用分光光度计测定糖化酶活力的方法
阅读：3发布：2020-05-22
专利汇可以提供用分光光度计测定糖化酶活力的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用分光光度计测定 糖化 酶活 力 的方法，属于 生物 化学分析领域。用分光光度计来测量由糖化酶 水 解 淀粉 产生的 葡萄糖 与3，5-二硝基水杨酸反应对 波长 为520nm光的吸收，来确定糖化酶酶活。该方法包括梯度样品的制作、梯度样品吸光度的测定、待测糖化液的制备、空白液制备、酶活力的测定。此方法简单，快速，灵敏度高，准确及时地指导糖化酶工业化生产。，下面是用分光光度计测定糖化酶活力的方法专利的具体信息内容。
1.一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于它是按以下步骤进行的： (1)梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应； (2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程； (3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应； (4)空白液制备：于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却； (5)酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取0.05～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比色，记录吸光度； (6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。
2.根据权利要求l所述的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在 于：所用的3， 5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：(1) 甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL10。/。氢氧化钠中，并稀释至69mL， 在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；(2) 乙液：称取255 g酒石酸钠，加到300 mL 10%氢氧化钠中，再加入 880mLl%3， 5-二硝基水杨酸溶液；(3) 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下， 放置7〜10天以后使用。
第1/13页
技术领域
背景技术
葡萄糖淀粉酶(GlucoamylaseEC3. 2. 1. 3)又称y-淀粉酶，简称糖化酶。主 要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中，同时也存在于人的唾液、 动物胰腺及细菌中。已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种，细菌有3属 3种，用于工业生产的菌株主要是黑曲霉。糖化酶是一种外切型糖苷酶，从淀粉 的非还原性末端依次水解a-l， 4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像P-淀粉酶 一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成p-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当 遇到分支点时，它也可以水解a-l， 6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄 糖.糖化酶也能微弱水解a-l， 3连接的碳链，它一般都能将淀粉百分之百地水 解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、 甘油、淀粉糖等工业中，是我国产量最大的酶制剂产品之一。但是，测定糖化 酶活性的条件各不相同，我国大多采用终浓度1-1.6%可溶性淀粉为底物，加入酶 液后于pH4.5-4.8， 40-50'C反应一定时间，用次碘酸盐法测定还原糖含量，以每 小时生成lmg葡萄糖所需的酶量，称为一个单位。美国Miles公司糖化酶 DIAZYME采用4。/。淀粉为底物于pH值4.2， 60'C反应lh用Schoorl法测定所生成葡 萄糖的量，以lh生成lg还原糖作为l个单位（DU)。日本常用SP单位表示糖化酶 活性，使用1.1%可溶性淀粉为底物，于pH4.8，55t:反应lh,用Lane-Eynon法定量 还原糖，以每小时生成10mg葡萄糖所需酶量为l个单位。所有这些检测方法不仅 速度慢，而且操作繁琐，对生产糖化酶过程中的在线测量十分不利，不能及时 地指导生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有测定糖化酶活性方法中存在的测量速度慢，操 作繁琐的缺点，提供一种测量速度快，操作方便的用分光光度计测定糖化酶活 力的方法。本发明目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，它是按以下步骤进行的：(O梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020~0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20~30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0~2mL的蒸馏水后摇匀4(TC水浴预热5-10min; 5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入不同稀释倍数的糖化酶溶液，开始计时，反应25〜35min， 分别向每个比色管中添加0.2~0.5mL质量浓度为20~25%的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤（1)得到的反应液稀释20倍，取0.5~2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3， 5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3〜5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；
(3) 待测糖化液的制备：称取0.5-1.5 g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸一乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20〜30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，4(TC水浴预热5〜10min;加入待测糖化酶溶液1.5~2.5mL，开始计时，反应25〜35min，向比色管中添加0.2〜0.5mL质量浓度为20〜25。/。的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(4) 空白液制备：于比色管中加入20~30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mLpH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，4(TC水浴预热5〜10min;向比色管中添加0.2-.5质量浓度为20~25%的NaOH溶液，加入1.5~2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；
(5) 酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取005〜1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3， 5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3〜5min，在520nm处比色，记录吸光度；
(6) 测出样品吸光度后，带入步骤（2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。
所用的3， 5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：(1) 甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL10。/。氢氧化钠中，并稀释至69mL,在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；
(2) 乙液：称取255 g酒石酸钠，加到300 mL 10%氢氧化钠中，再加入880mLl%3， 5-二硝基水杨酸溶液；
(3) 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7〜10天以后使用。
本发明方法的测定原理如下： 一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。
由于3， 5-二硝基水杨酸与还原糖显色反应灵敏度高，利用分光光度计进行定量检测，可以快速测量糖化酶酶活，另外该方法操作简便，有利于工业化生产。
附图说明
图l是实施例l中的标准曲线图。图2是实施例2中的标准曲线图。图3是实施例3中的标准曲线图。具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例l
本发明方法的测定原理如下： 一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。
糖化酶水解淀粉反应如下：
(C6H10O5 )n+nH20=nC6H1206
3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖的反应如下：(p〇OH
沸水浴 ^^OH+ C6H1206 -^ I + CeH^
黄色
棕红色
在520nm处，3-氨基-5-硝基水杨酸有强吸收，以空白为0点，以确定吸光度。
1. 材料与试剂
HH-S24数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂721可见光分光光度计上海箐华科技仪器有限公司BS/BT124s分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司糖化酶（酶活132600irg") 河南瑞驰生物科技有限公司生产化学试剂：均为分析纯
2. 试剂的配制
2.1 O.lmol丄-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6):称取6.7g乙酸钠(CH3COONa*3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸馏水溶解定容至l OOOmL,上述缓冲溶液应以酸度计校正pH值。
2.2 20X氢氧化钠溶液:称取20g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100mL。
2.3 2X可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉2.00g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL,此溶液需当天配制。
注:可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。
2.4 DNS溶液的配制
(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10%氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
(2) 乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10%氢氧化钠中，再加入880毫升1°/。3, 5-二硝基水杨酸溶液。
(3) 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7〜10天以后使用。3.测定方法
(1) 梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.3g已知酶活132600irg"液体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6个50mL的比色管，分别加25mL2%的淀粉溶液，5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取2mL、 1.6mL、1.2mL、 0.8mL、 0.4mL、 OmL蒸馏水，摇匀。40。C水浴锅中恒温预热5min。依次加入OmL、 0.4mL、 0.8mL、 1.2mL、 1.6mL、 2mL稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时，反应30min。分别向每个比色管中添加0.2mL20%NaOH，迅速用水冷却，终至酶反应。
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到100mL，然后取0.5mL稀释的反应液到试管中，加入0.5mLDNS，沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，用lcm比色皿，以OmL稀释糖化酶为O.OO的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长在520nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记录吸光度，结果见表l。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图l。
表l.不同酶活力的吸光度
稀释酶液/mL 蒸馏水/mL 酶活力/Xl()4u DNS/mL 0D52O
0 0 2 0 0.5 0
1 0.4 1.6 3.586 0.5 0.107
2 0.8 1.2 7.172 0.5 0.249
1.2 0.8 10.758 0.5 0.342
4 1.6 0.4 14.34 0.5 0.449
5 2.0 0 17.93 0.5 0.535
(3) 待测酶液的制备：称取lg样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙酸鈉缓冲溶液（pH4.6)稀释定容至刻度。
吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力卩5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴预热5min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时，于4(TC水浴锅保温糖化30min，迅速加入0.2mL20n/。NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终至酶解反应。
(4) 空白液的制备：吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力B5mL
8O.lmol七"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴锅中预热5min,再保温30min，迅速加入0.2mL20。/。NaOH溶液，力卩2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。
(5) 酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲（糖化液)、乙（空白液）两试管中，各加入0.5mLDNS,共同沸水浴3min。 分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm处比色，记录吸光度。
(6) 测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。4.计算
4.1 lg酶液在40'C、 pH4.6的条件下，lh分解可溶性淀粉产生lmg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。
由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图l。得到函数式：Y=0.0309-X
式中：x—酶活力(l(^u/g)
Y—吸光度
测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。4.2加标回收
用13.2xl0Au/g标准酶液向样品中加lg标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量结果见表2。
表2糖化酶酶活回收率测量结果
样品含量10411 加标后含量10V 加标量10411 回收率
1 2.326 15.336 13.2 98.5%
2.285 15 575 13.2 100%
2.384 15.284 13.2 97.7%
4 2.214 15.274 13.2 98.9%
平均 98.775%
相对标准偏差（％) 0.957%
根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95. 0%~105. 0%范围之间内，相对标准偏差为0.957%，完全符合分析方法中的规定。3.3对照实验
取13.2xl(yWg标准酶液lg，分别用分光光度计法和碘量法进行测量糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。
表3 分光光度计法与碘量 t法实验对照
实验 分光光度计法10411 碘量法10、
i 13.187 13.232
2 13.145 13.023
3 13.243 13.221
平均 13.192 13.158
实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘 量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。
实施例2
1. 材料与试剂
HH-S24数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂 721可见光分光光度计上海箐华科技仪器有限公司 BS/BT124s分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 糖化酶（酶活132600irg") 河南瑞驰生物科技有限公司生产 化学试剂：均为分析纯
2. 试剂的配制
2.1 O.lmol.U1乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6):称取6.7g乙酸钠 (CH3COONa.3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸馏水溶解定容至l OOOmL,上述缓 冲溶液应以酸度计校正pH值。
2.2 25X氢氧化钠溶液:称取25g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至 100mL。
2.3 1.5X可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉1.50g，然后用少量蒸馏水调匀, 徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL，此溶液 需当天配制。
注:可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。
2.4 DNS溶液的配制
(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10%氢氧化钠中，并稀释至69毫 升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
(2)乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10%氢氧化钠中，再加入 880毫升1%3， 5-二硝基水杨酸溶液。
10(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下， 放置7〜10天以后使用。 3.测定方法
(1) 梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.5g已知酶活132600irg"液 体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取5个50mL的比色管，分别加20mL2% 的淀粉溶液，3mL乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取1.6mL、 1.2mL、 0.8mL、 0.4mL、 OmL、蒸馏水，摇匀。4(TC水浴锅中恒温预热10min。依次加入OmL、 0.4mL、 0.8mL、 1.2mL、 1.6mL、稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时， 反应25min。分别向每个比色管中添加0.5mL 25%NaOH，迅速用水冷却，终至 酶反应。
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到 100mL，然后取2mL稀释的反应液到试管中，加入2mLDNS，沸水浴4min。分 别向试管中加入10mL蒸馏水，用lcm比色皿，以OmL稀释糖化酶为O.OO的试剂溶 液调整分光光度计的零点，在波长在20nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记 录吸光度，结果见表4。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见 图2。
表4.不同酶活力的吸光度
稀释酶液/mL 蒸馏水/mL 酶活力/X10"411 DNS/mL
0 0 2 0 0.5 0
1 0.5 1.5 3.353 0.5 0.103
2 1.0 1.0 7.987 0.5 0.253
1.5 0.5 10.58 0.5 0.340
4 2.0 0 14.34 0.5 0.447
(3) 待测酶液的制备：称取0.5g样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙 酸鈉缓冲溶液（pH4.6)稀释定容至刻度。
吸取20mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力口3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸 钠缓冲液，于40。C水浴预热10min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时， 于4(TC水浴锅保温糖化25min，迅速加入0.5L 20。/。NaOH溶液，摇匀，迅速用水 冷却，终至酶解反应。
(4) 空白液的制备：吸取20mll.5。/。的淀粉溶液 置入50mL比色管中，加3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴锅中预热5min，再保温30min， 迅速加入0.5L20。/。NaOH溶液，加2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。
(5) 酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定 容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后 分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲（糖化液）、乙（空白液）两试管中，各 加入0.5mLDNS，共同沸水浴3min。 分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm 处比色，记录吸光度。
(6) 测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。 4.计算
4.1 lg酶液在4(TC、 pH4.6的条件下，lh分解可溶性淀粉产生lmg葡萄糖的酶 量为一个酶活力单位。
由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图2。得到函数式：Y-0.0309-X
式中：X—酶活力(10Vg)
Y—吸光度
测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。 4.2加标回收
用13.2xl(Ai/g标准酶液向样品中加lg标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量 结果见表2。
表5糖化酶酶活回收率测量结果
样品含量10、 加标后含量10411 加标量10411 回收率
1 2.305 15.352 13.2 98.8%
2 2.196 15.472 13.2 100.5%
3 2.296 15.398 13.2 99.3%
4 2.312 15.403 13.2 99.2%
平均 99.5%
相对标准偏差（％) 0.733%
根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95. 0% 〜105. 0%范围之间内，相对标准偏差为0.733%，完全符合分析方法中的规定。 3.3对照实验
取13.2xl0Au/g标准酶液lg，分别用分光光度计法和碘量法进行观懂糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。
表6分光光度计法与碘量法实验对照
table see original document page 13实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘 量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。table see original document page 16
本发明的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，它是按以下步骤进行的：(O梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020~0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20~30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0~2mL的蒸馏水后摇匀4(TC水浴预热5-10min; 5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入不同稀释倍数的糖化酶溶液，开始计时，反应25〜35min， 分别向每个比色管中添加0.2~0.5mL质量浓度为20~25%的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤（1)得到的反应液稀释20倍，取0.5~2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3， 5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3〜5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；
(3) 待测糖化液的制备：称取0.5-1.5 g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸一乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20〜30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，4(TC水浴预热5〜10min;加入待测糖化酶溶液1.5~2.5mL，开始计时，反应25〜35min，向比色管中添加0.2〜0.5mL质量浓度为20〜25。/。的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；
(4) 空白液制备：于比色管中加入20~30mL质量浓度为1.5~2.5%的淀粉溶液和3〜8mLpH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，4(TC水浴预热5〜10min;向比色管中添加0.2-.5质量浓度为20~25%的NaOH溶液，加入1.5~2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；
(5) 酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取005〜1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3， 5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3〜5min，在520nm处比色，记录吸光度；
(6) 测出样品吸光度后，带入步骤（2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。
所用的3， 5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：(1) 甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL10。/。氢氧化钠中，并稀释至69mL,在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；
(2) 乙液：称取255 g酒石酸钠，加到300 mL 10%氢氧化钠中，再加入880mLl%3， 5-二硝基水杨酸溶液；
(3) 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7〜10天以后使用。
本发明方法的测定原理如下： 一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。
由于3， 5-二硝基水杨酸与还原糖显色反应灵敏度高，利用分光光度计进行定量检测，可以快速测量糖化酶酶活，另外该方法操作简便，有利于工业化生产。
附图说明
图l是实施例l中的标准曲线图。图2是实施例2中的标准曲线图。图3是实施例3中的标准曲线图。具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例l
本发明方法的测定原理如下： 一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。
糖化酶水解淀粉反应如下：
(C6H10O5 )n+nH20=nC6H1206
3， 5-二硝基水杨酸（DNS)与还原糖的反应如下：(p〇OH
沸水浴 ^^OH+ C6H1206 -^ I + CeH^
黄色
棕红色
在520nm处，3-氨基-5-硝基水杨酸有强吸收，以空白为0点，以确定吸光度。
1. 材料与试剂
HH-S24数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂721可见光分光光度计上海箐华科技仪器有限公司BS/BT124s分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司糖化酶（酶活132600irg") 河南瑞驰生物科技有限公司生产化学试剂：均为分析纯
2. 试剂的配制
2.1 O.lmol丄-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6):称取6.7g乙酸钠(CH3COONa*3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸馏水溶解定容至l OOOmL,上述缓冲溶液应以酸度计校正pH值。
2.2 20X氢氧化钠溶液:称取20g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100mL。
2.3 2X可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉2.00g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL,此溶液需当天配制。
注:可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。
2.4 DNS溶液的配制
(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10%氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
(2) 乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10%氢氧化钠中，再加入880毫升1°/。3, 5-二硝基水杨酸溶液。
(3) 将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7〜10天以后使用。3.测定方法
(1) 梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.3g已知酶活132600irg"液体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6个50mL的比色管，分别加25mL2%的淀粉溶液，5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取2mL、 1.6mL、1.2mL、 0.8mL、 0.4mL、 OmL蒸馏水，摇匀。40。C水浴锅中恒温预热5min。依次加入OmL、 0.4mL、 0.8mL、 1.2mL、 1.6mL、 2mL稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时，反应30min。分别向每个比色管中添加0.2mL20%NaOH，迅速用水冷却，终至酶反应。
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到100mL，然后取0.5mL稀释的反应液到试管中，加入0.5mLDNS，沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，用lcm比色皿，以OmL稀释糖化酶为O.OO的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长在520nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记录吸光度，结果见表l。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图l。
表l.不同酶活力的吸光度
稀释酶液/mL 蒸馏水/mL 酶活力/Xl()4u DNS/mL 0D52O
0 0 2 0 0.5 0
1 0.4 1.6 3.586 0.5 0.107
2 0.8 1.2 7.172 0.5 0.249
1.2 0.8 10.758 0.5 0.342
4 1.6 0.4 14.34 0.5 0.449
5 2.0 0 17.93 0.5 0.535
(3) 待测酶液的制备：称取lg样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙酸鈉缓冲溶液（pH4.6)稀释定容至刻度。
吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力卩5mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴预热5min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时，于4(TC水浴锅保温糖化30min，迅速加入0.2mL20n/。NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终至酶解反应。
(4) 空白液的制备：吸取25mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力B5mL
8O.lmol七"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴锅中预热5min,再保温30min，迅速加入0.2mL20。/。NaOH溶液，力卩2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。
(5) 酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲（糖化液)、乙（空白液）两试管中，各加入0.5mLDNS,共同沸水浴3min。 分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm处比色，记录吸光度。
(6) 测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。4.计算
4.1 lg酶液在40'C、 pH4.6的条件下，lh分解可溶性淀粉产生lmg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。
由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图l。得到函数式：Y=0.0309-X
式中：x—酶活力(l(^u/g)
Y—吸光度
测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。4.2加标回收
用13.2xl0Au/g标准酶液向样品中加lg标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量结果见表2。
表2糖化酶酶活回收率测量结果
样品含量10411 加标后含量10V 加标量10411 回收率
1 2.326 15.336 13.2 98.5%
2.285 15 575 13.2 100%
2.384 15.284 13.2 97.7%
4 2.214 15.274 13.2 98.9%
平均 98.775%
相对标准偏差（％) 0.957%
根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95. 0%~105. 0%范围之间内，相对标准偏差为0.957%，完全符合分析方法中的规定。3.3对照实验
取13.2xl(yWg标准酶液lg，分别用分光光度计法和碘量法进行测量糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。
表3 分光光度计法与碘量 t法实验对照
实验 分光光度计法10411 碘量法10、
i 13.187 13.232
2 13.145 13.023
3 13.243 13.221
平均 13.192 13.158
实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘 量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。
实施例2
1. 材料与试剂
HH-S24数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂 721可见光分光光度计上海箐华科技仪器有限公司 BS/BT124s分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 糖化酶（酶活132600irg") 河南瑞驰生物科技有限公司生产 化学试剂：均为分析纯
2. 试剂的配制
2.1 O.lmol.U1乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6):称取6.7g乙酸钠 (CH3COONa.3H20)，吸取冰乙酸2.6mL,用蒸馏水溶解定容至l OOOmL,上述缓 冲溶液应以酸度计校正pH值。
2.2 25X氢氧化钠溶液:称取25g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至 100mL。
2.3 1.5X可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉1.50g，然后用少量蒸馏水调匀, 徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL，此溶液 需当天配制。
注:可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。
2.4 DNS溶液的配制
(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10%氢氧化钠中，并稀释至69毫 升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。
(2)乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10%氢氧化钠中，再加入 880毫升1%3， 5-二硝基水杨酸溶液。
10(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下， 放置7〜10天以后使用。 3.测定方法
(1) 梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.5g已知酶活132600irg"液 体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取5个50mL的比色管，分别加20mL2% 的淀粉溶液，3mL乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取1.6mL、 1.2mL、 0.8mL、 0.4mL、 OmL、蒸馏水，摇匀。4(TC水浴锅中恒温预热10min。依次加入OmL、 0.4mL、 0.8mL、 1.2mL、 1.6mL、稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时， 反应25min。分别向每个比色管中添加0.5mL 25%NaOH，迅速用水冷却，终至 酶反应。
(2) 梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到 100mL，然后取2mL稀释的反应液到试管中，加入2mLDNS，沸水浴4min。分 别向试管中加入10mL蒸馏水，用lcm比色皿，以OmL稀释糖化酶为O.OO的试剂溶 液调整分光光度计的零点，在波长在20nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记 录吸光度，结果见表4。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见 图2。
表4.不同酶活力的吸光度
稀释酶液/mL 蒸馏水/mL 酶活力/X10"411 DNS/mL
0 0 2 0 0.5 0
1 0.5 1.5 3.353 0.5 0.103
2 1.0 1.0 7.987 0.5 0.253
1.5 0.5 10.58 0.5 0.340
4 2.0 0 14.34 0.5 0.447
(3) 待测酶液的制备：称取0.5g样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸一乙 酸鈉缓冲溶液（pH4.6)稀释定容至刻度。
吸取20mL2。/。的淀粉溶液，置入50mL比色管中，力口3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸 钠缓冲液，于40。C水浴预热10min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时， 于4(TC水浴锅保温糖化25min，迅速加入0.5L 20。/。NaOH溶液，摇匀，迅速用水 冷却，终至酶解反应。
(4) 空白液的制备：吸取20mll.5。/。的淀粉溶液 置入50mL比色管中，加3mL0.1mol丄"乙酸-乙酸钠缓冲液，于4(TC水浴锅中预热5min，再保温30min， 迅速加入0.5L20。/。NaOH溶液，加2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。
(5) 酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定 容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后 分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲（糖化液）、乙（空白液）两试管中，各 加入0.5mLDNS，共同沸水浴3min。 分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm 处比色，记录吸光度。
(6) 测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。 4.计算
4.1 lg酶液在4(TC、 pH4.6的条件下，lh分解可溶性淀粉产生lmg葡萄糖的酶 量为一个酶活力单位。
由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图2。得到函数式：Y-0.0309-X
式中：X—酶活力(10Vg)
Y—吸光度
测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。 4.2加标回收
用13.2xl(Ai/g标准酶液向样品中加lg标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量 结果见表2。
表5糖化酶酶活回收率测量结果
样品含量10、 加标后含量10411 加标量10411 回收率
1 2.305 15.352 13.2 98.8%
2 2.196 15.472 13.2 100.5%
3 2.296 15.398 13.2 99.3%
4 2.312 15.403 13.2 99.2%
平均 99.5%
相对标准偏差（％) 0.733%
根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95. 0% 〜105. 0%范围之间内，相对标准偏差为0.733%，完全符合分析方法中的规定。 3.3对照实验
取13.2xl0Au/g标准酶液lg，分别用分光光度计法和碘量法进行观懂糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。
表6分光光度计法与碘量法实验对照
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种质美味鲜无公害鲫鱼的养殖方法 | 2021-10-16 | 4 |
| 基于个性化人眼模型的角膜接触镜的设计 | 2020-11-16 | 3 |
| 重氢化(甲基)丙烯酸降冰片基酯、其制备方法、其聚合物以及光学元件 | 2021-05-14 | 2 |
| 多种水处理特性指示剂的同时监测方法 | 2021-07-04 | 1 |
| 肠道及口腔菌群多样性及差异性的分析方法 | 2021-12-09 | 2 |
| 用分光光度计测定糖化酶活力的方法 | 2020-05-22 | 3 |
| 基于核酸适体荧光探针AFP5的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | 2020-09-27 | 4 |
| 化学需氧量检测方法 | 2020-05-26 | 5 |
| 可调屈光度调试眼 | 2021-02-12 | 0 |
| 小孔防疲劳护目镜 | 2021-04-09 | 5 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
光度学热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈