本发明申请为解决上述课题而提出,首先,第一提供登革热病毒 感染抑制剂,其特征在于至少含有糖类分子作为有效成分,该糖类分 子具有下式(I)所示的寡糖链作为必须构成要素,
Hex1NAcβ1-3Hex2β1-4Hex1β1- (I)
式中,Hex1和Hex2表示己糖。
本发明申请第二提供登革热病毒感染抑制剂,其特征在于至少含 有下式(II)所示的分子作为有效成分,
(X)n-R (II)
式中,X表示下式(I)所示的寡糖链;R为选自氢
原子、具有S、 N、O、或P原子的取代基、
烃基、脂质、蛋白质和合成高分子的基质, 在任何一种情况下都可以具有取代基;n表示与R结合的寡糖链的数, 为1以上的数,
Hex1NAcβ1-3Hex2β1-4Hex1β1- (I)
式中,Hex1和Hex2表示己糖。
此外,本发明申请第三提供上述任一项所述的登革热病毒感染抑 制剂,其中,Hex3所示的己糖或Hex3NAc所示的
氨基己糖的任何一个 经β1-4连接方式连接到式(I)所示的寡糖链的非还原末端。
本发明申请第四提供上述任一项所述的登革热病毒感染抑制剂, 其中,式(I)所示的寡糖链中Hex1为葡萄糖(Glc),Hex2为半乳糖 (Gal)或甘露糖(Man)。
此外,本发明申请第五提供登革热病毒感染抑制剂,其中,式(I) 所示的寡糖链中Hex1为葡萄糖(Glc),Hex2为半乳糖(Gal)或甘露 糖(Man),Hex3为半乳糖(Gal)或N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
此外,本发明申请第六提供登革热病毒感染抑制剂,其中,式(I) 所示的寡糖链为
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ia)
所示的拟红细胞糖苷脂,
第七提供登革热病毒感染抑制剂,其中,式(I)所示的寡糖链为
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1- (Ib),
此外,第八提供登革热病毒感染抑制剂,其中,式(I)所示的寡糖链 为
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ic)。
本发明申请第九提供针对下式(Ia)所示拟红细胞糖苷脂的单克 隆抗体,
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ia),
第十提供针对下式(Ib)所示寡糖链的单克隆抗体,
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1- (Ib),
第十一提供针对下式(Ic)所示寡糖链的单克隆抗体,
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ic)。
此外,本发明申请第十二提供登革热病毒感染抑制剂,其特征在 于至少含有上述任一项所述的单克隆抗体作为有效成分。
附图说明
图1为表示本发明申请的
实施例中,磷脂酶C处理后的K562细 胞的中性糖脂质级分的TLC分析和病毒结合性的结果的照片。(a: Dittmer
试剂喷雾、b:Orcinol试剂喷雾、c:病毒结合测定;1:中 性糖脂质级分(未处理)、2:中性糖脂质级分(磷脂酶C(+))、3: 中性糖脂质级分(磷脂酶C(-))、4:磷脂酰胆
碱(磷脂酶C(+))、 5:磷脂酰胆碱(磷脂酶C(-));展开
溶剂:CHCl3/MeOH/12mM MgCl2 (50/40/10,vol.);使用板:Polygram Sil G)。
图2为表示本发明申请的实施例中,对于K562细胞的中性糖脂 质级分I~IV的病毒结合性的结果的照片。(a:Orcinol试剂喷雾、 b:病毒(-)、c:病毒(+);1:中性糖脂质级分I、2:中性糖脂 质级分II、3:中性糖脂质级分III、4:中性糖脂质级分IV、5:LacCer、 6:CTH、7:拟红细胞糖苷脂、8:GA1、9:红细胞糖苷脂;展开溶剂: CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.);使用板:Polygram Sil G)。
图3为表示本发明申请的实施例中,对于K562细胞的中性糖脂 质级分II-2的病毒结合性的结果的照片。(a:Orcinol试剂喷雾、b: 病毒(+);1:中性糖脂质级分II-2、2:磷脂酰肌醇、3:拟红细胞 糖苷脂、4:红细胞糖苷脂;展开溶剂:CHCl3/MeOH/12mM MgCl2 (50/40/10,vol.);使用板:Polygram Sil G)。
图4为表示本发明申请的实施例中,采用抗PG单克隆抗体(H11) 的K562细胞精制糖脂质级分的免疫化学检测结果的照片。(1:拟红 细胞糖苷脂、2:中性糖脂质级分II-2;展开溶剂:CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.);使用板:Polygram Sil G)
图5为表示本发明申请的实施例中,拟红细胞糖苷脂导致的对于 登革热病毒的K562细胞的结合抑制效果的解析结果的图。(a:病毒 (+)、b:病毒(-)、c:拟红细胞糖苷脂100μM、d:拟红细胞糖 苷脂200μM、e:拟红细胞糖苷脂500μM、f:GA1 500μM)
图6为表示本发明申请的实施例中,拟红细胞糖苷脂导致的对于 登革热病毒的K562细胞的结合抑制效果的解析结果的照片。(a:病 毒(+)、b:病毒(-)、c:拟红细胞糖苷脂100μM、d:拟红细胞 糖苷脂200μM、e:拟红细胞糖苷脂500μM、f:GA1 500μM)
图7为表示本发明申请的实施例中,对从来自蚊的C6/36细胞得 到的中性糖脂质级分中将登革热病毒结合脂质分离时的溶出图案用 TLC进行分析的结果的照片。
图8为表示本发明申请的实施例中,从来自蚊的C6/36细胞得到 的糖脂质和登革热病毒的结合性的解析结果的图。(1:从C6/36细胞 提取的中性糖脂质级分、2:由1精制的级分13和14、3:由1精制 的级分15)
图9为本发明申请的实施例中,表示拟红细胞糖苷脂糖链导致的 对于登革热病毒的K562细胞的感染抑制的解析结果的图。
本发明申请者们将注意力集中于引起登革热的登革热病毒的宿主 限定为人和蚊这一点上,为了查明这两种
生物共通具有的受容体分子 进行了锐意研究。此外,使用病毒能感染、增殖的培养细胞(K562细 胞:人体骨髓性白血病细胞株和C6/36细胞:来自白纹伊蚊(Aedes albopictus)),对于受容体为脂质的可能性、为蛋白质的可能性、 为它们的糖链加成体的可能性,采用生物化学上、免疫学上、细胞生 物学上的方法进行了研究,对登革热病毒的受体的检索和鉴定取得成 功,从而完成了本发明申请。
即,本发明申请的登革热病毒感染抑制剂含有糖类分子作为有效 成分,该糖类分子具有下式(I)所示的寡糖作为必须构成要素,
Hex1NAcβ1-3Hex2β1-4Hex1β1- (I)。
该糖类分子并不限定于多糖类,可以为糖脂质、糖蛋白。
此外,在该糖类分子中,Hex1和Hex2表示己糖,具体地说,可以 列举葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)。 其中,作为Hex1,优选Glc,作为Hex2,优选Gal或Man。
本发明申请的登革热病毒感染抑制剂还可以含有上述的寡糖部位 结合了例如烃基、合成高分子、脂质、蛋白质等合成化合物或天然化 合物的物质,即
(X)n-R (II)
所示的物质作为有效成分(式中,X表示下式(I)
Hex1NAcβ1-3Hex2β1-4Hex1β1- (I)
(式中,Hex1和Hex2表示己糖)所示的寡糖链;R为选自具有氢原子、 S、N、O、P原子的取代基、烃基、脂质、蛋白质和合成高分子的基质, 在任何一种情况下都可以具有取代基;n表示与R结合的寡糖链的数, 为1以上的数)。
此时,作为Hex1和Hex2,可以列举与上述相同的己糖。此外,作 为R,优选列举H、可以具有取代基的C1-20酰基、可以具有取代基的 C1-20烷基、乳酰基、氨基、羟基、硫酸基、
磷酸基等取代基,聚乙二 醇、聚谷氨酸等高分子链,デンドリマ一、多肽、或甘油、神经酰胺 等脂质,
白蛋白、胎球蛋白、
铁传递蛋白等血清糖蛋白质,DNA等。 其中,通过使用对于人体毒性低的甘油、神经酰胺等脂质,或血清糖 蛋白质作为R,可以获得稳定、处理容易的登革热病毒感染抑制剂的 有效成分。R可以结合到βGlu的C1位上,也可以在R的任何
位置上, 以任何形态与βGlu的C1
碳结合。
上述式(II)的物质,如例如Kitov et al.、Nishikawa et al. 的报告中指出的那样,可以具有对于一个R结合了多个(n个)寡糖 链的结构(Kitov,P.I.et al.,Nature 2000,Vol.403,p.669-672; Nishikawa K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.1999,p. 7669-7674)。
此外,根据本发明者们的研究获知,当Hex3所示的己糖或Hex3NAc 所示的氨基己糖的任何一个经β1-4连接方式连接到式(I)所示的寡 糖链的非还原末端时,寡糖链显示出特别高的登革热病毒结合性,登 革热病毒感染抑制剂的效果提高。因此,式(1)所示的寡糖链优选为
Hex3(或Hex3NAc)β1-4Hex1NAcβ1-3Hex2β1-4Hex1β1 (I′)。
此时,作为Hex3,可以列举葡萄糖(Glc)、果糖(Fru)、半乳糖(Gal)、 甘露糖(Man)等。此外,作为Hex3NAc,可以列举N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc) 等。其中,作为Hex3,优选Gal,此外,作为Hex3NAc,优选GalNAc。
在如上所述的登革热病毒感染抑制剂中,作为式(I)所示的寡糖 链,特别优选列举
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ia)
所示的拟红细胞糖苷脂、
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1- (Ib)
和
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- (Ic)
所示的寡糖链。
本发明申请的登革热病毒感染抑制剂利用了发明者们查明的、登 革热病毒特异地识别、结合上述式所示的特定的寡糖链的性质。因此, 如果采用公知的生物学的方法制造针对这些寡糖链的单克隆抗体,该 单克隆抗体还作为登革热病毒感染抑制剂的有效成分发挥作用。
此外,在如上所述的登革热病毒感染抑制剂中,作为有效成分使 用的、具有以寡糖链为必须构成要素的糖类分子或寡糖部位的物质, 或者寡糖的单克隆抗体以外的成分的组成、作为医药品的形态并无特 别限定。只要不妨碍登革热病毒与寡糖的结合,可以含有各种成分, 其
给药形态也无特别限定。具体地说,可以选择以锭剂、粒-散剂、糖 浆剂等形态的经口给药,以注射剂等形态的非经口给药,以栓剂等形 态的直肠给药等根据患者的症状、状态而定的给药方法。
当经口服用本发明申请的登革热病毒感染抑制剂时,可以为锭剂、 片剂、胶囊、灵药、粉末、颗粒、悬浊液、乳液和糖浆等形态。此外, 作为包覆粒子、多层锭剂或微小颗粒等,可以为缓释或延迟释放的形 态。在这些形态中,除了具有含有以寡糖链为必须构成要素的糖类分 子或寡糖链部位的物质、或寡糖链的单克隆抗体外,登革热病毒感染 抑制剂还可以含有药学上允许的结合剂、
甜味剂、崩解剂、稀释剂、 人工香料、包覆剂、保存剂、
润滑剂和/或效果延迟剂等。
如果为非经口给药,作为有效成分的具有含有以寡糖链为必须构 成要素的糖类分子或寡糖链部位的物质、或寡糖链的单克隆抗体可以 在不具有毒性、允许非经口的稀释剂或溶剂中,具体说,在无菌的水 溶液、或油性溶液、或悬浊液中调制。
对于本发明申请的登革热病毒感染抑制剂,作为有效成分的具有 寡糖链作为必须构成要素的糖类分子、具有寡糖链部位的物质以及寡 糖链的单克隆抗体可以以栓剂等形态直肠给药。优选的栓剂,可以通 过将活性物质与常温下为固体、在直肠熔解的非刺激性的赋形剂混合 而调制。
本发明申请的登革热病毒感染抑制剂虽然不太一般,但还可以具 有吸入喷剂、
软膏等
经皮给药用形态。例如,吸入喷剂可以为溶液、 悬浊液或乳状液,可以含有二
氧化碳、一氧化二氮等低毒性的可吸入 的喷雾剂。另一方面,作为经皮给药用,可以优选列举乳膏、软膏、 胶状、胶冻、酊剂、悬浊液或乳状液的形态。它们可以含有药学上允 许的结合剂、稀释剂、崩解剂、保存剂、润滑剂、分散剂、悬浊剂和/ 或乳化剂。
本发明申请的登革热病毒感染抑制剂可以采用通常所知的各种方 法制造。例如,通过将作为有效成分的具有寡糖链作为必须构成要素 的糖类分子或具有寡糖链部位的分子、以及寡糖链的单克隆抗体与1 种以上优选的载体、辅助剂、稀释剂、或赋形剂一起
磨碎、
粉碎、混 合、分散、溶解、悬浊、混合、混和、组合、乳化或均化而调制。此 外,可以将这些步骤1个以上组合而制造。
在本发明申请的登革热病毒感染抑制剂中,有效成分的含量并无 特别限定。例如,作为有效成分的具有寡糖链作为必须构成要素的糖 类分子、具有寡糖链部位的分子、或寡糖链的单克隆抗体的浓度可以 配合达到500-1000mg/人/日。当然,给予患者的给药量应当考虑患者 的年龄、性别、体重等,根据主治医生的诊断,根据患者的症状、状 态而确定。优选根据患者的体重,在10-100mg/kg的范围内给药。
如上所述的本发明申请的登革热病毒感染抑制剂以抑制登革热症 状的发病为目的,对于有可能感染登革热病毒的患者可以在感染初期 阶段给药。此外,如果将本发明申请的登革热病毒感染抑制剂给药于 显示出登革热症状的患者,也可以治疗登革热。此外,本发明申请的 登革热病毒感染抑制剂通过向登革热流行地区的居民或向流行地区的 移居者给药,可以有效地发挥登革热病毒感染预防剂的作用。
以下列举实施例对本发明申请进行更为详细的说明。当然,本发 明申请并不限于以下的实施例。
实施例
<实施例1>从K562细胞(人体骨髓性白血病细胞株)的登革热病毒结 合性脂质的分离、精制
(1)中性糖脂质的分离、精制
在K562细胞(T-225烧瓶26支)中加入冷PBS(-)0.5ml悬浊, 在4℃下进行离心。在得到的颗粒中加入5ml的精制水,进行充分悬 浊,然后加入100ml CHCl3/MeOH(1/1,vol.),边搅拌边进行1小 时总脂质的提取。将提取液过滤,对于残渣再次进行相同的处理,将 得到的滤液合并转移到茄型烧瓶中,将溶剂除去。在干固的总脂质级 分中加入MeOH 30ml,进行5分钟
超声波处理后,加入10N NaOH 300 μl,在37℃下培育一晚。
反应结束后,加入1N AcOH 3ml,充分悬浊,进行5分钟
超声波 处理,再次将溶剂除去。在干固的总脂质级分中加入精制水5ml,进 行充分悬浊,进行超声波处理5分钟。再次进行同样的处理,在4℃ 下将合并的悬浊液
透析一晚。进行
冷冻干燥,将其作为总脂质级分。
将得到的总脂质级分溶解于CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.)5ml 中,充分悬浊后进行5分钟超声波处理。再次进行相同的处理,将合 并的悬浊液供给到预先用同样的溶剂平衡化的DEAE-Sephadex A-25 (
醋酸型、凝胶容积100ml)柱中。流入凝胶容积10倍量的 CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.),收集该级分,作为中性糖脂质级 分,将溶剂除去。
在中性糖脂质级分中加入2ml的CHCl3/MeOH(1/1,vol.),充分 悬浊。
(a)中性糖脂质级分的TLC分析
将得到的中性糖脂质级分(5μl)、磷脂酰
乙醇胺(PE)(1μl)、 LacCer(Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)(1μl)、神经酰胺单己糖苷(CMH: Glcβ1-1’Cer)(2μl)、神经酰胺三己糖苷(CTH:Galα1-3Galβ 1-4Glcβ1-1’Cer)(2μl)、磷脂酰胆碱(PC)(2μl)、磷脂酰丝 氨酸(PS)(2μl)、磷脂酰肌醇(PI,来自
牛肝脏、SIGMA社)(2 μl)点到HPTLC上,用丙
酮展开一次,进行
风干后,用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2点(60/35/8,vol.)展开,1片用Orcinol试剂喷雾,加热到 110℃,1片用Dittmer试剂喷雾,进行发色。
(b)中性糖脂质级分的再次碱
水解将中性糖脂质级分的溶剂除去,加入MeOH 5ml,充分悬浊后进行 5分钟超声波处理。加入10N NaOH 50μl,在37℃下培育3小时。反 应结束后,加入0.1N AcOH 5ml,充分悬浊,进行5分钟超声波处理, 再次将溶剂除去。向其加入精制水5ml,进行充分悬浊,进行超声波 处理5分钟。再次进行同样的处理,在4℃下将合并的悬浊液透析一 晚。进行冷冻干燥。
(c)磷脂酶C处理
由于考虑到中性糖脂质级分中含有磷脂质,因此在PC完全水解 的条件下进行磷脂酶C处理。
首先,将中性糖脂质级分(50μl)和作为正对比的PC(5μl) 分别装入2根试管中,在氮气流下
蒸发固化,每个加入100μl乙醚/ 乙醇(98/2,vol.)。进行1分钟超声波处理,在各试料的1根试管 中加入100μl用含CaCl2的0.1M Tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲 烷)(pH7.2)溶解的磷脂酶C(来自Clostridium perfingens,SIGMA 社)(0.1mg/100μl),在剩余的1根中只加入100μl含CaCl2的0.1M Tris缓冲液(pH 7.2),进行充分悬浊后,在25℃的水浴中反应3 小时。
反应结束后,在氮气流下将溶剂除去,用反相柱将生成物脱盐。 在氮气流下将脱盐级分蒸发固化,将CHCl3/MeOH(1/1,vol.)在中性 糖脂质级分中加入30μl,在PC中加入15μl,充分悬浊后,点到TLC 板(Polygram Sil G)上。用丙酮将TLC板展开一次,进行风干后, 用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.)展开,1片用Orcinol 试剂喷雾,加热到110℃,1片用Dittmer试剂喷雾,进行发色。
此外,进行病毒结合测定。
结果示于图1。没有发现磷脂酶C处理产生的病毒结合性的变化。 在磷脂酶C处理后,仍观察到几个PC以外的磷脂质的谱带,因此使用 医用珠状(イアトロビ-ズ)柱进一步将中性糖脂质级分精制为4个级 分。
将中性糖脂质级分全量进行磷脂酶C处理,在4℃下将反应液全 量透析一晚,进行脱盐。对于干燥标品,加入1ml CHCl3/MeOH(8/2, vol.),进行悬浊,进行5分钟超声波处理后,将其装入医用珠状柱 中,用①CHCl3/MeOH(8/2,vol.)、②CHCl3/MeOH/H2O(65/25/4,vol.)、 ③CHCl3/MeOH/H2O(60/35/8,vol.)、④CHCl3/MeOH/H2O(50/40/10, vol.)4种溶剂连续溶出,进而将中性糖脂质级分分为4个级分(分 别为中性糖脂质级分I~IV)。
在氮气流下将它们蒸发固化,各自加入1ml的CHCl3/MeOH(1/1, vol.),然后将每个5μl点到TLC板(Polygram Sil G)上。用丙酮 将板再一次展开,用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.)展开, 用Orcinol试剂、Dittmer试剂喷雾,进行发色。
(d)中性糖脂质级分I~IV的化学分析和病毒结合性的研究
将上述(c)中得到的中性糖脂质级分I~IV(每个10μl)、作 为对照标准品的LacCer(1μl)、CTH(2μl)、拟红细胞糖苷脂(PG: Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)(2μl)、GA1(Galβ 1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)(2μl)、红细胞糖苷脂 (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)(2μl)点到TLC板 (Polygram Sil G)上,用丙酮展开一次后,用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2 (50/40/10,vol.)展开,用Orcinol试剂喷雾,加热到110℃,进 行发色。对于中性糖脂质级分I~IV,采用上述的方法进行TLC/病毒 结合测定。
结果示于图2。
从图2可以看到,在中性糖脂质级分I~IV中,中性糖脂质级分 II显示出与病毒的强结合性,表明具有与称为CTH、PG和红细胞糖苷 脂的中性糖脂质非常近的分子结构。
(e)从TLC板擦取、提取目的糖脂质
然后从TLC板将显示出与病毒结合性的部分擦取,进行提取,得 到含有目的物质的中性糖脂质级分。
作为前处理,将TLC板(Polygram Sil G)用CHCl3/MeOH/H2O(50/40/10,vol.)展开,进行风干。在氮气流下将中性糖脂质级分 II蒸发固化,加入0.1ml的CHCl3/MeOH(1/1,vol.),将其全量点 到板上达到1μl/mm lane,用丙酮一次展开后,用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.)展开。
切取TLC的两端,用Orcinol试剂喷雾,加热到110℃,使其发 色后,确认了目标糖脂质的谱带。
用
剪刀切取剩余的与板上的谱带对应的部分,从切取的TLC板上 擦取
二氧化硅凝胶,向其加入CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.)25ml, 搅拌1小时,进行提取。用
棉栓将提取液过滤,从滤液中将溶剂除去。 向其加入CHCl3/MeOH(8/2,vol.)1ml,进行超声波处理,供给到塞 进巴斯德氏移液管的医用珠状柱(凝胶容量1ml)中。
将CHCl3/MeOH(8/2,vol.)流入15ml柱中,收集该级分。(中 性糖脂质级分II-1)
然后,将溶出溶剂改为CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.),流入 20ml柱中。(中性糖脂质级分II-2)
从各个级分中将溶剂除去后,加入0.5ml的CHCl3/MeOH(1/1, vol.)。将每个5μl点到TLC板上,用丙酮展开一次后,用 CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10,vol.)展开,用Orcinol试剂喷 雾,加热到110℃进行发色。此时,作为对照标准品,还将PG、红细 胞糖苷脂、CTH每个2μl点到TLC上。
(2)对中性糖脂质级分的病毒结合性的解析
将采用上述(1)的方法得到的中性糖脂质级分II-2(10μl)、 PI(10μl)、PG(2μl)、红细胞糖苷脂(1μl)点到TLC板(Polygram Sil G)上,用丙酮展开一次后,用CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10, vol.)展开,用Orcinol试剂喷雾,加热到110℃使其发色。用上述 方法进行TLC/病毒结合测定。
结果示于图3。
从图3可以确认,在中性糖脂质级分II-2中含有在TLC上与PG 非常近的位置上展开的糖脂质,此外该糖脂质显示出与登革热病毒的 强结合性。此外,即使对于作为对照标准品的PG,也观察到同样的病 毒结合性。
(3)中性糖脂质级分中所含结合性脂质的结构解析
如上所述,显示出与登革热病毒的结合性的糖链分子具有与PG 非常近的糖链结构。因此,使用抗PG单克隆抗体进行免疫化学分析。
(a)免疫化学分析
将中性糖脂质级分II-2(10μl)和PG(2μl)点到TLC板 (Polygram Sil G)上,用丙酮、CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(50/40/10, vol.)连续展开。在1%BSA-PBS(牛血清白蛋白-
磷酸盐缓冲盐)溶液 中、4℃下将TLC板密封一晚。与用含有1%BSA的PBS稀释5000倍的 抗PG单克隆抗体(Clone H11)(5ml)反应1小时后,用含有0.05% 吐温20的PBS(10ml)洗涤3分钟,将其重复5次。洗涤结束后,与 用含有1%BSA的PBS稀释5000倍的HRP(辣根髓过
氧化酶(horseradish perosidase))标记ヤギ抗病毒IgG+IgM(5ml)(American Qualex Antibodies社)反应1小时。用PBS(-)将板洗涤3分钟,将其重复 5次。最后与发色基质溶液[0.1M
柠檬酸盐缓冲液pH6.0(5ml)、CH3CN中的4-氯-1-
萘酚0.11M(100μl)、CH3CN中的DEPDA 0.06M(100 μl)、30%H2O2(10μl)]反应,检测点。
结果示于图4。
从图4可以判明,在中性糖脂质级分II-2中含有与PG相同的糖 脂质。
由上可以确认,K562细胞中的登革热病毒结合性脂质为具有下式 所示拟红细胞糖苷脂(PG)糖链结构的中性糖脂质,
Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Ceramide
式中,Gal:半乳糖,GlcNAc:N-乙酰基葡糖胺,Glc:葡萄糖。
<实施例2>使用流式细胞测定器(Flow cytometer)进行的PG导致的 登革热病毒在K562细胞表面的结合抑制效果的解析
将K562细胞培养到溜圆后,分取到微管中以达到2× 105cells/0.1ml。在4℃下、以10000rpm将其离心2分钟后,用含有 0.1%BSA的PBS 1ml将得到的细胞的颗粒洗涤1次。在含有0.1%BSA 的PBS中、在4℃下将登革热病毒液(2000units/ml)和PG(0、100、 200、500μM)或作为对照糖脂质的GA1(500μM)预培育1小时后, 分别加入到K562细胞中100μl,在4℃下使其与细胞结合1小时。需 说明的是作为病毒(-),只加入同量的含有0.1%BSA的PBS。反应结 束后,用冷PBS(-)1ml将细胞洗涤3次,作为第一抗体,将人体抗 黄病毒属(flavivirus)抗血清(批#1)稀释200倍,每个加入100 μl,充分悬浊后,在4℃下反应30分钟。用冷PBS(-)1ml将细胞 洗涤3次,作为第二抗体,将FITC标记山羊抗人IgG(Zymed社)稀 释50倍,每个加入100μl,遮光后,在4℃下反应30分钟。反应结 束后,用冷PBS(-)1ml将细胞洗涤3次,对于得到的颗粒加入0.5ml 的冷PBS(-),充分悬浊后,用流式细胞测定器(Epics,U.S.A.) 进行测定。
研究PG引起的登革热病毒在K562细胞上的结合抑制,将PG浓 度依存性示于图5。
从图5可以看出,PG的浓度依赖性地登革热病毒在K562细胞上 的结合受到抑制。从作为对照糖脂质的GA1为中性的4糖,以及分子 内的非还原末端具有半乳糖残基方面出发,为与PG非常类似的物性。 但是,GA1即使在500μM的浓度下,也不能抑制登革热病毒在K562细 胞上的结合。
由以上可知,PG特异地与登革热病毒结合,由于该特异的结合, 病毒在宿主细胞表面的
吸附得到抑制。
<实施例3>拟红细胞糖苷脂导致的登革热病毒在K562细胞表面的结合 抑制活性的研究
(1)登革热病毒浓度
将K562细胞培养到溜圆后,分取到微管中以达到4× 105cells/0.1ml。在4℃下、以3500rpm将其离心3分钟后,用含有 0.1%BSA的PBS 1ml将得到的细胞的颗粒洗涤1次。此外,在4℃下、 以3500rpm离心3分钟后,将登革热病毒原液用含有0.1%BSA的PBS 分别稀释为5000units/ml、2000units/ml、1000units/ml、 500units/ml后,分别加入到K562细胞中100μl,在4℃下反应1小 时。
作为病毒(-),只加入同量的含有0.1%BSA的PBS。
反应结束后,用冷PBS(-)1ml将细胞洗涤3次,作为第一抗体, 将人体抗黄病毒属抗血清(批#1)稀释200倍,每个加入100μl,充 分悬浊后,在4℃下反应30分钟。用冷PBS(-)1ml将细胞洗涤3次, 作为第二抗体,将FITC标记山羊抗人IgG(Zymed社)稀释50倍,每 个加入100μl,遮光后,在4℃下反应30分钟。
反应结束后,用冷PBS(-)1ml将细胞洗涤3次,对于得到的颗 粒加入0.5ml的冷PBS(-),充分悬浊后,用流式细胞测定器(Epics, U.S.A.)进行测定。
以后,病毒的浓度为2000units/ml。
研究PG产生的登革热病毒在K562细胞上的结合抑制,PG浓度依 存性示于图6。
(2)第一抗体稀释浓度的研究
根据(1),将登革热病毒浓度设定为1000units/ml,进行结合 测定。这里,用冷PBS(-)进行稀释,使第一抗体的浓度为200倍、 400倍、800倍、1600倍。将稀释200倍的第一抗体用于病毒(-)。 实验方法按照(1)。
以后,第一抗体为稀释200倍。
(3)拟红细胞糖苷脂对病毒结合性产生的影响
将K562细胞(1×105cell)
播种到24well培养用板上,在RPMI 培养基中为全量1ml。加入进行稀释使拟红细胞糖苷脂的最终浓度为0 μM、100μM、200μM、500μM,在37℃下反应1小时。将其低速离 心,在得到的颗粒中加入含有0.1%BSA的冷PBS 1ml。转移到微管中, 采用(1)的方法评价病毒结合性。
从图6可以明确地观察到,如果预先将登革热病毒和拟红细胞糖 苷脂培育,依赖于拟红细胞糖苷脂的浓度,产生登革热病毒在K562 细胞上的结合抑制。
此外,以具有4糖结构的糖链、为结构类似中性糖脂质的GA1(ア シアロGM1)(Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer)作为阴 性对照,进行同样的实验,结果对于登革热病毒在细胞表面的结合完 全没有影响。
因此可以确认,登革热病毒结合抑制性是拟红细胞糖苷脂糖链结 构所具有的特异的特性。
以上表明,在K562细胞表面存在的拟红细胞糖苷脂作为登革热 病毒的受体本身、或其一部分发挥作用。
<实施例4>来自蚊子培养细胞株的登革热病毒结合性脂质的分离、精 制和鉴定
(1)C6/36细胞的培养
作为登革热病毒的标的细胞,使用对于该病毒显示感受性,而且 具有高病毒产生能力的来自白纹伊蚊(Aedes albopictus)的C6/36 细胞株。C6/36细胞在10%非动化牛
胎儿血清和含1%非必须氨基酸的 MEM培养基中,在28℃下进行培养。
细胞株的继代是向1/10的前培养液,加入新鲜MEM培养基,使 全量为20ml,在T-75烧瓶中播种。
(2)总脂质的提取
从15L培养液中收集C6/36细胞。在得到的细胞颗粒中加入 CHCl3/MeOH/H2O(10/10/1,vol.)1L,充分悬浊后,进行24小时提 取。
将其过滤,对于残渣再次进行同样的处理,将得到的上清合并, 转移到茄型烧瓶中,将溶剂除去。再加入MeOH 100ml,充分悬浊后, 进行10分钟超声波处理,加入10N NaOH 1ml,在37℃下培育15小时。
反应后,加入10N AcOH 1ml,充分悬浊后,进行5分钟超声波处 理,再次将溶剂除去。向其中加入20ml蒸馏水,充分悬浊后,进行 30分钟超声波处理。再次进行同样的处理,在4℃下将合并的悬浊液 进行46小时透析,进行冷冻干燥,将其作为总脂质级分。
(3)离子交换柱色谱法
在得到的总脂质级分中加入CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.) 100ml,充分悬浊后,进行10分钟超声波处理。将其供给到预先用同 样的溶剂平衡化的DEAE-Sephadex A-25(醋酸型、凝胶容积400ml) 柱中。流入凝胶容积47.5倍量的CHCl3/MeOH/H2O(30/60/8,vol.), 收集该级分,作为中性糖脂质级分。
(4)中性糖脂质级分的精制
将中性糖脂质级分溶解于3ml的CHCl3/MeOH(8/2,vol.)中。 将该级分1ml注射到安装有预先用同样的溶剂平衡化的Senshu Pak AQUASIL-SS-3251柱(8φ×250mm)的HPLC系统(PU-2080Plus、日 本分光)中。以从相同溶剂(100%)到相同溶剂:CHCl3/MeOH/H2O(60/35/8,vol.)(30/70,vol.)的直线浓度梯度流入总溶剂量100ml, 将柱溶出液每2ml分取。将各级分点到HPTLC上每个2μl,用 CHCl3/MeOH/12mM MgCl2(60/35/8,vol.)将板展开,用Orcinol试 剂喷雾,加热到110℃,进行发色,确认糖脂质的溶出。
(5)中性糖脂质和登革热病毒的
反应性在3片TLC板(Polygram Sil G,Marchery Nagel)上每个点中 性糖脂质级分1μl,进行风干后,用nPrOH/H2O/NH4OH(75/25/5,vol.) 进行展开,使其风干,1片用Orcinol试剂喷雾,加热到110℃,使其 发色。在剩余的2片上加入PBS,使其慢慢浸透后,进行吸引,用溶 液A(1%蛋白清蛋白、含有1%聚乙烯吡咯烷酮的PBS)在室温下密封1 小时。
反应后,将溶液A用于病毒(+),加入3ml调制为1000units/ml 的登革热病毒(D2Th7株)悬浊液,在病毒(-)中只同量加入溶液A, 在4℃下静置一晚。用PBS(-)将板洗涤3分钟、3次。
然后,加入2.5ml用溶液A稀释到1000倍的人抗黄病毒属抗血 清,在室温下反应1小时。用PBS(-)将板洗涤3分钟、3次。最后 与2.5ml发色基质溶液[0.1M柠檬酸盐缓冲液pH6.0(2.5ml)、CH3CN中的4-氯-1-萘酚0.11M(50μl)、CH3CN中的DEPDA0.06M(50μl)、 30%H2O2(5μl)]反应,检测出结合的病毒粒子。需说明的是登革热病 毒(D2Th7株)和人抗黄病毒属抗血清由长崎大学热带医学研究所、 五十岚章教授、森田公一教授给予。
(6)精制糖脂质的TLC分析
分离的中性糖脂质每1.5-2μl点到HPTLC上。用nPrOH/H2O/NH4OH(75/25/5,vol.)进行展开,用Orcinol试剂喷雾,加热到110℃, 进行发色。
此外,将各级分每0.5-1μl点到3片TLC板(Polygram Sil G) 上,用丙酮展开一次,进行风干后,用nPrOH/H2O/NH4OH(75/25/5, vol.)进行展开,使其风干。1片用Orcinol试剂喷雾,加热到110 ℃,使其发色。剩余的2片采用(5)的方法进行病毒结合测定。
然后,采用作为登革热病毒高感受性细胞株的来自蚊的C6/36细 胞,进行登革热病毒结合脂质的探索。
登革热病毒结合脂质与K562细胞的情况相同,在采用阴离子交 换柱色谱法进行的分级中,在中性糖脂质级分中溶出。
为了从该级分中将结合性脂质分离,进行安装了
二氧化硅柱的 HPLC。用TLC对其溶出图案进行分析,结果示于图7。图中箭头表示 的2种糖脂质具有结合性。在此次进行的HPLC的条件下,2种糖脂质 被完全分离。
对精制糖脂质和登革热病毒的结合性进行解析的结果示于图8。 级分13、14和15所含的精制糖脂质显示出非常强力地与病毒结合。 与来自昆虫的标准糖脂质的结构相比,级分13、14中含有的糖脂质的 结构为GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1-1Cer(其中,Man:甘露糖,Cer: 神经酰胺),另一方面,级分15中含有的糖脂质的结构为全新结构, 推定为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1-1Cer。
如果将由K562细胞作为结合性脂质分离的拟红细胞糖苷脂和从 以上的实施例分离的糖脂质的结构综合起来,则得到如下结果:
拟红细胞糖苷脂 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer
级分15 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1-1Cer
级分13、14 GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1-1Cer。
因此,从这些结构出发可知,用于与登革热病毒结合的必需的最 小的糖链结构为GlcNAcβ1-3Man(或Gal)β1-4Glcβ1-,此外,通 过在非还原末端经β1-4连接方式连接Gal,其结合性提高。
<实施例5>拟红细胞糖苷脂糖链导致的登革热病毒对K562细胞感染抑 制活性的研究
在以上实施例中使用的拟红细胞糖苷脂糖链均为结合到神经酰 胺上的物质。
因此确认,拟红细胞糖苷脂糖链导致的登革热病毒的结合抑制性 不依赖于对于拟红细胞糖苷脂的结合基质,即使是神经酰胺以外的结 合基质,也能获得同样的效果,因此只对于末端不具有基质的拟红细 胞糖苷脂糖链,试验其病毒结合抑制性。
(1)拟红细胞糖苷脂糖链和其他寡糖的调制
使用以下寡糖。
拟红细胞糖苷脂糖链 Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc
乳-N-四糖 Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc
乳糖 Galβ1-4Glc
N-乙酰基乳糖胺(LAcNAc) Galβ1-3GlcNAc
均用灭菌PBS(-)调制为1mM的储备溶液。将其适当稀释,用于 感染抑制实验。
(2)登革热病毒溶液的调制
用含有0.2%BSA的未添加血清的RPMI培养基(SF-RPMI)进行稀 释,以使最终病毒量达到3×105FFU(focus forming unit)/样品, 充分搅拌后,放置在
冰上。
(3)用寡糖进行的登革热病毒的前处理
对于上述(2)调制的登革热病毒溶液630μl(每1样品的病毒 容量),加入等量的稀释的含寡糖溶液,充分搅拌后,在28℃下培育 30分钟。将其前处理后作为病毒溶液。
此外,作为阴性对照,使用将PBS(-)和病毒溶液混合的溶液。
(4)病毒感染实验
用SF-RPMI将K562细胞洗涤1次后,用0.1%BSA-SF-RPMI调制 成1×106cells/ml。将该细胞悬浊液每100μl装入试管中。对其进行 前处理后,加入病毒溶液,轻轻搅拌后,在37℃下进行2小时对细胞 的感染。其间,每20分钟轻轻搅拌试管。以3400rpm进行3分钟离心 后,将病毒溶液除去,用0.1%BSA-SF-RPMI将细胞洗涤3次。在细胞 的颗粒中加入含2%血清的RPMI培养基(2%FCS-RPMI)2ml,进行悬浊, 转移到35mm盘中,在37℃下进行培养。
一定时间培养后将细胞回收,进行病毒
抗原的检测。
(5)病毒抗原的检测(病毒感染价的测定)
将回收的细胞转移到新试管中,用PBS(-)洗涤1次。在细胞的 颗粒中加入4%低聚甲
醛/PBS(固定液)200~600μl,在4℃下进行 10分钟固定操作。
加入PBS(-),达到全量1ml后,以2000rpm进行离心5分钟。 再进行同样的操作1次后,将细胞悬浊在PBS(-)1ml中,在4℃下 进行保存(固定化)。
在固定化细胞中加入perm溶液(IC PermTM Cell Permeabilization buffer,BIOSOURCE International)700μl,涡 旋后,在室温下放置4分钟。以2500rpm进行3分钟离心后,在试管 中残留perm溶液40μl,将上清除去。再以2500rpm离心3分钟后, 完全将perm溶液除去。在细胞的颗粒中加入Alexa标记小鼠抗黄病毒 属单克隆抗体(Clone 6B6C-1),充分悬浊后,用冰遮光,培育30 分钟。以2500rpm离心3分钟后,将上清除去,将细胞悬浊于PBS(-) 1ml中,在冰上放置5分钟(洗涤)。
再进行2次同样的操作,最后在细胞的颗粒中加入500-1000ml 的PBS(-),充分悬浊后,用流式细胞测定器进行抗原阳性细胞的检 测。
结果示于图9。与结合抑制相同,拟红细胞糖苷脂糖链浓度依赖 性地抑制登革热病毒对K562细胞的感染。因此,拟红细胞糖苷脂糖链、 来自昆虫的类似糖链显示出作为强力的登革热病毒感染抑制剂是有效 的。此外,还确认拟红细胞糖苷脂糖链导致的登革热病毒的结合抑制 性不依赖于结合基质。
如上所详细说明的那样,本发明申请提供能有效防止登革热病毒 感染的登革热病毒感染抑制剂。
尽管登革热被
指定为第4类感染症,但目前为止其有效的治疗方 法尚未确立,对于作为原因
微生物的登革热病毒向宿主感染的机理尚 有多处不明。
本发明申请首次实现了登革热病毒感染抑制剂,与此同时,对于 弄清登革热病毒感染所产生的细胞应答的分子机理,开发效果更好的 抗登革热剂等的有用性大。