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一种双 光子 近红外双大斯托克斯位移 荧光染料及其合成方法与应用

阅读：183发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成与应用。所述荧光染料的结构如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示，以所述化合物作为提供双大斯托克斯位移的近红外染料，并将其改造为检测CYS的荧光探针。本发明还提供了所述荧光染料的制备方法以及所述关-开分子探针的制备方法。本发明所制备系列染料可在单/ 双光子激发作用下可产生近红外发射，且单/双光子激发波长与其近红外发射波长之间均有很大的位移差，可用于改善由共聚焦显微镜及双光子荧光显微镜中分光镜造成的二次吸收，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高成像的分辨率和光穿透性。，下面是一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料，其特征在于，所述荧光染料结构式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：
（Ⅰ）
（Ⅱ）。
2.一种权利要求1所述荧光染料的合成方法，其特征在于，式（Ⅰ）化合物的合成采用以下步骤：
(1)在氮气保护下，200-500 mL 甲苯中，加入化合物2对羟基萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持12-40小时，真空除去溶剂，得对化合物3羟基1烯萘醛；
（2）在氮气保护下，将化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和步骤（1）制备的对化合物3羟基1烯萘醛加入400-500 mL乙腈中溶解，然后加入30-40滴哌啶混合均匀；
（3）将步骤（2）制备的混合物在氮气气氛下回流6小时，经处理后得到式（Ⅰ）化合物CYNH-2。
3.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）所述的化合物3对羟基萘醛及三苯基膦酰亚甲基乙醛的物质的量比例为1：3-1:5；所述化合物3对羟基萘醛与甲苯的物质的量体积比为1mmol:4mL。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和对羟基1烯萘醛的物质的量比例为1：1；所述化合物1
2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈与乙腈的物质的量体积比为3mmol:40mL。
5.一种权利要求1所述荧光染料的合成方法，其特征在于，式（Ⅱ）化合物的合成采用以下步骤：
(1) 氮气保护下在200-500 mL甲苯中，加入化合物2对羟基萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持12-20小时，真空除去溶剂，得对化合物3对羟基1烯萘醛；
（2）氮气保护下在200-500 mL甲苯中，加入步骤（1）制备的化合物3对羟基1烯萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持30-50小时，真空除去溶剂，得化合物4；
（3）将化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和步骤（2）制备的对化合物4加入400-500mL乙腈中溶解，然后加入30-40滴哌啶混合均匀得混合物；
（4）将步骤（2）制备的混合物在氮气气氛下回流6小时，经后处理后得到式（Ⅰ）化合物CYNH-3。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）所述的化合物3对羟基萘醛及三苯基膦酰亚甲基乙醛的物质的量比例为1：3-1:5；所述化合物3对羟基萘醛与甲苯的物质的量体积比为1mmol:4mL。
7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，步骤（3）所述的化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和化合物4的物质的量的比为1:1；所述化合物1 2（3，
5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈与乙腈的物质的量体积比为3mmol:40mL。
8.一种权利要求1所述荧光染料的应用，其特征在于，所述荧光染料在发光材料、荧光分子探针、生物荧光成像或多色荧光成像中的应用。
9.根据权利要求7所述的荧光染料改装为关-开分子探针的应用，其特征在于，所述荧光探针的制备方法为：
（1）在0℃的无水CH2Cl2中，将荧光染料CYNH-2或CYNH-3和ET3N滴加到丙烯酰氯中混合均匀得混合熔液Ⅰ；
（2）在所述温度下继续搅拌半小时，然后在室温下进一步搅拌所得混合物12小时得混合溶液Ⅱ；
（3）将水加入到步骤（2）所述的混合溶液Ⅱ中，然后用CH2Cl2萃取3次；得到系列Cys的关-开型荧光分子探针。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的荧光染料和CH2Cl2的物质的量体积比为为6.6mol:200mL；步骤（1）所述的荧光染料、ET3N和丙烯酰氯的物质的量比为
1：2：4；步骤（3）所述的水和混合溶液Ⅱ的体积比为1：1。

说明书全文

一种双 光子 近红外双大斯托克斯位移 荧光染料及其合成方法

与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成与应用。

背景技术

[0002] 荧光成像技术已成为生化分析的有效工具。在各种荧光团中，近红外（NIR）染料由于具有长发射波长的独特优点而备受关注，这使得NIR荧光团与生物样品窗口相对应。尽管NIR荧光团已有一定发展，但依然存在若干问题：短激发造成穿透深度有限，因此器官必须被切片方可用于组织成像，导致原位信息的丢失；窄的斯托克斯位移导激发和发射的重叠，带来二次吸收；由于光散射的影响，不可避免地会产生自猝灭、光子误差以及强背景；受短波长激发限制，单光子（OP）难以实现高空间分辨率；在低浓度下，光漂白通常难以避免。虽然近红外激发可以进一步放大波长，但它仍然可以解决、、、的问题。

[0003] 双光子（TP）荧光团允许在超快脉冲激光下同时激发两个光子。TP荧光团在激发波长较长时，能显著提高穿透深度。此外，TP激发仅发生在显微镜物镜焦点处的空间受限的体积内，从而可通过在横跨样本垂直轴的等间隔位置获取高三维(3D)空间分辨率图像。此外，TP荧光团可具有增强背景荧光和减少生物样品光漂白的作用，在实际成像中，小斯托克斯位移总是引起散射光的自淬灭及较强的背景荧光。当前，一些经典的商业化染料包括罗丹明、花青素、BODIPY和苯并呋喃在内的大多数红色荧光团通常显示出小的斯托克斯位移，这是非常令人遗憾的。即使对于双光子激发的红色荧光团，虽然TP荧光团有助于解决上述、、问题，但是可能出现另一个潜在的问题：双光子激发和红外发射之间的窄位移仍然限制了TP荧光团的优势发挥。因此，因此，开发一系列深层激发/发射和双大斯托克斯位移的TPNIR荧光染料仍然是一个极具挑战性的工作。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料。

[0005] 本发明的另一目的在于提供上述双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料的合成方法及应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案：一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料，其特征在于，所述荧光染料结构式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：
（Ⅰ）
（Ⅱ）。

[0007] 上述式（Ⅰ）化合物的合成采用以下步骤：(1)在氮气保护下，200-500 mL 甲苯中，加入化合物2对羟基萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持12-40小时，真空除去溶剂，得对化合物3羟基1烯萘醛；
（2）在氮气保护下，将化合物12（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和步骤（1）制备的对化合物3羟基1烯萘醛加入400-500 mL乙腈中溶解，然后加入30-40滴哌啶混合均匀；
（3）将步骤（2）制备的混合物在氮气气氛下回流6小时，经处理后得到式（Ⅰ）化合物CYNH-2。

[0008] 优选地，步骤（1）所述的化合物3对羟基萘醛及三苯基膦酰亚甲基乙醛的物质的量比例为1：3-1:5；所述化合物3对羟基萘醛与甲苯的物质的量体积比为1mmol:4mL。

[0009] 优选地，步骤（2）所述的化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和对羟基1烯萘醛的物质的量比例为1：1；所述化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈与乙腈的物质的量体积比为3mmol:40mL。

[0010] 上述式（Ⅱ）化合物的合成采用以下步骤：(1) 氮气保护下在200-500 mL甲苯中，加入化合物2对羟基萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持12-20小时，真空除去溶剂，得对化合物3对羟基1烯萘醛；
（2）氮气保护下在200-500 mL甲苯中，加入步骤（1）制备的化合物3对羟基1烯萘醛和三苯基膦酰亚甲基乙醛，加热至100-120℃并维持30-50小时，真空除去溶剂，得化合物4；
（3）将化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和步骤（2）制备的对化合物4加入400-500mL乙腈中溶解，然后加入30-40滴哌啶混合均匀得混合物；
（4）将步骤（2）制备的混合物在氮气气氛下回流6小时，经后处理后得到式（Ⅰ）化合物CYNH-3。

[0011] 优选地，步骤（1）所述的化合物3对羟基萘醛及三苯基膦酰亚甲基乙醛的物质的量比例为1：3-1:5；所述化合物3对羟基萘醛与甲苯的物质的量体积比为1mmol:4mL。

[0012] 优选地，步骤（3）所述的化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈和化合物4的物质的量的比为1:1；所述化合物1 2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈与乙腈的物质的量体积比为3mmol:40mL。

[0013] 一种上述荧光染料的应用，所述荧光染料可以在发光材料、荧光分子探针、生物荧光成像或多色荧光成像中的应用。

[0014] 上述的荧光染料改装为关-开分子探针的应用，所述荧光探针的制备方法为：（1）在0℃的无水CH2Cl2中，将荧光染料CYNH-2或CYNH-3和ET3N滴加到丙烯酰氯中混合均匀得混合熔液Ⅰ；
（2）在所述温度下继续搅拌半小时，然后在室温下进一步搅拌所得混合物12小时得混合溶液Ⅱ；
（3）将水加入到步骤（2）所述的混合溶液Ⅱ中，然后用CH2Cl2萃取3次；得到系列Cys的关-开型荧光分子探针。

[0015] 优选地，步骤（1）所述的荧光染料和CH2Cl2的物质的量体积比为6.6mol:200mL；步骤（1）所述的荧光染料、ET3N和丙烯酰氯的物质的量比为 1：2：4；步骤（3）所述的水和混合溶液Ⅱ的体积比为1：1。

[0016] 有益效果本发明制备的荧光染料呈现双光子/近红外/双大斯托克斯位移及深层组织穿透的特性。用于组织成像时分辨率大大提高，进而可以用于生物活体的荧光成像分析。本发明化合物可改造为荧光探针，可用于活体动物内CYS进行检测。本发明对于开发新颖光学性质的荧光染料/探针及活体成像有着重要的开拓性意义。
附图说明

[0017] 图1为双大斯托克斯位移工作原理、及本发明化合物发光参数；图2、3为本发明实施例3提供的荧光染料的吸收、发射及双光子激发发射光谱；
图4为本发明实施例2提供的化合物改造后的荧光探针对CYS检测响应线性规律图；
图5为本发明实施例1提供的所采用荧光染料的组织阻挡激发发射穿透深度检测图；
图6为本发明实施例2提供的采用荧光染料用于组织内z-轴荧光扫描图；
图7为本发明实施例2提供的采用荧光染料用于细胞/组织内光漂白检测图；
图8为本发明实施例5提供的采用荧光染料用于细胞内光穿透图；
图9为本发明实施例6提供的采用荧光染料用于斑马鱼内荧光成像图；
图10为本发明实施例7提供的采用荧光染料用于小鼠内荧光成像图。

具体实施方式

[0018] 下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

[0019] 实施例1双光子近红外双大斯托克斯位移系列化合物制备：
1）在200mL甲苯中，加入对羟基萘醛（8643mg，50mmol）和三苯基膦酰亚甲基乙醛（45600mg，150mmol）。将混合物加热至100℃反应40小时，真空下除去溶剂，得到对羟基1烯萘醛（见反应式中化合物3）。将化合物2（3，5，5-三甲基环己基-2-烯-1-亚乙基）丙二腈（见反应式中化合物1）（9300 mg，30 mmol）和对羟基1烯萘醛（见反应式中化合物3）（5946 mg，
30 mmol）溶解在400 mL乙腈中，然后加入20滴哌啶。混合物在氮气气氛下回流8小时。随后，在减压下除去溶剂。将所得残留物溶解于200毫升二氯甲烷中，用水（3×100毫升）洗涤，用无水Na2SO4干燥。除去溶剂后，用硅胶柱色谱(正己烷洗脱：二氯甲烷=1/1，v/v)对粗产物进行纯化，得到理想的橙色固体产物CYNH-2。

[0020] 2）在200 mL甲苯中，加入化合物3对羟基1烯萘醛（9910 mg，50 mmol）和三苯基膦酰亚甲基乙醛（15200 mg，50 mmol）。将混合物加热至100℃40小时，真空下除去溶剂，得到产物4。将化合物1（9300 mg，30 mmol）和4（6757 mg，30 mmol）溶解在400 mL乙腈中，然后加入20滴哌啶。混合物在氮气气氛下回流10小时。随后，在减压下除去溶剂。将所得残留物溶解于200毫升二氯甲烷中，用水（3×100毫升）洗涤，用无水Na2SO4干燥。除去溶剂后，用硅胶柱色谱(正己烷洗脱：二氯甲烷=1/1，v/v)对粗产物进行纯化，得到理想的橙褐色固体产物CYNH-3。(结构式、双大斯托克斯位移及光学机理见附图1)实施例2
在0℃的无水CH2Cl2（200 mL）中，将染料CYNH-2（6.6 mmolL）和ET3N（10 mmolL）滴加到丙烯酰氯（1600μl，20 mmolL）中。在该温度下继续搅拌半小时，将所得混合物在室温下进一步搅拌12小时。将水（200 ml）加入到混合物中，然后用CH2Cl （2 300 mL×3）萃取。将有机相用无水Na2SO4干燥。通过蒸发除去溶剂，并在硅胶上用闪蒸柱层析（石油醚/EtOTAC＝1∶1）纯化残留物，得到探针CYNA-2为白色固体（产率：75%）。

[0021] 实施例3在0℃的无水CH2Cl（2 200 mL）中，将染料CYNH-3（6.6 mmolL）和ET3N（10 mmolL）滴加到丙烯酰氯（1600μl，20 mmolL）中。在该温度下继续搅拌半小时，将所得混合物在室温下进一步搅拌12小时。将水（200 ml）加入到混合物中，然后用CH2Cl （2 300 mL×3）萃取。将有机相用无水Na2SO4干燥。通过蒸发除去溶剂，并在硅胶上用闪蒸柱层析（石油醚/EtOTAC＝1∶1）纯化残留物，得到探针CYNA-3为白色固体（产率：80%）。

[0022] 实施例4上述制备所得式（Ⅰ）和式(II)系列化合物的紫外吸收、荧光发射及双光子激发光谱检测：模拟生理条件，以下各项实验均在pH = 7.4条件下进行（HEPES缓冲溶液，浓度为10 mM），染料及探针的浓度均采用10μM实施。

[0023] 虽然大共轭系统往往提供长波长的激发和发射，但根据本发明的设计理念，我们更倾向于构建合适的共轭系统来控制激发（OP和TP）和NIR发射之间的距离。检测结果可见，该系列染料保证了620-650 nm左右的发射光谱性能。同时，相对于405 nm处的单光子激发和850 nm处的双光子激发可形成双大斯托克斯移位。在TP模式下，CYNH-2在激发波长为850 nm时表现出较强的荧光强度；CYNH-3在激发波长为870 nm时表现出较强的荧光强度。此外，在875 nm激发时，二者的TP横截面达到73-110 Gm。在各种溶剂其量子产率为9.72%～31.99%。这些性质表明CYNH-2和CYNH-3非常适于生物样本中双光子近红外大大斯托克斯移位模式下的成像分析，具体的光谱图见附图2-附图7。

[0024] 实施例5将实施例1制备的染料化合物和实施例2制备的荧光分子探针应用于细胞内的成像分析。

[0025] HeLa细胞分别在添加10%胎牛血清(FBS,Invitrogen)的DMEM培养基和1640培养基中培养。细胞放置于25个培养皿中，贴壁处理24小时。以染料（5-15μM）对37℃孵育30min后的细胞进行成像；其次，用染料改造后的探针（10μM）检测37℃孵育30min后细胞内源性Cys的变化。最后，对细胞进行复性验证，获得对照。激发波长设置为850 nm；收集窗口为520～650nm。

[0026] 在850 nm激发下，通过与对照样品分析，证明经染料分子或探针处理后，在收集窗(520-650nm)显示出增强的荧光信号，表明其性能可用于细胞成像及CYS检测。为了证实这一结果，阴性对照实验是在与探针CYNA孵育前用巯基阻断剂NEM(N-乙基马来酰亚胺，0.5mM)预处理细胞。在这种情况下，荧光强度显著减弱，表明内源Cys被NEM有效减少，从而导致相当弱的荧光。因此，细胞内应用表明，所制备荧光染料和改造后探针均可用于细胞成像分析，具体见附图8。

[0027] 实施例6将实施例1制备所得式（Ⅰ）化合物CYNH-2应用于斑马鱼进行荧光成像分析。首先，为了测试荧光素斑马鱼的适用性，我们以所制备染料孵育斑马鱼30分钟。同时，作为负对照，以NEM（0.5 mM）预处理斑马鱼后，加染料/探针并于E3培养基(15 mM NaCl、0.5 mM KCl、1 mM MgSO4、1 mM CaCl2、0.15 mM KH2PO4、0.05 mM Na2HPO4和0.7 mM NaHCO3；pH 7.5)中孵育。成像前，残留探针经E3培养基洗去。为探讨斑马鱼衰老过程中Cys水平的下调，用D-半乳糖（1600mg/L）处理斑马鱼卵6h，然后用探针处理0.5h，同时用D-半乳糖（1600mg/L）处理斑马鱼卵24h制备斑马鱼卵样。用D-半乳糖(1600mg/L)连续孵育6d,以探针孵育0.5h后经波长
850nm处双光子激发后在收集窗520-660nm实施荧光成像，荧光染料用于斑马鱼内荧光成像图见图9。

[0028] 实施例7将实施例1制备的式（Ⅰ）化合物CYNH-2和实施例2制备所得式（Ⅰ）化合物探针应用于小鼠活体进行荧光成像分析。首先，以生理盐水（见图7a）作为对照，检测染料和探针在小鼠体内成像能力：将染料/探针进行腹腔注射（40μm，200μL生理盐水（0.9%）），并跟随对照实验：NEM进行小鼠预处理，图10证明荧光染料和探针均可用于体内成像分析。然后，我们将染料和探针注射到不同衰老阶段(4-20周)小鼠体内，收集荧光强度范围，验证自然老化小鼠中CYS浓度水平随老化程度加强而下降。最后，以D-半乳糖进行皮下注射,每日120mg/kg,连续4周,建立小鼠人工衰老模型，进一步证实自然衰老小鼠Cys的衰老变化。

[0029] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

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一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成方法与应用

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