慢性神经退行性疾病早期诊断标志物及应用
阅读：571发布：2020-05-16
专利汇可以提供慢性神经退行性疾病早期诊断标志物及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种慢性神经退行性 疾病 早期诊断标志物，其为β型可溶性NSF附着蛋白β-SNAPs，其 氨 基酸序列如Seq？ID？No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明首次发现β-SNAPs的表达和含量变化可以指示慢性神经退行性疾病的早期发生，并开发出检测这种蛋白变化的 蛋白质 组学方法，为慢性神经退行性疾病的早期诊断和早期发现开辟了新思路，通过更深入的机理研究和损耗-时间曲线的建立，有助于将慢性神经退行性疾病的损失降到最低。，下面是慢性神经退行性疾病早期诊断标志物及应用专利的具体信息内容。
1.慢性神经退行性疾病早期诊断标志物，其特征在于，所述标志物为β型可溶性NSF附着蛋白β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述慢性神经退行性疾病包括但不限于传染性海绵状脑病和阿茨海默症。
3.权利要求1所述标志物在制备慢性神经退行性疾病早期诊断试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得相应抗体，将制备的抗体作为诊断试剂或诊断试剂中的有效成分。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述慢性神经退行性疾病包括但不限于传染性海绵状脑病和阿茨海默症。
6.慢性神经退行性疾病早期诊断试剂，其特征在于，其是以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得的相应抗体即为诊断试剂。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂，其特征在于，所述慢性神经退行性疾病包括但不限于传染性海绵状脑病和阿茨海默症。
8.慢性神经退行性疾病早期诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求6或7所述的诊断试剂。
慢性神经退行性疾病早期诊断标志物及应用
技术领域
背景技术
[0002] 朊蛋白病是发生在哺乳动物中枢神经系统的一类神经退行性疾病，具有较长的潜伏期，由于早期治疗对于该病的治愈有着重要意义，因此对于朊蛋白病的早期诊断的研究势在必行。目前对于神经退行性疾病早期诊断的研究主要围绕蛋白组学、基因组学、代谢组学以及影响观察几个方面进行展开。其中以二维聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的蛋白组学一直是近年来的研究热点。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000～3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度染色，例如银染或荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶；或者，可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。
[0003] 胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化产物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据，这些数据可以用于构建数据库或与已有的数据库进行比较分析。
[0004] LCM-二维电泳-质谱技术是蛋白质组学研究的经典技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即，通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后与抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断标志物。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述标志物在慢性神经退行性疾病早期诊断中的应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种慢性神经退行性疾病早期诊断标志物，所述标志物为β型可溶性NSF附着蛋白(Soluble NSF attachment proteins,SNAPs)β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] 本发明还提供所述标志物β-SNAPs在制备慢性神经退行性疾病早期诊断试剂中的应用。其是以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得相应抗体，将制备的抗体作为诊断试剂或诊断试剂中的有效成分。
[0009] 本发明还提供一种慢性神经退行性疾病早期诊断试剂，其是以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得的相应抗体即为诊断试剂。
[0011] 本发明中涉及的慢性神经退行性疾病包括但不限于传染性海绵状脑病（TSE）和阿茨海默症（AD）等。
[0012] 目前对于慢性神经退行性疾病（尤其是海绵状脑病和阿茨海默症），在无症状期和早期发病阶段，还没有找到行之有效的检测手段。目前的检测手段仍停留在发病后组织样本的提取分析和死亡后的组织病理学检测。由于目前没有治愈这类疾病的方法，因此慢性神经退行性疾病的早期诊断对于人和动物的健康具有十分重大的意义。本发明首次发现一种仅存在于脑组织中的蛋白N可溶性乙马来酰亚氨融合蛋白附着蛋白β型（β-SNAPs），其表达和含量变化可以指示慢性神经退行性疾病的早期发生，并开发出检测这种蛋白变化的蛋白质组学方法，为慢性神经退行性疾病的早期诊断和早期发现开辟了新思路，通过更深入的机理研究和损耗-时间曲线的建立，有助于将慢性神经退行性疾病的损失降到最低。
[0013] 本发明所采用的技术路线为：提取不同时间感染或未感染羊瘙痒因子263K的同日龄同性别仓鼠，转基因阿茨海默症模型小鼠或正常野生型小鼠的脑组织样品，进行二维电泳分析，通过专用软件（例如，Mascot，version2.3.02，Matrix Sciences公司）分析找出相对含量有明显变化的蛋白，进行MALDI-TOF/TOF MS质谱分析，获得的串联光谱通过专用软件在NCBInr数据库中进行搜索，从而分析出蛋白的名称和氨基酸序列。结合蛋白的生物学功能，发现参与神经递质释放和膜泡运输的蛋白β-SNAPs具有重要的研究意义。随后通过蛋白印迹（Western Blot）对样品中的β-SNAPs进行定量分析，从而确定并印证了β-SNAPs在脑组织中的早期含量降低变化和渐进性的损耗。并将Western Blot对β-SNAPs的定量检测作为早期发现β-SNAPs含量变化的有效检测方法之一。
[0014] 本发明通过对朊蛋白感染的小鼠的脑组织进行二维电泳，并对差异显著的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析，共发现7个可作为在朊蛋白病早期诊断的潜在标记物，同时Western Blot结果也证实了该结果。这为朊蛋白病的早期诊断和病理机制研究提供了新思路。附图说明
[0015] 图1为本发明实施例1中叙利亚仓鼠脑组织蛋白组二维电泳胶图；其中，箭头指向质谱成功鉴定的蛋白。
[0016] 图2为本发明实施例1中对照组和实验组中β-SNAPs蛋白在二维凝胶上的变化。
[0017] 图3为本发明实施例1中Western Blot检测β-SNAPs的变化量，结果符合二维电泳结果。使用α/β-SNAPs兔多克隆抗体、anti-actin单克隆抗体，A图中左侧三列为攻毒后四周、六周、八周β-SNAP表达量，右侧三列为对应时期PBS对照组的β-SNAP表达量，再与β-actin进行相对含量比较。B图数据分析得出β-SNAPs相对变化量和相对变化趋势。
[0018] 图4 为 2-D 标 准 蛋 白 参 考 图；图 中 选 用pH 值 4-7 的 IPG胶 条，a.Mw(kDa)77pI6/6.3/6.6，b.Mw(kDa)66.2pI5.4/5.6，c.Mw(kDa)43pI5/5.1，d.Mw(kDa)36pI8.3/8.5，e.Mw(kDa)29pI5.9/6，f.Mw(kDa)21.5pI4.6，g.Mw(kDa)17.6pI6.8/7.3。A图为标准蛋白单独进行二维电泳的蛋白分布图，B图为标准蛋白说明书参考对照图。
[0019] 图5为β-SNAPs的“损耗-时间曲线”图。
[0020] 图6为MALDL-TOF质谱鉴定胰蛋白酶消化的β-SNAPs，标注肽段符合β-SNAPs肽段质量理论值。
具体实施方式
[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0022] 实施例1慢性神经退行性疾病早期诊断标志物β-SNAPs的发现
[0023] 1.脑组织样品的制备
[0024] 对叙利亚仓鼠脑组织注入性状稳定、性能确定的羊瘙痒因子263K。将由此感染痒病的仓鼠的脑匀浆50μl注入刚断奶的若干只叙利亚仓鼠脑内。用同样剂量的PBS注入同日龄同性别的仓鼠脑内作为对照。分别在注入后第4、6、8周，选择无组织形态学变化的仓鼠和对照组仓鼠，对其进行安乐死，提取其脑组织并保存在-80℃冰箱中。12月龄的雌性阿茨海默症转基因小鼠(The Jackson Laboratory)[B6C3-Tg(APPSWE,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax mice]及合适的野生型正常对照小鼠的脑组织，同样在提取后保存在-80℃冰箱中。
[0025] 2.样品处理
[0026] 用含有全组分蛋白酶抑制剂混合物（Roche公司）的裂解缓冲液[7M尿素，2M硫尿，2%（w/v）CHAPS，0.2%（v/v）两性载体，65mM二硫苏糖醇（DTT）]使仓鼠的脑组织样品悬浮并匀浆均匀。在4℃下对脑匀浆进行12个循环的超声(25%振幅)破碎处理（每个循环：超声1s停5s）。在冰上放置30s后，25000×g离心1h（4℃）。用2-D定量试剂盒（GE Healthcare公司）对离心后上清中的蛋白含量进行准确定量。以每份样品中含450μg蛋白为标准，分装保存在-80℃中，以备二维凝胶电泳和Western Blot使用。
[0027] 3.二维凝胶电泳
[0028] 对上述步骤中的脑组织蛋白样品进行再水化。水化缓冲液[7M尿素，2M硫脲，2%(w/v)CHAPS，0.5%(v/v)两性载体，3%(w/v)DTT,0.002%(v/v)溴酚蓝]加入蛋白样品中使得总体积为450μl。加入到24cm长的固定pH4-7(非线性)梯度条上（GE Healthcare公司），于室温放置18h。通过以下步骤进行等点聚焦（IEF）：250V2h,1000V2h，5000V2h，3h渐进增至10000V（Hoefer IEF100系统）。样品条在0.5mM PH6.8Tris-HCl缓冲液（6M尿素，
30%甘油，2%SDS，2%DTT）中平衡18min，然后，将缓冲液成分DTT换成2.5%碘乙酰胺后再平衡15min。将样品条转移至12.5%SDS-PAGE凝胶中（Hoefer SE900系统）进行第二向电泳分离，1瓦/胶电泳5h，2瓦/胶电泳30h。完成后取出凝胶，在固定液（50%甲醇，5%乙酸）中固定1h后，在考马斯亮蓝染色液（20%甲醇，10%磷酸，10%硫酸铵，0.125%考马斯G-250）中染色过夜。
30%甘油，2%SDS，2%DTT）中平衡18min，然后，将缓冲液成分DTT换成2.5%碘乙酰胺后再平衡15min。将样品条转移至12.5%SDS-PAGE凝胶中（Hoefer SE900系统）进行第二向电泳分离，1瓦/胶电泳5h，2瓦/胶电泳30h。完成后取出凝胶，在固定液（50%甲醇，5%乙酸）中固定1h后，在考马斯亮蓝染色液（20%甲醇，10%磷酸，10%硫酸铵，0.125%考马斯G-250）中染色过夜。
[0029] 4.图像分析
[0030] 染色后凝胶用扫描仪（UMAX Power Look2100XL-USB）在500dpi下进行扫描。图像通过Dymension software专用分析软件(Syngene公司)进行分析。对至少3次相互独立的试验结果进行t检验。选择光强度差异在1.5倍或以上的蛋白点（p<0.05），用以进行下一步质谱分析，其中包括β-SNAPs蛋白。
[0031] 5.质谱仪分析及β-SNAPs的发现
[0032] 从凝胶上切下被选择的蛋白点，置于1.5mL的Eppendorf管中，三蒸水冲洗两遍，用100mM碳酸氢铵冲洗数次，再用100%纯乙腈脱水，置于冷冻真空干燥泵中冷冻干燥。每个样品管中加入50μL含10MmDTT的100mM碳酸氢铵，57℃还原作用1h，待室温冷却后去掉过量液体，随后迅速加入用100mM碳酸氢铵新鲜配制的55mM IAA，室温暗处放置烷基化30min。反应完成后用100mM碳酸氢铵冲洗2次，再用纯乙腈脱水后加入等体积的100mM碳酸氢铵冻干。每管用25μL胰蛋白酶进行消化，37℃过夜。用5%三氟乙酸（TFA）/50%乙腈（ACN）萃取两次，每次15min，合并萃取液冻干。向萃取后冻干的样品中加入0.8μL基质CHCA(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)溶液（0.5g/L，溶剂0.1%TFA/50%ACN），上MALDL靶板，在室温下自然干燥。另外，点0.5μL未加样品的0.5g/L CHCA溶液作为空白对照。用MALDI-TOF/TOF高分辨率串联质谱仪进行分析。MS结束后直接选择与对照基质的PMF图有差异、质量范围700-3200Da和最小信噪比为20的肽段进行MS/MS分析。串联光谱用Mascot，version2.3.02(MatrixSciences公司)软件对NCBInr数据库进行搜索以确定蛋白的名称和氨基酸序列，MSCOT对蛋白的评分不小于59分视为鉴定成功的蛋白。若一个蛋白点检测出多个蛋白，结合2-D标准蛋白（宝生物工程有限公司）（图4）估计其的分子质量并进行pI检验，选择分数较高的蛋白。
[0033] 共发现7个可作为在朊蛋白病早期诊断的潜在标记物（包括β-SNAPs蛋白），表1所示为成功鉴定的蛋白信息。
[0034] 表1通过MALDI-TOF/TOF MS分析鉴定出表达的不同蛋白
[0035]
[0036] 对质谱分析所确定的蛋白进行生物学作用分析，结合二维凝胶电泳图像的光强差异，可以发现β-SNAPs蛋白具有重大的研究意义。β-SNAPs在海绵状脑病和阿茨海默症患病动物脑内在无症状期就出现了显著减少，且随着感染时间的延长，β-SNAPs的含量越来越少。β-SNAPs参与神经递质释放和膜泡运输，是完成突触传递不可或缺的蛋白。它的含量减少，直接引起记忆、运动能力的降低，结合国内外文献对此蛋白的研究，可以推断β-SNAPs与慢性神经退行性疾病有直接关系，并由于其在疾病早期含量的显著变化，符合慢性神经退行性疾病生物学标志物的特征。
[0037] 6.Western Blot验证
[0038] 取出步骤2中提取的蛋白样品，用含50μg蛋白的样品进行Western Blot分析（BIO-RAD公司）。成组成对进行Western Blot分析，263K感染仓鼠、阿茨海默症转基因小鼠分别与其相应的对照组进行分析。分析均保证3次重复以保证结果真实性。步骤如下：
[0039] 聚丙烯酰胺凝胶电泳：按常规方法配制12%SDS-PAGE凝胶，每孔加样10μl，电泳条件为浓缩胶90V25min，分离胶120V90min。
[0040] 电转：80V4h。
[0041] 封闭：5%脱脂奶粉，37℃1h。
[0042] 一抗孵育：α/β-SNAPs兔多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology公司），100倍稀释，4℃孵育过夜，洗涤3次，每次5min。
[0045] 脱抗体和β-actin再孵育：洗去已经显色过的抗体，用anti-actin单克隆抗体和相应的二抗对β-actin进行孵育，曝光后与β-SNAPs进行相对含量比较，以消除上样样品中蛋白含量不同的影响。
[0046] Western Blot分析进一步确定了β-SNAPs确实在传染性海绵状脑病和阿茨海默症的无症状早期即出现了显著降低，并且在传染性海绵状脑病中随着感染时间的延长，β-SNAPs还出现了渐进性的损耗（图5）。由此证明β-SNAPs与慢性神经退行性疾病发生发展的直接关系，从而证明β-SNAPs作为慢性神经退行性疾病生物学标志物的可行性。而Western Blot分析方法是用于测定β-SNAPs在疾病早期进程中含量变化的行之有效的方法。
[0047] 图1为叙利亚仓鼠脑组织蛋白组二维电泳胶图；其中，箭头指向质谱成功鉴定的蛋白（见表1）。IPG胶条pH范围4-7，右侧分子量根据2-D标准蛋白确定。
[0048] 图2为对照组和实验组中β-SNAPs蛋白在二维凝胶上的变化。攻毒后四周、六周、八周β-SNAP表达变化；其中，箭头指向SNAP蛋白，结果由质谱鉴定所得，肉眼可见蛋白从攻毒后四周开始逐渐减少。
[0049] 图3为Western Blot检测β-SNAPs的变化量，结果符合二维电泳的结果。攻毒后四周出现减少，六至八周减少较明显。使用α/β-SNAPs兔多克隆抗体、anti-actin单克隆抗体，A图中左侧三列为攻毒后四周、六周、八周β-SNAP表达量，右侧三列为对应时期PBS对照组的β-SNAP表达量，再与β-actin进行相对含量比较。B图数据分析得出β-SNAPs相对变化量和相对变化趋势。
[0050] 图4为2-D标准蛋白在2-DE凝胶上的分布（2-D标准蛋白参考图）。本发明中选用pH值4-7的IPG胶条，图中a.Mw(kDa)77pI6/6.3/6.6，b.Mw(kDa)66.2pI5.4/5.6，c.Mw(kDa)43pI5/5.1，d.Mw(kDa)36pI8.3/8.5，e.Mw(kDa)29pI5.9/6，f.Mw(kDa)21.5pI4.6，g.Mw(kDa)17.6pI6.8/7.3。A图为标准蛋白单独进行二维电泳的蛋白分布图，B图为标准蛋白说明书参考对照图。
[0051] 图6为MALDL-TOF质谱鉴定胰蛋白酶消化的β-SNAPs，标注肽段符合β-SNAPs肽段质量理论值。
[0052] 实施例2慢性神经退行性疾病早期诊断标志物β-SNAPs的应用
[0053] 本发明还提供所述标志物β-SNAPs在制备慢性神经退行性疾病早期诊断试剂中的应用。具体为：以β-SNAPs作为免疫原，通过免疫动物，获得相应抗体，将制备的抗体作为诊断试剂或诊断试剂中的有效成分。
[0054] 利用上述诊断试剂制备得到慢性神经退行性疾病早期诊断试剂盒，从而为疾病的早期诊断提供可能。
[0055] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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