红细胞生成素。所述突变可用于按所需方式改变红细胞 生成素的特性。例如，在一个实施方案中，用于本发明实践的红细 胞生成素可以在影响受体结合的红细胞生成素的如下4个功能域内 改变一个或多个氨基酸：VLQRY(SEQ ID NO：1)和/或TKVNFYAW (SEQ ID NO：2)和/或SGLRSLTTL(SEQ ID NO：3)和/或SNFLRG(SEQ ID NO：4)。在另一个实施方案中，可以使用在其分子的周围区域含有 突变并影响分子的动力学或受体结合特性的红细胞生成素。

这些额外的修饰可以用于增强组织保护性细胞因子的组织保护 性效应、抑制骨髓效应或改变物理特性例如电荷。

用于制备本发明组织保护性细胞因子的上述示例性方法仅仅是 说明性的和非限制性的，这些方法或其它方法都可用于制备本发明 的化合物。其中所述制备方法中含有的上文中的名称例如“乙酰化” 或“生物素化”在本文中仅仅用作理解所述化合物是如何制备的手 段，然而本发明涉及作为上述反应产物的化合物。本领域技术人员 将容易理解所述化合物是上述反应的产物。迄今为止，本发明的化 合物都以非正式名称或俗名命名以表明本发明修饰的范围，而且它 们可存在于红细胞生成素或修饰红细胞生成素分子的一个或多个位 点上。作为非限制性实例，下面的具体化合物是本文所包括的化合 物的成员。

1.氨甲酰化红细胞生成素：下列化合物表示在红细胞生成素分 子N端氨基酸上的氨甲酰基部分(“α-N-氨甲酰-”)或在红细胞生成 素赖氨酰残基的一个(或多个)ε氨基上的氨甲酰基部分(“N-ε-氨甲酰 -”)。当然，可以存在含有或不含α-N修饰的多个N-ε修饰。

i.α-N-氨甲酰红细胞生成素；

ii.N-ε-氨甲酰红细胞生成素；

iii.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰红细胞生成素；

iv.α-N-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；

v.N-ε-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；

vi.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰脱唾液酸红细胞生成素；

vii.α-N-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素；

viii.N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素；和

ix.α-N-氨甲酰，N-ε-氨甲酰低唾液酸红细胞生成素。

2.琥珀酰化红细胞生成素：下列化合物表示在红细胞生成素分 子N端氨基酸上的琥珀酰基部分(“α-N-琥珀酰-”)或在红细胞生成 素赖氨酰残基的一个(或多个)ε氨基上的琥珀酰基部分(“N-ε-琥珀酰 -”)。当然，可以存在含有或不含α-N-修饰的多个N-ε修饰。

i.α-N-琥珀酰红细胞生成素；

ii.N-ε-琥珀酰红细胞生成素；

iii.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰红细胞生成素；

iv.α-N-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；

v.N-ε-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；

vi.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脱唾液酸红细胞生成素；

vii.α-N-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素；

viii.N-ε-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素；和

ix.α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸红细胞生成素。

3.乙酰化红细胞生成素：下列化合物表示在红细胞生成素分子 N端氨基酸上的乙酰基部分(“α-N-乙酰-”)或在红细胞生成素赖氨 酰残基的一个(或多个)ε氨基上的乙酰基部分(“N-ε-乙酰-”)。当然， 可以存在含有或不含α-N-修饰的多个N-ε修饰。

i.α-N-乙酰红细胞生成素；

ii.N-ε-乙酰红细胞生成素；

iii.α-N-乙酰，N-ε-乙酰红细胞生成素；

iv.α-N-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；

v.N-ε-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；

vi.α-N-乙酰，N-ε-乙酰脱唾液酸红细胞生成素；

vii.α-N-乙酰低唾液酸红细胞生成素；

viii.N-ε-乙酰低唾液酸红细胞生成素；和

ix.α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸红细胞生成素。

4.生物素化红细胞生成素：下列化合物表示在红细胞生成素分 子N端氨基酸上的生物素基部分(“α-N-生物素-”)或在红细胞生成 素赖氨酰残基的一个(或多个)ε氨基上的生物素部分(“N-ε-生物素 -”)。当然，可以存在含有或不含α-N-修饰的多个N-ε修饰。

i.α-N-生物素红细胞生成素；

ii.N-ε-生物素红细胞生成素；

iii.α-N-生物素，N-ε-生物素红细胞生成素；

iv.α-N-生物素脱唾液酸红细胞生成素；

v.N-ε-生物素脱唾液酸红细胞生成素；

vi.α-N-生物素，N-ε-生物素脱唾液酸红细胞生成素；

vii.α-N-生物素低唾液酸红细胞生成素；

viii.N-ε-生物素低唾液酸红细胞生成素；和

ix.α-N-生物素，N-ε-生物素低唾液酸红细胞生成素。

5.碘化红细胞生成素：当然，本领域技术人员知道红细胞生成 素内若干不同的酪氨酸残基以及酪氨酸残基的组合可以被碘化，而 且下面提供的仅仅是说明性的。

i.碘化红细胞生成素；

ii.碘化脱唾液酸红细胞生成素；和

iii.碘化低唾液酸红细胞生成素。

6.羧甲基赖氨酰-红细胞生成素：下列化合物表示在红细胞生成 素赖氨酰残基的一个(或多个)ε氨基上的羧甲基部分(“N-ε-羧甲基- ”)。当然，可以存在多个N-ε-修饰。

i.N-ε-羧甲基红细胞生成素；

ii.N-ε-羧甲基脱唾液酸红细胞生成素；和

iii.N-ε-羧甲基低唾液酸红细胞生成素。

各种宿主表达载体系统可用于产生本发明的红细胞生成素和红 细胞生成素相关分子。所述宿主表达系统代表载体但也可代表细胞， 通过所述载体，目标红细胞生成素可产生并随后被纯化，所述细胞 当用合适核苷酸编码序列转化或转染时，可在原位表现出修饰的红 细胞生成素基因产物。这些包括但不限于细菌宿主系统、昆虫宿主 系统、植物宿主系统、包括人在内的哺乳动物宿主系统，例如但不 限于用含有修饰红细胞生成素产物编码序列的重组病毒表达载体(例 如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有红细胞生成素相关分子编 码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花 叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统，或用含有红细胞生成素相关分 子编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统； 或包含含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动 子)或来自哺乳动物病毒启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒 7.5K启动子)的重组表达构建体的包括人细胞系统在内的哺乳动物细 胞系统(例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3)。

另外，可以选择调节插入序列表达或者按所需特定方式修饰和 加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的所述修饰(例如糖基化)和加 工(例如切割)对蛋白功能可能是重要的。不同宿主细胞对蛋白和基因 产物翻译后加工和修饰具有特征性的特有机制。可以选择合适的细 胞系或宿主系统，保证表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此， 可使用对初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细 胞机器的真核宿主细胞。包括人宿主细胞在内的哺乳动物宿主细胞 包括但不限于HT1080、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、 293、3T3和WI38。

为了长期、高产地产生重组蛋白，最好是稳定地表达。例如， 可以对稳定表达红细胞生成素相关分子基因产物的细胞系进行工程 改造。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用被合适表达控 制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点 等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞。导入外源DNA后，可以 让工程细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基 中。重组质粒中的选择标记赋予对选择物的抗性，并且允许细胞将 质粒稳定整合到其染色体中，让其生长以形成转化灶，随后可以被 克隆并扩增成细胞系。该方法可有利地用于将表达红细胞生成素相 关分子基因产物的细胞系进行工程改造。所述工程细胞系在筛选和 评价影响红细胞生成素相关分子基因产物的内源活性的化合物中特 别有用。

或者，可以通过将异源DNA调节元件插入到稳定细胞系或克隆 化微生物的基因组中，使插入的调节元件与内源红细胞生成素基因 有效连接，从而修饰细胞系内或微生物内的内源红细胞生成素的表 达特性。例如，可以通过插入在所述细胞系或微生物中能启动正常 表达基因产物表达的调节元件，来激活通常“转录沉默”的内源红 细胞生成素基因即在细胞系中通常不表达或仅表达非常低水平的红 细胞生成素基因。或者，可以通过插入可穿越细胞类型的混栖调节 元件，来激活转录沉默的内源红细胞生成素基因。

可以采用例如靶向同源重组等技术，将异源调节元件插入到稳 定的细胞系或克隆化微生物中，使其与内源红细胞生成素基因有效 连接，所述技术是本领域技术人员众所周知的，并描述于例如授予 巴斯德研究所的法国专利第2646438号、授予Chappel的美国专利第 4,215,051号；授予Sherwin等的美国专利第5,578,461号；Selden等 的国际申请号PCT/US92/09627(WO93/09222)；和Skoultchi等的国 际申请号PCT/US90/06436(WO91/06667)，所述每个专利都通过引用 全部结合到本文中。

在本发明的一个实施方案中，组织保护性细胞因子是缺失唾液 酸残基或完全缺乏唾液酸残基的化学修饰的红细胞生成素分子，并 且可以在包括人细胞在内的哺乳动物细胞中产生。所述细胞可以被 工程化，以缺失或缺乏加入唾液酸的酶，即β-半乳糖苷-α-2，3-唾液酸 转移酶(α-2，3-唾液酸转移酶@)和β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸转移酶(α- 2，6-唾液酸转移酶@)活性。在一个实施方案中，使用其中α-2，3-唾液 酸转移酶基因和/或α-2，6-唾液酸转移酶基因中的一个或两个都缺失的 哺乳动物细胞。可以采用本领域众所周知的基因剔除技术构建所述 缺失。在另一个实施方案中，二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞用作产生重组红细胞生成素相关分子的宿主细胞。 CHO细胞不表达α-2，6-唾液酸转移酶，因此不加入以2，6键连接这些 细胞产生的糖蛋白的N联寡糖的唾液酸。结果，CHO细胞产生的重 组蛋白缺乏以2，6键连接半乳糖的唾液酸(Sasaki等，(1987；Takeuchi 等，参见上文；Mutsaers等，Eur.J.Biochem.156，651(1986)；Takeuchi 等，J.Chromotgr.400，207(1987)。在一个实施方案中，为了产生用于 产生脱唾液酸红细胞生成素的宿主细胞，使在CHO细胞中编码α-2，3- 唾液酸转移酶的基因缺失。所述剔除α-2，3-唾液酸转移酶的CHO细 胞完全缺乏唾液酸转移酶活性，结果可用于由脱唾液酸红细胞生成 素组成的组织保护性细胞因子的重组表达和产生。

在另一个实施方案中，可以通过干扰唾液酸转运到高尔基体而 产生脱唾液酸糖蛋白，例如Eckhardt等，1998，J.Biol.Chem.273： 20189-95)。采用本领域技术人员众所周知的方法(例如Oelmann等， 2001，J.Biol.Chem.276：26291-300)，可以完成核苷酸糖CMP-唾液酸 转运蛋白的诱变，产生中国仓鼠卵巢细胞的突变体。这些细胞不能 向糖蛋白例如红细胞生成素上加入唾液酸残基，所以只能产生脱唾 液酸红细胞生成素。

产生红细胞生成素的转染哺乳动物细胞也产生胞质唾液酸酶， 所述酶如果渗漏到培养基中会高效降解唾液酸红细胞生成素(例如 Gramer等，1995 Biotechnology 13：692-698)。采用本领域技术人员众 所周知的方法(例如由Ferrari等，1994，Glycobiology 4：367-373提供的 信息)，细胞系可以被转染、突变或其它方法以组成型方式产生唾液 酸酶。脱唾液酸红细胞生成素可以按这种方式在脱唾液酸红细胞生 成素生产过程中产生。

本发明的组织保护性细胞因子在红细胞生成素的氨基酸残基上 具有至少一个修饰，而与所述分子的糖基化状态无关。如上所述， 化学修饰可以是至少一个氨基酸例如赖氨酸残基的至少一个氨基或 N端氨基的至少一个修饰，或至少一个酪氨酸残基的碘化。

产生本发明的重组组织保护性细胞因子和化学修饰的重组组织 保护性细胞因子后，本领域普通技术人员能采用众所周知的测定来 检验所述细胞因子的组织保护性特性和对骨髓效应的缺乏。

例如，可以通过使用TF-1测定来检验重组组织保护性细胞因子 的非红细胞发生的效应。在该项测定中，将TF-1细胞在CO2培养箱 中在补充5ng/ml GM-CSF和10％FCS的完全RPMI培养基中于37 ℃培养1天。然后将所述细胞在饥饿培养基(5％FCS，没有GM-CSF) 中洗涤并以106细胞/ml的密度在饥饿培养基(5％FCS，没有GM-CSF) 中悬浮16小时。通过以下步骤准备96孔板：(1)在外围孔中加入100μl 无菌水以保持湿度；(2)向5孔中加入培养基(10％FCS，无细胞或 GM-CSF)；和(3)在其余孔中以25,000细胞/孔接种含10％FCS和所 述重组组织保护性细胞因子的培养基(每种待测细胞因子5孔)。如果 细胞增殖，则重组组织保护性细胞因子可以是红细胞发生的。然后 可以在监测由重组组织保护性细胞因子引起的血细胞比容增加的体 内测定中，测试所述化合物的体内效应。阴性结果—在TF-1体外测 定中细胞未增殖和/或在体内测定中血细胞比容未增加—表明重组组 织保护性细胞因子是非红细胞发生的。

可以采用P-19体外测定或者在小鼠水中毒体内测定，来检验重 组组织保护性细胞因子的组织保护特性，这两种测定在下面有更详 细地概述。以上测定仅作为实例，确定所述细胞因子对骨髓效应和 组织保护效应的其它合适测定是本领域普通技术人员已知的，也是 本发明所预期的。

在本发明一方面的实践中，可以通过在血管系统中提供足够水 平的组织保护性细胞因子的任何途径，将上述含有组织保护性细胞 因子的药用组合物给予哺乳动物，以允许转运穿越内皮细胞屏障并 对效应细胞有有益影响。当用于灌注组织或器官时，可得到类似结 果。在其中所述组织保护性细胞因子用于离体灌注的情况下，所述 组织保护性细胞因子可以是任何上述化学修饰的红细胞生成素。在 细胞或组织是非血管化和/或给药是通过用本发明组合物浸泡细胞或 组织的情况下，所述药用组合物提供对效应细胞有益的有效量的组 织保护性细胞因子。组织保护性细胞因子所穿越的内皮细胞屏障包 括紧密连接、穿孔(perforated)连接、穿通(fenestrated)连接和哺乳动物 体内存在的任何其它类型的内皮屏障。优选的屏障是内皮细胞紧密 连接，但本发明并不限于此。

上述组织保护性细胞因子通常用于以下人类疾病的治疗性治疗 和预防性治疗：主要具有神经病学症状或精神病学症状的中枢神经 系统疾病或周围神经系统疾病以及眼病、心血管疾病、心肺疾病、 呼吸道疾病、肾病、尿道疾病和生殖道疾病、骨病、皮肤病、胃肠 道疾病和内分泌异常和代谢异常。具体地讲，所述病症和疾病包括 低氧病症，所述病症对可兴奋组织有不利影响，所述可兴奋组织例 如在脑、心、视网膜/眼等中枢神经系统组织、周围神经系统组织或 心脏组织或视网膜组织中的可兴奋组织。因此，本发明可用于治疗 或预防由各种病症和情况的低氧病症引起的可兴奋组织的损害。所 述病症和情况的非限制性实例如下表所提供。

在按本发明可治疗的神经元组织病理病症保护的实例中，所述 病理病症包括由神经元组织氧合降低所导致的病症。可以通过本发 明的方法，治疗降低神经元组织的氧利用度而导致的应激、损伤并 最终导致神经元细胞死亡的任何病症。通常称为低氧和/或局部缺血 的这些病症是由以下疾病引起的或者包括但不限于以下疾病：中风、 血管闭塞、产前缺氧或产后缺氧、窒息(suffocation)、噎塞、近似淹 溺、一氧化碳中毒、烟雾吸入、包括外科手术和放疗在内的创伤、 窒息(asphyxia)、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺部疾病、肺气肿、成 人呼吸窘迫综合征、低血压休克、败血症性休克、过敏性休克、胰 岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、氮麻醉和心肺分 流手术所致神经缺陷。

在一个实施方案中，例如可以给予具体的组织保护性细胞因子 的组合物，以防止在例如肿瘤切除或动脉瘤切除等外科手术中损伤 或组织损伤风险所引起的损伤或组织损伤。可以通过本文所述方法 治疗的由低血糖引起或导致的其它病理病症包括胰岛素过量，也称 为医源性高胰岛素血症、胰岛瘤、生长激素缺乏、肾上腺皮质功能 减退、药物过量和某些肿瘤。

由可兴奋神经元组织损伤引起的其它病理病症包括癫痫，例如 癫痫、惊厥或慢性癫痫。其它可治疗病症和疾病包括例如中风、多 发性硬化、低血压、心搏停止、早老性痴呆、帕金森病、大脑麻痹、 脑创伤或脊髓创伤、艾滋病性痴呆、年龄相关认知功能减退、记忆 力减退、肌萎缩性侧索硬化、癫痫、醇中毒、视网膜缺血、由青光 眼导致的视神经损害和神经元损失。

本发明具体的组合物和方法可用于治疗由病症或各种创伤引起 的炎症，例如物理或化学诱发的炎症。所述创伤可包括脉管炎、慢 性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、 视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多 肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎和坏死性小肠结肠炎。

有证据表明，活化星形胶质细胞可以通过产生神经毒素对神经 元发挥细胞毒作用。神经胶质细胞响应脑缺血时可释放一氧化氮、 活性氧组分和细胞因子(参见Becker，K.J.2001.Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke(靶向局部缺血 性中风中的中枢神经系统炎症反应).Curr Opinion Neurol 14：349-353 和Mattson，M.P.，Culmsee，C.和Yu，Z.F.2000.Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke(中风中的细胞凋亡和抗凋亡机制). Cell Tissue Res 301：173-187.)。研究进一步表明，在神经变性模型中， 神经胶质的活化和随后产生炎性细胞因子取决于原发性神经元损伤 (参见Viviani，B.，Corsini，E.，Galli，C.L.，Padovani，A.，Ciusani，E.和 Marinovich，M.2000.Dying neural cells activate glia through the release of a protease product(濒死神经细胞通过释放蛋白酶产物激活神经胶 质).Glia 32：84-90和Rabuffetti，M.，Scioratti，C.，Tarozzo，G.，Clementi， E.，Manfredi，A.A.和Beltramo，M.2000)Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines(由Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲酮 引起的胱冬蛋白酶-1样活性的抑制包括在脑缺血中通过细胞凋亡的 降低和促炎性细胞因子的减少，长时间持续性神经保护).J Neurosci. 20：4398-4404)。炎症和神经胶质的活化对于包括脑缺血、脑创伤和 实验性变应性脑脊髓炎在内的神经变性性疾病的不同形式是常见 的，在这些疾病中红细胞生成素发挥神经保护效应。由红细胞生成 素引起的对细胞因子产生的抑制可以至少部分介导其保护效应。然 而，不同于直接抑制肿瘤坏死因子产生的诸如IL-10和IL-13等“经 典”抗炎细胞因子，红细胞生成素看来仅在存在神经元死亡时才有 活性。

虽然不希望受任何具体理论的束缚，但是似乎抗炎活性可以用 若干非限制性理论假设性地解释。首先，因为红细胞生成素阻止细 胞凋亡，所以将阻止由细胞凋亡触发的炎性事件。此外，红细胞生 成素可阻止濒死神经元释放分子信号，所述信号可刺激神经胶质细 胞或者可以直接作用于神经胶质细胞以降低它们对这些产物的反 应。另一个可能性是红细胞生成素靶向更接近而触发细胞凋亡和炎 症的炎症级联成员(例如胱冬蛋白酶1、活性氧或氮中间产物)。

此外，红细胞生成素似乎提供抗炎保护，而没有通常与其它抗 炎化合物例如地塞米松相关的弹回效应。而且，虽然不希望受任何 具体理论的束缚，但是这似乎是因为红细胞生成素对多目标神经毒 素例如一氧化氮(NO)的效应。尽管活化星形胶质细胞和小胶质细胞 在响应不同创伤时产生神经毒性量的NO，但是NO在机体内有许多 用途，包括必要的生理功能的调节。因此，尽管使用抗炎药可以通 过抑制NO或其它神经毒素来缓解炎症，如果抗炎药具有太长半寿 期，也会干扰导致炎症的由创伤引起的损伤恢复中的这些化学作用。 假设本发明的组织保护性细胞因子能缓解炎症而不干扰神经毒素例 如NO的恢复能力。

本发明提供包含一种或多种组织保护性细胞因子和一种或多种 不同于组织保护性细胞因子的预防剂或治疗剂(即活性剂)的组合物， 并且用于预防、治疗或缓解哺乳动物的一种或多种哺乳动物效应细 胞及其相关细胞、组织和器官的炎症的相关症状的方法，所述方法 包括给予所述哺乳动物一种或多种所述组合物。本发明还提供包含 一种或多种组织保护性细胞因子的组合物，和用于预防、治疗或缓 解哺乳动物的一种或多种哺乳动物效应细胞及其相关细胞、组织和 器官的炎症的相关症状的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物一 种或多种所述组合物，其中所述组合物与不同于组织保护性细胞因 子的一种或多种预防剂或治疗剂联合用药。所述炎症可以由损伤或 疾病引起，所述损伤和疾病例如但不限于哮喘、脑炎(encephilitis)、 炎性肠病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、关节炎或变应性疾病。治 疗剂或预防剂包括但不限于肽、多肽、融合蛋白、核酸分子、小分 子、模拟剂、合成药、无机分子和有机分子。已知可用于或已用于 或正在用于预防、治疗或缓解炎症相关的一种或多种症状的任何药 物都可与根据本发明所述组织保护性细胞因子联合使用。所述试剂 的实例包括但不限于用于皮疹和红肿的皮肤用制剂(例如光线疗法(即 紫外B辐射)、光化学疗法(例如PUVA)和局部用药物例如润滑药、 水杨酸、煤焦油、局部用类固醇、局部用皮质类固醇、局部用维生 素D3类似物(例如卡泊三烯)、他扎罗汀和局部用类视色素)、抗炎药 (例如皮质类固醇(例如泼尼松和氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇、 非甾体抗炎药(例如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸和COX-2抑制剂)、 β-激动剂、抗胆碱能药和甲基黄嘌呤)、免疫调节剂(例如有机小分子、 T细胞受体调节剂、细胞因子受体调节剂、T细胞排空剂(depleting agent)、细胞因子拮抗剂、单核因子拮抗剂、淋巴细胞抑制剂或抗癌 药)、金注射剂、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成药(例如血管抑制 素、TNF-α拮抗剂(例如抗TNFα抗体)和内皮生长抑素)、氨苯砜、补 骨脂素(例如甲氧沙林和三甲沙林)、抗疟药(例如羟氯喹)、抗病毒药 和抗生素(例如红霉素和青霉素)。

本领域技术人员众所周知的任何免疫调节剂都可用于本发明的 方法和组合物。免疫调节剂可影响患者的一个或多个或所有方面的 免疫应答。免疫应答方面包括但不限于炎症反应。在本发明的一个 优选的实施方案中，将免疫调节剂给予患者可抑制或降低该患者的 一个或多个方面的免疫应答能力。在本发明的一个具体实施方案中， 所述免疫调节剂抑制患者的炎症反应。在一个实施方案中，本发明 的组织保护性细胞因子与一种或多种免疫调节剂联合用药，以治疗 即缓解症状或预防炎症。

免疫调节剂的实例包括但不限于蛋白质性药物例如细胞因子、 肽模拟物和抗体(例如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、 多克隆抗体、Fv、ScFv、Fab或F(ab)2片段或表位结合片段)、核酸 分子(例如反义核酸分子和三股螺旋)、小分子、有机化合物和无机化 合物。具体地讲，免疫调节剂包括但不限于甲氨蝶呤、来氟米特、 环磷酰胺、环磷酰胺制剂、Immuran、环孢菌素A、二甲胺四环素、 硫唑嘌呤、抗生素(例如FK506(他克莫司))、甲泼尼龙(MP)、皮质类 固醇、类固醇、麦考酚酸吗乙酯、雷帕霉素(西罗莫司)、咪唑立宾、 脱氧精胍菌素、布喹那、丙二腈酰胺(例如leflunamide)、T细胞受体 调节剂和细胞因子受体调节剂。T细胞受体调节剂的实例包括但不限 于抗T细胞受体的抗体(例如抗CD4抗体(例如cM-T412(Boeringer)、 IDEC-CE9.1(IDEC和SKB)、mAB 4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a (Janssen-Cilag))、抗CD3抗体、抗CD5抗体(例如抗CD5蓖麻毒素 连接免疫缀合物)、抗CD7抗体(例如CHH-380(Novartis))、抗CD8 抗体、抗CD40配体单克隆抗体、抗CD52抗体(例如CAMPATH 1H (Ilex))、抗CD2单克隆抗体)和CTLA4-免疫球蛋白。

细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于可溶性细胞因子受体 (例如TNF-α受体或其片段的胞外结构域，IL-1β受体或其片段的胞外 结构域和IL-6受体或其片段的胞外结构域）、细胞因子或其片段(例如 白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和 GM-CSF)、抗细胞因子受体的抗体(例如抗IL-2受体的抗体、抗IL-4受 体的抗体、抗IL-6受体的抗体、抗IL-10受体的抗体和抗IL-12受体 的抗体)、抗细胞因子的抗体(例如抗IFN受体的抗体、抗TNF-α的抗 体、抗IL-1β的抗体、抗IL-6的抗体和抗IL-12的抗体)。在一个具体 的实施方案中，细胞因子受体调节剂是IL-4、IL-10或其片段。在另 一个实施方案中，细胞因子受体调节剂是抗IL-1β的抗体、抗IL-6的 抗体、抗IL-12受体的抗体、抗TNF-α的抗体。在另一个实施方案中， 细胞因子受体调节剂是TNF-α受体或其片段的胞外结构域。在某些 实施方案中，细胞因子受体调节剂不是TNF-α拮抗剂。

在一个优选的实施方案中，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽(包 括抗体)来源于与所述蛋白、多肽或肽受体相同的物种，以降低对这 些蛋白、多肽或肽免疫应答的可能性。在另一个优选的实施方案中， 当所述患者是人时，用作免疫调节剂的蛋白、多肽或肽是人蛋白、 人多肽或人肽，或者是人源化蛋白、人源化多肽或人源化肽。

根据本发明，在给予炎症患者本发明治疗剂和/或预防剂之前、 之后或同时给予一种或多种免疫调节剂。必要时，最好给予炎症患 者一种或多种免疫调节剂以降低或抑制一个或多个方面的免疫应 答。本领域技术人员众所周知的任何技术都可用于测定具体患者体 内一个或多个方面的免疫应答，从而确定何时有必要给予所述患者 免疫调节剂。

在一个优选的实施方案中，给予炎症患者一种或多种免疫调节 剂，以一过性降低或抑制一个或多个方面的免疫应答。一个或多个 方面免疫应答的一过性降低或抑制可以持续数小时、数天、数周或 数月。一个或多个方面免疫应答的一过性降低或抑制最好可持续数 小时(例如2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、14小时、16 小时、18小时、24小时、36小时或48小时)、数天(例如3天、4天、 5天、6天、7天或14天)或数周(例如3周、4周、5周或6周)。一 个或多个方面免疫应答的一过性降低或抑制增强组织保护性细胞因 子的预防和/或治疗能力。

在本发明的一个实施方案中，按照本发明的方法将降低或减少 T细胞、最好是记忆T细胞的免疫调节剂给予炎症患者。参见例如 美国专利第4,658,019号。在本发明的另一个实施方案中，按照本发 明的方法将钝化CD8+T细胞的免疫调节剂给予炎症患者。在一个具 体的实施方案中，抗CD8的抗体用于降低或减少CD8+T细胞。

CD40配体(CD40L)-CD40相互作用是希望阻断免疫应答的目 标，因为其在T辅助细胞活化和功能上的广泛活性以及在其信号传 导途径中不存在丰余现象。因此，在本发明一个具体的实施方案中， CD40L与CD40间相互作用在给予一种或多种所述免疫调节剂的时 候被瞬时阻断。这可以通过用阻断TH细胞上CD40配体并干扰T辅 助细胞上CD40配体与B细胞上CD40抗原的正常结合的药物进行治 疗来完成。可以根据本发明的方法来选择CD40配体的抗体(抗CD40L) (可得自Bristol-Myers Squibb Co；参见例如公布于1993年8月18日 的欧洲专利申请555,880)或可溶性CD40分子，并用作免疫调节剂。

可用于本发明免疫调节剂的其它实例包括但不限于皮质类固 醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素A、氢化可的松、FK506、 甲氨蝶呤、来氟米特和环磷酰胺。环磷酰胺的短疗程已证明能成功 阻断CD4+T细胞和CD8+T细胞对腺病毒衣壳蛋白的活化(Jooss等， 1996，Hum.Gene Ther.7：1555-1566)。氢化可的松或环孢菌素A治疗 已成功用于降低细胞因子的诱导，这其中有些可参与细菌感染和炎 症的清除。

可以按照本发明的方法将编码具有免疫调节活性的蛋白、多肽 或肽的核酸分子或具有免疫调节活性的蛋白、多肽或肽给予炎症患 者。此外，可以按照本发明的方法将编码具有免疫调节活性的蛋白、 多肽或肽的衍生物、类似物、片段或变异体的核酸分子或具有免疫 调节活性的蛋白、多肽或肽的衍生物、类似物、片段或变异体给予 炎症患者。所述衍生物、类似物、变异体和片段最好保留全长野生 型蛋白、多肽或肽的免疫调节活性。

可以通过本领域众所周知的技术或本文所述技术，产生可用作 免疫调节剂的蛋白、多肽或肽。参见例如Ausubel等(编著)，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第16章，John Wiley & Sons， NY，所述文献描述了产生蛋白、多肽或肽的方法，所述文献通过引 用全部结合到本文中。可以通过例如描述于美国专利第6,245,527号 和Harlow和Lane.Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988的方法，产生用作免疫 调节剂的抗体，所述文献通过引用全部结合到本文中。市售的和已 知用作免疫调节剂的试剂最好用于本发明的组合物和方法。可以通 过包括例如用于特定蛋白(例如共刺激分子和细胞因子)的CTL测定、 增殖测定和免疫测定(例如ELISA)在内的本领域技术人员众所周知的 技术，测定试剂在体外和/或体内的免疫调节活性。

本发明具体的组合物和方法可用于治疗视网膜组织的病症和损 害。所述疾病包括但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱落、 色素性视网膜炎、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网 膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压和糖尿病性视网膜病。

在另一个实施方案中，本发明的方法和原理可用于保护或治疗 可兴奋组织的辐射损伤引起的损害。本发明方法的进一步用途是用 于治疗诸如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中毒等神经毒素中毒以及 Guam病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病。

如上所述，本发明也涉及增强哺乳动物可兴奋组织功能的方法， 即通过外周给予上述组织保护性细胞因子。各种疾病和病症可以用 该方法进行治疗，而且该方法用于在无任何病症或疾病时增强认知 功能。本发明这些用途在下文中有更详细的描述，包括在人和非人 类哺乳动物学习和训练上的增强。

可以通过本发明该方面的方法治疗的病症和疾病涉及中枢神经 系统，所述病症和疾病包括但不限于心境障碍、焦虑症、抑郁症、 孤独症、注意力不集中的过度反应症和认知功能障碍。这些病症受 益于神经元功能的增强。根据本发明所述可治疗的其它障碍包括睡 眠中断，例如睡眠性呼吸暂停和旅行相关障碍；蛛网膜下出血和动 脉瘤出血、低血压休克、震荡损伤、败血症性休克、过敏性休克和 各种脑炎和脑膜炎后遗症，例如结缔组织病相关性脑炎(cerebritide)例 如狼疮。其它用途包括预防或保护作用，以免于诸如软骨藻酸蛤贝 中毒、山黧豆中毒等神经毒素中毒以及Guam病、肌萎缩性侧索硬化、 帕金森病；栓塞性损伤或局部缺血性损伤的术后治疗；全脑辐照； 镰状细胞危象；和惊厥。

可以用通过本发明的方法治疗的其它类型病症包括遗传性或获 得性线粒体功能障碍，所述障碍是以神经元损伤和死亡为典型特征 的各种神经病的原因。例如亚急性坏死性脑脊髓病(亚急性坏死性脑 病)的特征是进行性视觉损失和脑病，是因为神经元损失和肌病。在 这些病例中，缺陷型线粒体代谢不能供应足够高的能量底物，以给 可兴奋细胞代谢供给能量。红细胞生成素受体活性调节剂在各种线 粒体疾病中能使破坏的功能最佳化。如上所述，低氧病症对可兴奋 组织有不利影响。所述可兴奋组织包括但不限于中枢神经系统组织、 周围神经系统组织和心脏组织。除了上述病症之外，本发明的方法 用于治疗吸入性中毒例如吸入一氧化碳和烟雾、严重哮喘、成人呼 吸窘迫综合征和窒息和近似淹溺。产生低氧病症或通过其它方式诱 导可兴奋组织损伤的其它病症包括可发生在不合适剂量给予胰岛素 的低血糖或产生胰岛素的肿瘤(胰岛瘤)。

认为起源于可兴奋组织损伤的各种神经精神障碍可以通过本发 明方法治疗。其中涉及神经元损伤并用本发明治疗的慢性障碍包括 中枢神经系统和/或周围神经系统相关障碍，包括年龄相关认知功能 减退和老年性痴呆、慢性癫痫、早老性痴呆、帕金森病、痴呆、记 忆力减退、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、结节性硬化、Wilson 病、大脑麻痹和进行性核上麻痹、Guam病、雷维小体性痴呆(Lewy body dementia)、朊病毒病例如海绵样脑病例如传染性海绵样脑病、亨廷 顿舞蹈病(Huntington′s disease)、肌强直性营养不良、弗里德赖希共济 失调(Freidrich ataxia)和其它共济失调以及图雷特综合征(Gilles de la Tourettle′s disease)、癫痫例如癫痫和慢性癫痫、中风、脑创伤或脊髓 创伤、艾滋病性痴呆、醇中毒、孤独症、视网膜缺血、青光眼、自 主功能障碍例如高血压和睡眠障碍，以及包括但不限于如下精神病 学障碍：精神分裂症、分裂情感障碍、注意力不集中、情绪恶劣性 障碍、重型忧郁性障碍、躁狂症、强迫性神经失调、精神作用药物 使用障碍、焦虑症、惊恐性障碍以及单相性和双相性情感障碍。其 它神经精神障碍和神经变性性疾病包括例如美国精神病学协会 (American Psychiatric Association)的精神障碍(DSM)诊断和统计手册 中列出的障碍，所述文献的最新版本IV通过引用全部结合到本文中。

在另一个实施方案中，包含红细胞生成素的重组嵌合毒素分子 可用于治疗性给予毒素，以治疗增生性疾病例如癌症，或病毒性疾 病例如亚急性硬化性全脑炎。

下表列出作为可以通过上述组织保护性细胞因子治疗的各种病 症和疾病的额外的示例性、非限制性适应征。   细胞、组织   或器官   功能障碍或病理学   病症或疾病   类型   心脏   局部缺血   冠状动脉疾病   急性、慢性   稳定、不稳定   心肌梗塞   心肌梗塞后综合征   心绞痛   先天性心脏病   瓣膜性心肌病   变异型心绞痛   心脏破裂   动脉瘤性隔膜穿孔   脉管炎   心律失常   快速心律失常、缓慢   心律失常、前室心室   传导异常   稳定、不稳定、超敏性   颈动脉窦房结   充血性心力衰竭   左心室、右心室、双   心室收缩、舒张   心肌病，例如特发性、   家族性、感染性、代谢   性、贮积性疾病、缺陷、   结缔组织障碍、浸润和   肉芽肿、神经血管性   心肌炎   自身免疫，感染性、特   发性   肺源性心脏病   钝器创伤和穿透性创伤   毒素   可卡因毒性   血管   高血压   原发性、继发性   减压病   纤维肌性增生   动脉瘤   分割性、破裂、扩张   肺   阻塞性   哮喘、慢性支气管炎、   肺气肿和气道阻塞   缺血性肺病   肺栓塞、肺血栓形成、   脂肪栓塞   环境性肺病   缺血性肺病   肺栓塞、肺血栓形成、   间质性肺病   特发性肺纤维化   先天性   囊性纤维化   肺源性心脏病   创伤   肺炎和pneumonitides   感染性、寄生虫性、   毒素性、创伤性、烧   伤性、吸入性   结节病   胰腺   内分泌   I型和II型糖尿病   β细胞衰竭，功能障   碍、糖尿病性神经病   胰腺其它内分泌细胞   衰竭   外分泌   外分泌胰腺衰竭   胰腺炎   骨   骨质减少   原发性、继发性   性腺机能减退、固定、   绝经后、年龄相关甲状   旁腺功能亢进、甲状腺   功能亢进、钙、镁、磷   和/或维生素D缺乏   骨髓炎   无血管性坏死   创伤   佩吉特病(Paget′s disease)   皮肤   脱发   簇脱、全脱   原发性、继发性男性秃   头   白癜风   局部性、全身性   原发性、继发性   糖尿病性溃疡   外周血管病   烧伤   自身免疫病   红斑狼疮、斯耶格伦综合   征、类风湿性关节炎、肾   小球性肾炎、脉管炎   朗氏组织细胞增多症   眼   视神经炎   钝器伤和穿透伤、感染、   肉样瘤、镰状细胞病、视   网膜脱落、   颞动脉炎   视网膜缺血，黄斑变性，   视网膜脱离、色素性视网   膜炎、动脉硬化性视网膜   病、高血压性视网膜病、   视网膜动脉阻塞、视网膜   静脉阻塞、低血压和糖尿   病性视网膜病   胚胎和胎儿   病   窒息   局部缺血   CNS   慢性疲劳综合征、急性和   慢性低渗状态综合征和高   渗状态综合征、艾滋病性   痴呆、触电   脑炎   狂犬病性、疱疹性   脑膜炎   硬膜下血肿   尼古丁瘾   药物滥用和戒断综合征   可卡因、海洛因、碱   化可卡因、大麻、   LSD、PCP、多药滥   用、摇头丸、阿片类、   镇静催眠药、苯丙   胺、咖啡因   强迫性神经失调   脊髓狭窄、横贯性脊髓   炎、急性热病性多神经   炎、创伤、神经根压迫、   肿瘤压迫、中暑   耳鼻喉   耳鸣   Meuniere综合征、听力   损失   创伤性损伤、耳气压伤   肾脏  肾衰竭  急性、慢性   血管/局部缺血性、间质   病、糖尿病性肾病、肾   病综合征、感染、损伤、   影像诱发的、化疗诱发   的、CPB诱发的或预防   药性的  亨诺赫-舍恩莱因紫癜  (Henoch S.Prupura)   横纹肌  自身免疫病  重症肌无力、  皮肌炎、多肌炎  肌病  遗传代谢性、内分泌  性和毒素性  中暑  挤压伤  横纹肌溶解  线粒体病  感染  坏死性筋膜炎   性功能障碍  中枢和外周(例如勃起功能  障碍)  药物继发性阳痿、(糖  尿病)   肝脏  肝炎  病毒性、细菌性、寄  生虫性  缺血性疾病  硬化、脂肪肝  浸润/代谢病   胃肠  缺血性肠病  炎性肠病  坏死性小肠结肠炎   器官移植  对供体和受体的处理   生殖道  不育  血管性、自身免疫、  子宫异常、植入障碍   内分泌  腺体功能亢进和功能减退

如上所述，这些疾病、障碍或病症仅仅是说明本发明组织保护 性细胞因子提供益处的范围。因此，本发明总的来讲提供对由机械 创伤或人类疾病导致的结果的治疗性治疗或预防性治疗。优选用于 CNS和/或周围神经系统的疾病、障碍或病症的治疗性治疗或预防性 治疗。提供用于具有精神病学问题的疾病、障碍或病症的治疗性治 疗或预防性治疗。提供用于包括但不限于以下疾病、障碍或病症的 治疗性治疗或预防性治疗：眼病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸道 疾病、肾病、尿道疾病和生殖道疾病、胃肠道疾病、内分泌异常和 代谢异常。

本领域技术人员知道，本发明的药用组合物可由本发明的组织 保护性细胞因子的混合物以及红细胞生成素来制备。

在一个实施方案中，可以系统给予红细胞生成素或组织保护性 细胞因子的药用组合物，以保护或增强靶细胞、组织或器官。所述 给药可以经胃肠外、通过吸入或经粘膜给药，例如口服、经鼻腔、 直肠、阴道内、舌下、粘膜下或经皮。给药最好是经胃肠外，例如 通过静脉内或腹膜内注射，并且也包括但不限于动脉内、肌内、皮 内和皮下给药。

对于例如通过使用灌注液、注射到器官或其它局部给药途径等 其它给药途径，将提供导致如上所述组织保护性细胞因子的相似水 平的药用组合物。优选水平约为15pM-30nM。

本发明的药用组合物可以包含治疗有效量的化合物和药学上可 接受的载体。在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是 指由联邦政府或州政府管理部门批准的，或者列入美国药典或其它 公认外国药典可用于动物、尤其是人。术语“载体”是指用于给予治 疗剂的稀释剂、辅料、赋形剂或溶媒。所述药用载体可以是无菌液 体，例如盐水溶液和包括石油、动物、植物或合成来源在内的油， 例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药用组合物经静脉内 给药时，优选盐水溶液作为载体。盐水溶液和葡萄糖水和甘油溶液 也可用作液体载体，尤其用于注射液。合适的药用赋形剂包括淀粉、 葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、大米、面粉、白垩、硅胶、 硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、 丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可以含有有少量润 湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可呈以下形式：溶液剂、混 悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等。所述组合 物可与传统粘合剂和载体例如甘油三酯一起配制成栓剂。本发明的 化合物可配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离 氨基形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的 盐；和与游离羧基形成的盐，例如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢 氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组 氨酸、普鲁卡因等的盐。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin 的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。所述组合物可含有治疗有 效量的化合物，最好以纯形式，并与适量的载体一起，以便提供适 合给予患者的形式。所述制剂应适合给药模式。

适于口服给药的药用组合物可以为胶囊剂或片剂；粉剂或颗粒 剂；溶液剂、糖浆剂或混悬剂(在水或非水液体中)；食用泡沫剂或搅 打剂(whip)；或乳剂。片剂或硬明胶胶囊剂可以包含乳糖、淀粉或其 衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软 明胶胶囊剂可以包含植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。 溶液剂和糖浆剂可以包含水、多元醇和糖。

预期用于口服给药的活性剂可以用延迟该活性剂在胃肠道内崩 解和/或吸收的材料包衣或与所述材料混合(例如可使用甘油单硬脂酸 酯或甘油二硬脂酸酯)。因此，活性剂的持续释放可达到数小时，而 且必要时可保护所述活性剂避免在胃中被降解。可配制供口服给药 的药用组合物，以使活性剂因规定pH或酶解条件而在特定胃肠道部 位释放。

适于经皮给药的药用组合物可以是预期保持与受体表皮长时间 密切接触分散的贴剂。适于局部给药的药用组合物可以是软膏剂、 乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、 气溶胶或油剂。对于皮肤、口腔、眼或其它外部组织的局部给药， 最好采用局部用软膏剂或乳膏剂。当配制成软膏剂时，活性成分可 以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可与水包 油基质或油包水基质一起配制在乳膏剂中。适于眼局部给药的药用 组合物包括滴眼剂。在这些组合物中，活性成分可溶于或悬浮于合 适载体例如水性溶剂中。适于口腔局部给药的药用组合物包括糖锭 剂、软锭剂和漱口剂。

适于鼻腔和肺部给药的药用组合物可以包含例如粉剂(最好粒径 范围为20-500微米)等固体载体。粉剂可以吸入(例如通过将盛装粉 剂的容器靠近鼻子而快速吸入鼻腔的方式)给药。或者，适于鼻腔给 药的组合物可以包含液体载体，例如鼻腔喷雾剂或滴鼻剂。或者， 可以通过深部吸入或通过通向咽部的口腔装置，给予直接吸入肺部 的化合物。这些组合物可以包含活性成分的水性溶液剂或油性溶液 剂。用于吸入给药的组合物可以以特殊合适的装置来提供，所述装 置包括但不限于加压的气溶胶、喷雾器或吹药器，可以生产所述装 置，以便提供预先确定的活性成分剂量。在一个优选的实施方案中， 通过鼻腔或咽部将本发明的药用组合物直接给予鼻腔或肺部。

适于直肠给药的药用组合物可以是栓剂或灌肠剂。适于阴道给 药的药用组合物可以是阴道栓剂、棉球、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、 泡沫剂或喷雾制剂。

适于胃肠外给药的药用组合物包括可含有抗氧化剂、缓冲剂、 抑菌剂以及赋予所述组合物与预期受体血液基本等渗的溶质的水性 和非水性无菌注射溶液剂或混悬剂。所述组合物中可具有的其它成 分包括例如水、醇类、多元醇、甘油和植物油。适于胃肠外给药的 组合物可以呈单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶，并且 可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，只需要在临用前加入无菌液体 载体例如注射用无菌盐溶液即可。临配的注射用溶液剂和混悬剂可 从无菌粉针剂、粒剂和片剂制备。在一个实施方案中，可提供用于 救护车、急诊室和战场情况下紧急使用的包含红细胞生成素注射液 的自动注射器，甚至还可用于在家中自我给药、特别是在可能发生 创伤性切断例如割草机使用不慎的情况下。通过尽快(甚至在医务人 员到达现场之前，或者脚趾被切断的伤者到达急诊室之前)在切断部 位多位点给予红细胞生成素或组织保护性细胞因子，当切断的脚或 脚趾被复植后，其细胞或组织存活的可能性会提高。

在一个优选的实施方案中，所述组合物按照常规方法配制成适 于静脉内给予人类的药用组合物。通常用于静脉内给药的组合物是 溶于无菌等渗水性缓冲剂中的溶液剂。如有必要，所述组合物也可 包括增溶剂和局部麻醉药例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。 通常，所述组分可单独或在单位剂型中混合提供，例如在指示活性 剂数量的密封容器例如安瓿或小药囊中的冻干粉剂或无水浓缩剂。 当经输注给予所述组合物时，它可用含有无菌药用级水或盐水的输 液瓶分散。当经注射给予所述组合物时，可提供无菌盐水的安瓿以 便所述组分在给药前可以混合。

栓剂通常含有范围在0.5％(重量)至10％(重量)的活性成分；口 服制剂最好含有10％至95％的活性成分。

可提供用于移植器官浸泡、原位灌注或在收获器官之前给予器 官供体血管的灌注液组合物。所述药用组合物可以包含不适用于急 性或慢性、局部或系统给予个体的红细胞生成素、组织保护性细胞 因子或者这两者之一的水平，但所述红细胞生成素、组织保护性细 胞因子、或者这两者之一的水平可以在消除或降低其中所含红细胞 生成素的水平之前、在将经处理的器官或组织暴露或回输正常循环 之前，在尸体、器官浸泡液、器官灌注液或原位灌注液中发挥本文 预期作用。用于本发明这一方面的红细胞生成素可以是任何红细胞 生成素，例如天然存在的形式例如人红细胞生成素，或以上所述的 任何组织保护性细胞因子，例如脱唾液酸红细胞生成素和苯基乙二 醛-红细胞生成素，作为非限制性实例。

本发明提供用于治疗、预防和缓解炎症相关的一种或多种症状 的药用组合物。在一个具体的实施方案中，组合物包含一种或多种 组织保护性细胞因子。在另一个实施方案中，组合物包含一种或多 种组织保护性细胞因子和不同于组织保护性细胞因子的一种或多种 预防剂或治疗剂，所述预防剂或治疗剂已知将用于或已用于或正在 用于预防、治疗或缓解炎症相关的一种或多种症状。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是药用组合物。所 述组合物包含预防有效量或治疗有效量的一种或多种预防剂或治疗 剂(例如组织保护性细胞因子或其它预防剂或治疗剂)，以及药学上可 接受的载体。在一个实施方案中，术语“治疗有效量”意指包括制剂 当单独给药时不一定有效、但当与另一种制剂联合用药时有效的量。

本发明也提供一种包含装有一种或多种本发明药用组合物的组 分的一个或多个容器的药物包装或药盒。所述容器任选带有政府部 门对药物或生物制品的生产、使用或销售要求的规定形式的通知， 所述通知反映了对人类给药的生产、使用或销售的批准。

具体地讲，本发明提供一种或多种本发明的预防剂或治疗剂或 药用组合物是包装在标明所述制剂数量的密封容器例如安瓿或小药 囊中。在一个实施方案中，一种或多种本发明的预防剂或治疗剂或 药用组合物是以密封容器中无菌冻干粉剂或无水浓缩剂的形式提 供，并且可以用例如水或盐水重建成用于给予患者的合适浓度。一 种或多种本发明的预防剂或治疗剂或药用组合物最好是以密封容器 中无菌冻干散剂、以至少5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至 少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg或至 少100mg的单位剂量提供。冻干的本发明预防剂或治疗剂或药用组 合物应在其原有容器中贮存于2-8℃，而且本发明预防剂或治疗剂或 药用组合物应在恢复后的1周内、最好5天内、72小时内、48小时 内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内或1小时 内给药。在一个替代实施方案中，一种或多种本发明的预防剂或治 疗剂或药用组合物在标明制剂数量和浓度的密封容器中以液体形式 提供。给药组合物的液体形式在密封容器中提供优选至少0.25 mg/ml、更优选至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少 5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、 至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。所述液体形式应 在其原有容器中贮存于2-8℃。

所述组合物如需要的话，可以是含有含所述活性成分的一种或 多种单位剂型的包装或分配器装置形式。所述包装可包括例如金属 箔或塑料箔例如泡眼包装。所述包装或分散装置可以附带给药指南。

通常，本发明组合物的组分来自与所述组合物的受体相同物种 来源或相同种属反应的受试者。因此，在一个优选的实施方案中， 将人抗体或人源化抗体给予人以用于治疗或预防。

在另一个实施方案中，例如可在控释系统中给予组织保护性细 胞因子。例如可采用静脉内输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质 体或其它给药方式给予所述多肽。在一个实施方案中，可使用泵(参 见Langer，参见上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201； Buchwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med. 321：574)。在另一个实施方案中，可在载体、尤其是脂质体中给予所 述化合物(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez- Berestein和Fidler(编著)，Liss，New York，第353-365页(1989)；WO 91/04014；美国专利第4,704,355号；LopezBerestein，出处同上，第 317-327页；一般参见出处同上)。在另一个实施方案中，可使用聚合 材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和 Wise(编著)，CRC Press：Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball (编著)，Wiley：New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci. Rev.Macromol.Chem.23：61，1953；另参Levy等，1985，Science 228： 190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J. Neurosurg.71：105)。

在又一个实施方案中，控释系统可放置在治疗靶例如靶细胞、 组织或器官的附近，因此只需要系统给药量的一小部分(参见例如 Goodson，载于Medical Applications of Controlled Release，第2卷，第 115-138页，参见上文，1984)。有关其它控释系统的综述可参见Langer (1990，Science 249：1527-1533)。

在另一个实施方案中，可以经鼻腔、口服、直肠、阴道或舌下 给药，给予适当配制的组织保护性细胞因子。

在一个具体的实施方案中，希望向需要治疗的部位局部给予本 发明的红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子；这可以例如但不限 于通过手术中局部输注、局部应用例如与手术后伤口敷剂一起使用、 通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来完成，所述植入物 是多孔、无孔或明胶类材料，包括诸如硅橡胶膜等在内的膜或纤维。

技术人员将根据本领域普通技术人员已知的若干因素，容易地 确定优选有效剂量的选择。所述因素包括红细胞生成素或组织保护 性细胞因子的具体形式及其生物利用度、代谢、半寿期等药物动力 学参数，这些参数在通常用于获得药用化合物法定批准的常规开发 程序中已经建立。在考虑剂量时的其它因素包括待治疗病症或疾病 或在正常个体中想获得的益处、患者体重、给药途径(不管给药是急 性还是慢性的)、同时给予的药物和影响所给药物功效的众所周知的 其它因素。因此精确剂量将根据医生的判断和每个患者的情况来决 定，例如根据每个患者的病症和免疫状态，并根据标准临床技术。

在本发明的另一方面，提供用于移植器官的灌注和保存的灌注 液或灌注用溶液，所述灌注液包括保护效应细胞和相关细胞、组织 或器官有效量的红细胞生成素或组织保护性细胞因子。移植包括但 不限于异体移植和自体移植，所述异体移植也就是从供体收获器官(包 括细胞、组织或其它机体部分)并移植到不同受体中；所述自体移植 也就是器官从机体的一部分取出并取代另一部分，包括其中器官被 取出、离体、切除、修补或进行其它操作例如肿瘤切除、然后放回 原先位置的离体外科手术。在一个实施方案中，所述灌注液是威斯 康星大学(UW)溶液(美国专利第4,798,824号)，所述溶液含有约1U/ml 至约25U/ml红细胞生成素、5％羟乙基淀粉(分子量为约200,000至 约300,000，并且基本上不含乙二醇、2-氯乙醇、氯化钠和丙酮)；25mM KH2PO4；3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES 缓冲液；5mM葡萄糖酸镁；1.5mM CaCl2；105mM葡萄糖酸钠；200,000 单位青霉素；40单位胰岛素；16mg地塞米松；12mg酚红；并且pH 为7.4-7.5和摩尔渗透压浓度约为320mOsm/l。所述溶液用于在移植 前维持尸体的肾脏和胰脏。使用所述溶液，保存期可延长超过推荐 用于尸体肾脏保存的30小时的极限。该具体的灌注液仅仅用来说明 包含有效量的红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子的大量的溶液 可适于目前的使用。在另一个实施方案中，所述灌注液含有约1ng/ml 至约500ng/ml红细胞生成素，或约40ng/ml至约320ng/ml红细胞 生成素。如上所述，在本发明的该方面，可以使用任何形式的红细 胞生成素或组织保护性细胞因子。

虽然用于本文目的的组织保护性细胞因子的优选受体是人，但 是本文的方法可同样应用于其它哺乳动物、尤其是驯养动物、家畜、 陪伴动物和动物园动物。然而，本发明并不限于此，其益处可应用 于任何哺乳动物。

在本发明的另一个离体的方面，例如但不限于上述红细胞生成 素和任何组织保护性细胞因子都可以使用。

在本发明的另一方面，提供用于增强没有因内皮细胞屏障而与 血管系统隔离的细胞、组织或器官活力的方法和组合物，即通过将 所述细胞、组织或器官直接接触包含红细胞生成素或组织保护性细 胞因子的药用组合物，或者将包含红细胞生成素或组织保护性细胞 因子的药用组合物给予或接触所述细胞、组织或器官的血管系统。 在被处理组织或器官中效应细胞增强的活性是积极效应发挥作用的 原因。

如上所述，本发明部分基于以下发现：红细胞生成素分子可以 从具有内皮细胞紧密连接器官的毛细血管的内皮细胞管腔表面转运 到基底膜表面，所述内皮细胞紧密连接包括例如脑、视网膜和睾丸。 因此，穿越屏障的效应细胞是易受红细胞生成素或组织保护性细胞 因子的有益影响的靶，而含有效应细胞和全部或部分依赖效应细胞 的其它细胞类型或组织或器官也是本发明方法的靶。虽然不希望受 任何具体理论的束缚，但是在红细胞生成素或组织保护性细胞因子 的胞转作用后，红细胞生成素或组织保护性细胞因子可以与如下效 应细胞上的红细胞生成素受体相互作用：例如，神经元细胞、视网 膜细胞、肌细胞、心细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、 肾上腺皮质细胞、肾上腺髓质细胞、毛细血管内皮细胞、睾丸细胞、 卵巢细胞或子宫内膜细胞，并且受体结合可以启动信号转导级联， 导致所述效应细胞或组织内基因表达程序的激活，导致保护所述细 胞或组织或器官免遭例如毒素、化疗药、放疗、低氧等损伤。因此， 在下文中详细描述了用于保护含效应细胞的组织免遭损伤或低氧应 激反应并增强所述组织功能的方法。

在本发明一个实施方案的实践中，哺乳动物患者经历了用于治 疗癌症的全身化疗，包括通常具有神经损害、肺损伤、心脏损伤、 卵巢损伤或睾丸损伤等副作用的放疗。在化疗和/或放疗之前和同时 给予包含上述红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子的药用组合 物，以保护各种组织和器官免遭化疗药的损伤，例如保护睾丸。治 疗可持续到化疗药在循环中的水平降至对哺乳动物机体产生潜在危 险的水平之下。

在本发明的另一个实施方案的实践中，计划从车祸的受害者收 获各种器官用于移植给多个受体，这其中有些需要长距离和长时间 的运输。在收获器官之前，用包含如本文所述的红细胞生成素和/或 组织保护性细胞因子的药用组合物输注受害者。用于运输的收获的 器官用含有如本文所述的红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子的 灌注液灌注，并贮存在包含红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子 的浸泡液中。某些器官用脉冲式灌注设备、用含有根据本发明的红 细胞生成素和/或组织保护性细胞因子的灌注液持续灌注。在运输和 移植和器官原位再灌注过程中，器官功能发生最小限度的退化。

在本发明的另一个实施方案中，恢补心脏瓣膜的外科手术需要 暂时的心麻痹和动脉闭塞。术前给患者输注组织保护性细胞因子即 每公斤体重4μg氨甲酰化脱唾液酸红细胞生成素。所述治疗预防含 氧量低的局部缺血性细胞损伤、尤其是在再灌注后。

在本发明的另一个实施方案中，在任何外科手术例如心肺分流 术中，可使用本发明的天然存在的红细胞生成素或组织保护性细胞 因子。在一个实施方案中，在分流术之前、期间和/或之后，给予包 含上述红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子的药用组合物，以保 护脑、心脏和其它器官的功能。

在其中本发明天然存在的红细胞生成素和/或组织保护性细胞因 子用于离体应用、或处理效应细胞例如神经元组织、视网膜组织、 心细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、小肠细胞、肾上腺皮质细胞、 肾上腺髓质细胞、毛细血管内皮细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或子宫 内膜细胞或组织的上述实例中，本发明提供这样一种药用组合物， 其剂量单位形式适用于保护或增强离开血管系统的效应细胞、组织 或器官，所述组合物包含剂量范围约为1pg-5mg、500pg-5mg、1ng-5 mg、500ng-5mg、1μg-5mg、500μg-5mg或1mg-5mg的组织保护 性细胞因子，以及药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中， 所述组织保护性细胞因子的量在约1pg-1mg范围内。在一个优选的 实施方案中，所述制剂含有非红细胞发生的组织保护性细胞因子。

在本发明的另一方面，发现给予经历脑创伤的动物组织保护性 细胞因子能恢复认知功能。延迟或者5天或者30天后，与安慰剂治 疗动物相比，给予红细胞生成素仍能恢复功能，这表明红细胞生成 素再生或恢复脑活动的能力。因此，本发明也涉及红细胞生成素和/ 或组织保护性细胞因子在制备用于治疗脑创伤(包括在损伤后很久例 如3天、5天、1周、1月或更长时间的治疗)和其它认知功能障碍的 药用组合物中的用途。本发明也涉及用于在损伤后通过给予有效量 的红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子治疗认知功能障碍的方 法。如本文所述的任何红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子可用 于本发明的这一方面。

此外，本发明的这一恢复方面涉及本文的任何红细胞生成素和/ 或组织保护性细胞因子在制备用于恢复细胞、组织或器官功能障碍 的药用组合物中的用途，其中在导致所述功能障碍的最初伤害之后 开始治疗和之后很久开始治疗。此外，用本发明的红细胞生成素和/ 或组织保护性细胞因子进行治疗可以在急性期以及慢性期跨过疾病 或病症的病程中。

在其中本发明红细胞生成素具有红细胞生成活性的情况下，在 一个优选的实施方案中，红细胞生成素每次给药可以以介于约1μg 和约100μg/kg体重之间、最好约5-50μg/kg体重、最优选约10-30 μg/kg体重的剂量系统给药。在给予红细胞生成素后，该有效剂量应 足以达到血清中大于约10,000mU/ml、15,000mU/ml或20,000mU/ml (80ng/ml、120ng/ml或160ng/ml)的红细胞生成素的血清水平。所述 血清水平在给药后约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小 时、7小时、8小时、9小时或10小时可以达到。如有必要，所述给 药可以重复。例如，只要临床需要，可以每天重复给药，或者在合 适间隔后重复给药，例如每1-12周、最好每1-3周。在一个实施方 案中，有效量的红细胞生成素和药学上可接受的载体可以包装成单 剂量小瓶或其它容器。在另一个实施方案中，使用能发挥其活性、 但不引起血红蛋白浓度或血细胞比容增加的组织保护性细胞因子。 在其中预期长期提供本发明的方法的情况下，优选所述组织保护性 细胞因子。在另一个实施方案中，以大于最大刺激红细胞发生所需 剂量给予红细胞生成素。如上所述，本发明的组织保护性细胞因子 不一定具有红细胞生成活性，因此以上用造血单位表示的剂量对红 细胞发生的红细胞生成素来说仅仅是示例性的；在上文中，提供用 于组织保护性细胞因子的剂量相当的重量。

在一个实施方案中，可以通过标准临床技术，确定本发明组合 物在预防、治疗或缓解炎症相关的一种或多种症状中的有效量。在 制剂中使用的精确剂量也可根据给药途径、病症的严重程度，并应 根据医生的判断和每个哺乳动物的情况来确定。可以从体外或动物 模型试验系统的剂量反应曲线外推有效剂量。

在一个具体的实施方案中，用于给予哺乳动物以预防、治疗或 缓解炎症相关的一种或多种症状的本发明组合物或预防剂或治疗剂 的剂量按哺乳动物每公斤体重为150μg/kg或以下、优选125μg/kg 或以下、100μg/kg或以下、95μg/kg或以下、90μg/kg或以下、85μg/kg 或以下、80μg/kg或以下、75μg/kg或以下、70μg/kg或以下、65μg/kg 或以下、60μg/kg或以下、55μg/kg或以下、50μg/kg或以下、45μg/kg 或以下、40μg/kg或以下、35μg/kg或以下、30μg/kg或以下、25μg/kg 或以下、20μg/kg或以下、15μg/kg或以下、10μg/kg或以下、5μg/kg 或以下、2.5μg/kg或以下、2μg/kg或以下、1.5μg/kg或以下、1μg/kg 或以下、0.5μg/kg或以下或0.5μg/kg或以下。在另一个实施方案中， 用于给予哺乳动物以预防、治疗或缓解炎症相关的一种或多种症状 的本发明组合物或预防剂或治疗剂的剂量是0.1mg-20mg、0.1mg-15 mg、0.1mg-12mg、0.1mg-10mg、0.1mg-8mg、0.1mg-7mg、0.1mg-5 mg、0.1-2.5mg、0.25mg-20mg、0.25-15mg、0.25-12mg、0.25-10mg、 0.25-8mg、0.25-7mg、0.25mg-5mg、0.5mg-2.5mg、1mg-20mg、 1mg-15mg、1mg-12mg、1mg-10mg、1mg-8mg、1mg-7mg、1mg-5 mg或1mg-2.5mg的单位剂量。

在又一个实施方案中，给予患者一剂或多剂的预防或治疗有效 量的一种或多种免疫调节剂，其中给予所述患者预防或治疗有效量 的所述药物的剂量在所述患者体内达到平均绝对淋巴细胞计数约为 500细胞/mm3至低于1500细胞/mm3，优选低于1400细胞/mm3、低 于1300细胞/mm3、低于1250细胞/mm3、低于1200细胞/mm3、低于 1100细胞/mm3或低于1000细胞/mm3。

本发明还涉及用于促进哺乳动物体内的分子转运穿越内皮细胞 屏障的方法，即通过给予包含与上文所述红细胞生成素或组织保护 性细胞因子缔合的特定分子的组合物。如上所述，机体的某些器官 中内皮细胞间紧密连接对某些分子的进入产生屏障。对于在屏障器 官内各种病症的治疗，需要促进药用制剂穿越的手段。本发明的红 细胞生成素或组织保护性细胞因子用作载体，用于传递其它分子穿 越血-脑屏障或其它类似屏障。制备包含希望穿越屏障的分子以及红 细胞生成素或组织保护性细胞因子的组合物，并将所述组合物外周 给药，导致所述组合物通过胞转作用穿越屏障。待转运以穿越屏障 的分子和红细胞生成素或组织保护性细胞因子之间的缔合可以是不 稳定的共价键，在这种情况下当穿越屏障后所述分子从与红细胞生 成素或组织保护性细胞因子的缔合中被释放出来。如果所述分子与 红细胞生成素和/或组织保护性细胞因子间的缔合仍能保持或不影响 所述分子所需药理学活性的话，可以给予所述复合物。

技术人员知道用于将分子与本发明的红细胞生成素或组织保护 性细胞因子和上述其它药物缔合的各种方式，即通过共价、非共价 和其它方式。此外，在实验系统中可容易地进行所述化合物功效的 评价。可以通过包括不稳定的、共价结合、交联等在内的各种方式 达到分子与红细胞生成素或组织保护性细胞因子的缔合。可使用生 物素/抗生物素蛋白的相互作用；例如，本发明的生物素化红细胞生 成素可以与抗生物素蛋白和希望转运的分子的不稳定缀合物复合。 如上所述，可以通过重组或合成方式制备杂种分子，例如包含具有 所需药理学活性的分子的结构域和负责红细胞生成素受体活性调节 的结构域的融合多肽或嵌合多肽。在所述分子内可以包含蛋白酶切 割位点。

一个分子可以通过多官能分子即多官能交联剂与本发明的红细 胞生成素或组织保护性细胞因子缀合。本文所用的术语“多官能分 子”包括具有能不止一次连续反应的官能团的分子例如甲醛，以及具 有不止一个活性基团的分子。本文所用的术语“活性基团”是指交联 剂上与分子(例如有待穿越内皮细胞屏障而传递的肽、蛋白、糖、核 酸、尤其是激素抗生素或抗癌药)上的官能团反应形成交联剂和所述 分子间共价键的官能团。术语“官能团”保留其在有机化学中的标准 含义。可以使用的所述多官能分子最好是生物相容性连接剂，即它 们在体内是非致癌的、无毒的和基本上没有免疫原性的。在动物模 型中可以容易地检测例如本领域已知的和在本文中描述的多官能交 联剂，以确定它们的生物相容性。所述多官能分子最好是双官能的。 本文所用的术语“双官能分子”是指具有两个活性基团的分子。所述 双官能分子可以是异型双官能分子或同型双官能分子。异型双官能 交联剂允许矢量结合。特别优选多官能分子在水中具有足够溶解性， 因为交联反应发生在水溶液例如pH6-8的缓冲水溶液中，而且为了 更有效的生物分布，所得缀合物保持水溶性。通常，多官能分子与 氨基或巯基官能团共价键合。然而，与其它官能团例如羧酸或羟基 反应的多官能分子也包括在本发明中。

同型双官能分子具有至少两个相同的活性官能团。同型双官能 分子上的活性官能团包括例如醛基和活性酯基团。具有醛基的同型 双官能分子包括例如戊二醛和subaraldehyde。戊二醛作为交联剂的 应用公开于Poznansky等，Science 223，1304-1306(1984)。具有至少两 个活性酯单元的同型双官能分子包括二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的 酯。N-琥珀酰亚胺酯的一些实例包括二琥珀酰亚胺基辛二酸二琥珀 酰亚胺酯和二硫代-双-(琥珀酰亚胺基丙酸酯)及其可溶性双磺酸和双 磺酸盐例如它们的钠盐或钾盐。这些同型双官能试剂可得自Pierce、 Rockford、Illinois。

异型双官能分子具有至少两个不同的活性基团。所述活性基团 与不同官能团(例如红细胞生成素和所述分子上存在的基团)反应。与 异型双官能交联剂上活性基团反应的这两个不同官能团通常是氨 基，例如赖氨酸的ε氨基；巯基，例如半胱氨酸的巯基；羧酸例如天 冬氨酸上的羧酸酯基；或羟基例如丝氨酸上的羟基。

当然，本发明的各种组织保护性细胞因子中的某些细胞因子和 红细胞生成素可以没有适于与某种交联剂反应的基团；然而，本领 域技术人员将充分理解，根据用于与本发明红细胞生成素或组织保 护性细胞因子交联的可用基团来选择交联剂。

当异型双官能分子活性基团与氨基形成共价键时，所述共价键 通常是酰氨键或亚氨键。与氨基形成共价键的活性基团可以是例如 活化的羧酸酯基、卤羰基或酯基。所述卤羰基最好是氯羰基。酯基 最好是例如N-羟基-琥珀酰亚胺酯基等活性酯基。

通常，其它官能团可以是巯基、能转化成巯基的基团或能与巯 基形成共价键的基团。通常，所述共价键是硫醚键或二硫键。与巯 基形成共价键的活性基团可以是例如与巯基或活化的二硫化物反应 的双键。含有能与巯基反应的双键的活性基团可以是马来酰亚胺基 和其它基团，例如丙烯腈。活性二硫键可以是例如2-吡啶二硫代基 或5，5′-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)基团。含有活性二硫键的异型双官 能试剂的一些实例包括3-(2-吡啶-二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯 (Carlsson等，1978，Biochem J.，173：723-737)、S-4-琥珀酰亚胺基氧羰 基-α-甲基苄基硫代硫酸钠和4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-(2-吡啶 二硫代)甲苯。优选3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯。包含具 有与巯基反应的双键的活性基团的异型双官能试剂的一些实例包括 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和间马来酰亚胺苯 甲酸琥珀酰亚胺酯。

其它异型双官能分子包括3-(马来酰亚胺)丙酸琥珀酰亚胺酯、4- (对马来酰亚胺-苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基- 环己烷)-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基-琥 珀酰亚胺酯。优选间马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯的磺酸钠盐。 许多上述异型双官能试剂及其磺酸盐可得自Pierce Chemical Co.， Rockford，Illinois USA。

技术人员可以容易地确定对上述缀合是可逆的或不稳定的需 要。可以在体外测试缀合物的红细胞生成素和所需药理学活性。如 果所述缀合物保留这两种特性，则其适合性可以在体内进行检验。 如果所述缀合的分子需要按活性从红细胞生成素或组织保护性细胞 因子中分离出来，优选与红细胞生成素或组织保护性细胞因子的不 稳定键合或可逆缔合。在体内试验之前，用标准体外方法也可以测 试不稳定特性。

有关怎样制备和使用它们以及其它多官能试剂的额外信息可从 下列出版物或本领域其它可用信息中得到：

1.Carlsson，J.等，1978，Biochem.J.173：723-737.

2.Cumber，J.A.等，1985，Methods in Enzymology 112：207-224.

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8.Lerner，R.A.等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3403- 3407.

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此外，交联方法的综述参见Means和Feeney，1990，Bioconjugate Chem.1：2-12。

本发明的上述方法和组合物所穿越的屏障包括但不限于血-脑屏 障、血-眼屏障、血-睾屏障、血-卵巢屏障和血-子宫屏障。

用于转运穿越内皮细胞屏障的候选分子包括例如激素例如生长 激素、神经营养因子、抗生素、抗病毒药、或者通常被脑和其它屏 障保护的器官排除在外的抗真菌药、肽类放射性药物、反义药物、 抗生物活性因子的抗体和抗病毒药、药用物质和抗癌药。所述分子 的非限制性实例包括激素例如生长激素、神经生长因子(NGF)、脑衍 生神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细 胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2 (TGFβ2)、转化生长因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3 和白介素6、AZT、抗肿瘤坏死因子的抗体和免疫抑制药例如环孢菌 素。此外，为了诊断目的而显现脑和其它屏障器官内的细胞、组织 或器官，可以将染料或标记连接到红细胞生成素上或本发明组织保 护性细胞因子之一上。作为一个实例，为了确定患者体内早老性痴 呆的进程，可以将用于显现脑内病斑的标记连接到红细胞生成素或 组织保护性细胞因子。

本发明也涉及一种包含待通过胞转作用穿越内皮细胞紧密连接 屏障而转运的分子和上述红细胞生成素或组织保护性细胞因子的组 合物。本发明还涉及分子和上述红细胞生成素或组织保护性细胞因 子间的缀合物在制备用于递送所述分子穿越上述屏障的药用组合物 中的用途。

在以下实施例中，提供神经保护和胞转作用的各种动物模型和 体外试验，以证明本发明组织保护性细胞因子的效力。所述模型包 括使用P-19细胞的体外模型和小鼠体内水中毒模型，所述体外模型 用来测定所述组织保护性细胞因子的神经保护效应，而所述体内模 型用来测定本发明的组织保护性细胞因子的体内神经保护效应。对 于胞转作用，评价与本发明红细胞生成素缀合的模型蛋白在胃肠外 给药后转运到脑内。这些在体外模型和动物模型中的试验预测本发 明化合物在包括人在内的其它各种哺乳动物中的功效。此外，实施 例1证明人脑具有大量红细胞生成素受体，提供了红细胞生成素以 及组织保护性细胞因子的胞转作用的机制。

通过参考以下作为本发明示例性的非限制性实施例，可以更好 地理解本发明。提供以下实施例是为了更充分说明本发明的优选实 施方案。然而，它们决不应该以任何方式限制本发明的宽范围。

                    实施例1

          红细胞生成素受体在人脑中的分布

在外科手术中切取的正常人脑(例如在肿瘤切除术中提供无肿瘤 边缘)立即放在5％丙烯醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中固定3小时。 用振动切片机切成40微米厚的切片。用自由漂浮切片并采用间接抗 体过氧化物酶-抗过氧化物酶方法，用1∶500稀释度的红细胞生成素 受体抗血清(得自Santa Cruz Biotechnology)进行免疫组织化学染色。 用过氧化氢预处理组织切片，猝灭内源过氧化物酶活性(3％过氧化氢 的甲醇溶液处理30分钟)。也通过第一抗体省略并通过使用合适的封 闭性肽(得自Santa Cruz Biotech.)处理组织对照，证实染色对红细胞生 成素(EPO)受体是特异性的。

图1显示通过使用特异性抗EPO受体的抗体进行免疫组织化学 测定，人脑毛细血管表达非常高水平的EPO受体。这提供了EPO之 所以能从体循环穿透血脑屏障进入大脑的机制。

图2显示EPO受体集中位于人脑中形成血脑屏障的毛细血管中 及其周围。

图3中进行了与图1和图2类似的方案，除了10微米切片是用 石蜡切片、包埋的切片浸泡在4％低聚甲醛中固定以外。图3显示人 脑毛细血管管腔表面和反面的高密度EPO受体，构成将EPO从循环 运输到脑内的解剖学基础。

图4是得自与图3类似的方案，除了组织用超薄切片机切片并 供电镜用、第二抗体用胶体金颗粒标记外。该图显示，发现EPO受 体在人脑的内皮表面(*)上、在胞质小泡(箭头)内和在神经胶质突触小 结(+)上，提供了EPO从循环运输到脑内的解剖学基础。

                    实施例2

               组织保护性细胞因子

如本文所述用途所需的组织保护性细胞因子可以通过如下方法 产生：胍化、氨甲酰化、酰胺化、三硝基苯基化、乙酰化、琥珀酰 化、硝化，或者在上文提到的其它方法中对红细胞生成素的精氨酸 或赖氨酸残基或羧基的修饰。这些修饰产生保留其对特殊器官和组 织的活性、但没有保留其对其它器官的组织例如红细胞的活性的组 织保护性细胞因子。当红细胞生成素经历以上反应时，发现所得的 分子通常缺乏体内和体外红细胞生成活性(例如Satake等；1990， Biochim.Biophys.Acta 1038：125-9)。下面描述了制备组织保护性细胞 因子的一些实施例。尽管以下实施例用红细胞生成素作为原料，但 是本领域普通技术人员将会认识到，也可以使用脱唾液酸化红细胞 生成素、胍化红细胞生成素、氨甲酰化红细胞生成素、酰胺化红细 胞生成素、三硝基苯基化红细胞生成素、乙酰化红细胞生成素、琥 珀酰化红细胞生成素、硝化红细胞生成素等红细胞生成素衍生物。

A.通过脱唾液酸红细胞生成素产生组织保护性细胞因子

可以通过以下示例性方法，将红细胞生成素进行脱唾液酸。唾 液酸酶(分离自链球菌(Streptococcacs sp)6646K.)得自SEIKAGAKU AMERICA(编号120050)。红细胞生成素用唾液酸酶(0.05U/mg EPO) 于37℃处理3小时以脱唾液酸。反应混合物用Ultrafree离心过滤单 元脱盐并浓缩。然后样品加样到AKTAprimeTM系统的离子交换柱。 蛋白用所选缓冲液洗脱。然后用含有大量蛋白的洗脱流分进行IEF 凝胶分析。合并只含最上两个条带的流分(在IEF凝胶上在pI～8.5和 pI～7.9迁移)，测定合并流分的蛋白质含量，加入1/9体积的10x 盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM柠檬酸)。然后测定溶液 的唾液酸含量。应该检测不到明显的唾液酸含量。

如图5-6所示，脱唾液酸红细胞生成素和苯基乙二醛红细胞生 成素在体外对神经细胞同天然红细胞生成素一样有效。用经历了去 除血清后细胞凋亡的神经样胚胎癌性细胞(P19)进行体外试验。在去 除血清后24小时，向培养物中加入1-1000ng/ml红细胞生成素或修 饰红细胞生成素。翌日去除培养基，用不含血清的新鲜培养基洗涤 细胞，向培养物中加入含有试验物质的培养基(无血清)，再培养48 小时。为了测定活细胞数，进行四氮唑还原试验(CellTiter 96；Promega， Inc.)。如图5-6所示，脱唾液酸红细胞生成素显示出同红细胞生成素 本身在防止细胞死亡中的同等效力。

用大鼠局灶性局部缺血模型证实体内神经保护活性的持久性， 在所述模型中可以如前所述形成中脑动脉区可逆损害(Brines等，2000， Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.97：10526-31)。在Sprague-Dawley成年雄 性大鼠动脉闭塞发作时，给予脱唾液酸红细胞生成素或红细胞生成 素(5000U(40μg)/kgBW腹膜内)或溶媒。24小时后，处死动物取脑 供研究用。进行连续切片并用四氮唑盐染色以鉴定脑内的存活区。 如图7所示，脱唾液酸红细胞生成素在1小时局部缺血时提供神经 保护同天然红细胞生成素一样有效。图8显示另一个局灶性局部缺 血模型的结果，其中用红细胞生成素和脱唾液酸红细胞生成素进行 比较剂量反应。在250U(2μg)/kg的最低剂量时，脱唾液酸红细胞 生成素提供保护，而未修饰的红细胞生成素不提供保护。

B.通过氨甲酰化红细胞生成素制备组织保护性细胞因子

按照如Jin Zeng(1991)描述的以下方法，天然红细胞生成素可用 于制备相应的氨甲酰化分子。通过氨甲酰化和胍化反应对金属硫蛋 白进行赖氨酸修饰。Methods in Enzymology 205：433-437。首先，将 氰酸钾重结晶。制备1M硼酸缓冲液(pH8.8)。将红细胞生成素溶液 与等体积硼酸缓冲液混合。将氰酸钾直接加入到反应管，至终浓度 为0.5M。将溶液混合均匀并于37℃保温6小时。然后用蒸馏水彻底 透析溶液。从透析管中取出产物，收集到新的试管中。测量体积， 向溶液中加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、 3mM柠檬酸)。测定蛋白质含量，计算产物回收率。通过IEF凝胶 以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

C.通过琥珀酰化红细胞生成素制备组织保护性细胞因子

按照如Alcalde等(2001)描述的以下方法，天然红细胞生成素可 用于制备相应的琥珀酰化分子。来自热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter sp.)501的环糊精糖基转移酶的琥珀酰化反应用淀粉作为供体时增强 其转移酶活性。J.Biotechnology 86：71-80。红细胞生成素(100μg)的 0.5M NaHCO3(pH8.0)与15摩尔过量的琥珀酸酐在15℃保温1小时。 通过对蒸馏水透析终止反应。

用于红细胞生成素琥珀酰化的另一种方法是将27mg/ml琥珀酸 酐溶于无水丙酮中。反应在10mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)的微量离心 管中进行。向试管中加入红细胞生成素和50倍摩尔量的琥珀酸酐。 将溶液混合均匀，试管于4℃旋转1小时。用透析盒(Slide-A-Laze 7K， Pierce 66373)通过对10mM磷酸钠缓冲液透析终止反应。从透析管 中取出产物，收集到新的试管中。测量体积，加入1/9体积的10X 盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM柠檬酸)。测定蛋白质含 量，计算产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-1细胞体外试验来分 析产物。

D.通过乙酰化红细胞生成素制备组织保护性细胞因子

按照如Satake等(1990)描述的以下方法，天然红细胞生成素可 用于制备相应的乙酰化分子。红细胞生成素的化学修饰：通过胍化 反应增加体外活性。Biochimica et Biophysica Acta.1038：125-129。

反应在80mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)的微量离心管中进行。向试 管中加入红细胞生成素和等摩尔量的乙酸酐。混合均匀后，溶液在 冰上保温1小时。用透析盒(Slide-A-Laze 7K，Pierce 66373)通过对水 透析终止反应。从透析盒中取出产物，收集到新的试管中。测量产 物体积后，加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、 3mM柠檬酸)。测定蛋白质含量，计算产物回收率。通过IEF凝胶 以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

E.通过羧甲基化红细胞生成素的赖氨酸制备组织保护性细胞因子

按照如Akhtar等(1999)描述的以下方法，天然红细胞生成素可 用于制备相应的Nε-(羧甲基)赖氨酸(CML)修饰分子，其中红细胞生 成素的一个或多个赖氨酰残基被修饰。Conformational study of Nε- (carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins(重组a-晶体 蛋白的Nε-(羧甲基)赖氨酸加合物的构象研究).Current Eye Research， 18：270-276。

在磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)中制备乙醛酸(200mM)和 NaBH3CN(120mM)。在微量离心管中，加入红细胞生成素(溶于磷酸 缓冲液)。然后计算出溶液中的赖氨酸等同物(约8个赖氨酸残基 /mol)。接着，向试管中加入3倍以上的NaBH3CN以及5倍以上或10 倍以上的乙醛酸。每管蜗旋震荡后，于37℃保温5小时。样品于4 ℃对磷酸缓冲液透析过夜。透析后，测量各产物体积。

测定蛋白质浓度，计算产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-1 细胞体外试验来分析产物。

F.通过碘化红细胞生成素制备组织保护性细胞因子

按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)提供的用于 IODO-Gen预包埋碘化管(产品目录号28601)的说明书描述的以下方 法，天然红细胞生成素可用于制备相应的碘化分子。

1.制备0.1M的NaI，在IODO-Gen预包埋碘化管(产品目录号 28601)中用溶于磷酸钠缓冲液(40mM，pH7.4)进行碘化反应，总反应 体积为0.1ml/管。蛋白底物(红细胞生成素)与磷酸钠缓冲液混合，然 后转移到IODO-Gen预包埋碘化管中。加入NaI，至终浓度为1-2mM， 使NaI/蛋白摩尔比为14-20。然后将溶液混合均匀并在室温下温和搅 拌中保温15分钟。通过除去反应混合物终止反应，向其中加入一管 3.9ml钠缓冲液(即40倍稀释)。通过预先润湿的Ultrafree离心过滤 单元浓缩产物。测定浓缩液体积，加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM柠檬酸)。测定蛋白质含量，然后计算 产物回收率。通过IEF凝胶以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

2.用于碘化红细胞生成素的另一种方法涉及在含有1mCi游离 Na123I的100μlPBS(20mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH7.5)中保温碘 珠(Pierce，Rockford，Il)达5分钟。然后将溶于100μlPBS的红细胞生 成素(100μg)加入到混合物中。在室温下保温10分钟后，通过从反 应容器中取出200μl溶液终止反应(留下碘珠)。然后通过在Centricon 10柱上进行凝胶过滤除去过量碘。如图9所示，按此法产生的碘化 红细胞生成素在去除血清的P19细胞保护中是有效的。

3.红细胞生成素也可用氯胺T碘化。将溶于100μlPBS的红细 胞生成素(100μg)加入到500uCi N125I中，然后将混合物在微量离心 管中混合在一起。然后加入25μl氯胺T(2mg/ml)，将混合物在室温 下保温1分钟。然后加入50μl氯胺T终止缓冲液(2.4mg/ml偏亚硫 酸钠、10mg/ml酪氨酸、10％甘油、0.1％二甲苯的PBS)。然后通过 用Centricon 10柱进行凝胶过滤，将碘化酪氨酸和碘化红细胞生成素 分开。

G.通过生物素化红细胞生成素制备组织保护性细胞因子

1.在Wojchowski等“Biotinylated recombinant human erythropoietins：Bioactivity and Utility as a receptor ligand(生物素化重 组人红细胞生成素：作为受体的配体的生物活性和用途)”.Blood，1989， 74(3)：952-8中，作者采用使红细胞生成素生物素酰化的3种不同方 法。将生物素加入到(1)唾液酸部分(2)羧基和(3)氨基上。作者使用小 鼠脾细胞增殖测定，证明(1)将生物素加入到唾液酸部分上不会使红 细胞生成素的生物学活性失活(2)将生物素加入到羧基上导致红细胞 生成素的生物学活性基本失活(3)将生物素加入到氨基上导致红细胞 生成素的生物学活性完全失活。这些方法和修饰全都包括在本文中。 图10显示在血清饥饿P19测定中生物素化红细胞生成素和脱唾液酸 红细胞生成素的活性。

2.此外，按照如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)提供的 用于 EZ-Link NHS-LC-生物素(产品目录号21336)说明书描述的以下 方法，天然红细胞生成素可用于制备相应的生物素化分子。

就在反应之前，将2mg/ml的EZ-Link NHS-LC-生物素(pierce， 21336)溶于DMSO中。在盛有总体积1ml的含有50mM碳酸氢钠(pH 8.3)的试管(17×100mm)中进行反应。加入红细胞生成素和＜10％的 EZ-Link NHS-LC-生物素，产生生物素/蛋白摩尔比为～20的溶液。将 溶液混合均匀并在冰上保温2小时。溶液用Ultrafree离心过滤单元 脱盐并浓缩。然后将产物收集到新的试管中。测定产物体积，向产 物中加入1/9体积的10X盐溶液(1M NaCl、0.2M柠檬酸钠、3mM 柠檬酸)。测定产物的蛋白质含量，然后计算产物回收率。通过IEF 凝胶以及用TF-1细胞体外试验来分析产物。

3.采用如下方法，红细胞生成素的游离氨基也可以被生物素化。 首先，将0.2mg D-生物素-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (Boehringer Mannheim #1418165)溶于100μl DMSO中。然后将溶液 在铝箔盖着的试管中与含有约0.2mg红细胞生成素的400μl PBS混 合。该溶液在室温下保温4小时后，通过在Centricon 10柱上进行凝 胶过滤分离出未反应的生物素。

预期若干这些修饰可以在红细胞生成素或红细胞生成素衍生物 上进行，以便制备组织保护性细胞因子。例如，红细胞生成素可以 按照实施例2(A)所述方法进行脱唾液酸，并按照实施例2(B)所述方 法进行氨甲酰化，产生脱唾液酸氨甲酰红细胞生成素。

                     实施例3

        通过其它方法制备组织保护性细胞因子

1.三硝基苯基化：如Plapp等(“Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups(具有修饰氨基的牛胰 腺脱氧核糖核酸酶A的活性)”1971，J.Biol.Chem.246，939-845)描述 的方法，红细胞生成素(100μg)用2，4，6-三硝基苯磺酸盐进行修饰。

2.精氨酸修饰：如Riordan(“Functional arginyl residues in carboxypeptidase A.Modification with butanedione(羧肽酶A中的功能 性精氨酰残基。用丁二酮修饰).”Riordan JF，Biochemistry 1973，12(20)： 3915-3923)描述的方法，红细胞生成素用2，3-丁二酮进行修饰。

3.如Patthy等(“Identification of functional arginine residues in ribonuclease A and lysozyme(核糖核酸酶A和溶菌酶的功能性精氨酸 残基的鉴定).”Patthy，L，Smith EL，J.Biol.Chem 1975 250(2)：565-9)描 述的方法，红细胞生成素用环己酮进行修饰。

4.如Werber等(“Proceedings：Carboxypeptidase B：modification of functional arginyl residues(会议录：羧肽酶B：功能性精氨酰残基的 修饰).”Werber，MM，Sokolovsky M Isr J Med Sci 1975 11(11)：1169-70) 描述的方法，红细胞生成素用苯基乙二醛进行修饰。苯基乙二醛修 饰的红细胞生成素用上述神经样P19细胞测定来检测。如图11所示， 该化学修饰的红细胞生成素完全保留其神经保护效应。

5.酪氨酸修饰：如Nestler等“Stimulation of rat ovarian cell steroidogenesis by high density lipoproteins modified with tetranitromethane(用四硝基甲烷修饰的高密度脂蛋白对大鼠卵巢细胞 类固醇产生的刺激).”Nestler JE，Chacko GK，Strauss JF 3rd.J Biol Chem 1985 Jun 25；260(12)：7316-21)描述的方法，将红细胞生成素 (100μg)与四硝基甲烷一起保温。

6.谷氨酸(和天冬氨酸)修饰：如Caraway等“Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen(胰凝乳蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶原的羧基修饰).”Carraway KL，Spoerl P，Koshland DE Jr.J Mol Biol 1969 May 28；42(1)：133-7描述的方法，为了修饰羧基，在 室温下，将红细胞生成素(100μg)与0.02M EDC的1M甘氨酰胺pH4.5 保温60分钟。

7.色氨酸残基修饰：如Ali等，J Biol Chem.1995 Mar 3；270(9)： 4570-4描述的方法，在室温下，将红细胞生成素(100μg)与20μM正 溴琥珀酰亚胺的20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)一起保温。按照 Korotchkina(Korotchkina，LG等，Protein Expr Purif.1995 Feb；6(1)：79- 90)描述的方法，测定氧化色氨酸残基数。

8.氨基的去除：如Kokkini等(Kokkini，G.等“Modification of hemoglobin by ninhydrin(茚三酮对血红蛋白的修饰.”Blood，第556卷， 第4期，1980：701-705)描述的方法，为了除去氨基，将红细胞生成素 (100μg)与含有20mM茚三酮(Pierce Chemical，Rockford，Il)的PBS(pH 7.4)于37℃保温2小时。通过使产物与硼氢化钠或氢化铝锂反应，完 成所得醛的还原。具体地讲，将红细胞生成素(100μg)与0.1M硼氢 化钠的PBS在室温下保温30分钟。通过将样品在冰上冷却10分钟 终止还原反应，并对PBS透析3次，过夜。(Kokkini，G.，Blood，第556 卷，第4期，1980：701-705)。在室温下，通过将红细胞生成素(100μg) 与0.1M氢化铝锂的PBS一起保温30分钟，完成用氢化铝锂的还原。 通过将样品在冰上冷却10分钟终止还原反应，并对PBS透析3次， 过夜。

9.二硫键还原和稳定化：红细胞生成素(100μg)与500mM DTT 于60℃保温15分钟。然后向混合物中加入20mM碘乙酰胺的水溶 液，并在室温下避光保温25分钟。

10.有限蛋白酶解：红细胞生成素可以经历靶向特定残基的有限 化学蛋白酶解。红细胞生成素与2-(2-硝基苯基亚磺酰基)-3-甲基-3′- 溴假吲哚反应，所述反应在氮气压下在有帽试管中在50倍过量的50％ 乙酸中在室温下避光达48小时，在色氨酸残基后特异性切割。通过 用色氨酸猝灭和脱盐终止反应。

如上所述，红细胞生成素或脱唾液酸红细胞生成素可以被修饰， 虽然红细胞生成素分子的多个修饰以及额外修饰也可在不偏离本发 明的精神下进行。任何上述实施例可以用如下所述方法制备的部分 脱唾液酸红细胞生成素进行。例如，可以通过使用例如苯基乙二醛、 按照Takahashi(1977，J.Biochem.81：395-402)描述的方法，在一个或 多个精氨酸残基上修饰任何上述修饰的红细胞生成素，所述反应可 以在室温下范围在0.5小时至3小时间的可变时间进行。反应通过将 反应混合物对水透析而终止。使用红细胞生成素的这样的修饰形式 全都包括在本发明中。

                     实施例4

         组织保护性细胞因子具有神经保护效应

按照Manley等，2000，Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke(小鼠水通道蛋 白-4缺失降低急性水中毒和局部缺血性中风后脑水肿)，Nat Med 2000 Feb；6(2)：159-63，用水中毒测定评价本发明的组织保护性细胞因子 的神经保护效应。使用C3H/HEN雌性小鼠。腹膜内给予小鼠其体重 20％的水和400ng/kg bw DDAVP(去氨加压素)。给予小鼠红细胞生 成素(A)或组织保护性细胞因子：脱唾液酸红细胞生成素(B)、氨甲酰 化脱唾液酸红细胞生成素(C)、琥珀酰化脱唾液酸红细胞生成素(D)、 乙酰化脱唾液酸红细胞生成素(E)、碘化脱唾液酸红细胞生成素(F)、 羧甲基化脱唾液酸红细胞生成素(G)、氨甲酰化红细胞生成素(H)、乙 酰化红细胞生成素(I)、碘化红细胞生成素(J)或Nε-羧甲基红细胞生成 素(K)。在给予水前24小时和在给予水的时候，腹膜内给予小鼠100 微克/kg剂量的红细胞生成素或组织保护性细胞因子，给予两次。来 自Manley等的改良等级量表用于评价小鼠。修改的评分如下列出：

1.探究笼子/桌子

是      0

否      1

2.视觉追踪目标

是      0

否      1

3.胡须运动

存在    0

不存在  1

4.腿-尾运动

正常    0

僵硬    1

瘫痪    2

5.痛苦撤回(脚趾夹)

是      0

否      1

6.运动协调性

正常    0

异常    1

7.在桌边停止

是      0

否      1

可能的总评分：8

在以下时间点对小鼠进行评分：15分钟、30分钟、45分钟、60 分钟、75分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟。所做的 评分是整个时间曲线下的面积，以仅接受盐水动物的百分率计。图12 显示接受红细胞生成素或一种本发明的组织保护性细胞因子小鼠的 评分，以得自对照小鼠的评分的百分率计。接受本发明组织保护性 细胞因子的小鼠表现出更少的神经病学损伤，因此在改良等级量表 中评分更好。图12显示本发明的组织保护性细胞因子保护神经元组 织。

                     实施例5

         红细胞生成素穿越血-脑脊液紧密屏障

Sprague-Dawley成年雄性大鼠麻醉后，腹膜内给予重组人红细 胞生成素。在30分钟间隔直到4小时从大池取脑脊液样，用灵敏和 特异性酶联免疫测定测定红细胞生成素浓度。如图13所示，CSF中 基线红细胞生成素浓度为8mU/ml。在数小时延迟后，测量的CSF 中红细胞生成素水平开始上升，到2.5小时和以后与基线浓度显著不 同(p＜0.01水平)。约100mU/ml的峰水平在已知发挥体外保护效应 的范围内(0.1-100mU/ml)。到达峰的时间发生在约3.5小时，所述时 间从峰血清水平显著延迟(不到1小时)。该实验结果表明，红细胞生 成素的显著水平可以通过大剂量胃肠外给予合适浓度的红细胞生成 素穿越紧密细胞连接而达到。本领域普通技术人员将会认识到，本 发明的组织保护性细胞因子也可以预期得到类似结果。

                     实施例6

             以备移植用心脏功能的维护

按照Delcayre等，1992，Amer.J.Physiol.263：H1537-45的方案， 对于体重在300-330g的Wistar雄性大鼠，在进行离体研究而取出心 脏前24小时，给予细胞生成素(5000U/kg体重)或溶媒。用戊巴比妥 (0.3mL)处死动物并在静脉内肝素化(0.2mL)。心脏开始让其平衡15 分钟。然后，使左心房囊膨胀至舒张期末压为8mmHg的体积。通 过增加囊体积膨胀至0.02ml，构建左心室压力体积曲线。零体积定 义为其中左心室舒张期末压为零的点。在完成压力体积曲线时，在 检查冠状动脉流动后，使左心室囊缩小至舒张期末压恢复到8mmHg 而且控制周期继续15分钟。然后，心脏用50mL Celsior+分子停止， 以在压力为60cm H2O下于4℃静息。然后切取心脏并在装满相同溶 液且周围放满碎冰的塑料容器中于4℃贮存5小时。

在完成贮存后，将心脏转移到Langendorf装置上。将囊导管重 新插入到左心室并使其重新膨胀到与缺血前期相同的体积。在37℃， 将心脏再灌注至少2小时。再灌注压力设置在50cm H2O达重新流动 15分钟，然后恢复到100cm H2O，再进行2小时。重建心博(320次/ 分)。在再灌注25分钟、45分钟、60分钟和120分钟，进行收缩指 数和舒张压的等容测量，重复3次。在该时间点完成压力体积曲线， 并收集45分钟再灌注期间的冠状动脉流出液，测量肌酸激酶渗漏。 运用非配对t-检验比较这两个治疗组，用舒张期末压数据的线性回归 用于设计依从曲线。如图14所示，在用红细胞生成素治疗后，发生 左心室压力变化的明显改善，以及改善的体积-压力曲线，降低左心 室舒张压并降低肌酸激酶渗漏。用本发明组织保护性细胞因子进行 治疗，预期可得到类似结果。

                     实施例7

     红细胞生成素保护心肌细胞免于局部缺血性损伤

麻醉前24小时，给予成年雄性大鼠重组人红细胞生成素(5000U (40μg)/kg体重)，并准备进行冠状动脉闭塞。手术开始时，给予额外 剂量的红细胞生成素，并使左主冠状动脉闭塞30分钟，然后再释放。 处理后，每天给予相同剂量的红细胞生成素达1周。然后研究动物 的心脏功能。如图15所示，接受假注射(盐水)的动物证明在左舒张 期末压有大的增加，表明继发心肌梗塞后扩大的、僵硬的心脏。相 比之下，与假手术对照相比，接受红细胞生成素的动物没有经历心 脏功能减退(显著性差异在p＜0.01的水平)。用本发明组织保护性细 胞因子进行治疗，预期可得到类似结果。

                     实施例8

      外周给予红细胞生成素对视网膜缺血的保护

视网膜细胞对局部缺血非常敏感，所以在缺血性应激反应30分 钟后，许多细胞死亡。此外，亚急性或慢性局部缺血是伴有大量的 人类常见疾病(例如糖尿病、青光眼和黄斑变性)的变性症状的基础。 迄今为止，尚没有保护细胞免于局部缺血的有效疗法。紧密内皮屏 障存在于血和视网膜之间，该屏障可排除大多数大分子。为了检测 外周给予红细胞生成素是否能够保护对局部缺血敏感的细胞，使用 如Rosenbaum等(1997；Vis.Res.37：3443-51)描述的的急性可逆青光 眼大鼠模型。具体地讲，将盐水注射到成年雄性大鼠的眼前房，给 全身动脉压力加压并维持60分钟。诱导局部缺血前24小时，腹膜 内给予动物盐水或5000U(40μg)/kg体重的红细胞生成素，并再连续 给予3天的日剂量。治疗后1周对适应黑暗的大鼠进行视网膜电描 记术。图16-17说明，与仅给予盐水治疗、只保留极少功能的动物(图 面C)相比，给予红细胞生成素在视网膜电图(ERG)(图面D)上有着良 好的保留。图16比较了红细胞生成素治疗组和盐水治疗组的视网膜 电图a-波和b-波振幅，显示出红细胞生成素提供显著保护。用本发 明组织保护性细胞因子进行治疗，可得到类似结果。

                     实施例9

  红细胞生成素对由脑创伤所致减退的认知功能的恢复效应

在证明红细胞生成素对接受脑创伤后小鼠恢复减退的认知功能 能力的研究中，按照Brines等，PNAS 2000，97；10295-10672描述的 方法，让雌性Balb/c小鼠遭受钝器脑创伤，5天后开始腹膜内每天给 予5000U(40μg)/kg-bw红细胞生成素。损伤后12天，在Morris水 迷宫中测试动物的认知功能，每天4次试验。虽然在试验中治疗动 物和未经治疗的动物表现都不好(游泳时间约为80秒，而不是可能的 90秒)，图18显示经红细胞生成素治疗的动物表现较好(在该图中， 负值较好)。即使延迟到创伤后30天才开始进行红细胞生成素治疗(图 19)，也可观察到认知功能的恢复。用本发明组织保护性细胞因子进 行治疗，预期可得到类似结果。

                    实施例10

                  红藻氨酸模型

在红藻氨酸神经毒性模型中，按照Brines等，Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.2000，97；10295-10672的方案，在给予25mg/kg红藻氨酸前24 小时，腹膜内给予剂量为5000U(40μg)/kg-bw的脱唾液酸红细胞生 成素，显示同红细胞生成素一样有效，正如死亡时间显示的(图20)。 用本发明组织保护性细胞因子进行治疗，可得到类似结果。

                    实施例11

                  脊髓损伤模型

1.测试红细胞生成素和组织保护性细胞因子的大鼠脊髓压迫

在该项研究中使用重量在180-300g的Wistar大鼠(雌性)。动物 在手术前禁食12小时并被人道地限制，然后腹膜内注射硫喷妥钠(40 mg/kg-bw)而麻醉。渗透到皮肤(布比卡因0.25％)后，借助解剖显微镜， 通过2cm切口进行完全单水平(T-3)椎板切除术。通过硬膜外应用暂 时动脉瘤夹对脊髓施加0.6牛顿(65克)闭合力达1分钟，诱导创伤性 脊髓损伤。除去夹子后，缝合皮肤切口，让动物从麻醉中完全恢复， 放回笼子。每天至少2次膀胱触诊，连续监测大鼠直到自动进行排 泄为止。

将40只动物随机分成5组。接受普通盐水(通过静脉内注射)的 对照组(I)动物(n＝8)在切开后立即缝合。组(II；n＝8)接受rhEPO@ 16 微克/kg-bw iv，组(III)接受本发明的脱唾液酸组织保护性细胞因子(脱 唾液酸红细胞生成素)@ 16微克/kg-bw iv，组(IV)接受脱唾液酸组织 保护性细胞因子@ 30微克/kg-bw iv，和组(V)接受本发明的脱唾液酸 组织保护性细胞因子(脱唾液酸红细胞生成素)@ 30微克/kg-bw；所 有都是在去除动脉瘤夹子后立即进行单次大剂量静脉内注射。

大鼠的运动神经功能将通过使用Basso等的运动等级量表来评 价。在该量表中，动物的评分范围从0(没有观察到后肢运动)到21(正 常步态)。将在损伤后1小时、12小时、24小时、48小时、72小时 和1周，由不知道每只动物接受的治疗的同一检查人员检查大鼠的 功能缺陷。

图21是一幅曲线图，证明大鼠在脊髓创伤30天内恢复的运动 等级。由图可见，给予红细胞生成素(组II)或组织保护性细胞因子(组 III-组V)的大鼠很容易从损伤恢复过来，并证明比对照鼠有更好的总 体恢复。用本发明组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期可得 到类似结果。

2.测试红细胞生成素和组织保护性细胞因子的兔脊髓缺血

在该项研究中使用重量在1.5-2.5kg的36只新西兰白兔(8-12月 龄，雄性)。动物禁食12小时并被人道地限制。通过吸入3％氟烷的 100％氧并在50％氧和50％空气混合物中的0.5-1.5％氟烷中维持，诱 导麻醉。将静脉内插管(22号)放置在左耳静脉中。在外科手术中，以 每小时4ml/kg体重(bw)的速率输注Ringers乳酸盐。术前静脉内给 予10mg/kg-bw头孢唑林以防感染。将动物放置成右侧卧位置，用聚 维酮碘备皮，用布比卡因(0.25％)渗透并且在第12肋骨平行于脊骨开 一个胁下皮肤切口。当切开皮肤和皮下胸腰筋膜后，腰最长肌和腰 髂肋肌收缩。通过左腹膜后途径将腹部主动脉暴露并转移到左肾动 脉下。一条PE-60管环绕在离开左肾动脉的主动脉周围且两端穿过 大橡胶管。通过拉紧PE管，大动脉被无创伤地闭塞20分钟。在主 动脉闭塞前，大剂量静脉内给予肝素(400IU)。20分钟闭塞后，去除 管子和导管，缝合切口，监测动物直至完全恢复，然后连续评价其 神经功能。

将36只动物随机分成6组。在对照组(I)中，动物(n＝6)在主动脉 闭塞释放后立即静脉内接受普通盐水。组(II)接受rhEPO@ 6.5微克 /kg-bw；组(III)接受组织保护性细胞因子(氨甲酰化红细胞生成素)@ 6.5微克/kg-bw；组(IV)接受另一种组织保护性细胞因子(脱唾液酸红 细胞生成素)@ 6.5微克/kg-bw；组(V)接受与组(IV)相同的组织保护 性细胞因子，但为@ 20微克/kg-bw；和组(VI)接受又一种组织保护 性细胞因子(脱唾液酸氨甲酰化红细胞生成素)@ 20微克/kg-bw；所 有都是在再灌注后立即经静脉内给予。

按照Drummond和Moore的标准，由不知道在再灌注后1小时、 24小时和48小时治疗的调查人员评价运动功能。如下对每个动物进 行从0到4的评分：0＝没有下肢运动功能的截瘫；1＝下肢运动功 能差，仅有微弱反重力运动；2＝有良好反重力力量，但不能在身体 下迈动腿的中等下肢运动功能；3＝良好运动功能，能在身体下拖动 腿跳跃，但不正常；4＝正常运动功能。在截瘫动物中每天2次手工 给膀胱排便。

图22是一幅曲线图，描绘恢复的兔的运动功能。图上证明，甚 至在仅2天周期内，红细胞生成素和本发明的组织保护性细胞因子 就能让兔从脊髓损伤中完全恢复过来。用本发明组织保护性细胞因 子进行治疗性治疗，预期将得到类似结果。

                    实施例12

             红细胞生成素的抗炎效应

体内研究：

1.大鼠中脑动脉闭塞(MCAO)研究

重量在250-280g的雄性Crl：CD(SD)BR大鼠得自Charles River， Calco，Italy。按照Brines，M.L.，Ghezzi，P.，Keenan，S.，Agnello，D.，de Lanerolle，N.C.，Cerami，C.，Itri，L.M.和Cerami，A.2000.Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury (红细胞生成素穿越血-脑屏障以防止实验性脑创伤).[In Process Citation]Proc Natl Acad Sci USA 97：10526-10531所述，对这些大鼠进 行手术。简而言之，将大鼠用水合氯醛(400mg/kg-bw，i.p.)麻醉，露 出颈动脉，用两次缝合闭塞右颈动脉并切开。邻近和朝向右眶的锯 齿孔让MCA清楚呈现，所述孔在离开鼻动脉处进行烧灼。为了产生 围绕该固定MCA损害的半影(边界)，使用细钳牵引，对侧颈动脉闭 塞1小时后再放开。MCAO后立即给予PBS或rhEPO(5,000U/kg-bw， i.p.；先前显示在该模型(1)中有保护性)。当需要时，如前所述(8)定量 测定大脑皮层匀浆的TNF和IL-6。用市售ELISA试剂盒(biosource， Camarillo，CA)，测定匀浆中的MCP-1。

MCAO后24小时，如上所述麻醉大鼠，并通过心脏灌注100ml 盐水，接着是250ml磷酸钠缓冲的4％低聚甲醛溶液。快速切下脑， 在磷酸钠缓冲的4％低聚甲醛溶液中固定2小时，转移到20％蔗糖溶 液的PBS过夜，然后在30％蔗糖溶液中直到它们被浸没，然后在2- 甲基丁烷中在-45℃冷冻。在-20℃，在恒冷切片机(HM 500 OM，Microm) 上以横向平面通过脑进行切片(30μm)并选择每隔5片的切片用于针 对不同抗原或苏木精-伊红染色的组织化学。分别按照Houser等所述 的方案和生产商的方案，用抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)小鼠 单克隆抗体(1∶250，Boehringher Mannheim，Monza，Italy)和用抗cdl11b (MRC OX-42)小鼠单克隆抗体(1∶50，Serotec，UK)处理自由漂浮切片用 于免疫反应性。所有切片在包埋的玻片上在盐水中制成用于光学显 微镜的浸片，通过逐级酒精脱水，在二甲苯中固定并用DPX mountant (BDH，Poole，UK)盖上玻片。邻近切片如(10)所述用苏木精-伊红染 色。

图23显示经苏木精和伊红染色的大脑皮层冠状冠状切片。对照 大鼠(A)、局部缺血性大鼠(B)用PBS治疗，局部缺血性大鼠(C)用rhEPO (5,000U/kg-bw，i.p.，MCAO后立即给予)治疗。切片B显示与对照(A) 相比，与炎症一致的组织染色的明显降低，伴随神经元成分的损失。 系统给予rhEPO大大降低了细胞死亡部位的局部缺血性损伤或局部 区域的损伤(C)。(放大倍数2.5x.比例尺＝800μm.)

图24显示用GFAP抗体染色的邻近梗塞区前皮层的冠状冠状切 片。对照大鼠(A)、局部缺血性大鼠用PBS治疗(B)，局部缺血性大 鼠用rhEPO治疗(C)。活化星形胶质细胞通过其GFAP阳性过程而显 现出来(图面B)。在数量上以及在代表性的经rhEPO治疗动物中活化 星形胶质细胞的染色强度都明显下降(图面C)。(放大倍数10x.比例 尺＝200μm.)

图25用OX-42抗体染色的大脑皮层的冠状冠状切片。局部缺血 性大鼠用PBS治疗(A)，局部缺血性大鼠用rhEPO治疗(B)。在局部 缺血性脑半球中，在两个治疗组中围绕梗塞组织的细胞染色特别突 出，但是在盐水治疗组中更密集更广泛。(放大倍数20x；比例尺＝100 μm)。

图26显示用OX-42抗体染色的邻近梗塞区的大脑皮层冠状冠状 切片。与用rhEPO治疗的局部缺血性大鼠(B)相比，用PBS治疗的局 部缺血性大鼠(A)中观察到高得多的单核炎性细胞密度。具有典型的 圆形的浸润性白细胞将会扩大梗塞体积。(放大倍数10x；比例尺＝200 μm)。

用本发明组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期将得到类 似结果。

2.Lewis大鼠的急性实验性变应性脑脊髓炎(EAE)

6-8周龄的雌性Lewis大鼠购自Charles River(Calco，Italy)。通 过在轻微醚麻醉下，向大鼠的两个后足垫注射用加有热灭活结核分 枝杆菌(M.tuberculosis)H37Ra(Difco，Detroit，MI)的等体积的完全弗 氏佐剂(CFA，Sigma)乳化的50μg豚鼠MBP(Sigma，St.Louis，MO)水 溶液(使终体积为100μ)，诱发大鼠EAE。盲法检查大鼠EAE体征并 如下评分：0，没有疾病；1，尾弛缓；2，共济失调；3，后肢完全 瘫痪并伴有小便失禁。自免疫后3天开始，腹膜内(i.p.)给予大鼠指定 剂量溶于PBS的r-Hu-EPO(EPOetin alfa，Procrit，Ortho Biotech，Raritan， NJ)，一天一次。因为临床级EPO含有人血清白蛋白，所以通常给予 对照动物含有相同数量的人血清白蛋白的PBS。每日给予5,000 U/kg-bw的EPO增加血细胞比容达30％(数据未显示)。当需要时， 从3天到18天用相当于1mg/kg-bw的地塞米松(DEX)的溶于PBS的 1.3mg/kg-bw的DEX的磷酸二钠盐(Sigma)注射(s.c.)大鼠。当需要 时，如前所述[Agnello，2000#10]定量测定脑和脊髓匀浆中的TNF和 IL-6。

图27显示经MBP免疫后3天到18天给予不同剂量EPO对EAE 临床体征的保护效应。EPO以剂量依赖方式延迟疾病的发作并降低 疾病的严重程度。但是，EPO不延迟达到最大严重程度的时间。

在疾病恢复后不继续用EPO治疗并监测大鼠达2月之久的实验 中，没有观察到复发，相反在延缓其给药后用DEX导致疾病恶化(图 28)。用本发明组织保护性细胞因子进行治疗性治疗，预期将得到类 似结果。

体外研究：

从1-2日龄的新生Sprague-Dawley大鼠制备神经胶质细胞原代 培养物。将脑半球从脑膜剥离并机械破坏。将细胞分散在2.5％胰蛋 白酶和1％DNA酶溶液中，通过100μm尼龙网过滤并接种(140,000 细胞/35mm皿)在补充10％胎牛血清、0.6％葡萄糖、链霉素(0.1mg/ml) 和青霉素(100Ul/ml)的Eagle氏极限必需培养基上。每周2次喂养神 经胶质培养物并让其在5％CO2的增湿培养箱中于37℃生长。所有实 验均在2-3周龄的神经胶质细胞培养物上进行，所述培养物用oGFAP 和Griffonia sirnplicifolia同工凝集素B4的免疫化学测定，其中有97％ 的星形胶质细胞和3％的小胶质细胞。从18天的大鼠胎儿海马建立 神经元培养物。取出大脑并从脑膜剥离，分离海马。通过在2.5％胰 蛋白酶溶液中于37℃保温15-20分钟，将细胞分散，然后测定浓度。 将细胞悬液在用于神经胶质细胞的培养基中稀释并以160,000细胞每 盖玻片的密度接种到聚鸟氨酸包埋的盖玻片上。接种后一天，将盖 玻片转移到含有神经胶质单层的、补充阿糖胞苷5μM的神经元维持 培养基(补充5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、100μg/ml腐胺、 30nM亚硒酸钠、20nM孕酮和100U/ml青霉素的Dulbecco氏改良 Eagle氏培养基和Ham氏营养混合F12)培养皿上。翻转盖玻片，使 海马神经元面向神经胶质单层。粘在盖玻片上的石蜡点支撑它们在 神经胶质上，产生狭缝，防止两种细胞类型彼此接触，但又允许可 溶性物质扩散。这些培养条件允许分化神经元培养物生长，所述培 养物用微管相关蛋白2和GFAP的免疫化学测定具有＞98％的同源 性。然后在rhEPO(10U(80ng)/ml)存在或不存在下，用1μM三甲 基锡(TMT)将细胞处理24小时，上清液用于TNF测定，细胞活力如 上所述进行评价。当需要时，在LPS存在下，有或没有rhEPO时， 将神经胶质细胞培养24小时，测定培养上清液中的TNF。通过3-(4，5- 二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)测定，测定细胞活力。 Denizot，F.和Lang，R.1986.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival.Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.(细胞生长和存活的快速比色测定。对四氮唑 染料方法的修改以得到改善的灵敏度和可靠性).J Immunol Methods 89：271-277。简而言之，将MTT四氮唑盐溶于无血清培养基中，至 终浓度为0.75mg/ml，加入到处于于37℃处理了3小时结束的细胞 中。然后除去培养基，用1N HCl∶异丙醇(1∶24)萃取甲。在微量板 读数器上读出560nm吸光度。

图29显示rhEPO在混合神经元胶质培养物中预防诱导神经元死 亡的TNF产生。图面A：有或没有用rhEPO(10U/ml)处理时，由1μM TMT诱导的神经细胞死亡百分率。图面B：在神经元存在(阴影条带) 或不存在(填黑条带)、有或没有rhEPO(10U/ml)时，从暴露给1μM TMT的神经胶质细胞释放的TNF。用本发明组织保护性细胞因子进 行治疗性治疗，预期将得到类似结果。

本发明的范围并不受用来作为本发明各个方面的个别说明的具 体实施方案的限制并且功能等同的方法和组成都在本发明范围内。 甚至从上所述和附图中对本发明的各种修改，除本文所示和所述外， 也将对本领域技术人员是显而易见的。所述修改都包括在所附权利 要求书的范围内。

以上引用的所有参考文献都通过引用全部结合到本文中，用于 所有目的。

                相关申请的交叉引用

本申请要求于2002年7月3日申请的美国专利申请第10/188,905 号的优先权，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。

序列表

<110>肯尼思S.沃伦协会有限公司(The Kenneth S.Warren Institute，Inc.)

<120>用于保护、恢复和增强效应细胞、组织和器官的组织保护性细胞因子

<130>10165-026-228

<140>

<141>

<150>10/188,905

<151>2002-07-03

<160>4

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：功能域

<400>1

Val Leu Gln Arg Tyr

 1               5

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：功能域

<400>2

Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp

 1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：功能域

<400>3

Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu

 1               5

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：功能域

<400>4

Ser Asn Phe Leu Arg Gly

 1               5