许多病毒感染都与细胞因子分布型中从Th1型应答到Th2型应 答转换有关，近来的研究表明，控制Th1和Th2型应答平衡可能利 于产生和/或保持抗病毒感染免疫。Th1型应答增强在HIV感染中显 得特别重要，其中长期HIV感染存活者的Th1型应答占优势，而HIV 感染恶化者的Th2型更占优势。例如，Barker等人提出，HIV感染 疾病恶化是因为感染宿主的细胞因子产生由Th1型转换为Th2型 [Barker E，Mackewicz CE，Levy JA Pro Natl Acad Sci USA 1995 Nov 21；92(24)：11135-9]。同样，Th2型应答降低似乎具有治疗意义，因 为Reiser等人报道，慢性丙型肝炎病毒感染的Th2细胞因子水平提 高[Reiser，M.等；J Hepatol 1997 Mar；26(3)：471-8]。已知各种影响 Th1/Th2平衡的方法，它们大致分为细胞因子相关性方法和非细胞因 子相关性方法。
在细胞因子相关性治疗方法中，给予细胞因子调节Th1/Th2平 衡向Th1型应答或Th2型应答方向转移。例如，Knight等人提出， 促进Th1细胞产生的细胞因子IL-12(白细胞介素-12)可用于治疗爱滋 病，因为已经证实，对鼠艾滋病毒或Rauscher白血病病毒(RLV)感 染的小鼠给予IL-12，有效恢复细胞介导性免疫[Knight，S.C.和 Patterson.S.，Annu.Rev.Immunol.1994.15：593-615]。再例如，Gracie， J.A.等人证明，给予小鼠IL-18对产生Th1型应答具有关键性的多效 活性。[Gracie等人，J Clin Invest 1999 Nov 15；104(10)：1393-1401]。 虽然给予细胞因子一般导致目标细胞因子相对特异性增加，但是长 期给予细胞因子可能出现各种问题。例如，重组细胞因子的生产相 对昂贵，而从天然材料中分离非重组细胞因子一般较难，因为在天 然材料中细胞因子的浓度非常低。更大的问题在于细胞因子的制品 通常需要纯度非常高以避免重复给药引起过敏反应。而且，根据细 胞因子性质，其在患者体的耐受性可能较差。
在非细胞因子相关性方法中，应用细胞因子以外的免疫调节物 质调节Th1型应答和Th2型应答之间的平衡。例如，Sprietsma J.E.[Sprietsma J.E；Med Hypotheses 1999 Jul；53(1)：6-16]提出，锌离子 (Zn++)和一氧化氮(NO)与谷胱甘肽(GSH)及其氧化型GSSG一起，可 能有助于调节对抗原的免疫反应。该作者还详细报道了Zn++、NO和 /或GSH的不足使Th1/Th2平衡转向Th2，而Zn++、NO和/或GSH 的补给可以使Th1/Th2平衡转向Th1。给予Zn++或GSH/GSSG特别 有利，因为这些物质即使在高浓度时也是无毒的，而且生产成本低 廉。此外，Zn++和GSH/GSSG制品可以口服方式给予，因此大大降 低了过敏反应的风险，特别是当所述制品不是超纯时。但是，给予Zn++ 和/或GSH/GSSG似乎仅有利于从Th2为主的状态恢复Th1/Th2平 衡，而给予Zn++和/或GSH/GSSG是否可以从正常的Th1/Th2平衡增 强Th1型应答还不清楚。
再例如，通过引用结合到本文的美国专利申请09/156.646中论 述了一种方法，发明者利用核苷类似物病毒唑(1-(5-脱氧-β-D-呋喃核 糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)调节Th1/Th2型应答的平衡。使用病毒唑 特别有利于病毒感染的治疗，因为病毒唑不仅调节免疫应答转向Th1 型应答，还可以作为病毒复制的抑制剂。例如，病毒唑已被成功应 用于丙型肝炎的治疗。这一效果部分是因为抗病毒作用，部分是因 为调节细胞因子平衡。
尽管病毒唑在病毒数量和免疫状态方面表现出令人满意的效 果，但是长期给予较高剂量的病毒唑常常伴有若干副作用，包括白 细胞减少和溶血性贫血。为了减少副作用的发生或其严重性，已有 介绍同时给予病毒唑和IFNα-2B[Reichert，O.等，1998；Lancet 351： 83-87]。但是，同时给予病毒唑和IFNα-2B大大增加治疗费用。而且， 长期给予IFNα-2B增加了由其引起新的副作用的风险。
尽管在病毒性疾病的治疗中应用病毒唑较成功，但病毒唑的使 用因为各种副作用的产生仍然存在问题。所以，需要提供改进的方 法和组合物来调节Th1/Th2平衡以治疗病毒感染，而且其副作用较 轻或者无毒性副作用。
发明概述
本发明涉及治疗患者病毒感染的方法，所其中给予所述患者 LevovirinTM(1-(β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)，其中所述病毒 感染是人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、丙型肝炎病毒感染(HCV)或乙 型肝炎病毒感染(HBV)。
本发明主题的一个方面是，给予LevovirinTM增强患者Th1型应 答(相对于Th2型应答)，特别设想了Th1型应答绝对增加。本发明主 题的再一方面是，体内给予LevovirinTM，优选静脉注射给予或者口 服给予，其中LevovirinTM的优选剂量为0.1mg/kg-1.0mg/kg。
根据以下详细介绍的本发明优选实施方案和附图可以更清楚了 解本发明的各种目的、特性、方面和优点，附图中的相同数字代表 相同组分。
附图简述
图1图示LevovirinTM的结构。
图2图示合成LevovirinTM的合成方案。
图3A-C图示LevovirinTM和病毒唑对Th1型应答各组分的各种 生物效应。
图4图示与LevovirinTM和病毒唑治疗有关的伴刀豆球蛋白A注 射小鼠的血清ALT水平。
发明详述
本文使用的术语“病毒感染”是指任何阶段的病毒感染，包括 潜伏期、休止期或静止期、急性期以及抗病毒免疫产生及维持期。 因此，术语“治疗”包括产生或恢复患者免疫系统免疫力的各个方 面，以及减弱或抑制病毒复制的各个方面。
此外，本文使用的淋巴因子是辅助T细胞产生的细胞因子亚群， 一般认为可分为两个亚类，Th1和Th2。Th1细胞(更新的说法是1型 细胞)产生白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和干扰素γ (IFNγ)，主要负责诸如迟发型超敏反应和抗病毒免疫的细胞介导免 疫。相反，Th2细胞(更新的说法是2型细胞)产生白细胞介素IL4、IL5、 IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要与促进体液免疫应答有关，例如可 见于过敏原反应的应答，例如IgE和IgG4抗体同种型转换(Mosmann， 1989，Annu Rev Immunol，7：145-173)。
本文进一步使用的术语Th1和Th2“应答”包括Th1和Th2淋 巴因子分别诱导产生的全部效应。所述应答尤其还包括相应细胞因 子产生增加、相应淋巴细胞增殖增强，以及其他与细胞因子产生增 加有关的作用，包括运动作用。Th1型应答的一般特征为IL-2、TNF-α 和IFN-γ增加，而Th2型应答的典型特征为IL4、IL-5、IL-6和IL-10 增加。
在一个优选实施方案中，CD4淋巴细胞数约500细胞/微升的HIV 感染患者，接受30天的治疗，每天注射一次总剂量为0.5mg/kg体 重的LevovirinTM水溶液。
本发明主题的可选择方面是，所述HIV感染不需要限于约500 细胞/微升的CD4淋巴细胞数，而是也可以包括较低的CD4淋巴细 胞数，包括CD4淋巴细胞数500-300个、300-150个和150个以下。 相似地，较高的CD4淋巴细胞数(即＞500个)也列入考虑中。还应进 一步了解到，除了病毒效价和CD4淋巴细胞数外的各种临床标记也 可能是合适的，包括检测所述HIV病毒存在的直接和间接试验。例 如，直接试验包括PBMC和血浆HIV的定量培养、定性和定量PCR 方法等。间接试验包括定性和定量ELISA方法等。
关于所述病毒感染的病毒类型，设想所述病毒感染的治疗不是 只针对某一特定类型或某一亚型的HIV病毒，还应了解到除了HIV 外的各种病毒也列入考虑中。一般考虑的选择病毒感染包括可用 LevovirinTM的D-异构体病毒唑治疗的病毒感染。特别考虑的选择病 毒感染包括HCV感染和HBV感染。
本发明主题的其它选择方面是，LevovirinTM的给药方式不必限 于连续30天每日注射一次，而可以包括选择给药频率和途径。例如， 在需要给予较大剂量LevovirinTM时，可以考虑每天注射二至四或者 更多次。相似地，在需要长时期保持LevovirinTM高血浆浓度时，可 以考虑持续给药。例如，更长期给药可以包括使用连续输注、渗透 泵或持续释放植入物。还应进一步了解到，所述给药途径不只限于 注射，而合适的给药途径包括口服、经皮、鼻内、肺部给药等途径。 因此，可选择的LevovirinTM制剂形式可以包括片剂、糖浆、凝胶、 气雾剂等。还可以考虑体外给予LevovirinTM。例如，可以把预定量 的全血或全血的分离部分与LevovirinTM体外预温育，以促进或产生 针对免疫原性刺激的免疫应答。
关于LevovirinTM的剂量，还设想了各种合适选择剂量，包括0.5 mg/kg-0.1mg/kg或更低剂量，也包括0.5mg/kg-1.0mg/kg或更高剂 量。一般来说，合适的剂量取决于多项参数，包括病毒感染类型、 病毒感染阶段、需要的LevovirinTM血浆浓度、治疗时间等。例如， 一些病毒感染较低血浆浓度LevovirinTM就可以获得治疗成功，而其 他病毒感染可能需要较高的剂量。
本发明主题更进一步的选择方面是，LevovirinTM可以与另外的 药用活性物质联合应用而有助于治疗所述病毒感染。考虑另外的药 用活性物质包括抗病毒剂和免疫调节物质。例如，抗病毒剂包括蛋 白酶抑制剂、或核苷酸和核苷类似物，而免疫调节物质可以包括细 胞因子。
尽管不希望受任何特定理论的限制，但是认为给予LevovirinTM 与患者体内Th1型应答相对于Th2型应答的增加有关，特别认为Th1 型应答相对于Th2型应答的增加是因为Th1型应答绝对增加。所述 细胞因子水平因此可能个别增加或者全面增加。例如，预计对活化 人PBMC给予LevovirinTM可能导致IL-2平均峰值水平相对于活化对 照水平增加至少70％(重量)。另一方面，预计对活化人PBMC给予 LevovirinTM可能导致IFN-γ平均峰值水平相对于活化对照水平增加至 少20％(重量)，或者TNF-α平均峰值水平相对于活化对照水平增加至 少50％(重量)(另见图3A-C)。再例如，预计Th1型应答增强可能包 括IL-2、IFN-γ和TNF-α的平均峰值分别增加(相对于活化对照水 平)42％(重量)、125％(重量)和72％(重量)。
特别应该了解的是，尽管病毒唑与LevovirinTM在可治疗病毒感 染类型上多少存在重叠，但是LevovirinTM的毒性显著降低。例如， 经口给予小鼠180mg/kg剂量的病毒唑，持续四周，产生显著的溶血 性贫血和白细胞减少症，而LevovirinTM没有产生任何可观察到的临 床病状。而且，特别认为，LevovirinTM治疗病毒性疾病主要基于调 节Th1/Th2平衡转向Th1为主的应答，而主要治疗基础不在于直接 的抗病毒作用。本文使用的术语“直接抗病毒”作用或活性是指药 物对病毒装配或复制的直接作用或活性。相反，认为由免疫系统一 个或多个组分至少部分介导引起的病毒活性或复制的减弱不是“直 接抗病毒”作用或活性。同样，还应了解到，根据本发明主题进行 治疗时的Th2型应答相对减少可能对与Th2型应答增加有关的疾病 特别有利(例如HCV感染)。
实施例
下述实施例说明了LevovirinTM的典型合成过程和各种应用。
实施例1
                       LevovirinTM的合成
1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖(1)：于室温在氩气环境中通过 注射器在15分钟内将新鲜配制的无水甲醇HCl(40ml，在0℃下在 甲醇中鼓泡通入无水HCL气体至总重增加4g制得)加入至L-核糖 (50.0g，333.33mmol)的无水甲醇(500ml)搅拌溶液中。加入甲醇HCl后，于室温搅拌该反应混合物3-4小时。然后加入无水吡啶(100ml)， 并在高真空下以低于40℃的温度蒸发至干。再加入无水吡啶(100 ml)，重复这一过程。该残余物以无水吡啶(250ml)溶解后，在氩气环 境中冰浴降温至0℃。通过滴液漏斗在15分钟内将乙酸酐(100ml) 加入至这一冷却的搅拌溶液中。在加入乙酸酐后，于室温除湿环境 下搅拌该反应混合物24小时。然后将该反应混合物蒸发至无水。所 得残余物分配在乙酸乙酯(400ml)和水(400ml)之间，然后在乙酸乙酯 中萃取。将水层用乙酸乙酯(100ml)重新萃取。用水(400ml)、饱和 NaHCO3溶液(2×300ml)、水(300ml)和盐水(200ml)清洗混合的乙酸 乙酯萃取液。该有机萃取物经无水Na2SO4干燥后，过滤，将滤液蒸 发至无水。该残余物在高真空下用无水甲苯(2×150ml)共蒸发。所得 无水油状残余物(92g，95％)直接在以下反应中的使用，而不需要进一 步表征。
将上述反应中得到的糖浆(92g)溶于冰醋酸(300ml)中，并在室 温下用乙酸酐(75ml)处理。将所述溶液在氩气环境中冰浴降温至0-5 ℃。在15分钟内缓慢加入浓硫酸(21ml)。于室温搅拌该反应混合物 14小时，然后倾倒至碎冰(500g)上，搅拌直至冰融化。加入水(500ml) 并用三氯甲烷(CHCl3)(2×300ml)萃取。用水(3×400ml)、饱和NaHCO3 溶液(2×300ml)、水(200ml)和盐水(200ml)清洗所得的三氯甲烷萃取 液。清洗后的有机萃取液经无水MgSO4干燥后，过滤、蒸发无水得 到油状残余物(99g)。该残余物用无水甲苯(200ml)共蒸发，然后溶于 乙醚(200ml)中，将之在10℃下冷却一天后得到无色晶体。用正己 烷∶乙醚(2∶1，50ml)过滤、清洗该结晶固体，然后干燥得到60.5g产 物。
甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯 (3)和甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-5-甲酸酯 (4)：将甲基-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(25.4g，200mmol)、1，2，3，5-四-O-乙 酰基-β-L-呋喃核糖(63.66g，200mmol)和二(对硝基苯基)磷酸酯(1g) 的混合物放入一个RB烧瓶(500ml)中。将该烧瓶放入预加热至165- 175℃的油浴中，在水抽真空下搅拌25分钟。通过置于抽吸器与RB 烧瓶之间的冰冷收集器收集置换出来的醋酸。然后将烧瓶从油浴中 拿出，冷却。当烧瓶温度达到约60-70℃时，加入乙酸乙酯(300ml) 和饱和NaHCO3(150ml)溶液，在乙酸乙酯中萃取。将水层用乙酸乙 酯(200ml)重新萃取。先后用饱和NaHCO3溶液(300ml)、水(300ml) 和盐水(200ml)清洗混合的乙酸乙酯萃取液。该有机萃取物经无水 Na2SO4干燥后，过滤，将滤液蒸发至无水。将残余物溶于乙醇(100 ml)，并用甲醇(60ml)稀释，然后将之在10℃下冷却12小时后得到 无色晶体。用最低温度的乙醇(20ml)过滤、清洗该固体，然后在高 真空下用固体NaOH干燥得到60g(78％)的滤液。将所述滤液蒸发至 无水并以ChCl3→乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液从硅胶柱上提纯。从所述 滤液中分离出两种产物：流速较快的产物8.5g(11％)和流速较慢的产 物5g(6.5％)。流速较慢的产物相当于结晶产物。发现流速较快的产 物即化合物(4)，是以泡沫形式获得的。化合物(3)的产量是65g(84％)。
1-β-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(5)：将甲基-1-(2，3，5-三-O- 乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(62g，161mmol)置于一 个钢瓶中并在0℃下用新鲜制备的甲醇氨(350ml，通过在0℃下向 无水甲醇通入无水HCl气体直至饱和制得)处理。关闭钢瓶并在室温 下摇动18小时。然后将钢瓶冷却至0℃，打开后将内容物蒸发至无 水。所述残余物用无水乙醇(100ml)处理并蒸发至无水。所得的残余 物用丙酮研磨得到固体产物，该固体产物用丙酮过滤和清洗。在室 温下将所得固体产物干燥过夜，然后溶于乙醇(600ml)和水(10ml)的 热混合液中。通过在加热板上加热和搅拌后所述乙醇溶液的体积减 至150ml。将所述热的乙醇溶液冷却后得到无色晶体，将其用丙酮 过滤、清洗并真空干燥。将过滤液进一步浓缩得到另外的物质。总 产量为35g(89％)。
实施例2
测定LevovirinTM和病毒唑作用的细胞因子类型
通过密度梯度离心后，用Lymphokwik(One Lambda，Canoga Park， CA)富集T细胞从健康捐血者血液中分离外周血单核细胞。通过塑 胶粘附去除污染的单核细胞。纯化的T细胞包括＞99％的CD2+、＜1％ 的HLA-DR+和＜5％的CD25+，将之保存于RPMI-AP5(含5％自体血浆、 1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和0.05％2-巯基乙醇的RPMI1640培 养基)中。为了检测细胞因子蛋白的水平，通过加入80ng的葡萄球 菌肠毒素B(SEB，Sigma，St.Louis，MI)活化T细胞(0.2ml含0.2*106 个细胞)，将之在含有0-10μM LevovirinTM或病毒唑的96孔板上于37 ℃培养48小时。活化后，分析上清液中细胞源性细胞因子的产量。 使用专用于IL-2、IFN-γ和TNF-α的酶联免疫吸附反应(ELISA)试剂 盒(Biosource，Camarillo，CA)检测细胞因子。所有的ELISA结果都以 pg/ml表示。数据以活化对照的百分数表示，这一百分数是以 LevovirinTM或病毒唑存在时活化T细胞的细胞因子水平与未经处理 的活化T细胞的细胞因子水平之比乘以100％。因此，细胞因子0效 应应为100％活化对照值。图3A-C图示经LevovirinTM或病毒唑处理 的T细胞和各种Th1细胞因子之间的剂量反应相似。表1显示病毒 唑和LevovirinTM对SEB激活的T细胞表达Th1细胞因子IL-2、IFN- γ和TNF-α的作用。目前的数据清楚地表明，LevovirinTM具有显著的 治疗以1型细胞因子占主导地位疾病的潜力。 治疗方案             IL-2         IFN-γ      TNF-α SEB                  100          100         100 SEB+病毒唑           143±18      131±6      124±4 SEB+LevovirinTM     131±12      122±3      144±7 表1：表中细胞因子的所有数据都是以活化对照的平均百分数(+/-标准差)表示 的。SEB诱导的1型细胞因子分泌的绝对水平(pg/ml+/-标准差)如下：IL-2是 640+/-36，IFN-γ是462+/-37，而TNF-α是223+/-27。所有细胞因子的静息水平 都＜30pg/ml。
实施例3
           直接抗病毒活性和细胞毒性试验
按Huffman，J.H.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，8： 75-83和Barnard，D.L.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，8： 223-223所述方法，体外测试LevovirinTM和病毒唑对流感病毒A和 B、副流感病毒1和2和呼吸道合胞病毒的直接抗病毒活性。国家癌 症研究所(the National Cancer Institute)使用设计用于检测在病毒复制 周期所有阶段起作用的药物的方法[Weislow，O.W.等人，J. Natl..Cancer Inst.1989，81：577-586]对抗人类免疫缺陷病毒的活性进 行了评估。采用Marion等人，Hepatology 1987，7：724-731所述方法， 监测抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。病毒唑的抗HIV活性和细胞毒性 可见以前的资料[McCormick，J.B.，Lancet，1998.II：1367-1369]。
表2显示LevovirinTM和病毒唑在各种病毒感染细胞中的直接抗 病毒活性和细胞毒性的比较。   化合物           活性        HB     HIV   INFL.A   INFL.B   PARA1    PARA3     RSV LevovirinTM 直接抗病毒活性  ＞100   ＞600   ＞200   ＞200   ＞1000   ＞1000   ＞1000
         细胞毒性        ＞100   ＞600   ＞200   ＞200   ＞1000   ＞1000   ＞1000 病毒唑       直接抗病毒活性  ＞100     40      6.1     1.9      40       4        5
         细胞毒性          53    ＞40       56   ＞100   ＞1000     480      100 表2：病毒的测试范围包括乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流 感病毒(INFL)A和B、副流感病毒(PARA)1和3，以及呼吸道合胞病毒(RSV)。 抗病毒活性(EC50)或细胞毒性(CC50)以μM表示。
实施例4
LevovirinTM在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎中的抗炎活性
给BALB/c小鼠(每组6只)腹膜内注射单剂量20μg(1mg/kg)的 LevovirinTM或病毒唑或者200μl PBS，1小时后通过尾静脉注射0.3mg 的伴刀豆球蛋白A(Con A，Calbiochem，San Diego，CA)。24小时后用 甲氧氟烷麻醉小鼠，然后通过心脏穿抽取全血。血液凝固获得血清 并将之用于检测丙氨酸转氨酶(ALT)。所述血清中的ALT水平通过 一个酶活试验(Sigma)检测，该酶活试验基于对ALT催化其底物丙氨 酸和α-酮戊二酸形成产物(丙酮酸和谷氨酸)的比色测量。图4图示病 毒唑或LevovirinTM或PBS作用的血清ALT量。病毒唑和LevovirinTM 都可以明显使Con A诱导的ALT水平由大约1900U/ml降低至969 U/ml±192(病毒唑)以及954U/ml±179(LevovirinTM)。
这样，公开了化合物的特定实施方案和应用以及用LevovirinTM 治疗病毒感染的方法。但是，本领域技术人员应该显而易见的是， 除了已经讲述的之外，还可有许多不偏离本发明构思的改进。因此， 本发明主题只受后附的权利要求书的限制。而且，解释说明书和权 利要求书时，所有术语的解释都应是与上下文一致的最宽泛解释。 尤其是术语“包含”和“包括”应该解释为是指非独有的要素、组 分或步骤，即表示所述要素、组分或步骤可以存在或使用或与其他 没有明确指出的要素、组分或步骤组合。
本申请要求1999年12月30日申请的美国专利申请第09/471,513 号的权益，后一申请要求美国临时申请第60/164,366号和第60/164,365 号的权益，所述专利申请内容均通过引用整体结合到本文中。