用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法
专利汇可以提供用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及活体 无损检测 测量技术领域，公开了一种用于 活性 氧 检测的 荧光 共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法，检测装置中，计算机与 数据采集 卡电连接，数据采集卡通过控制盒与 近红外 光 激光器 电连接，近红外激光器通过光纤与扩束镜光 信号 连接，光纤上设有 准直 器 ，数据采集卡通过CCD成像仪与采集镜头 光信号 连接，且CCD成像仪位于采集镜头的成像交点处，CCD成像仪通过滤光系统与采集镜头光信号连接，数据采集卡通过伺服 跟踪 系统与三维电动平台电连接，样品台固定在三维电动平台上，且样品台位于扩束镜和所述采集镜头的正下方。本发明为高 精度 、实时活性氧 活体检测 提供了一种可行性方案。，下面是用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测装置和检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：计算机（1）与数据采集卡（2）电连接，所述数据采集卡（2）通过控制盒（3）与近红外光激光器（4）电连接，所述近红外激光器（4）通过光纤（5）与扩束镜（7）光信号连接，所述光纤（5）上设有准直器（6），所述数据采集卡（2）通过CCD成像仪（8）与采集镜头（10）光信号连接，且所述CCD成像仪（8）位于所述采集镜头（10）的成像交点处，所述CCD成像仪（8）通过滤光系统（9）与所述采集镜头（10）光信号连接，所述数据采集卡（2）通过伺服跟踪系统（11）与三维电动平台（12）电连接，样品台（13）固定在所述三维电动平台（12）上，且所述样品台（13）位于所述扩束镜（7）和所述采集镜头（10）的正下方。
2.根据权利要求1所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述计算机（1）为带有采集控制软件和图像分析重建软件以及电机控制软件的计算机。
3.根据权利要求2所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述的采集控制软件和图像分析重建软件均为MATLAB软件；所述的电机控制软件为LabView软件。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述三维电动平台（12）包括前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台，所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机分别驱动。
5.根据权利要求4所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述前后移动平台、左右移动平台和上下移动平台由各自的步进电机驱动移动的最小步距均为
10 μm。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述近红外光激光器（4）发出的激光为连续激光，功率在0 20 W的范围内，波长为~
980 nm。
7.根据权利要求1所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置，其特征在于：所述滤光系统（9）为540nm、600nm和800 nm带通的滤光转换系统。
8.一种如权利要求1至7中任一项所述的用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针置入待测样品中，并将所述待测样品置于所述样品台（13）上；
S2：所述计算机（1）通过所述控制盒（3）控制所述近红外光激光器（4）发出近红外激光，并通过所述准直器（6）和所述扩束镜（7）调整激光光斑面积，使激光光斑覆盖整个所述待测样品的检测区域，调整所述采集镜头（10）的位置，使所述检测区域在所述CCD成像仪（8）上成像最清晰且处于中间位置；当所述待测样品中有活性氧产生时，所述近红外纳米荧光探针发出荧光信号；
S3：所述计算机通过控制所述近红外激光发射器发射的近红外激光的激发强度，以使所述纳米荧光探针产生差动变化的荧光信号；
S4：所述采集镜头（10）接收所述荧光信号，然后经所述滤光系统（9）滤除干扰光之后，所述数据采集卡（2）通过所述CCD成像仪（8）采集所述荧光信号，并将所述荧光信号传输并储存到所述计算机（1）中；
S5：所述计算机（1）对所述荧光信号进行计算分析，获得所述待测样品的活性氧浓度和产量信息以及所述待测样品的移动信息；
S6：所述计算机（1）将所述活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，并将比较结果输出到所述控制盒（3），通过所述控制盒（3）实时控制所述近红外激光发射器（4）的激光输出功率；并将所述移动信息输出到所述伺服跟踪系统（11），通过所述伺服跟踪系统（11）实时控制所述三维电动平台（12）跟踪所述待测样品的位置。
9.根据权利要求8所述的用于活性氧的荧光共振差分比率检测装置进行检测的方法，其特征在于：在所述S5中，所述活性氧浓度和产量信息通过以下公式计算得到：
；
其中，C为荧光分子浓度，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，ΔI′L10 、ΔI′L20、ΔI′L2、ΔF′L为检测的初始的540 nm发光，初始的800 nm发光，测量过程中800 nm发光和测量过程中600 nm荧光的发光差值。
10.一种如权利要求8或9中用于活性氧的荧光共振差动比率检测的近红外纳米荧光探针的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1-1：制备油酸包裹、核壳结构、980 nm近红外激发的上转换纳米粒子；
S1-2：将双羧基聚乙二醇PEG和不饱和磷脂分子用EDC和NHS活化后，共价连接形成羧基化的磷脂聚乙二醇分子，层析提纯待用；
S1-3：将所述DSPE-PEG-COOH分子和所述上转换纳米粒子共孵育并超声，实现充分包裹后离心，去上清，重悬备用；
S1-4：将活性氧检测分子和包裹好的所述上转换纳米粒子共孵育并超声，振荡过夜后离心去上清，重悬后得所述近红外纳米荧光探针。
用于活性氧检测的荧光共振差动比率探针的合成方法及检测
装置和检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
~
其中，C为荧光分子浓度，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，ΔI′L10 、ΔI′L20、ΔI′L2、ΔF′L为检测的初始的540 nm发光，初始的800 nm发光，测量过程中800 nm发光和测量过程中600 nm荧光的发光差值。
（1）
其中，k为吸收系数，μ为荧光激发量子效率，C为荧光分子浓度，为相应波长的环境传输损耗系数，F0为初始背景荧光。
上式说明，对于有FRET关系的两个荧光分子A和B，如果改变能量激发输入，并同时检测出相应A和B荧光的对应变化量，即dF′L 和dI′L1，即可求出荧光分子B的浓度，结果不再受本底荧光、光源变化和环境因素等的影响。
其中，b为IL2发光波长的环境传输损耗系数, β为IL2发光波长的上转换量子效率，ε为IL1发光波长上转换量子效率，I′L2为IL2的实际检测值。
a值在初始时刻检测计算获得，此时dI′L1和dI′L2分别为dI′L10和dI′L20，结果带入（3）式并将微分方程离散化得
（5）
该式表明，活性氧浓度（荧光分子浓度）和检测到的出射荧光及上转换发光的微分之比成正比。只要在初始较低能量共振转移损耗IL1较强时改变一次激发光源强度获得 的值，利用过程中出射荧光和上转换的800 nm出射光的动态差分值，求其比值就可以精确检测活性氧浓度以及其分布成像。该方法使用了荧光能量共振转移的建立过程，并采用差分控制激发和检测，从而用于精确测量荧光探针的浓度，因此被称作荧光共振差分比率检测法。
图3为近红外纳米荧光探针检测原理示意图；
图4为近红外纳米荧光探针细胞检测成像示意图；
图5 为活体检测应用实例。
具体实施方式
如图1，用于活性氧的荧光共振差动比率检测装置包括计算机1（带有采集控制软件（MATLAB软件）和图像分析重建软件（MATLAB软件）以及电机制软件（LabView软件））、数据采集卡2（型号为NI公司生产的PCI2400）、控制盒3、近红外光激光器4（发出的激光为连续激光，功率在0 20 W的范围内，波长在700nm 1000 nm的范围内，激光开关和功率经控制盒受~ ~
电脑软件控制实现差动激发）、激光功率光纤5（数值孔径为0.22、光纤接头为SMA905、光纤芯径为200 μm）、准直器6、扩束镜7（焦距为4.6 mm，透光波长在650～1050 nm的范围内）、可见光检测CCD成像仪8、滤光系统9（540，600 和800 nm带通的滤光片9）、采集镜头10、伺服跟踪系统11（优选三维光电跟踪系统，最大跟踪工作范围为5 cm，最小分辨率为横向为1mm，纵向为2 mm）和三维电动平台12，计算机1与数据采集卡2电连接，数据采集卡2通过控制盒3与近红外光激光器4电连接，近红外激光器4通过光纤5与扩束镜7光信号连接，光纤5上设有准直器6，数据采集卡2通过CCD成像仪8与采集镜头10光信号连接，并且CCD成像仪8位于采集镜头10的成像交点处，CCD成像仪通过可变换带通的滤光系统9与采集镜头10光信号连接，数据采集卡2通过伺服跟踪系统11与三维电动平台12电连接，扩束镜7、CCD成像仪8、滤光系统9和采集镜头10分别设于三维电动平台12外，样品台13固定在三维电动平台12上，并且样品台13位于扩束镜7和采集镜头10的正下方。
1）使用热沉淀法合成油酸包裹、核壳结构、980 nm近红外激发的上转换纳米粒子；将定量的稀土醋酸盐充分溶解后，置于烧瓶内除水除氧，在氩气保护下温控加热，最后通过多掺杂、多次结晶技术形成油酸包裹、核壳结构的980 nm近红外激发的上转换纳米粒子。调整合成过程中的掺杂比例，使合成的纳米粒子（NaYF4:Yb, Er, Tm @CaF2）特征为：50nm，980nm光激发，540和800 nm多波长发射。
1）在1 ml培养皿培养细胞中加入近红外纳米荧光探针，加入的近红外纳米荧光探针的浓度为1 mg/ml。同时，在培养皿中加入10 μg/ml的光敏剂焦脱镁叶绿酸-a（PPa），孵育3h后，用PBS清洗三次，最后加入1 ml PBS溶液，将培养皿置于样品台13上，用650 nm激光（10 mW/cm2）连续照射，利用光敏剂的光动力产生活性氧，同时实施活性氧检测。
1中。计算机1利用LabView软件，通过公式 计算活性氧浓度和产量
信息，并利用图像分析重建程序对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析。检测成像方法和结果如图3和4。再将获得的活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以实时控制近红外激光发射器4的激光输出功率；计算机1还通过图像特征分析获得样品的移动信息，并将移动信息输出到伺服跟踪系统11，通过伺服跟踪系统11实时控制三维电动平台12跟踪样品的位置。
培养肿瘤小鼠模型，待肿瘤长到0.5 cm3，按体重尾静脉注射100 μl光敏剂PPa（5 mg/kg），5小时后肿瘤局部皮下注射活性氧探针，等待1小时后实施光照和活性氧的同步监测。 其中，用650 nm激光（10 mW/cm2）连续照射，利用光敏剂的光动力产生活性氧；980 nm近红外激光激发；计算机1通过差动控制近红外激光发射器4发射的近红外激光的激发强度，功率为500 -510 mW/cm2，激发时间1 s。每隔30 s检测一次。每次CCD成像仪8记录差动激发下的600 nm荧光和 800 nm 的上转换发光强度。采集镜头10接收荧光信号，然后经滤光系统9滤除干扰光之后，数据采集卡2通过CCD成像仪8采集荧光信号，并将荧光信号传输并储存到计算机1中。计算机1利用LabView软件，通过公式 计算活性氧浓度
和产量信息，并利用图像分析重建程序对数据采集卡2所采集的荧光信号数据进行成像，根据荧光强度、荧光变化率对所成的像的对应区域做统计学分析。再将获得的活性氧浓度和产量信息与预设的阈值比较，比较结果输出到控制激光功率的控制盒3以实时控制近红外激光发射器4的激光输出功率；计算机1还通过图像特征分析获得样品的移动信息，并将获得的移动信息输出到伺服跟踪系统11，通过伺服跟踪系统11实时控制三维电动平台12跟踪样品的位置。检测成像结果如图5。
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