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抗CDH6抗体药物缀合物

阅读：141发布：2023-01-27

专利汇可以提供抗CDH6抗体药物缀合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及抗CDH6 抗体 、抗体 片段 、抗体药物缀合物和它们用于 治疗 癌症的用途。，下面是抗CDH6抗体药物缀合物专利的具体信息内容。

1.下式的抗体药物缀合物:
Ab-(L-(D)m)n
或其药学上可接受的盐；其中
Ab是与人CDH6的表位特异性地结合的抗体或其抗原结合片段；
L是接头；
D是药物部分；
m是1至8的整数；和
n是1-10的整数。
2.权利要求1所述的抗体药物缀合物,其中所述n是3或4。
3.权利要求1或2所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDH6的胞外结构域。
4.权利要求1或2所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或抗原结合片段特异结合包含SEQ ID NO:534的氨基酸序列的人CDH6的表位。
5.权利要求1-4中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
(i)轻链可变区，其包含:(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:225的LCDR2，(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的HCDR1，(e)SEQ ID NO:228的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
(ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:211的LCDR2，(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213的HCDR1，(e)SEQ ID NO:214的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
(iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:267的LCDR2，(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269的HCDR1，(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
(iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:309的LCDR2，(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311的HCDR1，(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
(v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
15的LCDR2，(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的HCDR1，(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
(vi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
29的LCDR2，(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的HCDR1，(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
(vii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:43的LCDR2，(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的HCDR1，(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
(viii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:57的LCDR2，(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:59的HCDR1，(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
(ix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
71的LCDR2，(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的HCDR1，(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
(x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
85的LCDR2，(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的HCDR1，(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
(xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
99的LCDR2，(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的HCDR1，(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
(xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:113的LCDR2，(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115的HCDR1，(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
(xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:127的LCDR2，(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129的HCDR1，(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
(xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:141的LCDR2，(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143的HCDR1，(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
(xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:155的LCDR2，(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157的HCDR1，(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
(xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:169的LCDR2，(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171的HCDR1，(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
(xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:183的LCDR2，(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185的HCDR1，(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
(xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:197的LCDR2，(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:199的HCDR1，(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
(xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:239的LCDR2，(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241的HCDR1，(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
(xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:253的LCDR2，(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255的HCDR1，(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
(xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:281的LCDR2，(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283的HCDR1，(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
(xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:295的LCDR2，(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297的HCDR1，(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
(xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:323的LCDR2，(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:325的HCDR1，(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
6.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
7.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的一个或两个氨基酸已经被修饰、缺失或取代。
8.权利要求1-4中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
(i)包含SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
(ii)包含SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
(iii)包含SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
(iv)包含SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
(v)包含SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
(vi)包含SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
(vii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
(viii)包含SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
(ix)包含SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
(x)包含SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
(xi)包含SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
(xii)包含SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
(xiii)包含SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
(xiv)包含SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
(xv)包含SEQ ID NO:160的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
(xvi)包含SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
(xvii)包含SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
(xviii)包含SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
(xix)包含SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
(xx)包含SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
(xxi)包含SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
(xxii)包含SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
(xxiii)包含SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
9.权利要求1-4中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
(i)包含SEQ ID NO:234的重链和包含SEQ ID NO:235的轻链；
(ii)包含SEQ ID NO:220的重链和包含SEQ ID NO:221的轻链
(iii)包含SEQ ID NO:276的重链和包含SEQ ID NO:277的轻链；
(iv)包含SEQ ID NO:318的重链和包含SEQ ID NO:319的轻链；
(v)包含SEQ ID NO:24的重链和包含SEQ ID NO:25的轻链；
(vi)包含SEQ ID NO:38的重链和包含SEQ ID NO:39轻链；
(vii)包含SEQ ID NO:52的重链和包含SEQ ID NO:53的轻链；
(viii)包含SEQ ID NO:66的重链和包含SEQ ID NO:67的轻链；
(ix)包含SEQ ID NO:80的重链和包含SEQ ID NO:81的轻链；
(x)包含SEQ ID NO:94的重链和包含SEQ ID NO:95的轻链；
(xi)包含SEQ ID NO:108的重链和包含SEQ ID NO:109的轻链；
(xii)包含SEQ ID NO:122的重链和包含SEQ ID NO:123的轻链；
(xiii)包含SEQ ID NO:136的重链和包含SEQ ID NO:137的轻链；
(xiv)包含SEQ ID NO:150的重链和包含SEQ ID NO:151的轻链；
(xv)包含SEQ ID NO:164的重链和包含SEQ ID NO:165的轻链；
(xvi)包含SEQ ID NO:178的重链和包含SEQ ID NO:179的轻链；
(xvii)包含SEQ ID NO:192的重链和包含SEQ ID NO:193的轻链；
(xviii)包含SEQ ID NO:206的重链和包含SEQ ID NO:207的轻链；
(xix)包含SEQ ID NO:248的重链和包含SEQ ID NO:249的轻链；
(xx)包含SEQ ID NO:262的重链和包含SEQ ID NO:263的轻链；
(xxi)包含SEQ ID NO:290的重链和包含SEQ ID NO:291的轻链；
(xxii)包含SEQ ID NO:304的重链和包含SEQ ID NO:305的轻链；或
(xxiii)包含SEQ ID NO:332的重链和包含SEQ ID NO:333的轻链。
10.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其在所述的轻链可变区或重链可变区上保留至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。
11.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人工程化抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
12.权利要求1-11中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述接头(L)选自由可切割的接头、不可切割的接头、亲水性的接头、预带电的接头和基于二羧酸的接头组成的组。
13.权利要求12所述的抗体药物缀合物,其中所述的接头源自于选自由下列组成的组的交联剂:N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,
11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸][2,5-二氧代吡咯烷-1-基]酯(CX1-1)。
14.权利要求13所述的抗体药物缀合物,其中所述接头源自于N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
15.权利要求1-14中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述药物部分(D)选自由下列组成的组:美坦生类化合物、V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里司他汀、多拉司他汀、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1的核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。
16.权利要求15所述的抗体药物缀合物,其中所述的药物部分是美坦生类化合物。
17.权利要求16所述的抗体药物缀合物,其中所述的美坦生类化合物是N(2’)-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)或N(2’)-去乙酰基-N(2’)-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(DM1)。
18.前面的权利要求中任意一种所述的抗体药物缀合物，其与另一种治疗剂组合。
19.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与列在表18中的治疗剂组合。
20.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合。
21.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与免疫调节分子组合。
22.下式的抗体药物缀合物:
或其药学上可接受的盐；其中:
Ab是与人CDH6特异性地结合的抗体或其抗原结合片段,并且n是1至10的整数。
23.权利要求22所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或抗原结合片段与处于(SEQ ID NO:4)的人CDH6的表位特异性地结合。
24.权利要求22所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段与人CDH6在(SEQ ID NO:534)处特异性地结合。
25.权利要求22所述的抗体药物缀合物,其中所述Ab是抗体或其抗原结合片段，其包含:
(i)轻链可变区，其包含:(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:225的LCDR2，(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的HCDR1，(e)SEQ ID NO:228的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
(ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:211的LCDR2，(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213的HCDR1，(e)SEQ ID NO:214的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
(iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:267的LCDR2，(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269的HCDR1，(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
(iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:309的LCDR2，(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311的HCDR1，(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
(v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
15的LCDR2，(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的HCDR1，(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
(vi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
29的LCDR2，(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的HCDR1，(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
(vii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:43的LCDR2，(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的HCDR1，(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
(viii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:57的LCDR2，(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:59的HCDR1，(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
(ix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
71的LCDR2，(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的HCDR1，(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
(x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
85的LCDR2，(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的HCDR1，(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
(xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
99的LCDR2，(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的HCDR1，(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
(xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:113的LCDR2，(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115的HCDR1，(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
(xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:127的LCDR2，(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129的HCDR1，(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
(xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:141的LCDR2，(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143的HCDR1，(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
(xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:155的LCDR2，(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157的HCDR1，(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
(xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:169的LCDR2，(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171的HCDR1，(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
(xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:183的LCDR2，(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185的HCDR1，(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
(xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:197的LCDR2，(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:199的HCDR1，(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
(xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:239的LCDR2，(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241的HCDR1，(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
(xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:253的LCDR2，(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255的HCDR1，(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
(xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:281的LCDR2，(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283的HCDR1，(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
(xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:295的LCDR2，(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297的HCDR1，(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
(xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:323的LCDR2，(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:325的HCDR1，(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
26.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
27.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的一个或两个氨基酸已经被修饰、缺失或取代。
28.权利要求22所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
(i)包含SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
(ii)包含SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
(iii)包含SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
(iv)包含SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
(v)包含SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
(vi)包含SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
(vii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
(viii)包含SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
(ix)包含SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
(x)包含SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
(xi)包含SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
(xii)包含SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
(xiii)包含SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
(xiv)包含SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
(xv)包含SEQ ID NO:160的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
(xvi)包含SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
(xvii)包含SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
(xviii)包含SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
(xix)包含SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
(xx)包含SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
(xxi)包含SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
(xxii)包含SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
(xxiii)包含SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
29.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其在所述的轻链可变区或重链可变区上保留至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。
30.权利要求22-29中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人工程化抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
31.权利要求22-29中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述n是2至8的整数。
32.权利要求22-29中任意一项所述的抗体药物缀合物,其中所述n是3至4的整数。
33.权利要求22-32中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与另一种治疗剂组合。
34.权利要求22-32中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与列在表18中的治疗剂组合。
35.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合。
36.前面的权利要求中任意一项所述的抗体药物缀合物，其与免疫调节分子组合。
37.药物组合物，其包含权利要求1-32中任意一项所述的抗体药物缀合物和药学上可接受的载体。
38.权利要求37所述的药物组合物，其中将所述组合物制备成冻干物。
39.治疗需要治疗的患者中CDH6阳性癌症的方法,包括向所述患者施用权利要求1-32中任意一项所述的抗体药物缀合物或权利要求37-38所述的药物组合物。
40.权利要求39所述的方法，其中所述癌症选自由下列组成的组:卵巢癌、肾癌、肝癌、软组织癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌和胆管上皮癌。
41.权利要求39所述的方法，其中与另一种治疗剂组合施用所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物。
42.权利要求39所述的方法，其中所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物与列在表18中的治疗剂组合施用。
43.权利要求39所述的方法,其中所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合施用。
44.权利要求39所述的方法，其中所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物与免疫调节分子组合施用。
45.权利要求1-32中任意一项所述的抗体药物缀合物，用作药物。
46.权利要求1-32中任意一项所述的抗体药物缀合物或权利要求37-38中任意一项所述的药物组合物,用于治疗CDH6阳性癌症。
47.权利要求45所述的抗体药物缀合物,其与另一种治疗剂组合施用。
48.权利要求45所述的抗体药物缀合物，其与列在表18中的治疗剂组合施用。
49.权利要求45所述的抗体药物缀合物，其与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合。
50.权利要求45所述的抗体药物缀合物，其与免疫调节分子组合。
51.编码权利要求1-30中任意一项所述的抗体或抗原结合片段的核酸。
52.包含权利要求51所述的核酸的载体。
53.包含根据权利要求52所述的载体的宿主细胞。
54.用于生产抗体或抗原结合片段的方法，包括培养权利要求53所述的宿主细胞并且从所述的培养物中回收所述抗体。
55.用于生产抗CDH6抗体药物缀合物的方法,该方法包括:
(a)以化学方法将N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)连接到药物部分DM-4；
(b)将所述接头-药物缀合到权利要求55所述的从所述的细胞培养物中回收的抗体；和(c)纯化所述的抗体药物缀合物。
56.根据权利要求55制备的抗体药物缀合物，采用紫外分光光度计测定，所述抗体药物缀合物具有平均大约3.5的美坦生类化合物与抗体的比率(MAR)。
57.抗体或其抗原结合片段，其包含:
(i)轻链可变区，其包含:(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:225的LCDR2，(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的HCDR1，(e)SEQ ID NO:228的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
(ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:211的LCDR2，(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213的HCDR1，(e)SEQ ID NO:214的HCDR2，和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
(iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:267的LCDR2，(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269的HCDR1，(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
(iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:309的LCDR2，(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311的HCDR1，(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
(v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
15的LCDR2，(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的HCDR1，(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
(vi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
29的LCDR2，(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的HCDR1，(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
(vii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:43的LCDR2，(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的HCDR1，(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
(viii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:57的LCDR2，(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:59的HCDR1，(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
(ix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
71的LCDR2，(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的HCDR1，(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
(x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
85的LCDR2，(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的HCDR1，(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
(xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:
99的LCDR2，(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的HCDR1，(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
(xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:113的LCDR2，(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115的HCDR1，(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
(xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:127的LCDR2，(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129的HCDR1，(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
(xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:141的LCDR2，(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143的HCDR1，(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
(xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:155的LCDR2，(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157的HCDR1，(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
(xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:169的LCDR2，(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171的HCDR1，(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
(xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:183的LCDR2，(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185的HCDR1，(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
(xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:197的LCDR2，(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:199的HCDR1，(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
(xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:239的LCDR2，(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241的HCDR1，(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
(xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:253的LCDR2，(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255的HCDR1，(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
(xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:281的LCDR2，(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283的HCDR1，(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
(xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:295的LCDR2，(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297的HCDR1，(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
(xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)，(b)SEQ ID NO:323的LCDR2，(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:325的HCDR1，(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
58.权利要求57所述的抗体或其抗原结合片段，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表
5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
59.权利要求57所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
(i)包含SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
(ii)包含SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
(iii)包含SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
(iv)包含SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
(v)包含SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
(vi)包含SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
(vii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
(viii)包含SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
(ix)包含SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
(x)包含SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
(xi)包含SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
(xii)包含SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
(xiii)包含SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
(xiv)包含SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
(xv)包含SEQ ID NO:160的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
(xvi)包含SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
(xvii)包含SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
(xviii)包含SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
(xix)包含SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
(xx)包含SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
(xxi)包含SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
(xxii)包含SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
(xxiii)包含SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
60.诊断试剂，其包含权利要求57或59所述的抗体或其抗原结合片段，所述诊断试剂是经标记的。
61.权利要求60所述的诊断试剂,其中所述的标记物选自由放射性标记物、荧光团、发色团、显像剂和金属离子组成的组。

说明书全文

抗CDH6抗体药物缀合物

发明领域

[0001] 本公开涉及抗CDH6抗体、抗体片段、抗体药物缀合物和它们用于治疗癌症的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 钙粘着蛋白是参与细胞间接触的一族细胞粘着分子。在这个家族里有超过30种钙粘着蛋白分子，其由具有个别的结合特异性的亚类组成。有被充分研究的典型的钙粘着蛋
白例如上皮(E)钙粘着蛋白、神经(N)钙粘着蛋白和胎盘(P)钙粘着蛋白，它们在组织例如上
皮的发育和维护中扮演关键角色。也通过钙粘着蛋白家族的氨基酸相似性将其分类,这把
钙粘着蛋白分成两组:I型和II型。其次有组织特异性的钙粘着蛋白例如钙粘着蛋白-6
(CDH6)。
[0004] 在1995年CDH6被首次克隆和表征(Shimoyama等人,Cancer Res.1995:55(10)2206-2211)。由Shimoyama分离的CDH6cDNA是4315个核苷酸的并且编码具有790个氨基酸并
且展示与大鼠K-钙粘着蛋白97％的同源性的钙粘着蛋白(Shimoyama,上文)。CDH6是具有五
个细胞外钙粘着蛋白重复、跨膜结构域和胞质结构域的II型钙粘着蛋白。在探索用于正常
组织表达时,在大脑、小脑和肾脏中检测到CDH6,在肺、胰腺和胃粘膜中具有较弱的表达。在
神经系统中,发现CDH6给听觉和身体感觉系统划界线(Inoue等人,Mol.Cell Neuro.2008:
(39)95-104)。已经证实CDH6是由眼睛中负责诸如亮度、运动方向或边缘这样的视觉质量的
视网膜神经节细胞(RGC)亚组表达的(Osterhout等人,Neuron 2011:71(4)632-639)。在
CDH6敲除小鼠中,CDH6的缺失引起轴突靶向损失。CDH6突变体轴突适当地延长并且被适当
地带领到它们的靶,但是生长穿过和经过它们的连接(Osterhout,上文)。在另一种研究中,
CDH6敲除小鼠展示了在发声方面的缺陷(Nakagawa等人,PLOS 2012:7(11)e49233)。
[0005] 转向它在癌症中的表达,从肝细胞癌细胞系中克隆了CDH6cDNA,它是它可能参与这种类型的癌症的早期指征(Shimoyama,上文)。早期的工作在几种肝细胞瘤系中发现了
CDH6表达,但是在正常的肝脏中没有发现CDH6表达。在后来的工作中,一个小组分析了患有
肾细胞癌的216名患者并且发现CDH6表达与这种类型的癌症关联(Paul等人,J Urology 
2004(171):97-101)。Shimazui发现表达CDH6并且缺乏E-钙粘着蛋白表达的肾细胞癌患者
具有差的预后(Shimazui等人,Clin.Cancer Res.1998(4):2419-2424)。也发现了CDH6是一
种TGF-B靶并且在甲状腺癌中发挥作用(Sancisi等人,PLoS One2013；8(9):e75489)。最后,
显示CDH6是卵巢癌的生物标志物(Kobel等人,PLoS One 2008 5(12):e232)。
[0006] 抗体药物缀合物(“ADC”)已经在癌症的治疗中被用于细胞毒剂的局部递送(参见例如Lambert,Curr.Opinion In Pharmacology 5:543-549,2005)。ADC允许靶向递送药物
部分，其中可以以最小的毒性实现最大的效力。由于更多的ADC显示有希望的临床结果,存
在着增大的开发新的用于癌症治疗的治疗剂的需要。
[0007] 发明概述
[0008] 下式的抗体药物缀合物:
[0009] Ab-(L-(D)m)n
[0010] 或其药学上可接受的盐；其中
[0011] Ab是与人CDH6的表位特异性地结合的抗体或其抗原结合片段；
[0012] L是接头；
[0013] D是药物部分；
[0014] m是1-8的整数；并且
[0015] n是1-10的整数。
[0016] 根据前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所说的n是3或4。
[0017] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合CDH6的胞外结构域(SEQ ID NO:4)。
[0018] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段与处于SEQ ID NO:534的人CDH6的表位特异性地结合。
[0019] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
[0020] (i)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:225的LCDR2、(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:227
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:228的HCDR2和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
[0021] (ii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:211的LCDR2、(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:213
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:214的HCDR2和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
[0022] (iii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:267的LCDR2、(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:269
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
[0023] (iv)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:309的LCDR2、(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:311
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
[0024] (v)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:15的LCDR2、(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:17的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
[0025] (vi)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:29的LCDR2、(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:31的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
[0026] (vii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:43的LCDR2、(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:45的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
[0027] (viii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:57的LCDR2、(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:59的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
[0028] (ix)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:71的LCDR2、(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:73的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
[0029] (x)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:85的LCDR2、(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:87的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
[0030] (xi)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:99的LCDR2、(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:101
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
[0031] (xii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:113的LCDR2、(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:115
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
[0032] (xiii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:127的LCDR2、(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID 
NO:129的HCDR1、(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
[0033] (xiv)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:141的LCDR2、(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:143
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
[0034] (xv)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:155的LCDR2、(c)SEQ ID N NO:156的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:
157的HCDR1、(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
[0035] (xvi)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:169的LCDR2、(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:171
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
[0036] (xvii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:183的LCDR2、(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID 
NO:185的HCDR1、(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
[0037] (xviii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:197的LCDR2、(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID 
NO:199的HCDR1、(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
[0038] (xix)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:239的LCDR2、(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:241
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
[0039] (xx)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:253的LCDR2、(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:255
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
[0040] (xxi)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:281的LCDR2、(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID NO:283
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
[0041] (xxii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:295的LCDR2、(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID 
NO:297的HCDR1、(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
[0042] (xxiii)轻链可变区,其包含:(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:323的LCDR2、(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区,其包含:(d)SEQ ID 
NO:325的HCDR1、(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
[0043] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
[0044] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中在CDR之内的一个或两个氨基酸已经被修饰、缺失或取代。
[0045] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
[0046] (i)含有SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
[0047] (ii)含有SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
[0048] (iii)含有SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
[0049] (iv)含有SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
[0050] (v)含有SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
[0051] (vi)含有SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
[0052] (vii)含有SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
[0053] (viii)含有SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
[0054] (ix)含有SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
[0055] (x)含有SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
[0056] (xi)含有SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
[0057] (xii)含有SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
[0058] (xiii)含有SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
[0059] (xiv)含有SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
[0060] (xv)含有SEQ ID NO:160重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
[0061] (xvi)含有SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
[0062] (xvii)含有SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
[0063] (xviii)含有SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
[0064] (xix)含有SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
[0065] (xx)含有SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
[0066] (xxi)含有SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
[0067] (xxii)含有SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
[0068] (xxiii)含有SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和含有SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
[0069] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
[0070] (i)含有SEQ ID NO:234的重链和含有SEQ ID NO:235的轻链；
[0071] (ii)含有SEQ ID NO:220的重链和含有SEQ ID NO:221的轻链；
[0072] (iii)含有SEQ ID NO:276的重链和含有SEQ ID NO:277的轻链；
[0073] (iv)含有SEQ ID NO:318的重链和含有SEQ ID NO:319的轻链；
[0074] (v)含有SEQ ID NO:24的重链和含有SEQ ID NO:25的轻链；
[0075] (vi)含有SEQ ID NO:38的重链和含有SEQ ID NO:39的轻链；
[0076] (vii)含有SEQ ID NO:52的重链和含有SEQ ID NO:53的轻链；
[0077] (viii)含有SEQ ID NO:66的重链和含有SEQ ID NO:67的轻链；
[0078] (ix)含有SEQ ID NO:80的重链和含有SEQ ID NO:81的轻链；
[0079] (x)含有SEQ ID NO:94的重链和含有SEQ ID NO:95的轻链；
[0080] (xi)含有SEQ ID NO:108的重链和含有SEQ ID NO:109的轻链；
[0081] (xii)含有SEQ ID NO:122的重链和含有SEQ ID NO:123的轻链；
[0082] (xiii)含有SEQ ID NO:136的重链和含有SEQ ID ID NO:137的轻链；
[0083] (xiv)含有SEQ ID NO:150的重链和含有SEQ ID NO:151的轻链；
[0084] (xv)含有SEQ ID NO:164的重链和含有SEQ ID NO:165的轻链；
[0085] (xvi)含有SEQ ID NO:178的重链和含有SEQ ID NO:179的轻链；
[0086] (xvii)含有SEQ ID NO:192的重链和含有SEQ ID NO:193的轻链；
[0087] (xviii)含有SEQ ID NO:206的重链和含有SEQ ID NO:207的轻链；
[0088] (xix)含有SEQ ID NO:248的重链和含有SEQ ID NO:249的轻链；
[0089] (xx)含有SEQ ID NO:262的重链和含有SEQ ID NO:263的轻链；
[0090] (xxi)含有SEQ ID NO:290的重链和含有SEQ ID NO:291的轻链；
[0091] (xxii)含有SEQ ID NO:304的重链和含有SEQ ID NO:305的轻链；或
[0092] (xxiii)含有SEQ ID NO:332的重链和含有SEQ ID NO:333的轻链。
[0093] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物，其在所述的轻链可变区或重链可变区上保留至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。
[0094] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
[0095] 根据前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述接头(L)选自由可切割的接头、非可切割的接头、亲水性接头、预带电的接头和基于二羧酸的接头组成的
组。
[0096] 根据前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述的接头源自于选自由下列组成的组的交联剂:N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺
基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡
啶基二硫代)戊酸盐(SPP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰
亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、顺丁烯二酰亚
胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚
胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(磺基-SMCC)或[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-
吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸][2,5-二氧代吡咯烷-1-
基]酯(CX1-1)。
[0097] 根据前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述接头源自于N-琥珀酰亚胺基-4-(2吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
[0098] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述药物部分(D)选自由下列组成的组:美坦生类化合物、V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、
HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里他汀
(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1的核输出
抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。
[0099] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述的药物部分是美坦生类化合物。
[0100] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述的美坦生类化合物是N(2’)-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)或N(2’)-去乙酰基-N
(2’)-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(DM1)。
[0101] 与另一种治疗剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0102] 与列在表18中的治疗剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0103] 与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0104] 与免疫调节分子组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0105] 下式的抗体药物缀合物:
[0106]
[0107] 或其药学上可接受的盐；其中:
[0108] Ab是与人CDH6特异性地结合的抗体或其抗原结合片段,并且n是1至10的整数。
[0109] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或抗原结合片段与处于(SEQ ID NO:4)的人CDH6表位特异性地结合。
[0110] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段与人CDH6在(SEQ ID NO:534)处特异性地结合。
[0111] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述Ab是抗体或其抗原结合片段，其包含:
[0112] (i)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:225的LCDR2、(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:228的HCDR2和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
[0113] (ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:211的LCDR2、(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:214的HCDR2和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
[0114] (iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:267的LCDR2、(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
[0115] (iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:309的LCDR2、(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
[0116] (v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:15的LCDR2、(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
[0117] (vi)轻链可变区，其包含(vi)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:29的LCDR2、(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
[0118] (vii)轻链可变区，其包含(vii)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:43的LCDR2、(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
[0119] (viii)轻链可变区，其包含(viii)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:57的LCDR2、(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:
59的HCDR1、(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
[0120] (ix)轻链可变区，其包含(ix)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:71的LCDR2、(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
[0121] (x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:85的LCDR2、(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
[0122] (xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:99的LCDR2、(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
[0123] (xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:113的LCDR2、(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
[0124] (xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:127的LCDR2、(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
[0125] (xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:141的LCDR2、(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
[0126] (xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:155的LCDR2、(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
[0127] (xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:169的LCDR2、(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
[0128] (xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:183的LCDR2、(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
[0129] (xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:197的LCDR2、(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:199的HCDR1、(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
[0130] (xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:239的LCDR2、(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
[0131] (xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:253的LCDR2、(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
[0132] (xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:281的LCDR2、(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
[0133] (xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:295的LCDR2、(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
[0134] (xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:323的LCDR2、(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:325的HCDR1、(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
[0135] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
[0136] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物，其中在CDR之内的一个或两个氨基酸已经被修饰、缺失或取代。
[0137] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
[0138] (i)包含SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
[0139] (ii)包含SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
[0140] (iii)包含SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
[0141] (iv)包含SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
[0142] (v)包含SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
[0143] (vi)包含SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
[0144] (vii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
[0145] (viii)包含SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
[0146] (ix)包含SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
[0147] (x)包含SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
[0148] (xi)包含SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
[0149] (xii)包含SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
[0150] (xiii)包含SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
[0151] (xiv)包含SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
[0152] (xv)包含SEQ ID NO:160的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
[0153] (xvi)包含SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
[0154] (xvii)包含SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
[0155] (xviii)包含SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
[0156] (xix)包含SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
[0157] (xx)包含SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
[0158] (xxi)包含SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
[0159] (xxii)包含SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
[0160] (xxiii)包含SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
[0161] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物，其保留所述的轻链可变区或重链可变区上至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。
[0162] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、人工程抗体、人抗体、单链抗体(scFv)或抗体片段。
[0163] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述n是2至8的整数。
[0164] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,其中所述n是3至4的整数。
[0165] 与另一种治疗剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0166] 与列在表18中的治疗剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0167] 与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0168] 与免疫调节分子组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0169] 药物组合物，其包含前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物和药学上可接受的载体。
[0170] 前面的实施方式中任意一种所述的药物组合物，其中把所述组合物制备成冻干物。
[0171] 前面的实施方式中任意一种所述的药物组合物,其中所述冻干物包含前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物、琥珀酸钠和聚山梨酸酯20。
[0172] 治疗需要治疗的患者中CDH6阳性的癌症的方法,包括向所述患者施用所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物。
[0173] 所述的方法，其中所述癌症选自由下列组成的组:卵巢癌、肾癌、肝癌、软组织癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌和胆管上皮癌。
[0174] 所述的方法，其中与另一种治疗剂组合施用所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物。
[0175] 所述的方法，其中与列在表18中的治疗剂组合施用所述的抗体药物缀合物或所述的药物组合物。
[0176] 与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0177] 与免疫调节分子组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0178] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物用作药物。
[0179] 所述的抗体药物缀合物或其药物组合物,用于治疗CDH6阳性癌症。
[0180] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物,与另一种治疗剂组合施用。
[0181] 与列在表18中的治疗剂组合施用的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0182] 与BCL2抑制剂、BCL-XL抑制剂、BCL2/BCL-XL抑制剂、IAP抑制剂或MEK抑制剂组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0183] 与免疫调节分子组合的前面的实施方式中任意一种所述的抗体药物缀合物。
[0184] 编码前面的实施方式中任意一种所述的抗体或抗原结合片段的核酸。
[0185] 包含前面的实施方式中任意一种所述的核酸的载体。
[0186] 包含根据前面的实施方式中任意一种所述的载体的宿主细胞。
[0187] 用于生产抗体或抗原结合片段的方法，包括培养宿主细胞并且从所述的培养物中回收抗体。
[0188] 用于生产抗CDH6抗体药物缀合物的方法,该方法包括:
[0189] (a)以化学方法把2-磺基-丁酸[N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)]酯(磺基-SPDB)连接到药物部分DM-4；
[0190] (b)把所述接头-药物缀合到从所述的细胞培养物中回收的抗体；和
[0191] (c)纯化所述的抗体药物缀合物。
[0192] 根据前面的实施方式中任意一种制造的抗体药物缀合物，采用紫外分光光度计测定，其具有平均大约3.5的美坦生类化合物与抗体的比率(MAR)。
[0193] 抗体或其抗原结合片段，其包含:(i)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:225的LCDR2、(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链
可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的HCDR1、(e)SEQ ID NO:228的HCDR2和(f)SEQ ID NO:
229的HCDR3；
[0194] (ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:211的LCDR2、(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:214的HCDR2和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
[0195] (iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:267的LCDR2、(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
[0196] (iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:309的LCDR2、(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
[0197] (v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:15的LCDR2、(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
[0198] (vi)轻链可变区，其包含(vi)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:29的LCDR2、(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
[0199] (vii)轻链可变区，其包含(vii)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:43的LCDR2、(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
[0200] (viii)轻链可变区，其包含(viii)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:57的LCDR2、(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:
59的HCDR1、(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
[0201] (ix)轻链可变区，其包含(ix)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:71的LCDR2、(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
[0202] (x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:85的LCDR2、(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
[0203] (xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:99的LCDR2、(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
[0204] (xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:113的LCDR2、(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
[0205] (xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:127的LCDR2、(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
[0206] (xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:141的LCDR2、(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
[0207] (xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:155的LCDR2、(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
[0208] (xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:169的LCDR2、(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
[0209] (xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:183的LCDR2、(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
[0210] (xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:197的LCDR2、(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:199的HCDR1、(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
[0211] (xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:239的LCDR2、(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
[0212] (xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:253的LCDR2、(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
[0213] (xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:281的LCDR2、(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
[0214] (xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:295的LCDR2、(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
[0215] (xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:323的LCDR2、(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:325的HCDR1、(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3。
[0216] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体或其抗原结合片段，其中在CDR之内的至少一个氨基酸被表5或6中另一种抗CDH6抗体的相应CDR的相应残基取代。
[0217] 前面的实施方式中任意一种所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含:
[0218] (i)包含SEQ ID NO:230的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:231的轻链可变区(vL)；
[0219] (ii)包含SEQ ID NO:216的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:217的轻链可变区(vL)；
[0220] (iii)包含SEQ ID NO:272的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:273的轻链可变区(vL)；
[0221] (iv)包含SEQ ID NO:314的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:315的轻链可变区(vL)；
[0222] (v)包含SEQ ID NO:20的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(vL)；
[0223] (vi)包含SEQ ID NO:34的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:35的轻链可变区(vL)；
[0224] (vii)包含SEQ ID NO:48的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:49的轻链可变区(vL)；
[0225] (viii)包含SEQ ID NO:62的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:63的轻链可变区(vL)；
[0226] (ix)包含SEQ ID NO:76的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:77的轻链可变区(vL)；
[0227] (x)包含SEQ ID NO:90的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:91的轻链可变区(vL)；
[0228] (xi)包含SEQ ID NO:104的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:105的轻链可变区(vL)；
[0229] (xii)包含SEQ ID NO:118的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:119的轻链可变区(vL)；
[0230] (xiii)包含SEQ ID NO:132的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:133的轻链可变区(vL)；
[0231] (xiv)包含SEQ ID NO:146的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:147的轻链可变区(vL)；
[0232] (xv)包含SEQ ID NO:160的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:161的轻链可变区(vL)；
[0233] (xvi)包含SEQ ID NO:174的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:175的轻链可变区(vL)；
[0234] (xvii)包含SEQ ID NO:188的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:189的轻链可变区(vL)；
[0235] (xviii)包含SEQ ID NO:202的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:203的轻链可变区(vL)；
[0236] (xix)包含SEQ ID NO:244的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:245的轻链可变区(vL)；
[0237] (xx)包含SEQ ID NO:258的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:259的轻链可变区(vL)；
[0238] (xxi)包含SEQ ID NO:286的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:287的轻链可变区(vL)；
[0239] (xxii)包含SEQ ID NO:300的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:301的轻链可变区(vL)；或
[0240] (xxiii)包含SEQ ID NO:328的重链可变区(vH)和包含SEQ ID NO:329的轻链可变区(vL)。
[0241] 诊断试剂，其包含被标记的前面的实施方式中任意一种所述的抗体或其抗原结合片段。
[0242] 前面的实施方式中任意一种所述的诊断试剂,其中所述的标记物选自由放射性标记物、荧光团、发色团、显像剂和金属离子组成的组。
[0243] 定义
[0244] 除非另有说明,下列术语和短语正如本文中所用的那样，意图具有下列含义。
[0245] 术语"烷基"是指具有指定成碳原子数目的单价饱和烃链。例如,C1-6烷基是指具有1至6个碳原子的烷基。烷基可以是直链的或带支链的。代表性的支链烷基具有一个、两个或
三个分枝。烷基的实例包括但是不限于甲基、乙基、丙基(正丙基和异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)、戊基(正戊基、异戊基和新戊基)和己基。
[0246] 术语“抗体”正如本文中所用的那样，是指能够非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白家族的多肽。例如天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互
连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的四聚体。每个重链由重链可变区(在本文中缩写
成VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可
变区(在本文中缩写成VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以进一
步把所述的VH和VL区细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区,其间散布着更加保守的被
称为构架区(FR)的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端到羧基端按照以下
顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组
织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典的补体系统的第一组分(Clq)。
[0247] 术语“抗体”包括但是不限于单克隆抗体、人抗体、人源化的抗体、骆驼抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如,抗本公开的抗体的抗Id抗体)。所述的抗体可以是任何同种型/类别的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、
IgG4、IgA1和IgA2)。
[0248] “互补决定域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地是指VL和VH的高变区。所述的CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，其含有用于这样的靶蛋白的特异性。在每个人VL或VH中存在着三个CDR(CDR1-3,从N-端起顺序地编号),构成所述的可变结构域的大约15-20％。可以通
过它们的区和顺序来提及CDR。例如,“VHCDR1”或“HCDR1”这两者是指重链可变区的第一
CDR。所述的CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并且因而直接地对结合特异性负责。VL或VH
的其余片段,所谓的构架区,在氨基酸序列方面展示较小的变化(Kuby,Immunology,第4版,
第4章，W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。
[0249] 可以使用本领域中各种熟知的定义来确定所述的CDR和构架区的位置,例如Kabat、Chothia和AbM(参见例如Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；
Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883
(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al Lazikani等人,J.Mol.Biol.,
273:927-748(1997))。抗原组合部位的定义也被描述在下列中:Ruiz等人,Nucleic Acids 
Res.,28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；
MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268–9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:
121–153(1991)；和Rees等人,在Sternberg M.J.E.(编辑),Protein Structure 
Prediction,牛津大学出版社,牛津大学,141–172(1996)。
[0250] 所述的轻链和重链这两者被分成具有结构和功能同源性的区。在功能上使用术语“恒定的”和“可变的”。在这方面,将会理解所述的轻(VL)和重(VH)链部分这两者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地,所述的轻链(CL)和所述的重链(CH1、CH2或CH3)的恒
定结构域赋予重要的生物学性质例如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合、互补结合等等。
按照惯例,当恒定区结构域变得距离抗体的抗原结合位点或氨基端更加远时，它们的编号
增大。所述的N-端是可变区并且在所述的C端处是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别地包
含重链和轻链的羧基端结构域。
[0251] 正如本文中所用的那样,术语“抗原结合片段”是指包含保留了特异性地(例如通过结合、位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)与抗原的表位相互作用的抗体的一个或更多个
部分的多肽。结合片段的实例包括但是不限于单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、
Fab片段、F(ab’)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含两个通过处于绞链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；
由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,
1989),其由VH结构域组成；以及分离的互补决定区(CDR)或抗体的其它表位结合片段。
[0252] 而且,尽管所述的Fv片段的两个结构域VL和VH是由分开的基因编码的,但是可以使用重组方法,通过合成接头使它们相连，合成接头使得它们能够被制造成单个的蛋白链，
其中所述的VL和VH区配对而形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”)；参见例如Bird等人,
Science 242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。
也意图将这样的单链抗体包括在术语“抗原结合片段”之内。使用本领域技术人员已知的常
规技术得到这些抗原结合片段,并且用和完整的抗体一样的方式针对实用性筛选所述的片
段。
[0253] 还可以把抗原结合片段掺入单结构域抗体、最大抗体、小抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如,Hollinger和Hudson,Nature 
Biotechnology 23:1126-1136,2005)。可以把抗原结合片段植入基于多肽例如III型纤连
蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199,其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
[0254] 可以把抗原结合片段掺入包含一对串联的Fv段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,Protein Eng.8:1057-1062,
1995；和美国专利号5,641,870)。
[0255] 术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”正如本文中所用的那样，是指多肽,其包括具有实质上相同的氨基酸序列或源自于相同的遗传来源的抗体和抗原结合片段。这个
术语也包括具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示针对特定表位的
单一结合特异性和亲和力。
[0256] 正如本文中所用的那样,术语“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中所述的构架区和CDR区这两者源自于人源序列。而且,如果抗体包含恒定区,则恒定区也源自于这样的
人序列,例如人种系序列或人种系序列的突变形式或包含来源于人构架序列分析的共有构
架序列的抗体,例如正如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中描述的那样。
[0257] 本公开所述的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如通过随机的或位点特异性的体外诱变或通过体内体细胞突变引入的突变或用来促进稳定性或生产的
保守性取代)。
[0258] 术语“识别”正如本文中所用的那样，是指抗体或其抗原结合片段找到并且与它的表位相互作用(例如结合),无论该表位是线性的还是构象的。术语“表位”是指本公开的抗
体或抗原结合片段特异性地结合的抗原上的部位。表位可以从通过蛋白质的第三级折叠并
置的相邻的氨基酸或非相邻的氨基酸形成。在暴露于变性溶剂时，由相邻的氨基酸形成的
表位通常被保留了,而当用变性溶剂处理时，由第三级折叠形成的表位通常被丢失了。在一
种独特的立体构象中，一个表位相通常包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的立体构象的方法包括本领域中的多种技术,例如X-射线晶体衍射和2维核
磁共振(参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66
卷,G.E.Morris编辑(1996))。“互补位”是识别抗原的表位的抗体部分。
[0259] 短语“特异性地结合”或“选择性地结合”，当其在描述抗原(例如蛋白)和抗体、抗体片段或来源于抗体的结合剂之间的相互作用的背景中被使用时，是指决定着在蛋白质和其它生物制剂的异源群体中，例如在生物样品(例如血液、血清、血浆或组织样品)中抗原存
在的结合反应。因此,在某些指明的免疫测定条件下,具有特定的结合特异性的抗体或结合
剂与特定的抗原结合至少两倍于背景并且实质上不以显著数量与存在于所述的样品中的
其它抗原结合。在一个方面中,在指明的免疫测定条件下,具有特定的结合特异性的抗体或
结合剂与特定的抗原结合至少十(10)倍于背景并且实质上不以显著数量与存在于所述的
样品中的其它抗原结合。在这样的条件下，与抗体或结合剂的特异性结合可能需要针对所
述的抗体或结合剂筛选它对于特定蛋白的特异性。根据需要或合适的,可以通过扣除与来
自其它物种(例如小鼠或大鼠)或其它亚型中的分子交叉反应的抗体来实现这种筛选。备选
地,在一些方面中,挑选与某些所要的分子交叉反应的抗体或抗体片段。
[0260] 术语“亲和力”正如本文中所用的那样，是指在抗体和抗原之间在单一的抗原位点处相互作用的力量。在每个抗原位点之内,所述的抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与
抗原在许多位点处相互作用；相互作用越多,亲和力越强。
[0261] 术语“分离的抗体”是指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。然而,与一种抗原特异性地结合的分离的抗体可能具有与其它抗原的交叉反应性。而且,分离
的抗体可以实质上不含其它细胞物质和/或化学制剂。
[0262] 术语“相应的人种系序列”是指由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的所有其它已知的可变区氨基酸序列相比，编码与参考可变区氨基酸序列或子序列共有最高的确定的
氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列。相应的人种系序列还可以
是指与所有其它评估的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最
高的氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅仅是构
架区、仅仅是互补决定区、构架和互补决定区、可变区段(正如上面定义的那样)或包含可变
区的序列或子序列的其它组合。可以使用本文中所描述的方法,例如使用BLAST、ALIGN或本
领域中已知的另一种比对算法比对两个序列，可以测定序列同一性。相应的人种系核酸或
氨基酸序列可以与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少大约90％、91、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0263] 可以使用多种免疫测定形式来筛选与特定的蛋白特异性地免疫反应的抗体。例如,以常规方式使用固相ELISA免疫测定来筛选与蛋白特异性地免疫反应的抗体(,关于可
以被用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件参见例如Harlow&Lane,Using 
Antibodies,A Laboratory Manual(1998))。通常，特异性的或选择性的结合反应将会产生
至少两倍于背景信号以及更通常至少10至100倍于背景的信号。
[0264] 术语“平衡解离常数(KD,M)”是指离解速率常数(kd,时间-1)除以缔合速率常数(ka,时间-1,M-1)。可以使用本领域中任何已知的方法测定平衡解离常数。本公开所述的抗
体一般地将具有小于大约10-7或10-8M,例如小于大约10-9M或10-10M,在一些方面中,小于大
11 12 -13
约10- M、10- M或10 M的平衡解离常数。
[0265] 术语“生物利用率”是指向患者施用的给定量药物的全身性利用率(即血液/血浆水平)。生物利用率是指示从施用的剂型中达到全身循环的时间(速率)和药物总量(范围)
这两者的量度的绝对项。
[0266] 正如本文中所用的那样,短语“基本上由...组成”是指包括在一种方法或组合物中的活性药剂的类或种以及用于预定目的的该方法或组合物的非活性的任何赋形剂。在一
些方面中,短语“基本上由...组成”排除了包含一种或更多种除本公开的抗体药物缀合物
以外的另外的活性剂。在一些方面中,短语"基本上由...组成"明确排除了包含一种或更多
种除本公开的抗体药物缀合物和同时施用的第二药剂以外的一种或更多种另外的活性剂。
[0267] 术语“氨基酸”是指天然存在的、合成的和非自然的氨基酸以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码
编码的那些氨基酸以及后来被修饰的那些氨基酸,例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷
酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构即与氢结合的
α-碳、羧基、氨基和R基团的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链,但是保留了与天然存
在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的
结构,但是以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
[0268] 术语“保守性地修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列这两者。关于特定的核酸序列,保守性地修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或当核酸
不编码氨基酸序列时,是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并,大量的功能上相同的
核酸编码任何给定的蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因
此,在其中丙氨酸是用一种密码子表示的每个位置处,可以把该密码子改变为所描述的相
应密码子中的任意一种而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守性
地修饰的变异中的一种。在本文中每个编码多肽的核酸序列也描述所述的核酸的每种可能
的沉默变异。技术人员将会认识到可以修饰核酸中的每个密码子(除了通常仅是甲硫氨酸
的密码子的AUG以及通常仅是色氨酸的密码子的TGG以外)以产生在功能上相同的分子。因
此,在每个描述的序列中，编码多肽的核酸的每一种沉默变异是隐含的。
[0269] 关于多肽序列“, 保守性地修饰的变体”包括对于多肽的单个取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表是本领域中熟知的。这样的保守性地修饰的变体是附加性的并且不排除多形性变体、种间同源物
和等位基因。下列8组包含相互之间是保守性取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天
冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins
(1984))。在一些方面中,术语“保守性序列修饰”被用来指不显著地影响或改变包含氨基酸
序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
[0270] 术语“最优化的”正如本文中所用的那样，是指已经被改变而使用在生产细胞或生物体,一般地真核细胞,例如酵母细胞、毕赤酵母属细胞、真菌细胞、木霉属细胞、中国仓鼠
卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的密码子编码氨基酸序列的核苷酸序列。把最优化的核苷
酸序列工程化以完全地或尽可能地保留最初由也被称为“亲本”序列的起始核苷酸序列编
码的氨基酸序列。
[0271] 术语“同一％”或“同一性％”在两种或更多种核酸或多肽序列的背景中,是指两个或更多个序列或子序列相同的程度。如果两个序列在被比较的区上具有相同的氨基酸或核
苷酸序列，则它们是“相同的”。如果当针对在比较窗口或指明的区上，进行最大一致性比较和比对时，正如使用下列序列比较算法中的一种测定的那样或者通过手工比对和肉眼观察
测定的那样，两个序列具有相同氨基酸残基或核苷酸的指定的百分数(即在指定的区上,或
者当没有指定时，在整个序列上，60％同一性,任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％或99％同一性)，则两个序列是“实质上同一的”。任选地,同一性存在于长度至少大约
为30个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上,或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核
苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
[0272] 为了序列比较,通常一个序列充当参考序列,将其与试验序列比较。当使用序列比较算法时,把试验序列和参考序列输入电脑,指定子序列坐标,如有必要,并且指明序列算
法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。然后序列比较算法基于程序参
数，针对试验序列相对于参考序列计算序列同一性％。
[0273] 正如本文中所用的那样,“比较窗口”包括具有选自由20至600,通常大约50至大约200,更通常大约100至大约150个组成的组的任意一种位置的相邻位置的区段的指代，其中
在对两个序列进行最佳比对以后，可以把序列与具有相同数目相邻位置的参考序列比较。
用于比较的比对序列的方法是本领域中熟知的。例如通过Smith和Waterman,
Adv.Appl.Math.2:482c(1970)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,
J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法,通过这些算法的计算机化的
实施(GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics 
Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)中,或通过手工比对和肉眼观察(参见例如
Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology,2003)，可以进行用于比较的最佳
序列比对。
[0274] 适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法,它们分别被描述在Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和
Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可公开地通
过国家生物技术中心(the National Center for Biotechnology)得到。这种算法涉及首
先通过在询问序列中鉴定长度W的短字来鉴定高得分序列对(HSP),当与数据库序列中具有
相同长度的词比对时，该短字要么匹配要么满足某种正值的阈值得分T。T被称为邻近词得
分阈值(Altschul等人,上文)。这些初始的邻近词命中充当用于启动检索以发现包含它们
的更长HSP的种子。把所述的词命中沿着每个序列双向延伸，直到能够增大累积的比对得
分。对于核苷酸序列,使用参数M(对于一对匹配的残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配
的残基罚分；总是<0)计算累积的得分。对于氨基酸序列,使用打分矩阵来计算累积得分。当
下列情况发生时，停止在每个方向上词命中的延伸:累积比对得分从它的最大实现值中减
少数量X；由于积累了一个或更多个负的得分残基比对，累积得分变为零或以下；或达到任
一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸
序列)使用词长11(W)、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两个链的比较作为默认值。对于氨基酸
序列,BLASTP程序使用词长3和期望值(E)10以及50的BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和
Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)、期望值(E)10、M＝5、N＝-4
和两个链的比较作为默认值。
[0275] BLAST算法也进行两个序列之间的相似性统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最
小总概率(P(N)),其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间将会发生偶然匹配的概率的指标。
例如,如果在试验核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于大约0.2,更优选地小于大约
0.01,以及最优选地小于大约0.001，则认为一种核酸与一种参考序列相似。
[0276] 还可以使用已经被整合到ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和Miller,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,1988)的算法,使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和
缺口罚分4，来测定两个氨基酸序列之间的同一性％。另外,可以使用已经被整合到GCG软件
包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法，使用
Blossom62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，来测定两个氨基酸序列之间的同一性％。
[0277] 除上面记录的序列同一性百分比以外,两个核酸序列或多肽实质上同一的另一个指标是:由第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体在免疫学上是交叉
反应性的,如下所述。因此,一种多肽通常与第二多肽是实质上同一的,例如,当所述的两个
肽仅仅相差保守性取代时。两个核酸序列实质上是同一的另一个指标是:所述的两个分子
或它们的补体彼此在严谨条件下杂交,如下所述。两个核酸序列实质上同一的又一个指标
是:可以使用相同的引物来扩增所述的序列。
[0278] 术语"核酸"在本文中可与术语“多核苷酸”互换地使用并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括包含已知的核苷酸类似物或修
饰的主链残基或键的核酸,其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相
似的结合性质并且其以类似于参考核苷酸的方式被代谢。这样的类似物的实例非限定性地
包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性的膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
[0279] 除非另有指示,特定的核酸序列也隐含地包括其保守性地修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确地指示的序列。具体地,正如下面详述的那样,可以通过
产生其中一种或更多种选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基
取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；
Ohtsuka等人,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人,(1994)
Mol.Cell.Probes8:91-98)。
[0280] 在核酸的背景中，术语“有效连接”是指在两种或更多种多核苷酸(例如DNA)片段之间的功能关系。通常,它是指转录的调节序列与转录的序列的功能关系。例如,启动子或
增强子序列与编码序列是有效连接的，如果它刺激或调节合适的宿主细胞或其它表达系统
中编码序列的转录的话。一般地,与转录的序列有效连接的启动子转录调节序列与所述转
录的序列在物理上是相邻的,即它们是顺式作用的。然而,某些转录的调节序列,例如增强
子，不必在物理上是相邻的或位于紧密邻近于其转录被它们增强的编码序列之处。
[0281] 在本文中可将术语“多肽”和“蛋白质”互换地使用，用来指氨基酸残基的多聚物。该术语适用于氨基酸多聚物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的
人造化学模拟物以及用来指天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。除非
另有指示,特定的多肽序列也隐含地包括其保守性地修饰的变体。
[0282] 正如本文中所用的那样，术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂例如有效负荷、药物部分、化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等等的连接。所述的连接可以是共价键或非共价相互作用例如通过静电力。为了形成免疫缀合物，可以使用本领域中已知的各种接头。另外,可以以融合蛋白形式提供免疫缀合
物，可以从编码免疫缀合物的多核苷酸表达该融合蛋白。正如本文中所用的那样,“融合蛋
白”是指通过连接最初为分开的蛋白质(包括肽和多肽)编码的两种或更多种基因或基因片
段而产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有来源于每一种原来的蛋白的功能性质的单一
蛋白。
[0283] 正如本文中所用的那样,术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,例如非人灵长类、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了当提到时以外,在本文中可互换地使用术语“患者”或“受试者”。
[0284] 正如本文中所用的那样,术语“毒素”、“细胞毒素”或“细胞毒性剂”是指对细胞的生长和增殖有害并且可以起作用而减小、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何药剂。
[0285] 正如本文中所用的那样，术语“抗癌剂”是指可以被使用来治疗细胞增生性的病症例如癌症的任何药剂,包括但不限于细胞毒剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向
的抗癌剂和免疫治疗剂。
[0286] 术语“药物部分”或“有效负荷”正如本文中所用的那样,是指与抗体或抗原结合片段缀合的化学部分并且可以包括任何治疗剂或诊断试剂,例如抗癌剂、抗炎剂、抗感染剂
(例如抗真菌剂、抗菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)或麻醉剂。在某些方面中,药物部分选自V-ATP酶抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里司他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、美坦生类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白CRM1的核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑
制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、蛋白酶体抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。用于使这些中的每一个附着到与抗体相容的接头的方法和本公开的方法是本领域中已知的。参见例如Singh
等人,(2009)Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols,第525卷,445-457。另外,
有效负荷可以是生物物理学探针、荧光团、自旋标记物、红外线探针、亲和力探针、螯合剂、光谱探针、放射性探针、脂质分子、聚乙二醇、多聚物、自旋标记物、DNA、RNA、蛋白质、肽、表面、抗体、抗体片段、纳米微粒、量子点、脂质体、PLGA微粒、糖或多糖。
[0287] 术语“美坦生类化合物药物部分”意指具有美坦生类化合物化合物的结构的抗体-药物缀合物的子结构。首先把美登素从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离出
来(美国专利号3,896,111)。随后,人们发现某些微生物也产生美坦生类化合物,例如美登
醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。已经报道了合成的美登醇和美登醇类似物。参
见美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,
307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,
348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533,以及Kawai等人(1984)Chem.Pharm.Bull.3441-3451,通过引用将其每一篇文献明确地并入
本文。可用于缀合的美坦生类化合物的具体实例包括DM1、DM3和DM4。
[0288] “肿瘤”是指赘生性细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,以及所有的前癌性和癌性的细胞和组织。
[0289] 术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖速率、生存能力或转移性活性的减小。一种可能的显示抗肿瘤活性的方式是显示肿瘤细胞生长速率的下降、肿瘤尺寸停滞或肿瘤尺寸
减小。可以使用体外或体内接受的肿瘤模型,包括但不限于异种移植模型、异源移植模型、
MMTV模型以及本领域中已知的其它已知的模型研究抗肿瘤活性，来评定这样的活性。
[0290] 术语“恶性肿瘤”是指非良性肿瘤或癌。正如本文中所用的那样,术语“癌”包括特征在于去调节的或不受控制的细胞生长的恶性肿瘤。示范性的癌包括:癌瘤、肉瘤、白血病
和淋巴瘤。
[0291] 术语“癌”包括原发性恶性肿瘤(例如除原始肿瘤的位点以外，其细胞未曾迁移到受试者身体中的位点处的那些恶性肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如从转移产生的那些恶性
肿瘤,肿瘤细胞迁移到不同于原始肿瘤位点的二级位点)。
[0292] 术语“钙粘着蛋白6”或“CDH6”是指作为细胞-细胞粘着分子的钙粘着蛋白家族的成员的细胞粘着分子。CDH6的核酸和氨基酸序列是已知的,并且已经被公布在GenBank登录
号Nos.AK291290(蛋白质登录号BAF83979.1)。也参见关于人CDH6 cDNA序列的SEQ ID NO:1
和关于人CDH6蛋白序列的SEQ ID NO:2。在结构上,CDH6受体是具有5个胞外钙粘着蛋白重
复并且在它的全长上与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的II型钙粘着蛋白。在结构上,CDH6核酸序列在它的全长上与SEQ ID NO 1的核酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0293] 术语“表达CDH6的癌症”或“CDH6阳性的癌症”是指在癌细胞的表面上表达CDH6和/或CDH6的突变体形式的癌症。
[0294] 正如本文中所用的那样,术语任意一种疾病或病症的“治疗”在一个方面中是指改善所述的疾病或病症(即减慢或阻止或减少所述的疾病或其至少一种临床症状的发展)。在
一个方面中,"治疗"是指减轻或改善至少一种物理参数，包括不能被患者觉察的那些物理
参数。在又一个方面中,"治疗"是指调节所述的疾病或病症,要么以身体方式(例如可觉察
的症状的稳定化)、以生理学方式(例如身体参数的稳定化)或这两者。在又一个方面中,"治
疗"是指预防或迟滞所述的疾病或病症的发作或发展或进展。
[0295] 术语“治疗上可接受的量”或“治疗上的有效剂量”可互换地是指足以实现所要的结果的数量(即减小肿瘤的尺寸、抑制肿瘤的生长、预防转移、抑制或预防病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)。在一些方面中,治疗上可接受的量不诱发或引起不受欢迎的副作用。通过
首先施用低剂量,然后逐渐地增加剂量直到达到所要的效果，可以确定治疗上可接受的量。
本公开所述的分子的“预防上有效的剂量”和“治疗上有效的剂量”可以分别地预防包括与
癌症有关的症状在内的疾病症状的发作或导致所述疾病症状的严重性减小。
[0296] 术语“共同施用”是指在个体的血液中同时存在两种活性剂。可以同时或顺序地递送被共同施用的活性剂。
[0297] 附图简述
[0298] 图1是在OVCAR3细胞上抗CDH6抗体的细胞结合EC50的图示描绘。
[0299] 图2显示抗CDH6抗体的表位装箱。
[0300] 图3表示CDH6的五个EC结构域的氘作图。
[0301] 图4是覆盖在CDH2ECD的已知结构上与CDH6EC5结构域结合的NOV0710的晶体结构。
[0302] 图5描绘与CDH6结合的NOV0712的晶体结构。
[0303] 图6描绘与CDH6结合的NOV0710的晶体结构。
[0304] 图7是显示三种抗CDH6抗体与CDH6的突变体形式结合的能力的ELISA试验。
[0305] 图8是要么未缀合的要么与磺基SPDB-DM4接头缀合的抗CDH6抗体/与表达人、猕猴、大鼠或小鼠CDH6的CHO细胞系结合的有效负荷的FACS数据。
[0306] 图9是显示在包括CDH6转染的细胞系和具有CDH6siRNA敲减的细胞系在内的卵巢癌细胞系上的CDH6表达水平的FACS图形。
[0307] 图10显示在一组卵巢癌细胞系中，要么未缀合的要么与磺基-SPDB-DM4接头/有效负荷缀合的抗CDH6抗体。
[0308] 图11显示在卵巢癌细胞系上，当与DM1或DM4缀合时，抗CDH6抗体的体外活性。
[0309] 图12显示未缀合的抗CDH6抗体或与磺基-SPDB-DM4缀合的抗CDH6抗体的体外活性。
[0310] 图13证明当与DM1缀合并且在卵巢癌异种移植小鼠模型中试验时，抗CDH6抗体的效力。
[0311] 图14证明当与DM1缀合并且在卵巢癌异种移植小鼠模型中试验时，抗CDH6抗体的效力。
[0312] 图15显示当SPDB-DM4缀合并且在卵巢癌异种移植小鼠模型中试验时，抗CDH6抗体的效力。
[0313] 图16比较了在卵巢癌异种移植小鼠模型中NOV0712-SPDB-DM4和NOV0712-SMCC-DM1的效力。
[0314] 图17在来源于患者的原代肿瘤异种移植(PTX)小鼠卵巢癌模型中，比较了NOV0712与SPDB-DM4、磺基-SPDB-DM4和SMCC-DM1接头/有效负荷组合的效力。
[0315] 图18显示在卵巢癌异种移植小鼠模型中，当与SPDB-DM4或磺基-SPDB-DM4缀合时，不同剂量的NOV0712的效力。
[0316] 图19在来源于患者的原代卵巢肿瘤异种移植小鼠模型中，比较了NOV0712与磺基-SPDB DM和SMCC-DM1接头有效负荷的组合。
[0317] 图20在来源于患者的原代异种移植小鼠卵巢癌模型中证明与磺基-SPDB-DM4缀合的抗CDH6抗体的体内效力。
[0318] 图21在来源于患者的原代异种移植小鼠肾癌模型中证明与磺基-SPDB-DM4缀合的抗CDH6抗体的体内效力。
[0319] 图22在来源于患者的原代异种移植小鼠肾癌模型中显示与磺基-SPDB-DM4缀合的抗CDH6抗体的体内效力。
[0320] 图23在来源于患者的原代异种移植小鼠肾癌模型中显示与磺基-SPDB-DM4缀合的抗CDH6抗体的体内效力。
[0321] 图24提供靶向CDH6的ADC与BCL2/BCL-Xl、BCL-Xl、IAP和MEK抑制剂的组合活性的Loewe协同作用得分。
[0322] 图25是在癌性组织中CDH6 mRNA表达的图示。
[0323] 图26是通过免疫组织化学在卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌和胆管上皮癌组织中CDH6蛋白质表达的图示。
[0324] 详细说明
[0325] 本公开提供与CDH6结合的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物。特别地,本公开指向与CDH6结合并且在这样的结合时内在化的抗体和抗体片段(例如抗
原结合片段)。可以使用本公开所述的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)来生产抗体药
物缀合物。此外,本公开提供抗体药物缀合物，其具有所希望的药物动力学特征以及其它所
希望的属性,因此可以被用于治疗表达CDH6的癌症,例如非限定性地:卵巢癌、肾癌、肝癌、
软组织癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌和胆管上皮癌。本公开进一步提供包含抗体药物缀
合物的药物组合物以及制造和使用这样的药物组合物用于治疗癌症的方法。
[0326] 抗体药物缀合物
[0327] 本公开提供抗体药物缀合物,其中与CDH6特异性地结合的抗体、抗原结合片段或它的功能等同物与药物部分相连。在一个方面中,通过接头经由共价连接，使抗体、抗原结
合片段或它们的功能等同物与作为抗癌剂的药物部分连接。抗体药物缀合物可以选择性地
把有效剂量的抗癌剂(例如细胞毒剂)递送到表达CDH6的肿瘤组织,凭此可以实现更大的选
择性(以及较低的有效剂量)。
[0328] 在一个方面中,本公开提供了式(I)的免疫缀合物:
[0329] Ab—(L—(D)m)n
[0330] 其中Ab代表本文中描述的结合CDH6的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)；
[0331] L是接头；
[0332] D是药物部分；
[0333] m是1-8在内的整数；和
[0334] n是1-20的整数。在一个方面中,n是1至10、2至8或2至5的整数。在一个具体的方面中,n是3至4。在一些方面中,m是1。在一些方面中,m是2、3或4。
[0335] 虽然对于特定的缀合物分子，药物部分与抗体比率具有精确的整数值(例如在式(I)中，n乘以m),但是应该明白:当被使用来描述包含许多分子的样品时，由于某种程度的
不均一性,通常与缀合步骤有关，该值将会常常是平均值。关于免疫缀合物样品的平均负荷
在本文中被称为药物部分与抗体比率或“DAR”。在美坦生类化合物的方面中,这可以被称为
美坦生类化合物与抗体比率或“MAR”。在一些方面中,该DAR在大约1和大约5之间,并且通常
是大约3、3.5、4、4.5或5。在一些方面中,按重量计，至少50％的样品是具有平均DAR加或减2的化合物,以及优选地至少50％的样品是包含平均DAR的加或减1的缀合物。其它方面包括
其中DAR大约为3.5的免疫缀合物。在一些方面中,‘大约n’的DAR意指DAR的测定值在n的
20％范围之内。
[0336] 本公开提供包含与药物部分连接或缀合的本文中公开的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和它们的功能等同物的免疫缀合物。在一个方面中,药物部分D是美坦生类化
合物药物部分,包括具有下列结构的那些药物部分:
[0337]
[0338] 其中波形线指示美坦生类化合物的硫原子与抗体药物缀合物的接头的共价连接。R在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基。使酰胺基与硫原子连接的亚烷基链可以是甲基
(methanyl)、乙基(ethanyl)或丙基(propanyl),即m是1、2或3。(美国专利号633,410、美国
专利号5,208,020、Chari等人(1992)Cancer Res.52；127-131、Lui等人(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.93:8618-8623)。
[0339] 考虑所述的美坦生类化合物药物部分的所有立体异构体用于所公开的免疫缀合物,即在所述的美坦生类化合物的手性碳处R和S构型的任何组合。在一个方面中，美坦生类
化合物药物部分具有下列立体化学。
[0340]
[0341] 在一个方面中,美坦生类化合物药物部分是N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(也被称为DM1)。DM1由下列结构式表示。
[0342]
[0343] 在另一个方面中，美坦生类化合物药物部分是N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(也被称为DM3)。DM3由下列结构式表示。
[0344]
[0345] 在一个方面中，美坦生类化合物药物部分是N2’-去乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(也被称为DM4)。DM4由下列结构式表示。
[0346]
[0347] 可以通过接头L使药物部分D与抗体Ab连接。L是能够使抗体Ab与药物部分D连接的任何化学部分。接头L使抗体Ab通过共价键与药物部分D连接。所述的接头试剂是可以被使
用来连接药物部分D和抗体Ab而形成抗体药物缀合物的双官能性或多官能性部分。可以使
用具有用于与药物部分D和抗体Ab结合的反应性官能团的接头来制备抗体药物缀合物。半
胱氨酸、硫醇或胺,例如所述的抗体的N-端或氨基酸侧链例如赖氨酸可以与接头试剂的官
能团形成键。
[0348] 在一个方面中,L是可切割的接头。在一个方面中,L是不可切割的接头。在一些方面中,L是酸不稳定的接头、光不稳定的接头、肽酶可切割的接头、酯酶可切割的接头、二硫
键可还原的接头、亲水性接头、预带电的接头或基于二羧酸的接头。
[0349] 在药物部分D例如美坦生类化合物和抗体Ab之间形成的不可切割的接头的合适交联剂是本领域中熟知的,并且可以形成包含硫原子(例如SMCC)的不可切割的接头或无硫原
子的不可切割的接头。在药物部分D例如美坦生类化合物和抗体Ab之间形成不可切割的接
头的优选的交联剂包含基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。根据本公开,这样的不可
切割的接头据说是来源于基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。
[0350] 包含基于马来酰亚胺基的部分的交联剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-
1-羧酸酯(磺基-SMCC)、作为SMCC的"长链"类似物(LC-SMCC)的N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰
亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6–氨基己酸酯)、κ-马来酰亚胺基十一碳酸N-琥珀酰亚胺基
酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰
亚胺基酯(EMCS)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚
胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMSA)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸
(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、N-(对-马来酰亚胺基
苯基)异氰酸酯(PMIP)和包含聚乙二醇间隔区的基于马来酰亚胺基的交联剂,例如MAL-
PEG-NHS。这种交联剂形成来源于基于马来酰亚胺基的部分的不可切割的接头。基于马来酰
亚胺基的交联剂的代表性的结构被显示如下。
[0351]
[0352] 在另一个方面中,接头L源自于N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)或
MAL-PEG-NHS。
[0353] 包含基于卤代乙酰基的部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀
酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。这些交联剂形成来源于基于卤代乙酰基的部分的
不可切割的接头。基于卤代乙酰基的交联剂的代表性的结构被显示如下。
[0354]
[0355]
[0356] 在一个方面中,接头L源自于N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)或N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。
[0357] 在药物部分D例如美坦生类化合物和抗体Ab之间形成可切割的接头的合适的交联剂是本领域中熟知的。包含二硫化物的接头是通过可以在生理学条件下发生的二硫化物交
换可切割的接头。根据本公开,据说这样的可切割的接头来源于基于二硫化物的部分。合适
的二硫化物交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚
胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯
(SPDB)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)，其结构被显
示如下。这些二硫化物交联剂形成来源于基于二硫化物的部分的可切割的接头。
[0358]
[0359] N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),
[0360]
[0361] N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPDP),
[0362]
[0363] N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDP)和
[0364]
[0365] N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)
[0366] 在一个方面中,接头L源自于N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)。
[0367] 在药物部分D例如美坦生类化合物和抗体Ab之间形成带电荷的接头的合适的交联剂被称为前带电的交联剂。在一个方面中,源自于前带电的交联剂的接头L是CX1-1。CX1-1
的结构在下面。
[0368]
[0369] [17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸][2,5-二氧代吡咯烷-1-基]酯(CX1-1)
[0370] 在由本公开提供的一个方面中,缀合物由任意一种下列结构式表示
[0371]
[0372]
[0373] 其中:
[0374] Ab是与人CDH6特异性地结合的抗体或其抗原结合片段；
[0375] n,其指示通过与Ab的伯胺形成酰胺键而连接Ab的D-L基团的数目，是1至20的整数。在一个方面中,n是1至10、2至8或2至5的整数。在一种具体的方面中,n是3或4。
[0376] 在一个方面中,在所述的缀合物中，药物部分(例如DM1或DM4)与抗体的平均摩尔比率(即平均w值,也被称为美坦生类化合物抗体比率(MAR))是大约1至大约10、大约2至大
约8(例如1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、
3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、
5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、
7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1)、大约2.5至大约7、大约3至大约5、大约2.5至大约
4.5(例如大约2.5、大约2.6、大约2.7、大约2.8、大约2.9、大约3.0、大约3.1、大约3.3、大约
3.4、大约3.5、大约3.6、大约3.7、大约3.8、大约3.9、大约4.0、大约4.1、大约4.2、大约4.3、大约4.4、大约4.5)、大约3.0至大约4.0、大约3.2至大约4.2或大约4.5至5.5(例如大约4.5、大约4.6、大约4.7、大约4.8、大约4.9、大约5.0、大约5.1、大约5.2、大约5.3、大约5.4或大约
5.5)。
[0377] 在由本公开提供的一个方面中,所述的缀合物实质上具有高纯度并且具有一种或更多种下列特征:(a)大于大约90％(例如大于或等于大约91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％),优选地大于大约95％的缀合物物种是单体的,(b)在所述
的缀合物制剂中未缀合的接头水平小于大约10％(例如小于或等于大约9％、8％、7％、6％、
5％、4％、3％、2％、1％或0％)(相对于全部的接头),(c)小于10％的缀合物物种是交联的
(例如小于或等于大约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％),(d)在所述的缀合物制剂中游离的药物部分(例如DM1或DM4)水平小于大约2％(例如小于或等于大约1.5％、
1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、
0.2％、0.1％或0％)(摩尔/摩尔，相对于全部的细胞毒剂)。
[0378] 正如本文中所用的那样,术语“未缀合的接头”是指以共价键与来源于交联剂的接头相连的抗体(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1),其中所述的抗体没有通过
接头与药物部分(例如DM1或DM4)共价偶联(即可以由Ab-SMCC、Ab-SPDB、Ab-磺基-SPDB或
Ab-CX1-1表示所述的"未缀合的接头")。
[0379] 1.药物部分
[0380] 本公开提供与CDH6特异性地结合的免疫缀合物。本公开所述的免疫缀合物包含与药物部分例如抗癌剂、抗血液学病症剂、自身免疫性治疗剂、消炎剂、抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或麻醉剂缀合的抗CDH6抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能
等同物。可以使用本领域中已知的任何方法使抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能
等同物与几个相同或不同的药物部分缀合。
[0381] 在某些方面中,本公开所述的免疫缀合物的药物部分选自由下列组成的组:美坦生类化合物、V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、阿里司他汀、多拉司他汀、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白CRM1的核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反
应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷基化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂和DHFR抑制剂。
[0382] 在一个方面中,本公开所述的免疫缀合物的药物部分是美坦生类化合物药物部分,例如但不限于DM1、DM3或DM4。
[0383] 进一步,可以使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与改进给定的生物反应的药物部分缀合。不应把药物部分理解为局限于经典的化学治疗
剂。例如,药物部分可以是具有所要的生物学活性的蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可以
包括例如毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱菌毒素或白喉毒素、蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、凋亡剂、抗血管增生剂或生物反应调节物例如淋巴因子。
[0384] 在一个方面中,使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与药物部分例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。细胞毒素的实例
包括但是不局限于紫衫烷(参见例如国际(PCT)专利申请号WO 01/38318和PCT/US03/
02675)、DNA烷基化剂(例如CC-1065类似物)、蒽环类、tubulysin类似物、多卡米星类似物、阿里司他汀E、阿里司他汀F、美坦生类化合物和包含反应性的聚乙二醇部分的细胞毒剂(参
见例如Sasse等人,J.Antibiot.(Tokyo),53,879-85(2000)、Suzawa等人,
Bioorg.Med.Chem.,8,2175-84(2000)、Ichimura等人,J.Antibiot.(Tokyo),44,1045-53
(1991)、Francisco等人,Blood 2003 15；102(4):1458-65)、美国专利号5,475,092、6,340,
701、6,372,738和6,436,931、美国专利申请公开号2001/0036923A1、待决的美国专利申请
系列号10/024,290和10/116,053和国际(PCT)专利申请号WO 01/49698)、taxon、细胞松弛
素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌
呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烧蚀剂(例如氮芥、硫替派、苯丁酸氮芥、美法仑、亚硝脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如道诺红菌素(以前的柔毛霉素)和阿
霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以
及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。(参见例如Seattle  Genetics 
US20090304721)。
[0385] 可以与本公开所述的抗体、抗体片段(抗原结合片段)或功能等同物缀合的细胞毒素的其它实例包括多卡米星、加利车霉素、美登素和阿里司他汀及其衍生物。
[0386] 各种类型的细胞毒素、接头及用于使治疗剂与抗体缀合的方法是本领域中已知的,参见例如Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)
Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,
(2002)Nat .Rev.Cancer  2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)
Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.Drug 
Deliv.Rev.53:247-264。
[0387] 还可以使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与放射性同位素缀合而产生被称为放射免疫缀合物的细胞毒性的放射性药物。可以与抗体缀合供
诊断或治疗上使用的放射性同位素的实例包括但是不限于碘-131、铟-111、钇-90和镥-
177。在本领域中建立了用于制备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物的实例是通过商
业途径可得到的,包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa 
Pharmaceuticals),并且可以利用本文中公开的抗体，使用相似的方法来制备放射免疫缀
合物。在某些方面中,大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸
(DOTA)，可以经由接头分子将其与抗体连接。这样的接头分子通常是本领域中已知的并且
被描述在Denardo等人,(1998)Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,(1999)
Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等人,(1999)Nucl.Med.Biol.26(8):943-50,
通过引用将其每一篇全文并入。
[0388] 还可以使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与异源蛋白质或多肽(或其片段,优选地具有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)缀合而产生融合蛋
白。特别地,本公开提供包含本文中描述的的抗体片段(例如抗原结合片段)(例如Fab片段、
Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白。
[0389] 可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(总体上被称为“DNA改组”)技术产生另外的融合蛋白。可以利用DNA改组来改变本公开的抗体或其片段的活性
(例如具有较高的亲和力和较低的离解速率的抗体或其片段)。一般地参见美国专利号5,
605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,(1997)
Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,(1998)Trends Biotechnol.16(2):76-
82；Hansson等人,(1999)J.Mol.Biol.287:265-76；及Lorenzo和Blasco,(1998)
Biotechniques 24(2):308-313(在此通过全文引用并入这些专利和公开中的每一篇)。在
重组之前，通过使其承受经由易错PCR、随机的核苷酸插入或其它方法的随机诱变，可以改
变抗体或其片段或编码的抗体或其片段。可以使编码与抗原特异性地结合的抗体或其片段
的多核苷酸与一个或更多个异质分子的一个或更多个组件、基序、区段、部件、结构域、片段等等重组。
[0390] 而且,可以使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与标志序列例如肽缀合而便于纯化。在优选的方面中,所述的标志氨基酸序列是六组氨酸肽,
例如在pQE载体中提供的标记(QIAGEN,Chatsworth,CA)等等,其中有许多是通过商业途径
可得到的。正如Gentz等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中描述的那样,例
如六组氨酸提供融合蛋白的方便的纯化。可用于纯化的其它肽标记包括但是不限于血凝素
(“HA”)标记,其对应于来源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,(1984)Cell 37:767),
和“FLAG”标记(A.Einhauer等人,J.Biochem.Biophys.Methods 49:455–465,2001)。正如本公开中描述的那样,还可以使抗体或抗原结合片段与肿瘤穿透肽缀合以便增强它们的效
力。
[0391] 在其它方面中,使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与诊断试剂或可检测的作用剂缀合。这样的免疫缀合物作为临床试验方法的一部分，可
用于监测或预测疾病或病症的发作、发展、进展和/或严重度,例如确定特定的治疗的效力。
可以通过使抗体与可检测的物质偶联来完成这样的诊断和检测，该可检测的物质包括但不
限于各种酶,例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；
辅基,例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料,例如但不限于Alexa 
Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、
Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 
568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa 
Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料,例如但不限于鲁米诺；生物发光材料,例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质,例如
但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Tl)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、
153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、64Cu、113Sn和117Sn；和利用各种正电子发射层析成像的发射正电子的金属和非放射性的顺磁性金属离子。
[0392] 还可以使本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与特别可用于免疫测定或纯化靶抗原的固相载体连接。这样的固相载体包括但是不限于玻璃、纤
维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
[0393] 2.接头
[0394] 正如本文中所用的那样,“接头”是能够使抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或功能等同物与另一部分例如药物部分连接的任何化学部分。接头可以是在化合物或抗体保
持活性所处的条件下对切割(例如酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱
导的切割和二硫键切割)敏感的(可切割的接头)。备选地,接头可以是实质上对切割有抗性
的(例如稳定的接头或不可切割的接头)。在一些方面中,所述的接头是预带电的接头、亲水
性的接头或基于二羧酸的接头。
[0395] 在一个方面中,所使用的接头源自于交联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基
4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸
酯(磺基SPDB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸
酯(SIAB)、顺丁烯二酰亚胺PEG NHS、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸
(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸(磺基-SMCC)或[17-(2,5-
二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸]
[2,5-二氧代吡咯烷-1-基]酯(CX1-1)。在一个方面中,所使用的接头源自于交联剂例如N-
琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲
基)环己烷羧酸(SMCC)、N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸(磺基-
SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯(磺基-SPDB)或[17-(2,5-二
氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸][2,
5-二氧代吡咯烷-1-基]酯(CX1-1)。
[0396] 不可切割的接头是能够以稳定的共价方式使药物部分例如美坦生类化合物与抗体连接并且没有落在上面所列的可切割的接头范畴下的任何化学部分。因此,不可切割的
接头实质上是对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键
切割有抗性的。此外,不可切割的是指在接头中或相邻接头的化学键经受由酸、对光不稳定
的切割剂、肽酶、酯酶或在药物部分例如美坦生类化合物或抗体所处的不失去它的活性的
条件下切割二硫键的化学的或生理学的化合物诱导的切割的能力。
[0397] 酸不稳定的接头是在酸性pH下可切割的接头。例如,某些细胞内区室,例如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)并且提供适合于切割酸不稳定的接头的条件。
[0398] 光不稳定的接头是可在光能够达到的身体表面处和许多体腔中使用的接头。此外,红外光可以穿透组织。
[0399] 某些接头可以被肽酶切割,即肽酶可切割的接头。仅仅某些肽在细胞内部或外部是容易切割的,参见例如Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和
Umemoto等人43Int.J.Cancer,677-684(1989)。此外,肽由α-氨基酸和肽键组成,肽键在化
学上是在一个氨基酸的羧酸基团和第二个氨基酸的氨基之间的酰胺键。其它酰胺键,例如
在赖氨酸的一个羧酸基团和ε-氨基之间的键不被理解为肽键并且被认为是不可切割的。
[0400] 某些接头可以被酯酶切割,即酯酶可切割的接头。此外,仅仅某些酯可以被存在于细胞内部或外部的酯酶切割。酯是由羧酸和醇的缩合形成的。简单的酯是采用简单的醇例
如脂族醇和小的环状醇以及小的芳醇生产的酯。
[0401] 预带电的接头源自于带电荷的交联剂，其在掺入抗体药物缀合物中以后保留它们的电荷。预带电的接头的实例可以在US 2009/0274713中被找到。
[0402] 3.ADC的缀合和制备
[0403] 可以通过本领域中已知的任何方法,例如在美国专利号7,811,572、6,411,163、7,368,565和8,163,888以及美国申请公开2011/0003969、2011/0166319、2012/0253021和
2012/0259100中描述的那些方法，来制备本公开所述的缀合物。在此通过引用并入这些专
利和专利申请公布的全部教导。
[0404] 一步法
[0405] 在一个方面中,可以通过一步法制备本公开所述的缀合物。所述的方法包括在任选地包含一种或更多种辅助溶剂的实质上水性介质中，在合适的pH下组合所述的抗体、药
物和交联剂。在一个方面中,所述的方法包括使本公开所述的抗体与药物(例如DM1或DM4)
接触而形成包含所述的抗体和药物的第一混合物的步骤,然后使包含所述的抗体和药物的
所述第一混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约4至
大约9的pH的溶液中接触，以提供包含(i)所述的缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4、磺
基-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离的药物(例如DM1或DM4)和(iii)反应副产品的混
合物。
[0406] 在一个方面中,所述的一步法包括使抗体与药物(例如DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约6或更大的(例如大约6至大约
9、大约6至大约7、大约7至大约9、大约7至大约8.5、大约7.5至大约8.5、大约7.5至大约8.0、大约8.0至大约9.0或大约8.5至大约9.0)的pH的溶液中接触。例如,所述的方法包括使细胞
结合剂与药物(DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约6.0、大约6.1、大约6.2、大约6.3、大约6.4、大约6.5、大约6.6、大约6.7、大约
6.8、大约6.9、大约7.0、大约7.1、大约7.2、大约7.3、大约7.4、大约7.5、大约7.6、大约7.7、大约7.8、大约7.9、大约8.0、大约8.1、大约8.2、大约8.3、大约8.4大约8.5、大约8.6、大约
8.7、大约8.8、大约8.9或大约9.0的pH的溶液中接触。在另一个方面中,所述的方法包括使
细胞结合剂与药物(例如DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约7.8的pH(例如7.6至8.0的pH或7.7至7.9的pH)的溶液中接触。
[0407] 可以在本领域中已知的任何合适的温度下进行所述的一步法(即使抗体与药物(DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。例如，所述的一步法可以在大约20℃或更小(例如大约-10℃)(条件是防止溶液冻结,例如通过使用
用来溶解细胞毒剂和双官能性交联剂的有机溶剂的存在)至大约20℃、大约0℃至大约18
℃、大约4℃至大约16℃)、在室温下(例如大约20℃至大约30℃或大约20℃至大约25℃)或
在高温(例如大约30℃至大约37℃)下发生。在一个方面中,所述的一步法在大约16℃至大
约24℃的温度(例如大约16℃、大约17℃、大约18℃、大约19℃、大约20℃、大约21℃、大约22℃、大约23℃、大约24℃或大约25℃)下发生。在一个方面中，在大约15℃或更小的温度(例
如大约-10℃至大约15℃或大约0℃至大约15℃)下进行所述的一步法。例如,所述的方法包
括使抗体与药物(例如DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在大约15℃、大约14℃、大约13℃、大约12℃、大约11℃、大约10℃、大约9℃、大约8℃、大约7℃、大约6℃、大约5℃、大约4℃、大约3℃、大约2℃、大约1℃、大约0℃、大约-1℃、大约-2℃、大约-3℃、大约-4℃、大约-5℃、大约-6℃、大约-7℃、大约8℃、大约-9℃或大约-
10℃的温度下接触,条件是防止溶液冻结,例如通过被用来溶解交联剂(例如SMCC、磺基-
SMCC、磺基-SPDB SPDB或CX1-1)的有机溶剂的存在。在一个方面中,所述的方法包括使抗体
与药物(例如DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在大约10℃至大约15℃、大约0℃至大约15℃、大约0℃至大约10℃、大约0℃至大约5℃、大约5℃至大约15℃、大约10℃至大约15℃或大约5℃至大约10℃的温度下接触。在另一个方面
中,所述的方法包括使抗体与药物(例如DM1或DM4)，然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、
SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在大约10℃的温度(例如8℃至12℃的温度或9℃至11℃的温度)
下接触。
[0408] 在一个方面中,通过提供抗体,然后使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触而形成包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的第一混合物,然后使包含抗体和药物(DM1或DM4)的所述第
一混合物与交联剂(例如SMCC、磺基
[0409] -SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触，来进行所述的接触。例如,在一个方面中,在反应器中提供抗体,把药物(例如DM1或DM4)添加到反应容器中(从而接触抗体),然后把
交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加到包含抗体和药物(例如DM1
或DM4)的混合物中(从而接触包含抗体和药物的混合物)。在一个方面中,在反应容器中提
供抗体,并且在把抗体提供到反应容器以后，立刻把药物(例如DM1或DM4)添加到反应容器
中。在另一个方面中,在反应容器中提供抗体,并且在把抗体提供到反应容器以后过一段时
间间隔(例如在把所述的细胞结合剂提供到所述的空间以后大约5分钟、大约10分钟、大约
20分钟、大约30分钟、大约40分钟、大约50分钟、大约1小时、大约1天或更长)后，把药物(例如DM1或DM4)添加到反应容器中。可以快速地(即在短的时间间隔之内,例如大约5分钟、大
约10分钟)或缓慢地(例如通过利用泵)添加药物(例如DM1或DM4)。
[0410] 然后可以使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)或者在使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触以后立刻或者在
使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触以后在某个更迟的时间点(例如大约5分钟至大约8小时
或更长)接触。例如,在一个方面中,在把药物(例如DM1或DM4添加到包含抗体的反应容器中
以后，立刻把交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)添加到包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物中。备选地,可以在使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触以后，在
大约5分钟、大约10分钟、大约20分钟、大约30分钟、大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约
4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时或更长时，使包含抗体和药物(例如
DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触。
[0411] 在使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以后，允许反应进行大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约
4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小时、大约23小时、大约24小时或更长(例如大约30小时、大约35小时、大约40小时、大约45小时或大约48小时)。
[0412] 在一个方面中,所述的一步法进一步包含猝灭步骤以猝灭任何未反应的药物(例如DM1或DM4)和/或未反应的交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)。通常在纯化所述的缀合物之前进行所述的猝灭步骤。在一个方面中,通过使所述的混合物与猝
灭剂接触来猝灭所述的混合物。正如本文中所用的那样,所述的“猝灭剂”是指与游离的药
物(例如DM1或DM4)和/或交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应的试
剂。在一个方面中,可以使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺猝灭剂(例如4-马来酰亚胺基丁酸、
3-马来酰亚胺基丙酸、N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺或碘乙酰胺基丙酸)来确保药物(例如
DM1或DM4)中任何未反应的基团(例如硫醇)被猝灭。所述的猝灭步骤可以帮助防止药物(例
如DM1)的二聚作用。所述的二聚化的DM1可能难以除去。在用极性的、带电荷的硫醇猝灭剂
(例如4-马来酰亚胺基丁酸或3-马来酰亚胺基丙酸)猝灭时,过量的、未反应的DM1被转变为
极性的、带电荷的、水溶性的加合物，该加合物可以在纯化步骤期间被容易地与共价连接的
缀合物分离。还可以使用采用非极性的和中性的硫醇猝灭剂的猝灭。在一个方面中，通过使
混合物与猝灭剂接触来猝灭混合物，该猝灭剂与未反应的交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、
SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)反应。例如,可以把亲核试剂添加到混合物中以便猝灭任何未反
应的SMCC。亲核试剂优选地是包含氨基的亲核试剂,例如赖氨酸、牛磺酸和羟胺。
[0413] 在另一个方面中,在使混合物与猝灭剂接触之前，允许所述的反应(即使抗体与药物(例如DM1或DM4)然后与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触)进
行完成。在这方面,在使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺
基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以后大约1小时至大约48小时(例如大约1小时、大
约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小时、大约23小时、大约24小时或大约25小时至大约48小时)，把猝灭剂添加到混合物中。
[0414] 备选地,通过把所述的混合物的pH降低到大约5.0(例如4.8、4.9、5.0、5.1或5.2)来猝灭混合物。在另一个方面中,通过把所述的pH降低到小于6.0、小于5.5、小于5.0、小于
4.8、小于4.6、小于4.4、小于4.2、小于4.0，来猝灭混合物。备选地,把所述的pH降低到大约
4.0(例如3.8、3.9、4.0、4.1或4.2)至大约6.0(例如5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、大约4.0至大约5.0、大约4.5(例如4.3、4.4、4.5、4.6或4.7)至大约5.0。在一个方面中,通过把所述的混合物的pH降低到4.8来猝灭所述的混合物。在另一个方面中,通过把所述的混合物的pH降低
到5.5来猝灭所述的混合物。
[0415] 在一个方面中,所述的一步法进一步包含保持步骤以从抗体中释放不稳定地结合的接头。所述的保持步骤包括在纯化所述的缀合物之前(例如在反应步骤以后、在所述的反
应步骤和所述的猝灭步骤之间或在所述的猝灭步骤以后)保持所述的混合物。例如,所述的
方法包括(a)使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触而形成包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的
混合物；然后使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、
SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约4至大约9的pH的溶液中接触，以提供包含(i)所述的
缀合物例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB DM4、磺基-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离的药物
(例如DM1或DM4)和(iii)反应副产品的混合物,(b)保持在步骤(a)中制备的混合物以从细
胞结合剂中释放不稳定地结合的接头,和(c)纯化所述的混合物以提供纯化的缀合物。
[0416] 在另一个方面中,所述的方法包括(a)使抗体与药物(例如DM1或DM4)接触而形成包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物；然后使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合
物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)在具有大约4至大约9的pH的
溶液中接触以提供包含(i)所述的缀合物、(ii)游离的药物(例如DM1或DM4)和(iii)反应副
产品的混合物,(b)猝灭在步骤(a)中制备的混合物以猝灭任何未反应的药物(例如DM1或
DM4)和/或未反应的交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1),(c)保持在步
骤(b)中制备的混合物以从细胞结合剂中释放不稳定地结合的接头,和(d)纯化所述的混合
物以提供纯化的缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4、Ab-磺基-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-
DM1)。
[0417] 备选地,可以在纯化所述的缀合物以后进行所述的保持步骤,随后是另外的纯化步骤。
[0418] 在另一个方面中,允许所述的反应在所述的保持步骤之前进行到完成。在这个方面，可以在使包含抗体和药物(例如DM1或DM4)的混合物与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、
SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以后大约1小时至大约48小时(例如大约1小时、大约2小时、
大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约11小时、大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小时、大约23小时、大约24小时或大约24小时至大约48小时)，进行所述的保持步骤。
[0419] 所述的保持步骤包括保持溶液在合适的温度(例如大约0℃至大约37℃)持续一段合适的时间(例如大约1小时至大约1星期、大约1小时至大约24小时、大约1小时至大约8小
时或大约1小时至大约4小时)以从抗体中释放不稳定地结合的接头，同时实质上不从抗体
中释放稳定地结合的接头。在一个方面中,所述的保持步骤包括保持溶液在大约20℃或更
小(例如大约0℃至大约18℃、大约4℃至大约16℃、在室温下(例如大约20℃至大约30℃或
大约20℃至大约25℃)或在高温下(例如大约30℃至大约37℃)。在一个方面中,所述的保持
步骤包括保持溶液在大约16℃至大约24℃(例如大约15℃、大约16℃、大约17℃、大约18℃、大约19℃、大约20℃、大约21℃、大约22℃、大约23℃、大约24℃或大约25℃)的温度下。在另一个方面中,所述的保持步骤包括保持溶液在大约2℃至大约8℃(例如大约0℃、大约1℃、
大约2℃、大约3℃、大约4℃、大约5℃、大约6℃、大约7℃、大约8℃、大约9℃或大约10℃)的温度下。在另一个方面中,所述的保持步骤包括保持溶液在大约37℃(例如大约34℃、大约
35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃或大约40℃)的温度下。
[0420] 所述的保持步骤的持续时间取决于进行所述的保持步骤所处的温度和pH。例如,通过在高温下进行所述的保持步骤可以实质上地减少所述的保持步骤的持续时间,同时最
大温度受细胞结合剂-细胞毒剂缀合物的稳定性的限制。所述的保持步骤可以包括保持溶
液持续大约1小时至大约1天(例如大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小
时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、大约12小时、大约14小时、大约16小时、大约18小时、大约20小时、大约22小时或大约24小时)、大约10小时至大约24小时、大约12小时至大约24小时、大约14小时至大约24小时、大约16小时至大约24小时、大约
18小时至大约24小时、大约20小时至大约24小时、大约5小时至大约1星期、大约20小时至大
约1星期、大约12小时至大约1星期(例如大约12小时、大约16小时、大约20小时、大约24小
时、大约2天、大约3天、大约4天、大约5天、大约6天或大约7天)或大约1天至大约1星期。
[0421] 在一个方面中,所述的保持步骤包括保持溶液在大约2℃至大约8℃的温度下持续一段至少大约12小时的时间，持续至多一个星期。在另一个方面中,所述的保持步骤包括保
持溶液在大约2℃至大约8℃的温度下过夜(例如大约12至大约24小时,优选地大约20小
时)。
[0422] 用于所述的保持步骤的pH值优选地是大约4至大约10。在一个方面中,用于所述的保持步骤的pH值是大约4或更大,但是小于大约6(例如4至5.9)或大约5或更大,但是小于大
约6(例如5至5.9)。在另一个方面中,用于所述的保持步骤的pH值范围从大约6到大约10(例
如大约6.5至大约9、大约6至大约8)。例如,用于所述的保持步骤的pH值可以为大约6、大约
6.5、大约7、大约7.5、大约8、大约8.5、大约9、大约9.5或大约10。
[0423] 在其它方面中,所述的保持步骤可以包括在25℃下在大约6-7.5的pH下培育所述的混合物持续大约12小时至大约1星期,在4℃下在大约4.5-5.9的pH下培育所述的混合物
持续大约5小时至大约5天,或在25℃下在大约4.5-5.9的pH下培育所述的混合物持续大约5
小时至大约1天。
[0424] 所述的一步法可以任选地包括向所述的反应步骤添加蔗糖以增大所述的缀合物的溶解度和回收率。理想地,以大约0.1％(w/v)至大约20％(w/v)(例如大约0.1％(w/v)、
1％(w/v)、5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)或20％(w/v))的浓度添加蔗糖。优选地,以大约
1％(w/v)至大约10％(w/v)(例如大约0.5％(w/v)、大约1％(w/v)、大约1.5％(w/v)、大约
2％(w/v)、大约3％(w/v)、大约4％(w/v)、大约5％(w/v)、大约6％(w/v、大约7％(w/v)、大约
8％(w/v)、大约9％(w/v)、大约10％(w/v)或大约11％(w/v)的浓度添加蔗糖。另外,所述的
反应步骤还可以包括添加缓冲剂。可以使用本领域中已知的任何合适的缓冲剂。合适的缓
冲剂包括例如柠檬酸缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在一个方面
中,所述的缓冲剂选自由下列组成的组:HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-羟基丙磺酸))、
POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-丙烷-磺酸)脱水物)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪1-乙磺酸)、
HEPPS(EPPS)(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)以
及其组合。
[0425] 所述的一步法可以进一步包括纯化所述混合物的步骤以提供纯化的缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-SPDB-DM4、Ab-磺基-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)。可以使用本领域中已知的
任何纯化方法来纯化本公开所述的缀合物。在一个方面中,本公开所述的缀合物使用切向
流过滤(TFF)、非吸附性色谱、吸附色谱、吸附过滤、选择性沉淀或任何其它合适的纯化方法以及其组合。在另一个方面中,在使所述的缀合物承受上面描述的纯化方法之前,首先通过
一种或更多种PVDF膜过滤所述的缀合物。备选地,在使所述的缀合物承受上述的纯化方法
以后，通过一种或更多种PVDF膜过滤所述的缀合物。例如,在一个方面中,通过一种或更多
种PVDF膜过滤所述的缀合物，然后利用切向流过滤纯化。备选地,利用切向流过滤纯化所述
的缀合物，然后通过一种或更多种PVDF膜过滤。
[0426] 任何合适的TFF系统可以被用于纯化,包括 型系统(Millipore,Billerica,MA)、 Cassette系统(Sartorius AG,Edgewood,NY)和
型系统(Pall Corp.,East Hills,NY)。
[0427] 可以使用任何合适的吸附层析用于纯化。优选的吸附层析树脂包括羟磷灰石层析、疏水性的电荷诱导层析(HCIC)、疏水作用层析(HIC)、离子交换层析、混合模式离子交换层析、固定化的金属亲和层析(IMAC)、染料配位体层析、亲和层析、反相层析以及其组合。合适的羟磷灰石树脂的实例包括陶瓷羟磷灰石(I型和II型CHT,Bio-Rad Laboratories,
Hercules,CA)、HA 羟磷灰石(Pall Corp.,East Hills,NY)和陶瓷
fluoroapatite(I型和II型CFT,Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的HCIC树脂的
实例是MEP 树脂(Pall Corp.,East Hills,NY)。合适的HIC树脂的实例包括丁
基-琼脂糖、己基琼脂糖、苯基-琼脂糖和辛基琼脂糖树脂(全部来自GE Healthcare,
Piscataway,NJ)以及 甲基和 叔丁基树脂(Biorad 
Laboratories,Hercules,CA)。合适的离子交换树脂的实例包括SP-
和 树脂(全部来自GE Healthcare,Piscataway,NJ)
和 S树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的混合模式离子交
换剂的实例包括 ABx树脂(JT Baker,Phillipsburg NJ)。合适的IMAC树脂
的实例包括螯合的 树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)和 IMAC
树脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。合适的染料配体树脂的实例包括蓝色琼脂糖
树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)和亲和胶蓝色树脂(Bio-Rad Laboratories,
Hercules,CA)。合适的亲和力树脂的实例包括A蛋白琼脂糖树脂(例如,MabSelect,GE 
Healthcare,Piscataway,NJ)和凝集素亲和力树脂,例如小扁豆凝集素 树脂(GE 
Healthcare,Piscataway,NJ),其中所述的抗体带有合适的凝集素结合位点。合适的反相树
脂的实例包括C4、C8和C18树脂(Grace Vydac,Hesperia,CA)。
[0428] 可以使用任何合适的非吸附性层析树脂用于纯化。合适的非吸附性层析树脂的实例包括但是不限于SEPHADEXTMG-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM树脂(例如S-200和S-300)、
SUPERDEXTM树脂(例如SUPERDEXTM75和SUPERDEXTM200)、 树脂(例如P-6、P-10、
P-30、P-60和P-100)和本领域普通技术人员已知的其它树脂。
[0429] 两步法和一罐法
[0430] 在一个方面中,可以按照美国专利7,811,572和美国专利申请公布号2006/0182750中描述的那样制备本公开所述的缀合物。所述的方法包括步骤(a)使本公开所述的
抗体与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-SPDB或CX1-1)接触以使接头(即Ab-SMCC、Ab-SPDB或Ab-CX1-1)与所述的抗体共价连接从而制备包含具有与其结合的接头的抗体的
第一混合物；步骤(b)任选地使所述的第一混合物承受纯化方法以制备纯化的具有与其结
合的接头的抗体的第一混合物；步骤(c)通过使具有与其结合的接头的抗体与药物(例如
DM1或DM4)在具有大约4至大约9的pH的溶液中反应而使药物(例如DM1或DM4)与在所述的第
一混合物中具有与其结合的接头的抗体缀合，以制备包含(i)缀合物(例如Ab-MCC-DM1、Ab-
SPDB-DM4、Ab-磺基-SPDB-DM4或Ab-CX1-1-DM1)、(ii)游离的药物(例如DM1或DM4)和(iii)
反应副产品的第二混合物；和步骤(d)使所述的第二混合物承受纯化方法以从所述的第二
混合物的其它组分中纯化所述的缀合物。备选地,可以省略所述的纯化步骤(b)。可以使用
本文中描述的任何纯化方法用于步骤(b)和(d)。在一种实施方式中,使用TFF进行步骤(b)
和(d)这两者。在另一种实施方式中,使用TFF进行步骤(b)并且使用吸收性层析(例如CHT)
进行步骤(d)。
[0431] 一步试剂和原位方法
[0432] 在一个方面中,按照美国专利6,441,163和美国专利申请公布号2011/0003969和2008/0145374中描述的那样，通过使预先形成的药物-接头化合物(例如SMCC-DM1、磺基-
SMCC-DM1、SPDB-DM4、磺基-SPDB-DM4或CX1-1-DM1)与本公开所述的抗体缀合、随后的纯化
步骤，可以制备本公开所述的缀合物。可以使用本文中描述的任何纯化方法。所述的药物-
接头化合物是通过使药物(例如DM1或DM4)与交联剂(例如SMCC、磺基-SMCC、SPDB、磺基-
SPDB或CX1-1)反应而制备的。任选地在与抗体缀合之前，使所述的药物-接头化合物(例如
SMCC-DM1、磺基-SMCC-DM1、SPDB-DM4、磺基-SPDB-DM4或CX1-1-DM1)进行纯化。
[0433] 4.所希望的抗体和抗体药物缀合物的表征和选择
[0434] 可以通过本领域中已知的多种试验表征本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物并且针对它们的物理/化学性质和/或生物活性选择它们。
[0435] 例如,可以通过已知的方法例如酶联免疫吸附测定、FACS、Biacore或蛋白质印迹测试本公开的抗体的抗原结合活性。
[0436] 转基因动物和细胞系特别可用于筛选具有作为预防性或治疗性治疗癌症潜力的抗体药物缀合物(ADC)，所述癌症过表达肿瘤相关的抗原和细胞表面受体。针对有用的ADC
的筛选可以涉及在多个剂量范围内向转基因动物施用候选者ADC,并且在不同的时间点测
定ADC对于被评估的疾病或病症的效果。备选地或另外,可以在暴露于疾病的诱导剂之前或
同时地施用所述的药物(如果可适用的话)。可以顺序地和个别地或平行地在介质或高通量
筛选形式下筛选候选者ADC。
[0437] 一个方面是筛选法，其包括(a)把来自表达CDH6的稳定的癌细胞系或病人肿瘤的细胞(例如卵巢细胞系或肿瘤碎片、肾细胞系或肿瘤碎片、肝细胞系或肿瘤碎片、甲状腺细
胞系或肿瘤碎片、中枢神经系统癌症细胞系或肿瘤碎片、胆管上皮癌癌细胞系或肿瘤碎片、
卵巢的、肾的、肝脏的、软组织、中枢神经系统、甲状腺或胆管上皮癌的原代细胞)移植到非人动物中,(b)向非人动物施用ADC药物候选者，和(c)确定所述的候选者抑制来自所述移植
的细胞系的肿瘤生长的能力。本公开还包括针对特征在于CDH的过表达的疾病或病症的治
疗筛选ADC候选者的方法，包括(a)使来自表达CDH的稳定的癌细胞系的细胞与药物候选者
接触,和(b)评估ADC候选者抑制稳定的细胞系生长的能力。
[0438] 进一步的方面是筛选法，其包括(a)使来自表达CDH6的稳定的癌细胞系的细胞与ADC药物候选者接触和(b)评估ADC候选者诱导细胞死亡的能力。在一个方面中，评估ADC候
选者诱导细胞凋亡的能力。
[0439] 可以通过在多个剂量的范围内向转基因动物施用并且评估随着时间的过去动物对所述的化合物的生理反应，筛选候选ADC。在一些情形中,化合物和将会增强所述的化合
物的效力的辅因子一起施用可能是合适的。如果使用来源于所述的受试者转基因动物的细
胞系来筛选可用于治疗与CDH6的过表达有关的多种病症的ADC，在合适的时间把试验ADC添
加到细胞培养基中,并且利用合适的生物化学和/或组织学试验评估随着时间的过去细胞
对ADC的应答。
[0440] 因此,本公开提供用于鉴定特异性地靶向和结合CDH6的ADC以及在肿瘤细胞上表达的CDH6的测定法。
[0441] CDH6抗体
[0442] 本公开提供了与人CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)。本公开的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包括但是不限于分离的人单克隆抗体或其片
段，正如在下面的实施例中描述的那样。
[0443] 在某些方面中，本公开提供特异性地结合CDH6的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段),所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:20、34、48、62、76、
90、104、118、132、146、160、174、188、202、216、230、244、258、272、286、300、314或328的氨基酸序列的VH结构域(表5和6)。本公开还提供与CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段(例如
抗原结合片段),所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有列在表5和6中的任意
一种VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。在特定的方面中，本公开提供与CDH6特异性地结合的
抗体或抗体片段(例如抗原结合片段),所述抗体包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个具有列在表5和6中的任意一种VH CDR的氨基酸序列的VH CDR(或备选地,由其组成)。
[0444] 本公开提供与CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段),所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有SEQ ID NO:21、35、49、63、77、91、105、119、
133、147、161、175、189、203、217、231、245、259、273、287、301、315或329的氨基酸序列的VL结构域(表5和6)。本公开还提供与CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片
段),所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含具有列在以下表5和6中的任意一种VL 
CDR的氨基酸序列的VL CDR。特别地,本公开提供与CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段
(例如抗原结合片段),所述抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含一个、两个、三个或更
多个具有列在表5和6中的任意一种VL CDR的氨基酸序列的VL CDR(或备选地,由其组成)。
[0445] 本公开的其它抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包括已经被突变的氨基酸,然而在CDR区域中具有与在表5和6中描述的序列中描绘的CDR区至少60、70、80、90或95％同一
性。在一些方面中,它包括突变体氨基酸序列，其中当与表5和6中描述的序列中描绘的CDR
区相比较时，在CDR区中至多1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变。
[0446] 本公开还提供编码与CDH6特异性地结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。可以优化这样的核酸序列用于在哺乳动物细胞中的表达。
[0447] 本公开的其它抗体包括其中所述的氨基酸或编码所述的氨基酸的核酸已经被突变,然而与5和6中描述的序列具有至少60、70、80、90或95％同一性的那些抗体。在一些方面中,它包括突变体氨基酸序列，其中当与5和6中描述的序列中描绘的可变区相比较时，在可
变区中至多1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变,同时保留实质上相同的治疗活性。
[0448] 由于这些抗体中的每一种可以与CDH6结合,VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以是“混合的和匹配的”以产生其它的结合
CDH6的抗体。可以使用本领域中已知的结合试验(例如酶联免疫吸附测定以及在实施例部
分中描述的其它试验)来测试这样的“混合的和匹配的”结合CDH6的抗体。当把这些链混合
并且匹配时,来自特定的VH/VL配对的VH序列应该被在结构上相似的VH序列替换。同样地，
来自特定的全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应该被在结构上相似的全长重链序列
替换。同样地,来自特定的VH/VL配对的VL序列应该被在结构上相似的VL替换。同样地,来自
特定的全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该被在结构上相似的全长轻链序列替
换。因此,在一个方面中,本公开提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合区，其具有:重链可
变区，其包含选自由下列组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:20、34、48、62、76、90、104、
118、132、146、160、174、188、202、216、230、244、258、272、286、300、314或328(表5和6)；和轻链可变区,其包含选自由下列组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:21、35、49、63、77、91、
105、119、133、147、161、175、189、203、217、231、245、259、273、287、301、315或329(表5和6)；
其中所述的抗体与CDH6特异性地结合。
[0449] 在另一个方面中,本公开提供了(i)分离的单克隆抗体，其具有:全长重链，其包含已经被优化用于在哺乳动物的细胞中表达的选自由下列组成的组的氨基酸序列:SEQ ID 
NO:24、38、52、66、80、94、108、122、136、150、164、178、192、206、220、234、248、262、276、290、
304、318或332；和全长轻链，其包含已经被优化用于在哺乳动物的细胞中表达的选自由下
列组成的组的氨基酸序列:SEQ ID NO:25、39、53、67、81、95、109、123、137、151、165、179、
193、207、221、235、249、263、277、291、305、319或333；或(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白。
[0450] 在另一个方面中,本公开提供结合CDH6的抗体，它包含表5和6中描述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合。所述的抗体的VH CDR1的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:
17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171、185、199、213、227、241、255、269、283、
297、311和325中。所述的抗体的VH CDR2的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:18、32、46、60、
74、88、102、116、130、144、158、172、186、200、214、228、242、256、270、284、298、312和326中。
所述的抗体的VH CDR3的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:19、33、47、61、75、89、103、117、
131、145、159、173、187、201、215、229、243、257、271、285、299、313和327中。所述的抗体的VL CDR1的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:14、28、42、56、70、84、98、112、126、140、154、168、
182、196、210、224、238、252、266、280、294、308和322中。所述的抗体的VL CDR2的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169、183、197、211、225、
239、253、267、281、295、309和323中。所述的抗体的VL CDR3的氨基酸序列被显示在SEQ ID NO:16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170、184、198、212、226、240、254、268、282、
296、310和324中。
[0451] 已知这些抗体中的每一种可以与CDH6结合并且抗原结合特异性主要地是由所述的CDR1、2和3区提供的,VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列可以是“混合的和匹配
的”(即可以使来自不同抗体的CDR混合和匹配,尽管每一种抗体必须包含VH CDR1、2和3以
及VL CDR1、2和3以产生其它结合CDH6的结合分子。可以使用本领域中已知的结合试验以及
被描述在实施例中的那些试验(例如酶联免疫吸附测定)测试这样的“混合的和匹配的”结
合CDH6的抗体。当使VH CDR序列混合和匹配时，来自特定的VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3
序列应该被在结构上相似的CDR序列替换。同样地,当使VL CDR序列混合和匹配时,来自特
定的VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该被在结构上相似的CDR序列替换。对于普通技
术人员来说将会是容易地显而易见的是:通过把一个或更多个VH和/或VL CDR区序列用来
自本文中显示的本公开的单克隆抗体的CDR序列的结构上相似的序列替代，可以产生新的
VH和VL序列。
[0452] 因此,本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区，包含:重链CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:17、31、45、59、73、87、101、115、129、143、157、171、185、199、213、227、241、
255、269、283、297、311和325组成的组的氨基酸序列；重链CDR2，其包含选自由SEQ ID NO:
18、32、46、60、74、88、102、116、130、144、158、172、186、200、214、228、242、256、270、284、
298、312和326组成的组的氨基酸序列；重链CDR3，其包含选自由SEQ ID NO:19、33、47、61、
75、89、103、117、131、145、159、173、187、201、215、229、243、257、271、285、299、313和327组成的组的氨基酸序列；轻链CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:14、28、42、56、70、84、98、112、
126、140、154、168、182、196、210、224、238、252、266、280、294、308和322组成的组的氨基酸序列；轻链CDR2，其包含选自由SEQ ID NO:15、29、43、57、71、85、99、113、127、141、155、169、
183、197、211、225、239、253、267、281、295、309和323组成的组的氨基酸序列；和轻链CDR3，其包含选自由SEQ ID NO:16、30、44、58、72、86、100、114、128、142、156、170、184、198、212、
226、240、254、268、282、296、310和324组成的组的氨基酸序列；其中所述的抗体特异性地结合CDH6。
[0453] 在一种具体的方面中,与CDH6特异性地结合的抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)包含:
[0454] (i)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:224的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:225的LCDR2、(c)SEQ ID NO:226的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:227的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:228的HCDR2和(f)SEQ ID NO:229的HCDR3；
[0455] (ii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:210的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:211的LCDR2、(c)SEQ ID NO:212的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:213
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:214的HCDR2和(f)SEQ ID NO:215的HCDR3；
[0456] (iii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:266的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:267的LCDR2、(c)SEQ ID NO:268的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:269
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:270的HCDR2和(f)SEQ ID NO:271的HCDR3；
[0457] (iv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:308的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:309的LCDR2、(c)SEQ ID NO:310的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:311
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:312的HCDR2和(f)SEQ ID NO:313的HCDR3；
[0458] (v)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:15的LCDR2、(c)SEQ ID NO:16的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:17的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:18的HCDR2和(f)SEQ ID NO:19的HCDR3；
[0459] (vi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:28的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:29的LCDR2、(c)SEQ ID NO:30的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:31的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:32的HCDR2和(f)SEQ ID NO:33的HCDR3；
[0460] (vii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:42的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:43的LCDR2、(c)SEQ ID NO:44的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:45的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:46的HCDR2和(f)SEQ ID NO:47的HCDR3；
[0461] (viii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:56的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:57的LCDR2、(c)SEQ ID NO:58的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:59的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:60的HCDR2和(f)SEQ ID NO:61的HCDR3；
[0462] (ix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:70的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:71的LCDR2、(c)SEQ ID NO:72的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:73的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:74的HCDR2和(f)SEQ ID NO:75的HCDR3；
[0463] (x)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:84的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:85的LCDR2、(c)SEQ ID NO:86的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:87的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:88的HCDR2和(f)SEQ ID NO:89的HCDR3；
[0464] (xi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:98的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:99的LCDR2、(c)SEQ ID NO:100的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:101的
HCDR1、(e)SEQ ID NO:102的HCDR2和(f)SEQ ID NO:103的HCDR3；
[0465] (xii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:112的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:113的LCDR2、(c)SEQ ID NO:114的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:115
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:116的HCDR2和(f)SEQ ID NO:117的HCDR3；
[0466] (xiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:126的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:127的LCDR2、(c)SEQ ID NO:128的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:129
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:130的HCDR2和(f)SEQ ID NO:131的HCDR3；
[0467] (xiv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:140的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:141的LCDR2、(c)SEQ ID NO:142的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:143
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:144的HCDR2和(f)SEQ ID NO:145的HCDR3；
[0468] (xv)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:154的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:155的LCDR2、(c)SEQ ID NO:156的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:157
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:158的HCDR2和(f)SEQ ID NO:159的HCDR3；
[0469] (xvi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:168的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:169的LCDR2、(c)SEQ ID NO:170的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:171
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:172的HCDR2和(f)SEQ ID NO:173的HCDR3；
[0470] (xvii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:182的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:183的LCDR2、(c)SEQ ID NO:184的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:185
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:186的HCDR2和(f)SEQ ID NO:187的HCDR3；
[0471] (xviii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:196的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:197的LCDR2、(c)SEQ ID NO:198的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:199的HCDR1、(e)SEQ ID NO:200的HCDR2和(f)SEQ ID NO:201的HCDR3；
[0472] (xix)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:238的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:239的LCDR2、(c)SEQ ID NO:240的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:241
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:242的HCDR2和(f)SEQ ID NO:243的HCDR3；
[0473] (xx)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:252的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:253的LCDR2、(c)SEQ ID NO:254的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:255
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:256的HCDR2和(f)SEQ ID NO:257的HCDR3；
[0474] (xxi)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:280的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:281的LCDR2、(c)SEQ ID NO:282的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:283
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:284的HCDR2和(f)SEQ ID NO:285的HCDR3；
[0475] (xxii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:294的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:295的LCDR2、(c)SEQ ID NO:296的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID NO:297
的HCDR1、(e)SEQ ID NO:298的HCDR2和(f)SEQ ID NO:299的HCDR3；或
[0476] (xxiii)轻链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:322的LCDR1(CDR-互补决定区)、(b)SEQ ID NO:323的LCDR2、(c)SEQ ID NO:324的LCDR3；和重链可变区，其包含:(d)SEQ ID 
NO:325的HCDR1、(e)SEQ ID NO:326的HCDR2和(f)SEQ ID NO:327的HCDR3；
[0477] 在某些方面中,与CDH6特异性地结合的抗体是在表5和/或6中描述的抗体或抗体片段(例如,抗原结合片段)。
[0478] 1.表位的鉴定和与该相同的表位结合的抗体
[0479] 本公开提供与CDH6的胞外域之内的表位结合的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。在某些方面中，所述的抗体和抗体片段可以与在CDH6胞外域的结构域之内的表位结
合。
[0480] 本公开还提供与在表5和6中描述的抗CDH6抗体一样，与相同的表位结合的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)。因此可以基于它们在CDH6结合试验中交叉竞争(例如以统
计学上显著的方式竞争性地抑制)与其它抗体的结合的能力来鉴定另外的抗体和抗体片段
(例如抗原结合片段)。测试抗体抑制本公开的抗体和抗体片段(例如抗原结合片段)与CDH6
蛋白(例如人CDH6)结合的能力证明所述的测试抗体可以与那种抗体或抗体片段(例如)竞
争与CDH6的结合；根据非限制理论,这样一种抗体可以与在所述的CDH6蛋白上相同或有关
的(例如在结构上相似的或在空间上邻近的)表位结合，正如与它竞争的抗体或抗体片段
(例如抗原结合片段)那样。在某种方面中,和本公开所述的抗体或抗体片段(例如抗原结合
片段)一样，与CDH6上相同的表位结合的抗体是人或人源化的单克隆抗体。可以按照本文中
描述的那样制备和分离这样的人或人源化的单克隆抗体。
[0481] 2.Fc区的构架的进一步改变
[0482] 本公开提供位点特异性的标记的免疫缀合物。这些免疫缀合物可以包含修饰的抗体或其抗原结合片段，其在VH和/或VL之内进一步包含对构架残基的修饰,例如用来改善抗
体的性质。典型地，进行这样的构架修饰以减小抗体的免疫原性。例如,一种方法是使一个
或更多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更具体地说、已经经历体细胞突变的抗
体可能包含与所述的抗体所源自的种系序列不同的构架残基。通过把所述的抗体构架序列
与所述的抗体所源自的种系序列比较，可以鉴定这样的残基。为了使所述的构架区序列回
复到它们的种系构型,可以通过例如定点诱变使体细胞突变“回复突变”为种系序列。也意
图包括这样的“回复突变”抗体。
[0483] 另一种类型的构架修饰涉及使构架区之内或甚至一个或更多个CDR区之内的一个或更多个残基突变,以除去T细胞表位，从而减少抗体的潜在的免疫原性。这种方法也被称
为“去免疫法”并且被Carr等人进一步详细描述在美国专利公布号2003/0153043中。
[0484] 除了在构架或CDR区之内进行的修饰之外或备选地,可以把抗体工程化以在Fc区之内包括修饰,典型地用来改变抗体的一个或更多个功能性质,例如血清半衰期、补体固
定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。此外,可以在化学上修饰抗体(例如可以
使一个或更多个化学部分与抗体连接)或修饰抗体以改变它的糖基化,再一次用来改变抗
体的一个或更多个功能性质。下面进一步详细描述这些方面中的每一个。
[0485] 在一个方面中,修饰CH1的绞链区，使得在绞链区中半胱氨酸残基的数目被改变,例如增加或减少。这种方法被Bodmer等人进一步描述在美国专利号5,677,425中。在CH1的
绞链区中的半胱氨酸残基的数目被改变，例如用来便于轻链和重链的装配或用来增大或减
小抗体的稳定性。
[0486] 在另一个方面中,使抗体的Fc绞链区突变以减小抗体的生物半衰期。更具体地说,把一个或更多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得相对于天然
的Fc铰链结构域SpA结合，抗体具有削弱的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。这种方法被Ward等人
进一步详细描述在美国专利号6,165,745中。
[0487] 在还有其它方面中，通过把至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基替换来改变Fc区，用来改变抗体的效应子功能。例如,可以把一个或更多个氨基酸不同的氨基酸残基替
换，使得抗体具有改变的对于效应子配体的亲和力，但是保留了亲本抗体的抗原结合能力。
对其亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组件。这种方法被Winter等
人描述在例如美国专利号5,624,821和5,648,260这两者中。
[0488] 在另一个方面中,选自多个氨基酸残基的一个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，使得所述的抗体具有改变的C1q结合和/或减小的或消除的依赖于补体的细胞
毒性(CDC)。这种方法被Idusogie等人描述在例如美国专利号6,194,551中。
[0489] 在另一个方面中,一个或更多个氨基酸残基被改变，从而改变所述的抗体固定补体的能力。这种方法例如被Bodmer等人描述在PCT公布WO94/29351中。在一种具体的方面
中,本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或更多个氨基酸被IgG1亚类和κ同种型的一个
或更多个异型的氨基酸残基替换。异型的氨基酸残基也包括但是不限于IgG1、IgG2和IgG3
亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，正如由Jefferis等人,MAbs.1:332-338
(2009)描述的那样。
[0490] 在又一个方面中,Fc区被修饰以增大所述的抗体介导依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或通过修饰一个或更多个氨基酸以增大所述的抗体对于Fcγ受体的亲和力。
这方法例如被Presta描述在PCT公布WO 00/42072中。而且,在人IgG1上FcγRl、FcγRII、Fc
γRIII和FcRn的结合位点已经被作图并且具有改善的结合的变体已经被描述(参见
Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
[0491] 在仍然另一个方面中,修饰了抗体的糖基化。例如,可以制造无糖基化抗体(即缺乏糖基化的抗体)。可以改变糖基化,例如用来增加抗体对于“抗原”的亲和力。可以通过例
如改变抗体序列之内一个或更多个糖基化位点来完成这样的碳水化合物修饰。例如,可以
进行一个或更多个氨基酸取代，其导致一个或更多个可变区构架糖基化位点被消除，从而
消除在该位点处的糖基化。这样的无糖基化可以增大抗体对于抗原的亲和力。这样一种方
法例如被Co等人描述在美国专利号5,714,350和6,350,861中。
[0492] 另外或备选地,可以制造具有改变类型的糖基化的抗体,例如具有减小的岩藻糖残基数量的低岩藻糖基化抗体或具有增大的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这样改变
的糖基化模式增大抗体的ADCC能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中
表达所述的抗体来完成这样的碳水化合物修饰。具有改变的糖基化机器的细胞已经被描述
在现有技术中并且可以被使用作为宿主细胞，其中要表达重组抗体从而生产具有改变的糖
基化的抗体。例如,由Hang等人的EP 1,176,195描述了具有在功能上被破坏的编码岩藻糖
基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得在这样的细胞系中表达的抗体展示低岩藻糖化。由
Presta的PCT公布WO 03/035835描述了变异的CHO细胞系Lecl3细胞，其具有减小的使岩藻
糖与Asn(297)连接的碳水化合物连接的能力,也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻
糖化(也参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。由Umana等人的PCT公
布WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如β(1,4)-N乙酰葡糖
胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在所述的工程化的细胞系中表达的抗体展示增加
的二等分GlcNac结构，其导致所述的抗体的增加的ADCC活性(也参见Umana等人,
Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
[0493] 在另一个方面中,修饰所述的抗体以增加它的生物半衰期。不同的方法是可能的。例如,可以引入一种或更多种下列突变:T252L、T254S、T256F,正如Ward的美国专利号6,
277,375中描述的那样。备选地,为了增加所述的生物半衰期,可以在CH1或CL区之内改变所
述的抗体以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位,正如由Presta
等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中描述的那样。
[0494] 为了使抗体的ADCC活性减到最小,在Fc区中的特定突变导致“Fc沉默”抗体，其具有与效应细胞的最小的相互作用。一般而言,使用“IgG Fc区”来定义免疫球蛋白重链的C端
区,包括天然的序列Fc区和变体Fc区。人IgG重链Fc区一般地被定义为包含来自IgG抗体的
羧基端的第C226位或来自P230的氨基酸残基。在Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编
号。Fc区的C端赖氨酸(残基K447)可以被除去,例如在所述的抗体的生产或纯化期间被除
去。
[0495] 通过在所述的抗体的Fc区中的突变可以得到沉默的效应子功能，并且其已经被描述在本领域中:LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.第20卷(6):685-
691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.181:6664-69)也参见Heusser等人,
WO2012065950。沉默的FclgG1抗体的实例是LALA突变体，其在lgG1Fc氨基酸序列中包含
L234A和L235A突变。沉默的lgG1抗体的另一个实例是DAPA(D265A、P329A)突变(US 6,737,
056)。另一种沉默的lgG1抗体包含N297A突变,其导致无糖基化/非糖基化的抗体。
[0496] Fc沉默的抗体导致无或低的ADCC活性,意指Fc沉默的抗体展示低于50％的特异性细胞裂解的ADCC活性,无ADCC活性意指Fc沉默的抗体展示低于1％的ADCC活性(特异性的细
胞裂解)。
[0497] 3.CDH6抗体的生产
[0498] 通过本领域中已知的任何手段，包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，可以生产抗CDH6抗体以及其抗体片段(例如抗原结合片段),而全长单克隆抗体
可以通过例如杂交瘤或重组生产来得到。重组表达可以来自本领域中已知的任何合适的宿
主细胞,例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等等。
[0499] 本公开进一步提供编码本文中描述的抗体的多核苷酸,例如编码重或轻链可变区或包含本文中描述的互补决定区的区段的多核苷酸。在一些方面中,编码重链可变区的多
核苷酸与选自由下列组成的组的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性:SEQ ID NO:22、36、50、64、
78、92、106、120、134、148、162、176、190、204、218、232、246、260、274、288、302、316和330。在一些方面中,编码轻链可变区的多核苷酸与选自由下列组成的组的多核苷酸具有至少
85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性:SEQ ID NO:23、37、51、65、79、93、107、121、135、149、163、177、191、205、219、233、
247、261、275、289、303、317和331。
[0500] 在一些方面中,编码重链的多核苷酸与SEQ ID NO:26、40、54、68、82、96、110、124、138、152、166、180、194、208、222、236、250、264、278、292、306、320和334的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性。在一些方面中,编码轻链的多核苷酸与SEQ ID NO:27、41、55、69、83、97、111、
125、139、153、167、181、195、209、223、237、251、265、279、293、307、321和335的多核苷酸具有至少85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列同一性。
[0501] 本公开所述的多核苷酸可以仅仅编码抗CDH6抗体的可变区序列。它们还可以编码所述的抗体的可变区和恒定区这两者。所述的多核苷酸序列中的一些编码包含一种举例说
明的抗CDH6抗体的重链和轻链这两者的可变区的多肽。一些其它的多核苷酸编码两个多肽
区段，它们分别地与一种小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区实质上相同。
[0502] 可以通过从头固相DNA合成或通过编码抗CDH6抗体的现有序列(例如下面的实施例中描述的序列)或它的结合片段的PCR诱变，可以生产所述的多核苷酸序列。核酸的直接
化学合成可以通过本领域中已知的方法完成,例如Narang等人,Meth.Enzymol.68:90,1979
的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,
Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固相载体
方法。通过PCR向多核苷酸序列中引入突变可以按照例如PCR Technology:Principles and 
Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑.),Freeman Press,NY,NY,
1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(编辑.),
Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和
Eckert等人,PCR Methods和Applications 1:17,1991中描述的那样进行。
[0503] 在本公开中还提供了用于生产上面描述的抗CDH6抗体的表达载体和宿主细胞。可以利用不同的表达载体来表达编码抗CDH6抗体链或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病
毒的表达载体和非病毒性表达载体这两者来在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。非病毒性载
体和系统包括质粒、附加型载体,典型地带有用于表达蛋白质或RNA的表达盒,和人的人工
染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。例如,可用于在哺乳动物(例
如人)细胞中表达抗CDH6多核苷酸和多肽的非病毒性载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/
His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体和本领域中已知的用于表达其
它蛋白质的许多其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱
疹病毒的载体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒的载体、痘苗病毒载体和塞
姆利基森林病毒(SFV)。参见Brent等人,上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；
和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
[0504] 对表达载体的选择取决于预定的要在其中表达所述的载体的宿主细胞。典型地,所述的表达载体包含启动子以及其它调节序列(例如增强子)，其与编码抗CDH6抗体链的多
核苷酸或片段有效连接。在一些方面，诱导性启动子用于除了在诱导条件下防止所插入序
列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可
以在非诱导条件下扩展转化的生物体的培养物，而不偏向编码序列的群，该编码序列的表
达产物被宿主细胞更好地耐受。除了启动子之外,也可能需要或希望其它调控元件，用于有
效表达抗CDH6抗体链或片段。这些元件典型地包括ATG起始密码子和邻接的核糖体结合位
点或其它序列。此外,通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以增强表达的效率
(参见例如Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等人,
Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如,可以使用SV40增强子或CMV增强子来增加在哺乳动
物宿主细胞中的表达。
[0505] 所述的表达载体也可以提供分泌信号序列的位置以与由插入的抗CDH6抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常常,使所述的插入的抗CDH6抗体序列在被包含在所述的载
体中之前，与信号序列连接。将要被用来接受编码抗CDH6抗体的轻和重链可变结构域的序
列的载体有时还编码恒定区或其部分。这样的载体允许所述的可变区表达为具有所述的恒
定区的融合蛋白，从而导致完整的抗体或其片段的产生。典型地,这样的恒定区是人。
[0506] 用于包含和表达抗CDH6抗体链的宿主细胞可以要么是原核的要么是真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本公开所述的多核苷酸的原核宿主。适于使用的其它微生物
宿主包括芽孢杆菌属,例如枯草杆菌以及其它肠杆菌科,例如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和多
种假单胞菌属物种。在这些原核宿主中,还可以制备通常包含与宿主细胞相容的表达控制
序列(例如复制起点)的表达载体。此外,将会存在许多多种众所周知的启动子,例如乳糖启
动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。
所述的启动子典型地控制表达,任选地带有操纵基因序列,并且具有核糖体结合位点序列
等等,用于启动和完成转录和翻译。还可以利用其它微生物(例如酵母)来表达抗CDH6多肽。
还可以使用与杆状病毒组合的昆虫细胞。
[0507] 在其它方面中,使用哺乳动物宿主细胞来表达并且生产本公开所述的抗CDH6多肽。例如,它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如骨髓瘤杂交瘤克
隆)或者是包含外原性表达载体的哺乳动物细胞系(例如SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何
正常必死的或者正常或反常的永生的动物或人细胞。例如,已经开发了许多能够分泌完整
的免疫球蛋白的合适的宿主细胞系,包括CHO细胞系、多种COS细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细
胞系、转化的B细胞和杂交瘤。在例如Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,
N.Y.,N.Y.,1987中一般性地讨论了哺乳动物的组织细胞培养物用于表达多肽的用途。哺乳
动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列,例如复制起点、启动子和增强子(参见例
如Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)以及必需的加工信息位点,例如核糖体结合位
点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常包含来源于哺乳
动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性
的、阶段特异性的和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但是不限于金属硫蛋白启
动子、组成型的腺病毒主要晚期启动子、地塞米松可诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP 
pol III启动子、组成型的MPSV启动子、四环素可诱导的CMV启动子(例如人立即早期CMV启
动子)、组成型的CMV启动子和本领域中已知的启动子-增强子组合。
[0508] 用于引入包含所述的目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如,通常利用氯化钙转染用于原核细胞,然而可以把磷酸钙处理或电穿孔用于其
它细胞宿主(一般地参见Sambrook等人,上文)。其它方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂
质体介导的转化、注射和显微注射、冲击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人造病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合(Elliot和O’Hare,Cell88:223,
1997)、作用剂增强的DNA摄取和离体转导。为了重组蛋白质的长期、高产率生产,稳定的表
达常常将会是所要的。例如,可以使用包含病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标记
基因的表达载体来制备稳定地表达抗CDH6抗体链或结合片段的细胞系。在引入所述的载体
以后,在把细胞转换到选择性培养基之前，可以允许细胞在滋养培养基中生长1-2天。所述
的选择性标记的目的是赋予对筛选的抗性,并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表
达所引入的序列的细胞的生长。可以使用适合于所述的细胞类型的组织培养技术来增殖抗
性的、稳定转染的细胞。
[0509] 治疗和诊断用途
[0510] 本公开所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于多种应用，其包括但不限于治疗癌症,例如实体癌。在某些方面中,所述的抗体、抗体片段(例如
抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积和/或减
小肿瘤的致肿瘤性。有用的方法可以是体外、离体或体内方法。
[0511] 在一个方面中,所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物可用于检测生物样品中CDH6的存在。术语“检测”正如本文中所用的那样，包括定量或定性的
检测。在某些方面中,生物样品包括细胞或组织。在某些方面中,这样的组织包括相对于其
它组织，以较高水平表达CDH6的正常组织和/或癌性组织。
[0512] 在一个方面中,本公开提供检测生物样品中CDH6的存在的方法。在某些方面中,所述的方法包括使生物样品与抗CDH6抗体在允许所述的抗体与抗原结合的条件下接触,并且
检测是否在所述的抗体和抗原之间形成复合物。
[0513] 还包括诊断与增加的CDH6表达有关的病症的方法。在某些方面中,所述的方法包括使测试细胞与抗CDH6抗体接触；通过检测抗CDH6抗体与CDH6抗原的结合来测定CDH6在测
试细胞上的表达水平(要么定量地要么定性地)；以及比较在测试细胞中CDH6的表达水平与
在对照细胞(例如具有与测试细胞相同的组织来源的正常细胞或以可与这样的正常细胞相
当的水平表达CDH6的细胞)中CDH6的表达水平,其中当与对照细胞相比时，在测试细胞上较
高的CDH6表达水平指示与增加的CDH6表达有关的病症的存在。在某些方面中,测试细胞是
从被怀疑患有与增加的CDH6表达有关的病症的个体中获得的。在某些方面中,所述的病症
是细胞增生性病症,例如癌症或肿瘤。
[0514] 在某些方面中,诊断或检测方法,例如上面描述的那些方法,包括检测抗CDH6抗体与在细胞的表面上表达的或在获自其表面上表达CDH6的细胞的膜制剂中的CDH6的结合。用
于检测抗CDH6抗体与在细胞表面上表达的CDH6的结合的示例性试验是“FACS”试验。
[0515] 可以使用某些其它方法来检测抗CDH6抗体与CDH6的结合。这样的方法包括但是不限于本领域中熟知的抗原结合试验,例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附
测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定、A蛋白免疫测定和免疫组织化学(IHC)。
[0516] 在某些方面中,抗CDH6抗体是经标记的。标记包括但是不限于被直接地检测的标记或部分(例如荧光的、发色的、电子密度高的、化学发光的和放射性的标记)以及被间接地
检测(例如通过酶促反应或分子相互作用)的部分,例如酶或配体。
[0517] 在某些方面中,把抗CDH6抗体固定在不溶性的基质上。固定化使得抗CDH6抗体与在溶液中保持游离状态的任何CDH6蛋白中分离开来。这通常是通过要么在测定工序之前使
抗CDH6抗体不溶,例如通过吸附到不溶于水的基质或表面上(Bennich等人,美国专利号3,
720,760),要么通过共价偶联(例如使用戊二醛交联),或在抗CDH6抗体和CDH6蛋白之间形
成复合物(例如通过免疫沉淀反应)以后，通过使抗CDH6抗体不溶来完成。
[0518] 使用本公开的免疫缀合物代替抗CDH6抗体或在除了抗CDH6抗体之外还使用本公开的免疫缀合物，可以进行上述诊断或检测的任一方面。
[0519] 在一个方面中,本公开提供了治疗、预防或改善疾病的方法，其包括向患者施用所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物,从而治疗疾病。在某些方面
中,采用所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物治疗的疾病是癌症。
可以被治疗和/或预防的疾病的实例包括但是不限于卵巢癌、肾癌、肝癌、软组织癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌和胆管上皮癌。在某些方面中,所述的癌症的特征在于表达CDH6的细
胞，所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)和抗体药物缀合物可以与所述的细胞特异
性地结合。
[0520] 本公开提供治疗癌症的方法，其包括施用治疗有效量的所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面中,所述的癌症是实体癌。在某些方面中,
所述的受试者是人。
[0521] 在某些方面中,所述的抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗有效量的所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物。在某些方面中,所述的受试者是
人。在某些方面中,所述的受试者患有肿瘤或已经切除了肿瘤。
[0522] 在某些方面中,所述的肿瘤表达抗CDH6抗体结合的CDH6。在某些方面中,所述的肿瘤过表达人CDH6。
[0523] 为了治疗所述的疾病,所述的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的合适的剂量取决于多种因素,例如将要被治疗的疾病类型、所述的疾病的严重度和
病程、所述的疾病的应答、先前治疗、患者的病历等等。可以一次性地或在持续从几天到几
个月的一系列治疗上或直到实现治愈或达到减轻所述的疾病状态(例如肿瘤尺寸的减小)
为止，施用所述的抗体或作用剂。最佳的定量给药计划可以由在患者的身体内药物累积的
测量值计算并且将会根据个体的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物的
相对功效而变化。在某些方面中,剂量为每kg体重0.01mg至l0mg(例如0.01mg、0.05mg、
0.lmg、0.5mg、lmg、2mg、3mg、4mg、5mg、7mg、8mg、9mg或10mg),并且可以每天、每个星期、每月或每年给予一次或更多次。在某些方面中,每两个星期或每三个星期给予本公开所述的抗
体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物一次。治疗医师可以基于测量的药物
在身体体液或组织中停留时间和浓度，估计关于定量给药的重复速率。
[0524] 组合疗法
[0525] 在某些情形中,把本公开的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物与其它治疗剂,例如其它抗癌剂、抗变应剂、抗恶心剂(或抗催吐药)、止痛药、细胞保护剂以及其组合组合。
[0526] 被考虑用于组合治疗的一般化疗剂包括阿那曲唑 比卡鲁胺博来霉素硫酸盐 白消安 白消安注射液
卡培他滨 N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂
亚硝脲氮芥 苯丁酸氮芥 顺铂 克
拉屈滨 环磷酰胺( 或 )、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖
苷(阿糖胞苷- )、阿糖胞苷脂质体注射液 氮烯唑胺
更生霉素(放线菌素D、 )、道诺红菌素盐酸盐 道诺红菌
素柠檬酸盐脂质体注射液 地塞米松、多西他赛 阿霉素盐
酸盐 依托泊苷 氟达拉滨磷酸盐 5-氟尿
嘧啶 氟他胺 tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧
啶核苷)、羟基脲 伊达比星 异环磷酰胺 伊立替康
)、L-天冬酰胺酶 亚叶酸钙、苯丙氨酸氮芥
6-巯基嘌呤 氨甲喋呤 米托蒽醌 麦罗塔、
紫杉醇 phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、具有亚硝脲氮芥植入物的
polifeprosan 20 柠檬酸他莫昔芬 替尼泊苷 6-硫
代鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明 用于注射的拓扑替康盐酸盐
长春花碱 长春新碱 和长春烯碱
[0527] 在一个方面中,以药物组合制剂或作为组合疗法的定量给药方案形式，把本公开的抗体、抗体片段(例如抗原结合片段)或抗体药物缀合物与具有抗癌性质的第二化合物组
合。所述的药物组合制剂或定量给药方案的第二化合物可以具有与所述组合的抗体或免疫
缀合物互补的活性，使得它们不相互不利地影响。例如,可以把本公开的抗体、抗体片段(例
如抗原结合片段)或抗体药物缀合物与(但不限于)化疗剂、酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替
尼)组合施用。
[0528] 术语“药物组合”正如本文中所用的那样，是指要么呈一个剂量的单元形式的固定组合，要么用于所述的组合施用的非固定组合或套药包，其中可以同时独立地或在多个时
间间隔之内单独地施用两种或更多种治疗剂,特别是当这些时间间隔允许所述的组合配偶
体显示协作的例如协同效应时。
[0529] 术语"组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗在本公开中描述的治疗状况或病症。这样的施用包括以实质上同时的方式,例如以具有固定的活性组分比率的单一
胶囊方式共同施用这些治疗剂。备选地,这样的施用包括以多个容器方式,或对于每一种活
性成分以单独的容器形式(例如胶囊、粉末和液体)共同施用。可以在施用之前，把粉末和/
或液体重建或稀释到所要的剂量。此外,这样的施用还包括以顺序的方式,要么在大约相同
的时间，要么在不同的时间使用每一类型的治疗剂。在任一情况下,所述的治疗方案都将会
在治疗本文中描述的状况或病症中提供所述药物组合的有益效果。
[0530] 所述的组合疗法可以提供“协同作用”并且证明是“协同的”,即当一起使用活性成分时所达到的效果大于由单独地使用所述的化合物所产生的效果的总和。当所述的活性成
分被:(1)同时配制并且施用或以组合的单位剂量制剂形式同时递送时；(2)以单独的制剂
形式交替地或平行地递送时；或(3)通过一些其它方案递送时，可以达到协同效应。当以交
替治疗方式递送时,当顺序地,例如通过不同的注射液在单独的注射器中，施用或递送所述
的化合物时，可以达到协同效应。一般而言,在交替治疗期间,顺序地，即连续地施用有效剂
量的每一种活性成分,然而在组合治疗中，一起施用有效剂量的两种或更多种活性成分。
[0531] 在一个方面中,本公开提供通过向需要治疗癌症的受试者施用与一种或更多种酪氨酸激酶抑制剂(其包括但不限于EGFR抑制剂、Her2抑制剂、Her3抑制剂、IGFR抑制剂和Met
抑制剂)组合的抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。
[0532] 例如,酪氨酸激酶抑制剂包括但是不局限于埃罗替尼盐酸盐 利尼伐尼(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N’-(2-氟-5-甲基苯基)脲,也被称为ABT 869,
可以从Genentech获得)；舒尼替尼苹果酸盐 博舒替尼(4-[(2,4-二氯-5-甲氧
基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈,也被称为SKI-606,
并且被描述在美国专利号6,780,996中)；达沙替尼 帕唑帕尼
索拉非尼 Zactima(ZD6474)；尼洛替尼 瑞戈非尼
和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼( 和 )。
[0533] 表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但是不局限于埃罗替尼盐酸盐Gefitnib N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3“S”)-四氢-3-
呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺, )；凡德他尼
拉帕替尼 (3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡
咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；Canertinib二盐酸盐(CI-
1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧
啶-4-胺(AEE788,CAS497839-62-0)；Mubritinib(TAK165)；Pelitinib(EKB569)；Afatinib
(BIBW2992)；来那替尼(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-
甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸,(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS599626)；N-
(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊烷并[c]吡咯-5-
基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647,CAS781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯乙基]氨基]-7H-
吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166,CAS187724-61-4)。
[0534] EGFR抗体包括但是不局限于西妥昔单抗 帕尼单抗马妥珠单抗(EMD-72000)；尼妥珠单抗(hR3)；扎芦木单抗；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS 
339151-96-1)；和ch806(mAb-806,CAS946414-09-1)。
[0535] 人表皮生长因子受体2(HER2受体)(也被称为Neu、ErbB-2、CD340或p185)抑制剂包括但是不局限于曲妥珠单抗 Pertuzumab 来那替尼(HKI-
272、(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-
基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺,并且被描述在PCT公开号WO 05/028443中)；拉帕替尼或
拉帕替尼二甲苯磺酸盐 (3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯
并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯
基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺
(BIBW-2992,CAS 850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲
基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸,(3S)-3-吗啉基甲基酯(BMS 599626,CAS 
714971-09-2)；Canertinib二盐酸盐(PD183805或CI-1033)；和N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-
甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊烷并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺
(XL647,CAS781613-23-8)。
[0536] HER3抑制剂包括但是不局限于LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111和MEHD-7945A。
[0537] MET抑制剂包括但是不局限于卡博替尼(XL184,CAS 849217-68-1)；Foretinib(GSK1363089,以前的XL880,CAS 849217-64-7)；Tivantinib(ARQ197,CAS 1000873-98-2)；
1-(2-羟基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-氧代-2-
苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-羧酰胺(AMG 458)；Cryzotinib( PF-02341066)；
(3Z)-5-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰
基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-
({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代二氢
吲哚-5-磺酰胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-
1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺酰胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲
基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]哒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605,CAS 
943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡
唑-1-基]乙醇(PF04217903,CAS 956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二 烷-2-基甲基)-N-甲
基-N’-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧代-5H-苯并[4,5]环庚烷并[1,2-b]吡啶-7-基]磺
酰胺(MK2461,CAS 917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]
哒嗪-3-基]硫代]-喹啉(SGX523,CAS 1022150-57-7)；和(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]
磺酰基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯烷基甲基)-1-吡咯烷基]羰基]-1H-吡咯-
2-基]亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮(PHA665752,CAS 477575-56-7)。
[0538] IGF1R抑制剂包括但是不局限于BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573和BI836845。关于综述，参见例如Yee,JNCI,104；975(2012)。
[0539] 在另一个方面中,本公开提供通过向需要治疗癌症的受试者施用与一种或更多种FGF下游信号传导途径抑制剂(其包括但不限于MEK抑制剂、Braf抑制剂、PI3K/Akt抑制剂、
SHP2抑制剂以及mTor抑制剂)组合的抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。
[0540] 例如,促分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂包括但是不局限于XL-518(也被称为GDC-0973,化学文摘检索号1029872-29-4,可以从ACC Corp获得)；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨
基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲酰胺(也被称为CI-1040或PD184352并且被描述在
PCT公开号WO2000035436中)；N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯
基)氨基]-苯甲酰胺(也被称为PD0325901并且被描述在PCT公开号WO2002006213中)；2,3-
双[氨基[(2-氨基苯基)硫基]亚甲基]-丁二腈(也被称为U0126并且被描述在美国专利号2,
779,780中)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟
丙基]-环丙烷磺酰氨(也被称为RDEA119或BAY869766并且被描述在PCT公开号
WO2007014011中)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,
4,9,19-四氢-1H-2-苯并氧杂环十四炔-1,7(8H)-二酮](也被称为E6201并且被描述在PCT
公开号WO2003076424中)；2’-氨基-3’-甲氧基黄酮(也被称为PD98059，可以从Biaffin 
GmbH&Co.,KG,德国获得)；维罗非尼(PLX-4032,CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟丙
基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-
733,CAS 1035555-63-5)；Pimasertib(AS-703026,CAS 1204531-26-9)；和Trametinib二甲
亚砜(GSK-1120212,CAS 1204531-25-80)。
[0541] 磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但是不局限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也被称为GDC 0941并且被描
述在PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730中)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹
啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也被称为BEZ 235或NVP-BEZ 
235,并且被描述在PCT公开号WO 06/122806中)；4-(三氟甲基)-5(2,6-二吗啉并嘧啶-4-
基)吡啶-2-胺(也被称为BKM120或NVP-BKM120,并且被描述在PCT公开号WO2007/084786
中)；Tozasertib(VX680或MK-0457,CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4(4-吡啶基)-6-喹啉基]
亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615,CAS 958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-
(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲
氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊烷并[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)三酮(PX866,CAS 
502632-66-8)；和8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色烯-4-酮(LY294002,CAS 154447-36-6)。
[0542] mTor抑制剂包括但是不局限于坦罗莫司 Ridaforolimus(正式地被称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,
26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,
10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环并[30.3.1.04,9]三十六碳烷-16,24,26,28-
四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯,也被称为AP23573和MK8669、并且被
描述在PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司( 或RAD001))；雷帕霉素
AY22989、 )；Simapimod(CAS 164301-51-3)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-
4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶－7－基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-
(2-羟基乙氧基)环己基]]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)酮
(PF04691502,CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并
吡喃-2-基)吗啉 -4]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-丝氨酸-,内盐
(SF1126,CAS 936487-67-1)。
[0543] 在又一个方面中,本公开提供通过向需要治疗癌症的受试者施用与一种或更多种促凋亡剂(其包括但不限于IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、MCl1抑制剂、Trail作用剂、Chk抑制剂)组合的抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。
[0544] 例如,IAP抑制剂包括但是不局限于NVP-LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406和TL32711。IAP抑制剂的其它实例包括但是不局限于在WO04/005284、WO 04/007529、WO05/
097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US2006/0014700、US2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295和WO08/134679中公开的那些,通过引用把所
有这些文献并入本文中。
[0545] BCL-2抑制剂包括但是不局限于4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己烯-1-基]甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-吗啉基)-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-
[(三氟甲基)磺酰基]苯基]磺酰基]苯甲酰胺(也被称为ABT-263并且被描述在PCT公开号WO 
09/155386中)；Tetrocarcin A；抗霉素；棉子酚((-)BL-193)；Obatoclax；2-氨基-6-环戊
基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-4H色酮-3-羧酸乙酯(HA14–1)；Oblimersen(G3139,
)；Bak BH3肽；(-)-棉子酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4’-氯[1,1’-联苯]-2-基)
甲基]-1-哌嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基氨基-1-[(苯硫基)甲基]丙基]氨基]-3-硝基
苯基]磺酰基]-苯甲酰胺(ABT-737,CAS 852808-04-9)；和Navitoclax(ABT-263,CAS 
923564-51-6)。
[0546] 促凋亡受体激动剂(PARA)包括DR4(TRAILR1)和DR5(TRAILR2),其包括但是不局限于Dulanermin(AMG-951、RhApo2L/TRAIL)；Mapatumumab(HRS-ETR1,CAS 658052-09-6)；
Lexatumumab(HGS-ETR2,CAS 845816-02-6)；Apomab Conatumumab(AMG655,
CAS 896731-82-1)；和Tigatuzumab(CS1008,CAS 946415-34-5,可以从Daiichi Sankyo获
得)。
[0547] 限制点激酶(CHK)抑制剂包括但是不局限于7-羟基星形孢菌素(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-哌啶基-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776,CAS 
891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-羧酸N-[(S)-哌啶-3-基]酰胺(AZD7762,CAS 
860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)氨基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-
氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR 124,CAS 405168-58-3)；7-氨基放线菌素D(7-AAD)、
Isogranulatimide、debromohymenialdisine；N-5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-吗啉基甲氧基]-
苯基]-N’-(5-甲基-2-吡嗪基)脲(LY2603618,CAS 911222-45-2)；萝卜硫烷(CAS 4478-93-
7、4-甲基亚硫酰基丁基异硫氰酸酯)；9,10,11,12-四氢-9,12-桥氧-1H-二吲哚并[1,2,3-
fg:3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮杂环辛-1,3(2H)-二酮(SB-218078,CAS 
135897-06-2)；和TAT-S216A(Sha等人,Mol.Cancer.Ther 2007；6(1):147-153)和CBP501。
[0548] 在一个方面中,本公开提供通过向需要治疗癌症的受试者施用与一种或更多种FGFR抑制剂组合的抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。例如,FGFR抑制剂包括但是不局限
于布立尼布丙氨酸酯(BMS-582664，(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-
甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙烷-2-基)2-氨基丙酸酯)；Vargatef
(BIBF1120,CAS 928326-83-4)；多韦替尼双乳酸(TKI258,CAS 852433-84-2)；3-(2,6-二
氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-
脲(BGJ398,CAS 872511-34 7)；danusertib(PHA-739358)；和(PD173074,CAS 219580-11-
7)。在一种具体的方面中,本公开提供通过向需要治疗癌症的受试者施用与FGFR2抑制剂组
合的抗体药物缀合物，来治疗癌症的方法。所述FGFR2抑制剂为例如3-(2,6-二氯-3,5-二甲
氧基苯基)-1-(6((4-(4乙基哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶4-基)-1-甲脲(也被称为BGJ-398)
或4-氨基-5-氟-3-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)喹啉-2(1H)-酮(也被称
为多韦替尼或TKI-258)，AZD4547(Gavine等人,2012,Cancer Research72,2045-56,N-[5-
[2(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-2H-吡唑-3-基-4-(3R,5S)-二甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺、帕
纳替尼(AP24534；Gozgit等人，2012,Mol Cancer Ther.,11；690-99；3-[2-咪唑并[1,2-b]
哒嗪-3-基)乙炔基]-4-甲基-N-{4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基))苯基}苯甲
酰胺,CAS 943319-70-8)。
[0549] 药物组合物
[0550] 为了制备包含免疫缀合物的药物或无菌的组合物,把本公开所述的免疫缀合物与药学上可接受的载体或赋形剂混合。所述的组合物另外可以包含适用于治疗或预防癌症例
如卵巢癌、肾癌、肝癌、软组织癌、中枢神经系统癌症、甲状腺癌和胆管上皮癌的一种或更多种其它治疗剂。
[0551] 通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以以例如冻干的粉末、浆液、水溶液、洗液或混悬液形式制备治疗剂和诊断试剂的制剂(参见例如Hardman等人,
Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New 
York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,
Lippincott、Williams和Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等人(编辑.),
Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；
Lieberman等人(编辑.),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY,
1990；Lieberman,等人(编辑.)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel 
Dekker,NY,1990；Weiner和Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,
Inc.,New York,N.Y.,2000)。
[0552] 在一种具体的方面中,本公开所述的抗体药物缀合物的临床适用形式(CSF)是在包含所述的ADC、琥珀酸钠和聚山梨酯20的小瓶中的冻干物。可以采用注射用水重建所述的
冻干物,溶液在大约5.0的pH下包含所述的ADC、琥珀酸钠、蔗糖和聚山梨酯20。为了随后的
静脉内施用,通常将会把所述得到的溶液进一步稀释到载体溶液中。
[0553] 为治疗剂筛选施用方案取决于几种因素,包括所述的实体的血清或组织更新率、症状水平、所述的实体的免疫原性和在生物基质中靶细胞的可及性。在某些方面中,施用方
案使递送到患者的符合可接受的副作用水平的治疗剂的量最大化。因此,递送的生物制剂
的量部分地取决于特定的实体和被治疗的状况的严重度。在筛选抗体、细胞因子和小分子
的合适剂量中的指南是能够得到的(参见例如Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios 
Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编辑.),Monoclonal Antibodies,
Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(编辑.),
Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel 
Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等人,New Engl.J.Med.348:601-608,2003；Milgrom等
人,New Engl.J.Med.341:1966-1973,1999；Slamon等人,New Engl.J.Med.344:783-792,
2001；Beniaminovitz等人,New Engl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等人,New 
Engl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等人,New Engl.J.Med.343:1594-1602,2000)。
[0554] 确定合适的剂量是由临床医师,例如使用本领域中已知的或怀疑影响治疗或预料影响治疗的参数或因素做出的。一般地,所述的剂量从稍微小于最优剂量的数量开始，并且
此后以小的增量使它增加，直到相对于任何不利的副作用，达到所要的或最优的效果为止。
重要的诊断测量值包括例如炎症的症状或产生的炎性细胞因子水平的那些测量值。
[0555] 可以改变所述的药物组合物中活性成分抗体药物缀合物的真实的剂量水平，以便获得在对所述的患者无毒的情况下，有效地达到所要的针对特定的患者、组合物和施用方
式的治疗应答的活性成分的数量。所选择的剂量水平将会取决于多种药物动力学因素，包
括使用的本公开所述的特定的组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使
用的特定化合物的排泄速率、所述的治疗的持续时间、与所使用的特定的组合物组合使用
的其它药物、化合物和/或材料、所述的被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康情况和先前的医疗史以及医学领域中已知的类似因素。
[0556] 可以通过连续的输注或以例如一天、一个星期的间隔或每个星期1-7次，通过多个剂量提供包含抗体或其片段的组合物。可以以静脉内方式、以皮下方式、以局部方式、以口
服方式、以经鼻方式、以直肠方式、肌肉内、脑内方式或通过吸入提供剂量。比剂量实验规程是涉及最大剂量或避免显著的不受欢迎的副作用的给药频率。
[0557] 对于本公开所述的免疫缀合物,向患者施用的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。所述的剂量可以是0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、
0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、
0.0001mg/kg至0.5mg/kg之间、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至
0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重。可以使用以
千克(kg)表示的患者体重，乘以以mg/kg表示的将要被施用的剂量，来计算所述的抗体或其
片段的剂量。
[0558] 可以重复所述的免疫缀合物的剂量并且所述的施用可以被分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在具体的方面中,每3个星期重复本公开所述的免疫缀合物的剂量。
[0559] 针对特定的患者的有效量可以根据多种因素(例如被治疗的状况、患者的总的健康情况、施用方法、途径和剂量以及副作用的严重度)而变化(参见例如Maynard等人,A 
Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,
1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,
2001)。
[0560] 所述的施用途径可以是经由例如局部的或皮肤的应用,经由静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊内、损害部内的注射或输注,或经由持续释放系统或植入物(参见例如Sidman等人,Biopolymers22:547-556,1983；Langer等人,
J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12:98-105,1982；Epstein等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692,1985；Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 
77:4030-4034,1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。当必要时,所述的组合物还可以
在注射部位包含增溶剂或局部麻醉剂例如利多卡因以镇痛,或这两者。此外,还可以利用肺
部施用,例如通过利用吸入器或喷雾器以及具有气溶胶化剂的制剂。见例如美国专利号6,
019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,
078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/
66903,通过引用它们的全部把其每一篇并入本文中。
[0561] 还可以使用本领域中已知的多种方法中的一种或更多种，经由一种或更多种施用途径来施用本公开的组合物。正如本领域技术人员将会理解的那样,所述的施用途径和/或
方式将会随所要的结果而变化。针对所述的免疫缀合物选择的施用途径包括静脉内、肌肉
内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它肠胃外的施用途径,例如通过注射或输注。肠胃外施用可以代表除肠内和局部施用以外的施用方式,通常通过注射,并且非限定性地包括静脉内、
肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地,可以经由非肠胃外的途径,例如局
部、表皮或粘膜施用途径,例如以鼻内方式、以口服方式、以阴道方式、以直肠方式、以舌下方式或以局部方式，施用本公开的组合物。在一个方面中,经由输注施用本公开所述的免疫
缀合物。在另一个方面中,以皮下方式施用所述的免疫缀合物。
[0562] 如果以控制释放或持续释放系统方式施用本公开所述的免疫缀合物,则可以使用泵来达到控制或持续释放(参见Langer,上文；Sefton,CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14:20,
1987；Buchwald等人,Surgery 88:507,1980；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574,1989)。
可以使用聚合物材料来达到所述的免疫缀合物的治疗的控制或持续释放(参见例如
Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑.),CRC Pres.,Boca 
Raton,Fla.,1974；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and 
Performance,Smolen和Ball(编辑.),Wiley,New York,1984；Ranger and Peppas,
J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61,1983；也参见Levy等人,Science 228:190,
1985；During等人,Ann.Neurol.25:351,1989；Howard等人,J.Neurosurg.7 1:105,1989；美
国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,
463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253。在持续释
放制剂中使用的聚合物的实例包括但是不限于聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(异丁烯酸
甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(亚乙基-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交
酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个方面中,在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性
的、不含可滤取的杂质、储藏稳定的、无菌的和可生物降解的。可以把控制或持续释放系统
置于预防或治疗靶的附近,因此仅仅需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson,在
Medical Applications of Controlled Release,上文,第2卷,第115-138页,1984中)。
[0563] 由Langer,Science 249:1527-1533,1990在综述中讨论了控制释放系统。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来生产包含本公开的一种或更多种免疫缀合物的持续
释放制剂。参见例如美国专利号4,526,938、PCT publication WO 91/05548、PCT公布WO 
96/20698、Ning等人,Radiotherapy&Oncology 39:179-189,1996；Song等人,PDA Journal 
of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397,1995；Cleek等人,Pro.Int’
l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854,1997；和Lam等人,Proc.Int’
l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,1997,通过全文引用将其每一篇并入本
文中。
[0564] 如果以局部方式施用本公开所述的免疫缀合物,则可以以油膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾、气溶胶、溶液剂、乳剂或本领域熟练技术人员众所周知的其它形式配制它们。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to 
Pharmaceutical Dosage Forms,第十九版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对于不可喷
雾的局部剂型,典型地利用包含与局部施用相容的载体或一种或更多种赋形剂并且在某些
情况下具有大于水的动态粘度的粘性至半固体的或固体形式。合适的制剂非限定性地包括
溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等等,如果需要的话，将其灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合，用于影响多种性质,例如举例来说渗透
压。其它合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中在某些情况下，使所述的活性成分
与固体或液体惰性载体组合，包装在具有加压的挥发物(例如气体推进剂,例如氟利昂)的
混合物中或挤压瓶中。如果想要的话，还可以把增湿剂或湿润剂添加到药物组合物和剂型
中。这样的另外的成分的实例是本领域中熟知的。
[0565] 如果包含免疫缀合物的组合物经鼻内施用，其可以以气雾剂形式，喷雾剂，雾剂或滴剂的形式配制。特别地，根据本公开使用的预防或治疗剂可以以来自加压包装或喷雾器
的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，其中使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲
烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体)。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(由例如
明胶组成)，其含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0566] 用于与第二治疗剂例如细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或放射同时施用或治疗的方法是本领域中已知的(参见例如Hardman等人,(编辑.)(2001)Goodman和Gilman的The 
Pharmacological Basis of Therapeutics,10.sup.th编辑,McGraw-Hill,New York,
N.Y.；Poole和Peterson(编辑.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A 
Practical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编
辑.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,
Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可以使症状减小至少10％；至少20％；至少大约30％；至少
40％，或至少50％。
[0567] 可以使与所述的免疫缀合物组合施用的另外的治疗(例如预防或治疗剂)可以与本公开所述的免疫缀合物相隔少于5分钟、相隔少于30分钟、相隔1小时、在相隔大约1小时
时、在相隔大约1至大约2小时时、在相隔大约2小时至大约3小时时、在相隔大约3小时至大
约4小时时、在相隔大约4小时至大约5小时时、在相隔大约5小时至大约6小时时、在相隔大
约6小时至大约7小时时、在相隔大约7小时至大约8小时时、在相隔大约8小时至大约9小时
时、在相隔大约9小时至大约10小时时、在相隔大约10小时至大约11小时时、在相隔大约11
小时至大约12小时时、在相隔大约12小时至18小时时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至
36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至
72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时或96小时至120小时施用。可以在一个
相同的患者探视之内施用所述的两种或更多种治疗。
[0568] 在某些方面中,可以配制免疫缀合物以确保在体内的适当分布。举例来说,血脑屏障(BBB)排除了许多高度地亲水性的化合物。为了确保本公开所述的治疗性化合物穿过所
述的BBB(如果想要的话),例如可以把它们配制在脂质体中。关于生产脂质体的方法,参见
例如美国专利号4,522,811；5,374,548和5,399,331。所述的脂质体可以包含一种或更多种
被选择性地输送到特定的细胞或器官中的部分,因此增强靶向的药物递送(参见例如
Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示范性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例
如Low等人的美国专利号5,416,016.)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)
Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.357:
140；Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂A蛋白受体
(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p 120(Schreier等人,(1994)
J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；
J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
[0569] 本公开提供用于向需要其的受试者施用包含单独的或与其它治疗组合的免疫缀合物的药物组合物的方案。可以同时地或顺序地向受试者施用所述的组合治疗(例如预防
或治疗剂)。还可以循环地施用所述的组合治疗的治疗(例如预防或治疗剂)。循环治疗涉及
施用第一治疗(例如第一预防或治疗剂)持续一段时间,随后施用第二治疗(例如第二预防
或治疗剂)持续一段时间，并且重复这种顺序的施用,即所述的循环,以便减少发生对所述
治疗(例如作用剂)中的一种的抗性，以避免或减小所述治疗(例如作用剂)中的一种的副作
用和/或以改善所述治疗的效力。
[0570] 可以同时向受试者施用本公开所述的组合治疗的治疗(例如预防或治疗剂)。
[0571] 术语“同时地”不局限于在刚好同时施用治疗(例如预防或治疗剂),而是意指以一种次序以及在时间间隔之内向受试者施用包含抗体或其片段的药物组合物，使得所述的免
疫缀合物可以与其它治疗一起起作用以提供与如果以其它方式施用它们相比增加的益处。
例如,可以同时或以任何次序在不同的时间点顺序地向受试者施用每一种治疗；然而,如果
不同时施用,应该在时间上充分靠近地施用它们，以便提供所要的治疗或预防效果。可以以
任何合适的形式以及通过任何合适的途径单独地向受试者施用每一种治疗。在多种方面
中,相隔少于15分钟、少于30分钟、少于1小时、在相隔大约1小时时、在相隔大约1小时至大
约2小时时、在相隔大约2小时至大约3小时时、在相隔在大约3小时至大约4小时时、在相隔
大约4小时至大约5小时时、在相隔大约5小时至大约6小时时、在相隔大约6小时至大约7小
时时、在相隔大约7小时至大约8小时时、在相隔大约8小时至大约9小时时、在相隔大约9小
时至大约10小时时、在相隔大约10小时至大约11小时时、在相隔大约11小时至大约12小时
时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1个星期，向受试者施用所述的治疗(例如
预防或治疗剂)。在其它方面中,在同一次患者探视之内施用两种或更多种治疗(例如预防
或治疗剂)。
[0572] 可以在同一个药物组合物中向受试者施用组合治疗的预防或治疗剂。备选地,可以在分开的药物组合物中同时向受试者施用组合治疗的预防或治疗剂。可以通过相同或不
同的施用途径向受试者施用预防或治疗剂。
实施例
[0573] 实施例1:通过噬菌体展示技术鉴定CDH6抗体
[0574] 淘选
[0575] 通过挑选与CDH6-ECD结合的克隆来鉴定抗体。作为抗体变体源，使用可商购的噬菌体展示文库Morphosys HuCAL 文库。所述的噬菌粒文库基于
概念(Knappik等人,J Mol Biol.2000:296(1):57-86；Prassler等人,J Mol Biol.2011:
413(1):261-78 2011)并且利用CysDisplayTM技术用于在噬菌体表面上展示Fab(Rothe等
人,J Mol Biol.2008:376(4):1182-200)。为了分离抗CDH6抗体,使用固相和溶液淘选方法
进行标准淘选策略。
[0576] 用于淘选和筛选的抗原(重组蛋白质和细胞系)和抗体试剂的概述
[0577] 在多种形式的CDH6抗原上做淘选。关于用作用于淘选以及随后的筛选和表征的抗原的重组CDH6蛋白和表达CDH6的细胞系的概述被提供在表1中。
[0578] 基于来自GenBank或Uniprot数据库的氨基酸序列，基因合成了人、小鼠和大鼠CDH6胞外域。基于使用来自多种猕猴组织(例如ZyagenLaboratories,San Diego,CA)的
mRNA产生的氨基酸序列和同源性信息，基因合成了猕猴CDH6cDNA模板。把所有合成的DNA片
段克隆到合适的被列明了亲和性标志物以允许纯化的表达载体或用于哺乳动物细胞表面
表达的表达载体ZyagenLaboratories中。
[0579] 为了产生外源地表达人CDH6的稳定的CHO细胞系，根据生产商的说明书使用TREX表达系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)。简单来说,使CHO-TREx细胞(Invitrogen,R718-07,
Carlsbad,CA)生长在含有10％FBS(Invitrogen,10082-147,Carlsbad,CA)和10μg/ml杀稻
瘟菌素(Invitrogen A11139-02,Carlsbad,CA)的DMEM培养基(Invitrogen 11995-085)中。
当细胞达到90％汇合时，在6孔板中进行转染。把4μg线性化的CDH6质粒DNA与100μl DMEM培养基(无FBS)在无菌的微量离心管(Eppendorf tube)中混合,把12μl
2000(Invitrogen 11668-019,Carlsbad,CA)与100μl DMEM培养基在另一个无菌的微量离
心管中混合。把DNA和 混合在一起并且在室温中培育15分钟。对于每一
个孔，把CHO-TREx细胞的培养基更换为无FBS的1ml DMEM培养基；把一半上述DNA/
混合物添加到每一个孔中,培育2小时。然后把2ml生长培养基(含有
FBS)添加到每一个孔中,并且培育所述的细胞过夜。下一天，把转染细胞从6孔板分开到
T175烧瓶中并且生长在含有FBS、10μg/ml杀稻瘟菌素、800-1000μg/ml遗传霉素
(Invitrogen10131-027)的筛选DMEM培养基。采用最终的1μg/ml四环素在筛选培养基中诱
导CDH6表达20-24小时。采用最终的5μg/ml抗CDH6一级单克隆抗体(来自R&D Systems,
Minneapolis,MN的MAB2715)标记阳性的细胞,然后采用PE缀合的抗小鼠二级抗体(目录#_
12-4010-87,eBioscience,San Diego,CA)标记并且通过FACS分选。
[0580] 通过采用各自的克隆到哺乳动物的表达载体(pcDNA6.1,Invitrogen,Carlsbad,CA)中的cDNA转染CHO-K1细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)产生特征为来自小鼠，大鼠和猕
猴来源的CDH6的外源性表达的稳定的CHO细胞系。当细胞达到90％汇合时，在6孔板中进行
转染。把4μg线性化的CDH6质粒DNA与无FBS的100μl DMEM培养基在无菌的微量离心管中混
合,把12μl 2000(Invitrogen 11668-019,Carlsbad,CA)与100μl DMEM
培养基在另一个无菌的微量离心管中混合。把所述的DNA和 溶液混合在
一起,并且在室温下培育15分钟。对于每一个孔，把CHO细胞的培养基更换为无FBS的1ml 
DMEM培养基；把一半上述的DNA/ 混合物添加到每一个孔中,培育2小时。
然后把2ml生长培养基(含有FBS)添加到每一个孔中,并且培育所述的细胞过夜。下一天，把
转染细胞从6孔板分开到T175烧瓶中并且生长在含有10％FBS、10μg/ml杀稻瘟菌素、800-
1000μg/ml遗传霉素(Invitrogen10131-027Carlsbad,CA)的筛选DMEM培养基中。采用最终
的1μg/ml四环素在筛选培养基中诱导CDH6表达20-24小时。采用最终的5μg/ml抗CDH6一级
单克隆抗体(来自R&D Systems,Minneapolis,MN的MAB2715)标记阳性的细胞,然后采用PE
缀合的抗小鼠二级抗体(目录#_12-4010-87,eBioscience,San Diego,CA)标记并且通过
FACS分选。一种备选的可商购的抗CDH6抗体是2B6抗体(#_GWB-E8FDF3-Genway,San Diego,
CA)。还使用这种抗体来证实在细胞中的CDH6表达。
[0581] 表1
[0582] 用于淘选和筛选的抗原、抗体和细胞系试剂的概述
[0583]
[0584]
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591] 重组蛋白质表达和纯化:
[0592] His6-SUMO-CDH6aa54-260-APP-Avi
[0593] 使用2xYT+50μg/ml卡那霉素和30μg/ml氯霉素，在 2 De3pLysS细胞(Millipore,Billerica,MA)中在pET载体中表达蛋白质。采用0.1mM IPTG在30℃下诱导细
胞。把沉淀物重悬浮在400ml 20mM Tris-Cl,pH 8.0,150mM NaCl,3mM CaCl2,20mM咪唑,+
PI标记(1/50ml)+1mg/ml新鲜添加的溶菌酶中,匀浆以分解团块并且穿过微量流化器3次。
在以20K x g离心30分钟以后，使用上清液的可溶组分在2ml Ni-NTA(Qiagen超流树脂,
Qiagen,Venlo,荷兰)上进行纯化。让裂解液以2.0ml/分钟在柱子上穿过,用10CV(柱体积)
的20mM Tris-Cl,pH 8.0,150mM NaCl,3mM CaCl2,20mM咪唑洗涤，并且4x 3.0ml洗脱级分，
使用20mM Tris-Cl,pH 8.0,500mM NaCl,3mM CaCl2,250mM咪唑洗脱蛋白质。汇集级分。添
加200单位的SUMO蛋白酶(Invitrogen)与～15ml蛋白质(～20mg)一起，并且在4℃下使用带
有10K截断值的 打褶管材(Thermo Scientific,Rockford,IL)将其透析到5L
的20mM Tris-Cl,pH 8.0,150mM NaCl,3mM CaCl2中过夜。收集透析后的物质并且在2.0ml 
Ni-NTA树脂上再纯化以除去没有切割的蛋白质和SUMO蛋白酶。从穿过和洗涤级分中收集切
割的蛋白质。把来自逆向Ni-NTA的穿过和洗后物浓缩到5ml体积,添加NaCl到500mM的最终
浓度并且注射到S200柱上,缓冲液＝20mM Tris-Cl,pH 8.0,150mM NaCl,3mM CaCl2。
[0594] hCDH6aa54-615 APPavi、hCDH6aa54-615 Fc、cynoCDH6 FL、moCDH6 FL、ratCDH6 FL
[0595] 在预先适应于悬浮培养并且生长在Novartis所有的无血清培养基的来源于HEK293(ATCC CRL-1573)的细胞系中表达蛋白质。在基于脂转染的瞬时6-孔板转染试验中
进行了小规模表达验证。经由瞬时转染的大规模蛋白质生产是以10-20L规模在WaveTM生物
反应器系统(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)中进行的。以1:3(w:w)的比率，把DNA聚乙烯
亚胺(Polysciences,Warrington,PA)用作质粒载体。在转染后7-10天收获细胞培养物上清
液并且在纯化之前通过交叉流过滤和渗滤进行浓缩。
[0596] 为了纯化,使来自瞬时转染的澄清并且过滤后的条件上清液以5ml/分钟在20ml亲和柱上穿过。用20CV的PBS,1％TX100,0.3％磷酸三正丁酯缓冲液,20CV PBS洗涤。使用
100mM柠檬酸钠，150mM NaCl pH3.0洗脱蛋白质，收集2ml级分。中和汇集的级分，然后在4℃采用5L 50mM Tris,150mM NaCl pH 7.4,3mM CaCl2透析过夜。然后使样品在采用透析缓冲
液平衡的 S200 16/60柱子(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上经受大小排阻
层析。
[0597] 在表2中指示了关于多种淘选策略的概述。
[0598] 表2
[0599] 淘选策略的概述
[0600]
[0601]
[0602] 蛋白质的生物素化
[0603] 遵照生产商(Avidity,Aurora,CO)关于在Avi标记的蛋白质上的蛋白质生物素化的标准规约，使用BirA酶将Avi标记的蛋白质生物素化。在生物素化以后，使蛋白质在
SuperdexS200 16/60柱子上进行大小排阻层析，进入50mM Tris,150mM NaCl pH 7.4,3mM 
CaCl2中。
[0604] 在生物素化前，在在室温搅拌下，使用Slide-A-Lyzer迷你型透析装置10000MWCO(#_69576Thermo Scientific,Rockford,IL)，把无Avi标记的蛋白质对着5L 1x PBS透析两
次持续2h。根据生产商的实验规程重建连接EZ的磺基-NHS-LC-生物素(#_21327Thermo 
Scientific,Rockford,IL)。采用20倍摩尔过量的生物素试剂在室温下培育所述的蛋白质
持续30分钟。为了除去没有反应的生物素试剂，再一次在在室温搅拌下，把所述的样品对着
5L 1x PBS透析两次持续2h。借助于 装置(Thermo Scientific,Rockford,
IL)测定蛋白质浓度。把样品储藏在4℃下直到使用为止。
[0605] 固相淘选
[0606] 在固相淘选中，采用已经通过直接固定化而与表面支持体结合的抗原温育展示Fab片段的噬菌体。
[0607] 在抗原选择方法之前,进行包被核查酶联免疫吸附测定以确定最佳的抗原包被浓度。为了这个目的，生产了覆盖24至0.19μg/mL的hCDH6aa54-615APPavi(参见表1)的2倍稀
释液系列。使用单个稀释液经由直接固定化来包被96-孔MaxisorpTM板(#_442404Nunc,
Rochester,NY)上的孔。在包被以后，采用300μL PBS洗涤所述的板三次并且随后在室温下
采用1x封闭缓冲液(2.5％牛奶,2.5％BSA,0.05％吐温20)封闭2h。
[0608] 为了检测结合的抗原,把抗APP抗体(内部产生的)添加到1μM、0.18μM或0.04μM。使用AP标记的抗小鼠IgG-F(ab)2特异性抗体以1:5000稀释度做第二次检测，参考115-056-006Jackson-Immunoresearch,West Grove,PA)。挑选观察到信号饱和时的抗原浓度作为用
于SP淘选的包被浓度。
[0609] 淘选码1038.1-8
[0610] 对于SP淘选1038.1-8(参见表2),把hCDH6aa54-615APPavi(参见表1,SEQ ID NO:4)经由直接固定化包被在96-孔MaxisorpTM板(Nunc)上。每个噬菌体子库组合用300μL抗原
溶液(10μg/毫升在PBS中)包被两个孔。在4℃时在具有(淘选1038.1-4)或没有(淘选
1038.4-8)1mM CaCl2存在的情况下进行包被过夜。随后采用400μL PBS洗涤所述的孔两次
并且采用400μL封闭缓冲液在室温下以400rpm封闭2h。在封闭以后，采用400μL PBS洗涤细
胞两次。
[0611] 在结合之前，在室温下采用无关的FLT2-APPavi以10μg/mL把噬菌体子库封闭和消耗1h，以消除非特异性的并且标记的结合剂。每个包被的孔转移300μL封闭并且消耗的噬菌
体库，并且在室温和400rpm下培育2h。通过列于如下表3中的洗涤步骤除去非特异性结合的
噬菌体。
[0612] 表3
[0613]
[0614]
[0615] 采用300μL洗脱缓冲液在室温下洗脱特异性地结合的噬菌体10分钟。使用洗脱的噬菌体以OD600＝0.6-0.8的光密度，再感染14mL大肠杆菌TG1F+(Stratagene/Agilent,
Santa Clara,CA)。为了噬菌体感染，在37℃的水浴中培育所述的大肠杆菌TG1F+和噬菌体
洗脱物的混合物45分钟。把细菌沉淀重悬浮在2xYT培养基中,铺板在补充有34μg/mL氯霉素
的LB琼脂平板上并且在37℃培育过夜。从所述的板上刮下菌落并且将其用于多克隆扩增富
集的克隆和噬菌体生产。采用纯化的噬菌体启动下一轮淘选。除了更加严格的洗涤条件以
外，按照第一轮的实验规程进行第二轮淘选。由于～104个cfu/mL的低的第二轮产量滴度，
省略第三轮淘选。
[0616] 淘选码1038.9-16
[0617] 对于SP淘选1038.9-16(表2)，按照针对淘选码1038.1-8所描述的那样，经由直接固定化把His6-SUMO-CDH6aa54-260-APP-Avi(参见表1)包被在96-孔MaxisorpTM板(Nunc)
上。对于淘选1038.13-16，给每个孔添加300μL的100nM工具抗体MAB2715的溶液并且在室温
下培育1h以避免选择识别与MAB2715相同表位的结合剂。除了包被的抗原和第三轮淘选之
外，按照针对淘选码1038.1-8所描述的那样进行淘选。
[0618] 淘选码1038.26-28
[0619] 对于SP淘选1038.26-28(参见表2)，按照针对淘选码1038.1-8描述的那样，经由直接固定化把hCDH6aa54-615-Fc(参见表1,SEQ ID NO:6)包被在96-孔MaxisorpTM板(Nunc)
上。除了包被的抗原和洗涤严紧度之外，按照针对淘选码1038.1-8描述的那样进行淘选。
[0620] 液相淘选
[0621] 在溶液淘选期间,在溶液中培育展示Fab片段的噬菌体和生物素化的抗原，期望这将增加所述的噬菌体对所述的抗原的可及性。按照上面描述的那样进行抗原的生物素化。
[0622] 淘选码1038.17-22
[0623] 在室温下在转轮上，采用相等体积的2xChemiblocker阻断每一个噬菌体文库子库。为了避免选择抗APPavi的抗体，与生物素标记无关的FLT3-APPAvi及生物素化的抗环孢
素msIgG在封闭步骤中分别地添加到7.5和18μg/mL。为了除去与链霉亲和素-珠结合的噬菌
体微粒,使用封闭的链霉亲和素珠(#_112.06D Invitrogen,Carlsbad,CA)进行封闭的噬菌
体微粒的预吸附。在室温下在转轮上，把封闭的并且预吸附的噬菌体与生物素化的
hCDH6aa54-615APPavi(参见表1,SEQ ID NO:4)一起培育持续1h。要么采用洗涤后的珠子
(淘选码1038.17-19)要么采用预包被了生物素化的抗CDH6抗体2B6(Genway,San Diego,
CA)的珠子捕获了噬菌体-抗原复合物以富集非2B6表位的结合剂(淘选码1038.20-22)。通
过几个洗涤步骤(见下文)除去非特异性的噬菌体微粒。按照针对淘选码1038.1-8所描述的
那样进行特异性地结合的噬菌体微粒的洗脱、感染和扩增。
[0624] 表4
[0625] 淘选码1038.17-25的洗涤条件
[0626]
[0627] 淘选码1038.23-25
[0628] 除了使用生物素化的hCDH6aa54-615-Fc(参见表1,SEQ ID NO:6)作为抗原以外，按照针对淘选码1038.1-8描述的那样进行淘选。
[0629] 亚克隆
[0630] FAB-FH表达的转化
[0631] 为了便于可溶性Fab片段的快速表达,把编码所选择的 PLATINUM噬菌体微粒的插入片段的Fab从 30展示载体亚克隆到 11_FH表达
载体中。使用包含被最后一轮淘选输出噬菌体感染的大肠杆菌的甘油原种来接种培养物，
用于按照生产商的手册(#_740.412.50Machery Nagel,Bethlehem,PA)，使用
Xtra Midi Plus试剂盒进行 30DNA纯化。经由EcoRI/XbaI/
BmtI(所有的限制性内切酶是从New England Biolabs,Ipswich,MA购买的)对5μg的每一个
30DNA输出库进行三重消化。使用Wizard SV Gel/PCR净化试剂盒，按照生产
商的手册(A9282,Promega,Madison,WI)对编码所得EcoRI/XbaIFab的1485bp片段进行凝胶
纯化并且连接到EcoRI/XbaI切割的 11_FH载体主链中。
[0632] IgG表达的转化
[0633] 为了表达全长IgG,遵照 实验规程(Morphosys,Martinsried/Planegg,德国)，把VH以及VL的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆到 4_
hIgG1f载体中。 是一种用于把大量Fab表达载体分批转化到IgG表达载体
中的两步克隆方法。在第一克隆步骤中,经由BsiWI/MfeI(用于κ库)或HpaI/MfeI(用于λ库)
消化以及随后的连接，把真核表达盒引入 11表达载体中。这后面是第二克隆
步骤,其中使用EcoRV/BlpI(κ和λ库这两者)消化包含所述的表达盒的Fab库并且随后将其
克隆到 4_IgG1f受体载体中，用于在哺乳动物细胞中表达。
[0634] Fab片段的表达和纯化
[0635] 大肠杆菌TG1F的转化
[0636] 把50μL的电穿孔感受态的大肠杆菌TG1F等分试样在冰上解冻,与50pg/μl11_FH质粒DNA混合并且转移到预冷却的电穿孔小杯中。把所述的细胞电穿
孔(Bio-Rad Gene Pulser；设置:1.75kV、200Ω,和25μF(Bio-Rad,Hercules,CA),转移到
950μl预温热的SOB培养基中并且在37℃下以220rpm摇动培育1h。把合适体积的转化样品铺
板到补充有34μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上并且在37℃下培育过夜而得到单一的菌落。
[0637] 主平板的产生
[0638] 把氯霉素抗性的单一克隆挑选到预填充了补充有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的60μl 2xYT培养基的无菌384-孔微量滴定板的孔中并且使其在37℃生长过夜。第二天早晨,
把包含60％甘油和1％葡萄糖的20μl无菌的2xYT培养基添加到主平板的每一个孔中。采用
铝箔密封平板并且储藏在-8℃。
[0639] 用于酶联免疫吸附测定筛选的包含Fab的细菌裂解液的产生
[0640] 把主平板的每一个孔的5μl转移到每个孔预填充了补充有34μg/ml氯霉素和0.1％葡萄糖的40μl 2xYT培养基无菌384-孔微量滴定板中。在37℃以480rpm和80％湿度培育平
板，直到培养物是微混浊的。为了诱导Fab片段表达，给每个孔添加补充有34μg/ml氯霉素和
5mM IPTG的10μl 2xYT培养基。采用透气的带子密封板并且在22℃在500rpm和80％湿度下
培育过夜。第二天，把15μl BEL裂解缓冲液(2.5mg/ml溶菌酶(#_10837059001,Roche,
Nutley,NJ)、4mM EDTA、10U/μl Benzonase(#_1.01654.0001Merck,White House Station,
NJ)添加到每一个孔中并且在500rpm和80％湿度下培育板1h。通过给每个孔添加15μL 2x 
Chemiblocker来阻断所得的Fab裂解液，随后在22℃、500rpm和80％湿度下培育30分钟。
[0641] 用于FACS筛选的包含Fab的细菌裂解液的产生
[0642] 把压缩板的每一个孔的5μl转移到每个孔预填充了补充有34μg/ml氯霉素的100μl 2xYT培养基的无菌96-孔圆底微量滴定板中。在37℃在500rpm和80％湿度下培育板，直到培
养物是微混浊的。为了诱导Fab片段表达，给每个孔添加补充有34μg/ml氯霉素和5mM IPTG
的10μl 2xYT培养基。采用透气的带子密封板并且在22℃在500rpm和80％湿度下培育过夜。
第二天，以1200g把所述的板离心10分钟并且丢弃上清液。在-20℃冷冻细菌沉淀物过夜以
便于裂解步骤。把解冻的沉淀物重悬浮在200μLBEL裂解缓冲液(参见上面)中并且在22℃和
250rpm下培育1h。以1200g将产生的Fab裂解液离心10分钟以除去细胞碎屑。使用包含Fab的
上清液用于筛选目的。
[0643] His6标记的Fab片段在大肠杆菌中的表达和纯化
[0644] 在补充有34μg/mL氯霉素和1％葡萄糖的2xYT上把包含 11FabFH DNA的大肠杆菌TG1F转化体挑选出来。挑选个别克隆并且转移到补充有34μg/mL氯霉素和
1％葡萄糖的3mL 2xYT种子培养物中并且在37℃、220rpm下培育4h。使用所述的种子培养
物，采用补充有34μg/mL氯霉素和1％葡萄糖的2xYT来接种50mL主要培养物，并且在250mL摇
瓶中在30℃下培育，直到OD600达到0.6的值为止。通过添加IPTG到0.75mM的最终浓度来诱
导Fab表达，并且在25℃和220rpm下进一步培育培养物过夜。第二天收获细胞并且在-20℃
下将细胞沉淀物冷冻过夜。在室温下在摇动的工作台上，通过在裂解缓冲液((25mM TRIS/
pH＝8、500mM NaCl、2mM MgCl2、10U/μl Benzonase(#_1.01654.0001Merck)、0.1％溶菌酶(#_10837059001,Roche)、蛋白酶抑制剂完全的w/o EDTA  1片/50mL缓冲液(#_
11873580001Roche))中重悬浮和培育来破坏细胞沉淀物。通过在15000g下离心30分钟并且
通过200nm孔径大小的过滤器过滤上清液来使裂解液澄清。经由固定化金属离子亲和层析
(Ni-NTA 珠子,#_30430Qiagen,Venlo,荷兰)分离His6标记的Fab片段并且使
用咪唑洗脱。使用PD-10柱子(#_17-0851-01GE Healthcare,Pittsburgh,PA)进行缓冲液交
换成1x PBS。把样品无菌过滤并且通过紫外线分光光度测定法测定蛋白质浓度。在变性的
还原的15％的SDS-PAGE中分析样品的纯度。通过质谱确认了所述的样品的身份。
[0645] IgG的表达和纯化
[0646] 以筛选规模表达IgG
[0647] 把真核HEK293c18细胞(ATCC CRL-10852)用在96-孔表达系统中，用于产生包含全长IgG的条件细胞培养上清液，为了随后在特异性和/或功能性测试中使用。把真核
HEK293c18细胞重悬浮在转染培养基(补充有2％L-谷氨酰胺(#_25030-024Gibco,Grand 
Island,NY)、10％FCS(#_3302PAN Biotech,Aidenbach,德国)和1％青霉素/链霉素(#_
15140-122Gibco,Grand Island,NY)的D-MEM)中，并且在前一天接种在96-孔平底板中，达
到在每个孔的50μl中大约有4x104个细胞的密度。通过把每个孔的0.6μl
2000(#_11668Invitrogen,Carlsbad,CA)与25μL I培
养基(#_31985-047Invitrogen,Carlsbad,CA)混合，制备了转染主混合物。在室温下培育所
述的主混合物15分钟。在一个新板上，把20μL I培养基添加到包含300ng 
DNA的孔中并且温和地混合。然后,把所述的DNA与所述的预培育的
2000合并,在室温下温和地混合和培育20分钟。然后把100μl预培育的
2000/DNA复合物转移到具有所述细胞的所述板的每一个孔中并温和混合。为了瞬时表达，
在37℃和6％CO2下培育板40h。把培养上清液转移到96-孔V形底的板中并且通过离心使其
澄清。通过抗Fd捕获酶联免疫吸附测定测试所产生的包含IgG的上清液，用于根据已知的标
准估计IgG的蛋白质浓度，并且储藏在-80℃用于以后使用。
[0648] 经由抗Fd酶联免疫吸附测定的IgG表达检查
[0649] 为了在筛选规模上评估来源于上清液的IgG水平，用在PBS中以1:1000稀释的50μl/孔Fd片段-特异性的绵羊抗人IgG(#_PC075 The Binding Site,San Diego,CA)包被
96-孔板(#_437111Nunc)。在包被以后,采用TBST洗涤所述的平板两次并且采
用在TBST中的5％脱脂奶粉封闭1h。同时以在TBST中的2.5％脱脂奶粉以1:50稀释包含IgG
的上清液。在采用TBST洗涤酶联免疫吸附测定板三次以后，向每个孔转移100μL稀释的上清
液并且在室温下培育板1h。随后,采用TBST洗涤所述的板五次并且通过与50μl F(ab’)2特
异性的山羊抗人IgG(#_109-055-097Dianova,Hamburg,德国)(以1:5000稀释的)一起在
TBST中的0.5％脱脂奶粉中培育1h，来检测捕获的IgG。在采用TBST洗涤所述的板五次以后，
按照生产商的说明书添加AttoPhos荧光底物(#_1484281Roche,Nutley,NJ)，并且采用在
430nm处的激发，采用酶联吸附测定读数器记录在535nm处的荧光发射。
[0650] 在微量规模上的IgG表达和纯化
[0651] 使用40kDa线性的PEI((PEI Max(#_24765-2Polysciences Warrington,PA))作为基因递送载体，采用 4 IgG表达质粒在 表达培养基(#_
12338 Invitrogen,Carlsbad,CA)中瞬时转染 细胞(CEVEC Pharmaceuticals,
Cologne,德国)。
[0652] 在所述的转染之前一天，把细胞稀释到～0.8E+06细胞/ml以确保指数生长。在转染的那天，把细胞稀释在9mL预温热的 (Invitrogen,Carlsbad,CA)培养基中，
达到～0.5x107个细胞/ml并且转移到125ml摇瓶中。把30μg DNA稀释在500μl OptiMEM中。
把1200μg PEI Max(#_24765-2Polysciences Warrington,PA)稀释在8.80mL OptiMEM培养
基中。把所述的DNA溶液滴加到所述的细胞中并且温和地混合。然后,把500μL PEI Max溶液
添加到所述的细胞中并且温和地混合。
[0653] 在37℃、6％CO2、85％湿度与以100rpm搅拌下，培育所述的细胞。在4h以后，添加补充有4mM L-谷氨酰胺和5μg/ml杀稻瘟菌素(#_R21001 Invitrogen,Carlsbad,CA)的10mL预温热的PEM。同时地,添加400μL丙戊酸(#_P4543-25G Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，达到
4mM的最终浓度。在37℃、6％CO2、85％湿度与以100rpm搅拌下培育细胞6天。
[0654] 在以1200g在4℃下离心5分钟以后，把上清液无菌过滤(0.2μm孔径大小)并且使其经受使用液体处理站的A蛋白亲和层析( SURE,GE Healthcare,Pittsburgh,
PA)。进行缓冲液更换成1x PBS并且把样品无菌过滤(0.2μm孔径大小)。通过紫外分光光度
法测定蛋白质浓度并且在SDS-PAGE中的变性、还原条件下分析IgG的纯度。
[0655] 包含Fab的粗细菌裂解液的筛选
[0656] ELISA筛选
[0657] 使用ELISA筛选,从淘选输出中鉴定了用于与所述的靶抗原结合的单Fab克隆。使用包含Fab的粗大肠杆菌裂解液测试了Fab片段。
[0658] 在直接包被的抗原上的ELISA筛选
[0659] 在4℃下，采用huCDH6蛋白，以在PBS中3μg/ml的浓度包被 (#_442404Nunc,Rochester,NY)384-孔板过夜。在洗涤以后，采用在1xPBST中的5％脱脂奶阻断
板2h。添加包含Fab的大肠杆菌裂解液并且在室温下允许结合1h。
[0660] 为了检测结合的Fab片段，采用TBST洗涤板并且以1/2500稀释度添加AP-抗人IgG F(ab’)2(#_109-055-097 Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)。在室温下1h以后，采
用TBST洗涤板5次，并且按照生产商的说明书添加AttoPhos底物。在添加所述的底物以后5
分钟，在酶联吸附测定读数器中读取板的读数。
[0661] 使用 板在生物素化的抗原上的ELISA筛选
[0662] 在4℃采用 (#_31000Thermo Scientific,Rockford,IL)以在PBS中10μg/ml的浓度包被 (#_442404Nunc,Rochester,NY)384-孔板过夜。在洗
涤以后,采用1x Chemiblocker封闭板2h。把包含Fab的大肠杆菌裂解液分配到新鲜的384-
孔微量滴定板中并且以2.5μg/mL的浓度添加生物素化的CDH6抗原。然后把Fab-抗原复合物
转移到所述的 包被的板并且在室温下允许捕获1h以及按照上面描述的
那样进行检测。
[0663] FACS筛选
[0664] 在FACS筛选中,从淘选输出中鉴定与细胞表面表达的CDH6抗原结合的Fab片段。把1x105个细胞/孔转移到U形底96-孔板中并且与40μl/孔的包含Fab的细菌裂解液混合。在4
℃摇动培育板1小时。在培育以后,添加100μl/孔冰冷的FACS缓冲液(3％FCS,0.02％NaN3,
2mM在PBS中的EDTA),在4℃以250g把细胞旋转下来持续5分钟，并且采用180μl/孔冰冷的
FACS缓冲液洗涤两次。在每一个洗涤步骤以后,将细胞离心并且小心地重悬浮。在最后的洗
涤步骤以后，把细胞重悬浮在50μL的1/200稀释的二级检测抗体(PE-缀合的山羊抗人IgG
(#_109-116-088,Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)中。在4℃下培育1h以后，再次
在180μL/孔冰冷的FACS缓冲液中洗涤细胞两次。最后,把细胞沉淀物重悬浮在含有0.4％多
聚甲醛的120μl/孔FACS缓冲液中，并且在装备有HTS板读数器的 (BD 
Biosciences,San Jose,CA)中进行分析。
[0665] 克隆测序
[0666] Fab克隆测序
[0667] 使证实的结合细胞的Fab命中进行VL和VH测序。给补充有μg/mL氯霉素和1％葡萄糖的1.2mL 2xYT接种从所述的压缩板得到的5μL细菌甘油原种，并且使其在37℃和500rpm
下在96-孔深孔微量滴定板中生长过夜。第二天收获细菌并且按照生产商的实验规程，使用
96-孔DNA纯化试剂盒( 96质粒纯化试剂盒#_740625.24,Machery Nagel,
Bethlehem,PA)纯化pMORPH11FH质粒。为了给VL和VH测序，分别地使用了引物M13rev(5’
CAGGAAACAGCTATGAC 3’(SEQ ID NO:10)和HuCAL_VH_for((5‘GATAAGCATGCGTAGGAGAAA 3
(SEQ ID NO:11))
[0668] IgG克隆测序
[0669] 使结合独特细胞的Fab克隆以多克隆方式以IgG1形式转化，以及然后通过VL和VH测序取回。给补充有100μg/mL Amp和1％葡萄糖的1.5mL 2xYT培养基接种单克隆并且使其
在37℃、450rpm和80％湿度下在96-孔深孔微量滴定板中生长过夜。第二天收获细菌并且按
照生产商的实验规程，使用96-孔DNA纯化试剂盒( 96质粒纯化试剂盒#_
740625.24,Machery Nagel,Bethlehem,PA)纯化编码IgG的 4质粒。为了给VL
和VH测序，分别地使用了引物((T75’TAATACGACTCACTATAGGG 3’(SEQ ID NO:12)和
CMVHCfor(5’CTCTAGCGCCACCATGAAACA 3’(SEQ ID NO:13))。
[0670] 体外试验
[0671] 使用 QK的亲和性评估
[0672] 经由Bio-Layer干涉量度法技术进行通过测定动力学参数的亲和性评估。使用链霉亲和素浸渍和读取生物传感器(#_18-0009ForteBio,Menlo Park,CA)测定所有的Fab样
品。把板置于 QK仪器(ForteBio,Menlo Park,CA)中并且允许其在室中平衡到27
℃。通过把所述的传感器放置在包含150nM生物素化的CDH6蛋白质的孔中持续300s来启动
运行。然后把传感器置于包含250nM Fab样品的孔中。通过测量层厚度(以纳米,nm表示)随
时间的变化，把Fab缔合和解离每一个都记录持续600s,全部都在计算机控制下。使用
User Software 3.0版本自动地加工数据。
[0673] 对抗体细胞的内化作用倾向的评估
[0674] 按照如下所述的那样，使用VTI HC读数器(ThermoFischer,Waltham,MA)，通过显微术评估经由靶介导的细胞内吞作用的IgG的细胞内化作用。基础的
分析实验规程是Spot Detector V4算法(ThermoScientific Thermo 
Scientific,Rockford,IL)。简单说来,这种分析实验规程提供快速并且一般的点滴分析，
其在免疫荧光染色以后，鉴定细胞内的点状目标,例如包含IgG的溶酶体小泡。然后可以将
总的点状荧光强度在所分析的细胞数目上求平均值。
[0675] 使OVCAR3细胞(ATCC HTB-161)生长在T150组织培养瓶中，达到大约90％汇合度。丢弃培养基并且用10mL PBS冲洗细胞。通过在37℃与4mL细胞解离缓冲液一起培育5分钟使
细胞脱壁。把脱壁后的细胞彻底地重悬浮在生长培养基中并且转移到50mL试管中。在Vi-
Cell分析仪(Beckman Coulter,Brea,CA)上计数细胞以后，在生长培养基中把悬浮液调节
到105个细胞/mL。给具有透明底的96-孔微量滴定板的每个孔接种100L所述的细胞悬浮液。
在37℃在5％CO2中培育板24h以允许细胞粘附和扩张。
[0676] 按照所描述的那样产生包含IgG的细胞培养上清液并且以覆盖从1:4到1:128的稀释范围的四倍稀释系列将其稀释在PBS中。给包含所述的细胞的微量滴定板的每个孔分配
100μl的每一样品稀释液，并且在37℃培育2h以允许IgG内化。随后,通过向每个孔添加100μl 1x 试剂(#_340181 BD Biosciences,San Jose,CA)来固定细胞。在10分钟以
后，采用PBS洗涤板两次，然后通过向每个孔添加100μl 0.1％Triton X-100来使细胞通透
性增加。在10分钟以后，再次采用PBS洗涤板两次并且在室温下采用100μl 1x Odyssey封闭
缓冲液(#_927-40000 LiCor,Lincoln,NE)将其封闭2个小时。为了检测内化的IgG，向每个
孔中添加补充有1:10000稀释度的Hoechst原子核染色试剂(#_B2261 Sigma,St.Louis,Mo)
的100μl的1:000稀释度的二级抗体Alexa 488山羊抗人IgG(#_11001Molecular 
Probes,Grand Island,NY)，并且在室温中在黑暗中培育1小时。然后采用PBS洗涤细胞两
次，没有最后的吸出。然后把板装载到 VTI  ArrayScan  HC读数器
(ThermoFischer,Waltham,MA)中并且分析。通过每个细胞的均值平均点强度(MSAI)评估
IgG内化的程度。
[0677] 使用抗人FAB-DM1缀合物的替代ADC试验
[0678] 为了测试在受体结合以后CDH6抗体内化和递送细胞毒性的有效负荷的能力，把抗人Fab-DM1试剂(与SMCC-DM1缀合的 Fab片段山羊抗人IgG H+L)与纯化的IgG
以固定的1:2比率混合，进行了替代ADC试验。在癌细胞系OVCAR3(在McCoys+20％FCS中培养
的卵巢浆液癌)上测试了细胞毒潜力，因为这些细胞显示高的CDH6表达。
[0679] 计数培养中的细胞并且在培养基中稀释到1x105个细胞/ml的浓度。把1000个细胞/孔转移到384-孔板(Corning Costar#_3707,Corning,Tewksbury,MA)。通过把666nM 
Fab-DM1与在细胞培养基中稀释并且在37℃培育30分钟的333nM第一人IgG组合而在1.4ml 
Matrix试管(Thermo,#_3790,Rockford,IL)中制备了第一抗体/Fab-DM1溶液。在384-孔深
孔板(Brandtech Scientific Inc#_701355,Essex,CT)中制备10个点的1:3系列稀释液，并
且把25μl转移到每个试验板(一式三份)以分别地产生66nM和33nM的FAB-DM1/人IgG的最高
起始浓度。对于对照,制备了仅仅含有细胞的孔(＝100％生存能力对照)和仅仅采用Fab-
DM1培育的细胞(以检查第二试剂的非特异性杀伤)。在37℃和5％CO2下培育板120h。使用
试剂(#_G7571Promega,Madison,WI)，按照生产商的说明书，测定了第一
抗体/Fab-DM1复合物的细胞活性。针对仅仅对照的细胞归一化生存能力。
[0680] 抗体筛选概述
[0681] 使用 PLATINUM噬菌粒文库来筛选抗人CDH6-ECD抗原的特异性的Fab片段。使用重组的人APPAvi和Fc融合体以及截断的结构域APPAvi融合蛋白进行所述的淘
选。以不同的子库组合，使 PLATINUM抗体-噬菌体微粒承受总共8种不同的淘选
策略，产生28个淘选输出库。总之,8种策略中的6种已经是多产的并且产生771种ELISA阳性
的筛选命中。
[0682] 在表达人CDH6的CHO细胞以及OVCAR3细胞上的FACS筛选产生了271种证实的细胞结合命中。为了巩固这些细胞的结合命中，进行了VL和VH测序，其导致鉴定了53种独特的
Fab抗体克隆。
[0683] 为了允许功能性表征,把Fab抗体克隆转变为IgG形式,产生了47种独特的IgG克隆，以筛选规模成功地表达了其中的44种。使纯化的、独特的IgG承受一系列表征试验，包括经由FACS的人/猕猴/大鼠/小鼠交叉反应性、经由Octet的亲和性排序、细胞内化作用试验
以及使用抗人IgGFab-SMCC-DM1第二试剂的替代ADC试验。基于这些试验,挑选了人IgG用于
放大生产、随后的直接与ADC接头/有效负荷缀合和按照在体外和在体内中的ADC那样的测
试。
[0684] 在表5中显示了选择的用于进一步深入表征的抗CDH6IgG的序列信息。
[0685] 表5
[0686] 选择的用于深入表征的IgG的序列信息。
[0687]
[0688]
[0689]
[0690]
[0691]
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[0805]
[0806]
[0807]
[0808]
[0809] 实施例2:经由定点诱变的抗体工程
[0810] 对于抗CDH6抗体的亚组，使用 定点诱变试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)进行定点诱变，用于除去用于翻译后修饰的潜在位点和种
系化。把NOV690序列改变为D53S和VL(3-J-种系)，产生抗体NOV1126。把NOV695序列改变为
N31Q和S49Y,产生抗体NOV1127。把NOV0720序列改变为N31Q、N95Q和VL(3-J-种系),产生抗体
NOV1132。在表6中描述了工程化抗体的序列信息。
[0811] 表6
[0812] 工程化抗体的序列信息
[0813]
[0814]
[0815]
[0816]
[0817]
[0818]
[0819]
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[0827]
[0828]
[0829]
[0830]
[0831]
[0832] 实施例3:与具有表达来自人、猕猴属、大鼠和小鼠来源的CDH6的特征的细胞结合的抗CDH6 IgG的测定
[0833] 为了测定与具有表达来自不同物种的CDH6的特征的细胞结合的抗CDH6，在内源性地表达CDH6的OVCAR3细胞上以及在被工程化以表达来自人、猕猴属、大鼠和小鼠来源的
CDH6的CHO细胞上进行FACS(荧光活化细胞分选)分析。
[0834] 从ATCC(#_HTB-161)获得OVCAR3(卵巢浆液癌)。具有表达CDH6的特征的CHO细胞系的产生被描述在上面的实施例1中。
[0835] 通过采用 细胞解离试剂(#_A1110501Gibco,Grand Island,NY)按照生产商的说明书处理培养中的细胞，随后在FACS缓冲液(PBS/1％BSA,Gibco)中洗涤所述的
细胞，制备了细胞悬浮液。以1x106个细胞/ml把细胞重悬浮在FACS缓冲液中并且以100μl/
孔将其等分到96-孔圆底板(Corning#CLS3360)中。制备了一级抗体的8个点1:5的系列稀释
液而产生10μg/ml的最高的最后的起始浓度，并且把100μl/孔添加到所述的细胞悬浮液中。
作为阴性对照，使用抗体人同种型对照IgG(R&Dsystems#1-001-AMinneapolis,MN)。把细胞
与一级抗体溶液在冰上一起培育30分钟,随后在200μl冷的FACS缓冲液中洗涤三次。把所述
的细胞重悬浮在以1/500稀释度使用的100μl PE缀合的抗人人Fc中(Jackson Immuno 
Research#109-116-098West Grove,PA)并且在冰上培育细胞30分钟。在200μl冷的FACS缓
冲液中洗涤3次后，在BD FACS (BD Biosciences,San Jose,CA)上分析细胞。使
用 软件测定每种样品的信号的几何平均值并且通过绘制信号的几何平均值对
浓度的图和使用Tibco (Tibco,Boston,MA)进行非线性回归曲线拟合来确定
EC50。全部20种被分析的抗CDH6抗体展示了在OVCAR3细胞(图1)和表达CDH6的CHO细胞上的
依赖于剂量的、靶特异性的结合。在不表达CDH6的野生型CHO细胞上没有观察到反应性。
EC50值被概括在表7中。
[0836] 表7.在OVCAR3细胞和对于CDH6表达为阴性(CHO-TREX)或被工程化以表达人、猕猴属、大鼠或小鼠CDH6的CHO细胞上CDH6 IgG的细胞结合亲和性(EC50[nM])。
[0837]
[0838] 实施例4:通过Biacore测定确定与来自人、猕猴、大鼠和小鼠的重组CDH6的结合亲和性和交叉反应性
[0839] 使用SPR技术在 T100仪器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上和采用CM5传感器芯片，测定了抗体与来自人、猕猴、大鼠和小鼠来源的重组CDH6蛋白的亲和力。
[0840] 简单来说,对于所有的实验，使用补充有0.5％牛白蛋白级分V(7.5％溶液)(Gibco 15260-037)的HBS-P(0.01M HEPES,pH 7.4,0.15M NaCl,0.005％表面活性剂P20)作为运行
缓冲液。通过应答单位(RU)测定固定化水平和分析物相互作用。进行预试验以测试和证实
固定化抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch 109-006-098West Grove,PA)和捕获测试抗
体的可行性。
[0841] 为了动力学测定,进行了实验，其中经由将抗人Fc抗体固定化把抗体捕获到传感器芯片表面并且测定了CDH6蛋白在自由的溶液中结合的能力。简单来说,在pH 5时，把通过
以12μl/分钟的流速胺偶联在所有四种流动池上以达到7500RU，来使30μg/ml抗人Fc抗体固
定化在CM5传感器芯片上。然后以10μl/分钟持续12秒把5-10μg/ml测试抗体注射到流动池
2、3和4。随后,以2倍系列稀释0.78-50nM的CDH6受体胞外域(ECD)并且以80μl/分钟的流速
持续100秒将其注射在参考(流动池1)和试验流动池2、3和4上。关于测试ECD的表被列于下
面。随后是结合的解离持续10分钟。在每一个注射周期以后,采用10mM甘氨酸pH2.0以60μl/
分钟再生芯片表面30秒。所有的实验都在25℃进行并且采用简单的1:1相互作用模型使用
T100评估软件版本2.0.3对应答数据进行总体拟合以得到缔合速率(ka)、解离
速率(kd)和亲和性(KD)的估测值。结果提示在这个组中测定的大多数CDH6抗体是可与人、猕
猴、大鼠和小鼠交叉反应的(表8)。
[0842] 表8.
[0843] 通过Biacore测定的抗CDH6 IgG与来自人、猕猴、大鼠和小鼠的重组CDH6的结合亲和性
[0844]
[0845]
[0846] 实施例5：经由Biacore的表位框并
[0847] 使用表面等离振子共振(SPR)技术在具有CM5传感器芯片的 A-100仪器(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上测定了CDH6抗体的表位定位。简单来说,对于所有的实
验，使用HBS-EP缓冲液(补充有0.25％BSA和10mM钙的10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,
3.4mM EDTA,0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液。通过应答单位(RU)确定了固定化水
平和分析物相互作用。进行了预试验以测试和证实固定化抗人Fc抗体(目录号Jackson 
Immuno Research 109-006-098West Grove,PA)和捕获测试抗体的可行性。
[0848] 为了表位定位,以10,000RU把抗人Fc抗体固定在所有四个流动池的斑点1、2和4、5上。使用斑点5作为参考。然后通过以大于300RU的应答水平将抗人Fc固定在生物传感器芯
片上,随后以高于20RU的结合水平把CDH6蛋白注射在斑点1和5中，来捕获每一种第一测试
CDH6抗体。使用斑点2和4作为另外的参考表面。采用两次以1mg/ml注射人IgG封闭每一种流
动池的所有五个斑点，以封闭抗人Fc的任何自由的结合位点。然后把每一种第二测试抗体
注射在斑点1、2或4、5上，以评估与第一测试抗体和CDH6蛋白质的复合物的结合程度。使用
人IgG同种型对照作为第一和第二测试的阴性对照抗体。在所有的四个流动池中平行地测
试抗体，直到抗体对所有可能的组合已经被评估为止。在每一个第一和第二抗体结合循环
以后，借助于注射10mM甘氨酸pH2.0来再生所有的流动池表面。
[0849] 使用在 4000评估软件中的表位定位模块评估结果并且以矩阵形式呈现,其中第一抗体成排而第二抗体成列(图2)。通过正的应答值指示了第二测试抗体与第一
测试抗体和CDH6蛋白的复合物的另外的结合。标记了阴性对并且将其与人IgG同种型对照
比较。然后使用所述的矩阵，基于它们怎么能够与其它抗体形成对来制作哪些抗体识别哪
些表位的图。抗体NOV0710和NOV0712彼此竞争，指示它们识别所述抗原上的重叠表位。
NOV1127当它被被用作第一和第二结合抗体时，显示阳性的结合,暗示它可以与CDH6上的多
个位点结合或初始的结合改变了构象并且打开了另外的结合位点。基于这个分析，
NOV0719、NOV0692、NOV1126和NOV1132全部看起来结合不同的表位。
[0850] 实施例6:经由氢-氘交换/质谱的表位定位
[0851] 使用与质谱(MS)组合的氢-氘交换(HDx)(Woods等人,J.Cell Biochem.2001S37:89-98))来定位抗体NOV1127、NOV0719、NOV0710和NOV0712在全长hCDH6的全长胞外结构域
(ECD)(aa54-615)上的结合位点,所述ECD包括钙粘着蛋白结构域(EC)1至5(表9)。此外,使
用抗体NOV0710和NOV0712，还在由EC 1至3组成的截短的ECD上进行了HDx(表10)。在HDx中，
蛋白质的可交换的酰胺氢被氘替换。这个过程是对蛋白质结构/动力学和溶剂可及性敏感
的，并且因此能够报告在配体结合时发生氘摄取减少的位置。这些实验的目标是鉴定潜在
的表位并且了解当与我们的治疗性抗体结合时hCDH6的动力学。重要的是指出在氘摄取中
的变化对直接结合和变构事件这两者是敏感的；为了精确地确定表位，HDx必须与正交技术
(例如X-射线晶体衍射)组合。
[0852] 利用与文献中所述的那些方法类似的方法(Chalmers等人,Anal Chem.2006:78(4):1005-14)进行了自动化的HDx/MS实验。所述的实验是在包括LEAP自动取样器、
nanoACQUITY UPLC系统和Synapt G2质谱仪(Waters Corp,Milford MA)的Waters
平台上进行的。采用氘来标记全长hCDH6(54-615)的蛋白质主链所使用的氘
缓冲液是50mM D-Tris，150mM NaCl pH 7.4+3mM CaCl2；在所述的溶液中氘的总的百分数
是89.5％。对于在不存在hCDH6抗体的情况下的hCDH6(54-615)氘标记实验，使用45μl在冷
却的试管中的氘缓冲液稀释5μl体积的600pmol的hCDH6(54-615)并且在4℃在旋转器上温
育25分钟。然后在冰上用75μl冷的猝灭缓冲液猝灭标记反应3分钟，随后将其注射到LC-MS
系统上，用于自动化的胃蛋白酶消化和肽分析。对于在存在结合的hCDH6抗体的情况下的
hCDH6(54-615)氘标记实验,首先把600pmol的hCDH6抗体固定化在Thermo Protein G Plus
珠子上并且使用二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)使其交联。为了进行标记实验,把抗体珠子
(包含600pmol抗体)与600pmol hCDH6(54-615)一起在4℃温育30分钟。在30分钟以后，用
200μlTris缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl pH 7.4+3mM CaCl2)洗涤所述的珠子。然后添加
200μl冷却的氘缓冲液(80.6％氘)并且在4℃温育复合物25分钟。在25分钟以后,在冰上用
125μl冷的猝灭缓冲液猝灭标记反应2.5分钟。在离心机中旋转所述的样品30秒以后，把猝
灭的溶液注射到LC-MS系统上，用于自动化的胃蛋白酶消化和肽分析。还在仅仅包含EC 3至
5的hCDH6(267-615)构建体上进行了类似的实验。在这些实验中，缓冲液是25mM HEPES pH
＝7.4，150mM NaCl，3mM CaCl2和包含94.2％氘的氘形式的缓冲液。
[0853] 所有的测定都是使用最少3次分析的三次重复进行的。所有的氘交换实验都是使用0.5M TCEP和3M脲(pH＝2.5)猝灭的。在猝灭以后,利用 固定化的胃蛋白
酶柱子(2.1x 30mm)，在12℃使所述的交换后的抗原进行在线的胃蛋白酶消化，随后将其捕
获在Waters HSS T3(Waters Corp.Milford MA)捕获柱上。把肽从所述的捕
获柱上洗脱下来，并且在Waters CSH C18 1 x 100mm柱子(保持在1℃)上，以40μl/分钟的
流速，利用2至35％B的二元的8分钟梯度(流动相A是99.9％水和0.1％甲酸；流动相B是
99.9％乙腈和0.1％甲酸)分离。
[0854] 对于hCDH6(54-615)蛋白，通过氘交换实验监测了73％的序列；这些肽的完整名单出现在表9中。图3提供关于hCDH6(54-615)蛋白的场内交换(on-exchange)特征的概括。与
展示更小的氘摄取的区域,例如区域EC4和EC5相比，具有更大的氘摄取的区域,例如EC3要
么更加暴露于溶剂要么具有较弱的氢键作用网络。总的说来,观察到EC1至EC3结构域具有
比EC4或EC5结构域氘的更大的场内交换。例如,EC2肽181-199VTATDADDPTYGNSAKVVY(SEQ 
ID NO:336)的平均氘摄取是3.61Da；相比之下，EC5肽506-525IQTLHAVDKDDPYSGHQFSF(SEQ 
ID NO:337)的平均氘摄取仅仅是1.18Da。由于在动态范围方面的限制，有限的氘摄取能够
使得对保护区域的确定更加具有挑战性，所述保护区域是在抗体结合时发生-0.5Da或更少
的偏移的那些区域。
[0855] 对于EC1(54-159)，在所有四种抗体结合时展示氘摄取减少的唯一的肽是61-70FLLEEYTGSD(SEQ ID NO:338)。在EC1中，抗体NOV1127和NOV0719展示在结构方面的显著
的去稳定作用以及在氘摄取方面大于或等于0.5Da的变化。NOV0710和NOV0712的结合没有
显著地改变在EC1结构域中抗原的氘交换行为。
[0856] 对于EC2(160-268)，在所有的抗体对氘的摄取方面，区域195-202AKVVYSIL(SEQ ID NO:339)具有临界减少。更加有趣地,区域203-221QGQPYFSVESETGIIKTAL(SEQ ID NO:
340)基本上被NOV0719以及稍微更少地被NOV0712去稳定化(即经历氘摄取增加)。NOV1127
和NOV0710均不去稳定化这个区域，具有+0.5Da或更大的在氘掺入方面的变化。最后,区域
225-237DRENREQYQVVIQ(SEQ ID NO:341)仅仅在NOV0719与hCDH6抗原结合时被去稳定化。
[0857] 对于EC3(269-383)，区域275-302FKTPESSPPGTPIGRIKASDADVGENAE(SEQ ID NO:342)被NOV0719去稳定化。区域303-315IEYSITDGEGLDM(SEQ ID NO:343)在所有抗体的氘摄
取方面展示减少,但是相对于其余两种抗体，由NOV0710和NOV0712引起的所述减少更加显
著。区域316-330FDVITDQETQEGIIT(SEQ ID NO:344)在所有抗体的氘摄取方面展示减少，但
是由NOV0719引起的所述减小是最小的。相比之下,区域331-336VKKLLD(SEQ ID NO:345)被
NOV0719去稳定化以及更少地被NOV0712去稳定化。对于除了NOV0719以外的所有抗体，区域
337-358FEKKKVYTLKVEASNPYVEPRF(SEQ ID NO:346)展示氘摄取方面的减少；相比之下，
NOV0719是使区域337-345FEKKKVYTL(SEQ ID NO:347)去稳定化的唯一的抗体。最后,观察
到NOV0719还使区域370-376VRIVVED(SEQ ID NO:348)去稳定化。
[0858] 对于EC4(384-486)和EC5(487-608)，所述的抗原的场内氘交换(图3)总体上是相对低 的 ，使得 检 测氘 摄取的 减 小具 有挑 战性 。对于 EC 4 ，区域 4 07 -
427AQDPDAARNPVKYSVDRHTDM(SEQ ID NO:349)展示了在NOV0710对于氘摄取方面的临界减
少。在EC4中没有其它区域在与所述的四种抗体中的任意一种结合时减少氘摄取。总的说
来 ,这些 观察 强 烈地 提示 EC 4不 参 与所述 的 表位 。相比 之 下 ,45 9 -
488IATEINNPKQSSRVPLYIKVLDVNDNAPEF(SEQ ID NO:350)展示被NOV0719、NOV1127、NOV0712
和NOV0710不同程度的去稳定化(以去稳定化的降序排列)。
[0859] 对于EC5，当hCDH6与NOV0710或与NOV0712复合时，仅仅区域564-586YLLPVVISDNDYPVQSSTGTVTV(SEQ ID NO:351)展示氘摄取方面的临界减少。应该注意到:
当hCDH6与所述的四种被研究的抗体中的任意一种相互作用时，在所述的五个胞外域中，仅
仅EC5没有展示任何区域的去稳定化。
[0860] 还在仅仅由EC3-EC5、hCDH6(267-615)组成的hCDH6构建体上进行了HDx实验。在这些实验中，研究了抗体NOV0710和NOV0712。这种构建体是与在晶体学实验中使用的相同的
构建体。在这些实验中的序列覆盖度是86％。表10提供了所有的肽的详尽目录。
[0861] 对于这种构建体,对于NOV0710和NOV0712这两者，在EC3中在区域295-315ADVGENAEIEYSITDGEGLDM(SEQ ID NO:352)中观察到氘摄取的减少；这是非常类似于全
长抗原的行为，在全长抗原中区域303-315IEYSITDGEGLDM(SEQ ID NO:343)展示经由所有
抗体的氘摄取减少,但是经由NOV0712和NOV0710的更加如此。有趣地,在EC3中存在着展示
所述的两种构建体之间差别行为的区域。例如,在hCDH6(54-615)中，NOV0719在许多区域中
引起显著的去稳定化，而其它抗体没有。相比之下,对于hCDH6(267-615)蛋白，NOV0710和
NOV0712这两者还在与在全长hCDH6(54-615)蛋白中观察到被NOV0719去稳定的区域非常相
似的区域中展示显著的去稳定化。
[0862] 在EC4中,观察到相似的去稳定化趋势。在hCDH6(54-615)中，NOV0719在这个结构域的C端一侧上引起最显著的去稳定化作用，并且NOV0710和NOV0712具有很少的效果。相比
之下,当使用hCDH6(267-615)构建体时，NOV0710和NOV712这两者显著地使EC4的C端一侧去
稳定。所述的在去稳定行为方面的差别的来源没有被很好地了解。重要的是要注意到:在
EC4结构域中，采用NOV0710或NOV0712，没有任何一种构建体在氘摄取方面有实质性减少，
提示这个区域不参与结合NOV0710或NOV0712。
[0863] 在EC5中，我们在hCDH6(54-615)和hCDH6(267-615)构建体之间观察到最一致的氘交换行为。没有任何一种构建体展示显著的被NOV0712或NOV0710去稳定化作用。而且,使用
hCD6(54-615)在氘摄取方面轻微的并且常常不显著的减少(不少于-0.5Da)在hCDH6(267-
615)中变得更加显著。在结合NOV0710或NOV0712时展示最显著的氘摄取减少的hCDH6(267-
615)区域的EC5包括区域492-505YETFVCEKAKADQL(SEQ  ID  NO:353)、551-
563TRKNGYNRHEMST(SEQ ID NO:354)和572-586DNDYPVQSSTGTVTV(SEQ ID NO:355)。对于
572-586DNDYPVQSSTGTVTV(SEQ ID NO:355)的实质性保护与来自NOV0710和NOV0712这两者
的X-射线晶体衍射的表位数据非常一致。氨基酸N573、D574和Y575展示大的可及表面区域
并且在与任何一种抗体形成复合物时，所有三种实质上都被埋藏了。V577也被埋藏在这两
种结构中，指示进一步的一致。晶体学数据没有指示492-505YETFVCEKAKADQL(SEQ ID NO:
353)被埋藏，因此这个保护本质上似乎为变构的,但是对551-563TRKNGYNRHEMST(SEQ ID 
NO:354)的保护特别是在其中R552被实质上埋藏的NOV0712复合物中似乎是有重大意义的。
[0864] 最后,重要的是要注意到:在与两种抗体中的任何一种形成复合物时，在氘摄取方面展示显著的(-0.5Da或更少)减少的EC5结构域中存在着其它区域。对于NOV0710，这些区
域包括510-525HAVDKDDPYSGHQFSF(SEQ ID NO:356)、542-550NKDNTAGIL(SEQ ID NO:357)
和591-604CDHHGNMQSCHAEA(SEQ ID NO:358)。对于NOV0712，这些区域包括512-
522VDKDDPYSGHQ(SEQ ID NO:359)、542-550NKDNTAGIL(SEQ ID NO:357)和591-
604CDHHGNMQSCHAEA(SEQ ID NO:358)。
[0865] 总的说来,HDx数据提示所鉴定的结合CDH6的抗体对CDH6的结合导致所述的CDH6蛋白变得更易于氘交换,可能反映由CDH6抗体的结合诱导的构象变化。被鉴定为在CDH6抗
体的存在下被保护免于受氘交换的区域与NOV0710和NOV0712的X-射线晶体衍射数据一致
并且形成这些抗体的表位的一部分。
[0866] 表9.NOV1127、NOV0719、NOV0710和NOV0712对包含钙粘着蛋白1-5结构域的hCDH6(54-615)的影响。
[0867]
[0868]
[0869]
[0870]
[0871]
[0872]
[0873]
[0874]
[0875] 表10
[0876] NOV0710和NOV0712对包含钙粘着蛋白3-5结构域的hCDH6(267-615)的影响。
[0877]
[0878]
[0879]
[0880]
[0881]
[0882]
[0883]
[0884]
[0885] 实施例7:经由X-射线晶体衍射的表位定位
[0886] 测定了与NOV0712或NOV0710的Fab片段(SEQ ID NO:444-447,表12和13)结合的人CDH6片段(胞外域5或EC5、SEQ ID NO:443,表11)的晶体结构。正如下面详细的那样,使CDH6 
EC5与NOV0712或NOV0710 Fab在哺乳动物细胞中共表达而产生纯化的复合物。然后利用蛋
白质晶体学产生关于与NOV712或NOV710 Fab结合的CDH6 EC5的原子解析数据并且定义表
位。
[0887] 用于表位定位的蛋白质生产
[0888] 为晶体学产生的CDH6 EC5、NOV0712 Fab和NOV0710 Fab的序列显示在上面的表9中。CDH6 EC5构建体包含残基490至608，在人CDH6的背景中显示为带下划线的(UniProt识
别符P55285,SEQ ID NO:533,表11,并且如下在表11中显示为SEQ ID NO:534。来自小鼠IgG 
kappa轻链的N端信号序列被用于CDH6 EC5的分泌表达并且在表达期间被切割,留下CDH6 
EC5的完整的N-端。使CDH6 EC5的C-端与来源于β淀粉状蛋白(APP标记,氨基酸:EFRHDS(SEQ 
ID NO:531))的纯化标记融合，在纯化标记之前是便于在纯化以后切割和除去标记的
蛋白酶(GE Healthcare,Piscataway,NJ)识别位点(氨基酸:LEVLFQGP(SEQ 
ID NO:532))。对于NOV0712和NOV0710 Fab,显示了重链和轻链的序列(SEQ ID NO:535-
538)。
[0889] 表11
[0890] 用于结构生物学研究的蛋白质
[0891]
[0892]
[0893]
[0894]
[0895]
[0896]
[0897] 在 细胞中把CDH6 EC5与NOV0712或NOV0710 Fab共表达以产生用于晶体学的复合物。详细地,使0.5mg编码CDH6 EC5的质粒与0.5mg NOV0712或NOV0710 Fab质粒
混合,稀释到50ml OptiMEM I培养基(Life Technologies,Grand Island,NY)中,并且将其
与2.5mg PEI(Polysciences,Warrington,PA)在50ml相同的培养基中一起培育30分钟。然
后在37℃与8％的CO2下，以1百万个细胞/ml把混合物添加到悬浮生长在 表达
培养基(Life Technologies Grand Island,NY)中的1L 细胞中。在72小时以
后,通过离心收获包含CDH6 EC5-Fab复合物的培养基,并且补充CaCl2到3mM。然后把与抗
APP标记IgG(内部产生的)缀合的 4B珠子(GE  Healthcare 
Pittsburgh,PA)添加到培养基中并且在4℃保持搅拌过夜。第二天把珠子填入重力柱子中
并且用25mM Hepes pH 7.4+150mM NaCl(HBS)和3mM CaCl2洗涤。采用3个柱体积(CV)的
100mM甘氨酸pH 2.5,150mM NaCl,3mM CaCl2把靶复合物洗脱到1/10(v/v)的1M Tris pH 
8.5中。把复合物与1/100(w/w)GST标记的 蛋白酶(GE Healthcare,
Pittsburgh,PA)在4℃一起培育过夜以切除APP标记。第二天,通过使混合物穿过1ml
HP柱子(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)来除去 蛋白酶。然后
使穿过液与1/10(w/w)的PNGaseF(内部纯化的)在37℃一起培育过夜以除去N联糖基化。在
去糖基化以后,浓缩混合物并且将其装载到在HBS加3mM CaCl2中平衡的HiLoad 16/600
200pg(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)上。通过SDS-PAGE和LCMS分析包含纯
化的CDH6-Fab复合物的峰值级分,汇集并且浓缩，用于结晶。
[0898] 结晶和结构测定
[0899] 分别地把CDH6 EC5/NOV0712和CDH6 EC5/NOV0710复合物浓缩到9.3mg/ml和14.7mg/ml,以20,000g离心5分钟,并且筛选用于结晶。在20℃通过悬滴汽相扩散来生长用
于数据收集的晶体。通过使1.2μl所述的复合物与包含20％(v/v)PEG3350和0.2M柠檬酸氢
二铵的1μl贮备溶液混合,并且使液滴相对于450μl相同的贮备溶液加50μl水平衡，来生长
CDH6 EC5/NOV0712复合物的晶体。通过将0.8μl CDH6 EC5/NOV0710复合物与1μl含有0.7M
柠檬酸三钠和0.1M Tris·HCl pH8.5的储存溶液混合，并使该液滴针对425μl相同储库溶
液加75μl水平衡而生长CDH6 EC5/NOV0710复合物的晶体。在数据收集之前,把晶体转移到
75％贮备溶液加25％甘油并且在液氮中急骤冷却。
[0900] 以Advanced Photon Source(Argonne National Laboratory,美国)在束线17-ID处收集衍射数据。使用Autoproc(Global Phasing,LTD)加工和标度数据。在空间群P212121
中，把CDH6 EC5/NOV0712的数据加工到 其具有晶胞尺寸
α＝90°,β＝90°,γ＝90°。在空间群P43212中，把CDH6EC5/NOV0710复合物的
数据加工到 其具有晶胞尺寸 α＝90°,
β＝90°,γ＝90°。通过分子置换，使用具有内部的Fab结构作为检索模型的相位器(McCoy等
人,(2007)J.Appl.Cryst.40:658-674)，解析了所述的复合物的结构。在CCP4程序套装
(Winn等人,(2011)Acta.Cryst.D67:235-242)中使用Buccaneer(K.Cowtan(2006)Acta 
Cryst.D62:1002-1011)从头开始建造了CDH6EC5的结构。把最后的模型装入COOT(Emsley&
Cowtan(2004)Acta Cryst.D60:2126-2132)并且采用Buster(Global Phasing,LTD,
Cambridge,UK)精制。对于CDH6 EC5/NOV0712复合物,R工作和R自由值分别是21.2％和25.2％；
并且键长和键角的均方根(r.m.s)偏差值分别是 和1.24°。对于CDH6 EC5/NOV0710
复合物,R工作和R自由值分别是18.2％和24.6％；并且键长和键角的r.m.s偏差值分别是
和1.28°。
[0901] 与NOV0712或NOV0710 Fab接触的CDH6 EC5的残基、相互作用的类型和埋藏的表面区域都是通过PISA(Krissinel等人,(2007)J Mol Biol.372:774-97)鉴定的并且被列在表
12和13中。对于在不对称单元(在晶体中最小的独特单元)中包含多于一个复合物拷贝的结
构,只有那些在所有的拷贝中常见的抗体接触的残基被列为表位残基。
[0902] NOV0712和NOV0710在CDH6上的表位
[0903] 总体结构
[0904] 在这个时候没有报道过CDH6的晶体结构。CDH6 EC5的总体折叠类似于CDH2(N-钙粘着蛋白)EC5的总体折叠,这两者都由一个三链β片层倚靠着另一个四链β片层堆积组成。
所述的两种结构的重叠导致 的小的均方根距离(RMSD)以及N-和C-端的类似取向。因
此基于EC5结构域的重叠，为了估测所述的取向以及NOV0712和NOV0710 Fab，可以把CDH6 
EC5/Fab复合物结构重叠到CDH2的全长ECD结构上。如图4中所示,NOV0712和NOV0710结合
CDH6 EC5的同一侧,并且共享显著地重叠的表位。与NOV0710比较，NOV0712的结合稍微从
EC4-EC5接头移开。
[0905] NOV0712的表位
[0906] 使用CDH6 EC5/NOV0712复合物的晶体结构来鉴定NOV0712在CDH6上的表位。经由NOV0712 Fab对于CDH6 EC5的相互作用表面是由几个连续的和不连续的(即非相邻的)序
列:即残基503、520-527、529、532-534、538-543、550、552、569和571-577形成的,正如在表
12中详述的那样。这些残基形成被NOV0712 Fab(图5上组)识别的三维构象表位。通过晶体
学确定的这个表位与通过氢氘交换质谱(HDx-MS)确定的那个表位有良好的一致性,其中残
基572-586实质上被NOV0712保护。有趣地,CDH6 EC5(残基571-579)的潜在的Ca2+-结合环
的大部分(10个残基中的8个)与NOV0712接触,特别是Tyr575和Asn573，它们几乎完全地被
抗体埋藏(表12和图5下组)。与CDH2结构相比较,CDH6 EC5的这种Ca2+-结合环呈由NOV0712
结合诱导的“外”构象(例如与在CDH2中它的相应残基Asp525相比较，CDH6的Asp572被翻
转)。
[0907] 表12
[0908] 在CDH6上的NOV0712表位。通过PISA鉴定了在晶体结构中与NOV0712接触的CDH6的所有残基,列出并对它们被NOV0712埋藏的表面积分类。适用时，还列举了相互作用的类型。
[0909]
[0910]
[0911]
[0912] 1通过侧链原子形成的氢键；2通过主链原子形成的氢键
[0913] NOV0712的表位
[0914] 使用CDH6 EC5/NOV0710复合物的晶体结构来鉴定NOV0710在CDH6上的表位。经由NOV0712 Fab对于CDH6 EC6的相互作用表面是由几个连续的和不连续的(即非相邻的)序
列:即残基520-527、529、541、543、569和571-579形成的,正如在表13中详述的那样。这些残基形成被NOV0710 Fab(图6上组)识别的三维构象表位。通过晶体学确定的这个表位与通过
氢氘交换质谱(HDx-MS)确定的那个表位有良好的一致性,其中残基572-586实质上被
NOV0710保护。有趣地,与在CDH6 EC5/NOV0712复合物结构中类似,在CDH6 EC5(残基571-
579)的潜在的Ca2+-结合环中所有的残基与NOV0710接触；其中Tyr575、Asn573和Asp574几
乎完全地被抗体埋藏(表13和图6下组)。与CDH2结构相比较,CDH6 EC5的这种Ca2+-结合环
呈由NOV0712结合诱导的“外”构象(例如与在CDH2中它的相应残基Asp525相比较，CDH6的
Asp572是翻转的)。
[0915] 表13
[0916] 在CDH6上的NOV0710表位。通过PISA鉴定了在晶体结构中与NOV0710接触的CDH6的所有残基,列出对它们被NOV0710埋藏的表面积分类。适用时，还列举了相互作用的类型。
[0917]
[0918]
[0919] 1通过主链原子形成的氢键；2通过侧链原子形成的氢键
[0920] 实施例8:用来证实共-晶体结构和确定抗CDH6抗体与野生型和突变体CDH6蛋白结合的ELISA试验
[0921] 对CDH6蛋白/NOV0710或/NOV0712晶体结构的分析突出了具有高埋藏的表面值的几个氨基酸残基(Asn573、Asp574和Tyr575),暗示它们对于介导抗体与CDH6蛋白的相互作
用可能是重要的。我们产生了重组的突变体CDH6蛋白,将这些残基用丙氨酸替换(表11,SEQ 
ID NO:539、540和541)并且进行ELISA。在4℃采用1ug/ml、100ul/孔的合适的重组人蛋白
(CDH6wt、CDH6-N573A、CDH6-D574A或CDH6-Y575A)包被96-孔Maxisorp板(Nunc)过夜。然后
采用PBS/0.1％Tween-20洗涤所有的孔3次,采用PBS/1％BSA/0.1％Tween-20封闭一个小时
并且采用PBS/0.1％Tween-20洗涤3次。把抗CDH6抗体的系列稀释液添加到有关的孔中
(100nM起始浓度；5倍系列稀释液)并且在室温下温育板两个小时。采用PBS/0.1％Tween-20
洗涤板3次，然后添加在PBS/1％BSA/0.1％Tween-20中1/10000稀释的山羊抗人过氧化物酶
连接的检测抗体(Pierce,#31412,Thermo,Rockford,IL)。在室温下温育板一个小时，然后
用PBS/0.1％Tween-20洗涤3次。把100μl TMB(3,3’,5,5’四甲基联苯胺)底物溶液(BioFx)
添加到所有的孔中6分钟，然后采用50μl 2.5％H2SO4停止反应。通过使用SpectraMax板读
数器(Molecular Devices)测定OD450确定了CDH6抗体与每一种重组蛋白质结合的程度。使
用Graphpad Prism分析了剂量反应曲线。
[0922] 如图7中所示,D574A突变废除了NOV0710和NOV712这两者的结合,证实这种残基是所述的两种抗体的共有表位的必需组分。有趣地,N573A突变体保留与NOV712的结合但是没
有保留与NOV0710的结合,然而Y575A突变体保留与NOV0710的结合但是没有保留与NOV0712
的结合。值得注意的是,这些突变中没有一个影响结合不同表位的抗CDH6抗体NOV0720的结
合(NOV0720是图2中NOV1132的非种系化形式)–指示所述的突变体没有改变所述蛋白质的
总体结构。这些数据进一步证实了共晶体结构并且证实所述的两种抗体的特征是具有重叠
的然而不同的表位。
[0923] 实施例9:抗体药物缀合物的制备
[0924] 通过一步法制备DM4缀合物
[0925] 使抗CDH6抗体,例如NOV7012，以大约10.0mg/mL的浓度与DM4(相对于抗体的数量，6.8倍摩尔过量)混合，然后与磺基SPDB(相对于抗体的数量，大约5.2倍过量)混合。在20℃
在包含10％DMA的20mM EPPS[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸]缓冲液(pH 8.1)中进行反应大
约16小时。通过添加1M乙酸以把pH调节到5.0来猝灭反应。在pH调节以后,通过多层(0.45/
0.22μm)PVDF过滤器过滤反应混合物并且使用切向流过滤将其纯化和渗滤到10mM琥珀酸盐
缓冲液(pH 4.5)中。用于切向流过滤的仪器参数的实例被列在下面的表14中。
[0926] 表14
[0927] 用于切向流过滤的仪器参数
[0928]
[0929]
[0930] 通过下列分析从上面描述的方法中获得的缀合物:用于细胞毒性剂负荷(美坦生类化合物与抗体比率,MAR)的紫外光谱学；用于确定缀合物单体的SEC-HPLC；和用于游离的
美坦生类化合物百分比的逆相HPLC或疏水性保护相(Hisep)-HPLC。
[0931] 采用SPDB或磺基-SPDB接头和DM4细胞毒性剂制备ADC
[0932] 使抗CDH6抗体,例如抗体NOV0712，与DM4(6.8和10.2倍摩尔过量)在25℃在包含～10％DMA的50mM EPPS缓冲液(pH 8.1)中混合。向这种混合物中添加N-琥珀酰亚胺基4-(2-
吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB,分别4.0和6.0倍摩尔过量)，使得最后的抗体浓度是4mg/mL并
且最后的DMA含量是10％。允许反应在25℃在50EPPS缓冲液(pH 8.1)中进行～16小时。使用
被10mM琥珀酸盐，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％吐温20,pH 5.5平衡和洗脱的
G25柱子纯化缀合反应混合物。使用类似方法来产生抗CDH6-磺基-SPDB-
DM4缀合物。
[0933] 任何一种上述方法可用于抗体与SPDB-DM4或磺基-SPDB-DM4的缀合中。下面表15提供了CDH6 ADC的一个实例。
[0934] 表15
[0935] DM4缀合的抗体的性质
[0936]
[0937]
[0938] 通过原位法制备SMCC-DM1缀合物
[0939] 还可以利用原位法，按照下列工序，使抗CDH6抗体与SMCC-DM1缀合。使用磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)接头，使CDH6抗体与DM1
缀合。在DMA中制备DM1和磺基-SMCC杂双官能性接头的储备溶液。使磺基-SMCC和DM1硫醇在
25℃在包含40％v/v的含水的50mM琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA,pH 5.0的DMA中以1.3:1摩尔
当量的DM1:接头比率和1.95mM的DM1最终浓度混合在一起反应10分钟。然后使所述的抗体
与一个等分的上述原位产生的SMCC-DM1反应，使得最后的缀合条件包括2.5mg/mL的Ab在
50mM EPPS,pH 8.0，10％DMA(v/v)中并且SMCC:Ab的摩尔比率在6.5左右。在25℃在大约18
以后,使用被10mM琥珀酸，250mM甘氨酸，0.5％蔗糖，0.01％吐温20,pH 5.5平衡的
G25柱子纯化缀合反应混合物。
[0940] 实施例10:在表达来自人、猕猴、大鼠或小鼠来源的CDH6的CHO细胞系的组中抗CDH6抗体和ADC结合的确认
[0941] 为了确认未缀合的抗CDH6抗体和抗CDH6-ADC与具有表达来自不同物种的CDH6的特征的细胞的结合,在被工程化以表达来自人、猕猴、大鼠和小鼠来源的CDH6的CHO细胞上
进行FACS(荧光活化细胞分选)分析。具有CDH6表达特征的CHO细胞系的产生被描述在实施
例1中；FACS方法被描述在实施例3中。
[0942] 如图8中所示,非缀合的CDH6抗体NOV0712具有对来自人、猕猴、大鼠和小鼠来源的CDH6的相当的细胞结合的特征。NOV0712-磺基-SPDB-DM4抗体药物缀合物具有与非缀合的
NOV0712相当的结合谱的特征。这种结果指示:添加接头和有效负荷没有干扰抗CDH6抗体的
结合亲和性或特异性。
[0943] 实施例11:在一组卵巢癌细胞系中评估CDH6表达和靶向CDH6的抗体和ADC的细胞结合
[0944] 在准备评估靶向CDH6的ADC的细胞活性中,通过FACS在一组卵巢癌细胞系中评估了CDH6细胞表面表达水平。具体地,通过采用 细胞解离试剂(Gibco,#
A1110501 Grand Island,NY)按照生产商的说明书处理培养中的细胞，随后在FACS缓冲液
(RPMI/1％BSA,Gibco,Grand Island,NY)中洗涤所述的细胞，制备了细胞悬浮液。以1x106
个细胞/ml把细胞重悬浮在FACS缓冲液中并且以100μl/孔将其等分到96-孔圆底板
(Corning#CLS3360 Tewksbury,MA)中。以5μg/ml把一级抗体(抗CDH6-PE(R&D Systems,#
FAB2715P Minneapolis,MN)和对照小鼠IgG1  PE缀合物(R&D  Systems,#IC002P 
Minneapolis,MN)稀释在FACS缓冲液中。在200μl冷的FACS缓冲液中洗涤3次以后,在BD 
FACS (BD Biosciences,San Jose,CA)上分析细胞。利用 软件确定
了每个试样的信号的几何平均值。
[0945] OVCAR3内源性地表达高水平的CDH6。为了产生具有受抑制的CDH6表达的同基因的细胞系,按照生产商的说明书给OVCAR3转导慢病毒载体，该慢病毒载体递送靶向CDH6的
shRNA(Mission shRNA细菌甘油原种,#TRCN0000054117,Sigma,St.Louis,MO)。OVCAR8细胞
不内源性地表达CDH6。为了产生具有CDH6表达特征的同基因的细胞系,给OVCAR8细胞转导
驱动人CDH6cDNA表达的慢病毒构建体。具体地,从Genecopoeia(#Z2028,Genecopoeia,
Rockville,MA)购买用于CDH6的cDNA并且利用 克隆按照生产商的说明书
(Invitrogen,Carlsbad,CA)将其克隆到pLenti6.3中。
[0946] FACS分析证实了在野生型OVCAR3中高水平的内源性CDH6表达以及在OVCAR3 shRNA CDH6细胞系中CDH6的抑制。证实了OVCAR8细胞是CDH6阴性的,同时在OVCAR8工程化
的CDH6+细胞中观察到CDH6的高水平的外源性表达(图9)。
[0947] FACS分析进一步证实了所产生的靶向CDH6的抗体和ADC的特异性的细胞结合。如图10中所示,利用相同的抗体以及所述的磺基-SPDB-DM4接头/有效负荷，非缀合的CDH6抗
体(NOV0712)具有与磺基-SPDB-DM4缀合物的结合模式相当的CDH6特异的结合模式特征。包
括非结合的未缀合的IgG或ADC作为对照并且发现不象期望的那样导致细胞结合。再次指示
添加接头和有效负荷不干扰抗CDH6抗体的亲和性或特异性。
[0948] 实施例12:靶向CDH6的ADC的体外细胞活性
[0949] 在一组包含OVCAR3(培养在RPMI+20％FCS中的卵巢浆液癌瘤)、JHOS4(1:1F12:DMEM+10％FBS)、KNS42(EMEM+10％FBS)、NCIH661(RPMI+10％FBS)、SNU8(RPMI+10％FBS)和
OVCAR8(RPMI+10％FBS)的细胞系上测定了一组抗CDH6抗体的SMCC-DM1缀合物的体外细胞
活性。OVCAR3和NCIH661细胞系是从ATCC(#HTB-161和#HTB-183,ATCC Manassas,VA)获得
的。JHOS4是从RIKEN(#RCB1678,RIKEN Cell Bank,RIKEN,Tsukuba,日本)获得的。KNS42是
从Health Science Research Resources Bank HSRRB(#IFO50356,HSRRB,Osaka,日本)获
得的。SNU8是从Korean Cell Line Bank KCLB(#00008,KCLB,Seoul,韩国)获得的。OVCAR8
是从NCI/DCTD Tumor/Cell Line Repository(NCI,Frederick,MA)获得的。
[0950] 计数培养中的细胞并且将其稀释在培养基中达到1x105个细胞/ml的浓度。把1000个细胞/孔转移到384-孔板(Corning Costar#3707,Corning,Tewksbury,MA)。在1.4ml 
Matrix试管(Thermo,#3790,Rockford,IL)中制备ADC储备溶液。在384-孔深孔板
(Brandtech Scientific Inc#701355,Essex,CT)中制备10个点、1:3系列稀释液并且给每
个试验板转移25μl(一式三份)以产生最高起始浓度为33nM的ADC。对于对照,制备了仅仅含
有细胞(＝100％生存能力对照)和与SMCC-DM1缀合的非靶向抗体一起培育的细胞(为了检
查非靶标驱动的活性)的孔。在37℃和5％CO2下培育板持续120h。使用 试
剂(Promega#G7571,Madison,WI)按照生产商的说明书，测定了一级抗体/Fab-DM1复合物的
细胞活性。把生存能力对仅仅有细胞的对照归一化并且利用Tibco Spotfire(Tibco 
Software Inc,Palo Alto,CA)绘图。
[0951] 靶向CDH6的ADC亚组能够在对于缺乏CDH6表达的细胞(OVCAR8)非活性的浓度(1.22nM)下抑制CDH6阳性细胞的增殖,指示CDH6-ADC的靶依赖性体外细胞活性(表16)。
[0952] 表16
[0953] 抗CDH6 SMCC-DM1缀合物的体外细胞活性。这个表显示在1.22nM ADC下的抑制百分比。
[0954]抗体 OVCAR3 JHOS4 KNS42 NCIH661 SNU8 OVCAR8
NOV0670 -29.97 -27.88 -18.63 5.14 -15.57 -23.77
NOV0672 -16.25 -22.96 -12.26 -6.14 -10.94 -16.16
NOV0674 -10.29 -11.94 -6.82 3.9 -1.42 -8.97
NOV0682 61.75 33.92 23.75 16.44 10.83 -2.17
NOV0685 -20.65 -14.67 -14.65 2.08 -0.1 -11.51
NOV0689 7.21 3.63 -3.11 -0.53 10.27 -7.29
NOV0690 84.8 50.97 56.81 14.55 18.39 -15.8
NOV0691 -1.5 -14.37 -9.23 -10.47 -2.56 -10.48
NOV0692 88.01 62.3 57.32 14.77 15.66 -10.83
NOV0693 85.73 58.08 15.17 25.87 35.56 -7.07
NOV0695 89 66.94 66.31 18.69 21.56 -7.04
NOV0699 n/a n/a n/a n/a n/a n/a
NOV0705 68.57 40.35 -13.35 -3.15 6.4 -22.58
NOV0709 46.88 4.5 -4.2 5.91 -7.7 -8.34
NOV0710 90.84 69.01 56.98 38.7 42.4 6.53
NOV0712 87.62 67.56 56.82 32.46 31.35 1.68
NOV0713 -3.55 -6.22 -17.26 -9.74 7.79 -0.08
NOV0718 -3.8 -5.03 3.5 2.51 3.35 6.64
NOV0719 76.05 27.25 40.97 -9.87 3.18 -2
NOV0720 80.72 43.52 56.97 1.94 3.56 -3.9
[0955] 实施例13:作为SMCC-DM1和SPDB-DM4缀合物的抗CDH6 ADC在卵巢癌细胞系上的体外细胞活性
[0956] 在一组卵巢癌细胞系上评估了作为SMCC-DM1和SPDB-DM4缀合物的抗CDH6 ADC的体外细胞活性(图11和在SMCC-DM1和SPDB-DM4这两种形式中，靶向CDH6的ADC展示靶和剂量
依赖性细胞活性，正如与非表达的同基因细胞系对和同种型对照ADC(图11和表17)相比，在
表达CDH6的细胞系中对增殖的抑制所指示的那样。按照实施例12中公开的那样进行细胞活
性测定和分析。
[0957] 17)。为了评估抗CDH6 ADC的靶依赖性和特异性活性,按照实施例11中描述的那样，为OVCAR3和OVCAR8细胞系产生了同基因的细胞系对。
[0958] 在SMCC-DM1和SPDB-DM4这两种形式中，靶向CDH6的ADC展示靶和剂量依赖性细胞活性，正如与非表达的同基因细胞系对和同种型对照ADC(图11和表17)相比，在表达CDH6的
细胞系中对增殖的抑制所指示的那样。按照实施例12中公开的那样进行细胞活性测定和分
析。
[0959] 表17
[0960] 作为SMCC-DM1和SPDB-DM4缀合物的抗CDH6 ADC在卵巢癌细胞系上的体外细胞活性
[0961]
[0962]
[0963] 实施例14:呈非缀合的形式或作为磺基-SPDB-DM4抗体药物缀合物的靶向CDH6的抗体或对照IgG的体外细胞活性
[0964] 在一组卵巢癌细胞系(参见实施例11)中评估了作为非缀合的IgG或磺基-SPDB-DM4缀合物的CDH6抗体NOV0712的细胞活性。进一步包括非缀合的形式或作为磺基-SPDB-
DM4缀合物形式的非靶向的同种型对照抗体。如图12中所示,靶向CDH6的抗体药物缀合物
NOV0712-磺基-SPDB-DM4展示了靶和剂量依赖性细胞活性，正如与非表达的细胞系
(OVCAR8)比较，对表达CDH6的细胞系(OVCAR3和OVCAR8-CDH6+)的增殖的抑制所指示的那
样。采用非缀合的NOV0712抗体或非靶向的IgG对照没有观察到细胞活性。采用对照IgG-磺
基-SPDB-DM4缀合物看到了在被理解将要导致非特异性的细胞毒性的浓度下的边际活性。
按照在实施例9中公开的那样进行了细胞活性测定和分析。
[0965] 实施例15:作为SMCC-DM1缀合物的抗CDH6抗体在卵巢癌异种移植小鼠模型中的体内效力
[0966] 在OVCAR-3卵巢异种移植模型中评估了筛选的抗CDH6 ADC的抗肿瘤活性。以皮下方式给雌性NOD-scid-γ小鼠的右胁植入在磷酸盐缓冲液(PBS)中包含50％MatrigelTM(BD 
Biosciences)的10x106个OVCAR-3细胞。包含悬浮中的细胞的总注射体积是200μl。在植入
3
后29天，把小鼠登记在所述的研究中，其具有165mm 的平均肿瘤体积。在被随机地分配到七
个组中的一个组(n＝4/组)以后,给小鼠静脉内施用单次剂量PBS(10ml/kg)、非靶同种型对
照hIgG1-SMCC-DM1(10mg/kg)或五种抗CDH6-SMCC-DM1中的一种(10mg/kg)。每个星期测定
肿瘤体积和体重两次。当与对照臂比较时，在10mg/kg的单次剂量以后，每一种抗CDH6-
SMCC-DM1 ADC引发了对于肿瘤生长的抑制效果(图13)。
[0967] 在OVCAR-3卵巢异种移植模型中评估了二次筛选的抗CDH6 ADC的抗肿瘤活性。以皮下方式给雌性NOD-scid-γ小鼠的右胁植入在PBS中包含50％MatrigelTM(BD 
Biosciences,San Jose,CA)的10x106个OVCAR-3。包含悬浮中的细胞的总注射体积是200μ
l。在植入后35天，把小鼠登记在所述的研究中，其具有166mm3的平均肿瘤体积。在被随机地分配到七个组中的一个组(n＝4/组)以后,给小鼠静脉内施用单剂量的PBS(10ml/kg)、非靶
同种型对照hIgG1-SMCC-DM1(10mg/kg)或五种抗CDH6-SMCC-DM1中的一种(10mg/kg)加
NOV0712-SMCC-DM1，其已经在先前的OVCAR3分选中被定量给药。每个星期测定肿瘤体积和
体重两次。没有一只小鼠显示体重减少,这指示ADC被很好地耐受(数据没有显示)。在所述
的五种抗CDH6-SMCC-DM1中，仅仅NOV0690引发了可与NOV0712-SMCC-DM1引发的应答比得上
的应答(图14)。
[0968] 实施例16:作为SPDB-DM4缀合物的抗CDH6抗体在卵巢癌异种移植小鼠模型中的体内效力
[0969] 在OVCAR-3卵巢异种移植模型中评估了筛选的抗CDH6 ADC的抗肿瘤活性。以皮下方式给雌性NOD-scid-γ小鼠的右胁植入在PBS中包含50％MatrigelTM(BD Biosciences,
San Jose,CA)的10x106个OVCAR-3细胞。包含悬浮中的细胞的总注射体积是200μl。在植入
后21天，把小鼠登记在所述的研究中，其具有174mm3的平均肿瘤体积。在把小鼠随机地分配
到九个组中的一个组(n＝5/组)以后,给小鼠静脉内施用单剂量的PBS(10ml/kg)、非靶同种
型对照hIgG1-SPDB-DM4(5mg/kg)、非靶同种型对照hIgG1-SMCC-DM1(5mg/kg)、NOV0712-
SMCC-DM1(5mg/kg)或七种抗CDH6-SPDB-DM4中的一种(5mg/kg)。每个星期测定肿瘤体积和
体重1-2次。没有一只小鼠显示体重减少,这指示在这个剂量下ADC被很好地耐受(没有显示
数据)。在所有的抗CDH6-SPDB-DM4剂中,NOV0712-SPDB-DM4引发最大的抗肿瘤效果，在给药
后70天退化。在这个研究中，NOV0710-SPDB-DM4是第二最具活性的抗CDH6-SPDB-DM4(图
15)。
[0970] 实施例17:卵巢癌异种移植小鼠模型中呈SMCC-DM1或SPDB-DM4缀合物的抗CDH6抗体的体内效力
[0971] 在OVCAR-3卵巢异种移植模型中评估了呈不同的接头-有效负荷形式的筛选的抗CDH6 ADC NOV0712的抗肿瘤活性。以皮下方式给雌性NOD-scid-γ小鼠的右胁上植入在PBS
中包含50％MatrigelTM(BD Biosciences,San Jose,CA)的10x106个OVCAR-3细胞。包含悬浮
中的细胞的总注射体积是200μl。在植入后21天，把小鼠登记在所述的研究中，其具有
3
174mm的平均肿瘤体积。在把小鼠随机地分配到五个组中的一个组(n＝5/组)以后,给小鼠
静脉内施用单剂量的PBS(10ml/kg)、非靶同种型对照hIgG1-SPDB-DM4(5mg/kg)、非靶同种
型对照hIgG1-SMCC-DM1(5mg/kg)、NOV0712-SMCC-DM1(5mg/kg)或NOV0712-SPDB-DM4(5mg/
kg)。每个星期测定肿瘤体积和体重1-2次。没有一只小鼠显示体重减少(没有显示数据)。
NOV0712的L/P这两种形式引发抗癌效果,但是SPDB-DM4形式是更加有效的，在给药后导致
持久的推行，持续超过70天(图16)。药物动力学采样指示所述的两种作用剂具有类似的药
物动力学谱(没有显示数据)。
[0972] 实施例18:在卵巢癌的患者来源的原代肿瘤异种移植小鼠模型中，具有不同接头/有效负荷形式的抗CDH6 ADC的体内效力
[0973] 在被异种移植到小鼠中的表达CDH6的原发性(来源于患者的)卵巢肿瘤中，评估了不同的接头有效负荷形式的抗CDH6 ADC NOV0712的抗肿瘤活性。通过以皮下方式把原发性
人肿瘤组织直接植入nu/nu裸小鼠中而建立了人原代异种移植模型。在用在本研究中之前，
使所产生的异种移植物连续地传代4-10次。以皮下方式给无胸腺裸小鼠的右胁上植入尺寸
大约为27mm3的肿瘤碎片。在植入48天后，把小鼠登记在所述的研究中，其具有178mm3的平均肿瘤体积。然后将其随机地分配到8个组中的一个组中(n＝5/组)。每14天(Q14D)给小鼠静
脉内施用单剂量的PBS(10ml/kg)、非靶同种型对照hIgG1接头有效负荷形式(-SMCC-DM1、-
SPDB-DM4、-磺基-SPDB-DM4)、NOV0712接头有效负荷形式(-SMCC-DM1、-SPDB-DM4、-磺基-
SPDB-DM4)或呈裸抗体的NOV0712。以5mg/kg给所有的小组定量给药。每个星期测定肿瘤体
积和体重1-2次。没有一只小鼠显示体重减少(没有显示数据)。呈裸抗体的NOV0712对于肿
瘤生长没有抑制效果。在这个模型中，NOV0712-SMCC-DM1治疗没有导致消退。NOV0712的每
一种可切割的形式都导致消退。NOV0712-磺基-SPDB-DM4在5mg/kg Q14D(每14天单次剂量)
时是最有效的治疗臂，在第一次定量给药后具有持续150天的持久的肿瘤消退(图17)。
[0974] 实施例19:在卵巢癌的异种移植小鼠模型中，具有不同接头/有效负荷形式的抗CDH6 ADC的体内效力
[0975] 在OVCAR-3卵巢异种移植模型中评估了筛选的抗CDH6 ADC的抗肿瘤活性。以皮下方式给雌性NOD-scid-γ小鼠的右胁上植入在PBS中包含50％MatrigelTM(BD Biosciences,
San Jose CA)的10x106个细胞。包含悬浮中的细胞的总注射体积是200μl。在植入20天后，
把小鼠登记在所述的研究中，其具有172mm3的平均肿瘤体积。在将其随机地分配到八个组
中的一个组中(n＝5/组)以后，给小鼠静脉内施用单剂量的PBS(10ml/kg)、非靶同种型对照
hIgG1-SPDB-DM4(5mg/kg)、非靶同种型对照hIgG1-磺基-SPDB-DM4(5mg/kg)、NOV0712-
SPDB-DM4(1.25、2.5和5mg/kg)或NOV0712-磺基-SPDB-DM4(1.25、2.5和5mg/kg)。在整个研
究期间，每个星期测定肿瘤体积和体重1-2次。没有一只小鼠显示体重减少,这指示ADC被很
好地耐受(没有显示数据)。在2.5mg/kg和5mg/kg这两个剂量水平上，NOV0712-磺基-SPDB-
DM4比NOV0712-SPDB更加有效。单次2.5mg/kg剂量的NOV0712-磺基-SPDB-DM4导致消退。单
次5mg/kg剂量的每一种形式导致消退,但是磺基-SPDB-DM4剂量的效果比–SPDB-DM4剂量的
效果长久。总体上这些数据显示:在被评估组中，磺基-SPDB-DM4形式是使用ADC靶向CDH6的
最具活性形式(图18)。
[0976] 实施例20:在卵巢癌的患者来源的原代肿瘤异种移植小鼠模型中，具有不同接头/有效负荷形式的抗CDH6 ADC的体内效力
[0977] 在被异种移植到小鼠中的表达CDH6的原发性(来源于患者的)卵巢肿瘤中，评估了抗CDH6 ADC NOV0712的不同的接头有效负荷形式的抗肿瘤活性。通过以皮下方式把原发性
人肿瘤组织直接植入nu/nu裸小鼠中而建立了人原代异种移植模型。在用在本研究中之前，
使所产生的异种移植物连续地传代4-10次。以皮下方式给无胸腺裸小鼠的右胁上植入尺寸
3
大约为27mm的肿瘤碎块。由于在原发肿瘤的生长动力学中可变的潜伏期,使小鼠以滚动方
式进入所述的研究。当达到147mm3和244mm3之间(在册的平均尺寸是180mm3)合适的体积时，
把肿瘤分配给一个小组。把前5只小鼠分配给第1至5小组,把接下来的5只小鼠分配给第5至
1小组,等等，直到5个小组(n＝5/小组)被填满为止。在登记时，每2个星期(Q14D)给每一只
小鼠静脉内施用一个剂量的PBS(10ml/kg)、非靶同种型对照hIgG1-SMCC-DM1(5mg/kg)、
NOV0712-SMCC-DM1(5mg/kg)、非靶同种型对照hIgG1-磺基-SPDB-DM4(2.5mg/kg)或
NOV0712-磺基-SPDB-DM4(2.5mg/kg)。每个星期测定肿瘤体积和体重两次。没有一只小鼠显
示体重减少,这指示ADC被很好地耐受(没有显示数据)。在这个模型中，NOV0712-SMCC-DM1 
5mg/kg Q14D能够减小肿瘤生长。在这个模型中，NOV0712-磺基-SPDB-DM4 2.5mg/kg Q14D
有效地使肿瘤生长停止42天(图19)。
[0978] 实施例21:在一组卵巢癌的患者来源的原代肿瘤异种移植小鼠模型中，抗CDH6 ADC的体内效力
[0979] 在一组28种卵巢原代肿瘤异种移植(PTX)模型中，在1x1x1的设计(1种PTX x 1只动物x 1种治疗)中评估了抗CDH6 ADC(NOV0712-磺基-SPDB-DM4)的抗肿瘤活性。通过以皮
下方式把原发性人肿瘤组织直接植入到nu/nu裸小鼠中，建立了人原代异种移植模型。在用
于本研究中之前，使所产生的异种移植物连续地传代4至10次。使用12号的套针，以皮下方
式给雌性裸小鼠的腋区中植入3x 3x 3mm肿瘤碎块。一旦测得的肿瘤在200-250mm3，就把小
鼠登记到所述的研究中并且开始治疗。在登记后，每2个星期(Q14D)给小鼠静脉内施用一个
剂量的NOV0712-磺基-SPDB-DM4(5mg/kg)。没有一只小鼠显示体重减少,这指示ADC被很好
地耐受(没有显示数据)。每个星期测定肿瘤体积和体重两次。为了显示抗肿瘤活性,使用
Tibco Spotfire(Tibco Software,Palo Alto,CA)绘制肿瘤体积％随着时间变化的图。
[0980] 使用免疫组织化学(IHC)在来自未处理的PTX肿瘤的样品上评估PTX样品中的CDH6表达。具体地,在杀死时，立刻切除肿瘤,收集到组织学盒中并且固定在10％缓冲的福尔马
林中24小时。然后把组织学盒转移到70％乙醇中并且使用常规组织学方法处理和包埋在石
蜡中。以3.5μm把实验性的FFPE块切割成在载玻片上的完整切片。从Sigma-Aldrich获得兔
多克隆的抗人CDH6抗体(目录#HPA007047,Sigma Aldrich,St.Louis,MO)并且将其用作原
发性免疫组织化学(IHC)抗体。使用不含Ventana生物素的DAB检测系统在Ventana 
DISCOVERY XT生物标志物平台(Tuscon,AZ)上检测抗体。
[0981] 优化的实验规程包括标准的暴露于Ventana Cell Conditioning#1抗原挽回试剂(目录#950-124)。在DAKO Cytomation抗体稀释剂(目录#S0809)中把一级抗体稀释到1:200
的浓度,以100μl体积应用并且在37℃温育60分钟。随后与Ventana OmniMap预稀释的HRP缀
合的抗兔二级抗体(目录#760-4311)一起温育4分钟。然后使用ChromoMap DAB试剂盒(目
录#760-159)检测二级抗体并且采用Ventana苏木精(目录#760-2021)将载玻片复染色4分
钟,随后采用Ventana Bluing试剂(目录#760-2037)复染色4分钟。在递增浓度的乙醇(95-
100％)中然后在二甲苯中将载玻片脱水，随后加盖玻片。通过光学显微术评估加了盖玻片
的载玻片并且通过Leica/Aperio ScanScope载玻片扫描器(Vista,CA)进行扫描。在从集成
的Leica eSlide Manager/Aperio Spectrum(Vista,CA)打开的Indica Labs HALO
(Corrales,NM)中发射染色的载玻片的扫描图象。观察数字图像，并使用具有用于肿瘤检测
的Classifier Module(CDH6未固定肿瘤2、CDH6阴性的肿瘤2&CDH6肿瘤&CDH6肿瘤2)或没有
Classifier Module的面积定量算法(Area Quantification v1.0)进行注解和分析。使用
图像分析算法来检测任何强度。
[0982] 正如在图20中阐明的,通过IHC，在PTX模型,特别是在具有大于20％CDH6阳性的肿瘤区域的特征的肿瘤模型中观察到抗CDH6 ADC的效力。特别值得注意的是,11/28(39％)的
PTX模型以持续超过150天的完全肿瘤消退应答。
[0983] 实施例22:以2.5mg/kg静脉内Q14D,或以5mg/kg静脉内Q14D给药的抗CDH6 ADC在患者来源的肾癌原代肿瘤异种移植小鼠模型中的体内效力
[0984] 在肾原代肿瘤异种移植(PTX)模型中评估了抗CDH6 ADC(要么以5mg/kg Q14D要么以2.5mg/kg Q14D定量给药的NOV0712-磺基-SPDB-DM4)的抗肿瘤活性。通过以皮下方式把
原发性人肿瘤组织直接植入到nu/nu裸小鼠中，建立了人原代异种移植模型。在用于本研究
中之前，把所产生的异种移植物连续地传代4至10次。使用12号的套针，以皮下方式给裸小
鼠的腋区中植入3x 3x 3mm肿瘤碎块。在肿瘤碎块植入以后的第20天，把动物随机分配到治
疗组中，此时平均肿瘤体积是195mm3(范围115-282mm3)。在第20天启动治疗。在肿瘤细胞植
入后第53天，即启动治疗后33天、最后一天，测定了抗肿瘤活性，此时所有的动物保持在研
究状态时。包括非靶向的ADC作为对照，用于确定CDH6特异性的抗肿瘤活性。没有一只小鼠
显示体重减少,这指示ADC被很好地耐受(没有显示数据)。如同卵巢癌模型的情况一样，通
过IHC，在具有大于20％CDH6阳性的肿瘤区域的特征的肾PTX模型中观察了抗CDH6 ADC的效
力。正如在图21中显示的那样,在肾PTX模型中，抗CDH6 ADC治疗对原发性人肿瘤是有效的。
[0985] 实施例23:以2.5mg/kg静脉内Q14D,或以5mg/kg静脉内Q14D给药的抗CDH6 ADC在来源于患者的肾癌原代肿瘤异种移植小鼠模型中的体内效力
[0986] 在肾原代肿瘤异种移植(PTX)模型中评估了抗CDH6 ADC(NOV0712-磺基-SPDB-DM4)的抗肿瘤活性。通过以皮下方式把原发性人肿瘤组织直接植入到nu/nu小鼠中，建立了
人原代异种移植模型。在用在本研究中之前，使所产生的异种移植连续地传代4至10次。使
用12号的套针，以皮下方式给雌性裸小鼠的腋区中植入3x 3x 3mm肿瘤碎块。在肿瘤碎块植
入以后的第14天，把动物随机分配到治疗组中，此时平均肿瘤体积是160mm3(范围113-
245mm3)。在第14天启动治疗。在肿瘤细胞植入后的第50天，测定了抗肿瘤活性。没有一只小鼠显示体重减少,这指示ADC被很好地耐受(没有显示数据)。如同卵巢癌模型的情况一样，
通过IHC，在具有大于20％CDH6阳性的肿瘤区域的特征的肾PTX模型中观察了抗CDH6 ADC的
效力。如图22中所示,在肾PTX模型中，抗CDH6 ADC治疗对原发性人肿瘤是有效的。
[0987] 实施例24:以2.5mg/kgQ14D，或以5mg/kgQ14D给药的抗CDH6 ADC在来源于患者的肾癌原代肿瘤异种移植小鼠模型中的体内效力
[0988] 在肾原代肿瘤异种移植(PTX)模型中评估了抗CDH6 ADC(NOV0712-磺基-SPDB-DM4)的抗肿瘤活性。通过以皮下方式把原发性人肿瘤组织直接植入到nu/nu裸小鼠中，建立
了人原代异种移植模型。在用在本研究中之前，使所产生的异种移植物连续地传代4至10
次。使用12号的套针，以皮下方式给雌性裸小鼠的腋区中植入3x 3x 3mm肿瘤碎块。在肿瘤
3
碎块植入以后的第19天，把动物随机分配到治疗组中，此时平均肿瘤体积是176mm (范围
123-267mm3)。在第19天启动治疗。在肿瘤细胞植入后的第49天，测定了抗肿瘤活性。没有一只小鼠显示体重减少,这指示ADC被很好地耐受(没有显示数据)。如同卵巢癌模型的情况一
样，根据IHC，在具有大于20％CDH6阳性的肿瘤区域的特征的肾PTX模型中观察了抗CDH6 
ADC的效力。如图23中所示,在肾PTX模型中，以5mg/kg和2.5mg/kg剂量这两者，抗CDH6 ADC
治疗对原发性人肿瘤是有效的。
[0989] 实施例25:在组合治疗中的抗CDH6 ADC
[0990] 可以把抗CDH6 ADC与小分子抑制剂或其它抗体组合。使用Chalice软件(Zalicus,Cambridge MA)或ComboExplorer应用(Novartis,Basel CH),针对广泛地使用的关于药物
与它本身的剂量加和性的Loewe模型(Lehar等人，Nat.Biotechnol.(2009)27:659–666；
Zimmermann等人,Drug Discov.Today(2007)12:34–42)，把所述的组合的应答与它的单一
作用剂相比较。可以把与加和性比较过量的抑制绘制成充足剂量-矩阵图以显现当发生协
同作用时的药物浓度。表18显示几种抗CDH6 ADC/化合物组合。
[0991] 通过使用CellTiter 发光试验(Promega,Madison WI)测定细胞ATP含量，可以测定细胞的生存能力。在添加药物之前一天,把250-500个细胞铺板到在20μl生长培养基
中的384-孔板(Greiner,Monroe,NC)中。然后把细胞与作为单一作用剂、单一作用剂化合物
或抗CDH6 ADC/化合物组合的不同浓度的抗CDH6  ADC(表18)一起培育120h，之后把
CellTiter 试剂添加到每一个孔中并且在 板读数器(Perkin Elmer,
Waltham MA)上记录发光。使用发光值来计算相对于DMSO处理的细胞(0％抑制)，细胞生存
能力的抑制。
[0992] 表18
[0993] 抗CDH6 ADC组合
[0994]
[0995]
[0996]
[0997]
[0998] 图24是与小分子抑制剂组合的抗CDH6 ADC的实例。按照实施例12中描述的那样使SNU-8卵巢癌细胞生长并且用剂量递增的抗CDH6 ADC(NOV0712-磺基-SPDB-DM4)和Bcl2/
Bcl-Xl抑制剂(ABT-263)、Bcl-Xl抑制剂(WEHI-539)、IAP抑制剂(NVP-LCL161)或MEK抑制剂
(trametinib)来治疗。采用与Bcl2/Bcl-Xl、Bcl-Xl、MEK和IAP抑制剂组合的抗CDH6 ADC
(NOV0712-磺基-SPDB-DM4)看到有效的协同作用。把ADC的自身-自身组合例如(CDH6-ADC+
CDH6-ADC)或小分子的自身-自身组合例如(NVP-LCL161+NVP-LCL161)包括在内以区分剂量
加和性与真实的协同作用并且把这些得分报告在图24中。正如图24指示的那样,与自身-自
身组合比较，CDH6-ADC加小分子组合具有显著更高的Loewe协同作用得分的特征。
[0999] 这些数据指示:在由仅抗有丝分裂/细胞毒性的ADC有效负荷诱导的初始G2/M抑制或损伤以后，ADC与抗有丝分裂有效负荷(例如磺基-SPDB-DM4、SPDB-DM4、SMCC-DM1)或其它
有效负荷与促凋亡小分子抑制剂(例如ABT-261、ABT-199、WEHI-539或IAP抑制剂如NVP-
LCL161)或MAPK途径抑制剂(即trametinib)的组合产生细胞凋亡的更加有效的执行。
[1000] 此外,通过体内组合治疗可以进一步评估CDH6-ADC组合。CDH6-ADC可以与靶向PD/PD-L1途径的免疫调节剂例如 (pembrolizumab)或 (nivolumab)
协同作用。总之,当与其它分子组合使用时，本文中公开的抗CDH6 ADC可以发挥协同效应而
产生用于治疗的其它选项。
[1001] 实施例26:在肿瘤适应证中的CDH6表达
[1002] CDH6在包括卵巢癌、肾癌、软组织癌、中枢神经系统癌、甲状腺癌和胆管上皮癌在内的几种肿瘤适应证中被过度表达。使用Affymetrix 平台(Santa Clara,
CA)评估了CDH6 mRNA表达。具体地,使用CDH6探针组214803_at查询了包含关于人肿瘤和正
常组织样品的数据的Novartis内部的mRNA表达数据库，并且使用Tibco Spotfire(Palo 
Alto,CA)把数据绘制成图。在图上的每一个点代表单个肿瘤或正常组织样品。正如在图25
中举例说明的那样,CDH6具有受限制的正常组织表达的特征并且在卵巢癌、肾癌、中枢神经
系统癌、软组织癌和甲状腺癌以及胆管上皮癌中被显著地过表达。
[1003] 通过免疫组织化学，使用在实施例21中描述的实验规程，在人原发肿瘤样品集合中进一步评估了CDH6表达。如图26中所示,在大多数卵巢癌和肾癌样品中观察到CDH6蛋白
表达。还经常在子宫内膜癌以及胆管上皮癌中检测到CDH6表达。有趣地,在胆管上皮癌之内
的CDH6表达在肝内亚型中被强化了。
[1004] 应该理解，本文中描述的实施例和方面仅仅用于举例说明的目的，并且根据其的多种修饰或变化将会被提示给本领域技术人员并且被包括在本申请的精神和范围以及所
附的权利要求的保护范围之内。
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