已经使用多种化验来检测身体样品中的各种物质(通常一般称作分析物或配体)的存在。通常，这些化验涉及抗原抗体反应、配体、抗配体、配体受体，并利用包括放射性金属可溶性标记、金属酶可溶性标记、荧光金属可溶性标记或视觉上可观测到的金属可溶性标记在内的合成缀合物和特别设计的反应室。大多数当前测试被设计成进行定量测定，但是在许多情况下，需要的是定性指示或者阳性/阴性指示。已经利用化验来检测传染剂，例如流感。
由于测试液体中的目的分析物的浓度通常较低，所以即使阳性/阴性化验也必须非常灵敏。假阳性也会比较麻烦，特别是利用凝集或其它快速检测方法(例如，浸量尺(dipstick)和色变试验)。由于这些问题，已经开发出使用金属溶胶或其它类型的色粒的夹心(sandwich)化验方法和其它灵敏的检测方法。这些技术还未解决在这些快速检测方法中碰到的所有问题。此外，在高致病病原体(例如，流感病毒)出现的情况下，需要开发有效的实验室的或即时(point-of-care)的方法和系统，从而能够有效而又准确地检测一种或多种传染剂，例如流感类型或亚型内的株。
在遍及世界的局部暴发或流行病中常会看到流感。流行病可以在任何时间出现，并可能在很少预兆或毫无预兆的情况下爆炸性地发生。受感染的人数可以从几百变化到几十万。流行病可能是短暂的，持续数日或数周，但大多数流行病会持续数月。虽然流行病对于大多数人来说是轻型疾病，但是它对老年人、非常年幼或虚弱的人构成生命威胁。流行病导致生产力受到巨大损失。因此，需要开发出在从受试者获得的样品中有效地检测出存在的病原体(pathogen)(例如，流感)的类型和亚型的装置和方法，从而判断传染是否由流感(季节性流感)的典型的或预想的亚型或者作为流行性或全国流行性病原体的亚型引起。
本发明的目的在于提供一种快速且灵敏的用于检测生物样品中的分析物的方法。另一目的在于提供一种化验，该化验具有高灵敏度，并且与传统化验相比具有较少的假阳性。又一目的在于提供一种用于检测在生物样品中存在的低水平的分析物的装置和系统。再一目的在于提供一种化验系统，该化验系统涉及最少数量的程序步骤，即使该化验系统由未经训练的人使用，仍产生可靠的结果。再一目的在于提供一种用于测试传染剂的系统，该系统在几分钟之内提供识别一种或多种传染剂的结果。再一目的在于一种系统，在该系统中，尽管在获取结果所需的反应完成之后1小时至若干小时才能读取结果，但测试器具的结果对于目标分析物来说均是特定的且灵敏的。根据以下说明书、附图和权利要求书，本发明的这些和其它目的和特征将是显而易见的。

在本发明的特定方面中，提供了一种样品采集装置(SCD)，用于检测可能存在于样品中的一种或多种目标抗原或分析物。样品采集装置可以与测试装置结合使用。一方面，提供了一种用于检测一种或多种分析物的系统，所述系统包括SCD、测试装置和读取器，如这里进一步所述。
在各种实施例中，SCD包括一个或多个上密封室，所述密封室可以包含相同或不同的溶液。在一个实施例中，上密封室包括至少两个区室或者均包括子室。在其它实施例中，上室可以包括可穿刺、可破裂或可破坏的安瓿。在一些实施例中，SCD提供必要的试剂，从而与可能存在于样品中的一种或多种不同的目标抗原形成复合物(complex)，其中，所述复合物包括捕获部分和可检测的标记；测试装置提供必要的工具，从而可寻址地捕获一种或多种由此形成的复合物；读取器提供工具，用来检测从可寻址地捕获的复合物中检测一个或多个信号。
在各种实施例中，上密封室包括提取缓冲液和/或试剂、样品采集器具、样品采集器具固定器(holder)和多种试剂，其中，所述试剂包括多个特定结合的对，其中，每对包括缀合到第一特定结合剂的标记和缀合到第二特定结合剂的捕获部分，其中，第一特定结合剂和第二特定结合剂特定地结合目标抗原，从而形成复合物。捕获部分可以被“捕获”或者被固定，其中，设置在基底上的配对物捕获部分结合到捕获部分-特定结合剂缀合物。
在各种实施例中，多种特定结合剂包括多组特定结合对，其中，每组包括特定结合一种目标抗原的特定结合剂，第二组特定结合对特定结合第二种不同的抗原。因此，包含在SCD中的多种特定结合对能够检测多种不同的抗原。
在各种实施例中，捕获部分是寡核苷酸、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、吡喃RNA(pyranosyl，pRNA)、适体或者它们的组合。在各种实施例中，标记是金属、荧光团、发色团或它们的组合。在一些实施例中，包括在SCD中的多种特定结合对可以包括一种类型的捕获部分，而没有不同的捕获部分配对物，例如，每个特定结合剂缀合到pRNA，其中，针对不同抗原的每组包括不同的pRNA。在其它实施例中，多个特定结合对包括一种或多种不同的捕获部分，例如，针对一组特定结合对的pRNA，而针对另一组的链霉抗生物素，或者不同类型的捕获部分的组合。
在一些实施例中，包含在SCD中的多个特定结合对可以包括一种类型的标记(例如，特定结合对，其中，每组缀合到具有相同波长信号的荧光团或者不同波长信号的荧光团)。在其它实施例中，特定结合对可以包括不同类型标记的组合(例如，金属和荧光团的组合)。在一个实施例中，捕获部分是pRNA，标记是铕。
在各种实施例中，特定结合剂是抗体，所以特定结合对包括抗体-标记结合剂(“标记探针”)或者抗体-捕获部分(“捕获物探针”)。在这种实施例中，“配对物捕获部分(partner capture moiety)”包含在设置在测试装置中的测试膜上，配对物结合特定捕获探针，例如，pRNA配对物特定结合包含在捕获探针(针对目标抗原的抗体)上的pRNA(即，捕获部分)。
在一些实施例中，检测的不同的分析物是病毒或者病毒的组分(例如，多肽)。在各种实施例中，不同的抗原来自流感病毒和流感病毒的亚型。在一个实施例中，可以检测到的流感病毒是甲型流感病毒和乙型流感病毒以及流感病毒的亚型。一个实施例涉及检测甲型流感病毒株和乙型流感病毒株以及HxNy形式的亚型，其中，x可以是1至16，y可以是1至9，或者为xy的任意组合。
在又一实施例中，检测的不同分析物是一种或多种不同的传染剂和/或一种或多种传染剂的不同亚型。这种传染剂包括HIV、HCV和分枝杆菌(myobacterium)、肺结核、细菌、真菌、酵母、HSV、HPV或它们的组合。
在各种实施例中，SCD包括采样器具，所述采样器具提供从受试对象采集样品的工具，其中，包含的采样器具连接经过采样器具固定器连接到上室。采样器具设置在轴的远端，所述轴可以是实心的、空心的或者半透的。在一些实施例中，采样器具是药签、梳子、刷子、刮板、棒、泡沫、絮状的基底或旋转的基底。
在各种实施例中，SCD包括一个或多个密封的上室，其中，密封件作为阀来控制SCD的上室和下室之间的流体连通。在一些实施例中，阀可以是破裂阀、挡板阀、扭转阀、螺旋阀、可破碎的阀、可刺穿的阀或可破坏的阀。在其它实施例中，上室可以包括一个或多个安瓿，除非施加压力使安瓿破裂、破坏或破碎从而释放其中包含的任何成分，否则安瓿防止其中包含的溶液流动下室。
本发明的一方面涉及一种SCD，SCD包括活塞器具上游的贮样品室、用于传送一种或多种溶液的多个可密封的孔、用于过滤来自样品的一种或多种化合物从而便于样品储藏的基底以及能够特定结合所述样品中的至少一种分析物的试剂。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于检测一种或多种分析物的测试装置，其中，所述装置包括主体中的横向流动膜(lateral flow membrane)，横向流动膜的上游的室包含流体或溶液，其中，在所述室和所述横向流动膜之间设置有间隙(gap)，从而防止所述室和横向流动膜之间的流体连通。在一个实施例中，对所述施加的压力将所述间隙推紧，从而在所述室和横向流动膜之间形成流体连通。在一个实施例中，SCD的顶端适合的开口直接设置在位于间隙下游而位于横向流动膜上游的灯芯材料垫正上方。
在一实施例中，测试装置室包括含有相同或不同溶液的一个或多个子室。在其它实施例中，子室的室包括可破裂、可破碎或可破坏的一个或多个安瓿。因此，对这种安瓿施加压力时，成分被可控制地释放。如这里所述，测试装置可以包括间隙工具或者不包括间隙工具(gap means)，用于中断所述室与横向流动膜之间的流体连通。测试间隙可以形成为零到3.0mm、0.5mm到3.5mm、1.0mm到2.5mm、1.0mm到3.0mm、或2.0mm到4.0mm。
在一些实施例中，测试装置可以包括容纳横向流动膜的主体，其中，所述主体提供一个或多个窗口，通过所述窗口可以观察到横向流动膜。在这里所述的各种实施例中，测试装置包括横向流动膜，横向流动膜包括灯芯材料基底和设置在所述横向流动膜上的测试区域的上游或下游的吸收基底。在一些实施例中，在SCD或测试装置中提供了用于采集存档用的小体积样品的基底。在一个实施例中，提供这种存档工具的基底是采集小体积样品的过滤器、膜或纸，以后从装置上去除所述基底。
在各种实施例中，SCD和/或测试装置包括一个或多个相同的识别标签，可以从一个装置去除所述识别标签并且放置在另一个装置上。
在一些实施例中，测试装置被形成为仅适于(特定配体(adaptor)的形状)读取器的容纳口(receiving port)，如果上游的室被压下，则表示其中包含的清洗缓冲液或者跟踪缓冲液已经通过横向流动膜被释放。在这种实施例中，特定配体的测试装置和读取器提供了一种工具来验证测试装置上游的室中的跟踪缓冲液或溶液已经释放，从而清洗过的任何样品通过横向流动膜而位于横向流动膜的上游。因此，特定的配体提供了“安全工具”来防止读取未处理的样品。
在本发明的另一方面中，处理过的样品通过测试装置的横向流动膜来运转，可以放置30分钟至几个小时。在各种实施例中，多个样品通过测试装置来运转，在0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时后读取样品，得到连续并且精确的信号。
在本发明的特定方面，这里公开的装置用在检测可以存在于样品中的一种或多种分析物的方法中。在一些实施例中，方法涉及检测传染剂的一个或多个株。在一个实施例中，一种方法涉及利用本发明的装置来检测一种或多种流感病毒及其亚型。例如，提供用于检测甲型流感和乙型流感以及可以存在于单个样品中的甲型流感的亚型的方法。
在一个实施例中，提供一种方法，来确定受试对象是否被感染流行性、非流行性流感或者有疫苗的流感病毒的株。
在一些实施例中，测试装置排除能够特定结合目标抗原的任何试剂或结合剂。
在本发明的一方面，提供了一种读取器，来检测来自测试装置的信号，其中，所述读取器是UV LED读取器。在各种实施例中，检测的信号是来自检测器分子的荧光信号。在另一实施例中，检测器分子是镧系元素。在又一实施例中，镧系元素是铕。
在一个实施例中，读取器包括UV光电二极管。在又一实施例中，读取器包括UV激光二极管。
在本发明的另一方面，读取器被构造为包括至少一个硬性标准件。在另一实施例中，读取器被构造为包括至少两个或多个硬性标准件。在各种实施例中，硬性标准件包括发射可检测信号的标记分子。在又一实施例中，标记是荧光标记。在又一实施例中，荧光标记是镧系元素。在再一实施例中，镧系元素是铕。
在本发明的另一方面，本发明的SCD和测试装置用在检测一种或多种分析物的方法中，其中，这种分析物与疾病、病态或者其它生理条件有关。在各种实施例中，这种分析物是与涉及心脏、肝脏、肾、肠、脑、胎儿或胰腺的条件有关的生物标记物。在一个实施例中，这种分析物与心脏条件(例如，心肌梗死)有关。
在各种实施例中，本发明的装置可以用在检测从受试对象得到的样品中的抗原或蛋白(分析物)的任何方法中，从而通过使用免疫反应的特定板或者针对期望分析物的特定结合试剂来检测任何这样的分析物。
在本发明的方面中，测试装置包括上游室，上游室包括提供清洗/运转缓冲液或液体的工具。在各种实施例中，这种缓冲液或液体包括添加剂例如，通过光读取器或通过肉眼可以读取的信号/检测器分子。在特定实施例中，缓冲液或液体包含在由玻璃安瓿或膜袋、囊组成的区室中，或者形成填充的囊。在又一实施例中，这种区室被破坏、被破碎，否则通过对所述区室施加压力来释放它们的成分。在其它实施例中，这种区室被附件或针刺破或切开。在再一实施例中，这种区室通过安全装置保护，排除意外或不小心地释放它们的组分。
通过引用而包含的内容
本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用被包含于此，在某种程度上，就像每个单独的出版物或专利申请被具体地并且单独地指出通过引用而包含一样。

在权利要求中具体列出了本发明的新颖性特征。通过参照阐述了示例性实施例的以下详细说明，将更好地理解本发明的特征和优点，在示例性实施例中利用了本发明的原理，在附图中：
图1示出了样品采集装置。
图2A示出了具有混合室的放大图的样品采集装置。
图2B示出了采样组件。
图3示出了测试装置。
图4示出了读取器。
图5示出了样品采集装置。
图6示出了样品采集装置。
图7示出了包括间隙工具的测试装置。
图8示出了样品采集装置和测试装置。
图9A和图9B示出了利用不同体积的提取缓冲液测试的测试条(test strip)。
图10A和图10B示出了背景清理(clean-up)的效果和不同量的提取缓冲液。
图11示出了检测甲型流感的两种不同的测试。
图12示出了检测甲型流感和乙型流感的两种不同的测试。
图13示出了使用金作为标记的甲型流感的检测。
图14示出了使用金作为标记的乙型流感的检测。
图15示出了使用铕缀合物的甲型流感的检测。
图16示出了使用铕缀合物的乙型流感的检测。
图17示出了在乙型流感的检测中铕缀合物的灵敏度。
图18示出了利用甲型流感亚型测试的条。
图19示出了仅缓冲液对照。
图20示出了甲型流感和亚型H3N2的测试。
图21示出了乙型流感的测试。
图22示出了甲型流感和亚型H5N1的测试。
图23示出了甲型流感和亚型H1N1的测试。
图24示出了乙型流感和甲型流感亚型H5N1的测试。
图25示出了Epstein-Barr病毒的测试。
图26示出了用于不同类型和亚型的分析物的包括多条测试线(test line)的测试装置；901-施加到样品的过滤器或样品垫(pad)；902-试剂垫；903-用于分析物/传染剂的类型1的测试线；904-分析物/传染剂的类型2；905-类型1或类型2的亚型；906-类型1或类型2的亚型；907-对照线。
图27A至图27C示出了一个测试装置的各个方面；图27A组装的测试装置1001；图27B未组装的测试装置，具有上部1002、下部1004和测试条1003以及用于容纳样品的孔/舱1005(aperture/port to receive a sample 1005)；图27C弹簧/按钮室的较近视图，可以将弹簧/按钮室按下，从而将设置在膜/垫1006上方的缓冲液/液体室破裂(rupture)、裂开(break)或刺破(puncture)，缓冲液/液体室与测试条1003处于液体连通状态。
图28A示出了将SCD 1101和测试装置1105组件连接的实施例，在该实施例中，提供了环锁(collar lock)，当环锁1104在上锁位置打开(turned in the lock position)(即，使液流从上游的缓冲液/液体室横向穿过测试装置)时，环锁1104提供对上游室1102打开的几何结构的通道/孔1103。上游室1102可以是安瓿或成形的填充囊。
图28B示出了测试装置的实施例，其中，该装置包括保护盖(safeguard cover)1107，保护盖1107在包含液体(例如，冲洗/运行(running)缓冲液)的上游室1106之上。此外，该装置包括贮液室1109，贮液室1109与样品孔/舱1108处于液体连通状态，所述贮液室可以包括用于保持存档样品的膜或室。
图28C示出了设置在测试装置中的具有破断点(break point)1110的室(例如，安瓿)1111，其中，测试装置被构造成提供槽(trough)/通道1112和支撑基底1113，支撑基底1113将安瓿下游的液体内含物引导到测试条；图28D提供了包括囊/安瓿1114的室的俯视图，囊/安瓿1114位于发生样品引入的位置1115的下游，该室被构造成提供液体斜坡(ramp)1119和载体(support)1118，室的内含物通过载体1118到达空间1117，空间1117与吸水垫1116处于液体连通状态。
图29提供了具有存档组件的采样装置的一个示例；采样药签1205附着到空心轴(hollow shaft)1201，套子(sleeve)1202位于空心轴1201的侧部并在疏水性玻璃料(frit)(10+u)1206和1203的上游，下面是能够采用各种形状的滤纸(图29B)，滤纸具有用于保持存档样品的区域1209和能够例如保持试剂丸/珠的三个三维区域1210。此外，试剂丸/珠还可以设置在滤纸1208的下游的室中，滤纸1208能够在驱使样品通过尖端1204之前使样品混合。
图30A示出了利用pRNA的条状测试条；图30B示出了利用单克隆抗体的条状测试条。
图31示出了利用pRNA和抗体的灵敏度的比较，即，图31示出了使用抗体和pRNA作为捕获比较乙型流感检测的灵敏度。
图32提供了测试条上的多个分析物的pRNA结合的示意图。
图33A至图33H示出了硬性标准件(hard standard)；图33A示出了由UV LED读取器读取的铕的六个不同浓度的曲线图；图33B示出了六个硬性标准件的示图；图33C示出了1号浓度的曲线图，其中，1号铕浓度大约2100计数；图33D示出了5号浓度的曲线图，其中，5号铕浓度大约2280计数；图33E示出了3号浓度的曲线图，其中，3号铕浓度大约2700计数；图33F示出了6号浓度的曲线图，其中，6号铕浓度大约3310计数；图33G示出了2号浓度的曲线图，其中，2号铕浓度大约19500计数；图33H示出了4号浓度的曲线图，其中，4号铕浓度大约140000计数。
图34A和图34B示出了硬性标准件；图34A提供了由UV LED读取器读取的7个不同硬性标准件的曲线图；图34B提供了具有多个窗口的测试装置，当将测试装置设置在读取器中时，通过所述多个窗口检测信号。
图35示出了含液体的上游室1401(例如，安瓿)与干燥吸水垫1402处于液体连通状态的实施例，当操作所述室以释放其液体内含物时，所述干燥吸水垫1402膨胀，其中，所述膨胀增大吸水垫1403的尺寸，从而使干燥吸水垫1402变成与设置在测试条1406上的样品1405处于液体连通状态。因此，基于吸水材料1402的密度/类型，从通过测试条1406的样品1405的释放位置到开始流动位置，可以将预定的时间延迟(predetermined time delay)构建到系统中。
图36示出了亚型H5N1病毒的测试条，即，亚型H5N1病毒的荧光强度。
图37示出了亚型H1N1病毒的测试条，即，亚型H1N1病毒的荧光强度的图。
图38示出了乙型流感病毒的测试条，即，乙型流感病毒的荧光强度的图。
图39示出了使用MAB捕获系统的Nanogen甲型流感测试的灵敏度。
图40示出了使用pRNA捕获系统的Nanogen甲型流感测试的灵敏度。
图41示出了使用pRNA捕获系统Nanogen甲型流感测试和膜阻断的灵敏度。
图42提供了Nanogen甲型流感测试的灵敏度，即，MAB、pRNA和利用阻断的pRNA的灵敏度的比较。

虽然在此已经示出并描述了本发明的优选实施例，但对于本领域技术人员来讲显而易见的是，这些实施例仅是通过示例方式提供的。现在，在不脱离本发明的情况下，对于本领域技术人员来说将做出许多改变、变化和替换。应当理解的是，在实施本发明中，可以采用对在此描述的本发明的实施例做出的各种可选实施例。权利要求书意图限定本发明的范围，由此将涵盖处在这些权利要求书及其等同物的范围内的方法和结构。
本发明的各个方面涉及利用特定的结合部分和捕获部分对样品中的所选的分析物进行定性和/或定量分析的装置和结合对化验(binding-pair assay)。本发明在用于检测存在于样品中的一种或多种传染剂的各种化验中是有用的。在本发明中使用的化验包括竞争性免疫化验、非竞争性免疫化验、夹心免疫化验和阻断化验，但不限于此。
然而，本发明的用途不限于免疫化验，如包括配体-受体、配体-结合蛋白、适体-结合剂、酶-基底的其它化验，通过利用本发明的装置或方法来检测化学或生化反应。根据本发明的一方面，本发明的方法和系统利用样品采集装置、测试装置和读取器。用于实施本发明的各种特定的化验方案、试剂、装置或分析物是已知的，例如参见第4,313,734号、第4,366,241号、第5,266,266号、第6,235,539号、第6,468,474号、第6,565,808号、第6,448,001号或第5,415,994号美国专利以及公开号为2006/0040405、2004/0014094、2004/0048395或2005/0130120的美国公开。
根据本发明的一方面，样品采集装置用于采集样品，并利用提供检测工具和捕获工具的免疫反应性试剂来处理样品，处理的样品随后被提供到测试装置，该测试装置提供用于读取/观测由所述检测工具提供的信号的工具。可以用肉眼读取所述信号，或者利用依靠所用的检测工具(例如，缀合标记(conjungate label))的组合的仪器来读取所述信号。此外，测试装置可以被构造成允许多种分析物的检测。这样的分析物可以来自一种或多种传染剂，包括不同的株和/或亚型。检测可以包括一种或多种分析物的定性和/或定量测量。
样品采集装置。本发明的一方面涉及一种样品采集装置(SCD)，该样品采集装置包括用于采集生物样品所需的工具以及用于处理样品并使结合试剂与一种或多种目标分析物进行反应所需的试剂和缓冲液。如图2B中所示，示例性的SCD包括上室210、附着到上室210的采样器具夹持部(sampling implement holder)209、杆(stem)208、采样器具207，从而集合形成采样组件(sampling assembly)。
采样组件(图1)可以从包括采样容纳管(sample receiving tube)103、下室混合或试剂区域104的壳体(housing)卸掉，下室混合或试剂区域104可以容纳特异结合到一种或多种目标抗原的试剂。下室104可以包括一个或多个室。例如，可以在下室中串联布置两个室。可以将采样组件放置到壳体的样品容纳管103中，以提供一体化的结构。在这样的结构中，采样器具107位于下室的上游，并与下室处于液体连通状态。为了样品采集(例如，喉鼻样品采集)，可以将采样组件的长度最佳化。例如，装置(例如，一体化的结构)的长度可以为大约1-9英寸，或大约3、4、5、6、7、8或9英寸。
杆102可以是中空的、实心的或半多孔的。因此，在一些实施例中，杆实际上提供从上室100到采样器具107(例如，药签)的液体连通路径。杆由采样夹持部(sample holder)101夹持，夹持部101安装到上室100的容纳端(receiving end)中。例如，杆可以是中空的或半渗透的，杆的可延伸到上室中的部分具有封闭的终端，因而，如果上室中的杆部分断裂或破裂，那么提供从上室向下通过杆的末端到包含样品(例如，生物样品)的采样器具(例如，药签)的液体连通(即，液体流动)。
上室可以包括一个或多个室。上室可以由半刚性或可抑压的材料组成，并可以成形为球形体(bulb)99。这样的球形体可以容纳溶液。
上室可以被密封。此外，可以通过阀结构将这样的密封刺破、破裂或打开，从而在上室和下室之间提供液体连通。在一些实施例中，上密封室中的溶液是缓冲溶液。在各种实施例中，上室中的溶液的体积可以为大约10μL至大约500μL，或者为大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μL。在一个实施例中，溶液体积为150μL。
在一些实施例中，包含所需溶剂(例如，检测/捕获特定结合剂等)的液体溶液可以放置在与上室处于液体连通状态的下室的试剂区域中。如在图2A中所示，液体从上室向下流到采样器具，以提取样品，所提取的样品穿过孔，该孔可以约束/控制从上室到下室的液体流动，例如，下室可以包括孔，以通过尺寸大小(例如，穿孔的大小)或设置在下室中的区室的最近的一端201上的基底或过滤器的类型来控制流动。下室可以包括试剂区域。在一个实施例中，试剂区域(例如，203)包含固体基底，固体基底包括必需的试剂202(例如，免疫化验试剂，如检测和捕获探针等)，试剂202被形成为干燥的固体、单独设置的固体或一体化的固体。
因此，如果在上室中经由溶液(例如，缓冲液)向下冲洗样品，则产生混合物，从而携带样品向下行进到下室的试剂区域，所述室包括含基底的固体试剂202。固体试剂被缓冲液快速溶解，所得的溶液为可包含目的分析物和免疫化验试剂(例如，特定结合剂、标记缀合物和捕获探针等)的样品的混合物。例如，固体试剂202可以包括在化验中使用的标记和捕获探针，标记和捕获探针能够明确地结合目标分析物。一体化的装置200包括上室、下室、样品采集装置和路厄(luer)锁206，路厄锁206锁到侧部流动装置中，从而用于传送反应混合物，以进行后续检测。此外，如上所述，上室可以设计有可抑压的(例如，塑料的)球形体205，因此，如果需要，则施加另外的压力，以促使液体从上室流到下室中。
在一个实施例中，上室包括阀，该阀可控制地释放容纳在上室中的溶液。例如，在该阀是速动阀(snap-valve)的情况下，用户对阀杆施加力，以破坏杆，因此，一碰即破(breakaway)的特征使得缓冲液经过杆进入下室。此外，密封的室可以是可挤压的球形体，其能够被压缩(例如，用户对球形体施加压力)，从而控制溶液(例如，缓冲液)到采样器具的流速。
在一些实施例中，上室由球形体组件组成，球形体组件是容纳溶液的独立区室。这样的溶液包括提取液、裂解液、试剂溶液、缓冲液或防腐液。在一个实施例中，溶液是用于将生物样品从采样器具向下传送到下室的缓冲液。
此外，这样的上室可以包括一个或多个区室，例如在图5中所示。每个区室可以容纳相同的或不同的溶液501和502。
此外，这样的溶液可以包括期望的试剂，包括提取缓冲液、还原剂、免疫反应性试剂(例如，包括检测标记(例如，缀合物)和捕获部分在内的抗分析物特定结合剂)。在503中示出了用于反应的试剂，504示出了路厄附着到测试条505。
在另一实施例中，采样组件没有与包括样品容纳管的壳体形成为一体，参见图6。在这样的结构中，利用采样组件601来采集样品，并将样品传送到样品容纳室609。样品容纳室可以是打开的或关闭的，从而将样品引入到样品容纳管中。应当理解的是，根据需要，在此公开的任意样品容纳管可以是包括圆柱、正方形、三角形或任意多边形在内的各种几何形状。在一些实施例中，壳体可以包括一个或多个可密封的孔603，可以将孔603打开，以添加一种或多种选择的试剂607、缓冲液或冲洗液。
例如，在一个实施例中，将全血液汲取到样品容纳室609中。随后，样品穿过膜602(例如，将红细胞与血浆分离以使血浆穿过的膜)进入到样品容纳管的下部，从而与例如免疫化验所需的各种试剂混合。以特定分析物作为目标所需的免疫试剂可以是预先选择的，并设置成SCD中的固体基底607，或穿过孔603来添加，或可以设置在膜604上。
因为释放出全血样品，所以膜604可以用作过滤器，以防止血液组分穿过，从而仅使血浆穿过样品容纳管605的末端，其中，样品容纳管605将安装在测试装置606中。可利用的其它阀包括旋转阀、可破裂的阀、活栓阀、闸阀、球阀、挡板阀、针阀、蝶阀、夹管阀、波纹管阀、活塞阀、滑阀、塞阀、分流阀或电动阀。
在此使用的“捕获探针”是指连接到捕获部分的结合剂的缀合物，“检测探针”是指连接到标记或信号生成部分的结合剂的缀合物，其中，捕获探针和检测探针中的每个能够特定地结合到目标分析物。此外，为了清楚起见，测试装置的上下文中的“捕获部分配对物”(如下所述)是指特别地结合到容纳在捕获探针上的捕获部分的补体、同源物或配对物分子。
固体试剂组分包括粉末、药丸、珠、冻干的球、加压冻干的粉末，固体试剂组分在固体载体(例如，玻璃/塑料珠)上干燥，或者在固体载体上冻干或与固体载体缀合或直接在混合室或下室中干燥。这样的试剂在本领域中是已知的，例如在CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Coligan，John E.et.al.，eds.1999)中公开的。
在一些实施例中，因为溶液穿过样品器具，所以样品的提取步骤发生(例如，在溶液包括提取缓冲液的情况下)。此外，下室可以包括过滤器，提取的样品穿过过滤器流动。例如，如果将过滤器设置在下室的最近的一端处，那么提取的样品流动穿过过滤器(例如，网格盘)，由此防止提取混合物的某些组分进入到容纳固体试剂珠的试剂区域区室中。此外，过滤器工具还可以用于在SCD传输和储存期间阻止试剂珠。如这里所述，试剂珠可以包括检测和捕获探针，或者两个独立的珠可以各自包括检测或捕获探针。
过滤方面允许目的分析物携带少许干扰物质(如果有的话)以受控的方式迁移通过装置。过滤方面(如果存在的话)通常根据要处理的样品的类型提供更高的成功概率，要处理的样品的类型(例如，全血样品与咽喉药签)对于本领域技术人员来讲是明显的。在另一实施例中，SCD还可以结合有这样的试剂，即，这种试剂用于防止与可能存在于样品中的非目标分析物发生交叉反应和/或用于以样品为条件；根据特定的实施例，这些试剂可以包括非-hCG阻断剂、抗-RBC试剂、基于Tris的缓冲液、EDTA等，但不限于此。当预计使用全血液时，通常使用抗-RBC。在又一实施例中，SCD可以结合有其它试剂，例如辅助的特定结合成员、液体样品预处理试剂和信号生成试剂(例如，与标记缀合物反应所需的基底)。
在另一实施例中，下室可以包括一些吸水纸，在吸水纸上保持预定百分比的提取样品，以用于存档目的。在提取样品穿过采集装置并限定一部分提取样品用于存档目的之后，提取样品接触试剂溶液或固体(例如，缀合物珠202)，当样品液体快速地溶解缀合物珠并使反应物混合并开始化验时，进行下一个化验步骤。
在其它实施例中，设置在SCD的末端上的路厄105可以用阀结构替换或者进一步附着到阀结构，所述阀结构也用于控制出自样品采集装置的液体的流动。在实施本发明中还可以利用阀，将阀设置在上密封室中，从而提供对容纳在上密封室中的溶液的释放进行控制的工具。不管是在上室中、在下室中还是在设置在SCD中的任意区室之间，阀可以是在本领域中公知的任意类型，例如旋转阀、速动阀、可破裂的阀、活栓阀、闸阀、球阀、针阀、蝶阀、夹管阀、波纹管阀、活塞阀、滑阀、塞阀、分流阀或电动阀，但不限于此。在一个实施例中，阀可以是速动阀，将速动阀打开，在阀的延伸到上密封室(100)中的杆部中施加压力，从而使中空杆102破开，并使密封的上室的内含物流到中空管中，在中空管的端部处设置采样器具(例如，药签107)。
在一个实施例中，在SCD的末端处有阀。当阀处于关闭位置时，样品或者样品和试剂可以保持在下室104中。当阀处于打开位置时，混合子室中的内含物例如通过重力流而被释放。可选地，利用样品采集装置的球形体组件从路厄、路厄阀或阀释放样品/试剂。在本发明的优选实施例中，从SCD释放来自样品采集装置(SCD)的末端或出口端的内含物，从而可以促使、调节或调整流动。
在另一实施例中，打开SCD的末端，从而在从上密封室释放溶液之前，将SCD接合到测试装置的容纳端(例如，通过摩擦拟合)。在这样的实施例中，从SCD的末端流到测试装置中的液体没有被路厄或阀结构调节。在另一实施例中，SCD的末端不使用阀，而是打开的。SCD可以在从上室释放缓冲液之前附着到测试装置。当从上室释放溶液时，通过溶液从采集器具释放和/或提取样品，并且样品与位于下室中的试剂混合。然后，混合物流到用于分析一种或多种分析物的存在的测试装置。在上室内可以包括可溶于水的膜，以减缓混合物从SCD到测试装置上的流动。这样的膜是传统的，并可以被设计成准许混合物保持不同的时间段，从而足以使试剂和样品分析物混合并反应。例如，这样的膜可以由蛋白质、多糖或成膜剂来制备。
在另一实施例中，SCD的末端包括非常窄的开口，从而使液体从末端流出，如果不对装置施加压力或者在对装置施加压力(例如，通过SCD的球形体结构施加压力，或者如果壳体是可抑压的(depressible)，则通过对壳体自身施加压力)之前，该开口防止流体流动。
根据本发明的另一方面，关闭液体调整工具(例如，路厄105、路厄阀组合和阀)，从而使样品或者样品和一种或多种试剂在下室104中保持任意长的时间。然后，可以机械地将阀结构全部或部分打开，从而可选地以经调整或经调节的速率将内含物通过SCD的末端或出口端释放到测试装置中。
在本发明的SCD中使用的试剂可以包括一种或多种盐、螯合剂、抗凝血剂、清洁剂、稳定剂、稀释剂、缓冲剂、酶、辅酶因子、特定结合成员、标记、溶解粘液等。所述一种或多种试剂可以是有利于分析样品的化合物。此外，这样的试剂可以容易地适合于用在本发明的测试装置中。
在一个实施例中，将SCD接合到第二装置(例如，本发明的测试装置)，因此，阀结构的开口将内含物释放到第二装置中，或者，移去覆盖开口(没有阀)的帽106，从而将内含物释放到第二装置中。在另一实施例中，将包括公型路厄(male luer)的SCD和包括母型路厄(female luer)的测试装置接合导致释放反应子室的内含物。在又一实施例中，可以经过球形体组件来释放来自末端的内含物。如果在SCD中使用阀结构，则可以通过各种手段将阀结构打开以释放内含物，例如，通过打开活栓或通过转动、旋转、扭动或滑动阀结构(但不限于此)，或者通过移去打开液体流动路径的帽，使得阀能够被打开，从而使液体流到测试平台中。
存档样品。根据本发明的一方面，提供了用于将一部分样品存档的工具。在一些实施例中，SCD或测试装置或者这两者包括存档工具，该存档工具可以包括吸收或吸附基底(例如，纸或膜)、限定长度的短毛细管或者小的贮液室/区室，以在下室中保持一部分样品。在一些实施例中，在样品遇到反应试剂之前，这个存档机制位于装置中的一定位置处。
在图28中示出的一个实施例中，能够为存档样品提供小贮液室的小区室1109设置在测试装置中，并与用于将样品传送到测试装置的舱/孔1108相邻。可以将这样的存档区室构造成是可移去的，或者构造成上面设置有存档样品的基底自身是可以从所述区室移去的。例如，按尺寸安装到区室中的过滤器/膜材料将用于采集预定容量的样品(例如，细胞、细胞成分、蛋白质、核酸等)。测试装置可以包括带有壳体或盖子1107的冲洗缓冲液的袋子1106。
在另一实施例中，SCD包括用于保持存档样品的工具，参见图29A。例如，在SCD下区室中，可以提供过滤纸和疏水性膜，以保持用于存档目的的样品。材料的各种组合是可以的。在一个实施例中，用于存档的工具包括三个盘1203、1206、1207，这三个盘可以彼此接触或者可以彼此不接触。在另一实施例中，SCD(图29A)可以被构造成具有套子1202，套子1202提供用于将管/外壳(casing)的尺寸移到更接近附着到杆1201的药签1205的工具，因此，当液体离开药签时，所述液体将保持非常接近于药签，从而提高从药签提取液体的效率。将试剂珠表示为1208，出口为1204。
如图29B中所示，盘可以包括网格部分1210和衬垫部分1209，其中，将衬垫部分设计成保持存档样品。衬垫部分可以由任意吸收/吸附材料组成，并可以包括盘的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的表面积。此外，网格部分可以包括相对于盘的表面凸起的三维(3D)基底。这样的3D可以提供网格，可以将试剂珠设置到网格中。这样的珠可以在尺寸方面从大约0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4、4.5、5.0、5.5mm到大约6.0mm。
在一个实施例中，存档的材料是细胞或细胞成分，包括蛋白质、肽、蛋白质片段或核酸分子。因此，为了根据所存档的分子的类型(例如，蛋白质与核酸)进一步进行测试，可以存档样品。此外，存档盘1207(例如在图29A中所示)提供储存样品的工具，并保持所述样品从大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21天到30天的稳定性。例如，RNA在大约2、3、4或5天内是稳定的。
在另一实施例中，将存档盘放置在保存液(preservative solution)中，所述保存液将所述存档样品的储存时间延长大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。当然，根据现场设置，可以不确定地储存样品(例如，将样品冰冻一次)。
在另一实施例中，可以从样品容纳管移去下室中的反应区室，并将样品容纳管放置在壳体(例如，塑料管)中。在一个实施例中，区室(例如，笼子)保持少量体积的样品混合物，防腐剂可以添加到样品混合物，以用于储存。在另一实施例中，在上室中提供的溶液或下室中的反应溶液还可以包含将液体样品存档所必需的防腐剂。这样的防腐剂在本领域中是已知的。例如，参见美国专利RE29061；Buccholz等.Transfusion.1999年9月；39(9)：998-1004；Quiagen specialty reagents，可在Quiagen.com上获得。
在一个实施例中，将存档样品保持，以稍后用于测试(例如，通过RT-PCR，参见示例8)。
样品识别。SCD还包括位于采样器具或样品容纳管的任何位置上(例如，附着到外管103)的用于患者识别号的3个同样的识别标记(例如，允许至少109个唯一值的条形码)。标记是可以被剥去的，并且是自粘的。将一个标记保持在SCD 103上。被剥去的副本可以放置在测试装置(参见图3)上，并放置在任意设备文书或存档贮液工具上。条形码格式将是通用的标准，例如Codabar 303或305。在其它实施例中，识别标记可以是在本领域中公知的信号发射应答机，包括射频发射器、光发射器或电磁波发射器，但不限于此。
上室或下室中的区室。根据本发明的一些方面，在下室中，SCD包括一个或多个区室，所述一个或多个区室可以容纳试剂、过滤器、膜或贮液室。在一个实施例中，SCD的上室可以包括一个、两个或多个区室，每个区室还可以容纳溶液。在一些实施例中，这样的区室可以容纳相同的或两种不同的溶液、试剂、缓冲液或它们的组合。此外，多个区室可以在下室中串联排列(例如，串联的多个笼子)。另外，在这里的公开中，可以将这样的室称作“子区室”。
在一个实施例中，区室是相对于采样器具的末端，并容纳包括结合剂在内的液体或固体试剂成分，所述结合剂对于特定的分析物(或分析类型)而言是特异的。例如，液体或固体试剂成分包括特定结合剂(例如，抗体)，该特定结合剂能够特定地结合在样品中可能存在的分析物。在一些实施例中，在SCD中利用单个反应或混合区室，所述单个反应或混合区室是采样器具的末端，并与采样器具处于液体连通状态。在其它实施例中，可以使用一个或多个区室，其中，一个区室用作裂解或提取室，而第一区室末端的第二个区室用作试剂-样品混合室。在其它实施例中，过滤工具可以设置在一个或多个区室的最近端，所述区室设置在相对于采样器具的末端。在处理期间的提取/裂解、样品-试剂混合之前或在从SCD释放之前，可以利用过滤工具从样品中去除特定成分。此外，如果在样品容纳管中存在多个区室，则可以在这样的多个区室上设置相同或不同的过滤工具。
样品
样品是对于分析物的存在和/或浓度而言将被测试的任何材料。通常，生物样品可以是从受体(例如，非人类动物或人类)取得的任何样品，并可以用在测试装置中。例如，生物样品可以是来自活细胞检查的任何体液、细胞或组织样品。体液可以包括但不限于血液、尿、唾液、精液、排泄物、口水、胆汁、脑液、鼻液、泌尿生殖液、鼻吸出物、脊髓液等。生物样品还可以包括源自直接取于受体(例如，人类)的样品的任何样品。例如，生物样品可以是血液样品的血浆部分、血清、蛋白质或者采集细胞或组织的核酸提取物，或者，生物样品可以来自已经以一定方式处理过的样本，这种处理方式用来提高该样本的可检测性，例如，该样本为包含粘液溶解剂和清洁剂的裂解缓冲液，所述粘液溶解剂将鼻样本中的mucens分解，从而显著地减小样本的粘性，所述清洁剂将病毒裂解，以释放抗原，并使抗原可用于化验检测。样品可以来自任何主体动物，包括人类、鸟、猪、马、牛、鼠科动物、猫、狗或羊，但不限于此。
例如，样品可以源自诸如生理液之类的任何源，包括血液、血清、血浆、唾液或口水、痰、眼液、鼻液、鼻咽液或鼻咽拭子或吸出物、汗、尿、乳、腹液、黏液、滑液、腹膜液、透皮分泌液、咽液(pharyngeal exudate)、支气管肺泡灌洗液、气管吸出物、脑脊髓液、精液、子宫颈粘液、阴道或尿道分泌液、羊水等。这里，细胞组织(例如，发毛、皮和指甲碎屑)的液体均匀混合物和肉汁也被视为生物液体。预处理可以涉及从血液制备血浆、稀释或处理粘性液体等。处理方法可以涉及干扰成分的过滤、蒸馏、分离、浓缩、灭活和试剂的添加。对于工业、环境或食品生产化验以及诊断化验的性能来说，可以使用除了生理液之外的其它样品，例如水、食品、土壤提取物等。另外，当将怀疑含有分析物的固体材料进行改进以形成液体介质或释放分析物时，可以使用所述固体材料作为测试样品。在测试之前，生物样品、工业样品和环境样品的选择和预处理在本领域中是众所周知的，不需要进一步予以描述。
涉及的其它领域包括：牲畜疾病的诊断；细菌污染的肉、家禽、鱼的分析；食品厂、餐馆、医院或其它公共设施的检查；包括海滩水、海洋、湖的环境样品或游泳池污染的分析。由这些测试检测的分析物包括病毒抗原和细菌抗原以及化学品(例如，包括铅、杀虫剂、激素、药和它们的代谢物)、烃和各种各样的有机或无机化合物。
测试装置
本公开提供了一种用于确定在液体样品中存在或不存在多种分析物的测试装置，特别是免疫化验装置。通常，本公开的测试装置(参见图3)包括限定轴向流动路径的基质。通常，基质还包括样品容纳区域(sample receiving zone)、一个或多个测试区和一个或多个对照区。在多个实施例中，测试区域包括测试和对照区，测试和对照区是全体可寻址线(addressable line)。
这里，在测试装置的上下文中使用的术语“轴向流动膜(axial flow membrance)”、“横向流动膜(lateral flow membrance)”、“测试膜”、“测试条”或“基质”是可以交换使用的，这里采用毛细管作用来移动或传送测试液体，或者，通过气压、液压的积聚(对化验液体使用活塞或旋转的风箱(bellow)或其它类型的泵直接泵抽、电场引起的静电移动、重力等)来泵抽液体，从而在不采用毛细管作用的情况下使液体移动。
根据本发明的一方面，如在图3中示出的测试装置包括孔/舱，本发明的SCD的末端通过摩擦拟合、路厄锁、适配器(adaptor)或阀而接合到孔/舱中。孔/舱302提供开口，样品经过该开口从SCD流到测试装置中。血液分离膜可以设置在提供单向流动的舱中。在另一实施例中，这样的膜还可以设置在SCD(例如，样品药签器具的恰巧末端)中。
孔的上游是区室307，区室307与孔处于液体连通状态，所述孔与吸水基底309处于液体连通状态。此外，区室可以包括容纳一种或多种溶液的一个或多个子区室308。在测试装置的上下文中，子区室可以由可刺穿的、可穿孔的、可破裂的(例如，安瓿)或可抑压的囊状材料制成。然而，在一个实施例中，环脱离开，当对缓冲液/冲洗液区室308施加额外的力时，仅释放缓冲液。如这里所述，这样的区室可以通过以下方法来操作，即，施加足够的压力，从而刺穿、破裂或压下区室，以释放其内含物。另外，由于对这样的区室施加力(例如，拇指向下按压)，所以矛状物、刺或附属物刺入到所述区室中，由此可以刺穿所述区室。
在一个实施例中，测试装置包括两部分，其中，一部分包括施加样品的部分302和容纳冲洗或运行缓冲液的施加样品的区室上游部分308。在另一实施例中，上游部分可以包括一个或多个(例如，两个)区室，所述一个或多个区室可以容纳相同或不同的缓冲液，其中，可以单独操作每个区室或同时操作每个区室，以排出其内含物。
在另一实施例中，区室307自身可以是半刚性的、容易弯曲的或可抑压的，或者是囊状的，这为挤压区室以排出其中的任何内含物提供了手段。因此，在一些实施例中，用户可以对区室307施加压力，从而将其中的内含物(不管是容纳在区室中的内含物还是容纳在子区室中的内含物)释放到吸水基底309。这样的溶液可以用作冲洗或跟踪(chase)缓冲液，从而调动或提高经过吸水垫进入测试条310中的处理过的样品混合物的移动。通常，这样的液体溶液可以包括冲洗缓冲液、盐水或任何期望的容器。此外，在一些实施例中，这样的溶液可以包括试剂、酶、标记或化合物。冲洗缓冲液调动任何非结合的标记，以使其沿条迁移穿过检测区，从而减少背景。
此外，测试条310的下游设置在吸附基底311上。测试膜基底可以分别与吸水基底和吸收基底叠置或相邻，或者可以与吸水基底和吸收基底中的一个重叠或相邻。此外，在一些实施例中，测试装置的上壳体306或下壳体312可以包括识别标记303和305，识别标记303和305识别并对应于SCD上的同样的识别标记，还可以识别测试装置的批号(例如，用于质量保证和跟踪目的)。穿过上壳体的窗口304准许结果的显现和读取。
在相关的实施例中，基质还包括设置在横向流动基底、膜或基质的下游的吸收区。在一个实施例中，吸水垫可以设置在横向流动膜的上游。在另一实施例中，吸水垫直接设置在样品进入孔下方。此外，在优选的实施例中，包括测试和对照区的测试区域是看得见的(参见图8)。
用于制备吸收基底311的适当材料包括亲水性聚乙烯材料或垫、丙烯酸类纤维、玻璃纤维、滤纸或垫、干纸、纸浆、织物等，但不限于此。例如，横向流动膜吸收区可以包括诸如水刺法非织造丙烯酸类纤维(即，New Merge(获自DuPont)或HDK材料(获自HDK Industries，Inc.))、非织造聚乙烯之类的材料，将这样的材料进行处理，以改善材料的疏水性能。
安全工具。在一些实施例中，安全工具301设置在可抑压的室307上，因而室的内含物不能意外地流出到与横向流动膜处于液体连通状态的通道中。安全工具可以是升降的盖子或凸缘，以暴露可抑压的室或者设置在可抑压的室上的按钮。
此外，对于出现在SCD的末端上的特定同类适配器、路厄或阀来说，这样的安全工具可以用作适配器。因此，例如，在将样品释放到测试装置中之前，安全工具可以覆盖孔，其中，SCD的末端接合到孔中。在另一实施例中，设计读取器，因此，如果首先移去安全盖子，则可以将测试装置仅插入到容纳舱中。例如，移去安全盖子的测试装置表示样品已经被引入到测试装置中，并且运行缓冲液已经从区室307，即孔(适配器/安全盖子)的上游被释放。在一个实施例中，孔设置在吸水垫309上方。
间隙工具。在一些实施例中，测试装置包括设置在横向流动膜(例如，吸水垫)和与缓冲液贮液室处于液体连通状态的通道之间的间隙。间隙用于保持容纳在按钮贮液室中的任何溶液与化验样品分开，直到根据化验进展的适当时间为止(参见图7)。在一些实施例中，间隙可以为大约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9或10mm。在一个实施例中，间隙大于0且小于3mm。因此，在用户对区室即样品孔的上游施加压力的情况下，迫使在703和704之间示出的间隙关闭，并且容纳在区室中的溶液沿701所示的方向流向吸水垫并穿过吸水垫，从而使样品通过测试条。如上所述，溶液可以包括任何期望的缓冲液、试剂、化合物、染料、标记或珠。应当理解的是，在此公开的间隙实施例可以适合于在此公开的任何测试装置结构。
在一个实施例中，测试装置是横向流动测试条，优选地装在壳体中(虽然不必要)，并被设计成由读取器读取(参见图3、27)。
在一个实施例中，在图27A、27B和27C中，将SCD处理的样品引入到测试装置1001中，随后，跟踪或运行缓冲液被释放，并跟随样本通过吸水垫，并进入到测试条1003中，其中，特定图案化的捕获剂结合它们的配对物捕获探针。因此，如果存在特定的分析物，则该特定的分析物将被检测探针和捕获探针(如上所述)结合，所述捕获探针将结合其特定的配对物捕获部分，该特定的配对物捕获部分被固定在测试条1003上的限定场所或线上。图27B示出了测试装置的组件，包括上壳体1002、下壳体1004和孔1005。
在一个实施例中，冲洗/运行缓冲液容纳在箔、囊或buster型包(例如，类似于番茄酱/调味品包)中，箔、囊或buster型包设置在测试装置即样品进入舱302、504、605、1005、1108的上游中(参见图27C)。可以将囊或包设计成使其关于两条正交轴对称，因而可以容易地将囊或包加载到测试装置中。因此，在一个实施例中，当向下按压测试装置的设置在包上的盖子时，会使得包破裂，从而释放其中的内含物。
在另一实施例中，按钮部分可以包括刺穿附属物，当压下按钮时，刺穿附属物刺破包，从而释放其中的内含物。板簧或悬臂弹簧(参见图27C)可以安置在包和按钮之间，并产生施加于包的压力，以确保释放所有的内含物。此外，构造测试装置的几何形状，从而将冲洗缓冲液引导到吸水垫904/905、1006。此外，按钮、弹簧和壳体的几何形状还减少包区域中的孔隙，从而根据需要使冲洗缓冲液沿任意方向流动，即使与重力相反(例如，向上)，但不回到包储存区域中。
为了使冲洗缓冲液从包预定地流出，所制造的孔的数量和尺寸以及所制造的孔的几何形状可以相互进行调整。
在一个实施例中，刺穿附属物(例如，针)将在包的顶部提供液体阻力障碍，以使液体沿吸水垫的方向离开包的下部。用于刺穿的针还可以是锥形的，从而实现或增强这一功能。
在一个实施例中，弹簧(参见图27C)是按钮、上壳体或下壳体(参见图27B)的完整部件，或者，它可以是独立的组件，总而言之，将弹簧构造成容易地安装并密封冲洗/运行缓冲液室。
在一个实施例中，按钮的侧部被设计成：当压下按钮时，使夹点最少。侧部还可以被设计成提供挡板式功能，从而使液体离开测试装置的风险最小化。
对支撑吸水条末端的特征的几何形状进行设计，以允许刺穿特征(例如，针)穿过包，而不允许包在包和支撑特征之间形成密封。针的作用是刺穿吸水盘和包。在另一实施例中，刺穿的仅是带有吸水盘的包，吸水盘的位置直接相邻于刺穿的孔。
在一个实施例中，测试装置中的冲洗/运行缓冲液容纳在可破裂/裂开的基底(例如，安瓿)中。对密封膜或按钮施加的压力使安瓿破裂，从而释放其内含物。在一个实施例中，设计通道、沟或槽，从而将缓冲液引导到吸水盘。
在一个实施例中，用于容纳SCD末端的孔包括可脱离的环(“锁环”)1104(参见图28A)，所述环附着到SCD组件，当移去SCD 1101时，所述环脱离测试装置主体1105，从而从区室/贮液室1102即所述孔的上游或恰巧上游释放冲洗/运行缓冲液。在另一实施例中，当锁环被扭曲到锁定位置时，使样品分配到测试装置上，同时从上游的区室释放缓冲液或冲洗缓冲液。例如，锁环将包括几何形状的通道1103、孔或开口，仅当环处于锁定位置时，所述通道1103、孔或开口与冲洗液/缓冲液区室的开口、通道或孔对齐。一个或多个上游区域1102、1106中的任何区室可以利用这样的锁环，所述一个或多个区室1102、1106可以用于传送缓冲液/冲洗液或任何其它液体。
在可选的实施例中，SCD 1101可以包括锁环1103，该锁环1103安装到测试装置主体1103中，并从开锁位置转变到锁定位置1104。
在一个实施例中，如在图28B中所示，上游的冲洗液/缓冲液区室包括软膜(例如，形成填充密封包装)或安瓿，当施加最小的力(例如，用户用手指按压)时，软膜或安瓿就容易裂开/破裂。这样的洋葱皮(onion skin)区室1106还可以被硬的可移动的盖子1107覆盖，盖子1107阻止洋葱皮的突然破裂。样品通过舱1109进入测试装置，所述装置可以具有窄的通道1109，以回收存档样品。
如图8中所示，样品通过包括杆和药签806的SCD 802被传递到测试条。测试条的上游是具有缓冲液或其它液体的区室801。测试条包括测试区803和对照区A、B、C 804。检测探针将通过缀合标记提供可检测的信号。然后，将测试装置插入读取器400中，如图4中所示，其中，测量和/或检测来自标记的信号。在另一实施例中，在短的化验处理时间段已经完成后，可以在非常短的读取时间段(～20秒)内将测试条401插入到可移动的盘402中，这在一个读取器的情况下允许更高的测试通过量。此外，在另一实施例中，可以在添加样品之前将测试条插入到读取器中。
在这里任意实施例中，涉及从样品的上游室(例如，样品进入舱)释放冲洗/运行缓冲液，可以将时间延迟特征构建到测试装置中，从而在样品的引入和冲洗/运行缓冲液之间经过一段时间。例如，当干的吸水垫基底处于潮湿状态(即，在冲洗缓冲液释放之后)时，所述吸水垫基底膨胀，并且由于膨胀而连接，否则断开吸水条(参见图34)。例如，施加样品1405。将容纳冲洗缓冲液的安瓿或基底1401破裂/裂开，从而将液体释放到干的吸水垫部分1402中，所述干的吸水垫部分1402膨胀1403，并对含样品1405的吸水垫部分提供液体连通。样品/缓冲液经过吸水垫1406穿过测试条流动。
在另一实施例中，将预定长度/密度的纤维膜设置在冲洗缓冲液区域和吸水膜之间，所述纤维膜能够延迟冲洗缓冲液与吸水膜的接触，从而用作延时机构。缓冲液通过毛细作用沿着纤维膜移动，并在膜纤维的端部累积，直到它到达吸水膜并流动穿过设置在吸水膜上的样品为止。在另一实施例中，缓冲液在膜纤维的端部累积，直到有足够的体积渡过将纤维膜与吸水膜分开的间隙为止。
在其它实施例中，将柱塞或弹簧机构构建到测试装置中，所述柱塞或弹簧机构用于减小区室/安瓿体积，从而确保其中的内含物被分散到吸水垫上。通过用户对按钮施加压力，柱塞可以向前移动，或者，可以按照自动方式(例如，设置在读取器中)向前驱动加载有弹簧的柱塞。当柱塞向前驱动时，该柱塞形成密封，因而液体仅通过出口到达吸水垫。
在一个实施例中，沿着测试条的液体传送基于毛细管作用。在另一实施例中，沿着基质的液体传送基于非吸水的横向流动，其中，所有溶解的或分散的液体样品成分以基本上相等的速率被携带并且以相对未受损害的流动横向通过基质，就像一种或多种成分的优选保持力将出现的那样，例如在化学地、物理地、电离地或以其他方式相互作用的具有一种或多种成分的材料中。参见例如第4,943,522号美国专利，通过引用将其全部内容引入本文中。
任何适当的材料都能够用于制造在此公开的装置，这样的材料包括刚性或半刚性的材料、非水渗透性的材料，例如玻璃、陶瓷、金属、塑料、聚合物或共聚物或者它们的组合。在一些实施例中，SCD或测试装置包括塑料、聚合物或共聚物，例如耐破裂的聚合物或共聚物，如聚丙烯、异质同晶聚合物、聚碳酸酯或环烯或者环烯共聚物。此外，本发明的装置可以通过适当的制造方法来制造，例如注射成型、吹塑、切削加工或模压成型。
如在此使用的测试条基底是指利用本领域中的传统方法连接到捕获部分的材料。可以使用各种材料作为基底，包括可以用作附着相关分子的载体的任何材料。这样的材料对于本领域技术人员来说是公知的，并包括但不限于：有机或无机聚合物；天然和合成聚合物，其包括但不限于：琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、其它纤维素衍生物、右旋糖苷、右旋糖苷衍生物和右旋糖苷共聚物、其它多糖、玻璃、硅胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、人造纤维、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、丙烯酸脂和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯和丙烯酰胺的共聚物、异丁烯酸酯、异丁烯酸酯衍生物和共聚物、具有各种官能团的其它聚合物和共聚物、乳胶、丁基橡胶和其它合成橡胶；硅、玻璃、纸、天然海绵、不溶性蛋白、表面活性剂、红细胞、金属、非金属、磁性材料或其它商业上可获得的介质或者由固体或半固体基底构成的复合材料，所述固体或半固体基底用改善条基底的亲水性能的材料涂覆，所述材料例如为聚苯乙烯、聚酯薄膜(Mylar)、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、金属，所述金属例如为铝、铜、锡或用右旋糖苷、清洁剂、盐、PVP涂覆的金属的混合物和/或用静电或等离子体放电处理过的金属的混合物，以向表面增加电荷，从而对表面提供亲水性能。
在一个实施例中，横向流动膜包括多孔材料，例如由Porex Technologies Corp.of Fairburn，Ga.，USA制造的高密度聚乙烯片材料。该片材料具有开口孔(open pore)结构，该开口孔结构在40％空隙(void)体积下具有0.57gm/cc的典型密度和1-250微米的平均孔直径，平均值通常为3-100微米。在另一实施例中，标记区包括多孔材料，例如非织造丙烯酸类纤维(类似于样品容纳管)，例如New Merge或HDK材料。通常，多孔材料可以由一般防水层(例如，Mylar)支持，或可以层叠在防水层上。当采用时，通过粘合剂(例如，3M 444双面胶带)将衬背固定到基质。通常，防水衬背用于厚度小的膜。可以使用各种各样的聚合物，倘若它们不非特定地结合到化验成分并且不干扰液体样品的流动。示例性的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。必要时，基质可以是自支持的。也可以使用顺从非吸水流动的其它膜，例如聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、醋酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在另一实施例中，横向流动膜包括诸如未处理的纸、纤维素共混物、硝化纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物等。可以将标记区构造成提供吸水流动或非吸水流动，通常，流动类型与样品容纳区的至少一部分中提供的流动类型类似或相同。在另一实施例中，标记区包括无纺织物，例如Rayon或玻璃纤维。适合于用在本发明中的其它标记区材料包括在第5,075,078号美国专利中公开的色谱材料，通过引用将这件专利并入本文中。
在另一实施例中，利用包括材料阻断剂和标记稳定剂在内的溶液处理测试条基底。阻断剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甲基化的BSA、酪蛋白、酸或碱水解的酪蛋白、脱脂奶粉、鱼明胶等。稳定剂是容易获得的，且在本领域中是众所周知的，例如，稳定剂可以用于稳定被标记的试剂。在一些实施例中，容纳溶液307的上游区室可以包括多个安瓿，可以选择性地将所述多个安瓿刺穿或破裂，以释放它们的内含物因此，在一个实施例中，将阻断剂容纳在用于预处理(例如，“阻断”)测试条(即，横向流动膜)的一个安瓿中，而保留另外的安瓿用于通过测试条冲洗样品。
在本文的各个公开中，测试条/横向流动膜包括多个测试区，在图8中将一个测试区标为803。测试区通常包括预先选择的捕获部分，其中，预先选择的区域包括捕获部分，该捕获部分是分析物特定结合剂(例如，单克隆抗体)的捕获分子的配对物。在当前涉及的许多实施例中，将多种被标记的试剂引入在SCD中，因而它们可以与在装置中接触的液体样品渗透在一起。这些多种被标记的试剂可以是分析物特定的试剂或控制试剂，并可以具有不同的可检测特征(例如，不同的颜色)，因此，当在相同的装置中使用这些试剂时，一种被标记的试剂可以与另一种被标记的试剂区分开，或者，在优选的实施例中，这些多种被标记的试剂具有不同的捕获部分。当被标记的试剂频繁地结合到特定的目的分析物，并随后通过包括测试条的测试装置被处理时，具有不同特异性的被标记试剂(包括分析物特定的试剂和对照标记的试剂)的区分检测会是期望的属性。然而，通常，由于在装置中存在限定的测试和对照区，从而在指定的区中累积了被标记的试剂，所以单独基于标记成分来区分地检测具有不同特异性的被标记试剂的能力不是必需的。
在一些实施例中，将每个检测探针缀合到发射不同波长的荧光标记。在多个特定结合剂包括在SCD中的情况下，如果多个特定结合剂包括若干不同组的特定结合对，则给定组的每个结合对包括与任何其它组不同的标记，其中，多个组补足所述多个特定结合剂。例如，可以将甲型流感的一组特定结合抗体缀合到一种荧光标记(即，缀合到第一荧光标记的检测探针)，而一组特定结合抗体(即，缀合到第二荧光标记的检测探针)、第三组、第四组或第五组可以各自包括缀合到不同荧光标记的检测探针。当然，应当明显的是，检测探针还可以包括不同类型的标记(例如，包括荧光标记的第一组，包括金属的第二组，而对照可以包括发色团)。
在一个实施例中，荧光标记发射足够不同的波长，从而能够区分若干测试线。
本描述在单个免疫化验装置中提供单个或多个对照区的开发和用途，所述单个或多个对照区相对于各个测试区以预定的方式设置，从而允许容易地识别在所述装置中测试的一个或多个目的分析物中的每个分析物。本描述还提供了制作各种形状、物理或化学特征和颜色的对照区。部分地，这样的对照区的用途允许容易地使用免疫化验装置，并允许在单个化验过程中识别多个分析物。(参见示例11)。
在一个实施例中，测试装置不包括容纳在其中的任何试剂，所述试剂能够特定地结合到分析物(例如，对H5N1特定的抗体)。
通常，测试区域包括一个或多个对照区，所述对照区用于检验样品流动符合期望。每个对照区包括空间不同的区域，该区域包括与被标记的对照试剂相互作用的特定结合对的固定成员。在特殊情况的实施例中，程序上的对照区容纳目的分析物的可信样品或其碎片。在这个实施例中，可以利用一种被标记的试剂，其中，液体样品将被标记的试剂传送到测试和对照区；然后，未结合到目的分析物的被标记试剂将结合到位于对照区中的目的分析物的可信样品。在另一实施例中，对照线包括抗体，所述抗体特定地用于被标记试剂的固定，或者提供被标记试剂的固定。在操作中，即使测试样品不存在任何或所有的目的分析物，被标记的试剂仍被保持在一个或多个对照区的每个对照区中。
在一些实施例中，将被标记的对照试剂引入到SCD或测试装置中的液体样品流动中。例如，在测试装置中，对照试剂可以容纳在上游溶液/缓冲液贮液室中，这里对此做了描述(参见图3)。在另一示例中，在将样品施加到测试装置(例如，存在于SCD中的混合子室中)之前，可以将被标记的对照试剂添加到液体样品。
例如，被标记的对照试剂和区的示例性功能包括确认样品的液体流动有效地溶解并调动来自SCD的被标记试剂，所述被标记试剂在一个或多个限定测试区中被捕获。此外，对照可以确认当前穿过测试条测试和对照区的足够量的液体，以使足够量的捕获部分可以与复合到特定分析物(即，通过抗原特定结合剂)的相应特定捕获探针发生反应。此外，对照试剂确认免疫复合物(例如，分析物-分析物特定结合剂)以一定量通过测试区移动到包括测试和对照区的测试区域上，因而被标记的分析物的累积将产生可视的信号，或者，在测试区中的阳性测试结果的情况下，产生可读取的信号。此外，对照区的其它功能可以是用作参考区，所述参考区允许用户识别被显示为可读取区的测试结果。
因为本发明的装置可以包括一个或多个对照区，所以将被标记的对照试剂及其相应的对照区开发成每个对照区将变成可视的，其中，不管一个或多种目的分析物是否存在，在液体样品与所述装置接触之后，对于所有的对照区来说，每个对照区具有期望的强度。
在一个实施例中，在测试条上，单个被标记的对照试剂将被每个对照区捕获。通常，如果存在多个对照区，则这样的被标记的对照试剂将以超过组合对照区的总结合容量的容量的量沉积在标记区上或沉积在标记区中。因此，对于对照标记特定的捕获试剂的量可以按照以下的量进行沉积，即，所述量允许在一个或多个对照区产生期望的信号强度，并允许每个对照区保持期望量的被标记的对照试剂。在完成化验之后，每个对照区优选地提供期望的和/或预先设计的信号(在强度和形式方面)。预期的预先设计的信号的示例包括：每个对照区中的相等强度的信号；或者，在增大、减小的期望图案之后，对照区中的其它信号强度。
在另一实施例中，每个对照区对于唯一的对照试剂而言将是特定的。在这个实施例中，标记区可以包括多个且不同的被标记的对照试剂，在化验或相关改变中使对照区的数量相等。其中，每个被标记的对照试剂可以一个或多个预定的且特定的对照区中变成受到限制。这些被标记的对照试剂可以提供相同的可检测信号，或者基于对照区中的累积提供可区分的可检测信号(例如，具有不同的颜色标记或其它检测体系)。
在另一实施例中，对照区可以包括在两个先前实施例中描述的两种对照区的组合，具体地讲，一个或多个对照区能够抑制或结合单种被标记的对照试剂，相同测试条上的其它对照区将能够结合一种或几种其它特定标记的对照试剂。
在一个实施例中，被标记的对照试剂包括结合到特定结合对的一个成员的可检测部分通常，将被标记的对照试剂选择成不同于通过能够在测试区中抑制目的分析物的工具识别的试剂。此外，被标记的对照试剂对于分析物而言通常不是特定的。在通常的实施例中，被标记的对照试剂能够结合在对照区上或在对照区中固定的特定结合对或对照捕获配对物的相应成员。因此，被标记的对照试剂被直接限制在对照区中。
在另一实施例中，形成被标记的对照试剂的标记成分的可检测部分是与被用作目的分析物的被标记的测试试剂的标记成分相同的可检测部分。在通常的实施例中，被标记的对照试剂的标记成分与被标记的测试试剂的标记成分不同，因此容易确定化验结果。在另一通常的实施例中，对照试剂和测试标记包括有色珠，例如有色乳胶。另外，通常，对照和测试珠包括不同的颜色。
在另一实施例中，被标记的对照试剂包括链霉抗生物素、抗生物素蛋白或生物素，对照捕获部分包括这样的特定结合对的相应成员，这样的特定结合对容易地并特定地彼此结合。在一个示例中，被标记的对照试剂包括生物素，对照捕获配对物包括链霉亲和素。本领域技术人员将明白，能够可选地使用特定结合对的其它成员，包括例如与分析物无关的抗原/抗体反应。在另一实施例中，捕获配对物可以包括在此公开的任何结合部分。
对照区的用途在于：对照区中的信号的出现表示能够读取测试结果的时间(甚至对于阴性结果)。因此，当期望的信号出现在对照线中时，可以表明测试区中的信号存在与否。
在另一实施例中，利用包括标记物的对照区，当测试区域处于潮湿状态时，所述标记物在测试区域中变成是可视的。在以下专利申请中公开了这一类型的对照区，即：在2001年9月10日提交的序列号为09/950,366的当前未决的美国专利申请，公布为公开号为20030049167的美国专利申请；在2002年9月10日提交的序列号为10/241,822的当前未决的美国专利申请，公布为公开号为20030157699的美国专利申请。
在特殊情况的实施例中，利用这一类型的一个或多个对照区。在另一实施例中，能够使用以下类型的对照区的组合，所述对照区的类型包括：利用被标记的对照试剂和对照区的类型；当处于潮湿状态时显示对照区的类型。这允许一种简单的方法来阐明对照区，同时允许使用基于试剂的对照区来确定SCD处理过的样品中的试剂的再溶解和移动已经是有效的，并确定特定的反应沿着测试装置、吸水垫、测试条和吸收垫限定的路径如期望地发生。本实施例包括一个或多个对照区的用途，对于除了在测试条的末端或下游端上的对照区之外的化验的每个对照区而言，当测试区域处于潮湿状态时，所述一个或多个对照区变成是可视的。
本说明还提供了用于建立快速的多分析物化验的工具，在环境监视、医学的许多领域中特别是在传染病领域中需要这一工具。例如，预期的装置包括用于区分诊断可能导致不同治疗的甲型流感或乙型流感和它们的亚型(例如，甲型流感、H5N1)的装置或用于在一个步骤中区分诊断甲型流感、乙型流感和/或RSV的装置。这样的装置准许使用单个样品来一次化验多个分析物，有益地，这样的装置允许相当大地减少动手时间和诊断处理的持续时间，从而通常有利于医生或使用者。这样，在本发明的SCD中能够利用多个免疫试剂，其中，所述多个免疫试剂包括特定结合剂的群(population)，所述特定结合剂包括分别缀合到标记和捕获部分的对，因此，所述多个免疫试剂包括多个群，每个群与任何其它群相比对于不同的分析物来说是特定的。例如，所述多个免疫试剂对于若干类型的一种病原体或不同病原体来说可以是特定的。
利用本公开的装置和方法来化验各种分析物。在用于对样品中的一个或多个目的分析物进行化验的特定装置中，可以将目的分析物的采集物称作试验系列(panel)。例如，试验系列可以包括甲型流感、乙型流感、甲亚型流感、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒和不同类型的副流感病毒(Parainfluenza virus)(例如，1型、2型、3型等)的任一组合(或所有组合)。另一试验系列可以包括用于选择一种或多种上呼吸道感染的测试，上呼吸道感染例如包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)和/或肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)。可以针对例如包括衣原体、毛滴虫(Trichomonas)和/或淋病(Gonorrhea)的性传播疾病的诊断来设计又一试验系列。在各种情况下，通过合并在此描述的SCD中不同套的检测和捕获探针容易获得被设计成在测试装置上对一系列特定分析物提供信号的特定试验系列。因此，特定的SCD将采用具有检测试剂(不是特异于目的分析物)的测试条，提供对使用测试装置时检测到的特定试验系列的分析物进行检测所必需的所有试剂。在其它实施例中，大范围测试装置可以包括用于来自于相关或不同病原体的若干系列的分析物的非特定捕获部分，例如，对HIV和HCV抗原、HIV和肺结核、甲型、乙型和甲亚型流感、细菌和病毒感染的检测。因此，只要效率和成本效益增强，可将单个测试装置和包括用于不同试验系列的分析物的免疫反应体的SCD一起使用。
例如，可选地，试验系列可以包括含有SARS相关冠状病毒(coronavirus)、甲型流感在内的多种其它目的分析物；肝炎试验系列包括乙型肝炎表面抗原或抗体、乙型肝炎核心抗体(hepatitis B core Ab)、甲型肝炎病毒抗体和丙型肝炎病毒的筛选(selection)；磷脂试验系列包括抗心磷脂(Anticardiolipin)抗体(IgG、IgA和IgM异型)的筛选；关节炎试验系列包括类风湿因子、抗核抗体和尿酸；Epstein Barr试验系列包括Epstein Barr核抗体、Epstein Barr病毒壳体抗原和Epstein Barr病毒、早期抗原的筛选；其它试验系列包括HIV试验系列、狼疮试验系列、H.Pylori试验系列、弓形虫(toxoplasma)试验系列、疱疹试验系列、Borrelia试验系列、风疹试验系列、巨细胞病毒试验系列、利用包括异型肌钙蛋白和肌红蛋白和/或CKMB和其它物质的分析物测试近期心肌梗塞的试验系列。本领域技术人员应该明白，利用在此公开的装置借助免疫化验可以化验各种试验系列。免疫化验方法在本领域是公知的。例如，见CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(免疫学实验指南，Coligan，JohnE.等，eds.1999)。
可以根据本发明使本领域技术人员熟知的众多分析装置适于检测多个分析物。通过示例，为了检测并鉴别多个分析物，可以根据本发明修改浸量尺装置、横向流动装置和灌流(flow-through)装置，具体地讲，那些是免疫化验。示例性的横向流动装置包括那些在第4,818,677、4,943,522、5,096,837(RE35,306)、5,096,837、5,118,428、5,118,630、5,221,616、5,223,220、5,225,328、5,415,994、5,434,057、5,521,102、5,536,646、5,541,069、5,686,315、5,763,262、5,766,961、5,770,460、5,773,234、5,786,220、5,804,452、5,814,455、5939,331、6,306,642号美国专利中描述的装置。其它的可用于对流体样品中的多个分析物鉴别检测而修改的横向流动装置包括第4,703,017、6,187,598、6,352,862、6,485,982、6,534,320和6,767,714号美国专利。示例性浸量尺装置包括那些在第4,235,601、5,559,041、5,712,172和6,790,611号美国专利中描述的装置。本领域技术人员应该理解的是，上述专利可能并且确实频繁地公开了一种以上的化验构造，并且对于这些附加的公开也引用于此。有利的是，描述的改进可应用于各种化验(尤其是免疫化验)、构造。
本发明的SCD或测试装置可以被构造成利用现有的分析物检测系统。例如，本发明的SCD可以被构造成与现有的测试装置使用，或者对于测试装置，可以按照在此的公开来构造/修改现有的测试装置。可以以这样的方式修改的一些示例性装置包括浸量尺、横向流动、匣(cartridge)、多重微孔板(multiplexed)、微量滴定板、微流体、板或阵列或高通量平台，例如那些在以下的专利中公开的装置：第4,235,601、4,632,901、5,559,041、5,712,172、6,790,611、6,448,001、4,943,522、6,485,982、6,656,744、6,811,971、5,073,484、5,716,778、5,798,273、6,565,808、5,078,968、5,415,994、6,235,539、6,267,722、6,297,060、7,098,040、6,375,896、4,818,677、4,943,522、5,096,837(RE 35,306)、5,096,837、5,118,428、5,118,630、5,221,616、5,223,220、5,225,328、5,415,994、5,434,057、5,521,102、5,536,646、5,541,069、5,686,315、5,763,262、5,766,961、5,770,460、5,773,234、5,786,220、5,804,452、5,814,455、5939,331和6,306,642号美国专利。其它的可用于对流体样品中的多个分析物鉴别检测而修改的横向流动装置包括在以下专利中描述的装置：第4,703,017、6,187,598、6,352,862、6,485,982、6,534,320、6,767,714、7,083,912、5,225,322、6,780,582、5,763,262、6,306,642、7,109,042、5,952,173和5,914,241号美国专利。示例性的微流体装置包括那些在第5,707,799、5,837,115和WO2004/029221号美国专利中公开的装置。上述专利公开中的每个通过引用全部包含于此。
读取器
系统和方法包括：免疫化验装置，与读取器400组合，具体地讲，该读取器为具有内置计算机的读取器400，例如，基于反射和/或荧光的读取器；数据处理软件，采用数据精简和曲线拟合算法，可选地与训练神经网络组合，用于精确地确定生物样品中分析物的存在或浓度。如在这里所使用的，读取器是指用来检测和/或定量分析数据的仪器，例如，包括在测试装置401中的测试条。数据可以是肉眼看得见的，但是不需要是看得见的。所述方法包括以下步骤：对病人样品执行免疫化验；利用基于反射和/或荧光的读取器来读取数据；利用采用数据精简的处理软件处理所得到的数据。优选的软件包括曲线拟合算法(可选地，与训练神经网络相组合)，用来确定给定样品中的分析物的存在或量。然后，可以通过医疗诊断系统对从读取器获得的数据进行进一步的处理，从而提供风险评估或医疗条件的诊断作为输出。在可替换的实施例中，所述输出可以用作到随后的决策支持系统(例如被训练为评估这样的数据的神经网络)中的输入。
在各种实施例中，根据将要从测试装置(例如，LRE Medical，美国)检测到的信号，读取器可以是反射读取器、透射读取器、荧光读取器、生化荧光读取器、磁性读取器或电流式读取器(或者是两种或两种以上的试验系列)。在一个实施例中，读取器包括被设计成接收测试装置的接收端口，而这种设计使得如下所述情形中测试装置仅可以插入到接收端口，如果已经压下样品入口孔(entry aperture)的可压下(例如，按钮)装置上游，能使测试装置装配到接收端口402中。因此，在这样的实施例中，仅当储液罐中的内容物(例如，洗涤缓冲液)被释放时，测试装置置于读取器中，确保样品已经“穿过(run-through)”测试装置中包括的横向流动薄膜。
在一个实施例中，读取器是检测荧光信号的UV LED读取器。通过在光谱的UV区中发射的发光二极管并且在荧光信号的吸收峰(例如，镧系元素(lanthanide)标记)内来激发荧光信号。通过光二极管来检测发出的荧光信号，利用长通滤波器可以限制检测到的信号的波长，其中，长通滤波器阻挡偏离发射的光，并吸收波长在发射荧光标记的峰值发射波长及其左右的光。在其它实施例中，可以用带通滤波器(band pass filter)来代替长通滤波器。此外，可以通过带通滤波器来限制激发光。
在另一实施例中，二极管是UV激光二极管。可以使用任一传统的UV、LED或光二极管。
在任一这样的实施例中，激发源和检测器安装在单台机器或模制块中。为了简化在测试条上产生的荧光信号的读取。在又一实施例中，这样的机器还包括在此描述的硬性标准件(例如，图33A和图33B)。
在一个实施例中，激发光的轴与测试装置或测试装置中包括的测试条成90度。此外，发射的光的轴与测试条成90度以外的角。
在一个实施例中，由短通滤波器来限制激发光的波长。在又一实施例中，由带通滤波器和短通滤波器的试验系列来限制激发光的波长。在再一实施例中，由带通滤滤器和长通滤波器的试验系列来限制检测到的光的波长。读取器可以被构造成检测在此描述的信号发射器/标记中的任何一种。在一个实施例中，标记可以是在此描述的镧系元素中的任何一种。在又一实施例中，使用的镧系元素为铕。
如在这里所指出的，在一个实施例中，读取器被构造成包含一个或多个硬性标准件。因此，可以将读取器设计成提供保持0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2mm、2.25mm、2.5mm或3mm标准(例如，如在此描述的丙烯酸类(acrylic)中所包括的(encase))的工具(例如，夹具)，该标准设置在大约3mm、4mm、5mm或6mm中心上(例如见图33A、图33B、图34)。
在一个实施例中，读取器适于图27A和图27B的测试装置的接收端口，该接收端口自身被构造有图27C中的安全装置。在一个实施例中，如果没有按下按钮，则读取器将接受测试装置401，但是不处理测试装置401；或者，如果洗涤缓冲液对照(control)没有生成阳性信号等，则读取器将接受并读取测试装置，但是将拒绝该结果。在后面的这个实施例中，在图27C中在样品上游设置的区室/囊中设置的洗涤/运行缓冲液可以包含读取器被编程来检测的控制信号(例如，以不同波长发射的标记)。
可选地与训练神经网络相组合，利用采用数据精简和曲线拟合算法的数据处理软件来处理读取器获得的信号，从而对每条测试线给出阳性结果或阴性结果，或者定量确定样品中每个分析物的浓度，这个与指示疾病或病症的风险或存在的结果有关。可选地，可以将该结果输入到决策支持系统中，并处理该结果，以提供对医疗条件的风险改进性评估作为输出。在一个实施例中，整个程序可以自动进行和/或是电脑控制的。
护理系统的多分析物点
流感快速测试已有多年的市场。大多数这些测试是利用金或乳胶作为显色剂的横向流动免疫化验测试。虽然大多数新的快速免疫化验能够将甲型流感与乙型流感区别开来，但是只有少数的快速免疫化验在一个测试条上具有对甲型和乙型的测试线。然而，这些测试中没有一个被设计成区分出甲型流感的亚型。因此，这些测试可以能够检测出禽流感，但没有一个能够证明病人是否被甲型季节性流感病毒或更为严重的诸如命名为H5N1的甲亚型禽流感(或当前潜在大流行性的甲亚型流感)感染。本发明是基于以下构思而设计的：当应用于利用改进的再现性进行超敏分析时，能够检测出甲型、乙型并使亚型H5N1与季节性流感(亚型H1和H3)相区分，并且本发明容易使用。已经致力于将多种新技术应用于新装置设计，例如，将样品与缀合物预混合，使用跟踪(chasing)或洗涤缓冲液来减少背景，并采用独特的普通(generic)捕获剂pRNA(允许以高灵敏度进行多种分析物检测)、高度灵敏的荧光标记等。这些途径的组合使新型且高度有效地流感快速测试(该法更为灵敏)成为可能，提供了低成本产品，容易操作并且具有将季节性流感与流行性禽流感H5N1区分开来的能力。
在一个实施例中，在此描述的特征的组合对于根据本发明构建的化验的优异灵敏度和再现性以使用新型系统是可靠的，用来在测试条的测试位点从测试样品集中配体(concentrate ligand)，使用金属溶胶或其它彩色粒子作为标记物系统允许在完成化验所需的最短时间之后的一个小时或几个小时的时间段内对荧光的持续目视观察。通过在测试仪器中包括用来洗掉多余/未结合标记的可控释放的缓冲液，在保持优良灵敏度的同时，消除背景噪声。此外，将一个或多个控制位点的颜色与测试位点进行对比。在一些实施例中，在采样仪器或测试仪器中包括过滤工具，该过滤工具中限制来自天然或未加工生物样品的污染物被引入到测试位点。在又一实施例中，过滤工具是膜，并且包括设置在其上的检测和捕获探针604。
化验方法
在一个实施例中，化验方法包括以下步骤：将采样仪器作用于受试对象或受试对象的生物样品，以采集样品(例如，鼻子、嘴、喉咙、耳朵内部的分泌物)；使采集元件作用于从受试对象获得的生物样品；将采集仪器插到样品采集装置容纳室中，挤压上室以使速动阀打破，并使缓冲液向下流到采样仪器，从而浸入设置在采样仪器上的生物样品并使缓冲液和样品的混合物流到反应室(例如，下室)中，在反应室中，多个捕获和检测探针结合到它们特定的目标分析物。随后或同时，借助连接到捕获探针的互补捕获部分，从SCD的末端将混合物排到测试装置中，测试装置包括被设计成捕获分析物和检测/捕获探针的复合物的固定的捕获部分。因此，对于一种特定分析物，特定的捕获探针被设计成对固定的捕获部分是互补的。此外，如在此所公开的，捕获部分按不同位点/图案设置在横向流动膜上，在如果借助信号发射标记检测到信号或斑的情况下，能够对特定分析物进行定性和/或定量检测。因此，如在此所公开的，通过将横向流动膜上的特定捕获探针图案化，化验方法可以检测相同或相关传染物的试验系列，甚至不相关传染物的试验系列。
在一些实施例中，使用的是夹心免疫化验格式，但是，可以使用包括竞争性化验在内的任一传统格式。典型地，按夹心格式使用对形成的免疫复合物间接捕获。样品中的一种或多种分析物与一对或多对检测探针和捕获探针接触。每对包含检测探针和捕获探针，其中，检测探针是包括标记和能够与分析物特异结合的特异结合剂(SBA)的缀合物，捕获探针是包括检测部分和另一个能够与同一分析物特异结合的SBA的缀合物。特异结合剂的示例包括抗体和适体。在一个实施例中，由于两种SBA中的每种是相同的目标抗原或分析物，所以每种都是特异结合配对物。SBA的示例是本领域公知的，并且包括但不限于抗体、适体或寡核苷酸。在夹心化验中，分析物同时被检测探针和捕获探针结合。检测部分是特异结合对的一部分，这对的另一配对物在测试装置上是固定的，从而随着其流过测试装置，捕获免疫复合物。对每种不同的分析物使用不同的捕获部分允许在测试装置上从单个样品和反应序列检测出多种分析物。在多数情况下，用于每种分析物的标记是不同的。然而，利用对每种分析物具有特异性定位作为捕获区，所述捕获区具有针对每种分析物的不同的捕获部分，能够对所有的分析物使用相同的标记。
在第4,168,146号和第4,366,241号美国专利中描述了在测试条上执行夹心免疫化验的示例，这两个专利均通过引用包含于此。在第4,235,601、4,442,204和5,208,535美国专利中描述了竞争性免疫化验的示例，这些专利均通过引用包含于此。可以适于并入本发明的一个或多个组件的一些附加的示例性装置包括浸量尺、横向流动、匣、多重微孔板、微量滴定板、微流体、板或阵列或者高通量平台，例如那些在以下专利中公开的装置：第6,448,001、4,943,522、6,485,982、6,656,744、6,811,971、5,073,484、5,716,778、5,798,273、6,565,808、5,078,968、5,415,994、6,235,539、6,267,722、6,297,060、7,098,040、6,375,896、7,083,912、5,225,322、6,780,582、5,763,262、6,306,642、7,109,042、5,952,173和5,914,241号美国专利。示例性的微液体装置包括那些在第5,707,799和WO2004/029221号美国专利中。
在一种这样的方案中，测试条包含针对分析物的酶标记的结合配对物，其在自样品应用区的区域下游中。如果在测试样品中存在分析物，则该分析物将与它的标记结合配对物组合而形成复合物，该复合物将沿着测试条流到检测区，该检测区包含含有用于酶标记的基底并且能够提供可检测的酶的反应，例如，在存在酶的情况下为颜色反应。测试条还包含其中预定量的分析物固定的区域，从而由于在样品中不存在分析物，而将捕获不与分析物组合的任一标记的结合配对物，并由此被抑制到达检测区。
可替换地，测试条可以包含结合配对物，该结合配对物包括具有可检测的物理性质的部分。例如，标记的结合配对物可以包括一个或多个部分，例如，基于特定物理性质可检测到的化学基团，所述特定物理性质包括但不限于有色种类的荧光剂、磷光分子、放射性同位素、电活性部分、诸如金的粒子等。
在另一方案中，检测是基于它的量在样品中被确定的特异性分析物(例如，配体、抗原或抗体)和已知量的示踪剂之间的竞争，利用分析物和示踪剂在朝着分析物和示踪剂是特异性的结合剂上竞争有限量的可获得的结合位点，其中，示踪剂通常是标记形式的分析物或其合适的类似物。例如，如果示踪剂和结合剂的浓度是固定的，并且唯一的变量是分析物的水平，则可以通过确定系统中的结合的和/或游离的示踪剂体重为测量未知水平的分析物。将化验中确定的值与通过以相同方式处理的已知量的分析物的范围给定的值进行比较，通过这种比较，可以确定样品中的分析物的量。
通常，为了确定在被结合和/或游离部分的被化验物中的示踪剂作为对分析物的测量，在这种化验中使用的示踪剂要求使用仪器和/或对示踪剂进行处理。例如，在使用酶作为对示踪剂的标记或标记物的被化验物中，必须用合适的显影剂使酶显影。当标记或标记物是荧光材料时，通过使用用于确定荧光性的适合的仪器来确定被结合和/或游离部分的示踪剂。
可替换地，在化验中使用的示踪剂是用颗粒标记标记的配体，该颗粒标记在结合到载体上时或者结合到已结合到载体上的结合剂的分析物时是可见的，而无需进一步的处理，其中，配体用结合剂或分析物来结合。同样见第4,703,017号美国专利，该专利通过引用包含于此。
在另一个具体的方面，本发明的基于非核酸的筛选测试包括任何固相测试、横向流动测试或灌流测试。通常，固相免疫化验装置包含固相载体，配体-受体对的一个成员，通常为抗体、抗原或半抗原结合到该固相载体。共同早期形式的固相载体是由聚苯烯制成的板、管或珠，这是放射免疫化验和酶免疫化验领域所公知的。最近，已经采用许多诸如尼龙、硝化纤维、醋酸纤维素和其它的多孔聚合物的多孔材料作为固相载体。
在一个实施例中，借助采样仪器102从受试对象采集样品，并将该样品放回到SCD装置200的柱形壳(cylinder housing)中。首先，SCD可以插到测试装置中，或者在插到测试装置之后，释放在SCD的上密封室中包含的溶液，从而将样品和溶液有效地洗涤到下面朝着反应室的混合物中。在反应室中设置包含检测和捕获探针的液体或固体试剂，所述检测和捕获探针以在此公开的一种或多种不同的分析物为靶，从而形成结合到检测和捕获探针的分析物的复合物。然后，将样品从SCD通过孔释放到测试装置中，所述孔从外部环境密封SCD和测试装置之间的接触(例如，防止溢出、悬浮或污染)。通过将SCD(上密封室)挤压到测试装置中引入的重量或大气压力的力，作为此结果，样品混合物可以流动。在毛细管力的作用下和/或通过测试装置307中包括的洗涤缓冲液来推动样品，从而使任何分析物-探针复合物穿过测试装置中包含的横向流动膜。捕获探针和互补的固定的捕获部分在横向流动膜803或804上以预定线或点相互结合或杂交，由此，检测探针(借助检测探针中包含的缀合标记)将提供可检测信号，随后可以读取该可检测信号以确定在处理过的样品存在哪些分析物。
在一个实施例中，其上具有处理过的样品的测试装置在读取结果之前可以放在旁边大约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时或8小时的时间段，如果在处理之后的15分钟或20分钟读取结果，该测试装置仍可以提供一样精确的结果。因此，生成的信号长时间稳定，从而可以在实际执行测试之后的更靠后的时间读取结果。这是对即时护理诊断的重大改进，即时护理在现场条件下人力和时间的资源有限，并且可以在不容易快速访问的远程距离内可以进行测试设定。
结合试剂
本发明的一个方面在于一种设置在SCD中的结合试剂。例如，在一些免疫化验中，使用抗体对，该抗体对的每个成员可以特定结合同一目标分析物，其中，一个抗体是捕获抗体，另一个是检测抗体。捕获抗体直接或间接连接到捕获部分，所述捕获部分被设置在固相载体(例如，硝化纤维膜)上的同源固定的捕获部分“捕获”。此外，检测抗体(即，检测探针)连接到可检测标记。优选地，检测抗体由缀合到物理可检测标记进行标记，并且在与包含目标分析物的样品接触时形成复合物。然后，可以借助捕获部分将抗体-分析物复合物固定在固相载体上。借助标记可以检测固定在固相载体上的得到的复合物。
在一个实施例中，SCD试剂溶液或固相基底包括多个不同的检测探针，每个检测探针能够结合到不同的目标，并且每个检测探针能够用检测信号标记或能够获得检测信号的信息，从而通过在针对那个目标(即，在测试装置中)的测试区的信号的信息来指示每个目标的存在；其中，用于至少两个捕获部分的目标是传染物、致病微生物或者指示被获取样品溶液的宿主的疾病、紊乱或条件的标记物，其中，至少两个捕获部分能够结合到同一传染物或致病微生物的不同的组分或者标记物，或者结合到不是由传染物或致病微生物引起的用于相同疾病、紊乱或条件的不同标记物，作为对那些捕获部分的目标。此外，SCD还将包括多个不同的捕获探针，每个探针与检测探针配对，由结合特定目标分析物的能力来定义这些对。
如这里所使用的，术语“特异结合(specifically binds)”表示特异结合对的结合特异性。“特异结合对成员”表示特定性结合对(sbp)的成员，是指两个不同的分子，其中，一个分子特定与第二个分子通过化学方法或物理方法结合。例如，一对pRNA或适体/目标抗原对，或者链霉亲和素-生物素提供示例性特异结合对成员或sbp。这两个分子在某种意义上来讲是相关的，即，它们彼此的结合使得它们能够使它们的结合配对物与其它具有相似特征的化验成分区分开来。特异结合对的成员称作配体和受体(反配体)、sbp成员和sbp成员(partner)等。分子可以是用于分子的凝集的sbp成员；例如，可以考虑将针对第二抗体和其对应的抗原的免疫复合物的抗体作为用于免疫复合物的sbp成员。
除了抗原和抗体特异结合对成员之外，其它的特异结合对包括作为示例而不限于生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和外源凝集素(lectin)、互补核苷酸序列、互补肽序列、效应物和受体分子、酶辅助因子和酶、酶抑制因子和酶、肽序列或化学部分(诸如地高辛(digoxin)/抗地高辛)和对序列特异的抗体、化学部分或整个蛋白质、聚合物酸和聚合物碱、染色(dye)和蛋白质结合剂、肽和特异性蛋白结合剂(例如，核糖核酸酶、S-肽和核糖核酸S-肽)、金属和它们的螯合剂，等等。此外，特异结合对可以包括作为原始特异结合成员的类似物的成员，例如，通过重组技术或分子工程制得的分析物-类似物或特异结合成员。
如果sbp成员和另一sbp成员均能够结合到另一相同的互补sbp成员，则这个sbp成员是另一sbp成员的类似物。例如，这样的sbp成员可以是由基团取代至少一个氢原子改性的配体或受体，例如为标记的配体或标记的受体。sbp成员可以与分析物类似或互补，或者与分析物互补的sbp成员类似或互补。如果特异结合成员是免疫反应物，则该特异结合成员可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或抗体、嵌合抗体、它们的混合物或片断，以及抗体和其它特异结合成员的混合物。结合对的其它示例可以包含到在以下专利中公开的检测分子中：第6,946,546、6,967,250、6,984,491、7,022,492、7,026,120、7,022,529、7,026,135、7,033,781、7,052,854、7,052,916和7,056,679号美国专利。
“抗体”是指基本由一个或多个免疫球蛋白基因编码的多肽或它的片断，并且包括含有单克隆抗体、多克隆抗体、结合到特异抗原的多特异或双特异抗体在内的任何一种免疫球蛋白。完全抗体包括两条重链和两条轻链。每条重链由可变区与第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。抗体呈“Y”形状，其中，Y的干(stem)由借助二硫键键结在一起的两套重链的第二恒定区和第三恒定区组成。Y的每条臂由键结到单轻链的可变区和恒定区的单重链的可变区和第一恒定区组成。轻链的可变区和重链的可变区对抗原组合负责。这两种链的可变区通常包含称作互补决定区(CDR)的三个高变环(轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3)(如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)，vols.1-3，NIH Publication91-3242，Bethesda Md.所限定的)。这三个CDR置于已知的框架区(FR)的侧翼框架之间，所述框架区比CDR更加高度保守，并且形成用来支撑超变环的骨架。重链和轻链的恒定区不是包含在抗原结合剂中，而是表现出各种效应子功能。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区，以及许多免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，这反过来又定义了免疫球蛋白类和亚类，免疫球蛋白类和亚类分别包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgA1或IgA2、IgD和IgE。通常，抗体是在其表面上或在腔内具有一定面积的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白特异结合到另一分子的特定空间和极性组织并由此拒绝与该组成互补。抗体可以是多克隆或单克隆。抗体可以包括完全免疫球蛋白或完全免疫球蛋白的片断。完全免疫球蛋白的片断可以包括Fab、Fv和F(ab′)2、Fab′等。抗体也可以包括嵌合抗体或通过重组方法制得的嵌合抗体的片断。在这里使用的术语“抗体”是基于抗体重链的恒定区的氨基酸序列来分类的。抗体的主要分类是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些分类中的一些分类例如被分为亚类。
除了完整免疫球蛋白之外，在这里使用的术语“抗体”还指完整免疫球蛋白的片断(即，免疫球蛋白分子的至少一个免疫活性部分)，例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片断、单链抗体分子、由包括一个或多个CDR的免疫球蛋白分子的任一片断形成的多特异性抗体。此外，在这里使用的抗体可包括来自移植到一个或多个不同人免疫球蛋白的框架区的特定人免疫球蛋白的一个或多个CDR。
关于抗体的“Fab”是指由通过二硫键键结到单重链的可变区和第一恒定区的单轻链(可变区和恒定区)组成的那部分抗体。
“Fab”是指包括铰链区的一部分的Fab片断。
“F(ab′)2”是指Fab′的二聚物。
关于抗体的“Fc”是指由经过二硫键键结到第二重链的第二恒定区和第三恒定区的第一重链的第二恒定区和第三恒定区组成的那部分抗体。抗体的Fc部分对各种效应子功能负责，但是对抗原结合不起作用。
关于抗体的“Fv”是指携带(bear)完整抗原结合位点的抗体的最小片断。Fv片断由键结到单重链的可变区的单轻链的可变区组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由相互直接连接或借助肽接头序列连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程抗体(Huston 1998)。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接抗体的Fc区的scFv组成的工程抗体。
在这里使用的术语“表位”是指在抗体结合的抗原分子上的原子和/或氨基酸的基团。
在这里使用的在这里使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同质抗体的群获得的抗体或抗体的片断，即，除了可能少量存在的能够自然发生突变的之外，包括群的个体抗体相同。单克隆抗体直接针对抗原上的单抗原决定簇(epitope)是高特异性的。单克隆抗体是相对于多克隆抗体而言的，多克隆抗体通常包括针对抗原上不同抗原决定簇的不同抗体。虽然在传统上，单克隆抗体源于杂交，但是本发明的单克隆抗体不受它们生产方法的限制。例如，本发明的单克隆抗体可以通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤的方法制得，或者可以通过重组DNA方法制得(例如，见第4,816,567号美国专利)。
在这里使用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体以及这种抗体的片断，即，在该抗体中，重和/或轻链的一部分与从特定物种获取或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或具有同源性，而重和/或轻链的其余部分与从其它物种获取或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或具有同源性，对于抗体片断只要这种抗体片断表现出期望的抗原-结合活性即可(Cabilly等，第4,816,567美国专利；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：68516855(1984))。
在这里使用的术语“人源化抗体”是指作为人免疫球蛋白(受体抗体)的抗体或抗体片断，其中，来自受体的CDR的一部分或全部的残基被来自具有期望的特异性、亲合力和能力(capacity)的诸如小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的CDR的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被对应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包括既不是在受体抗体中也不是在移植的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步精炼并优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括至少一个(典型地，为两个)可变区的基本全部，其中，CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体可选地还将包括免疫球蛋白Fc区的至少一部分，典型地，包括人免疫球蛋白的Fc区。对于更详细的描述，见Jones等，Nature，321：522525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397402(2000)。
本发明提供了通过小鼠杂交瘤细胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2生成的抗-H5单克隆抗体。这些单克隆抗体是以产生这些抗体的杂交瘤细胞株命名的。因此，分别由小鼠杂交瘤细胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2生成的抗-H5单克隆抗体被分别命名为单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2。单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2特异结合到亚型H5禽流感病毒的血凝素。已于2006年1月17日将小鼠杂交瘤细胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC-C200607(杂交瘤细胞株8H5)、CCTCC-C200605(杂交瘤细胞株3C8)、CCTCC-C200608(杂交瘤细胞株10F7)、CCTCC-C200606(杂交瘤细胞株4D 1)、CCTCC-C200604(杂交瘤细胞株3G4)和CCTCC-C200424(杂交瘤细胞株2F2)。
在各个实施例中，提供了单克隆抗体，阻断(block)单元单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2与亚型H5禽流感病毒的血凝素的结合。这样的阻断单克隆抗体可以结合到血凝素上由单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2识别的相同的表位。或者，那些阻断单克隆抗体可以结合到与通过单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2识别的表位空间重叠的表位。这些阻断(blocking)单克隆抗体可以使单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2与亚型H5禽流感病毒血凝素的结合减少至少大约50％。可替换地，这些阻断单克隆抗体可以使结合减少至少大约60％，优选地为至少大约70％，更优选地为至少大约75％，更优选地为至少大约80％，更优选地为至少大约85％，甚至更优选地为至少大约90％，甚至更优选地为至少大约95％，最优选地为至少大约99％。
测试单克隆抗体减少已知单克隆抗体与H5血凝素的结合的能力可以由常规竞争性化验来测定，例如，如在Antibodies：A Laboratory Manual(《实验手册》)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Ed Harlow and David Lane(1988)中所描述的方法。例如，这样的化验可以通过如下步骤来执行：用抗原预涂覆微量滴定板；利用与选定浓度的标记已知抗体混合的未标记的测试抗体的连续稀释，对预涂覆板进行培养；洗涤培养混合物；在测试抗体的各个稀释物检测并测定结合到板的已知抗体的量。测试抗体与用于结合到抗原的已知抗体的竞争越强，已经抗体与抗原的组合将减少得越多。通常，在96孔板上预涂覆抗原，利用放射性或酶标记来测定未标记抗体阻断与标记抗体的结合的能力。
首先，可以通过Kohler等，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在该杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物被免疫剂和(如果期望的话)佐剂的一种或多种注射物免疫。典型地，将通过多次皮下注射或腹腔内注射将免疫剂和/或佐剂注射到宿主动物内。使免疫剂缀合到已知的对正被免疫的宿主动物产生免疫性的蛋白质(例如，血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)，这样可能是有用的。可以采用的佐剂的示例包括Freund的竞争佐剂和MPL-TDM。在免疫之后，宿主动物使产生或能够产生抗体的淋巴细胞将特异结合到免疫使用的抗原。可替换的，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。采集期望的淋巴细胞，并利用合适的融合剂(例如，聚乙二醇)使所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。
对由此制备的杂交瘤细胞育种并使其在适合的培养基中生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制不融合、亲代杂交瘤细胞生长或生存的物质。例如，如果亲代杂交瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基将典型地包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺乏细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些被选定的抗体生成细胞有效地融合、支持抗体的稳定高水平生长的细胞，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠科动物骨髓瘤系，例如那些能够从美国加利福尼州亚圣地亚哥(San Diego，Calif.USA)Salk Institute Cell Distribution Center得到的MOP-21和MC-11小鼠瘤获取的细胞系和从美国马里兰州洛克威尔(Rockville，Md.USA)American Type Culture Collection得到的SP-2或X63-Ag8-653细胞获取的细胞系。也已经对人单克隆抗体的生成描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
为了生成针对抗原的单克隆抗体，对杂交瘤细胞在其内生长的培养基进行化验。优选地，通过免疫沉淀反应或体外结合化验，例如通过放射免疫化验(RIA)或酶联免疫吸附化验(ELISA)，确定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。例如，可以通过Scatchard analysis of Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)来确定单克隆抗体的结合亲合力。
在鉴别出生成期望特异性、亲合力和/或活性的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释过程对这些细胞进行亚克隆，并使这些细胞按照标准方法来生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。例如，用于此目的的合适的培养基包括DMEM或RPMI-1640基。此外，杂交瘤细胞可以在体内作为动物的腹水瘤来生长。
通过传统的免疫球蛋白纯化步骤，例如通过蛋白质A-琼脂糖、羟基磷石灰柱层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清适当地分离出由亚克隆分泌的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体还可以通过传统的基因工程方法来制得。利用能够特异结合到编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡聚核苷酸探针，例如通过PCR从杂交瘤细胞中分离出编码单克隆抗体的重链和轻链的DNA分子。然后，将DNA分子插到表达载体中。将表达载体转染到没有另外生成免疫球蛋白的宿主细胞中，所述宿主细胞例如为E.coli细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。在适于抗体表达的条件下培养宿主细胞。
本发明的抗体可以结合到特异性和亲合力高的H5血凝素。抗体与其它亚型血凝素的交叉反应性应该低，优选地，与其它亚型血凝素不具有交叉反应性。在一个方面，本发明提供了以小于1×10-5M的KD值结合到H5血凝素的抗体。优选地，KD值小于1×10-6M。更优选地，KD值小于1×10-7M。更优选地，KD值小于1×10-8M。
本发明的抗体可以包含传统由两条重链和两条轻链组成的“Y”状结构。此外，抗体也可以是Fab片断、Fab′片断、F(ab)2片断或Fv片断，或者是传统的“Y”状结构的保持与血凝素的结合亲合力的其它部分片断。片断与血凝素的结合亲合力可以比传统“Y”状结构的结合亲合力高或低。
可以通过完整抗体的蛋白水解生成抗体片断(例如，见Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods，24：107-117，(1992)和Brennan等，Science，229：81(1985))。也可以通过重组宿主细胞直接生成这些片断(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.，11：548-557(1999)；Little等，Immunol，Today，21：364-370(2000))。例如，Fab′片断可以从E.coli直接恢复并化学结合，从而形成F(ab)′2片断(Carter等，Bio/Technology，10：163-167(1992))。在另一实施例中，利用亮氨酸拉链GCN4形成F(ab)′2片断，以促进F(ab)′2分子的组装。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养基分离Fv片断、Fab片断、F(ab)′2片断。对于本领域普通技术人员而言，其它用于生成抗体片断的技术应该是清楚的。
本发明提供了编码特异结合到H5血凝素的抗体或其片断的分离的核苷酸分子。可以从杂交瘤细胞分离编码抗体的核苷酸分子。可以利用本领域普通技术人员已知的常规技术来确定分子的核苷酸序列。也可以利用传统的基因工程技术以及化学合成来制备本发明的核苷酸分子。在一个方面，本发明提供了编码抗H5(HA)抗体的重链的可变区的分离的核苷酸分子或者这种核苷酸分子的一部分。在另一方面，本发明提供了编码抗体重链或轻链可变区的CDR的分离的核苷酸分子。
在一个方面，本发明提供了编码单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链和轻链的可变区的分离的核苷酸分子。分别在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24中提到了编码单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链可变区的核苷酸序列。分别在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：24中提到了编码单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1和2F2的轻链可变区的核苷酸序列。本发明还包括编码单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链和轻链的可变区的核苷酸序列的退化性类似物。
在另一个方面，本发明提供了与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26的核苷酸序列具有序列同一性的分离的核苷酸变异体。在一个实施例中，对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：26的序列，核苷酸变异体具有至少70％的序列同一性，优选地为至少75％序列同一性，更优选地为至少80％序列同一性，更优选地为至少85％序列同一性，更优选地为至少90％序列同一性，更优选地为至少95％序列同一性。
本发明还提供了编码仍然能够特异结合到亚型H5禽流感病毒的抗体片断的分离的核苷酸分子。
本发明还提供了编码抗体重链可变区的分离的核苷酸分子，所述抗体重链可变区包括在SEQ ID NO：28-30、SEQ ID NO：34-36、SEQ ID NO：40-42、SEQ ID NO：46-48、SEQ ID NO：52-54和SEQ ID NO：58-60中提到的氨基酸序列。本发明提供了编码抗体轻链可变区的分离的核苷酸分子，所述抗体轻链可变区包括在SEQ ID NO：31-33、SEQ ID NO：37-39、SEQ ID NO：43-45、SEQID NO：49-51、SEQ ID NO：55-57和SEQ ID NO：61-63中提到的氨基酸序列。
本发明提供了包括本发明的分离的核苷酸分子的重组表达载体。本发明还提供了用核苷酸分子转化的宿主细胞。此外，本发明提供了一种生产本发明的抗体的方法，该方法包括在表达核苷酸分子以生成抗体的条件下培养宿主细胞，并从宿主细胞分离出抗体。
抗体多肽序列
已经从单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链和轻链的可变区的核苷酸序列推导出它们各自的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：25中提到了单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链可变区的氨基酸序列。在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：27中提到了编码单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1和2F2的轻链可变区的核苷酸序列。在一个方面，本发明提供了包括重链可变区的抗H5抗体，所述重链可变区包括如在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：25中提到的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供了包括轻链可变区的抗H5抗体，所述轻链可变区包括如在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：25中提到的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的可变区的抗体重链，优选地具有至少75％的序列同一性，更优选地具有至少80％的序列同一性，更优选地具有至少85％的序列同一性，更优选地具有至少90％的序列同一性，最优选地具有至少95％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供了包括可变区的抗体轻链，可变区与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：27中提到的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，优选地具有至少75％的序列同一性，更优选地具有至少80％的序列同一性，更优选地具有至少85％的序列同一性，更优选地具有至少90％的序列同一性，最优选地具有至少95％的序列同一性。
单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链和轻链的可变区的CDR的氨基酸序列已经确认如下：
分别在SEQ ID NO：28-30中提到单克隆抗体8H5的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：31-33中提到单克隆抗体8H5的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
分别在SEQ ID NO：34-36中提到单克隆抗体3C8的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：37-39中提到单克隆抗体3C8的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
分别在SEQ ID NO：40-42中提到单克隆抗体10F7的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：43-45中提到单克隆抗体8H5的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
分别在SEQ ID NO：46-48中提到单克隆抗体4D1的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：49-51中提到单克隆抗体4D1的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
分别在SEQ ID NO：52-54中提到单克隆抗体3G4的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：55-57中提到单克隆抗体3G4的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
分别在SEQ ID NO：58-60中提到单克隆抗体2F2的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：61-63中提到单克隆抗体2F2的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
表1单克隆抗体CDR氨基酸序列的六株

在另一方面，本发明提供了包括以下CDR的抗H5单克隆抗体重链或其片断：(i)从SEQ ID NO：28-30中选择的一个或多个CDR；(ii)从SEQ IDNO：34-36中选择的一个或多个CDR；(iii)从SEQ ID NO：40-42中选择的一个或多个CDR；(iv)从SEQ ID NO：46-48中选择的一个或多个CDR；(v)从SEQID NO：52-54中选择的一个或多个CDR；或者(vi)从SEQ ID NO：58-60中选择的一个或多个CDR。在一个实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括分别具有在SEQ ID NO：28-30中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括分别具有在SEQ ID NO：34-36中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括具有在SEQ ID NO：40-42中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括具有在SEQ ID NO：46-48中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括具有在SEQ ID NO：52-54中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体重链或其片断包括分别具有在SEQ IDNO：58-60中提到的氨基酸序列的三个CDR。
在另一方面，本发明的包含在抗H5单克隆抗体重链或其片断中的CDR可以包括从SEQ ID NO：28-30、34-36、40-42、46-48和58-60中提到的氨基酸序列中取代、添加和/或缺失的一个或多个氨基酸。优选地，可以只是在三个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。更优选地，可以只是在两个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。更优选地，可以只是在一个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。
在另一方面，本发明提供了包括以下CDR的抗H5单克隆抗体轻链或其片断：(i)从SEQ ID NO：31-33中选择的一个或多个CDR；(ii)从SEQ IDNO：37-39中选择的一个或多个CDR；(iii)从SEQ ID NO：43-45中选择的一个或多个CDR；(iv)从SEQ ID NO：49-51中选择的一个或多个CDR；(v)从SEQID NO：55-57中选择的一个或多个CDR；或者(vi)从SEQ ID NO：61-63中选择的一个或多个CDR。在一个实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括分别具有在SEQ ID NO：31-33中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括分别具有在SEQ ID NO：37-39中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括具有在SEQ ID NO：43-45中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括具有在SEQ ID NO：49-51中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括具有在SEQ ID NO：55-57中提到的氨基酸序列的三个CDR。在另一实施例中，抗H5单克隆抗体轻链或其片断包括分别具有在SEQ IDNO：61-63中提到的氨基酸序列的三个CDR。
在另一方面，本发明的包含在抗H5单克隆抗体轻链或其片断中的CDR可以包括从SEQ ID NO：31-33、37-39、43-45、49-51、55-57和61-63中提到的氨基酸序列取代、添加和/或缺失的一个或多个氨基酸。优选地，可以只是在三个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。更优选地，可以只是在两个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。更优选地，可以只是在一个氨基酸位置处发生氨基酸取代、添加和/或缺失。
表2结合到8H5mAb或3C8mAb的7aa肽的氨基酸序列

通过在上面描述的抗体或上面描述的CDR的可变区中取代、添加和/或缺失氨基酸生成的变异体保持与亚型H5禽流感病毒的特异结合的能力。本发明还包括这类变异体的抗原结合片断。
本发明的单克隆抗体变异体可以通过传统的基本工程方法来制得。可以利用本领域普通技术人员公知的方法将核苷酸突变引入到DNA分子中。可替换地，可以通过化学合成来制得编码重链和轻链的核苷酸分子。
在另一方面，本发明的筛选方法包括以下步骤：(i)在适于肽表达的条件下培养肽展示库(peptide display library)；(ii)使培养液与本发明的单克隆抗体接触；(iii)选择特异结合到所述单克隆抗体的噬菌体克隆。筛选所用的单克隆抗体可以包括但不限于单克隆抗体8H5、3C8、10F7、4D1和3G4。在此包括的示例12详细描述了利用肽噬菌体展示库对结合到本发明的单克隆抗体的短肽成功筛选的化验。
表3结合到8H5mAb的12aa肽的序列


如这里所使用的术语“分析物”是指待检测的或待测定的化合物或组成物，并且具有至少一个表位或结合位点。分析物可以是存在自然发生分析物特异结合成员的任何物质或者是可以制备出分析物-特异结合成员的任何物质，例如，碳水化合物和凝集素、激素和受体、互补核酸等。此外，可能的分析物实际上包括任何化合物、组合物、聚集物或其它可以免疫检测的物质。即，分析物或其部分应该是具有至少一个决定簇(determinant)位点的抗原或半抗原，或者应该是自然发生结合对的成员。
分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、细菌、病毒、氨基酸、核酸、碳水化合物、激素、类固醇、维生素、药品(包括那些出于治疗目的使用的药品以及那些出于不正当用途使用的药品)、污染物、杀虫剂和代谢物或者对以上物质中的任何一种产生抗体。术语“分析物”还包括任何抗原物质、半抗原、抗体、大分子及其组合。在第4,366,241，号美国专利第19栏第7行至第26行至42行中提到了示例性分析物的非穷尽性列举，该专利的公开通过引用包含并入本文。第4,299,916号、第4,275,149号和第4,806,311号美国专利中有对代表性分析物的进一步的描述和列举，所有这些专利通过引用包含于此。在一些实施例中，SCD或测试装置被构造成检测多种不同分析物(例如，图26)。
标记试剂
“标记试剂”是指包括附着到特异结合成员的可检测标记(例如，检测探针)。所述附着可以是共价结合或非共价结合，但是附着的方法对于本发明而言并不是关键性的。标记使标记试剂能够产生与分析物在流体样品中的存在相关的可检测信号。选择标记试剂的特异结合成员，以通过辅助特异结合成员直接结合到分析物或者间接结合到分析物，在下方将对此进行更详细的描述。标记试剂可以从捕获区在位点上游并入到测试装置中，可以与流体试验系列合以形成流体溶液，可以与测试样品分开而添加到测试装置中，或者可以沉积或相反固定在捕获区。此外，可以在通过适合的附着方法执行化验之前或过程中标记特异结合成员。
“标记”是指任何能够生成通过视觉或仪器工具可检测到的信号的物质。适于本发明使用的各种标记包括通过化学手段或物理手段生成信号的标记。这样的标记可以包括酶和基底、色原、催化剂、荧光体或类似荧光体的化合物和/或颗粒、磁性化合物和/或颗粒、化学发光化合物和/或颗粒以及放射性标记。其它适合的标记包括颗粒状(particulate)标记，例如，诸如金的胶体金属颗粒、诸如硒或碲的胶体非金属颗粒、诸如染色塑料或染色的微生物的染料或着色颗粒、有机聚合物胶乳颗粒和微脂粒、着色珠、聚合物微胶囊(polymer microcapsule)、囊(sac)、红细胞、红细胞血影或者其它直接包含可见物质的泡囊等。典型地，视觉可检测的标记用作标记试剂的标记，从而提供了直接视觉或仪器读出分析物在测试样品中的存在或量，而无需在检测位点生成组分的附加信号。
本发明的实践中可利用的另外的标记包括发色团、电化学部分、酶、放射性部分、磷光基团、荧光部分、化学荧光部分或量点，或者更具体地讲，放射性标记、荧光团标记、量子点标记、发色团标记、酶标记、亲配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、用纳米颗粒光散射标记或其它纳米颗粒标记的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明(rhodamine)、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、德克萨斯红(Texas Red)、Phar-红、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)(APC)、诸如FLAG或HA表位的表位标签和酶标签，酶标签例如为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或诸如地高辛配基或二硝基苯基的乙酰胆碱酯酶和半抗原缀合物、或能够形成诸如链霉抗生物素/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体复合物的复合物的结合对的成员，其中，抗原/抗体复合物例如包括兔IgG和抗兔IgG；荧光团，例如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红(eosin)、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素(coumarin)、甲基香豆素、嵌二萘(pyrene)、孔雀绿(malachite green)、芪(stilbene)、荧虾黄(lucifer yellow)、Cascade Blue、二氯代三嗪基胺荧光素、二甲氨基萘磺酰氯(dansyl chloride)、藻红素(phycoerythrin)、诸如那些包括铕和铽的荧光体镧系复合物、Cy3、Cy5、分子信标(beacon)及其荧光衍生物、诸如luminol的发光材料；散光或胞质基团谐振(plasmon resonant)材料，例如金或银颗粒或量子点；或者放射性材料包括14C、123I、124I、125I、131I、Tc99m、35S或3H；或者，球形壳体和用任一其它本领域技术人员公知的生成标记的信号标记的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光素以及其它如在以下出版物中描述的本领域公知的其它物质：例如，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Joseph R.Lakowicz(Editor)，Plenum Pub Corp，2nd edition(July 1999)and the 6th Edition of the Molecular Probes Handbook by Richard P.Hoagland。
可以采用许多信号生成系统来实现本发明的目的。信号生成系统生成与样品中的分析物(即，目标分子)的存在相关的信号。信号生成系统可以包括要求生成可测量的信号的所有试剂。信号生成系统的其它组成可以包括在显影溶液中，并且可以包括基底、增强剂、活化剂、化学发光化合物、辅助因子、抑制剂、净化剂、金属离子、要求信号生成的结合的特异结合物质等。信号生成系统的其它组成可以是辅酶、与酶产物反应的、其它的酶和催化剂等。在一些实施例中，期望通过视觉检查，信号生成系统通过使用电磁辐射提供由外部工具可检测的信号。在第5,508,178号美国专利中描述了示例性的信号生成系统。
在一些实施例中，核酸分子可以连结到检测探针(例如，抗体链结寡聚核苷酸)，从而核酸分子起着利用核酸标记的标记的作用。例如，SCD中包括的试剂溶液或基底可以包括检测试剂-多个检测和捕获特异结合剂(SBA)-包括起着提供可检测信号的多个寡聚核苷酸，从而对于给定子群的SBA(对特定分析物是特异性的)，缀合的寡聚核苷酸用不同的染色剂预染色，而对于另一子群的抗体(对不同的分析物是特异性的)是以连续单独的方式结合核酸分子的核酸染色剂。示例包括内嵌(intercalating)染色，例如，phenanthridine和吖啶(例如，溴化乙啶、碘化丙啶、hexidium iodide、二氢乙啶、乙啶均二聚物-1和乙啶均二聚物-2、单叠氮乙啶和ACMA)；一些微grove结合剂，例如，吲哚和咪唑(例如，Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580和DAPI)；和混杂核酸染色剂，例如，吖啶橙(也能够内嵌)、7-AAD、霉放线菌(actinomycin)D、LDS751和hydroxystilbamidine。所有上述提到的核苷酸染色剂均可由供应商(例如，Molecular Probes，Inc)处以商业的办法得到。核苷酸染色剂的其它示例包括以下来自Molecular Probes的染色剂：花青染料，例如SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、YTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)。其它可检测标记物包括化学发光和染色基因分子、光学或电子密度标记等。
如在某些实施例中所述，标记包括半导体纳米晶，例如，在第6,207,392号美国专利中描述的量子点(即，Qdot)。可以从Quantum Dot Corporation商业获得Qdot。在本发明的实践中使用的半导体纳米晶包括：第II-VI族半导体的纳米晶，例如，MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、和HgTe以及它们混合的组成物；第III-V半导体的纳米晶，例如，GaAs、InGaAs、InP和InAs以及它们混合的组成物。在某些条件下作用诸如锗或硅的第IV族半导体或者有机半导体也是可行的。半导体纳米晶也可以包括合金，所述合金包含从由以上第III-V族化合物、第II-V族化合物、第IV族元素及其组合组成的组中选择的两种或两种以上的半导体。
在一些实施例中，荧光能受体作为标记连接到检测探针(即，与检测分子缀合的结合部分)。在一个实施例中，荧光能受体分子可以这样来形成，即，化合物与单纯的氧反应形成荧光化合物，或者化合物可以与由其转化而来的辅助化合物反应来形成荧光化合物。所述辅助化合物可被包含在SCD和/或测试装置中含有的缓冲物中。在其它实施例中，荧光能受体可作为化合物的一部分被包含，所述化合物还包含化学发光剂。例如，荧光能受体可包括稀土元素如铕、钐、碲等的金属螯合物。由于这些材料的发光带尖锐，所以这些材料尤其引人注目。此外，镧系标记例如铕(III)提供有效的、长时间的信号发射，并且耐光漂白，从而允许含有处理过的/反应过的样品的测试装置长时间设置在旁边(如果需要的话)。
已经表明，寿命长的荧光铕(III)螯合物纳米颗粒在各种非均相和均相免疫测定中可作为标记。例如，参见Huhtinen等Clin.Chem.2004Oct；50(10)：1935-6。当结合时间分辨荧光检测来使用这些固有地标记的纳米颗粒时，可以提高测定性能。在非均相测定中，可以扩展低浓度下的测定的动态范围。此外，通过使用涂覆有抗体的高特异活性纳米颗粒标记，而不是使用传统标记的检测抗体，可以提高测定的动态特性。在均相测定中，已经表明铕(III)纳米颗粒是荧光共振能量转移中的有效供体，能够进行简捷快速的高通量筛选。非均相和均相的基于纳米颗粒标记的测定可以与各种样品基质(例如血清、肝素、血浆和粘液)一起使用。
在一些实施例中，包括在这里公开的标记(例如荧光标记)，该标记作为与生物分子缀合的纳米颗粒标记。换言之，可以使用检测探针或捕获探针来利用纳米颗粒。例如，在本发明的实践中(例如基于纳米颗粒的免疫测定)，可以利用这样的铕(III)标记的纳米颗粒，即，该纳米颗粒连接到单克隆抗体或者链霉抗生物素以检测样品中的分析物。纳米颗粒用作基底，特异性的结合剂附着到该基底，并且特异性的结合剂将分析物与检测(即标记)部分或捕获部分结合。
在本发明的各个实施例中，所利用的标记是镧系金属。镧系元素包括但不限于铕、钐、铽或镝。非特定的背景荧光具有仅仅大约10ns的衰减时间，因此这样的背景在测量样品荧光之前消失。此外，镧系元素螯合物具有大的Stokes位移。例如，铕的Stokes位移几乎为300nm。激发峰和发射峰之间如此大的差异意味着在背景影响最小的波长下进行荧光测量。另外，发射峰非常尖锐，这意味着检测器可被设定成非常细小的限度，并且可以容易地将不同镧系元素螯合物的发射信号彼此区分开来。因此，在一个实施例中，在同一测定中可以使用一种镧系元素或多种不同的镧系元素。
硬性标准件。在一个实施例中，荧光读取器被构造成包括集成的或永久的标准件(“硬性标准件”)。这里所说的术语“硬性标准件”表示按照检测/量化一种或多种分析物的方法读取测试样品的装置，包括内部的、集成的或永久的标准件，这相对于采用与硬性标准件中使用的标记相同的标记来标记的样品被读取而言。在一个实施例中，硬性标准件和测试标记包括镧系元素(例如铕III)。图33A至图33H。
在一个实施例中，读取器是LED，LED包括发射光谱的UV A(400nm-315nm)部分的灯。发射处于光谱的可见部分中。第7175086、7135342和7106442号美国专利中公开了一些示例性的或传统的LED或光电二极管，上述美国专利的内容均被完全包含于此。
在另一实施例中，读取器包括不同量(例如高浓度标记和低浓度标记)的至少两个硬性标准件，从而提供读取器的两点校正。例如，两(2)个镧系元素硬性标准件(例如铕)永久性地安装在读取器载物片上，并可以在每一测试读取过程中被读取。这样，可以使用两个硬性标准件，以确定较低的检测限(即，在分析物定量测定过程中或用于确定定性测定中的最低检测阈)。这里，读取荧光，并以荧光的百分比(y轴)相对于浓度(x轴)来作图。该图上的每个硬性标准件的两个读取值之间的直线允许测量噪声(无标记)的截距，从而给出最低检测限的测量值。
在一些实施例中，测试装置包括室(区室或液囊)，该室包含用于去除未结合标记从而减小或消除背景噪声的洗涤或运行(running)缓冲液。在各个实施例中，包括硬性标准件的装置为存在于样品中并用标记标记的分析物提供准确的定性和定量测定，其中，所述标记与硬性标准件中使用的标记相同。
在一些实施例中，硬性标准件被嵌入或浇铸在玻璃、聚合物材料(包括塑料、乙烯基材料或丙烯酸类材料)中(图33B)。所述嵌入的标记可被浇铸成合适的形状/尺寸。可选择地，这样的硬性标准件可被切割成合适的尺寸，以被集成到读取器。在一个实施例中，硬性标准件被切割成矩形、正方形、长方形、圆形或者任意的多边形。在一个实施例中，硬性标准件被切割成矩形形状，所述矩形形状包括高约0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.10、0.11、0.12、0.125、0.126、0.127、0.128、0.129、0.130、0.135、0.140、0.150英寸，宽约0.01、0.02、0.03、0.035、0.039、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0英寸，长约0.01、0.02、0.03、0.035、0.039、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1.0英寸的尺寸。
在一个实施例中，利用采用硬性标准件作为参考的读取器来相对于总体(population)进行标准化，例如，相对于预定的“金标准件”描绘后续的读取器性能，如下表所示：
表4
  金标准件   测试   S0   1000   900   S1   5400   5000   S2   10200   11000   S3   19000   20000   S4   22000   23000   S5   50000   50000
因此，在y轴和x轴分别为测试读取器和金标准件测量值的情况下，检测下限是绘制的线与噪声水平交叉的节距(在没有标记的情况下读取)。
在一个实施例中，测试装置包括不同的pRNA，pRNA基于特定的分析物均被图案化，互补的SCD包括多个捕获抗体，所述多个捕获抗体连接到与测试装置上固定的pRNA同源的pRNA，且所述多个捕获抗体包括对不同的分析物来讲为特异性的不同亚群的抗体。此外，SCD试剂溶液或基底(例如冻干的固体基底)包括由对不同的分析物来讲为特异性的相同亚群的抗体组成的多个铕(III)标记的抗体或检测探针。在本发明中可实施的另外的镧系元素标记在本领域中是已知的，例如，在第7,101,667号美国专利中公开。例如，还可参阅Richardson F.S.，″Terbium(III)and Europium(III)Ions as Luminescent probes and Stains for Biomolecular Systems″(作为生物分子系统的探针和染色剂的铽(III)和铕(III)离子)Chem.Rev.，82：541-552(1982)。
因此，根据选择的标记，在一些实施例中肉眼可以看到信号，而在其它实施例中，在本发明的实践中利用读取仪器。
捕获部分
在一些实施例中，一对互补捕获部分的一个成员将结合到分析物特异性结合剂，另一成员分别固定在线或点上(图8A)。如这里所指出的，术语“捕获部分”指的是对配对物(partner)或互补捕获部分为特异性的结合部分(例如，对互补pRNA为特异性的pRNA，或者抗生物素蛋白/链霉抗生物素-生物素(avidin/streptavidin-biotin))。在一个实施例中，测试装置包括不同的捕获部分的组合，其中，所述捕获部分包含数量上和/或类型上不同的物质。例如，设置在测试装置中的测试条可包括一条或多条可寻址的测试线，所述测试线包括pRNA、抗体和特异性结合成员(例如抗生物素蛋白/生物素)。因此，在同一类型的捕获部分中的两个捕获部分设置在测试条上的各个实施例中，每个捕获部分对于不同的互补配对物分子都是特异性的。例如，对于两条pRNA可寻址线，每条线将包括具有不同序列的pRNA，所述pRNA将特异性地结合到互补序列的pRNA，所述互补序列的pRNA本身结合到导向不同的分析物(例如，相对于乙型流感的甲型流感)的抗体。此外，在这样的构造中，另外的测试线可包括不同的捕获部分(例如抗体或抗生物素蛋白)，所述不同的捕获部分本身结合它们的同源配对物分子。因此，在一个实施例中，测试条包括2、3、4、5、6、7或8条可寻址的测试线，这些测试线可包括1、2、3或4种不同类型的捕获部分。
在期望进行多重(即，多种分析物)检测的情况下，利用多种捕获部分，对一个分析物为特异性的抗体将包括互补捕获部分的一个特异性对中的成员，特异性地结合第二的和不同的分析物的抗体将包括互补捕获部分的第二的和不同的特异性对中的成员，等等。因此，在一个实施例中，可以检测多种不同的分析物，其中，一对捕获部分中的同源成员在测试仪器中包括的测试膜上被固定在离散的位置。例如，SCD中的多种抗体包括针对多个流感病毒株和/或亚型的抗体，其中，所述抗体包括成对的检测抗体-捕获抗体，捕获抗体具有特异性的捕获部分。此外，多个抗体中的每一族抗体由抗体所结合到的具体的目标分析物来限定。因此，针对一个特异性目标分析物的所有捕获抗体将具有相同的捕获部分，为此，同源的/互补的捕获部分设置在测试装置中。
在各个实施例中，捕获部分包括寡核苷酸、抗生物素蛋白、链霉抗生物素、吡喃RNA(pyranosyl RNA，pRNA)、为了高的亲合性而选择的抗原-抗体结合对、适体或它们的组合。在另外的实施例中，寡核苷酸为DNA或RNA。此外，在一些实施例中，在本发明的相同的检测系统中利用不同的捕获部分的组合。例如，用于一个特定分析物的捕获部分包括寡核苷酸对，而用于不同的分析物的捕获对包括包含pRNA、或抗生物素蛋白或链霉抗生物素等的捕获部分。在其它实施例中，在本发明的装置和分析中利用不同类型的捕获部分的组合，以检测多种分析物(例如多个捕获抗体，由此，对于单种分析物为特异性的每一族捕获抗体连接到一种捕获部分，其它对被分析物为特异性的抗体连接到其它捕获部分，例如适体、pRNA或链霉抗生物素)。
在一个实施例中，所有的捕获部分是pRNA，并具有多对pRNA捕获部分和pRNA配对物捕获部分(例如，一个缀合到特异性的结合剂，同源pRNA固定在横向流动膜上)。
pRNA
在本发明的一方面中，互补吡喃RNA(pRNA)序列的组合被包含在本发明的能够同时对多种分析物进行特异性检测的SCD/测试装置中(图32)。在各个实施例中，一对同源pRNA序列中的一个固定在测试装置中的测试区或特定条中，而该对同源pRNA序列中的另一个缀合到结合部分，所述结合部分特异性地结合到目标分析物。因此，在一个实施例中，目标分析物通过用它的结合对pRNA与固定的pRNA序列相互作用而被固定的pRNA捕获。分析物被缀合到第二结合部分1301的检测分子检测到，第二结合部分1301对于同样的目标分析物也是特异性的。
在一些实施例中，pRNA结合配对物从下面的pRNA中选择，但是不限于下面的pRNA。
表5：


所有的寡核苷酸都具有4′-C12氨基和2′-己醇基团
因此，在多个捕获探针(例如连接到pRNA的抗体)的情况下，每个捕获探针连接到捕获部分，为此，同源捕获探针被固定在测试装置中包括的测试条310、903、904、905、906上的预定位置中(图3、图26、图27A至图27C)。也可参阅图39-图42，图39-图42示出了pRNA捕获物的实际灵敏度。
因此，在测试条上被固定于特异性可寻址线的序列将特异性地结合到与抗分析物结合部分缀合的互补pRNA(例如抗病毒抗体)。示例6中说明了这样的特异性的效能(例如图30A和图30B)。
在一些实施例中，包含一个或多个pRNA结合对的测试装置提供大约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15、20、30、40或50ng/mL的灵敏度。
在一些实施例中，pRNA利用蛋白接头(protein linker)附着到膜(即测试条)。例如，pRNA可以缀合到亲水蛋白。在一个实施例中，接头蛋白具有至少从大约500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7500、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、225000、250000、300000、350000至大约450000的分子量。这样的接头的尺寸可以为大约5至10、6至11、7至12、8至13、9至14、10至15、11至16、12至17、13至18、14至19、15至20、16至21、17至22、18至23、19至24、20至25、21至26、22至27、23至28、24至29、25至30、35、40、45或50AA长。接头可以是肽或多肽。在一个实施例中，接头是BSA或IgG。
在一个实施例中，pRNA通过pRNA分子与亲水蛋白之间的之间的共价键结合到亲水蛋白/肽。含有pRNA-蛋白复合物的溶液被涂敷到测试膜上的限定区域(例如硝酸纤维)，由此，锚固蛋白(protein anchor)以不可逆的方式结合到膜。随后，可以在测定中使用该pRNA。在一个实施例中，锚固蛋白/连接蛋白是亲水蛋白，测试膜是硝酸纤维。
如前面所指出的，测试装置可包括利用不同类型的捕获部分(例如，组合形式的抗体、核酸、pRNA、抗生物素蛋白/链霉抗生物素/生物素)的可寻址测试线。在一个实施例中(例如图32)，至少一条可寻址线或特异性的捕获区1305、1312包括pRNA 1304、1311序列，pRNA 1304、1311序列结合到固体支撑物1308(例如硝酸纤维、聚苯乙烯、玻璃、塑料、金属等)并且对于同源pRNA序列在结合方面具有特异性，所述同源pRNA序列缀合到对具体的目标分析物1306为特异性的第二结合部分1302、1310。此外，第二结合分子是第一结合分子的配对物，所述第二结合分子缀合到检测分子1301、1309(例如荧光标记)。如这里的示例6所表明的，pRNA被有效地固定，并且可以特异性地结合互补序列，从而允许检测分析物。因此，pRNA提供了一种基于pRNA分子的大的特异性和亲合力来检测多种分析物的新工具。
在一个实施例中，pRNA分子设置在测试装置中的1、2、3、4、5、6或7条不同的可寻址线(即捕获区)上。在其它实施例中，与抗体、核酸结合对、抗生物素蛋白/链霉抗生物素、地高辛/抗地高辛组合起来使用pRNA。例如，测试装置包括具有5条可寻址测试线/捕获区的测试条，其中，每个测试区对不同的分析物(例如甲型流感或乙型流感)或亚型(例如甲型流感的大流行的亚型和非大流行的亚型)是特异性的。因此，例如，两个测试区利用pRNA结合，而一个利用链霉抗生物素/抗生物素蛋白-生物素，另一个使用固定的抗体，又一个使用DNA/RNA。在这个示例中，对于每一类型的结合系统，都存在对具体测试区上被“捕获”的目标分析物来讲为特异性的互补结合配对物。此外，如这里所述，分析物还被缀合到检测分子/标记(例如荧光标记)的结合物所结合。因此，一旦分析物-检测-结合配对复合物(Analyte-detector-binding partner complex)流经测试装置，该复合物就在具有固定结合配对物的不同的测试区被捕获。
因此，本发明的这些SCD/测试装置的核心方面在于它们可被构造成检测多种分析物，包括细胞、细胞成分(例如细胞标记物、细胞表面标记物)、蛋白(例如酶)等。
在一个实施例中，本发明的SCD/测试装置可以用在测定任何致病情况的方法中，用于所述致病情况的具体的对应分析物是已知的或者在将来被确定。SCD和测试装置可被构造成提供在这里公开的检测试剂(例如pRNA、核酸、抗体、特异性结合配对物(例如抗生物素蛋白/生物素))的任意组合。例如，在检测/诊断心肌梗塞(MI)的过程中可以确定对应于MI的多种分析物。用于各种情况的标记物在本领域是已知的，例如5,604,105、5,710,008、5,747,274、5,744,358和5,290,678号美国专利中公开的心脏标记物，这些美国专利的内容通过引用均被完全包含于此。
在一个实施例中，将设计本发明的装置(见示例10)，所述装置为心肌梗塞的蛋白类心脏标记物提供三合一的测定。
在一个实施例中，以这样的方式应用样品，即，样品能够与缀合到检测试剂(例如金微粒和荧光标记的组合)的第一结合物的混合物(串行的或并行的)混合，且能够与缀合到pRNA同源结合对的第一成员的第二结合物混合，其中，所述第二结合物可以包含或者可以不包含能够进行免疫结合反应和/或pRNA同源结合对的特异性结合的材料。
如果对该系统设计期望的预培养(pre-incubation)，使得第一结合物和第二结合物能够附着到分析物并桥接分析物从而形成复合物，则这样的步骤可以处于试剂向测试区或捕获区流动的过程中。可选择地，可以使流动停止，以使得反应更接近于完成。在又一实施例中，试剂在被应用于测试装置之前在本发明的SCD中混合。
混合物通过毛细作用或静水压由几种机理中的任意一种或通过其它非毛细作用沿着固体材料/基底(例如测试条)的表面或在固体材料/基底(例如测试条)内流动，使得在反应混合物经过/穿过测试/捕获区时，第一和第二同源结合对接触。如果第一结合物和第二结合物具有桥接的分析物(图32)，则检测试剂(例如铕)将在测试/捕获区积累，从而产生可以可视地解析或可以利用设备读取器来解析的信号。
在试图检测多种不同的分析物的实施例中，对于每种分析物使用不同的检测试剂，每种不同的分析物在单个检测/捕获区中被捕获。采用设备读取器来区分每种分析物的信号。在一个实施例中，设备读取器可以检测信号，从而提供定性的和定量的测量。
在另一实施例中，对于每种目标分析物，利用唯一的pRNA同源结合对。
在另一实施例中，通过流动路径(如这里所描述的)释放洗涤缓冲液或试剂缓冲液，其中，所述缓冲液可包括导致几种形式中的任何一种形式的能量释放，可利用设备、读取器或可视地检测所述几种形式中的任何一种形式的能量释放。例如，所述反应可以导致光、电子的释放，或者可以需要对基底输入电子，从而释放出光。这样的反应对本领域技术人员来讲是公知的。
在荧光化合物与运行/洗涤缓冲液接触之后，这样的反应可引起荧光化合物启动从而发荧光，导致电子、质子、中子的释放，如这里所述，可以通过设备或读取器检测电子、质子、中子的释放。
适体
在一些实施例中，捕获部分是适体分子，所述适体分子可以采用捕获探针来可交换地利用，或者可以可交换地用作测试装置轴向流膜中包括的固定的捕获部分。适体包括从核酸的候选混合物中确定的核酸。在优选的实施例中，适体包括与通过SELEX方法分离的核酸配体基本同源的核酸序列。基本同源的意思是主要序列同源性的程度超过70％，最优选地超过80％。这里使用的“SELEX”方法涉及到所选择的核酸配体的组合，所选择的核酸配体以期望的作用与目标分析物相互作用，例如结合到蛋白，使那些被选择的核酸扩增。可选择的反复循环的选择/扩增步骤可以选择一种或少量的核酸，所述核酸最强烈地与来自于池的目标抗原/生物标记物相互作用，所述池含有量非常大的核酸。连续地进行循环的选择/扩增步骤，直到实现所选择的目标。SELEX方法在下面的美国专利和专利申请中有描述：申请号为07/536,428的美国专利申请和公开号为5,475,096、5,270,163的美国专利。
传染剂
在这些组合物和方法的各个实施例中，传染剂可以是任何病原体，包括但不限于细菌、酵母、真菌、病毒、真核寄生虫等。在一些实施例中，传染剂是流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠形病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、HIV、肠道病毒、乳头状瘤病毒(papillomavirus)、库克萨基病毒(coxsackievirus)、单纯疱疹病毒或Epstein-Barr病毒。在其它实施例中，传染剂是分枝杆菌(Mycobacterium)、链球菌(Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌(Shigella)、staphylcococcus、奈瑟菌(Neisseria)、梭菌(Clostridium)或者大肠杆菌。对本领域技术人员将清楚的是，通过利用对于传染剂的类型或亚型而言为特异性的不同试验系列的结合剂(例如抗体)，本发明的组合物和方法可容易地适用于不同的传染剂。
通常，传染剂的普通型可以是传染剂的属型，或者是传染剂的任何初次或首次分型或鉴别。传染剂的分型可以是传染剂的类型或种型，或者是传染剂的任何二次的或者后续的分型。根据本发明，传染剂的普通型或亚型的鉴别可以通过各种合适的测试设置来执行。例如，传染剂的普通型的鉴别可以包括一个或多个筛选测试，所述一个或多个筛选测试用于1)传染剂的特定普通型、2)传染剂的特定期望或选择的普通型、或3)传染剂的所有或基本上所有相关的普通型，或者它们的组合。类似地，传染剂的亚型的鉴别可包括一个或多个筛选测试，所述一个或多个筛选测试用于：1)、传染剂的一个或多个特定亚型；2)传染剂的具体的普通型的一个或多个特定亚型；3)、基于与受试者相关的附加信息而选择的传染剂的一个或多个特定亚型，例如，具体的群(population)或者地理位置的一个或多个可疑或期望的亚型；4)、与为了普通型而测试的传染剂等同或相关的传染剂的一个或多个潜在大流行的或者流行性的亚型，或者它们的组合。
根据本发明的另一方面，本发明提供的方法可以任选地或者额外地包括与第一传染剂密切相关的第二传染剂的普通型和/或亚型的鉴别，或者可选择地，第二传染剂的传染与第一传染剂的传染相关，或者可能与第一传染剂的传染结合。在一个实施例中，本发明提供的方法包括病毒以及细菌的普通型和亚型的鉴别。例如，HIV传染可以与特定的细菌传染有关，因此其对HIV以及分枝杆菌和/或卡氏肺囊虫(Pneumocystis carina)的普通型和亚型的鉴别将是有用的。具体地讲，本发明提供的方法包括HIV和一类或多类分枝杆菌和/或卡氏肺囊虫的鉴别。
在另一实施例中，本发明提供的方法包括第一病毒和第二病毒的普通型和亚型的鉴别。例如，本发明提供的方法可包括HIV以及肝炎病毒的普通型和亚型的鉴别，或者可选择地，可包括HIV的普通型和亚型以及肝炎病毒或肝炎病毒的特定株的普通型的鉴别。在一个实施例中，在存在其它肠的或传染的种的情况下检测大肠杆菌0157(非常危险的、常常是致命的传染种)的测定中，可以利用本发明的方法和组合物。另一示例将对患者进行流感传染测试，其中已知的是，将发生亚型内的株的突变或变异，并且某些形式的流感的致病性远大于其它形式的流感。又一个示例是对HIV的不同类型进行检测，例如对HIV-1和HIV-2进行检测。在一方面中，人体免疫缺损病毒(HIV)的普通型的鉴别可包括对HIV的存在进行筛选，而HIV的亚型的鉴别可包括对HIV-1、HIV-2和/或其它HIV的亚型进行筛选。类似地，疱疹病毒的普通型如单纯疱疹病毒(HSV)的鉴别可包括对HSV的存在进行筛选，而HSV的亚型的鉴别可包括对HSV 1型和/或HSV 2型进行筛选，或者对Epstein-Barr病毒和/或EBV的亚型进行筛选。
在再一个具体的方面中，肠病毒的普通型的鉴别可包括对一种或多种肠病毒(例如脊髓灰白质病毒(poliovirus)、库克萨基病毒(coxsackievirus)、艾柯病毒(echovirus)、指定的肠病毒等)的存在进行筛选，而肠病毒的亚型的鉴别可包括对脊髓灰白质病毒(例如血清1-3型)、库克萨基病毒A(例如血清1-22和24型)、库克萨基病毒B(例如血清1-6型)、艾柯病毒(例如血清1-9、11-27、29-31型)和指定的肠病毒(例如肠病毒68-71)等进行筛选。
通常，对于细菌性传染剂，细菌型传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对与传染和/或传染剂的耐药性相关的细菌性传染剂的属和一个或多个类或株进行筛选。在一个实施例中，细菌性传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对分支杆菌和分支杆菌的一个或多个类进行筛选，所述一个或多个类包括但不限于结核、avium、bovis、chelonei、fortuitum、intracellulare、kansasii、leprae等。在另一实施例中，细菌性传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对沙门氏菌和沙门氏菌的一个或多个类进行筛选，所述一个或多个类包括但不限于typhi、肠炎等。在又一个实施例中，细菌性传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对志贺氏杆菌和志贺氏杆菌的一个或多个类进行筛选，所述一个或多个类包括但不限于dysenteriae。在再一实施例中，细菌性传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对链球菌(Streptococcus)和链球菌的一个或多个类进行筛选，所述一个或多个类包括但不限于肺炎、生脓原(pyogenes)(A群)等。在再一实施例中，细菌性传染剂的普通型和亚型的鉴别包括对大肠杆菌和大肠杆菌的一个或多个株进行筛选，所述一个或多个种包括但不限于产肠毒素的株。
根据本发明，用于鉴别传染剂的普通型和亚型的筛选测试可以是本领域已知或以后发现的任何合适的测试。例如，本发明的筛选测试可以是非核酸类的测试或化学类的测试，所述非核酸类的测试包括但不限于蛋白、肽、氨基酸、配体。在一个实施例中，本发明的筛选测试是基于传染剂的一种或多种结构蛋白(例如糖蛋白、包膜蛋白、多糖等)的存在或不存在而进行的测试。在另一实施例中，本发明的筛选测试是基于传染剂的一种或多种抗原或抗原决定基或抗体的存在或不存在而进行的测试。在又一实施例中，本发明的筛选测试是基于传染剂释放或代谢的一种或多种物质的存在或不存在而进行的测试。在再一实施例中，本发明的筛选测试是基于从宿细胞衍生的一种或多种物质的存在或不存在而进行的测试，其中，所述一种或多种物质与传染剂的传染有关或者由传染剂的传染而产生。
在一个具体的方面中，本发明的非核酸类筛选测试包括常用的配体结合或免疫测定，例如配体或免疫层析测定。这些测定中的许多测定基于特异性结合对之间的高度特异性的相互作用。这样的结合对的示例包括抗原/抗体、半抗原/抗体、凝集素/糖类、脱辅基蛋白质/辅因子、生物素/抗生物素蛋白(链霉抗生物素)。此外，这些测定中的许多测定涉及到装置(例如固体相、横向流动测试条、流过测试)，这些装置具有附着到可移动的或不可移动的固体相材料的结合对中的一个或多个成员，所述固体相材料例如为胶乳珠、玻璃纤维、玻璃珠、纤维素条或硝酸纤维膜(第4,703,017、4,743,560、5,073,484号美国专利)。
在一个实施例中，利用本发明的方法和设备来检测或鉴别甲型流感亚型和/或乙型流感和/或丙型流感。
流感病毒属于Orthomyxoviridae家族中的正黏病毒属(orthomyxovirus)。ssRNA用螺旋对称对病毒进行包膜。包膜的颗粒的直径为80nm-120nm。RNA与核蛋白(NP)紧密结合，从而形成螺旋结构。对用8个RNA片段(7个用于丙型流感)对基因组进行分段。出现了四种基本抗原，即血凝素(H)、神经氨酸酶(N)、核蛋白(NP)、基质(M)蛋白。
NP是以三种形式即A、B和C出现的类型-特异性抗原，它为人流感病毒和非人流感病毒的分类提供基础。基质蛋白(M蛋白)包围核壳体并构成颗粒质量的35％-45％。此外，看到两种表面糖蛋白在表面上为杆形突起物。血凝素(H)由两个亚单元即H1和H2构成。血凝素介导病毒对细胞受体的附着。神经氨酸酶分子在包膜中以较少的量存在。甲型流感病毒的血凝素和神经氨酸酶的抗原性差异为它们被分类成亚型提供基础，例如，A/Hong Kong/1/68(H3N2)表示1968年从一名患者身上分离出来的H3N2亚型的甲型流感病毒。
在各个实施例中，本发明的方法和设备致力于检测或鉴别由HxNy限定的甲型流感病毒，其中，x为1-16，y为1-9，或者xy任意组合。例如，在一个实施例中，利用本发明的方法和设备来H1N5亚型的甲型流感病毒。因此，在本发明的SCD中设置针对流感病毒的不同亚型的多个检测探针和捕获探针。在一个实施例中，利用该测定来检测甲型流感(具有H1/H3亚型和大流行的H5亚型)和乙型流感。
具体地讲，流感病毒的普通型可以是基于核蛋白和基质蛋白抗原的抗原性特性而指定的任何类型，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒，而亚型可以是基于抗原细分的流感病毒的一种或多种类型，例如以表面抗原如血凝素(H)和神经氨酸酶(N)表征的甲型流感病毒或乙型流感病毒的一种或多种亚型。
在一个实施例中，流感病毒的普通型的鉴别包括对甲型流感病毒、乙型流感病毒和/或丙型流感病毒进行筛选，而流感病毒(例如甲型病毒)的亚型的鉴别包括对甲型的一个或多个预计的亚型进行筛选，例如，在测试的时候预计存在于群(population)中的亚型、任选的一个或多个可疑的亚型，例如处于爆发(例如流行性爆发和大流行性爆发)监测下的亚型。在另一实施例中，流感病毒的普通型的鉴别包括对甲型流感病毒和乙型流感病毒进行筛选，而流感病毒(例如甲型病毒)的亚型的鉴别包括对用于生产流感疫苗的一种或多种亚型进行筛选，例如，用于测试季节的当前的疫苗亚型或株，包括预计在下一流感季节中传播的亚型和/或株。在又一实施例中，流感病毒的普通型的鉴别包括对甲型流感病毒和乙型流感病毒进行筛选，而流感病毒(例如甲型病毒)的亚型的鉴别包括对用于生产流感疫苗的一种或多种亚型或株、怀疑导致大流行性爆发的一种或多种亚型或株(例如，一种或多种禽亚型或株如H5N1或它们的衍生形式)进行筛选。
在又一个实施例中，流感病毒的普通型的鉴别包括对甲型流感病毒和乙型流感病毒进行筛选，而流感病毒(例如甲型病毒)的亚型的鉴别包括对传播中的一种或多种常见的或预计的亚型进行筛选，所述传播中的一种或多种常见的或预计的亚型包括但不限于a)H1和H3，b)H1、H3和H2，c)H1、H2、H3和H9，d)H1、H3和N1，e)H1、H3、N1和N2，f)H1、H3和N2，g)N2，h)N1和N2。例如，用于鉴别甲型流感病毒的亚型的筛选测试可以对亚型组a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)或h)中列出的任一种亚型的存在进行鉴别，而不是必需鉴别亚型组中的特定亚型的存在。可选择地，用于鉴别甲型流感病毒的亚型的筛选测试可以对a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)或h)中列出的每种和所有亚型的存在或不存在进行鉴别，例如，对亚型组中的特定亚型的存在进行鉴别。
在再一实施例中，流感病毒的普通型的鉴别包括对甲型流感病毒和乙型流感病毒进行筛选，而流感病毒(例如甲型病毒)的亚型的鉴别包括对传播中的一种或多种大流行的或意外的亚型进行筛选，所述传播中的一种或多种大流行的或意外的亚型包括但不限于a)H5，b)H5和H7，c)H5、H7和H9，d)N2、N7和N8，e)H5和N2，f)H5和N1，g)H5和N8，h)H5、N8、H7和N7，i)H5、H7、H9、N7和N8。例如，用于鉴别甲型流感病毒的亚型的筛选测试可以对亚型组a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)中列出的任一种亚型的存在进行鉴别，而不是必需鉴别亚型组中的特定亚型的存在。可选择地，用于鉴别甲型流感病毒的亚型的筛选测试可以对a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)或i)中列出的每种和所有亚型的存在或不存在进行鉴别，例如，对亚型组中的特定亚型的存在进行鉴别。
在另一具体的方面中，普通型的肝炎病毒可以是甲型病毒、乙型病毒和丙型病毒，每种病毒可能具有包括突变种的若干种亚型。在一个实施例中，肝炎病毒的普通型的鉴别包括对甲型、乙型和/或丙型肝炎病毒进行筛选，而肝炎病毒的亚型的鉴别包括分别对甲型、乙型和丙型肝炎病毒的亚型或突变株进行筛选。在另一实施例中，肝炎病毒的普通型的鉴别包括对乙型肝炎病毒进行筛选，而肝炎病毒的亚型的鉴别包括对乙型肝炎病毒的一种或多种亚型或突变株进行筛选。在又一实施例中，肝炎病毒的普通型的鉴别包括对丙型肝炎病毒进行筛选，而肝炎病毒的亚型的鉴别包括对丙型肝炎病毒的1-9亚型中的一种或多种进行筛选。
在各个实施例中，本发明的方法和设备可以检测一种或多种不同的传染剂。例如，采样器可以包含多种不同的抗体，其中，存在多个亚群的抗体，由此每个亚群的抗体特异性地结合不同的传染剂。例如，多种抗体可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚群，其中，多种抗体中的每个亚群的抗体特异性地结合不同的传染剂。在一些实施例中，本发明的方法和设备检测大流行的和非大流行的传染剂。在一个实施例中，大流行的和非大流行的传染剂是流感病毒。
自十九世纪初以来，流感爆发性的特性和这种疾病特殊的临床特征已经给出了这种传染病的可靠的流行病学记录。有记录的为十九世纪期间发生过若干次流行，但第一次大流行没有被准确地记录，直到1889年至1892年。可能起源于欧洲的第二次大流行发生在1918年至1919年，这就是人们所熟知的西班牙流感，其导致2000万-2500万人(主要是青壮年)死亡。
在西班牙流感之后，在1932年至1933年、1947年至1948年、1957年和1968年，有规律地连续发生大流行。下一次大流行被认为是延后了。后来的这些大流行类似于1890年的大流行，使几百万人受到轻度上呼吸道感染的侵袭并导致少量的死亡。H1N1(猪)病毒可能出现在1918年，并持续传播，直到1957年为止，在1957年其被H2N2(亚洲的)病毒取代。H2N2病毒的流行一直到1968年，在1968年出现了H3N2(Hong Kong)病毒株。H1N1病毒在1977年再次出现，并没有取代H3N2亚型，这两种亚型继续一起传播。因此，急需以一种准确有效的方式来对受试者进行筛选，以确定个体被哪种病毒株和/或亚型感染。此外，在某些情况下，必须以一种即时的方式(point-of-care setting)进行这样的样品收集和处理(例如，在战场上，有大量的受试者需要采样和处理，并且执行该采样的人力有限)。
这样，在一个实施例中，在处理大量样品的过程中以即时的方式利用本发明的方法和设备，其中，在测试完成后的某个时间段，可以看到(即读取)测试结果。例如，所述时间段可以为30分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。在一些实施例中，与这里公开的试剂结合的方法和设备提供了高的灵敏度和特异性，其中，在很长一段时间内读取的荧光结果可以为非常相似的结果。因此，在一些实施例中，可以收集并处理生物样品，而放置在一旁经过相当长的一段时间之后再读取，这在即时方式的情况下非常有利，或者在用有限的人力或时间来收集大量样品并进一步处理样品的情况下非常有利。
在本发明的又一方面中，本发明的组合物和方法被用来检测样品中存在的任一种分析物或多种分析物。如上面所指出的，例如，通过利用特异性地结合标记物(该标记物与某种状况有关)的不同的结合部分，可以检测与MI有关的一种或多种分析物。因此，SCD和测试装置可以包含用于诊断疾病或病理状况而不是传染病所需的试剂。
在某些实施例中，一种或多种分析物是与病理状况或疾病有关的标记物。在另一实施例中，一种或多种分析物是与营养状态或状况有关的多肽。在又一实施例中，一种或多种分析物是与细胞周期和细胞生长有关的细胞标记物。在另一实施例中，一种或多种分析物与细胞增殖和细胞分化有关。在一个实施例中，细胞标记物与癌症有关。
示例
示例1-测定体积和跟踪缓冲液
为了探究将给出最好灵敏度的最佳测定样品体积，并为了研究跟踪缓冲液是否也将增大测试条的灵敏度和性能。
材料：硝酸纤维膜：Millipore HiFlow 135膜，2.5cm宽，货号SHF1350425，批号R68N46849，代码号RK04414，卷(roll)号04OLI。用1.0mg/mL的单克隆抗H5N1抗体clone 3C8在膜上形成条带。用1.5mg/mL的兔抗鼠抗体在对照线上形成条带。灯芯材料垫：0.05％的Tween-20处理的聚酯垫，Alhstrom6613级。准备的吸收垫：Ahlstrom 222级的纸，3.5cm宽，从Fisher购买，货号2228-1212，批号6150502。由加拿大多伦多的Nanogen POC制备抗H53G4金缀合物，处于最大吸收峰下的3G4金缀合物的OD为112.54。提取缓冲液：50mM的Tris-Cl，pH为8.15，0.75M的NaCl，1％的BSA，0.1％的普流尼克(pluronic)F68，0.05％的内切(digested)酪蛋白，2mM的TCEP和0.02％的NaN3。由加拿大多伦多的Nanogen POC提供重组H5血凝素(0.2mg/mL)。
方案：横向流动测试条的制备。将其上形成有抗体条带的硝酸纤维膜叠放在塑料卡上，并与灯芯材料垫和吸收垫叠置1-2mm。任何组件上都没有应用覆盖带。将条带切成5mm宽。
测试：将50-100μL提取缓冲液与1.1μL3G4金缀合物和2μL重组H5血凝素混合，或者将50-100μL提取缓冲液与1.1μL 3G4金缀合物混合物。通过将条带插入到提取缓冲液中来开始测试，在15分钟、20分钟、25分钟和30分钟扫描结果。对于采用跟踪缓冲液的试验，具体的请参见结果。
结果：图9A和图9B为用不同体积的提取缓冲液以15分钟、20分钟、25分钟和30分钟来测试条带。图9A：以不同体积的提取缓冲液对测试条进行测试。在15分钟、20分钟、25分钟和30分钟，取出条带，并用Bio-Rad GS-800Calibrated Densitometer来扫描。第1行和第2行：50μL提取缓冲液；第3行和第4行：60μL提取缓冲液；第5行和第6行：70μL提取缓冲液；第7行和第8行：80μL提取缓冲液；第9行和第10行：100μL提取缓冲液。图9B：将测试带的测试线强度与不同读取时间下的不同体积的提取缓冲液相比较。
表6.采用Quantity One进行的图9A和图9B的数据分析

图10A：具有不同量的提取缓冲液的3号测试带和背景消除对它们的阴性对照结果的影响。
表7.采用Quantity One软件进行的图10A和图10B的数据分析


向不同量的提取缓冲液中加入1.1μL3G4金缀合物。通过将条带插入到测定溶液中来开始测试，在15分钟进行扫描。(第一圈)。随后将所有的条带转移到仅含有提取缓冲液的管中，再进行5分钟的运行。再次扫描条带。(第二圈)。
图10B：具有不同量的提取缓冲液的3号测试带和背景消除对它们的灵敏度的影响。
向不同量的提取缓冲液中加入1.1μL3G4金缀合物和2μL重组H5血凝素。通过将条带插入到测定溶液中来开始测试，在15分钟进行扫描。(第一圈)。随后将所有的条带转移到仅含有提取缓冲液的管中，再进行5分钟的运行。再次扫描条带。(第二圈)。
表8.采用Quantity One软件进行的图4的数据分析

讨论。在用于即时护理的大部分横向流动测试的设计中，通常在与硝酸纤维交界的缀合剂垫上干燥抗体缀合剂。这种设计的缺点在于：由于缀合剂垫的材料，所以干燥的缀合剂有时不会在条带间均匀地、一致地释放。相反，在将抗体缀合物与测定溶液预混合的情况下，因为一旦灯芯材料垫是湿的，流速实际上是由膜控制而不是由灯芯材料垫控制，所以更有可能使液体流是一致的；只要液体流是一致地的，抗体缀合物的流动就应该是更加一致和均匀的。因此，在上述实施例中，将抗体金缀合物直接与测定溶液混合。
最初，将100μL提取缓冲液用于每个测试，且测定的读取时间被设定在15分钟。发现在15分钟结束时，不是全部的测定溶液都被消耗掉。存在分析物和金缀合物的浪费。设计试验，来研究处于相对短的读取时间范围的最佳测定体积为多大。图9B和表2表明：当测定溶液的体积较大，例如为100μL时，需要较长的时间来获得较好的灵敏度。然而，采用50μL测定缓冲液，在15分钟之后的不同的读取时间，测试线的颜色强度并没有增大很多，这表明大部分分析物和金缀合物在15分钟时已经通过了捕获线。虽然在30分钟时，用100μL测定溶液测试的条带的颜色强度达到的水平几乎与用小体积的测定溶液测试的条带在15分钟时的颜色强度的水平相同，但是很明显，15分钟的测试在市场上比30分钟的测试更具有竞争力。
然而，因为相对小体积的测定溶液中的金缀合物的浓度较高，所以测试条的背景显示出显著的红色背景，这减小了测试线和背景之间的反差并且在外观上是不期望的。图10B显示出在15分钟之后运行跟踪缓冲液可以显著地清除背景，从而使测试的灵敏度增大43％-63％。该数据还再次表明：小的测定体积(50μL)对于测试来讲是较好的选择。
示例2-与现有技术的系统相比的铕珠
材料：灭活的甲型流感病毒：来自Microbix Biosystems有限公司的Texas1/77(H3N2)，货号EL-13-02，批号13037A3；灭活的乙型流感病毒：来自Microbix Biosystems有限公司的Hong Kong 5/72，货号EL-14-03，批号14057A2；Quidel QuickVue A+B测试，批号702391。
方案：病毒稀释-在使用之前，用盐水将甲型流感制剂和乙型流感制剂分别稀释至4096HA/mL和409.6HA/mL。测定过程：进行Quidel测试盒的包装说明书中描述的过程，并在这里做简要的评述。从试剂管分配全部的提取试剂溶液。轻轻地使管打旋，以使其内含物溶解。将病毒刺入管中。将拭子放到提取管中。将拭子转动至少三次，同时用拭子头按压提取管的底部和侧部。将拭子在管中保留1分钟。靠着管的内部转动拭子头，同时将其去除。将测试条放到提取管中。在10分钟时读取结果。
结果：图11：用不同量的甲型，Texas 1/77流感病毒来测试QuickVue FluA+B。在对照线的上方示出了测试线。
表9.可视的读取结果和采用Quantity One软件进行的图4的数据分析


用Quantity One软件分析峰强度。该软件给出了数值。用眼睛读取，处于4以下的任何值将为负值。
图12：用不同量的乙型，Hong Kong 5/72流感病毒来测试QuickVue FluA+B。
用于乙型的测试线处于对照线以下。
表10.可视的读取结果和采用Quantity One软件进行的图4的数据分析


用Quantity One软件分析峰强度。该软件给出了数值。在可视读取的情况下，处于4以下的任何值将成为负结果。
表11.用不同量的乙型，Hong Kong 5/72流感病毒来测试Quidel QuickVue Flu A+B。

示例3-用金标记来测试甲型流感和乙型流感测试的检测限。
材料：由加拿大多伦多的Nanogen POC制备抗甲型流感M4090913金缀合物。处于最大吸收峰下的OD为102.69。由加拿大多伦多的Nanogen POC制备抗乙型流感抗体2/3金缀合物。处于最大吸收峰下的OD为94.78。对于硝酸纤维膜、灯芯材料垫和吸收垫，参见以上所述。用1.5mg/mL的抗乙型流感M2110171在膜上形成条带，由加拿大多伦多的Nanogen POC制备1.5mg/mL的兔抗鼠抗体。用1.5mg/mL的抗甲型流感7304在膜上形成条带，由加拿大多伦多的Nanogen POC制备1.5mg/mL的兔抗鼠抗体。灭活的甲型H3N2，Texas 1/77流感购自Microbix Biosystems有限公司，批号13037A3，40960HA/mL。
灭活的乙型Hong Kong 5/72流感购自Microbix Biosystems有限公司，批号14057A2，40960HA/mL；分子生物级的水，批号318105；3倍提取缓冲液，含有0.15M的Tris-Cl、pH为8.0，2.25M的NaCl、0.3％的普流尼克F68、3％的BSA、6mM的TCEP、1.5％的内切酪蛋白和0.06％的NaN3；2倍提取缓冲液，含有0.1M的Tris-Cl、pH为8.0，1.5M的NaCl、0.2％的普流尼克F68、2％的BSA、4mM的TCEP、1％的内切酪蛋白和0.04％的NaN3；1倍提取缓冲液，批号(lot#)2232-003。
方案：制备横向流动测试膜(参见以上所述)；病毒稀释：用具有1％BSA的10mM的PBS将甲型Texas 1/77流感稀释至409.6HA/mL。在使用之前用相同的缓冲液将灭活的乙型Hong Kong 5/72流感稀释至40.96HA/mL。使用金缀合物的甲型流感和乙型流感测试：对于甲型流感测试，向管中加入16.7μL3倍提取缓冲液、1.96μL M4090913金缀合物和不同量的灭活的甲型流感病毒。加水至最终体积为50μL。对于乙型流感测试，向管中加入25μL2倍提取缓冲液、2.12μL2/3金缀合物和不同量的病毒。加水至最终体积为50μL。通过将测试条插入到测定溶液中来开始测试。在15分钟时，将50μL 1倍提取缓冲液加入到同一管中，再执行5分钟的测试。在用Bio-Rad GS-800Calibrated Densitometer扫描之后，用眼睛读取条带上的结果，并且还用Quantity One软件进行分析。
结果：图13：用金作为标记来测试甲型流感和乙型流感测试的检测限。
表12.可视的读取结果和采用Quantity One软件进行的图7的数据分析

峰强度的值是采用Quantity One分析的结果。
图14.用金作为标记来测试乙型流感测试的检测限。
表13.可视的读取结果和采用Quantity One软件进行的图9A和图9B的数据分析

峰强度的值是采用Quantity One分析的结果。
示例4-采用荧光铕缀合物来测试甲型流感和乙型流感测试的检测限。
材料：灯芯材料垫：0.05％的Tween-20处理的聚酯垫，1.4cm宽，由加拿大多伦多的Nanogen POC提供；吸收垫：Ahlstrom 222级的纸，3.5cm宽，从Fisher购买，货号2228-1212，批号6150502；硝酸纤维膜：Millipore HiFlow135膜，2.5cm宽，货号SHF1350425，批号R68N46849，代码号RK04414，卷号04OLI；甲型流感膜：1.5mg/mL的抗甲型流感Medix 7304抗体位于测试线上，1.5mg/mL的兔抗鼠IgG位于对照线上，由加拿大多伦多的Nanogen POC形成条带；抗甲型流感Fitzgerald M4090913-由加拿大多伦多的Nanogen POC制备1％珠浓度的铕缀合物；乙型流感膜：1.5mg/mL的抗乙型流感Medix9901抗体位于测试线上，1.5mg/mL的兔抗鼠IgG位于对照线上，由加拿大多伦多的Nanogen POC形成条带；乙型流感膜：1.5mg/mL的抗乙型流感M2110171抗体位于测试线上，1.5mg/mL的兔抗鼠IgG位于对照线上，由加拿大多伦多的Nanogen POC形成条带；抗乙型流感HyTest 2/3-由加拿大多伦多的Nanogen POC制备1％珠浓度的铕缀合物；灭活的甲型流感病毒：来自Microbix Biosystems有限公司的Texas 1/77(H3N2)，货号EL-13-02，批号13037A3；灭活的乙型流感病毒：来自Microbix Biosystems有限公司的Hong Kong 5/72，货号EL-14-03，批号14057A2；在圣地亚哥的Nanogen制备的3倍提取缓冲液，含有0.15M的Tris-Cl、pH为8.0，2.25M的NaCl、3％的BSA、0.3％的普流尼克、0.06％的NaN3、1.5％的内切酪蛋白和6mM的TCEP，批号2232-001；病毒稀释缓冲液：具有1％的BSA的10mM的PBS；抗体-铕缀合物稀释缓冲液：10mM的PBS、1％的BSA和0.2％的Tween-20。
方案。横向流动测试条的制备：将其上形成有抗体条带的硝酸纤维膜叠放在塑料卡上，并与灯芯材料垫叠置1-2mm，且硝酸纤维条的一端与吸收垫叠置1-2mm。任何组件上都没有应用覆盖带。将条带切成5mm宽。病毒稀释：将灭活的甲型流感阳性对照物和乙型流感阳性对照物分别稀释至409.6HA单位/mL和40.96HA单位/mL，以采用流感测试来测定。
抗体-铕缀合物的预处理：将1％的抗体-铕缀合物在超声波浴中用超声处理4分钟。随后用抗体-铕缀合物将缀合珠的量稀释至0.04％，随后进行另外4分钟的超声处理。
采用抗体-铕缀合物的甲型流感和乙型流感测试过程：向试管中的16.67μL的3倍提取缓冲液中加入5μL0.04％的抗体-铕缀合物和不同量的病毒。加水至最终体积为50μL。将横向流动测试膜插入到测定溶液中。在室温下等待15分钟。向同一管中加入50μL 1倍提取缓冲液。在室温下等待5分钟。将横向流动测试膜放在盘中，并测量荧光强度。每种测试条件重复5次。
结果：图15：利用铕缀合物的甲型流感测试的分析灵敏度。
表14.用于利用铕缀合物的甲型流感测试的分析灵敏度的原始数据的统计分析。

图16：利用膜上的Medix 9901和铕缀合物来测试乙型流感测试的分析灵敏度。
表15.用于利用铕缀合物的乙型流感测试的分析灵敏度的原始数据的统计分析。

图17：利用膜上的M2110171和铕缀合物来测试乙型流感测试的分析灵敏度。
表16.用于利用铕缀合物的乙型流感测试的分析灵敏度的原始数据的统计分析。

结果：表5-7显示出当前市场上主导的快速流感免疫测定(Quidel QuickVue Flu A+B测试)对甲型Texas 1/77流感具有4.1HA单位的检测限，对乙型Hong Kong 5/72流感具有1.6HA单位的检测限。当使用金标记时，并且当使用有限的测定体积和跟踪缓冲液时，本发明的流感快速测试可以检测至少0.41HA的甲型Texas 1/77流感和0.082HA的乙型Hong Kong 5/72流感。在检测甲型Texas 1/77流感和乙型Hong Kong 5/72流感方面，本发明的流感快速测试分别比Quidel QuickVue Flu A+B测试灵敏10倍和20倍。通过应用荧光铕缀合物，本发明的流感快速测试能够检测低至0.021HA单位的甲型Texas 1/77流感，信号/噪声(S/N)比为2.03，且本发明的流感快速测试能够检测低至0.0021HA单位的乙型Hong Kong 5/72流感，S/N比为4.96。如果S/N比为2被认为是基于铕的测定的检测限，则乙型流感的检测将能够低至0.001HA单位/测试。或者说灵敏度与用于乙型的Quidel测定相比提高了大约1600倍。该研究清楚地说明了：对硝酸纤维测定技术所做的改进确实明显改善了POC测定性能。
示例5
实验室测试结果用于初步证明这样的原则，即，可以利用提出的产品设计和仪器来将H5N1流感与季节性的人流感病毒区分开来。
材料：3倍提取缓冲液，含有0.15M的Tris-Cl、pH为8.0，2.25M的NaCl、0.3％的普流尼克F68、3％的BSA、1.5％的酪蛋白和0.06％的NaN3，批号2232-001；1倍提取缓冲液，批号2232-003；0.2M的三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，批号2232-078；分子生物级的水，批号318105；铕稀释缓冲液，批号RC 6-8-06；10mM的PBS，pH为7.2，含有1％的BSA，批号HR 7-19-06；具有0.025mg抗体的1％的HyTest 2/3铕缀合物，批号E2/3-270706-2；具有0.025mg抗体的1％的M4090913铕缀合物，批号E13-270706-2；具有0.1mg抗体的1％的3C8铕缀合物，批号E3C8-180806；由加拿大多伦多的Nanogen POC制备硝酸纤维膜，用抗甲型流感A60010044P、抗乙型流感9901、抗H53G4和兔抗鼠抗体在该硝酸纤维膜上形成条带。对于所有的三条测试线，抗体涂层浓度为2.0mg/mL。对照线的抗体涂层浓度为1.5mg/mL。各条测试线之间的距离以及测试线和对照线之间的距离为5mm±0.5mm；灯芯材料垫：0.05％的Tween-20处理的聚酯垫，1.4cm宽，由加拿大多伦多的Nanogen POC提供；吸收垫：Ahlstrom 222级的纸，3.5cm宽，从Fisher购买，货号2228-1212，批号6150502；灭活的甲型H1N1，Beijing/262/95流感购自NIBSC，40μg HA活性/安瓿；灭活的甲型H3N2，Texas 1/77流感购自Microbix Biosystems有限公司，批号13037A3，40960HA/mL；来自中国Wantai的灭活的H5N1，Ck/HK/Yu22/02流感；灭活的乙型Hong Kong 5/72流感购自Microbix Biosystems有限公司，批号14057A2，40960HA/mL；Epstein-Barr病毒购自ATCC，VR-1491，B98-8株，批号14057A2。
过程：制备具有多条测试线的流感测试条：将其上形成有抗体条带的硝酸纤维膜叠放在塑料卡上，并与灯芯材料垫和吸收垫叠置1-2mm。任何组件上都没有应用覆盖带。将条带切成5mm宽。用10mM PBS/1％BSA将灭活的甲型H3N2，Texas 1/77流感和乙型Hong Kong 5/72流感分别稀释10倍和100倍；用1mL H2O重组灭活的H1N1 Beijing 262/95；将1％的抗体铕缀合物在Branson 1210超声波浴中用超声处理4分钟。随后用铕缀合物稀释缓冲液将单独的缀合物稀释至0.04％，随后在冰浴中超声处理3次，每次处理4分钟。在一些实施例中，将所有的3个铕缀合物共同稀释在同一管中。在这种情况下，每一抗体铕缀合物浓度仍为0.04％珠。测定准备：
对于每一测定，将下面的组分加入到管中：16.67μL3倍提取缓冲液；0.5μL0.2M的TCEP；5μL稀释的铕缀合物(如果所有的铕缀合物都被稀释在同一管中)或15μL铕缀合物(如果单独地稀释各个铕缀合物，则每个5μL)；如图中所示的病毒；用H2O将最终体积调节至50μL。
测试：通过将测试条插入到测定溶液中来开始测试。15分钟之后，将50μL1倍提取缓冲液加入到试管中，执行另外5分钟的测试。在20分钟时，用荧光读取器读取测试条的结果。每个测试重复三次。
结果：图18：在用缓冲液、甲型H3N2、H1N1和H5N1亚型流感、乙型流感和Epstein-Barr病毒测试条带之后在UV光下的流感快速测试条的图像。
图19：仅采用缓冲液进行流感快速测试。
图20：采用甲型H3N2，Texas 1/77亚型流感进行流感快速测试。
图21：采用乙型流感进行流感快速测试。
图22：采用甲型H5N1，Ck/HK/Yu22/02亚型流感进行流感快速测试。
图23：采用甲型H1N1Beijing/262/95亚型流感进行流感快速测试。
图24：采用H5N1和乙型流感进行流感快速测试。
图25：采用Epstein-Barr病毒进行流感快速测试。
结果：基于最初的测试结果，已经选择了抗体，用于检测甲型、乙型和H5亚型流感。制备了具有三条不同的测试线的条带，所述三条不同的测试线分别检测甲型、乙型和H5亚型。图1至图7中的结果显示出当测试乙型流感时，仅观察到乙型流感峰。当测试H1N1或H3N2时，仅看到甲型流感测试峰，没有观察到对应于H5亚型的峰。根据这里的一个实施例，一旦选择了抗H1和H3抗体，就用对应于H1和H3(一起)的另一测试线在膜上形成条带。随后除了甲型流感峰之外，也将观察到对应于H1/H3的另一峰。当测试H5N1亚型时，观察到甲型流感峰和H5峰两者，且甲型流感峰显示出比H5峰强的信号。该结果被认为是MAb选择和抗体加载的另外的优化，化验内的其它因素被最优化。没有观察到流感测试与EB病毒的交叉反应。这些结果清楚地说明：在这里发现的方法可以获得多种分析物测试结果，而没有测试线之间的干扰。
上面示出的结果已经清楚地证明：已经发现了一种新颖的完全集成的POC技术，该技术高度灵敏，并可以在同一测试条上独立地检测不同的病毒类型和病毒亚型。
示例6.使用pRNA作为捕获物来进行乙型流感快速化验
将pRNA固定到膜上，来确定与抗乙型流感核蛋白抗体缀合的互补pRNA捕获物的效能，从而当在样品中存在乙型病毒时产生信号，并且形成抗体-抗原-抗体复合物。
材料：灯芯材料垫：0.05％的Tween-20处理的聚酯垫，由加拿大多伦多的Nanogen POC提供，1.4cm宽；吸收垫：Ahlstrom的Grade 222纸，3.5cm宽，从Fisher购买，货号2228-1212，批号6150502；硝酸纤维膜：Millipore HiFlow 135膜，2.5cm宽，货号SHF1350425，批号R68N46849，代码号RK04414，卷号04OLI；硝酸纤维膜，1.5mg/mL的M2110171在硝酸纤维膜上形成条带，M2110171的批号M083106；硝酸纤维膜，1.35mg/mL的102a4-5G4在硝酸纤维膜上形成条带，102a4-5G4的批号MZ-42-74247-pRNA135；抗乙型流感HyTest2/3-加拿大多伦多的Nanogen POC制备的缀合有珠浓度为1％的铕，批号E2/3-270706-3；灭活的乙型流感病毒：来自Microbix Biosystems有限公司的Hong Kong 5/72，货号EL-14-03，批号14057A2；在圣地亚哥的Nanogen制备的3倍提取缓冲液，含有0.15M的Tris-Cl、pH为8.0，2.25M的NaCl、3％的BSA、0.3％的普流尼克(pluronic)、0.06％的NaN3、1.5％的内切酪蛋白和6mM的TCEP，批号2232-001；0.2M的TCEP，批号2232-078；1倍提取缓冲液，批号2232-003；铕缀合稀释缓冲液，批号RC 6-8-06；病毒稀释缓冲液：具有1％的BSA的10mM的PBS；10mM的PBS，批号SP09-22-06；缀合有铕的抗体稀释缓冲液：10mM的PBS、1％的BSA和0.2％的Tween-20；用于与将被固定到膜上的pRNA缀合的蛋白5G4；从Fitzgerald购买的抗乙型流感核蛋白M2110171，批号578；通过PDITC合成和激活pRNA 102a4-amn和102b4-amn(一共13mer)。
方案：
pRNA抗体-缀合物的制备
表17.计算缀合所需的寡核苷酸和抗体的量

在两个单独的管中，将激活的pRNA 102a4amn(一共229nmol)和102b4amn(一共164nmol)溶解在150μL的水中。
a.对于每种pRNA，等分为50μL加入3个微型离心管中，并且利用旋转真空器(spin vac)对它们进行干燥。
b.将1.5mg的5G4单克隆抗体放置到一个旋转过滤器中，并且将2.0mg的M2110171单克隆抗体放置到另一个旋转过滤器中，从而浓缩这两个抗体。用0.1M的硼酸钠缓冲液清洗抗体。5G4和M2110171的最终浓度由280nm处的吸光率来确定，分别为33.35mg/mL和28.6mg/mL。
c.取34μL浓缩后的5G4(1.15mg)和57μL浓缩后的M2110171。使用0.1M的硼酸盐缓冲液将以上两个体积调节到65μL。
d.将每个抗体添加到对应的pRNA中，并且使反应在室温下进行15-20小时。
e.然后用床体积为7mL的用0.01M的PBS平衡的Sephadex G-50柱净化pRNA抗体缀合物。
1.制备用102a4-5G4形成条带的硝酸纤维膜。
2.在多伦多的NPOC在膜上形成条带，见“材料”。
3.制备横向流动测试条：
将其上形成有抗体或者102a4-5G4条带的硝酸纤维膜叠放在塑料卡上，一端与灯芯材料垫叠置1-2mm，另一端与吸收垫叠置1-2mm。将条带切成5mm宽。
4.病毒稀释：
用0.01M的PBS和1％的BSA缓冲液将灭活的乙型流感病毒稀释到4.096HA单位/mL。
抗体铕缀合物预处理
在浴槽近距离声波定位器中将1％的抗乙型流感2/3-铕缀合物进行超声波处理4分钟。然后用抗体-铕稀释缓冲液将10μL的量的缀合珠稀释到0.02％，并且利用探针近距离声波定位器(Fisher，型号550)在功率调整为2的情况下进行声波处理20秒(4个脉冲)，在每个脉冲(每5秒)之间在冰块中保温10秒。
用10mM的PBS将102b4-M2110171(纯化后为0.54mg/mL)稀释为0.1mg/mL。
化验过程
取50μL的化验混合物，并将化验混合物加入试管中。将测试条插入化验混合物中。在室温下等待15分钟。向同一试管中加入50μL的1倍提取缓冲液，再保持5分钟。用LRE荧光读取器读取测试条。
a.制备化验混合物，用于形成具有102a4-5G4条带的条
表18.

b.制备化验混合物，用于形成具有抗乙型流感抗体M2110171的条带的条
表19.

结果
图30A：其上具有102a4-5G4缀合物的测试条的原始信号。
表20.图30A中示出的信号的净峰高
表20.
  HA单位/测试   1   2   AVG  信号/噪声   0   360.0   331.9   345.9   1.0   0.002   521.1   447.1   484.1   1.4   0.004   682.0   783.3   732.7   2.1   0.008   1048.5   916.2   982.4   2.8   0.016   1799.0   1594.3   1696.7   4.9   0.032   2745.4   3257.2   3001.3   8.7
图30B：其上具有抗体M2110171的测试条的原始信号。
表21.图30B中示出的信号的净峰高


图31比较了两种乙型流感测试条的灵敏度。
数据清楚地示出了：1)在与蛋白质例如5G4抗体缀合的情况下，pRNA可以被固定到硝酸纤维膜上；2)pRNA在硝酸纤维膜上可以与缀合有抗体的互补寡核苷酸杂交；3)与pRNA缀合之后，分析物中的特异性抗体仍然起作用。结果表明pRNA的特异性对可以用作横向流动快速化验中的捕获系统。
示例7.读取器铕检测
利用六种不同标准浓度的铕来测定读取器(注：下面的标号与附图中使用的标号对应：(1)5x10-6M；(5)5x10-5M；(3)5x10-5M；(6)5x10-4M；(2)5x10-4M和(4)5x10-3M。铕被包围在丙烯酸中，并且切成不同尺寸的块，从而提供不同的浓度。在图33A至图33H中，测量值为每米的数量×10-4。
在另一示例中，7个1mm宽的铕的硬性标准件被安装在4mm的中心上，图34A和图34B。
示例8.存档样品。
流感病毒：灭活的甲型流感/Texas 1/77(H3N2)，40960HA单位/mL，来自加拿大安大略湖的Microbix Biosystem有限公司，分类号EL-13-02；灭活的乙型流感/Hong Kong，40960HA单位/mL，来自加拿大安大略湖的MicrobixBiosystem有限公司，分类号EL-14-03。
病毒RNA转录阳性对照；甲型流感RNA对照物，PN：606161，LN：RH2174P73，50000拷贝/μL；乙型流感RNA对照物，PN：606162，LN：RH2174P73，50000拷贝/μL。
提取缓冲液：3倍提取缓冲液
下表列出了3倍提取缓冲液的配方和每种组分对应的含量(part number)、批号和供应商。
表22.


三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride TCEP)200mL，由HR在7-6-06上制备，从PIERCE订购，产品号：20491，批号：GL102548。
制备新鲜的1倍提取缓冲液：将200μL3倍提取缓冲液与6μL 0.2M的TCEP和394μL的水组合，得到600μL的1倍提取缓冲液。1倍提取缓冲液的配方是：50mM的Tris，1％的BSA，0.1％的嵌段式聚醚F68，0.5％的酪蛋白，0.02％的NaN3，0.75M的NaCl和2mM的TCEP。
样品包装和存储材料：Whatman FTA Elute Micro卡，货号WB120401，LN：FE6231106；Whatman Harris UNI-CORE 2.00mm打孔器，货号WB640001，LN：6023；MicroAmp反应管，上限为0.2mL，PN：N801-0540，LN：P34H4QA11，ABI。
提取材料：蒸馏水，DNA酶，无RNA酶，货号10977-015，LN：1317578，Invitrogen。
热源：GeneAmp PCR系统9700，ABI，QA2126
RT和PCR试剂和材料：
表23
  组分   供应商   分类号   批号   RT Mix   Prodesse   GLS01   050105RM   MgCl21M   Ambion   9530G   064R37A   MulV逆转录酶，50u/μL   ABI   N808-0018   H03264   RNase抑制剂，20u/μL   ABI   N808-0119   H05526   RVA引物Mix   Nanogen   没有   RH2174P100   AmpliTaq金聚合酶，5u/μL   ABI   N808-0249   G03670   96孔PCR反应板  ABI   4306737   P03F6QA41

评价RT-PCR反应的材料：Agilent DNA 1000试剂：PN：5067-1504，LN：0623；Agilent DNA片段：PN5067-1522，LN：JA21BK01
方法
制备RT总混合物(Master Mix)
表24
  组分   每次反应的体积(μL)   RT混合物   11   1M MgCl2   0.1   MulV逆转录酶(50u/μL)   1   RNA酶抑制剂(20u/μL)   1   DNA酶，无RNA酶的水   1.9   总计   15
将15μL的RT总混合物添加到96孔PCR板的孔中。
表25.制备PCR总混合物
  组分  每次反应的体积(μL)   RVA引物混合物   39.5   AmpliTaq金聚合酶(5u/μL)   0.5   总计   40
将40μL的PCR总混合物添加到96孔板的孔中。
表26.RNA阳性对照物的稀释：如下表所述，用DNA酶、无RNA酶的水稀释甲型流感和乙型流感RNA。

将5μL稀释后的RNA添加到适当的RT反应中。
表27.用1倍提取缓冲液来稀释甲型流感和乙型流感灭活病毒

将样品涂覆到FTA Elute卡上
将5μL下面的样品涂覆到Whatman FTA Elute Micro卡的样品区域上；将1倍提取缓冲液作为对照物；用1倍提取缓冲液稀释病毒；在室温下空气干燥FTA Elute卡15-20分钟；从涂覆有样品的区域用打孔器打出5mm至6mm直径的片，然后放到0.2mL的MicroAmp反应管中；
从FTA Elute片提取RNA：向包含所述片的管中添加150μL的水并且漩涡3次，每次5秒；通过使用无菌吸头去除水；重复一次添加/去除水的过程；离心分离5秒，接着吸走多余的液体；添加50μL的水，在65℃下加热30分钟，接着漩涡试管5秒；取出5μL液体并添加到96孔RT板的合适的孔中。
RT-PCR化验
RT步骤的热循环过程
  温度(℃)   时间(分钟)   循环次数   22   10   1   42   60   1   95   5   1   4   保持
将10μL完成RT的反应物转移到包含PCR总混合物的合适的PCR孔中。上下吸取来混合。
表28.PCR步骤的热循环过程


使用Agilent生物分析仪来评价扩增子的PCR反应
RT-PCR Agilent结果：没有模板的对照反应没有产生任何可以检测到的扩增子。
RNA阳性对照
表29.

观察到甲型流感和乙型流感RNA阳性对照的带的大小是适当的大小。
表30.流感病毒

结论：利用Whatman FTA Flute从溶解的甲型流感和乙型流感病毒中成功地检测到了RNA。
卡和RT-PCR扩增
该化验检测到低至0.2HA单位/片的甲型流感病毒和0.002HA单位/片的乙型流感病毒。Whatman FTA Elute卡可以用来存档病毒RNA，用于以后RT-PCR化验中的测试，从而检测甲型和乙型流感。
示例9.多重分析物检测。
为了示出多重分析物流感诊断测试可以将流感H5N1与季节性流感区别开的理论的证据，开发了一种快速并且高灵敏性的化验，并且将这种化验与利用显色的乳胶珠和胶体金的传统横向流动测试相比较。
在乳胶微粒填充有铕配合物的情况下使用镧系标记，将镧系标记与清洗缓冲液结合，表现出改进的灵敏度。利用在测试条上的不同区域处直接形成条带的抗甲型流感、抗乙型流感和抗H5抗体的膜，将季节性流感(例如，在该示例中为乙型流感)与禽流感H5N1区分开。
数据显示：利用pRNA和在硝酸纤维上直接形成条的MAb作为同一横向流动测试条上的捕获系统，能够单独检测位于单个硝酸纤维测试条上的不同测试区域上的甲型流感H1N1和H5N1亚型以及乙型和甲型核蛋白。
表31.为观点提供证据的表



材料
1.由Nanogen Bothell开发小组提供预激活的pRNA。
a.102a10(10mer)，批号825-079A
b.102b10(10mer，102a10的互补pRNA)，批号825-065D，批号825-065D
c.3a10(10mer)，批号825-079C
d.3b10(10mer，3a10的互补pRNA)，批号825-65F，批号825-065F
2.抗体
a.来自BiosPacific的抗甲型流感7304
b.来自Fitzgerald的抗甲型流感M4090913
c.来自HyTest的抗乙型流感2/3
d.来自Fitzgerald的抗乙型流感M2110171
e.来自Fitzgerald的抗H1型流感M322210
f.来自Chemicon的H1型抗流感8252K
g.来自厦门大学的抗H510F7型流感
h.来自厦门大学的抗H53G4型流感
3.OptiLink羧酸酯改性的微粒(铕珠)
从ThermoFisher Scientific(Seradyn)购买直径为0.3μm的铕珠，货号83470750010250，生产批号C020512，包装批号201154。
4.病毒
来自Microbix的乙型流感Hong Kong/5/72，来自Bovian博士实验室的乙型/Shanghai/2002，来自NIBSC的甲型/Taiwan/1/86(H1N1)，Bovian博士实验室提供的A/Beijing/95(H1N1)，来自香港大学Guan博士实验室的斑头雁(Bar-headed)GS/QH/15/2005(H5N1)和DK/VNM/568/2005(H5N1)。
5.三倍提取缓冲液，包含150mM的Tris-Cl，pH 8.0，2.25M的NaCl，3％的BSA，1.5％的内切酪蛋白，0.3％的嵌段式聚(pluronic)F68和0.15％的ProClin 300，批号2277-038。
6.溶液：0.2M的三(2-羧乙基膦)盐酸盐溶液，批号2277-067。
7.重组链霉抗生物素。
8.Nanogen多伦多机构制备的用于与pRNA缀合的非特异性抗体5G4，用于在硝酸纤维上形成条。
9.条形衬靶卡，来自G&L的0.1”特级白聚苯乙烯。
10.吸收垫，来自Alstrom过滤的222级滤纸。
11.灯芯材料垫，用0.05％的Tween-20处理的聚酯垫。
过程
制备抗体铕缀合物
1.1通过ThermoFisher Scientific(Seradyn)，将抗体M4090913，2/3和3G4与0.3μm的铕缀合。
1.2通过将生物素化的8252K与涂覆有铕微粒的链霉抗生物素结合，通过间接过程来制备抗体8252K铕缀合物。在Nanogen多伦多机构制备生物素化的8252K和涂覆有铕微粒的链霉抗生物素。用浴槽近距离声波定位器将含有1％固体的链霉抗生物素铕原种进行声波处理5分钟。然后用铕缀合稀释缓冲液稀释到0.02％，并且用探针近距离声波定位器进行声波处理20秒。用PBS缓冲液将生物素化的8252K稀释到10μg/mL。向每个管中添加等分的5μL。然后将等分的5μL 0.02％的固体链霉抗生物素铕缀合物快速与生物素化的8252K混合。利用2.5μL 100mM的生物素阻断(block)缀合物。然后在化验中直接使用8252K铕缀合物。
2.抗体-pRNA缀合物的制备：利用来自Amicon的Microcon 50将所有抗体浓缩为大约20mg/mL。缓冲液换为0.1M的硼酸钠，pH 9.0。将等分的1mg非特异性抗体5G4添加到含有33.5nmol预激活的pRNA 102b10或3b10(干粉)的管中。将等分的0.5mg M322210和0.5mg 10F7分别添加到含有16.7nmol预激活的pRNA 102a10和3a10中。在室温下反应15小时。利用10mMPBS缓冲液平衡的Sephadex G-50柱对抗体pRNA缀合物进行纯化，pH 7.0。确定了两个峰，第一峰为缀合物，第二峰为未激活的pRNA(通过HPLC确认，未示出数据)。
3.制备形成有四条测试线的条带的硝酸纤维膜。对于此膜，分别将1.5mg/mL的抗甲型流感7304和抗乙型流感M2110171直接形成测试线“A”和测试线“B”。缀合物102b10-5G4和3b10-5G4按照0.75mg/mL形成“H1”和“H5”测试线。用0.5mg/mL的兔抗-鼠抗体形成对照线。所有的线间隔5mm。然后，用包含0.35％的PVP、0.25％的Triton X-100和0.5％的内切酪蛋白的溶液将所述膜阻断(block)，并且在37℃下固化。
4.制备测试条：在衬靶卡上层叠形成有4条测试线和一条对照线的硝酸纤维膜，并且硝酸纤维膜与处理过的聚酯垫和吸收垫叠置1-2mm。利用Kinematic 2360条切割器将条切割为5mm宽。
5.测试程序：如下制备化验混合物。向试管中添加16.7μL 3倍提取缓冲液、0.5μL 0.2M的TCEP、0.1μg的102a10-M322210缀合物、0.1μg的3a10-10F7缀合物、抗体铕缀合物和不同的病毒。所有抗体铕缀合物的最终浓度为在50μL的最终体积中含有0.002％的固体。通过将测试条插入到化验混合物中来开始测试。15分钟后，再次添加50μL的1倍提取缓冲液来清洗所述条。在20分钟的时候，用荧光读取器来读取所述条。
结果.
表32.下表比较了用不同病毒进行测试时不同测试峰的信噪比。

上述数据清楚地示出了所述测试系统能够将多重分析物区分开。在这个示例中，被检测的分析物包括：季节性H1N1亚型流感、禽流感的乙型流感H5N1，其具有良好的A型信号。在该测试中，使用两对pRNA作为捕获系统，从而将H1测试线与H5测试线区分开。当检测H5病毒时，在H1测试线位置观察到一些低反应性时，表明缀合到抗H5抗体的pRNA 3a10与在测试线H1上形成条带的102b10有少量的杂交。在检测H1N1亚型病毒时，在H5特异性测试线上没有观察到假阳性反应现象。
另外，该报道清楚地显示，当对所有的测试样本使用单个的多分析反应混合物时，该化验示出了良好的反应性、分析物信号分离良好。另外，当测试处于中等病毒负荷的单个测试样本时，该化验可以同时检测所有合适的分析物。
结论：结果表明，采用多种亚型的病毒，对于待测试的每种病毒品系和亚型，实现了每种分析物的明显的信号分离(图36至图38)。为了确保结果的有效性，测试了每种亚型的两个单独的株系。而且，结果清楚表明，将pRNA类的捕获系统应用于H1和H5检测系统，从而能够将pRNA捕获系统用于不同分析物的其它试验系列。
此外，所述化验可以被容易地适用于包括附加的分析物-特异性结合剂。另外，本发明的装置/化验可以用在筛选不同的分析物的方法中。例如，可以筛选确定大量的抗-H3表达克隆。
当然，本发明的装置/方法可以用来筛选新的病毒品系(重要的示例是新的Fugan类品系)。例如，得到H5N1亚型的新品系作为新的MAb，它们可以包含在SCD和用于筛选的本发明的测试装置中。
以上示出的结果已经清楚地表明，已经发现了可以对同一测试条上的不同病毒类型和亚型进行单独检测并且灵敏度高的一种新的完全集成的化验技术。另外，这种化验可以以即时的方式进行(Point-of-Care setting)。
示例10.多分析物检测：标记物蛋白
本发明的装置和方法也可以用来检测与疾病情况或营养状态或者任何其它有关的特性有关的各种分析物。例如，可以检测和/或定量多种心脏标记物：
(1)Troponin标记物：捕获物抗体是多克隆兔抗-Troponin-I，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：98)。检测抗体是两个鼠MAb的混合物，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(2)CK/MB标记物：捕获物抗体是多克隆羊，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：99)。检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(3)Myoglobin标记物：捕获物抗体是兔抗肌红蛋白多克隆，并且缀合到特定的pRNA序列缀合(SEQ ID NO：100)。检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(4)由兔抗鼠构成的对照线
因此，多分析物“即时”化验系统可以如上所述按照单个化验形式对每个标记物进行单独定量，如下：
利用具有硬性铕标准件(锁定在丙烯酸类中的铕标准件，并且在一组均匀的条件下长时间产生均匀的读取值)的读取器，确保读取器能够满足荧光信号强度所需的再现性。因此，每种分析物可以被单独定量。
示例11.多分析物检测：病毒
这里如上所述，本发明的装置也可以被构造为检测多种不同的病毒，或者多种不同亚型的病毒。例如，本发明的装置可以被构造为提供流感多分析物加RSV定量化验，其中，多分析物可以从单个样本中检测：
(1)甲型流感：捕获物抗体是MAb，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQID NO：99)；检测抗体也是MAb，被缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(2)乙型流感：捕获物抗体是单克隆鼠MAb并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：100)；检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(3)H1和H3流感：捕获物抗体是对H1和H3血凝素有特异性的MAb，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：101)。检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(4)H5流感：捕获物抗体是单克隆鼠MAb，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：102)；检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(5)RSV：捕获物抗体是单克隆鼠MAb，并且缀合到特定的pRNA序列(SEQ ID NO：103)；检测抗体也是MAb，缀合到生物素，并且与涂覆有0.3μm的铕乳胶微粒的链霉抗生物素反应。
(6)对照线：捕获物抗体是兔抗鼠，并且结合到铕乳胶微粒上的MAb。
示例12.表达单链抗体10F7和4D1并且测试它们的活性。
每个抗体的重链和轻链的可变区基因与为短肽(GGGGS)编码的核酸链接，从而形成为单链抗体编码的DNA。利用10F7VHF/10F7VHR作为引物对，来扩增10F7重链的可变区DNA片段。利用10F7VKF/10F7VKR作为引物对，来扩增10F7轻链的可变区DNA片段。利用4D1VHF/4D1VHR作为引物对，来扩增4D1重链的可变区DNA片段。利用4D1VKF/4D1VKR作为引物对，来扩增4D1轻链的可变区DNA片段。
利用10F7VHF/10F7VKR作为引物，来扩增叠置有10F7的单链DNA片段。利用4D1VHF/4D1VKR作为引物，来扩增叠置有4D1的重链DNA片段。回收扩增后的DNA片段，用BamH I和Sal I进行内切，克隆到用同一限制性内切酶内切的原核表达载体pTO-T7。利用ER2566E.coli作为宿主细胞，利用标准方法来表达单链抗体蛋白质。表达的蛋白质是不溶的包含体(inclusion body)的形式。通过超声处理来打破该包含体，所得沉积物利用标准方法来纯化。纯化后的沉积物溶解在8M的尿素中。在1倍PBS溶液中缓慢透析该尿素溶液，并且在12000rpm的情况下离心分离10分钟，从而去除剩余的沉积物。最后纯化的单链抗体溶液用于测试活性。
选择26个品系的H5N1病毒，利用以上所述的HI化验来测试以上纯化的10F7和4D1单链抗体的活性。10F7单链抗体的浓度在1.06mg/mL下使用。4D1单链抗体的浓度在0.34mg/mL下使用。4D1单链抗体显示出针对23个病毒品系的HA抑制活性。10F7单链抗体显示出针对14个病毒品系的HA抑制活性(见下表33)。
表33.三种单链抗体针对25个H5N1病毒的HA抑制活性


HI滴定率通过2的n次幂来稀释。n是表中示出的数。以上纯化的10F7单链抗体的活性利用中和方法来测试。从香港、印尼、青海和其它地区的鸡、鸭和各种野生鸟中分离出来的7个病毒品系用来测试使用HI化验的10F7的活性。抗体示出了针对5个病毒品系的良好的中和活性(表34)。以64倍稀释，抗体仍然能够抑制宿主细胞的病毒浸染。
表34.10F7单链抗体中和测试结果。

示例13.检测7aa丝氨酸的活性
大量扩增包含7aa丝氨酸的三种抗菌素8H5A、8H5E和3C8A。用PEG沉淀三种抗菌素之后，抗菌素被溶解在PBS中。噬菌体滴定率在1011和1012之间。以5μg/mL的单克隆抗体8H5、4A1、9N7和4D11预涂覆微型板。所述板用含有5％的乳的PBS阻断。三种噬菌体被连续稀释，并且添加到所述板上。反应1小时。然后，清洗所述板5次。添加1∶5000稀释的小鼠抗M13/HRP抗体(Amersham Phamarcia Biotech，美国)作为二次抗体，并且保持0.5小时。反应完成后读取结果。结果在下面的表35中示出，结果表明肽8H5A和单克隆抗体8H5之间的特定反应良好，8H5A和其它三种单克隆抗体之间的反应微弱。8H5E和单克隆抗体8H5之间的特定反应相对较差。
表35.7aa丝氨酸与单克隆抗体的特定结合活性的检测结果
  单克隆抗体   8H5A(1∶1000)  8H5E(1∶1000)   8H5   0.559   0.25   4A1   0.158   0.142   9N7   0.062   0.065   4D11   0.118   0.078
示例14.利用Nanogen甲型流感测试的MAb捕获系统和pRNA捕获系统。
为了比较利用两种不同的捕获系统的Nanogen甲型流感测试的灵敏性，并且比较利用两种不同测试条的pRNA捕获系统。
切断测试条的过程：通过放置吸收垫(3.5cm宽)并且用Tween-20进行预处理来制备膜卡；预先切开粘合剂侧上的聚酯灯芯材料垫(1.4cm宽)，聚酯灯芯材料垫与膜叠置1mm，合适的抗体在上述垫上形成条带。用切纸机将这种准备好的卡切成5mm宽的测试条。
病毒稀释：根据下面的稀释程序用含有1％BSA的PBS稀释甲型/Texas/1/7740960HA单位/mL病毒。
表36：甲型流感病毒的稀释程序

铕稀释：利用铕稀释缓冲液将17-10-06-1铕缀合物稀释为0.02％；245μL的铕稀释缓冲液+5μL的1％的原种。利用探针近距离声波定位器(Fischer型号550)在功率调整为3的情况下超声处理稀释后的铕缀合物，总时间为20秒(每次10秒，中间间隔5秒)。
pRNA缀合物稀释：利用10mM的PBS将102a10-7304(0.39mg/mL)缀合物稀释为0.1mg/mL，pH为7.2；37.2μL的PBS+12.8μL的102a10-7304缀合物。
化验过程：根据下表制备化验混合物。
表37：MAb捕获系统的化验混合物

表38：pRNA捕获系统的化验混合物

表39.材料

将7304(1.5mg/mL)的测试条放置到MAb捕获系统的化验混合物中。
将102b10-5G4(0.75mg/mL)w/o阻断和w/0.5％的酪蛋白阻断测试条放到pRNA捕获系统化验混合物中。
重复进行多次试验。
在室温下保持15分钟。
向同一管中添加50μL的1倍提取缓冲液，来清洗试管。
5分钟后，利用荧光读取器来读取测试条。
结果
表40.MAb捕获系统(见图39)
  HA单位/测试   0   0.01   0.02   0.04   0.1   1   1   528.1   793.7   935.7   1421.6   2550.1   21111.3   2   569.6   776.0   1037.5   1440.0   2395.4   19961.8   AVG   548.8   784.9   986.6   1430.8   2472.8   20536.5   S/N   1.4   1.8   2.6   4.5   37.4
表41.具有用0.5％的酪蛋白阻断的0.75mg/mL膜的pRNA捕获系统(见图40)
  HA单位/测试   0   0.01   0.02   0.04   0.1   1   1   114.6   434.1   703.0   1360.9   3222.7   21209.1   2   222.6   628.5   804.6   1385.1   2891.4   19440.1   AVG   168.6   531.3   753.8   1373.0   3057.1   20324.6   S/N   3.2   4.5   8.1   18.1   120.5
表42：没有阻断的0.75mg/mL膜的pRNA捕获系统(见图41)
  HA单位/测试   0   0.01   0.02   0.04   0.1   1   1   284.4   737.9   940.0   1880.4   3336.0   22387.5   2   318.1   612.2   814.6   1471.3   3560.8   22383.6   AVG   301.3   675.1   877.3   1675.9   3448.4   22385.6   S/N   2.2   2.9   5.6   11.4   74.3
结论：如数据示出的，当用多伦多的0.5％酪蛋白阻断的测试条时，pRNA捕获系统的测试灵敏度最高，1HA单位的信噪比为120，但是利用MAb直接在测试条上打点，S/N比仅为37.4，这表明pRNA捕获系统明显改进了化验系统的灵敏度。
SEQ ID NO：1 8H5Vh核苷酸序列
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata
tcctgcaagg ctactggcta cactttcagt aactactgga tagagtggat aaagcagagg
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagcgatag aacaaactac
aatgggaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcccac
atgcaactca gtagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aaatagatac
gacgggtatt attttggttt ggattactgg ggtcaaggaa cctcagtcgc cgtctcctca
gcc
SEQ ID NO：2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thy Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Arg Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Asn Arg Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ala
SEQ ID NO：3 8H5Vk核苷酸序列表
gaaatcgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga gaaggtcacc
atgagctgca gggccagctc aagtgtaaat ttcgtttact ggtaccagca gaggtcagat
gcctccccca aactattgat ttactattca tccaacctgg ctcctggagt cccacctcgc
ttcagtggca gtgggtctgg gaactcttat tctctcacaa tcagcggctt ggagggtgaa
gatgctgcca cttattactg ccagcacttt actagttccc cgtacacgtt cggagggggg
accaacctgg aaataaaacg g
SEQ ID NO：4 8H5Vk氨基酸序列
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Phe Val
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Gly Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Thr Ser Ser Pro Tyr Thr
                 85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
SEQ ID NO：5 3C8Vh核苷酸序列
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc
tcctgcaagg cctctgggta cagcttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct
ccaggaaagg gtctaaagtg gatgggctgg ataaacacct acaccggaga gccagcctat
gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctctggaaa cctctgccag cactgcctat
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatggaat
agagatgcta tggactactg gggtcaagga acctcggtca ccgtatctag c
SEQ ID NO：6 3C8Vh氨基酸序列
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Trp Asn Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
SEQ ID NO：7 3C8VK核苷酸序列
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcttgggca gagggccacc
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttctgaca atagtcttat gcactggtac
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct
gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat
cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtattgg ggatcctccg
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg
SEQ ID NO：8 3C8VK氨基酸序列
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Ser
            20                  25                  30
Asp Asn Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
                85                  90                  95
Gly Asp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105                 110
SEQ ID NO：9 10F7Vh核苷酸序列
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg
cctggacagg gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgattctta tactaactac
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggggggt
acaggagact ttcactatgc tatggactac tggggtcaag gcacctcggt caccgtatca
tcg
SEQ ID NO：10 10F7Vh氨基酸序列
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Thr Gly Asp Phe His Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
SEQ ID NO：11-10F7VK核苷酸序列
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc
atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatct
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgttcagt tcccgtacac gttcggaggg
ggcaccaagc tggaaatcaa acgg
SEQ ID NO：12 10F7VK氨基酸序列
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Val Gln Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
SEQ ID NO：13人工序列/未知生物
catgggatgc tgccggtgta t
SEQ ID NO：14人工序列/未知生物
aattctgggc cttggctgac g
SEQ ID NO：15人工序列/未知生物
tggccgcctc tgtcgaagaa g
SEQ ID NO：16 4D1 VH核苷酸序列
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaacctg
tcctgtaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg
cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagttt tactacctac
aatcaaaact tcaaagacag ggccacattg actgtagaca aatcatccag cacagcctac
atgcagctca gaagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc cagggggggt
ccaggagact ttcgctatgc tatggattac tggggccaag gcacctcggt caccgtctcc
tca
SEQ ID NO：17-4D1VH氨基酸序列
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Phe Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
SEQ ID NO：18-4D1VK核苷酸序列
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc
atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatcc
gaagactttg cagactatta ctgtgtacag tatgttcagt ttccctacac gttcggaggg
gggaccaagc tggaaataaa acgggct
SEQ ID NO：19-4D1VK氨基酸序列
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Val Gln Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
            100                 105
SEQ ID NO：20-3G4VH核苷酸序列
caggtccaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt
tcctgcaagg gttctggcta cacattcact gattatgcta tgcattgggt gaagcagagt
catgcaaaga gtctagagtg gattggactt attaatactg actatggtga tactacttac
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccaa cacagcctat
atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagatcggac
tatgattact atttctgtgg tatggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgaatct
cta
SEQ ID NO：21 3G4VH氨基酸序列
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Asn Thr Asp Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Phe Cys Gly Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Glu Ser Leu
        115                 120
SEQ ID NO：24-2F2VH核苷酸序列
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagcg cctgtccatc
acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg tacactggat tcgccagtct
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatgggctg agggaagaac cgactataat
tcagttctca aatccagact gagcatcaat aaggacaatt ccaggagcca agttttctta
gaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccag agaggtgatt
actacggaag cctggtactt cgatgtctgg ggccaaggaa cctcggtcac cgaatct
SEQ ID NO：25-2F2VH氨基酸序列
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Arg Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Ala Glu Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Glu Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Glu Val Ile Thr Thr Glu Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Glu Ser
        115
SEQ ID NO：26-2F2VK核苷酸序列
gacattgtga tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct
ctttcctgca gggccagcca gagtattagc gactacttat actggtatca acaaaaatca
catgagtctc caaggcttct catcaaatat gcttcccaat ccatctctgg gatcccctcc
agattcagtg gcagtggatc agggtcagat ttcactctca ctatcaacag tgtggaacct
gaagatgttg gaatgtatta ctgtcaaaat ggtcacacct ttccgctcac gttcggtgct
ggcaccaagc tggaaatcaa acgg
SEQ ID NO：27-2F2VK氨基酸序列
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Gly Met Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Thr Phe Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg.