1.发明领域

本发明涉及用于进行实时PCR的过程，并涉及包含用于实现本发 明的方法的试剂以及工具和仪器的试剂盒。该过程适合于通过在实时 扩增中在相同阵列上鉴定其或鉴定其组分来鉴定、检测和/或定量不同 群(类别、科、属、种、其他中的个体)的大量(微)生物。

本发明特别适合于同时鉴定和/或定量相同生物学样品中存在的 (微)生物的群或亚群或相关基因。

本发明还提供了用于检测和鉴定任何搜索(微)生物或基因连同 其定量的简化过程。

2.相关领域的描述

生物或微生物的鉴定可以基于其特异性序列的遗传材料的存在来 进行。特定生物的鉴定可以通过使用特异性引物和检测或鉴定扩增序 列来扩增生物的给定序列容易地进行。

然而，在许多应用中，特别是在诊断中，生物样品中存在的可能 生物是众多的且属于不同科、属、种、亚种或甚至个体。每一种可能 生物的扩增是困难和昂贵的。因此需要用于此类多参数、多水平分析 的简单方法。

给定序列的扩增通过最常用的几种方法来进行，所述方法例如聚 合酶链反应(PCR)(美国专利号4,683,195和4,683,202)、连接酶 链反应(LCR)(Wu和Wallace，1989，Genomics 4：560-569)或循 环探针反应(CPR)(美国专利号5,011,769)。检测给定序列的存在 和因此特定生物的存在的一种特定方法是在扩增子循环期间跟踪扩增 子在溶液中的出现。该方法称为实时PCR。当扩增子形成时，荧光信 号出现在溶液中，并且当达到阈值时，扩增视为阳性的。

检测扩增子还可以在扩增后通过基于扩增子与固定在固体载体上 的互补序列的特异性识别的方法来进行。用于此类杂交的第一种载体 是硝酸纤维素或尼龙膜。然而，将该方法小型化，并且提出新载体例 如传导表面、硅石和玻璃连同检测过程的小型化。在扩增步骤(PCR) 后或在逆转录成cDNA和扩增(RT-PCR)后，微阵列或DNA芯片用于对 于生物特异的DNA或RNA核苷酸序列的多重分析。待检测的靶序列在 扩增或拷贝步骤期间进行标记，并随后在阵列上进行检测和可能地定 量。阵列上特定靶序列的存在是样品中存在给定基因或DNA序列的指 示，并且因此是存在随后可以鉴定的给定生物的指示。当几种序列彼 此同源，但必须在同一阵列上特异性区分时，检测问题变得困难。希 望使用用于此类诊断目的的阵列来解决这个技术问题，因为目的生物 或微生物在分类学基础上通常非常类似于其他的并存在几乎相同的 DNA序列。

Company Affymetrix Inc.已开发了通过在加工的每个步骤时使用 屏蔽用于在固体载体上、在特定位置处直接合成寡核苷酸的方法。所 述方法包括在成长中的合成寡核苷酸上添加核苷酸，以便在所需位置 处获得所需序列。这种方法衍生自光刻法技术，并且与光保护基团的 使用偶联，所述光保护基团在添加新核苷酸前被释放(美国专利号 5,510,270)。然而，在表面上仅存在小寡核苷酸，和所述方法发现主 要用于测序或鉴定相应于阵列上结合的每一种特定寡核苷酸的阳性点 的模式的应用。通过将这种多核苷酸切割成小寡核苷酸和杂交模式与 参考序列的比较来获得靶序列的表征。将所述技术应用于结核分枝杆 菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因的鉴定(WO 97/29212)， 其中捕获分子包含小于30个核苷酸，并且来自可能相差单个核苷酸的 2种不同序列的分析(SNPs的鉴定或基因分型)。小捕获寡核苷酸序 列(具有10-20个核苷酸的长度)是优选的，因为当它们的长度较小 时，相差1个碱基的2种寡核苷酸之间的区分较高。

该方法因为下述事实而变复杂：它不能直接检测起因于基因扩增 (PCR)的扩增子。用具有T3或T7序列的引物进行双重扩增，然后用 RNA聚合酶进行逆转录。在阵列上检测前，将这些RNA切割成约40个 碱基的碎片(WO 97/29212的实施例1)。每种序列需要在阵列上存在 10种捕获分子和待检测的10种对照核苷酸序列。关于这种复杂操作 的原因是在表面上存在的小寡核苷酸捕获分子上，长DNA或RNA片段 杂交极慢。所述方法因此不适合于检测同源序列，因为同源性沿着序 列而改变并且因此碎片的部分将在相同捕获分子上杂交。因此，将用 于解释结果的软件掺入方法中用于允许解释获得的结果。在阵列上不 执行扩增子的单次杂交的主要原因是扩增子将在溶液中比在阵列的小 捕获分子上的杂交快得多地再次杂交。

此类限制的后果是多核苷酸仅在被切割成寡核苷酸后在基于寡核 苷酸的阵列上进行分析。对于基于mRNA的cDNA拷贝的检测的基因表 达阵列，该问题仍存在但较不严重，因为cDNA是单链的。片段也被切 割成更小的种类和该方法需要使用几种捕获寡核苷酸序列，以便获得 证明给定基因的存在的信号模式。所述切割还减少标记的核苷酸的数 目，并因此减少获得的信号。在cDNA分析的情况下，长捕获多核苷酸 序列的使用给出对于检测好得多的灵敏度。在许多基因表达应用中， 当待检测的cDNAs源于具有不同序列的基因时，长捕获分子的使用不 是问题，因为序列中的差异足以避免它们之间的交叉反应，甚至对于 长于100个碱基的序列，从而使得多核苷酸可以用作捕获分子。然而， 长捕获分子给出所需灵敏度，但它们仍与其他同源序列杂交。

DNA中单核苷酸多态性的检测仅是同源序列的检测的一个特定方 面。已提议使用阵列以区分在序列的特定位置处相差1个核苷酸的2 种序列。因为DNA或RNA序列为低拷贝数，所以首先扩增它们的序列， 从而使得在阵列上分析双链序列。已提出几种方法以检测一个位置中 的此类碱基变化。文件WO 97/31256提出一种寡核苷酸探针(其具有 靶序列特异性部分和可寻址的阵列特异性部分)和第二种寡核苷酸探 针(其具有靶序列特异性部分和可检测标记)之间的连接检测反应。 当2种寡核苷酸在靶上杂交时，它们进行连接。在溶液中连接后，通 过可寻址的阵列特异性部分将标记产物固定在阵列上。SNP的检测是 用于个别生物中的多态性区分的基础，也是用于其基因分型的基础， 因为个体的基因组由于所述SNPs而不同于相同物种或亚种中的彼此。 特定SNP的存在影响酶如P450的活性并使得它们在药物的代谢中更有 活性或活性更少。

靶核苷酸杂交后，阵列上存在的捕获寡核苷酸还可以用作引物用 于延伸。文件WO 96/31622提议通过延伸具有可检测的经修饰的核苷 酸的捕获分子来鉴定在序列上给定位置处的核苷酸，以便检测给定点， 其中靶已结合在这个特定位置处与靶序列互补的捕获分子的最后一个 核苷酸。文件WO 98/28438提议完成杂交-延伸步骤的几个循环以标记 点，以便补偿靶序列的低杂交得率。这种方法允许通过标记延伸捕获 分子的点来鉴定序列的给定位置处的核苷酸。

在延伸前，阵列上存在的捕获分子可以通过核酸酶进行消化，以 便区分匹配和未匹配的异双链体(美国专利号5,753,439)。还已提 议使用核酸酶用于鉴定序列(EP 0721016)。还已提议将靶互补的第 二种标记的核苷酸序列加入杂交的靶中并与捕获分子连接，如果靶的 最后一个核苷酸在这个位置处与靶互补(WO 96/31622)。

文件EP-0785280提出基于在包含各相差1个碱基的几种寡核苷酸 序列的块上的靶核苷酸杂交的多态性检测，并获得用于确定哪种序列 是最佳杂交匹配的强度比。

提议使用膜或尼龙载体以通过在载体和捕获分子之间掺入间隔物 来增加固体载体上的多核苷酸检测的灵敏度。Van Ness等人(Nucleic Acids Research，第19卷，第3345页，1991)描述了用于结合尼龙 膜上的DNA的聚(乙烯亚胺)臂。文件EP-0511559描述了作为间隔物 用于结合膜上的小寡核苷酸的六乙二醇衍生物。当诸如尼龙的膜用作 载体时，不存在固体载体和寡核苷酸之间的结合位点的对照，并且观 察到polydT尾部增加固定得率和因此增加所得到的杂交(WO 89/11548)。

Guo等人(Nucleic Acids Research，第22卷，第5456页，1994) 教导了15个碱基的polydT作为间隔物用于结合玻璃上的寡核苷酸的 用途，伴随增加的杂交敏感性。

Anthony等人(Journal of clinical microbiology，第38卷， 第7817页，2000)的出版物描述了在PCR扩增后使用膜阵列用于检测 各种细菌物种的23S核糖体DNA。检测的靶是通过共有区PCR由细菌 扩增的rDNA，并在包含用于所述细菌的捕获分子并具有20-30个碱 基的捕获分子的尼龙阵列上获得检测，所述捕获分子与尼龙共价连接， 并且不存在可用于杂交的序列的部分的对照。rDNA是用于补偿该方法 的低检测得率的多拷贝DNA。同样，由于小捕获分子的使用，它们仅 能通过其特异性序列而不是科或属检测单个细菌物种。

在工艺水平中不存在下述指示或暗示，长于寡核苷酸的多核苷酸 可以用作微阵列中的捕获序列，以便区分同源多核苷酸序列之间的结 合，并允许鉴定(微)生物序列或其组分的的其他种、属或科中的一 种靶序列，并且在扩增期间检测和/或定量靶的存在。

另外不存在下述指示或暗示，在序列的一个位置处相差1个核苷 酸的同源序列(例如在多态性分析中观察到的)可以通过在扩增期间 扩增的序列在相应的捕获分子上的杂交进行检测。

在本发明之前，不知道可以在单步过程中，即扩增子在阵列上的 扩增连同直接杂交，鉴定属于相同群、2个群或更多的生物连同群像 这样的特异性鉴定。另外，不知道可以在其序列之一的扩增期间鉴定 属于群或亚群的生物连同这些群和亚群的特异性鉴定。另外此类鉴定 可以通过使用多核苷酸作为捕获序列用于所有检测来获得。

另外不知道长于寡核苷酸的多核苷酸可以用于在其扩增期间鉴定 在序列的特定位置中存在相差1个核苷酸的同源多核苷酸序列。

另外不知道同源多核苷酸序列可以在其扩增期间以极高灵敏度直 接在阵列上进行区分和检测，因为相关技术需要扩增子的断裂用于其 在小寡核苷酸阵列上的检测。断裂与实时检测不相容，因为断裂的扩 增子无法再扩增因此导致扩增的终止。

发明概述

本发明部分基于下述发现：阵列可以用于在其序列的扩增步骤期 间获得属于几个群的相同或不同(微)生物的同源(生物学)组分(例 如遗传序列或mRNA)之间的区分，连同这些群的鉴定和/或其定量。

本发明提供了用于实时PCR的过程，其包括下述步骤

a)进行至少一个PCR循环以形成扩增子；

b)使扩增子与固定的未标记的捕获分子杂交；

c)检测杂交扩增子；

d)重复步骤a)b)c)至少一次。

本发明在通过实时PCR使用阵列以区分属于几个群的同源核苷酸 序列连同像这样鉴定这些群中特别有用。

本发明进一步提供了通过经由实时RT-PCR区分基因含量用于鉴 定和/或定量生物的部分例如以mRNA形式的表达基因的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了基于简化技术的诊断试剂盒， 其需要在单步扩增中使用单个或有限数目的引物对，以通过记录所述 微阵列上的单点鉴定来检测特定靶或靶序列群的存在，连同鉴定(检 测和/或定量)所述特异性靶或靶遗传序列群，并且在相同实验方案中， 所述信号对于生物或生物的群或亚群特异。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于执行本发明的方法的仪 器。

本发明还提供了通过在实时PCR测定法中其扩增多核苷酸序列在 阵列上杂交用于鉴定相差给定核苷酸序列的单碱基差异的生物的工 具。

附图简述

图1a是用于在微阵列上执行实时PCR和检测的优选装置的表示。 该装置包含由具有腔(3)的支持物(2)制成的载体(1)、用具有入 口(6)的盖玻片(5)密封的运载体(1)。图1b是该装置的顶视图， 和图1c表示侧视图A-B。

图1d是与温控仪(8)接触用于PCR扩增和与检测装置(7)接触 用于微阵列分析的装置的表示。

图1e表示图1的装置的倍增。

图2a表示用于在微阵列上执行多重实时PCR和检测的装置，所述 装置具有含盖(9)的2个室(11)，由以具有阵列的腔的形式的通道 (10)分开。图2b是与温控仪(8)接触用于PCR扩增和与检测装置 (7)接触用于微阵列分析的装置的表示。

图3a是用于在微阵列上执行实时PCR和检测的优选装置的表示， 所述装置具有存在于环上并围绕温控仪(8)退火的几个室(11)。阵 列(4)位于室中的特定位置处。盖(9)使得能够通过入口(6)将溶 液引入室中。图3b表示当包括检测装置(7)时该装置的侧视图A-B。

图4表示用于在微阵列上执行实时PCR和检测的另一种装置，所 述装置具有2个室(11)，其中一个室具有阵列(4)。流体可以通过 通道(10)从一个室转移至另一个。

图5a表示用于在微阵列上执行实时PCR和检测的优选装置，所述 装置具有不对称的室(11)，其中一个部分具有阵列(4)。该装置优 选是圆盘载体的部分以允许该装置的容易离心(图5b)。其中使用该 装置的方法的步骤在图5a中呈现。在步骤1中，将包含核苷酸分子以 及用于扩增和标记的试剂的溶液引入反应室(11)的第一个区室内。 将捕获分子(4)固定在反应室(11)的第二个区室的顶部。在步骤2 中，反应室用盖(9)进行密封并且在反应室(11)的第一个区室中执 行PCR扩增，使所述反应室与温控仪(8)接触。在步骤3中，使反应 室(11)离心并翻转，以便使包含标记的靶分子的溶液与固定在第二 个区室中的捕获分子(4)接触。在步骤4中，使反应室(11)翻回， 并且经由检测器(7)通过窗口测量结合的标记的靶分子。

图6a表示具有不同微阵列用于在PCR期间检测扩增子和沿着圆盘 的不同部分具有不同温度的圆盘。具有变性(12)、退火T°(13)、 延伸T°(14)、用于阅读的窗口(15)的部分。图6b表示与温控仪 (8)接触用于PCR扩增和与检测装置(7)接触用于微阵列分析的图 6a的装置的侧视图A-B。该圆盘借助于步进电机(16)在其轴上旋转。

图7a是以3步的一个扩增/检测循环的表示：变性(12)、退火 (13)和延伸(14)。在捕获分子上的扩增子的杂交(17)及其检测 (18)优选在循环的退火步骤期间进行。下一个循环的开始由虚线表 示。图7b是以5个步骤的扩增/检测循环的表示：变性(12)、退火 (13)、延伸(14)、变性(12′)和杂交(17)检测(18)。在这个 实施方案中，扩增子的检测不在PCR循环期间进行而在特异性杂交步 骤期间进行，所述特异性杂交步骤在变性步骤(12)后，以使捕获分 子上的信号变成零。下一个循环的开始由虚线表示。这个实施方案在 实施例2中举例说明。

图8是在本发明的具体实施方案中以6步的一个扩增/检测循环的 表示，其中捕获分子与PCR溶液断续接触。顺次步骤是：变性(12)、 退火(13)、延伸(14)、变性(12′)、杂交(17)和检测(18)。 图8a表示其中捕获分子被固定在反应室中优选在底部的实施方案。它 们在所有步骤期间与PCR溶液接触，除了在检测(18)期间。为了达 到这个目的，从捕获分子处去除液体。一个实施方案是在检测步骤(18) 前(T)和后(T′)使室完全颠倒。下一个循环的开始由虚线表示。图 8b表示其中捕获分子被固定在反应室的盖(9)中的备选实施方案。 它们仅在杂交(17)步骤期间与PCR溶液接触。为了达到这个目的， 在杂交步骤(17)前(T)和后(T′)使室完全颠倒。下一个循环的开 始由虚线表示。

图9：根据本发明用于进行实施检测连同PCR的不同循环以根据 所获得的值来终止反应的过程的不同步骤的一般示意流程图。这个一 般流程图对应图7b的5步骤循环。

图10.使用实施例1中提供的标记的通用引物用于在微阵列上在 线检测PCR扩增的结果。在包含不同结合的捕获分子的微阵列的存在 下，对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和肺炎球菌(S.pneumoniae) 的基因组DNA进行PCR。一种捕获分子是扩增产物金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)特异的，和另一种是扩增产物肺炎球菌(SEQ ID NO：2) 特异的。将一种阳性杂交对照加入反应混合物中，并相应于用与捕获 分子BAT-973(SEQ ID NO：3)互补的cy3标记的扩增子。这种对照 用于检查杂交阶段。在不同热循环的退火步骤期间对金黄色葡萄球菌 (SEQ ID NO：1)、肺炎球菌(SEQ ID NO：2)和BAT-973(SEQ ID NO： 3)的捕获分子进行测量。

图11显示如图7b中提供的在5步骤中在扩增/检测的一个循环期 间监控扩增子在微阵列上的杂交的动力学的结果。在包含不同结合的 捕获分子的微阵列的存在下，对CYP2C9基因进行PCR。一种捕获分子 是扩增产物MT2C9*3(SEQ ID NO：4)特异的。在循环41的5个步骤 期间常规进行测量：于94℃变性、于60℃退火、于72℃延伸、于94 ℃变性和于40℃杂交。T℃(◆)。提供了在变性和杂交步骤期间信 号增加的回归曲线(▲)。

图12显示在5个步骤中在扩增/检测的3个循环期间监控扩增子 在微阵列上的杂交的动力学的结果。实验如图11中提供的来进行。在 第26个(▲)、第31个(●)和第36个(■)循环时，在杂交步骤 期间以规律间隔进行测量，并且提供了与这些测量相关的回归曲线。T ℃(◆)。

举例说明性实施方案的描述

下文是本发明的某些实施方案的描述，所述实施方案仅为了举例 并就附图而言而给出。

定义

术语“核酸、寡核苷酸、阵列、核苷酸序列、靶核酸、基本上结 合、与......特异性杂交、背景、鉴定”是通过引用合并入本文的国际 专利申请WO 97/27317中描述的那些。术语多核苷酸指通常由DNA或 RNA序列组成的核苷酸或核苷酸样序列。寡核苷酸视为通常长度15- 40个核苷酸的小序列，并且无论如何长度小于100个核苷酸。

术语“核苷酸三磷酸盐、核苷酸、引物序列”是在通过引用合并 入本文的文件WO 00/72018和WO 01/31055中描述的那些。

提及核苷酸、多核苷酸等包括其中糖-磷酸盐主链进行修饰和/或 替换的类似种类，条件是不破坏它的杂交性质。例如主链可以由称为 肽核酸(PNA)的等价合成肽替换。

术语“同源遗传序列”意指在相应位置处具有高于纯粹随机比对 中的相同氨基酸或核苷酸百分比的氨基酸或核苷酸序列。当它们显示 最低限度同源性(或序列同一性)时，它们视为同源的，所述最低限 度同源性定义为，在考虑待比较的2种序列之一中的添加或缺失(如 缺口)序列已进行最佳比对后，与总核苷酸或氨基酸比较，在每个位 置处发现的相同核苷酸或氨基酸的百分比。编码给定蛋白质但存在于 遗传上不同来源如不同生物中的基因通常是同源的。另外在给定生物 中，编码相同家族的蛋白质或酶(白介素、细胞色素b、细胞色素P450) 的基因。当同源序列仅在一部分、少数部分或沿着其序列全部同源时， 同源性(或序列同一性)的程度可以改变很多。在2种序列中相同的 序列的部分被说成保守的。具有显著部分的相同序列的序列视为同源 的。这个部分长度为至少10个连续核苷酸和更佳15个和甚至更佳20 个。呈现保守的三维结构的蛋白质结构域通常由同源基因编码并甚至 通常由独特的外显子编码。在其序列中显示出高度不变性的序列被说 成高度保守的，并且它们呈现高度同源性。

术语“群、亚群和亚亚群”首先指生物学生物在分类学界、门、 纲、目、科、属、种、亚种、变种或个体中的分类。这些构成生物学 分类学组构的不同水平。群还指具有某些共同方面，但具有某些遗传 差异的生物，如例如GMO植物、转基因或嵌合动物。为了本发明的目 的，这些共同方面必须反应为共同或同源DNA或RNA序列以及DNA序 列中的不同性或差异。基因序列还可以不依赖其生物起源在群或亚群 中进行分类，并且像这样是本发明的方面。它们随后将指属于给定家 族例如细胞色素P450基因、蛋白质激酶、G受体偶联蛋白质及其他的 群或亚群基因。如上文定义的，这些基因对于彼此是是同源的。

基因(核苷酸序列)的分类用作分子古生物学的基础用于确定生 物分类成种、属、科、目、纲、门、界和类(taxus)。

“微阵列”意指在其上固定多种捕获分子以便能够与给定特异性 靶分子结合的载体。微阵列优选由存在于载体表面上或载体内或在覆 盖载体的基质上的特异性定位区域处的捕获分子组成。特异性定位区 域是包含对于指定靶分子特异的结合捕获分子的表面区域。特异性定 位区域通过构建微阵列的方法已知或在检测期间或之后限定。点是在 其中特异性靶分子被固定在其捕获分子上并由检测者可见的区域。在 本发明的一个具体应用中，捕获分子的微阵列还在不同或分开的载体 上提供，只要不同载体包含特异性捕获分子并且可以彼此区分开以便 能够定量特异性靶分子。这可以通过使用具有特定特征并能够彼此识 别以便定量结合分子的珠的混合物来达到。随后一种珠或珠的群体被 视为具有对于一种靶分子特异的捕获分子的点。另外其为多孔板平板 的部分并具有捕获分子的孔被视为阵列。

微阵列通过将捕获分子沉积在基质上来优先获得，这通过物理方 式例如针或“针和环”触摸表面，或通过例如压力或纳米分配器的方 法释放溶液的微滴来完成。备选地，捕获分子在基质上的原位合成是 使用寡核苷酸或多核苷酸在预定位置中合成的光空间分辨率的本发明 一个实施方案，例如由5,744,305和6,346,413提供的。

如本文所使用的，“捕获分子”指分子、或其复合物或组合，其 能够与一种靶分子、或靶分子家族、或多种靶分子中的一个或多个成 员、或其部分特异性结合，捕获分子优选是其为寡核苷酸或多核苷酸 的核酸，其在载体的表面上原位化学合成或放在其上。核酸结合经由 2种多核苷酸之间的碱基配对来达到，一种是固定的捕获分子和另一 种是待检测的靶。

术语“实时PCR”意指其允许在PCR循环期间检测和/或定量扩增 子的存在的方法。在实时PCR中，扩增子的存在在至少一个扩增循环 中进行检测和/或定量。与在PCR循环期间形成的扩增子量相关的扩增 子或信号增加用于检测和/或定量PCR溶液中的给定核苷酸序列。

术语稳定(或恒定)和受控温度意指这样的温度，其通过其为温 度调节装置的受控系统获得，并且在给定测量的时间过程期间足够稳 定以避免超过10％的靶杂交率变化。一般的稳定温度是对于至少1分 钟和更佳5分钟的时间段或甚至更佳60分钟的时间段或甚至24小时 变化不超过5℃并优选不超过1℃的温度。

本发明的“扩增子”意指其为生物材料中存在的核苷酸分子的PCR 扩增结果的靶核苷酸分子。

术语“溶液接触”意指流体形式或允许液体的移动。例如离心或 完全颠倒的表面不是流体接触的，即使液体的薄膜仍覆盖表面。

“断续接触”意指根据某一时帧在物理上接触或不接触。在本发 明的具体方面，PCR溶液与捕获分子断续接触，意指对于给定时间段 从具有固定的捕获分子的表面处去除或置换PCR溶液(不接触)，然 后将其移回至其原始位置(接触)。在反应室中去除或置换优选超过 95％和优选超过99％的PCR溶液。PCR溶液优选由重力引流置换，所 述重力引流起因于反应室的方向中的变化，优选反应室的旋转、平移 或侧运动。

本发明涉及用于鉴定和/或定量样品中的生物学生物或生物的部 分的方法。该方法包括检测对于所述生物特异的核苷酸序列，其中所 述核苷酸序列呈现与来自其他生物的至少2种、和优选至少4种其他 同源核苷酸序列的同源性。该方法优选在其为基因组DNA或mRNA的遗 传材料的提取和/或纯化后。

该方法包括下述步骤：

a)进行至少一个PCR循环以形成扩增子；

b)使扩增子与固定的未标记的捕获分子杂交；

c)检测杂交扩增子；

d)重复步骤a)b)c)至少一次。

优选地，PCR循环包括变性、退火和延伸的步骤，由此PCR溶液 与捕获分子持续接触，从而使得扩增子在退火步骤期间与捕获分子杂 交。

在备选实施方案中，捕获分子与PCR溶液断续接触。

因为PCR循环其自身包含3个步骤，所以在一个实施方案中，本 发明的方法包括下述6个步骤：

a)变性；

b)退火；

c)延伸；

d)变性；

e)杂交；和

f)检测。

在一个实施方案中，捕获分子仅在步骤e)期间和任选地在步骤d) 期间与PCR溶液接触。

在另一个实施方案中，本发明的方法包含下述步骤：

a)变性；

b)退火；

c)延伸；

d)变性；

e)杂交；和

f)检测。

在一个实施方案中，捕获分子优选仅在步骤a)和e)期间与PCR 溶液接触。在备选实施方案中，捕获分子在除了步骤f)期间外的所 有步骤中与PCR溶液接触。

希望PCR扩增主要在溶液中发生，并且沿着PCR循环对于形成的 扩增子进行检测且不干扰扩增过程。已发现由于这个原因，优选的捕 获分子是包含间隔物部分和捕获部分的那些。仅捕获分子的捕获部分 是扩增子特异的。希望地，将捕获分子以这样的方式与固体载体固定， 使得间隔物部分位于固体载体和捕获部分之间。优选地，捕获分子的 捕获部分通过至少6.8nm的间隔物部分与所述固体载体的表面分开。

方便地，间隔物部分是核苷酸序列，和间隔物部分的远端(即， 远离捕获部分的末端)处的核苷酸可以用于使捕获分子与固体载体结 合。为了这个目的，可以提供在间隔物部分的远端处具有氨基的核苷 酸，所述氨基可以与例如预处理的固体载体的表面上存在的醛基形成 共价键。

间隔物部分应包含至少20个核苷酸、优选至少40个核苷酸、和 更优选至少90个核苷酸，并且包含约20-约120个碱基。

特别优选的是包含与下述序列具有至少60％同源性、优选至少80 ％、更优选至少90％的间隔物部分的捕获分子：

5′AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTC CTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC 3′(SEQ ID NO：2)(90 个碱基)。

特别优选的是包含与下述序列具有至少60％同源性、优选至少80 ％、更优选至少90％的间隔物部分的捕获分子：

5′ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCAC AACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA 3′(SEQ ID NO：3) (95个碱基)。

捕获分子的捕获部分可以包含对于在PCR期间生产的扩增子特异 的10-100个核苷酸，优选15-40个核苷酸，更优选20-30个核苷 酸。优选地，捕获分子的捕获部分包含10-600个碱基、优选20-50 个碱基、更优选15-40个碱基。

捕获分子可以通过其5′末端或通过其3′末端进行固定。

对于倍增，捕获分子以至少4种捕获分子/cm2、优选至少20种捕 获分子/cm2、更优选至少100种捕获分子/cm2的微阵列形式被固定在 固体载体的特异性定位区域中。载体上的捕获分子的密度为20-2000 fmoles/cm2。

在具体实施方案中，捕获分子包含10-100个核苷酸的捕获部分， 其与扩增子的特异性序列互补，从而使得所述捕获部分限定扩增子的 2个非互补末端，和具有至少20个核苷酸的间隔物部分，并且其中扩 增子的2个非互补末端分别包含间隔物末端和非间隔物末端，从而使 得间隔物末端与捕获分子的间隔物部分不互补，和所述间隔物末端超 过所述非间隔物末端至少50个碱基。

在优选实施方案中，样品中的生物学生物或生物的部分的鉴定和/ 或定量通过监控阵列的不同位置上的信号来进行，其中在扩增过程的 至少2个循环中的每个位置进行至少2次测量。随后处理数据。

在具体实施方案中，在位置上的测量在PCR扩增的每个循环时进 行。

在另一个优选实施方案中，阵列包含在载体的不同位置上结合的 至少4种不同的捕获分子/cm2固体载体表面。希望地，4种不同的单 链捕获分子能够与4种靶同源核苷酸序列特异性结合。

在优选实施方案中，将本发明的方法应用于包含核苷酸序列的样 品，所述核苷酸序列与样品中也可能存在的至少4种其他同源核苷酸 序列具有高于30％、优选超过60％、更优选超过80％的同源性。在 极端情况下，样品中存在的核苷酸序列与样品中也可能存在的其他同 源核苷酸序列相差1个核苷酸。

在另一个实施方案中，至少2种扩增子用至少2种捕获分子进行 检测，和其中所述至少2种捕获分子的捕获部分相差至少10％、优选 相差至少20％。

有利地，待扩增的核苷酸序列是同源核苷酸序列，其使用如 WO0177372中描述的通用引物在PCR期间在微阵列上进行定量。相同 引物用于扩增样品中可能存在的所有同源序列。用相同荧光染料标记 的扩增子对于不同的捕获分子进行区分，每一种靶向不同的同源序列。 如同仅一种引物对和一种荧光染料一样，测定法通过使用存在于微阵 列上的多种捕获探针进行倍增。因此本发明优选使用能够扩增具有超 过60％、优选超过90％同源性的至少2种靶序列的通用引物对，并包 含能够检测2种靶序列中的每一种的捕获分子的使用。

在一个实施方案中，通过相同引物对扩增序列的数目高于5种并 甚至高于20种，和扩增靶当存在于溶液中时在阵列上进行检测。

在具体实施方案中，本发明的方法包括从生物学生物或生物的部 分中提取对于那种生物特异的核苷酸序列的步骤。

在另一个优选实施方案中，PCR循环包含标记对于所述生物特异 的核苷酸序列，以形成标记的靶核苷酸序列。

在优选实施方案中，对于生物特异的核苷酸序列是DNA核苷酸序 列。

在备选实施方案中，对于生物特异的核苷酸序列是在PCR前逆转 录成cDNA的mRNA。

在另一个实施方案中，在至少一个PCR循环中使用引物对，和使 用相同引物对用于拷贝对于生物特异的核苷酸序列。

在具体实施方案中，捕获分子能够区分其为扩增子的一条链的靶 序列和与靶具有小于85％同源性的另一种扩增子序列。

在优选实施方案中，本发明的方法包括能够扩增具有超过60％、 优选超过90％同源性的至少2种靶序列的通用引物对的使用，并包括 能够检测2种靶序列中的每一种的捕获分子的使用。在具体实施方案 中，通用引物对能够扩增具有超过60％、优选超过90％同源性的至少 4种、优选至少10种、更优选至少20种靶序列，并包含能够检测4、 10或20种靶序列中的每一种的捕获分子的使用。

在另一个实施方案中，至少一个PCR循环包含耐热DNA聚合酶的 使用，所述耐热DNA聚合酶在25-300mM的盐浓度下是有活性的。优 选的盐是：谷氨酸钾、氯化钾和氯化钠。聚合酶优选是嗜热水生菌 (Thermus aquaticus)DNA聚合酶。耐热意指在一个PCR循环后仍保 留至少其50％的最初活性。在盐浓度中有活性的意指与在具有低于25

mM的盐的溶液中的活性比较，显示优选至少5％和更佳以及更佳至少 20％和再更佳至少50％其活性的酶。

靶核苷酸序列优选通过标记进行标记，和检测杂交扩增子的步骤 包括所述标记的检测。

在具体实施方案中，PCR循环包含用于扩增超过一种核苷酸序列 的超过一种引物对的使用。

在优选实施方案中，PCR循环包含具有与捕获分子序列不同的序 列的引物的使用。

在另一个实施方案中，生物特异的扩增子与捕获分子的杂交在预 定位置处形成单点信号，由此所述单点信号的检测允许区分特异性扩 增子与来自其他生物的同源扩增子。

在优选实施方案中，检测与捕获分子杂交的扩增子和PCR循环的 步骤都在1个室中进行。另外该室包含含有待扩增的特异性核苷酸序 列的溶液，以及用于核苷酸分子扩增的试剂和固定的捕获分子的阵列。

在另一个优选实施方案中，在检测杂交扩增子的步骤期间从阵列 中去除包含在室中的溶液。例如，移动室的位置以便在监控阵列的不 同位置上的信号期间从阵列中去除包含在室中的溶液。在具体实施方 案中，这种移动包含使室完全颠倒。

在优选实施方案中，该方法通过监控阵列的不同位置上的信号来 进行，其中在至少5个、优选至少10个PCR循环、更优选至少20个 PCR循环中的每个位置进行至少5次测量。随后处理数据。在具体实 施方案中，过程包括超过20个PCR循环，并且在前20个PCR循环期 间不进行测量。

在优选实施方案中，在PCR循环开始后，在预定时间点上测量信 号，并且所述预定时间在不同PCR循环时对于每个位置优选是相同的。

在另一个实施方案中，PCR循环包含退火步骤，和在退火步骤开 始后5分钟内、优选2分钟内、更优选1分钟内测量信号。

在另一个实施方案中，PCR循环包含3个温度步骤，并在PCR循 环的3个温度步骤中的至少一个结束时测量信号。

在备选实施方案中，通过在PCR循环的3个温度步骤中的至少一 个期间进行至少2次测量来随着时间监控信号。

在另一个实施方案中，PCR扩增使用至少20个PCR循环来获得， 每个循环包含变性、退火和延伸的3个步骤，由此每个循环在10秒- 6分钟、优选1-3分钟的时间段内进行。

在另外一个实施方案中，3个温度步骤随后为与捕获分子杂交的 步骤。任选地这种杂交在变性步骤后。

在优选实施方案中，捕获分子仅在杂交步骤期间与PCR溶液接触， 和检测的信号是在与不同PCR循环相关的杂交步骤期间扩增子在捕获 分子上积聚的结果。这个实施方案优选通过图8b中举例说明的6步骤 的扩增/检测循环获得。

在另一个实施方案中，捕获分子在杂交步骤和变性步骤期间与 PCR溶液接触，和检测的信号是在给定循环时扩增子在捕获分子上杂 交的结果。

在优选实施方案中，通过从在退火或延伸步骤时获得的第二种信 号中扣除在变性温度步骤时获得的第一种信号处理数据。变性步骤允 许分离扩增子的双链和分离杂交链与捕获分子。

在另一个实施方案中，测量关于每一个不同位置本底信号和的信 号，并通过从关于每一个不同位置的信号值中扣除本底信号处理数据。 优选地，本底信号是其中捕获分子结合的位置周围的局部本底。优选 地如de Longueville等人，2002(Biochem.Pharmacol.64，137-149) 所述进行点的定量和/或数据分析。

在优选实施方案中，通过使不同位置的信号值与固定值比较来获 得样品中生物学生物或生物的部分的定量。

在另一个实施方案中，通过使达到固定值所需的PCR循环数目 (CT)与参考核苷酸分子的CT比较来获得定量，所述参考核苷酸分子 优选是在与靶核苷酸分子相同的溶液中进行扩增，并在与靶核苷酸分 子相同的阵列上进行检测的核苷酸分子。备选地，通过使达到固定值 所需的PCR循环数目(CT)与其中CTs值针对标准浓度标绘的标准曲 线比较来获得定量。

在另一个备选实施方案中，通过比较至少2个循环的信号的动力 学常数来获得样品中生物学生物或生物的部分的定量。

生物的定量通过关于生物中存在的遗传元件的信号的定量来优选 进行。有利地，通过比较对于生物特异的靶的信号数据与加入分析溶 液中的标准拷贝的预定数目，就样品中的拷贝数而言进行特定生物的 定量。

在另一个实施方案中，通过比较对于生物特异的靶与对于家族特 异的靶的量相对于其家族进行一种生物的定量。

在具体实施方案中，不同靶的PCR扩增通过PCR来进行，所述PCR 具有有尾引物，并使用与有尾引物的尾部相同或互补的第二种引物。 在具体实施方案中，有尾引物用于扩增靶和标准。PCR溶液还包含与 有尾引物的尾部相同或互补的第二种引物。如Knut等人(Nucleic Acids Research，第31卷，第e62，2003页)描述的，具有共有尾部 的第一个有尾引物对针对特异性靶和/或标准，并且第二种引物对针对 尾部。他们还提出在用第二种引物对扩增5-40循环前破坏有尾引物。

在本发明的优选实施方案中，用有尾引物和第二种引物进行扩增， 两者从扩增开始都存在，而不破坏有尾引物。这种方法需要使用有尾 引物和第二种引物之间的合适比，前者比后者第至少5倍，优选低10 倍。

在具体实施方案中，待检测和/或定量的生物的部分是表达的基因 或mRNA，或其互补cDNA。该方法包括下述步骤：

将mRNA拷贝成cDNA，使用能够扩增来自相同生物的至少2种同 源核苷酸序列的引物对，通过至少2个PCR循环将所述cDNA或其部分 扩增成双链靶核苷酸序列；

使所述靶核苷酸序列与单链捕获分子接触，所述单链捕获分子在 阵列的位置中与不溶性固体载体共价结合，和其中所述捕获分子包含 能够与所述靶核苷酸序列特异性结合，而不与所述至少4种其他同源 核苷酸序列结合的10-600个碱基的捕获部分，以及检测所述靶核苷 酸序列与所述捕获分子的特异性杂交，其中捕获分子上的杂交与用于 鉴定和/或定量样品中的生物学生物或生物的部分的实时PCR过程组 合在一个过程中。

在具体实施方案中，通过使用用于扩增的引物对拷贝核苷酸序列。

在另一个实施方案中，在相同测定法中扩增和鉴定和/或定量样品 中存在的1-4种核苷酸序列、优选1-20种核苷酸序列。

有利地，本发明的方法可以用于鉴定和/或定量组分或(微)生物 的几个群、亚群或亚亚群的存在。彼此相关的组分使用通用引物进行 扩增。预期可能存在于样品中的可能的个体遗传序列(核苷酸和/或氨 基酸序列)将与相应的特异性捕获分子结合，这在预期位置处形成信 号。这允许鉴定对于组分或包含所述组分的(微生物)的群、亚群或 亚亚群特异的靶。

例如，通过本发明的方法鉴定的生物组分可以是相同(微)生物 特异的或不同(微)生物特异的不同核苷酸序列。所述分子的例子是 呈现高同源性的同源核苷酸序列，例如受体、HLA分子、细胞色素P450 等。

此外，本发明人已发现可以显著简化此类生物样品中存在的许多 其他中的一种或几种(微)生物或其部分的鉴定或定量。通过检测、 定量和/或可能地记录阵列上单个信号的存在，所述信号独特地起因于 特异性捕获分子及其相应的靶核苷酸序列，通过组合使用共同引物对 的单次扩增和可能的(微)生物或其部分的鉴定来获得鉴定和/或定量。 随后所述检测的靶核苷酸序列的存在与对于所述(微)生物特异的核 苷酸序列的身份相关。

这意指本发明的方法将允许容易的鉴定和/或检测在其他同源序 列中的特异性序列，以及其靶核苷酸序列的定量，所述靶序列具有对 于特定(微)生物特异的核苷酸序列。

在本发明的优选实施方案中，通过检测和可能地记录在其中先前 结合特异性捕获分子的一个特定位置处的单点信号，在扩增循环期间 无需洗涤而直接获得此类鉴定和/或定量，并且甚至在可能的污染物的 存在下。鉴定不是微阵列上的特定模式的分析结果，如在现有技术系 统中提出的。因此，本发明的方法不一定需要如由现有技术系统要求 的通过图像处理工具和相应的软件详细分析模式。

本发明通过下述发现变得可能，作为单链存在的靶序列，甚至连 同在相同溶液中存在的其互补链，可以通过使用由至少2部分组成的 结合捕获分子在具有高灵敏度的阵列上与其他同源序列区分开，所述 2部分一个是由与载体(优选非孔载体)单一和有利地预定(限定) 连接结合的间隔物部分，和其为能够与核苷酸靶序列杂交的特异性核 苷酸序列的另一个部分一一捕获部分。

当高浓度的捕获分子与固体载体的表面结合时，这种检测得到增 加。

此外，当相对于杂交扩增子链的游离末端捕获分子的捕获部分的 位置对应下述特征时：位于捕获分子的间隔物部分侧的扩增子的游离 末端(间隔物末端)超过位于溶液中的游离末端(非间隔物末端)至 少50个碱基，检测得到极大增加。

高浓度、长核苷酸序列和捕获分子的捕获部分的特异性设计的使 用产生允许本发明的未预料到的特有特征。DNA杂交的理论提出溶液 中的2个DNA互补序列之间的杂交率与DNA长度的平板根成比例，较 小的序列是限制因素(Wetmur和Davidson，J.Mol.Biol，第3卷， 第584页，1968)。为了获得所需特异性，与靶比较，捕获分子的特 异性序列将必须很小。此外，靶通过PCR扩增来获得并且是双链的， 从而使得它们在溶液中再结合比它们在固定在固体载体上的小序列上 杂交快得多，在固体载体中扩散很低从而使反应速率甚至减少更多。 在使用短特异性捕获部分序列的杂交的得率中观察到大增加是未预料 的。在本发明中，在PCR的不同循环期间进行检测。这意指扩增子不 能被切割，因为否则扩增将在后续循环中终止。结果是甚至更加未预 料的，因为就必须与2个完全不同过程相容的装置、溶液和物理参数 而言，检测与PCR循环相容：在固体载体阵列上完整扩增子的特异性 扩增和特异性检测。同样未预料到的是下述事实，读数可以在1-5 分钟内并甚至在退火步骤期间完成，从而使得所需扩增时间不或仅略 微延长超过在反应管中进行的常规PCR。

本发明还涉及鉴定得自生物学(微)生物或其部分的靶核苷酸序 列，特别是来自至少4种其他同源(微)生物或其部分的生物样品中 可能存在的基因。这些其他(微)生物可能存在于相同生物样品中， 并且具有与靶同源的核苷酸序列。

所述鉴定最好通过经由共同引物对基因扩增所述核苷酸序列(靶 和同源序列)获得。可以获得可能的不同靶扩增核苷酸序列之间的区 分。通过在阵列的表面上杂交扩增序列有利地获得这种区分。阵列包 含在给定位置处对于靶核苷酸序列特异的捕获分子，所述靶核苷酸序 列对于生物样品中可能存在的每种(微)生物特异。通过鉴定和可能 地记录信号来检测特异性靶核苷酸序列，所述信号起因于这种靶核苷 酸序列与其相应的捕获分子在预期位置处的特异性结合。

根据本发明，用于基因扩增的优选方法是使用2种反向平行的通 用引物的PCR，所述通用引物可以识别所有所述靶同源核苷酸序列， 但也可以使用其他基因扩增方法。

(微)生物可以存在于任何生物材料或样品中，包括得自病毒、 真菌、细菌、植物或动物细胞包括人体的遗传材料。生物样品还可以 是其中存在微生物、异生物质或污染物质的任何培养基，以及得自植 物或动物(包括人)器官、组织、细胞或生物学体液(血液、血清、 尿、唾液等)的提取物。

可以通过使用生物学生物或生物的部分的特异性鉴定(诊断和/ 或定量)试剂盒来进行根据本发明的方法，所述试剂盒包含用于执行 本发明的方法的工具和介质。具体地，优选试剂盒包含：

-在其上共价结合单链捕获分子的不溶性固体载体表面，根据阵 列将所述捕获分子排列在固体载体的表面上，其中所述阵列包含在载 体的不同位置处结合的至少4种不同单链捕获分子/cm2固体载体表 面，和其中所述捕获分子包含10-600个碱基的捕获部分，其能够与 所述生物或其部分的核苷酸序列特异性结合，

-用于执行基因扩增连同鉴定和/或定量来自所述生物或其部分 的扩增核苷酸序列的反应室，其中实时进行关于生物的任何扩增序列 的存在的检测和基因扩增。

在优选实施方案中，捕获分子与至少4种同源靶序列特异性结合， 所述同源靶序列为待检测和/或定量的生物或其部分的扩增核苷酸序 列。

在优选实施方案中，捕获分子能够与具有高于30％、优选高于60 ％、更优选超过80％的同源性的靶序列特异性结合。

在另外一个优选实施方案中，捕获分子的捕获部分具有低于90％ 并仍低于80％的序列同源性。

在优选实施方案中，阵列包含在载体的不同位置处结合的，至少 4种和优选20种不同的单链捕获分子/cm2固体载体表面的密度。

在另外一个实施方案中，阵列包含在载体的不同位置处结合的， 至少100种和优选300种不同的单链捕获分子/cm2固体载体表面的密 度。

在一个实施方案中，反应室由彼此流体接触的2个区室组成。

在另外一个实施方案中，提供具有含结合的捕获分子的阵列的一 个区室。

在另一个实施方案中，诊断和/或定量试剂盒进一步包含：dNTPs、 耐热DNA聚合酶和缓冲液。更完全的试剂盒还将包含引物。

在优选实施方案中，诊断和/或定量试剂盒进一步包含待用作内部 标准的核苷酸分子。

在另一个实施方案中，载体和反应室是药筒的部分。

在试剂盒的优选实施方案中，能够与其相应的靶核苷酸序列杂交 的捕获分子的特异性序列(捕获部分)具有15-50个碱基的序列，或 备选地通过至少6.8nm的间隔物部分与固体载体的表面分开。

在试剂盒的另一个实施方案中，间隔物部分是超过20个碱基、优 选超过40个碱基、更优选超过90个碱基的核苷酸序列。

在根据本发明的试剂盒中，捕获分子存在于具有1微米2-75mm2 和优选0.005-0.2mm2的表面积的不溶性固体载体上的定位区域中。

根据本发明方法、试剂盒和装置特别适合于鉴定靶。优选地靶存 在于生物学(微)生物或其部分中。靶可以存在于其中还存在至少4、 12、15种或甚至更多同源序列的生物样品中。由于高同源性，所述核 苷酸序列可以通过通用引物进行扩增，从而使得靶核苷酸序列的鉴定 通过在其与相应的捕获分子结合后区分特异性获得，所述相应的捕获 分子先前结合在微阵列上的给定位置处。当捕获分子通过机器人、以 高密度并根据阵列点样在固体载体表面上时，灵敏度可以得到更大增 加。本发明的优选实施方案是使用点样在阵列上的捕获分子的量，导 致约0.01-约5pmoles等价序列/cm2固体载体表面的结合。

根据本发明的试剂盒还可以掺入用于执行根据本发明的方法的各 种介质或装置。所述试剂盒还可以包括在自动化仪器中，例如高流通 量筛选仪器，用于检测和/或定量待分析的生物样品中存在的多种核苷 酸序列。所述试剂盒或仪器可以适合于执行根据本发明的方法的所有 步骤或仅几个特定步骤。

在根据本发明的方法和试剂盒中，结合的捕获分子的长度优选为 约30-约600个碱基，更优选约40-约400个碱基，并再更优选约 40-约150个碱基。可以使用更长的核苷酸序列，如果它们不减少靶 核苷酸序列的结合得率，如可以起因于其采用基于发夹的二级结构， 或通过彼此相互作用。

在优选实施方案中，能够与其相应的靶核苷酸序列杂交的捕获分 子的特异性序列(即捕获部分)通过具有至少6.8nm的长度的间隔物 部分与固体载体的表面分开，所述长度相应于至少44个碳键。

间隔物部分是超过20个核苷酸，优选长于40个核苷酸，更优选 长于90个核苷酸的核苷酸序列。核苷酸可以包含核苷酸衍生物，例如 PNA。

在优选实施方案中，捕获分子的特异性序列的长度为约10-600 个碱基，优选20-50个碱基，更优选15-40个碱基。

在另一个优选实施方案中，所有捕获分子是长度超过100个碱基 的多核苷酸。

在另一个实施方案中，捕获分子与结合至固体载体的聚合物分子 连接。聚合物优选是至少10个原子的链，优选选自聚乙二醇、聚氨基 酸、聚丙烯酰胺、聚氨基糖、聚糖精(polyglucides)、聚酰胺、聚 丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚环氧化物或聚酯(可能分支的聚合物)。

在具体实施方案中，反应室包含在扩增过程期间制成防水的入口 和出口。

在另一个实施方案中，室是不对称的，其中第一个部分具有比第 二个部分更低的高度。在这个实施方案中，阵列优选存在于室的第一 个部分上。

在具体实施方案中，室被制成通过微通道彼此流体接触的2个部 分，其中一个部分具有微阵列。在具体设计中，微通道具有不超过3mm， 优选小于1mm的宽度。

在具体实施方案中，载体和/或室材料选自玻璃、电子装置、硅载 体、塑料载体、硅石、金属及其混合物，其中所述载体以选自载片、 圆盘、凝胶层和微珠的形式进行制备。

在另外具体的实施方案中，载体和/或室材料包含环烯烃聚合物， 优选或(Zeon Chemicals，Louisville，USA)、Topas、 Udel、Radel或THV。

如果待检测的序列之间的同源性很低(30-60％)，那么对于每 一个单个靶序列特异的序列的部分可以用于设计特异性捕获分子。然 而，发现足够保守以提供“共有”序列的序列的部分更加困难，所述 “共有”序列将扩增或拷贝所有所需序列。如果一对通用引物不足以 扩增所有同源序列，那么使用2个或更多引物对的混合物，以便获得 所需扩增。通过相同通用引物扩增的同源序列的最低数目是2，但不 存在关于这个数目的上限。

如果序列显示高度同源性，高于60％并甚至高于90％，那么容易 获得用于通用引物的共有序列的发现，但用于特异性捕获分子的选择 变得更加困难。

在本发明的另一个优选实施方案中，捕获分子是短于100个碱基 的化学合成的寡核苷酸序列(在程序化自动合成仪上容易进行)。此 类序列可以具有用于与载体共价附着的官能化基团。

优选通过(PCR)扩增掺入包含捕获分子的捕获部分和间隔物部分 的质粒内的序列合成更长的捕获分子。

在根据本发明的方法中，捕获分子的捕获部分包含约3-约60个 碱基，优选约15-约40个碱基和更优选约20-约30个碱基。这些碱 基优选指定为位于捕获分子的一个末端处或附近的连续序列。这个部 分视为用于检测的特异性序列。在本发明的优选实施方案中，位于捕 获部分和载体之间的序列是非特异性序列，优选地间隔物部分。

在本发明的另一个实施方案中，包含约3-约60个碱基、优选约 15-约40个碱基和更优选约20-约30个碱基的捕获部分位于约30 -约600个碱基的捕获分子上。

根据本发明的方法适合于检测和/或定量由DNA或RNA制成的靶， 包括在其总长上部分或全部同源的序列。

即使当靶呈现与其他分子大于30％、大于60％和甚至大于80％ 的同源性(或序列同一性)时，也可以执行根据本发明的方法。

在根据本发明的方法中，捕获分子有利地与不溶性固体载体共价 结合(或固定)，如下文所述的优选通过其末端之一。

根据本发明的方法给出允许鉴定(检测和定量)在溶液中的扩增 子的结果，所述扩增子浓度为低于约10nM、低于约1nM、优选低于 约0.1nM和更优选低于约0.01nM(＝1fmole/100微升)。

本发明的另一个重要方面是在表面上使用极浓缩的捕获分子。如 果这个浓度太低，那么结合的得率可能是无法检测的。优选在点样溶 液中约600-约3,000nM的捕获分子浓度。然而，在有利的情况下(当 共价固定的得率很高时或当待检测的靶是单链并以高浓度存在时)， 低至约100nM的浓度仍给出阳性结果。此类低点样浓度对应低至20 fmoles/cm2的捕获分子密度。另一方面，更高的密度在测定法仅受捕 获溶液的浓度限制。高于3,000nM的浓度给出良好结果。

与存在的捕获分子的量比较，在点上“结合”的靶的量很小，并 且与溶液中存在的靶分子比较，也很小。

在一个实施方案中，对于在扩增或拷贝后获得的全长序列进行检 测。当通过掺入标记核苷酸进行标记时，更多的标记存在于杂交靶上， 使得测定法灵敏。

在一个实施方案中，根据本发明的方法包括其他结合的捕获分子 的使用，其具有与先前那种相同的特征并且用于鉴定来自另一群同源 序列的靶。这些同源序列优选通过通用引物进行扩增。

在微生物领域中，优选使用对于微生物的每个科或属特异的通用 引物进行扩增，然后根据本发明通过使用捕获分子在阵列上鉴定这些 各种科的一些或所有物种。在相同阵列上可以有利地进行其他序列的 检测(例如，通过允许与用于定量的标准核苷酸序列杂交，与用于相 同或不同微生物菌株的共有捕获分子杂交，与允许检测经由微生物的 可能的抗生素抗性基因或用于杂交的阳性或阴性对照的序列杂交)。 所述其他捕获分子可以具有长于10-60个碱基和高至600个碱基的总 长度的特异性序列，并且还与不溶性固体载体结合(优选在与本发明 相关的其他结合的捕获分子制成的阵列中)。长捕获分子还可以作为 共有捕获分子存在于阵列上，用于与来自相同科或属的微生物的所有 序列杂交，从而给出关于生物样品中此类科、属的微生物的存在与否 的信息。

在具体实施方案中，相同阵列还具有对于细菌群特异的捕获分子， 和作为对于革兰氏阳性或革兰氏阴性菌株，或甚至所有细菌的特异性 应用。

另一种应用是来自相同物种的共有蛋白质例如各种细胞色素 P450的同源基因的检测，通过特异性捕获分子伴随或不伴随对于生物 样品中可能存在的所有细胞色素P450的共有捕获分子。通过逆转录成 cDNA在基因水平上进行此类检测。

根据本发明的固体载体优选由选自玻璃、电子装置、硅载体、塑 料载体材料、硅石、金属及其混合物的材料以诸如载片、光盘、凝胶 层、层、微珠的形式制成。有利地，所述固体载体是单个载玻片，其 可以包含用于改善根据本发明的方法的另外工具(条形码、标记等) 或介质。优选载体之一包含具有化学和热稳定性、低荧光和光稳定性 的聚合物，优选环烯烃聚合物，优选或(Zeon Chemicals，Louisville，USA)或但不限于Topas、Udel、Radel或 THV。

有利地通过众所周知的扩增方案来获得在根据本发明的方法中使 用的扩增步骤，所述扩增方案优选选自PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、 ICR或Avalanche DNA技术。

有利地，待鉴定的靶核苷酸序列在其与单链捕获分子杂交前进行 标记。优选还在变性前在扩增序列上获得所述标记(使用对于本领域 技术人员已知的技术)(如果该方法包括扩增步骤)。

有利地，靶核苷酸序列的长度选择为有限长度，优选50-2000 个碱基、更优选200-800个碱基。这种优选需求依赖发现通用引物以 扩增样品中可能存在的所需序列的可能性。太长的靶核苷酸序列可以 更快地再分配，并采用可能抑制在捕获分子上的固定的二级结构。

通过经由通用引物进行mRNA的逆转录获得同源表达基因的检测， 优选通用引物是polydT。在一个实施方案中，如本文所描述的，随后 通过通用引物扩增逆转录的cDNA。

根据本发明的进一步方面，根据本发明的方法有利地用于鉴定不 同葡萄球菌属(Staphylococcus)物种或变种，优选金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、 溶血性葡萄球菌(S.hominis)或(S.haemolyticus)。对于可能一 起或分开存在于生物样品中的这种类型的同源器官，通过检测所述不 同物种中的FemA基因的遗传变体来获得鉴定，优选通过使用FemA遗 传序列中的共同位置。在本发明的另一个方面中，在阵列上通过相同 引物扩增和鉴定后可以检测16个葡萄球菌属物种。

本发明的进一步方面是检测分枝杆菌属(Mycobacteria)物种、 结核分枝杆菌和其他物种，优选鸟分枝杆菌(M.avium)、胃分枝杆 菌(M.gastrii)、戈登分枝杆菌(M gordonae)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasi)、莫尔墨埃斯分支杆菌(M.malmoense)、海洋分枝杆菌(M. marinum)、瘰疬分支杆菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M. simiae)、苏加分枝杆菌(M.szulgai)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、 溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)。

在本发明的进一步应用中，一种阵列可以特异性检测来自属于相 同属的几个细菌物种或来自几个属的扩增序列，所述几个属如葡萄球 菌属、链球菌属、肠球菌属、嗜血菌属或不同细菌物种和属于革兰氏 阳性菌和/或革兰氏阴性菌的属。

优选地，促旋酶(亚单位A)序列的引物和特异性部分用于获得 扩增产物。已选择这些引物作为通用引物用于扩增测试的所有细菌的 促旋酶基因，并且它们可能将扩增来自许多其他可能的细菌物种和属 和科的促旋酶。

本发明特别适合于检测术语下述属科中的至少2个的细菌：葡萄 球菌属、肠球菌属、链球菌属、嗜血菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、 弯曲杆菌属(Campylobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、奈瑟球 菌属(Neisseria)、变形杆菌属(Proteus)、沙门菌属(Salmonella)、 西蒙斯氏菌属(Simonsiella)、里默氏菌属(Riemerella)、埃希氏 菌属(Escherichia)、奈瑟球菌属(Neisseria)、脑膜炎球菌属 (Meningococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、金氏杆菌属 (Kingella)、色杆菌属(Chromobacterium)、布兰汉氏球菌属 (Branhamella)。

相同应用被开发用于G蛋白偶联受体(GPCR)。这些受体结合所 有种类的配体，并且通过调节转录因子的活性负责至细胞质以及经常 至核的信号转导。形成通用引物用于各种亚型的GPCR用于多巴胺以及 用于血清素和组胺。对于组胺和其他配体同样可能。各种HLA类型的 检测也是本发明的应用之一。HLA是从一个个体到另一个不同的同源 序列。HLA类型的测定在组织移植中特别有用，以便测定供体和受体 之间的相容性程度。它还是用于免疫接种的有用参数。考虑到同源序 列之间的大量亚型和紧密联系，一般不可能完全区分一种序列与所有 其他序列，并且对于它们中的一些，存在1次或2次交叉反应。在这 种情况下，在阵列上加入与扩增序列的另一个位置互补的第二种捕获 分子，以便使得鉴定完全。

还可以通过根据本发明的方法进行多态性序列(即使仅相差1个 碱基，它们也可以视为同源的)的检测。细胞色素P450形式的区分是 本发明的一个重要应用，因为某些同种型的存在改变某些药物的代谢。 发现本发明对于区分细胞色素P4502D6、2C9和2C19的同种型特别有 用。更一般地，本发明特别良好地适合于给生物基因分型，或用于区 分称为单核苷酸多态性(SNP)相差1个碱基突变或缺失的序列。本发 明的独特特征在于对于扩增序列直接进行杂交步骤，无需拷贝成RNA 并将它们切割成碎片。

此外，一种阵列可以特异性检测来自属于几个科的几个动物物种 和属的扩增序列，所述几个科如(Galinacea)、兔科(Leporidae)、 猪科(Suidae)和牛科(Bovidae)。

一种阵列可以特异性检测来自几个科例如鲭科(Scombridae)、 鲑科(Salmonidae)、无须鳕科(Merluccidae)、鲽科 (Pleuronectidae)、鳕科(Gadidae)和鲱科(Clupeidae)的属于 几个属例如舵鲣属(Auxis)、狐鲣属(Sarda)、鲭属(Scomber)、 金枪鱼属(Thunnus)、(Oncorhynch)、鲑属(Salmo)、无须鳕属 (Merluccius)、鲽属(Pleuronectes)、Platichtlys、马舌鲽属 (Reinhardtius)、青鳕属(Pollachius)、鳕属(Gadus)、沙丁 鱼属(Sardina)的几个鱼类物种例如太平洋鳕(G.morhua)、大头 鳕(G.macrocephalus)、川鲽(P.flesus)、无须鳕(M.merluccius)、 虹鳟(O.mykiss)、鲽(P.platessa)、青鳕(P.virens)、大 西洋鲑(S.salar)、欧洲沙丁鱼(S.pilchardus)、扁舵鲣 (A.thazard)、长鳍金枪鱼(T.alalunga)、大眼金枪鱼(T.obesus)、 马舌鲽(R.hippoglossoides)、欧鳟(S.trutta)、狐鲣(S.sarda)、 蓝鳍金枪鱼(T.thynnus)、鲭鱼(S.scombrus)的扩增序列。其他 同源序列允许测定属于几个科的植物物种和属，例如马铃薯、番茄、 稻属、玉蜀黍属、大豆、小麦、大麦、豆、胡萝卜。

根据本发明的进一步方面，根据本发明的方法有利地用于鉴定肉 类的起源。

优选地，细胞色素b序列的引物和特异性部分用于获得扩增产物。 已选择这些引物作为通用引物用于扩增测试的所有动物的细胞色素B 基因，并且它们可能将扩增来自许多其他动物物种和属和科的细胞色 素B。

根据本发明的进一步方面，根据本发明的方法有利地用于鉴定鱼 类的起源。

根据本发明的进一步方面，根据本发明的方法有利地用于鉴定植 物的起源。

优选地，用于获得扩增产物的蔗糖合酶序列的引物和特异性部分 是下文在实施例中描述的那些。已选择这些引物作为通用引物用于扩 增测试的所有植物的蔗糖合酶基因，并且它们可能将扩增来自许多其 他植物物种和属和科的蔗糖合酶。

根据本发明的进一步方面，根据本发明的方法有利地用于鉴定基 因修饰生物(GMOs)。通过将一种或多种外部基因连同其他调节或构 建序列插入生物的基因组内来产生GMOs。

优选地，用于获得扩增产物的所述蔗糖合酶序列的引物和特异性 部分是下文在实施例中描述的那些。已选择这些引物作为通用引物。

根据本发明的进一步方面，如上文引用的例子中提供的以及实施 例1-2中呈现的，根据本发明的方法有利地用于鉴定生物或其部分。

本发明的另一个方面涉及包含所述上述序列(特别是实施例中描 述的特异性捕获分子)的生物芯片或微阵列的任何部分，以及通过任 何方法在任何类型的微阵列或生物芯片上与同源序列区分，用于鉴定 对于科类型的所述(微)生物特异的靶序列的一般筛选方法。

通过一系列描述的方法但不限于下文呈现的那些在阵列上检测杂 交靶，只要它们与由PCR给出的限制相容。已提出非标记方法，其可 应用于阵列上并且基于通过目前应用于阵列的质谱法(美国专利号 5,821,060)或通过？鉴定靶。

标记相关的检测方法众多。WO 97/27317中给出了不同标记分子 的综述。它们使用已标记的引物获得，或通过在拷贝或扩增步骤期间 酶促掺入标记核苷酸或通过嵌入剂随后为荧光检测(WO 97/27329)。

优选标记是用荧光检测器以高灵敏度检测的荧光染料。荧光染料 包括但不限于，适合于通过使用商购可得的阵列扫描仪(如可从例如 General Scanning，Genetic Microsystem获得)分析阵列的花青苷 染料(Cy3、Cy5和Cy7)。优选地，关于花青苷3的激发波长为540 -558nm，其峰值在550nm处，并且发射波长为562-580nm，其峰 值在570nm处。

优选地，关于花青苷5的激发波长为639-659nm，其峰值在649 nm处，并且发射波长为665-685nm，其峰值在670nm处。优选地， 关于花青苷7的激发波长为733-753nm，其峰值在743nm处，并且 发射波长为757-777nm，其峰值在767nm处。

在本发明的优选实施方案中，与溶液中的荧光比较，与捕获分子 上存在的扩增子相关的荧光信号的检测产生阵列上的信号增加。在具 体实施方案中，阵列上存在的荧光染料的检测差异基于与溶液中的游 离移动分子比较，与捕获分子如DNA双螺旋上杂交的结合分子相关的 荧光染料的各向异性中的差异。各向异性依赖待检测的荧光染料的移 动性和寿命。关于在阵列上的各向异性的测定方法目前可从 Biotechnologies Inc.，238 East Caribbean Drive，Sunnyvale， CA 94089(http://www.blueshiftbiotech.com/dynamicfl.html) 获得。

在具体实施方案中，荧光团分子的检测优选以时间分辨方式获得。 荧光分子具有与发射过程相关的荧光寿命。一般地关于小荧光团如荧 光素和罗丹明的寿命为2-10纳秒范围。时间分辨荧光(TRF)测定法 使用长命(>1000ns)荧光团，以区分测定法信号与短命干扰例如基 质或荧光样品的自体荧光，其几乎一直具有比10ns少得多的寿命。 寿命优选通过在附近存在与其发生共振能量转移的另一种荧光团或猝 灭剂得到调节。用于TRF的器械只是使发射的测量延迟直至短命荧光 已消失和长命报道荧光仍持续后。荧光寿命可以以2种基本方式进行 测定。时域技术使用极短脉冲(皮秒)的激发，然后随着纳秒寿命过 去实时监控发射。使衰变曲线与指数拟合产生寿命。频域技术以兆赫 频率调节发射，然后观察响应的发射强度波动。时相延迟和振幅调节 随后可以用于测定寿命。关于快速和经济的寿命成像的频率技术目前 可从Blueshift Biotechnologies Inc获得。

在本发明的优选实施方案中，检测杂交扩增子的步骤在溶液中产 生比在杂交捕获分子上更低的扩增子荧光信号。

在具体实施方案中，通过荧光染料的猝灭获得与杂交扩增子比较 在溶液中较低的扩增子荧光信号。用荧光染料标记引物，所述荧光染 料当在溶液中游离时是荧光的，并且当掺入扩增子内时被猝灭。优选 通过使用掺入第二条非荧光扩增子链内的猝灭剂来获得荧光猝灭，所 述猝灭剂例如但不限于Dabcyl。一个具体实施方案使用PlexorTM技术 (Promega)。这种技术利用2种经修饰的核苷酸之间的高特异性相互 作用：异鸟嘌呤(iso-dG)和5′-甲基异胞嘧啶(iso-dC)。在实时 PCR反应中，合成在5′末端处具有iso-dC残基和荧光染料的一种引物。 第二种引物是未标记的。在反应混合物中包括经修饰以包括Dabcyl 作为猝灭剂的Iso-dGTP核苷酸。在扩增期间仅与iso-dC残基互补的 位置处掺入Dabcyl-iso-dGTP，并且作为2种残基之间的紧密接近的 结果，荧光被猝灭。在捕获分子上携带荧光染料的扩增子链的杂交将 恢复荧光发射。

在备选实施方案中，通过存在于溶液中和固定在捕获分子上的扩 增子之间的荧光激发的最佳波长中的差异获得在溶液中较低的扩增子 信号。在另外一个实施方案中，通过存在于溶液中和固定在捕获分子 上的扩增子之间的荧光发射的最佳波长中的差异获得在溶液中较低的 扩增子信号。

优选地，通过荧光共振能量转移(FRET)获得荧光发射波长中的 差异。在一个具体实施方案中，用具有给定最近荧光发射波长并充当 供体的荧光染料(F1)标记引物，所述荧光染料在溶液中在其激发波 长处进行激发时是荧光的。在荧光染料受体(F2)附近将引物掺入扩 增子内将导致不同于荧光染料F1的最佳荧光发射波长。通过检测在对 应F1的最佳发射的波长处的荧光发射，信号对于杂交扩增子将是最佳 的，并对于存在于溶液中的扩增子将是更低的。特别地，合成在5′末 端处具有iso-dC残基和荧光染料供体(即TAMRA)的引物，并且溶液 包含经修饰以包括荧光染料受体(即，Cy5)的Iso-dGTP核苷酸。在 PCR期间，如先前对于PlexorTM技术(Promega)解释的，形成具有紧 密接近的2种荧光染料的扩增子。随后使用对于供体最佳的激发/发射 波长进行检测。由于供体和受体之间的紧密接近，检测出的荧光在溶 液中减少。在捕获分子上携带供体的扩增子链的杂交将恢复最佳荧光 发射。

上述方法允许在溶液中存在的和在捕获分子上杂交的扩增子之间 的更好区分。

在另一个优选实施方案中，优选对于与捕获分子结合的靶上存在 的荧光团，而不是溶液中存在的荧光团上的那种获得荧光团分子的激 发。在优选方法中，通过集中于阵列的表面上的激光束获得激发。具 有激光束的聚焦的扫描仪方法使用包括针孔的共焦扫描方法。许多此 类扫描仪是商购可得的，例如来自 Life的 扫描仪系列、Affymetrix 428扫描仪、Virtek Vision Chipreader系列等。某些基于荧光激光的检测目前可用于多孔形式， 如例如来自Tecan(Tecan Trading AG，，Switzerland(http: //www.tecan.com/)的Safir。它们可以适合于本发明。

在另一个实施方案中，通过照射阵列基质侧获得荧光染料的激发， 以便产生对于接近于表面的分子的激发。在优选实施方案中，用于检 测信号的装置包含照射不溶性固体载体侧的光源。如由Aurora Photonics Inc.26791 West Lakeview，Lake Barrington，USA (info@auroraphotonics.com)提出的，光源优选是非校准激光源或 经由一对光纤维束的发光二极管。

在另外一个实施方案中，通过在其上固定捕获分子的纤维光学提 供荧光激发。US 6,503,711提供了基于使用等于或大于光学元件相互 作用表面的折射率的固定层折射率的系统，从而使得在固定层中的荧 光团的直接激发导致靶核酸的检测。

某些荧光标记可以是特别有利的，例如具有荧光性质的纳米晶体 颗粒。最常用的是量子点(Han等人，Nature Biotechnology，第19 卷，第631页，2001)。它们是荧光的并且随着时间或用照射不漂白。 它们的稳定性使得它们特别适合于在如本发明中提议的连续读数中使 用。此外，它们包含对于这些颗粒赋予特定性质的金属，从而使得除 荧光外的其他方法可以用于监控其与捕获分子的附着。这些颗粒的热 加热是可以随着时间监控的参数之一。金属吸收光束优选地激光束的 能量并诱导颗粒加热的事实，已用作用于检测载体上的低密度金颗粒 的基础，并且甚至检测单一颗粒(Boyer等人，Science，第297卷， 第1160页，2002)。该方法称为光热干涉差。

用于检测微阵列的捕获分子上的靶分子结合的直接方法是基于非 线性生成频率光谱法(GFS)的光学过程的化学绘图法(L.Dreesen 等人，Chem Phys Chem，第5卷，第1719页，2004)。这种技术允许 以亚微米空间分辨率实时成像表面和界面的震动性质。通过在基质的 表面上混合2个激光束获得测量，一个具有可见光(绿色)中的固定 频率，和另一个具有红外线中的可变频率。通过测量由样品发出的光 以红外激光束的频率函数获得在界面处的震动标记。这种方法避免标 记待检测的靶并因此它表示具体实施方案。

用于直接测量纳米颗粒的另一种技术是雷利散射。这种方法基于 适应的光束的使用，以便获得金属颗粒中的电子的振动，从而使得从 颗粒获得可以检测的电磁辐射(Stimpson等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，第100卷，第11350页，2003)(通过使用光波导器实时检测在 寡核苷酸阵列上的DNA杂交和解链)。然而，迄今为止该方法缺乏用 于应用于生物样品所需的灵敏度。

备选地，雷利散射和表面等离子体共振可以应用于本发明中，所 述技术已广泛用于检测抗体/抗原结合，并且还充分适合于阵列的多参 数测量和适合于对于生物样品的所需灵敏度。(Thiel等人， Analytical Chemistry，第69卷，第4948页，1997)。

在另一个实施方案中，可以应用石英晶体微量天平，其目前足够 灵敏，使得它们可以测量小于1纳克的质量变化(参见Caruso等人， Analytical Chemistry，第69卷，第2043页，1997)。这是用于实 时微阵列检测的一种建议。

悬臂是用于检测微阵列上的DNA的另一个选择。(McKendry等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第9783页，2002)。

此外，另一种技术是考虑其金属性质的纳米颗粒的电检测。首先 应用电化学检测，但具有低灵敏度。更先进和更灵敏的方法是通过差 示脉冲伏安法的检测(Ozsoz等人，Analytical Chemistry，第75卷， 第2181页，2003)。

金属的电阻率和电容性质在电子芯片上待检测的最佳性质中。2 个电极之间的金属的存在诱导芯片或电极的电性质中的变化，包括电 容和/或阻抗的电阻率或导电性的变化。当捕获分子存在于电极之一上 时，随后观察到DNA或蛋白质的检测(Moreno-Hagelsieb等人， Sensors and Actuators B-Chemical，第98卷，第269页，2004)。 金标记的DNA的电容测定法已由Guiducci等人(Biosens Bioelectron，第19卷，第781页，2004)描述。因为可以制备包含 几个小块的电子芯片，所以可以在不同小块上检测不同靶，并且可以 记录电阻率或电容中的变化。一种有希望的方法是允许阵列模式和电 极上的位置之间的相容性的交错电极的使用。尽管这些方法仍不能产 生由生物样品要求的可靠和灵敏检测，但其中一些仍成功实现实时检 测的需求(参见由Foultier等人，IEE Proc.Nanobiotechnol.，第 152卷，第3页，2005的关于纳米颗粒的检测方法的综述)。

用于检测颗粒的另一种方法是通过例如由Blab等人 (BiophysicalJ.，第90卷，第L13页，2006)描述的光学方法，根 据其在阵列上的位置计数其。该方法依赖围绕NanoAbsorder的激光诱 导散射(Laser Induced Scattering around a NanoAbsorder)(LISNA)。 它提供在阵列的每个点上的单个纳米颗粒的直接计数。

在优选实施方案中，在阵列的不同位置上监控的信号选自：比色 法、荧光、时间分辨荧光、光热干涉差、雷利散射、拉曼散射、表面 等离子体共振、质量的改变、石英晶体微量天平、悬臂、差示脉冲伏 安法、通过非线性生成频率光谱法的化学绘图法、光学改变、电阻率、 电容、各向异性、折射率和/或计数纳米颗粒。

定量不仅已考虑在阵列上的杂交得率和检测规模(其对于靶和参 考序列是相同的)，还考虑了提取、扩增(或拷贝)和标记步骤。

根据本发明的方法还可以包括通过使用以已知浓度加入的标准核 苷酸序列(外部或内部标准)用于获得靶核苷酸序列的定量的工具。 捕获分子也存在于阵列上，以便在与所述靶相同的条件下固定标准(可 能在复制或拷贝后)；该方法包括定量起因于由捕获分子和标准之间 的互补碱基配对形成的双链核苷酸序列形成的信号的步骤，以及起因 于所述双链核苷酸序列形成的信号与起因于由捕获分子和靶之间的互 补碱基配对形成的双链核苷酸序列的信号的相关分析的步骤，以便定 量生物样品中待检测和/或定量的原始核苷酸序列的存在。

有利地将标准加入最初的生物样品中或在提取步骤后加入，并且 用与靶相同的引物进行扩增或拷贝，和/或具有与靶相同或相差不超过 20％的长度以及与靶相同或相差不超过20％的GC含量。更优选地， 标准可以设计为具有在文件WO 98/11253中发现的内部标准特征的竞 争性内部标准。所述内部标准具有其序列与靶共同的部分和不同的特 异性部分。它在其2个末端处或附近还具有与用于扩增或拷贝靶的2 种引物互补的序列和相似的GC含量(WO 98/11253)。在本发明的优 选实施方案中，术语“标准和靶的共同部分”意指对于通过相同引物 扩增的所有靶同源的核苷酸序列(即，其属于待定量的生物的相同科)。

优选地，标准通过这种特异性序列的杂交得率等于靶序列的杂交 得率，或与靶序列的杂交得率相差不超过20％，并且如WO 98/11253 中所述获得定量。

在根据本发明的试剂盒中还有利地包括所述标准核苷酸序列、外 部和/或内部标准，可能连同用于执行根据本发明的不同步骤所需的所 有介质和工具(杂交和培养介质、聚合酶和其他酶、标准序列、标记 分子等)。

有利地，固体载体或生物芯片还包含具有各种浓度(即，4种) 标记捕获分子的点。这些标记的捕获分子还由已知溶液浓度进行点样， 并且它们的信号允许将杂交结果转变成绝对量。它们还允许测试检测 的重现性。

通过基于使用微流体技术控制液体溶液可以将生物芯片的固体载 体插入与另一个室和自动机器连接的载体中。通过插入此类微实验系 统内，它可以通过自动化进行温育、加热、洗涤和标记，甚至用于预 备步骤(如DNA的提取、基因扩增步骤)或鉴定和区分步骤(标记和 检测)。可以在相同固体载体上进行所有这些步骤。

本发明还涉及通过测量其以阵列类型形式的遗传材料用于鉴定生 物样品中可能存在的同源序列(及其属于的群，以及最终生物及其群) 的方法。该方法充分适合于测定属于几个群的生物，其自身是超群 (super-group)的成员。该方法例如充分适合于动物、植物、真菌或 微生物的生物测定和/或分类。

该方法涉及作为阵列呈现的多种捕获分子的使用，相应的靶序列 的捕获及其分析，和可能地其定量。该方法还允许通过表征具有所需 捕获分子的阵列的阳性区域来鉴定这些生物及其群。本发明的一个具 体说明是下述事实：导致在阵列上的点的阳性杂交给出用于鉴定序列 或生物或其属于的群或亚群的必需信息。

它还提供了这样的方法，其用于在基因扩增期间任何研究生物的 存在的序列分析，随后为在阵列上的扩增子检测和其后相应的生物或 群的鉴定。

此外，本发明人已发现通过本发明的方法可以获得属于彼此同源 的几个序列群或亚群或亚亚群的此类多重序列的非常快速和容易的鉴 定，直至获得可能的单个序列，通过组合使用通用引物对的单核苷酸 扩增优选通过PCR，连同通过在具有至少5种不同结合单链捕获分子 /cm2固体载体表面的阵列上检测和可能地记录在不同水平上鉴定生 物，起因于捕获序列与其相应靶序列之间的结合的单个信号的存在， 以及其后使所述检测的靶序列的存在与在其他中特异性遗传序列的鉴 定关联。该方法特别充分适合于通过分析其表达的基因组或基因的给 定部分来鉴定生物物种、属和科，这些序列在不同生物中彼此同源。

单个信号意指这样的信号，其自身足以鉴定它设计针对的一种或 多种靶核苷酸序列，并因此足以产生(必要时)关于样品中存在的生 物或生物群，或所述样品已从中获得的生物或生物群存在与否的明确 应答。

根据本发明的方法允许在其他可能的扩增核苷酸序列中容易鉴定 /检测特异性核苷酸序列，和任选地其靶序列的定量(生物样品中拷贝 数的表征或所述生物的存在)，所述靶核苷酸序列具有对于所述生物 或生物群特异的核苷酸序列。

阵列可以包含来自几个生物属和来自在属内的几个种的捕获分 子。捕获分子可以检测属、种以及这些属属于其的科。捕获分子还可 以检测亚种和甚至一个或多个种的个体生物。给定种的个体生物被视 为具有非常同源的序列，主要相差在其一些DNA序列或基因内的单个 碱基。同源性对于获得通用引物是重要的，和单碱基变化足以获得2 个靶扩增子之间的区分。如果不完全，那么区分可以通过使用第二种 捕获分子加以证实，所述第二种捕获分子存在于阵列上并能够结合在 不同序列位置上的相同扩增子。

所述鉴定通过下述获得：首先经由通用引物对基因扩增所述核苷 酸序列(靶序列)，随后(洗涤后)根据上述方法区分扩增的可能的 不同靶。

扩增序列可以属于相同基因，可以是相同DNA基因座的部分，并 且彼此同源。

该方法还像这样应用于核苷酸序列的鉴定和可能地表征，不依赖 于生物。基因或DNA序列可以根据其序列同源性分成群和亚群和亚亚 群。存在用于序列比对和比较的生物信息学程序(例如Clustal， Intelligenetics，Mountain View，Calif，或Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics computer Group Madison，Wis.，U.S.A.或Boxshade)。可以根据同 源性百分比和序列的比对进行分类。来自给定生物、组织或细胞中的 给定家族的序列检测和鉴定中的优点是例如检测任何给定分子、生物 或病理学条件(通过蛋白组学、功能基因组学等)对于一个或多个家 族的总体和特异性基因的影响。

本发明人还发现通过使用固定在载体上的高密度捕获分子，优选 高于约100fmoles/cm2固体载体表面增加测定法的灵敏度。

对于生物群的测定特异的捕获分子以这样的方式设计，以便能够 特异性捕获属于各个群的不同序列。这些捕获分子称为对于这个生物 群的共有区。共有捕获分子可以包含长于群的不同成员的特异性捕获 分子的特异性序列。这些捕获分子是共有序列(即，序列在其每一个 位置处包含在比对时在群的成员的不同序列中出现最多的碱基)。在 一个实施方案中，共有捕获分子具有扩增序列的长度。

通过反应的盐浓度以及温度和速率？。

根据本发明，像这样通过其特异性多态性鉴定生物。在基因组的 特定位置中的单碱基置换是个体生物在相同物种的其他中的特征。用 于鉴定多态性的方法是本发明的部分，使用扩增序列在阵列的捕获分 子上的直接杂交和固定的靶序列的检测。

本发明还允许通过下述鉴定多态性的存在：使用具有至少5种不 同的结合单链捕获多核苷酸序列/cm2固体载体表面的阵列，单个信号 的测定起因于捕获序列和靶序列之间的结合，使杂交物的至少一个多 核苷酸引物在3′至5′方向中延伸超过其3′末端核苷酸，使用多核苷 酸序列作为模板，所述延伸在聚合剂和核苷酸前体的存在下实现，其 中掺入延伸的引物分子内的至少一个核苷酸是可检测修饰的核苷酸。

阵列可以存在于多孔的表面中，和多孔平板检测器可以用于阅读 结果。

在具体实施方案中，阵列在分别的区域中具有位于捕获分子的相 同位置中仅相差1个核苷酸的几种相同的捕获分子，最后一个游离末 端是询问碱基。阵列随后能够鉴定在序列给定位置存在的4种碱基中 的任何一种的存在。当检测纯合或杂合生物中的多态性时，或当多态 性未知时，此类阵列特别有用。

在根据本发明的方法中，与靶序列互补的捕获分子的捕获分子由 至少2个家族组成。第一个包含约5-约60个碱基，优选约15-约 40个碱基和更优选约20-约30个碱基。在第二个捕获家族中，捕获 分子序列的捕获部分包含约10-1000个碱基和优选100-600个碱基。 这些碱基优选指定为位于捕获分子的末端处或附近的连续序列。这个 捕获部分被视为用于检测的特异性序列。在本发明的优选形式中，位 于捕获部分和载体表面之间的序列是非特异性序列或捕获部分。

在本发明的另一个优选实施方案中，捕获分子的第一个家族检测 群的成员，而捕获分子的第二个家族像这样检测群。然而，捕获分子 的2个家族都可以是多核苷酸。

可以选择通用引物以便扩增不同序列和序列群。相同引物对扩增 对于同源序列的不同群不同的几个序列群，每一个与一个或多个生物 群相关。通用引物对可以与群鉴定和/或对于在阵列上的物种鉴定相 关。

在具体实施方案中，对于扩增步骤加入第二种或第三种或甚至更 多引物，以便可能地扩增与一个特定群相关或不相关并对于样品中的 检测有用的其他序列。易于存在于临床样品中的病毒连同细菌是其中 本发明的此类方面特别有用的例子之一，如病毒检测的组合。

在另一个具体实施方案中，使用2对(可能通用)引物用于扩增， 一对用于扩增革兰氏阳性菌序列和另一对用于扩增革兰氏阴性菌。扩 增序列对于革兰氏阳性或革兰氏阴性菌特异，并且其后在阵列上作为 特定细菌物种和/或属和/或科进行检测)。2种引物对各自扩增对于 一个或多个科特异的各种序列，其随后在阵列上作为特异性种和/或 属、科进行检测。相同阵列优选具有对于细菌科或属特异的捕获核苷 酸序列。

在本发明的一个优选实施方案中，群的任何成员的存在的检测首 先在PCR期间使用如实时PCR的方法进行检测，并且扩增子其后用于 在阵列上的鉴定。

记录扩增溶液的荧光信号，并且如果它与阈值相交，那么溶液进 行处理用于阵列的捕获分子上的杂交。在优选实施方案中，将具有阵 列的固体载体加入扩增室和杂交过程中。在另一个优选实施方案中， 杂交在与PCR相同的室的表面上进行。室优选地闭合室具有与阵列相 容的任何大小、形式和材料。室可以是聚合物例如聚碳酸酯、聚丙烯 或玻璃例如毛细管或混合材料。基于聚丙烯酸酯的表面是特别有用的， 因为它们对于光是透明的并允许对于阵列所需的捕获分子的共价结 合。捕获分子的游离末端优选具有经修饰的5′或3′-OH或磷酸基以便 避免延伸。优选地，捕获分子的捕获部分具有小于用于扩增的引物的 解链温度，以便避免在PCR循环期间的杂交。此外，杂交优选使用扩 增循环仪的加热和控制系统在给定温度下进行。优选地，在扩增循环 仪上提供控制过程以在扩增步骤后继续或不继续阵列上的检测。

本发明的一个实施方案将实时PCR连同在捕获分子上的杂交组合 在一个过程中，用于在相同室中并用相同装置鉴定靶分子或生物。

在一个实施方案中，将用于在阵列上进行PCR扩增和检测所需的 诊断和/或定量仪器的不同部分整合到相同仪器内，以便检测在扩增的 PCR循环期间结合在阵列的捕获分子上的靶核苷酸分子。为了读出核 苷酸的存在，结合在捕获分子上的靶意指必须在PCR其自身的步骤之 一期间或循环之间的步骤中进行检测。在优选实施方案中，读数需要 给循环添加1个优选2个步骤，一个是双链扩增子变性所需的和另一 个是杂交其自身所需的。

本发明还包含用于执行该过程的各个步骤所需的机器和仪器，所 述过程主要用于诊断和/或定量样品中可能存在的(微)生物或生物的 部分，其包含：

a)根据阵列在特定位置处与不溶性固体载体表面结合的捕获分 子；

b)用于热调节的装置；

c)用于检测在扩增子和捕获分子之间的结合位置处形成的信号的 装置；

d)用于将信号转化成数字数据的计算机程序。

在另一个实施方案中，计算机程序进一步识别其中形成信号的阵 列位置。

在具体实施方案中，这种仪器还包含用于PCR扩增的反应室，从 而使得在阵列上的扩增和检测被整合到相同仪器内，以便在扩增的 PCR循环期间检测杂交扩增子。

在该仪器中，捕获分子优选是在阵列的位置中与不溶性固体载体 共价结合的单链捕获分子，其中所述捕获分子包含10-600个碱基的 捕获部分，所述捕获部分能够与所述扩增子特异性结合。

优选地，阵列包含彼此仅相差1个核苷酸的至少2种捕获分子。

该仪器可以进一步包含用于执行将得自生物或生物的部分的核苷 酸序列自动PCR扩增成双链靶核苷酸序列的热循环仪，所述热循环仪 能够交替加热和冷却所述载体用于生产标记的靶核苷酸。

优选仪器是其中检测在扩增的循环期间进行的那种。

用于检测信号的装置优选在PCR期间测量在其捕获分子上结合的 靶核苷酸序列至少2次，优选5次，更优选超过10次。

在备选实施方案中，用于检测信号的装置测量在扩增循环完成后 在其捕获分子上结合的靶核苷酸序列。

该仪器优选具有选自下述方法的检测器：比色法、荧光、时间分 辨荧光、光热干涉差、雷利散射、拉曼散射、表面等离子体共振、质 量的改变、石英晶体微量天平、悬臂、差示脉冲伏安法、通过非线性 生成频率光谱法的化学绘图法、光学改变、电阻率、电容、各向异性、 折射率和/或计数纳米颗粒。

优选地荧光扫描仪使用激光束，包括共焦扫描方法并还优选针孔。

该仪器可以进一步包含：

用于贮藏在热循环的限定时限时来自关于载体的至少5个不同位 置的不同测量的数据的贮藏系统，

对于阵列的每一个位置在至少一个热循环中重复检测和贮藏步骤 至少一次的控制器，

用于处理至少一个热循环中获得的数据的计算机程序，以便在扩 增前检测和/或定量样品中存在的核苷酸分子的量。

该仪器可以进一步包含：

激光源；

关于通过所述激光源产生的激光束的聚焦装置；

光电倍增管；

针孔。

该仪器可以进一步包含用于将在位置上形成的信号转变成与特定 靶的存在相关的数据的计算机程序。

在具体实施方案中，该仪器是用于基因、DNA和多核苷酸序列的 扩增和检测的多功能仪器，其执行PCR扩增、多核苷酸检测；实时PCR、 定量实时PCR、微阵列检测和/或定量、SNP检测。

根据本发明的仪器包含2个不同系统：第一个包含温育部分，以 便获得在其捕获分子上扩增和杂交靶所需的条件。优选地第一个系统 包含用于加热的过程，以便提供用于发生扩增和结合反应的温度。加 热系统可以是受控珀耳帖元件，导入光学级别聚酯片之间的模式的微 薄导线加热元件如来自Minco的Thermal-ClearTM透明加热器，或外部 循环温度调节流体的流体系统。加热系统由主动温度控制系统和温控 仪(8)组成，允许精确调节温度并执行温度循环。该系统还优选包含 用于去除室内的液体并增加反应率的混合或搅动系统。

第二个系统包含检测系统以检测来自与其捕获分子结合的靶的光 发射。光源产生光束以激发载体上的标记靶。光源可以是以约15mW 的功率递送的激光，其产生具有约532nm的波长的束，伴随可能低于 1.2mrad的发散。

由激光产生的激光束优选是几乎平行和几乎高斯的。可更换的激 发滤光镜可以用于仅收集目的波长。可以放置另外的滤光镜轮，并用 作弱化滤光镜以精确调节激光功率。这种滤光镜轮可以以各种已知吸 收水平进行差异渐变。可以是抗反射包被的透镜可以用于使激光束集 中在载体(2)上。光源、透镜和载体之间的距离可以改变以允许聚焦。

其后，使光通过二色镜。这种镜可以通过具有低于约530nm的波 长的光，但反射具有大于560nm的波长的光。因此，来自激光的532nm 光经过二色镜至载体。光随后经过室(11)和荧光标记的样品并到达 载体(2)，其中结合的标记靶被激发并发出在约560nm处的荧光。 因为它的波长大于约560nm，所以发出的荧光在二色镜上进行反射至 显微镜物镜用于放大成像样品。发荧光的光随后集中于光电倍增管用 于检测其中存在的光子数目。在具体实施方案中，可以添加透射具有 大于约550nm的波长的光的另外发射滤光镜。因此，光电倍增管基本 上仅检测发荧光的光。光电倍增管对于检测的每一个光子产生脉冲。 这些脉冲中的每一个进行扩增并通过光电效应转变成电子信号。数据 采集板(7)随后收集所产生的信号。

收集来自底物区域的数据后，运载体(1)移动载体从而使得光可 以指向在载体(2)上的不同区域。重复该过程直至已扫描载体上的所 有区域。

在一个实施方案中，包含捕获分子的固体载体相对于2个系统进 行移动。随后不依赖于第一个系统，在第二个系统中进行结合的检测。

在另一个实施方案中，使2个系统固定并一起工作，没有固体载 体相对于2个系统的移动。

在另外一个实施方案中，光学系统的分辨率为0.1微米-500微 米，并更优选10-100微米。在另一个实施方案中，距离在温育系统 和检测系统中不同，优选与温育系统比较，在检测系统中小2-100 倍。

图9的流程图描述了其中实时仪器受程序控制计算机控制的具体 实施方案。扫描仪可以是与来自Axon的可编程Genepix 6.0软件偶联 的来自Axon的Genepix 4200A扫描仪。

在步骤1时，提示用户填入所需参数，例如：分辨率、PMT的电 压、激光功率、扫描区域、变性温度、变性时间、退火温度、退火时 间、延伸温度、延伸时间和循环数目。

不同参数的解释

分辨率定义像素尺寸。一般地，选择导致超过50个像素/合成区 域(“特征”)的像素尺寸。设置太高，分辨率产生数据的超负荷， 而具有太低，像素尺寸产生低质量结果。

PMT电压扩大检测的信号。增加激光功率将增加每个像素中的光 子计数。

“循环数目”参数对应用户希望循环温度和扫描底物的次数。以 这种方式，用户可以执行一系列扫描以跟踪反应动力学。

扫描区域参数对应待测试的底物的尺寸。温度可以依待测试的聚 合物类型而变。优选地，测试在产生最大结合亲和力而减少错配的温 度下进行。

温度参数控制不同扩增步骤的温度。

温度时间参数定义每个扩增步骤的持续时间。这些参数还定义在 其下进行检测的时刻。

在步骤2时，系统进行初始化：将运载体移至原始位置同时检查 激光功率。

在步骤3时在预定变性时间期间发生第一次加热至预定变性温 度。

步骤4类似于步骤3用于退火温度。

在步骤5时，进行第一次扫描并收集在所选择的底物区域上发出 的荧光。保存图像。

如果未达到待完成的扫描数目，那么程序进行步骤6，其在预定 持续时间期间加热至延伸温度，并且循环回到步骤3。

如果不是，那么发生步骤7：收集图像用于提取关于在载体上存 在的每个靶的信号和本底值。

步骤8对应图像定量。

步骤9对应数据分析。

该仪器能够执行2个不同过程，其具有不同任务并需要完全不同 的规格。

第一个是必须精确控制的加热系统，从而使得扩增和杂交在其中 靶多核苷酸可以正确扩增并结合其捕获多核苷酸而不是(或不显著) 同源或无关序列的条件下进行。优选地，温育必须提供液体的混合或 搅动或移动以便有利于靶分子之间的接触，所述靶分子与其捕获分子 一起在溶液中。在优选实施方案中，通过静电波或压电振动进行混合。

第二个是与其存在于固体载体的表面上的捕获分子结合的靶分子 的检测。检测水平是每个点飞摩尔或更小的级别，并且在溶液中相同 分子的存在下检测结合靶是挑战。扫描仪必须在整个表面上以相同效 率执行检测，否则无法完成在相同样品中存在的靶定量的比较。

2个过程在整合系统中进行，只要技术部分(具有规格所需的) 彼此相容。光源在载体(2)表面上和与热稳定运载体(1)接触的表 面定向相反。

其他序列的检测可以有利地在相同载体上进行，例如通过允许与 用于定量的标准核苷酸序列杂交，使用用于相同或不同微生物菌株的 共有捕获分子，使用允许检测经由微生物的可能的抗生素抗性基因或 用于杂交的阳性或阴性对照的序列。所述其他捕获分子可以具有长于 10-60个碱基和高至600个碱基的总长度的特异性序列，并且还在不 溶性固体载体上结合，优选在与本发明相关的其他结合的捕获分子制 成的阵列中。

关于核苷酸序列的具体检测和分析详细描述的这些特征可以由本 领域技术人员应用于(微)生物的其他组分，例如受体、抗体、酶等。

本发明将参考附图在下述非限制性实施例中详细描述。

实施例

实施例1.监控在微阵列上的同源序列的PCR扩增

捕获分子固定

根据专利申请WO02/18288中描述的方法，使Diaglass载片 (Eppendorf，Hamburg，Germany)就醛的存在进行官能化。遵循这个 专利申请中描述的方案用于将胺化DNA移植至醛衍生的玻璃。胺化捕 获分子从溶液中以3μM的浓度进行点样，除了以300nM点样的 BAT-973外。使用250μm直径针用自制(home made)机器人装置将 捕获分子印迹到显微镜载玻片上。点直径为400μm并且分配的体积 为约0.5n1。使载片在室温下进行干燥并贮藏于4℃直至使用。

在这个实验中使用的捕获分子的捕获部分具有下述序列：

AATSauG2(SEQ ID NO：1)：

5′-AACTGCTGGACTTATTTTAGGTAAGAG-3′

AATSpneG2(SEQ ID NO：2)：

5′-CTTGTCATGGGGAAATCAGGTATCCA-3′

BAT-973(杂交控制)(SEQ ID NO：3)：

5′胺-

TAGCCCTCTCACATTTATGAAGCAAGCCCCACTTATTCCCCATTCTTCCTAGTTTTCTC

CTCCCAGGAACTGGGCCAACTCACCTGAGTCACCCTACCTGTGCCTGACCCTACTTCTT

TTGCTCTTAGCTGTCTGCTCAGACAGAACCCCTACATGAAACAGAAACAAAAACACTAA

AAATAAAAATGGCCATTTGCTTTTTCACCAGATTTGCTAATTTATCCTGAAATTTCAGA

TTCCCAGAGCAAAATAATTTTAAACAAAGGTTGAGATGTAAAAGGTATTAAATTGATGT

TGCTGGACTGTCATAGAAATTACACC-3′

2C9*3(SEQ ID NO：4)：

5′-GGTGGGGAGAAGGTCAAGGTA-3′

AATSauG1(SEQ ID NO：5)

5′-TTAATCAATGGTGTACTTAGCTTAAGTA-3′

AATSpnG1(SEQ ID NO：6)

5′-TGACCAAAAGGTTTGGAAAACGTGCA-3′

AATSorG1(SEQ ID NO：7)

5′-ACTGCCAAGGTTGAAAAGCTCATGG-3′

AATEfinG1(SEQ ID NO：8)

5′-TCTGAGGTAGTAGCGGCTATCGATT-3′

AATEfsG1(SEQ ID NO：9)

5′-GATTGATGCAACAAGTTTATTGATGGAC-3′

在例外的BAT-973的情况下，每个捕获分子包含在捕获部分的5′ 末端处长90个碱基的间隔物部分，所述间隔物具有下述序列：

5′胺- AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATAT GTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC-3′。

DNA纯化

细菌菌株在LB培养基(10g蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl/l) 中在好氧条件下于37℃由单个菌落过夜生长。通过离心(5000g，5 分钟)使等分试样(0.1ml)的过夜培养物形成团块。将细菌团块重悬 浮于包含100μg溶葡萄球菌素(Sigma，Mo，USA)和100μg RNA 酶的300μl裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH 8.0、100μM EDTA、 150mM NaCl、1％SDS)中，并于37℃温育30分钟。通过在200μg 蛋白酶K(Boehringer，Mannheim，Germany)的存在下于37℃温育 30分钟并煮沸5分钟来达到裂解。使裂解物在4000g下离心5分钟， 并且根据制造商的说明书，通过在Nucleospin C+T柱 (Macherey-Nagel，Duren，Germany)上吸附从200μl上清液中提 取DNA。DNA在200μl无菌水中进行洗脱并贮藏于-20℃。

PCR和杂交

PCR设计用于使用通用引物扩增来自金黄色葡萄球菌和肺炎球菌 的细菌培养物的基因组DNA样品。将一种阳性杂交对照加入反应混合 物内，并对应用cy3标记的扩增子，所述扩增子与捕获分子BAT-973 (SEQ ID NO：3)互补。这种对照用于检查杂交阶段。

在这个实验中使用的引物具有下述序列：

AAPgyr1(SEQ ID NO：10)：

5′-GCNGCDGCRATGCGTTATAC-3′

AAPgyr3Cy3(SEQ ID NO：11)：

5′-Cy3-GAACCHYKACCTGTTTCATA-3′

N＝A，G，T，C

D＝G，A，T

R＝A，G

H＝A，T，C

Y＝C，T

K＝G，T

扩增产物具有捕获分子AATSauG2(SEQ ID NO：1)和AATSpneG2 (SEQ ID NO：2)特异的其链序列之一的部分。

如下制备用于PCR反应的475μl混合物：1x浓缩Topo缓冲液、 dNTP混合物(每一种dNTP以200μM的终浓度)、0.05μM引物 AAPgyr1(SEQ ID NO：10)、在5′处Cy3标记的0.1μM AAPgyr3Cy3 (SEQ ID NO：11)、在95μl中以5U的Topo Taq DNA聚合酶、以 150mM的谷氨酸钾。45μl这种混合物用于每次PCR反应。加入从金 黄色葡萄球菌(从临床样品中分离的)的纯培养物中提取的1μl基 因组DNA；从肺炎球菌(从临床样品中分离的)的细菌纯培养物中提 取的1μl基因组DNA，1μl蒸馏水，2μl Cy3-BAT扩增子(40ng)。 将50μl这种PCR反应装载到由在具有350μm的厚度的Zeonex中 用盖玻片密封的9 x 9mm，杂交室构成的微阵列上。

在载片的背面上，固定温度控制的专门热电偶。完整加热过程测 试台由下述相关组分组成：

*“热电偶”：RS-COMPONENT n°219-4321自我粘附热电偶K型 -镍铬/镍铝(RS组分，Northamptonshire，UK)，

*“传送器”：RS-COMPONENT n°363-0222传送器温度热电偶4-20 mA(RS组分，Northamptonshire，UK)，

*“转换器”：NATIONAL INSTRUMENTS 779026-01USB-6009 48K 样品/秒DAQ多功能14比特用于USB(National Instruments，Austin， TX，USA，

*“加热器”：MINCO加热箔弹性加热器：Kapton 0，75＂ x 0，75＂ HK 5578 R 18，3 L12F(MINCO，Minneapolis，MN，U.S.A)。

尽可能靠近加热表面放置的热电偶通过传送器测量温度。经由转 换器将这种温度信息给予计算机。

每一秒，软件比较测量的温度与由最终用户要求的温度设定点， 并且控制器调整加热以便提供要求的温度。

随后将载片倒置放入Axon扫描仪(4100个人)内，在整个实验 期间它保留在其中。以20微米的分辨率在600的增益时用532波道进 行用于Cy3检测的扫描。

加热盖按程序工作以产生如下的50个循环：于94℃ 30秒(变性)、 于56℃ 1分钟(退火)和于76℃ 30秒(延伸)。在循环5、10、15、 19、20、25、30、33、35、37、39、41、43、45、47、48、49和50 的退火步骤(于56℃)开始后，通过起始30秒扫描微阵列表面测定 荧光发射。扫描仪使用集中于载体的表面上的激光作为激发光。通过 光电倍增管检测并扩增发射光。图像采集后，将扫描的16-比特图像 输入用于定量信号强度的软件′Genepix 5＂(Axon，Unioncity，Ca， USA)。定量关于阵列上一式三份存在的2种捕获分子AATSauG(SEQ ID NO：1，金黄色葡萄球菌)和AATSpneG2(SEQ ID NO：2，肺炎球菌) 的信号。扣除局部本底并且使信号减本底针对循环数目进行标绘。阵 列还包含在阵列上一式四份存在的用于阴性杂交对照(SEQ ID NO：4 -9)和用Cy3标记的阳性检测对照的捕获分子。用作阴性杂交对照的 捕获分子无一给出阳性信号。

在微阵列上的实时PCR结果呈现于图10中。结果显示关于特异性 捕获分子金黄色葡萄球菌的信号在循环37时出现。信号继续有规律地 增加直至循环50。关于捕获分子肺炎球菌的信号开始在循环46时出 现并有规律地增加直至循环50。杂交对照给出关于其捕获分子 BAT-973(SEQ ID NO：3)的阳性信号，这伴随循环进展保持恒定。

实施例2.在5步骤PCR过程的1个循环期间监控在微阵列上的 扩增子的杂交动力学

这个实施例对应图7b中提供的实施方案。

捕获分子序列及其固定与实施例1中相同，包括间隔物。

用于跟踪杂交的捕获分子的捕获部分如下：

2C9*3(SEQ ID NO：4)：

5′-GGTGGGGAGAAGGTCAAGGTA-3′

PCR和杂交

用于PCR的DNA模板是包含在载体pCR4Topo中克隆的CYP2C9 基因的整个外显子7的质粒DNA。该质粒包含突变3。它通过PCR使用 下述引物进行扩增。

MP2C903(SEQ ID NO：12)：

5′-Cy3-CTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3′

MP2C904(SEQ ID NO：13)：

5′-CAGAGTGTTGATTTGACAAGATTTTAC-3′

扩增子的预期大小是1114bp。起因于扩增的扩增子是捕获分子 2C9*3(SEQ ID NO：4)特异的。

PCR混合物如下：1x浓缩Topo缓冲液、dNTP混合物(每一种dNTP 以200μM的终浓度)、在5′末端处Cy3标记的0.125μM引物 MP2C903(SEQ ID NO：12)、0.125μM MP2C904(SEQ ID NO：13)、 在50μl中以2.5U的Topo Taq DNA聚合酶、以150mM的谷氨酸钾。 将携带突变3的CYP2C9的外显子7的5μl质粒DNA(5ng/μl)加入 在200μl PCR管中的45μl这种PCR混合物中。

在热循环仪(Eppendorf，Hamburg，Germany)中进行PCR。样品 首先于94℃变性5分钟。随后进行由下述组成的40个扩增循环：于 94℃ 30秒、于63℃ 1分钟和于72℃ 1分钟以及于72℃ 10分钟的最终 延伸步骤。

在40个循环结束时，将50μl这种PCR反应装载到由杂交室构 成的微阵列上，并且在载片的背面上，如实施例1中提供的固定专门 热电偶。

随后将载片倒置放入Axon扫描仪(4100个人)内。

加热盖如下按程序工作用于以5个步骤的另外循环：

于94℃ 30秒(变性)然后于60℃ 5分钟(退火)然后于72℃ 30 秒(延伸)然后于94℃ 30秒(变性)和最后于40℃ 5分钟(杂交)。

在5种温度的这个循环期间，在0秒、80秒、140秒、220秒、 300秒、380秒、450秒、530秒、600秒、680秒、760秒和840秒的 不同时间点上(对应捕获分子2C9*3扫描时间)扫描阵列。

如实施例1中进行扫描，除了使用500的增益代替600。定量关 于阵列上一式三份存在的捕获分子MT2C9*3(SEQ ID NO：4)的信号。 扣除局部本底并且使信号减本底针对第41个循环的5个步骤的时间进 行标绘。

结果呈现于图11中。结果显示关于特异性捕获分子MT2C9*3(SEQ ID NO：4)的信号。信号在于60℃的退火步骤期间出现。信号有规律 地增加直至退火步骤结束。然后信号在延伸和变性步骤期间丧失并回 到本底水平。然后信号在于40℃的杂交步骤期间再次出现，并且有规 律地增加直至杂交步骤结束。图11中提供了在退火和杂交步骤期间信 号增加的回归曲线。

实施例3.在5步骤PCR过程的3个循环期间监控在微阵列上的 扩增子的杂交动力学

这个实施例对应图7b中提供的实施方案。

捕获分子序列及其固定与实施例1中相同，包括间隔物。

如实施例2中提供的进行实验，除了下述方面。将携带突变3的 CYP2C9的外显子7的10μl质粒DNA(5ng/μl)加入在200μl PCR 管中的90μl PCR混合物中。

在热循环仪(Eppendorf，Hamburg，Germany)中进行PCR。样品 首先于94℃变性5分钟。随后进行由下述组成的40个扩增循环：于 94℃ 30秒、于63℃ 1分钟和于72℃ 1分钟，然后于72℃ 10分钟的最 终步骤。

在第25、30和35个PCR循环结束后，从PCR管中取出30μl PCR 产物并装载到由杂交室构成的微阵列上，并且在载片的背面上，如实 施例1中提供的固定专门热电偶。

随后将载片倒置放入Axon扫描仪(4100个人)内。

加热盖如下按程序工作用于以5个步骤的另外循环：

于94℃ 30秒(变性)然后于63℃ 1分钟(退火)然后于72℃ 30 秒(延伸)然后于94℃ 30秒(变性)和最后于55℃ 5分钟(杂交)。

在5种温度的这个循环期间，在0秒、100秒、300秒、400秒、 500秒和600秒的不同时间点上(对应捕获分子2C9*3扫描时间)扫 描阵列。

对于在第30和35个循环后获得的PCR产物重复读数。

如实施例1中进行扫描，除了使用550的增益代替600。定量关 于阵列上一式三份存在的捕获分子MT2C9*3(SEQ ID NO：4)的信号。 扣除局部本底并且使信号减本底针对第26、31和36个循环的5个步 骤的时间进行标绘。

结果呈现于图12中。在变性步骤期间(在100秒的时间点上)进 行一次测量。关于3个测量循环的信号极低并且在本底水平的范围内。 在杂交步骤期间进行接下来的4次测量(在300秒、400秒、500秒和 600秒的时间点上)。观察到关于特异性捕获分子MT2C9*3(SEQIDNO： 4)的信号。信号随着杂交的时间线性增加，并且曲线的斜率伴随循环 数目增加(斜率对于第26个循环为0.422，对于第31个循环为1.562， 和对于第36个循环为2.514)。图12中提供了在杂交步骤期间的信 号的时帧的回归曲线。

实施例4.在5步骤PCR过程的多个循环期间监控在微阵列上的 扩增子的杂交动力学

捕获分子序列及其固定与实施例1中相同，包括间隔物。

如实施例3中提供的进行实验，除了下述方面。

如实施例1中提供的，将50μl这种PCR反应装载到由杂交室 构成的微阵列上。通过如实施例1中固定在载片的背面上的热电偶控 制PCR的温度。

随后将载片倒置放入Axon扫描仪(4100个人)内，在整个实验 期间它保留在其中。

加热盖按程序工作至于94℃ 5分钟样品第一次变性。在由下述组 成的5步骤PCR中进行50个扩增循环：于94℃ 30秒(变性)然后于 63℃ 1分钟(退火)然后于72℃ 30秒(延伸)然后于94℃ 30秒(变 性)和最后于55℃5分钟(杂交)。

如实施例3中所述进行扫描。在第35、40和45个PCR循环期间， 在循环开始后的不同时间点上(对应捕获分子2C9*3扫描时间)扫描 阵列：0秒、100秒、300秒、400秒、500秒和600秒。

观察到关于特异性捕获分子MT2C9*3(SEQ ID NO：4)的信号。 信号随着杂交的时间线性增加，并且曲线的斜率伴随循环数目增加。

本发明已就上文讨论的某些实施方案而言进行描述。应认识到这 些实施方案允许本领域技术人员众所周知的各种修饰和备选形式。

无需背离本发明的精神和范围，即可对本文描述的结构和技术进 行除上述那些外的许多修饰。因此，尽管已描述了具体实施方案，但 这些仅是例子并且不限制本发明的范围。

发明背景