用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法
阅读：359发布：2023-01-21
专利汇可以提供用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 大体上涉及具有独特核糖体翻译谱，即翻译活性的 哺乳动物 细胞亚群。本发明进一步涉及用于鉴定和分离这些细胞的方法、包含这些细胞的 试剂 盒 ，或利用这些哺乳动物细胞亚群的不同翻译活性的方法。，下面是用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法，其中所述方法包括：
用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，用包含以下的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因；
测定相比于参照标准所表达的由所述报告基因编码的报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中所述报告蛋白的水平，以鉴定所述哺乳动物细胞亚组是否表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型；
如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从所述哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；
使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；和
任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群，且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，且其中所述方法不是治疗或诊断方法。
2.一种用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质是否对哺乳动物细胞有毒性的方法，所述方法包括：
用包含以下的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞以形成稳定转化的细胞：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因；
用至少一种毒素处理稳定转化的哺乳动物细胞的亚组以形成毒素处理细胞；
测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定所述稳定转化的哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；
如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从所述稳定转化的哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；
使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；
任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群；
使所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和
所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触后，检测所述报告蛋白的存在或测定所述报告蛋白的水平，其中与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质的毒性和哺乳动物细胞翻译对所述物质的抗性和所述报告蛋白的存在或所述报告蛋白的水平增加相关，并且与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质毒性的缺乏和哺乳动物细胞翻译对所述物质抗性的缺乏和不存在所述报告蛋白或所述报告蛋白的水平降低相关，
且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在mRNA翻译活性处于它的峰值时测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞后至少6小时时测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞后6小时到30小时的时间点测定所述哺乳动物细胞亚群中所述报告蛋白的水平。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是I类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平至多500％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是II类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的500％以上且不超过1,400％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是III类细胞，其特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的1,400％以上且不超过75,000％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中用至少两种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中用至少三种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
11.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中用至少五种毒素的组合来处理所述哺乳动物细胞。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少两种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少三种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少五种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
15.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞。
16.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌干细胞。
17.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人原代细胞或鼠原代细胞。
18.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由HEK293、HT1080、NTERA-2D、HeLa、Caco2、HepG2、HCT116、MDA231、U2OS、DU145、LNCaP、LoVo、MiaPaCa2、AsPC1、MCF-7、PC3、Capan-2、COLO201、COLO205、H4、HuTu80和SK-N-MC组成的组。
19.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞mES。
21.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述报告基因选自由EGFP、GFP、EYFP、荧火虫荧光素酶、Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、LacZ、CAT、TK和TKsr39组成的组。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
23.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQ ID NO:1、即小鼠plp TR，SEQ ID NO:2、即小鼠dm TR，SEQ ID NO:3、即人plp TR，和SEQ ID NO:4、即人dm TR组成的组。
25.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述测定包括微量酶标仪分析、荧光显微镜技术、免疫组织化学、ELISA、发光计、FACS或分光光度计。
26.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群的分离包括通过亚克隆的单集落分离。
27.一种哺乳动物细胞亚群，其通过根据权利要求1或权利要求3-26引用权利要求1时任一项所述的方法所获得，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞。
28.一种I类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求6或9-26引用权利要求1时任一项所述的方法所获得，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，其中I类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平至多500％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
29.一种II类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求7或9-26引用权利要求1时任一项所述的方法所获得，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，其中II类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的500％以上且不超过
1,400％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
30.一种III类哺乳动物细胞，其通过根据权利要求8-26引用权利要求1时任一项所述的方法所获得，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，其中III类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的1,400％以上且不超过
75,000％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
31.一种适用于毒性试验的试剂盒，其包含通过根据权利要求1或权利要求3-26引用权利要求1时任一项所述的方法所获得的I类、II类或III类哺乳动物细胞或其细胞裂解物；和所述试剂盒的使用说明书，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，且其中I类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平至多500％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞；
II类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的500％以上且不超过1,400％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞；以及
III类哺乳动物细胞的特征在于所述报告蛋白的水平大于所述参照标准中所述报告蛋白水平的1,400％以上且不超过75,000％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其包含所述I类哺乳动物细胞。
33.根据权利要求31所述的试剂盒，其包含所述II类哺乳动物细胞。
34.根据权利要求31所述的试剂盒，其包含所述III类哺乳动物细胞。
35.一种用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法，其中所述方法包括：
用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，用包含以下的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因；
测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的所述毒素处理细胞中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定所述哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；
如果所述哺乳动物细胞的所述毒素处理细胞表现所述所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从所述哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；
使所述细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；
任选地，用所述至少一种毒素处理所述哺乳动物细胞亚群，并重复所述测定、分离和生长步骤直到鉴定出所述所需的哺乳动物细胞亚群；
使所述所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和
测定相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白的表达与所述物质接触后由所述所需的哺乳动物细胞亚群所产生的所述报告蛋白的表达，其中由所述物质处理细胞所产生的所述报告蛋白的表达相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的减少表明所述物质抑制蛋白质翻译，
且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
36.一种用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法，其中所述方法包括：
使根据权利要求28-30中任一项所述的哺乳动物细胞与所述物质接触；和
测定相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白的表达的与所述物质接触后由所述哺乳动物细胞所产生的所述报告蛋白的表达，其中由所述物质处理细胞所产生的所述报告蛋白的表达相比于未曾用所述物质处理的所述细胞所产生的所述报告蛋白表达的减少表明所述物质抑制蛋白质翻译，且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中用包含以下项的核酸表达盒稳定转化的所述哺乳动物细胞被用来测定所述物质抑制非帽依赖性翻译的能力：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码单个报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因。
38.一种用来产生目标多肽的哺乳动物细胞，其中所述细胞通过下述获得：
向根据权利要求30所述的III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，所述表达盒包含以下：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因。
39.一种用于重组表达目标多肽的方法，所述方法包括：
向根据权利要求30所述的III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，所述表达盒包含以下：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译；
使表达所述第二核酸表达盒的所述哺乳动物细胞在允许表达所述目标多肽的条件下生长；和
纯化所述目标多肽，
其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第二核酸表达盒被瞬时转化。
41.根据权利要求39所述的方法，其中用哺乳动物病毒载体瞬时转化或感染所述第二核酸表达盒。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述第二核酸表达盒被稳定转化。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
44.根据权利要求39或43所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQ ID NO:1、即小鼠plp TR，SEQ ID NO:2、即小鼠dm TR，SEQ ID NO:3、即人plp TR，和SEQ ID NO:4、即人dm TR组成的组。
45.根据权利要求39或41所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括将所述III类哺乳动物细胞暴露于至少一种毒素。
46.根据权利要求39或41所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括将所述III类哺乳动物细胞暴露于至少两种毒素的组合。
47.根据权利要求39或41所述的方法，其中使所述哺乳动物细胞生长的所述步骤包括在至少五种毒素的组合的存在下培养所述III类哺乳动物细胞。
48.根据权利要求39或41所述的方法，其中所述毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
49.根据权利要求46所述的方法，其中所述至少两种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述至少五种毒素的组合选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、秋水仙碱、硼替佐米、和美新和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
51.根据权利要求40和43中任一项所述的方法，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
52.一种用于鉴定在非帽依赖性翻译的调节中所涉及的蛋白质的方法，所述方法包括：
用至少一种毒素处理哺乳动物细胞以形成毒素处理细胞，用包含以下项的核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因；
从所述毒素处理细胞制备细胞裂解物；
分离编码所述TR元件和可操作地连接到所述TR元件的所述核苷酸序列的mRNA；
使所述mRNA和来自所述细胞裂解物的蛋白质接触以形成与所述mRNA结合的蛋白质；和鉴定与所述mRNA结合的所述蛋白质，
且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求8所述的方法鉴定的细胞。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求9所述的方法鉴定的细胞。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是通过根据权利要求10所述的方法鉴定的细胞。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述鉴定蛋白质的方法包括South Western免疫印迹、Western免疫印迹、蛋白质提取、抗体超迁移试验或微质谱测序。
57.一种用于恢复所需哺乳动物细胞亚群的表型的方法，其中所述方法包括：
培养所述哺乳动物细胞的至少一个亚组以形成培养细胞，其中用核酸表达盒稳定转化所述哺乳动物细胞，该表达盒包含选择标记的核苷酸序列和以下：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到所述TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从所述TR元件翻译，其中所述TR元件源自哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)或DM20基因；
用所述选择标记对其提供抗性的物质处理所述培养细胞，使得不再含有所述核酸表达盒的所述培养细胞死亡；
使所述处理细胞生长以形成哺乳动物细胞亚群；和
任选地重复所述培养、处理和生长步骤，直到恢复所述所需哺乳动物细胞亚群的所述表型，
且所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
58.一种用于验证I类、II类或III类哺乳动物细胞保留它们的表型的方法，所述方法包括：
用至少一种毒素处理根据权利要求27-30中任一项所述的哺乳动物细胞的亚组；
测定相比于参照标准所表达的所述报告蛋白水平的所述哺乳动物细胞亚组中由所述报告基因编码的报告蛋白的水平；
验证所述哺乳动物细胞保留它们的表型，其中所述I类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达至多500％，所述II类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达的500％以上到1400％，并且所述III类细胞的特征在于所述报告蛋白的表达大于未曾用所述毒素处理的所述哺乳动物细胞中所述报告蛋白表达的1400％以上到75000％，其中所述哺乳动物细胞不是人胚胎干细胞，并且所述方法不是治疗或诊断方法。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述选择标记选自由新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、潮霉素B、灭瘟素和G418组成的组。
60.根据权利要求57和59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是I类细胞，其特征在于所述报告基因所编码的报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平至多500％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
61.根据权利要求57和59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是II类细胞，其特征在于所述报告基因所编码的报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平的500％以上且不超过1,400％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
62.根据权利要求57和59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞亚群是III类细胞，其特征在于所述报告基因所编码的报告蛋白的水平大于参照标准中所述报告蛋白水平的1,400％且不超过75000％，所述参照标准是用所述核酸表达盒稳定转化而未用所述至少一种毒素处理的哺乳动物细胞。
63.根据权利要求57或59中所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞。
64.根据权利要求57或59中所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌干细胞。
65.根据权利要求57或59中所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人原代细胞或鼠原代细胞。
66.根据权利要求57或59中所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由HEK293、HT1080、NTERA-2D、HeLa、Caco2、HepG2、HCT116、MDA231、U2OS、DU145、LNCaP、LoVo、MiaPaCa2、AsPC1、MCF-7、PC3、Capan-2、COLO201、COLO205、H4、HuTu80和SK-N-MC组成的组。
67.根据权利要求57或59中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞mES。
69.根据权利要求57或59中任一项所述的方法，其中所述报告基因选自由EGFP、GFP、EYFP、荧火虫荧光素酶、Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、LacZ、CAT、TK和TKsr39组成的组。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述报告基因是荧火虫荧光素酶。
71.根据权利要求57、59中任一项所述的方法，其中所述TR元件是鼠源的或人源的。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述TR元件选自由SEQ ID NO:1、即小鼠plp TR，SEQ ID NO:2、即小鼠dm TR，SEQ ID NO:3、即人plp TR，和SEQ ID NO:4、即人dm TR组成的组。
73.根据权利要求29或30所述的II类或III类哺乳动物细胞的细胞裂解物的用途，其用于药物筛选、突变与检测分析、蛋白质间相互作用、配体结合区测定、确认或竞争试验、蛋白质结构分析、用于蛋白质-DNA相互作用的电泳迁移率变动试验(EMSA)、DNA足迹与蛋白质交联研究、蛋白质-RNA结合试验、翻译后修饰测试、克隆基因产物的验证或表征，或蛋白质二聚化试验中，并且所述用途不是治疗或诊断用途。
74.权利要求73的用途，其中所述药物筛选用于影响翻译速率的药物，突变与检测分析是酶动力学、和/或所述蛋白质间相互作用是使用GST融合蛋白或是蛋白质复合体的免疫沉淀。
用于鉴定具有独特核糖体翻译谱的哺乳动物细胞亚群的方法
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 生物体中的正常生物活性结合了构成个体基因组的基因响应于外界的内源性表达。在高级真核生物中，基因表达开始于细胞核中，其中基因组DNA转录为pre-mRNA或“初级”RNA转录物。而仍在细胞核中，pre-mRNA被修饰为包括5'帽结构，形成异核核糖核蛋白(hnRNP)复合体，获得3'多聚腺苷酸尾，并经历剪接以去除间插RNA序列(例如内含子)。成熟mRNA接着输出到细胞质，在那里蛋白质复合体指导(1)经由5'帽结构与核糖体的缔合，称为帽依赖性翻译，或(2)与促进mRNA储存、加工或降解的胞浆RNA结合蛋白的相互作用。在核糖体驱使的翻译之后，3'-多聚腺苷酸尾的连续缩短导致mRNA体转运至核糖核酸酶(RNAse)的复合体(称为外来体)，其降解老化的mRNA并有效地终止蛋白质合成。
[0004] 如所预期的，基因表达是必定在特定时间、以特定速率和数量产生所需基因产物(通常是多肽)的高度调节过程。除转录调节之外，转录后过程诸如mRNA衰变和翻译也是基因表达中的关键检查点。不足为奇的是，由基因突变或对外部刺激的异常反应所产生的细胞表达谱的改变会引起严重异常，该严重异常常常导致急性细胞死亡或慢性疾病表型的表现。
[0005] 由环境因素(诸如营养水平改变、细胞因子、激素和温度变动)以及环境应激(如低氧、低钙血、病毒感染和组织损伤)所引起的广泛或长时间的细胞刺激导致帽依赖性翻译的快速衰减。此过程是自适应性的，因为它缩减了立即应激反应和恢复所不需要的全蛋白质合成。然而，此翻译减弱并不完全消除核糖体活性，因为应激反应和恢复基因的许多产物继续由称为非帽依赖性翻译的替代过程来合成(评述于Guhaniyogi&Brewer,2001,Gene 265(1-2):11-23)。
[0006] 非帽依赖性翻译通过将核糖体直接募集到称为内部核糖体进入位点(IRES)的特异性RNA结构而发生。IRES元件已经在许多真核生物mRNA中得到鉴定(Bonnal S等,(2003)Nucleic Acids Res.31:427-428)，并确保在“帽依赖性”翻译起始受到抑制时(即，凋亡、饥饿、γ辐射、低氧、有丝分裂或终末分化)在细胞核失活或急性细胞应激期间蛋白质或其片段的高效表达。
[0007] 忽视对5'mRNA帽结构的需要最初被描述为不考虑感染细胞中细胞帽依赖性翻译的几乎完全抑制而翻译病毒RNA的机制(Jang等,1988,J.Virol.,62:2636-43)。一般来说，IRES序列无法由序列同源性鉴定，并且使用功能性试验验证了充分表征的IRES元件(Mountford和Smith,1995,TIG,11(5):179-184；Baird等,2006,NAR,12(10):1755-85)。当前证据显示，IRES RNA的构象和辅助蛋白与特异性mRNA序列的结合使核糖体能够结合。在真核细胞中，IRES指导的翻译常常与含有特别长的热力学稳定的RNA二级结构的mRNA的5'非翻译区(5'UTR)相关联，所述二级结构具有多个短开放阅读框(ORF)，其显著抑制核糖体依赖性翻译的起始。然而，对于许多这些5'UTR IRES元件的IRES活性的功能验证因存在克隆自重叠5'基因启动子的转录效应子序列而复杂化。在IRES报告载体中采用这些5'UTR元件的尝试因这一剩余本底转录活性而复杂化，所述剩余本底转录活性掩盖了由这些序列产生的任何翻译调节。因此，非帽依赖性翻译和它的调节仍然是未研究的领域，大体上利用翻译作为读出工具的系统也如此。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明的一个目的在于提供用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群并重复所述测定、分离和生长步骤，直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质对哺乳动物细胞是否有毒性的方法。所述方法包括用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化哺乳动物细胞以形成稳定转化的细胞：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用至少一种毒素处理稳定转化的哺乳动物细胞的亚组以形成毒素处理细胞；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定稳定转化的哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型；如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从稳定转化的哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物；使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群；任选地用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群并重复所述测定、分离和生长步骤，直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群；使所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触；和所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触后，检测所述报告蛋白的存在或测定报告蛋白的水平，其中与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，所述物质的毒性和哺乳动物细胞翻译对物质的抗性和报告蛋白的存在或报告蛋白的水平增加相关，并且与未暴露于所述物质的对照哺乳动物细胞相比，物质毒性的缺乏和哺乳动物细胞翻译对物质抗性的缺乏和不存在报告蛋白或报告蛋白水平降低相关。
[0011] 本发明的又一目的在于提供利用本发明的方法获得的具有独特核糖体谱的哺乳动物细胞亚群。与此相关，本发明进一步提供如本文中所定义的I类、II类和III类哺乳动物细胞。
[0013] 本发明的另一目的在于提供用于重组表达目标多肽的方法。所述方法包括向III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，该表达盒包含以下任一项：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；使表达第二核酸表达盒的哺乳动物细胞在允许表达目标多肽的条件下生长；和纯化目标多肽。
[0014] 本发明还涉及用来产生目标多肽的哺乳动物细胞，目标多肽是通过包括以下步骤的方法获得：向III类哺乳动物细胞中引入第二核酸表达盒，该表达盒包含以下任一项：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；和使表达第二核酸表达盒的哺乳动物细胞在允许表达目标多肽的条件下生长。
[0015] 本发明的又一目的是提供用于鉴定参与非帽依赖性翻译的调节的蛋白质的方法。所述方法包括用至少一种毒素处理哺乳动物细胞以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下项的核酸表达盒稳定转化：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；
由毒素处理细胞制备细胞裂解物；分离编码TR元件的mRNA和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列；使mRNA和来自细胞裂解物的蛋白质接触以形成与mRNA结合的蛋白质；和鉴定所述与mRNA结合的蛋白质。
由毒素处理细胞制备细胞裂解物；分离编码TR元件的mRNA和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列；使mRNA和来自细胞裂解物的蛋白质接触以形成与mRNA结合的蛋白质；和鉴定所述与mRNA结合的蛋白质。
[0016] 本发明还提供用于验证I类、II类或III类哺乳动物细胞保留它们的翻译表型的方法。所述方法包括用(多种)毒素处理I类、II类或III类哺乳动物细胞的亚组；测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的哺乳动物细胞亚组中由报告基因编码的报告蛋白的水平；验证哺乳动物细胞保留它们的表型，其中I类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白的表达高达500％，II类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的500％以上到1400％，并且III类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的1400％以上到约75000％。
[0017] 本发明的再一目的在于提供用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法。所述方法包括使I类、II类或III类哺乳动物细胞与所述物质接触；和测定相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白的表达的与所述物质接触后由哺乳动物细胞所产生的报告蛋白的表达，其中由物质处理细胞所产生的报告蛋白的表达相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白表达的减少表明物质抑制蛋白质翻译。
[0018] 本发明的另一目的在于提供用于恢复所需哺乳动物细胞亚群的表型的方法。所述方法包括培养至少一个哺乳动物细胞亚组以形成培养细胞，其中用核酸表达盒稳定转化哺乳动物细胞，该表达盒包含用于选择标记的核苷酸序列和以下任一项：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因；用选择标记对其提供抗性的物质处理培养的细胞，使得不再含有核酸表达盒的培养细胞死亡；使处理细胞生长以形成哺乳动物细胞亚群；和任选地重复所述培养、处理和生长步骤，直到复原所需哺乳动物细胞亚群的表型。
[0019] 其它目的与特点将在下文部分显而易见并部分指出。
[0021] 图1示出人HCT116细胞系对5-试验和15-试验程序的TR特异性反应。
[0022] 图1A显示用五个单毒素试验测试细胞的5-试验柱状图。表3中示出这些研究中所用毒素的组成和浓度。在此柱状图中，将TR特异性反应显示为对HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#30细胞系重复三次(每柱三个样本)进行的三个独立试验(三个柱)。使用标准微量酶标仪试验测定荧火虫荧光素酶(fLUC)蛋白活性并表达为处理培养物与未处理培养物的比率(即，诱导倍数)。每个柱代表超过1.0的比率并指示表现TR依赖性翻译的细胞。TPA单毒素试验产生TR调节翻译的最显著增加。
[0023] 图1B示出由HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#38细胞系的三个重复样本产生的TR特异性反应的5-试验柱状图。这些结果强调了细胞反应的幅度差异。
[0024] 图1C示出HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#30细胞反应的15-试验柱状图。如上所述，重复三次进行所有试验。图1C示出在组合TPA+泰素的二毒素试验中TR调节翻译的极显著增加，这在单毒素5-试验中未观察到。图1D显示HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#38细胞系的15-试验柱状图。如前所述，在TPA+泰素处理的样本中观察到TR介导的翻译的较大增加。这证实在所测试的毒素之中，使用单毒素试验程序，TPA或泰素产生最佳的TR特异性反应。然而，在组合TPA+泰素处理中观察到的TR反应的较大增加证实TPA+泰素试验是所测试的二毒素组合中用于产生最大TR特异性翻译增加的最佳毒素试验。
[0025] 图2示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应HEK293细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0026] 图2A左图示出由用mTRdm-fLUC表达载体稳定转化的人胚肾HEK293细胞池所产生的TR反应的15-试验柱状图。此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。使用微量酶标仪分析测定fLUC蛋白活性，将其表达为处理样本与未处理样本的比率(即，诱导倍数)。右图示出表达人hTRdm-fLUC表达载体的HEK293细胞池的TR反应的15-试验柱状图。
[0027] 图2B示出由用小鼠mTRdm-fLUC(浅色柱)和人hTRdm-fLUC(深色柱)表达盒稳定转化的HEK293细胞池产生的TR反应的5-试验柱状图。这一直接比较显示在对TR序列的幅度或毒素反应上没有物种特异性差异。
[0028] 图2C示出对于来自HEK293 hTRdm-fLUC池的9个亚克隆的酶标仪结果的例子。不用毒素(UNT)或用TPA单毒素试验(TPA)处理重复三次的样本。对酶标仪值求平均并表示为未处理样本与处理样本的比率(诱导倍数)。对于具有统计上超出剩余两个重复值的范围的任何原始值的样本，指派可疑反应并在随后试验中对这些样本进行再筛选(用问号标注)。表现一致低值的样本(处于或接近给定增益设定下的酶标仪背景值)被视为无反应性的并从任何继续评估中去除(用XX标注)。本实施例中，9个随机样本返回为6个反应克隆(4.1到17.4的诱导倍数范围)、2个可疑克隆和1个表现背景值的克隆。
[0029] 图2D左表示出对于用TPA毒素试验处理的43个HEK293 mTRdm-fLUC细胞亚克隆所观察到的诱导倍数和它们的类别指派。右上图示出43个HEK293 mTRdm-fLUC细胞亚克隆的呈等级顺序(x轴上从最低到最高)与诱导倍数(y轴)的函数形式的曲线图，称之为等级图。右中图示出去除了最大的异常值物种来突出具有较小翻译反应的反应亚克隆的同一等级图。右表示出使用所有等级图结果的汇编来定义类别命名的类别指派。对于HEK293 mTRdm-fLUC细胞池，43个反应者中有25个(58.1％)显示诱导倍数值在5.0以下的低TR特异性毒素反应(称之为I类细胞)，43个亚克隆中有13个(30.2％)表现II类表型(超过5.0到14.0的范围)，而43个亚克隆中有5个(11.6％)表现III类表型(超过14.0的诱导倍数)。
[0030] 图2E左表示出对于82个HEK293 hTRdm-fLUC细胞亚克隆所观察到的诱导倍数和类别指派。右上图示出82个HEK293 hTRdm-fLUC细胞亚克隆的等级图。右表示出对于HEK293 hTRdm-fLUC细胞池的类别指派。82个反应者中有50个(61.0％)显示I类反应，82个亚克隆中有27个(32.9％)表现II类表型，并且82个亚克隆中有5个(6.1％)表现III类表型。
[0031] 图2F上图是示出65个HEK293 mTRplp-fLUC亚克隆的等级图。下表示出对于HEK293 mTRplp-fLUC细胞池的类别指派。65个亚克隆中有51个(78.5％)是I类细胞，65个中有13个(20.0％)表现II类表型，并且65个中有1个(1.5％)显示III类反应。
[0032] 图2G上图是示出39个HEK293 CMV-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于HEK293 CMV-fLUC池的类别指派；39个亚克隆中有34个(87.2％)显示I类反应，39个中有4个(10.3％)表现II类表型，并且39个中有1个(2.6％)产生III类反应。
[0033] 图3示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应HEK293细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0034] 图3A上图是由用小鼠mTRdm-gLUC(gaussia荧光素酶)表达载体稳定转化的HEK293细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的81个TR反应的等级图。下表示出对于HEK293 mTRdm-gLUC池的类别命名；81个亚克隆中有56个(69.1％)显示I类反应，81个亚克隆中有23个(28.4％)表现II类表型，并且81个反应者中有2个(2.5％)显示III类表型。
[0035] 图3B上图是示出89个HEK293 hTRdm-gLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于HEK293 hTRdm-gLUC池的类别指派；89个中有56个(62.9％)显示I类表型，89个中有30个(33.7％)显示II类反应，并且89个中有3个(3.4％)表现III类反应。
[0036] 图3C上图是示出来自HEK293 mTRplp-gLUC亚克隆的69个反应的等级图。下表示出对于HEK293 mTRplp-gLUC池的类别命名；69个中有58个(84.1％)标记为I类细胞，69个中有9个(13.0％)表现II类反应，并且69个中有2个(2.9％)显示III类表型。
[0037] 图4示出应用毒素试验程序鉴定翻译反应U2OS细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0038] 图4A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人骨骼骨肉瘤U2OS细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的106个TR反应的等级图。下表示出对于U2OS mTRdm-fLUC池的类别命名；106个亚克隆中有95个(89.6％)显示I类反应，106个亚克隆中有11个(10.4％)表现II类表型，并且106个反应者中有0个(0％)显示III类表型。
[0039] 图4B上图是示出82个U2OS mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于U2OS mTRplp-fLUC池的类别标记；82个中有81个(98.8％)显示I类表型，82个中有1个(1.2％)显示II类反应，并且82个中有0个(0％)表现III类反应。
[0040] 图4C上图是示出来自U2OS CMV-fLUC亚克隆的79个反应的等级图。下表示出对于U2OS CMV-fLUC池的类别命名；79个中有78个(98.7％)标记为I类细胞，79个中有0个(0％)展表现II类反应，并且79个中有1个(1.2％)显示III类表型。
[0041] 图5显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应MCF7细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0042] 图5A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人乳腺癌MCF7细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的11个TR反应的等级图。下表示出对于MCF7 mTRdm-fLUC池的类别命名；11个亚克隆中有6个(54.5％)显示I类反应，11个亚克隆中有4个(36.4％)表现II类表型，并且11个反应者中有1个(9.1％)显示III类表型。
[0043] 图5B上图是示出36个MCF7 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于MCF7 mTRplp-fLUC池的类别命名；36个中有31个(86.1％)显示I类表型，36个中有3个(8.3％)显示II类反应，并且36个中有2个(5.6％)表现III类反应。
[0044] 图5C上图是示出来自MCF7 CMV-fLUC亚克隆的50个反应的等级图。下表示出对于MCF7 CMV-fLUC池的类别命名；50个中有45个(90.0％)标记为I类细胞，50个中有5个(10.0％)表现II类反应，并且79个中有0个(0％)显示III类表型。
[0045] 图5D上图是示出由MCF7 hTRdm-fLUC亚克隆产生的89个反应的等级图。下表示出对于MCF7 hTRdm-fLUC池的类别命名；89个中有68个(76.4％)标记为I类细胞，89个中有17个(19.1％)表现II类表型，并且89个中有4个(4.5％)显示III类反应。
[0046] 图5E上图是示出由在MCF7转染池的二次筛选中分离的MCF7 mTRdm-fLUC亚克隆所产生的92个反应的等级图。下表示出对于二次MCF7 mTRdm-fLUC池的类别命名；92个中有27个(29.3％)标记为I类细胞，92个中有19个(20.7％)表现II类表型，并且92个中有46个(50.0％)显示III类反应。
[0047] 图6显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应DU145细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0048] 图6A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人前列腺癌DU145细胞池的初级筛选在用TPA毒素试验处理之后所产生的22个TR反应的等级图。下表示出对于DU145 mTRdm-fLUC池的类别命名；22个亚克隆中有5个(22.7％)显示I类反应，22个亚克隆中有13个(59.1％)表现II类反应，并且22个反应者中有4个(18.2％)显示III类表型。
[0049] 图6B上图是示出由在DU145转染池的二次筛选中分离的DU145 mTRdm-fLUC亚克隆所产生的65个反应的等级图。下表示出对于二次DU145 mTRdm-fLUC池的类别命名；65个中有10个(15.4％)标记为I类细胞，65个中有33个(50.8％)表现II类表型，并且65个中有22个(33.8％)显示III类反应。
[0050] 图6C上图是示出来自DU145 CMV-fLUC亚克隆的初级筛选的16个反应的等级图。下表示出对于DU145 CMV-fLUC池的类别命名；16个中有14个(87.5％)标记为I类细胞，16个中有2个(12.5％)表现II类反应，并且16个中有0个(0％)显示III类表型。
[0051] 图6D上图是示出由在DU145转染池的二次筛选中分离的DU145 CMV-fLUC亚克隆所产生的55个反应的等级图。下表示出对于二次DU145 CMV-fLUC池的类别命名；55个中有30个(54.5％)标记为I类细胞，55个中有22个(40.0％)表现II类表型，并且55个中有3个(5.5％)显示III类反应。
[0052] 图7显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应HCT116细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0053] 图7A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人结肠直肠癌HCT116细胞池的初级筛选在用dbcAMP(图7A-C)和TPA(图7D-E)单毒素试验处理之后所产生的21个TR反应的等级图。下表示出对于HCT116 mTRdm-fLUC池的类别命名；21个亚克隆中有20个(95.2％)显示I类反应，21个亚克隆中有1个(4.8％)表现II类表型，并且21个反应者中有0个(0％)显示III类表型。
[0054] 图7B上图是示出12个HCT116 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于HCT116 mTRplp-fLUC池的类别命名；12个中有11个(91.7％)显示I类表型，12个中有0个(0％)显示II类反应，并且12个中有1个(8.3％)表现III类反应。
[0055] 图7C上图是示出来自HCT116 CMV-fLUC亚克隆的6个反应的等级图。下表示出对于HCT116 CMV-fLUC池的类别命名；6个中有6个(100.0％)标记为I类细胞，6个中有0个(0％)表现II类反应，并且6个中有0个(0％)显示III类表型。
[0056] 图7D上图是示出由在HCT116转染池的二次筛选中分离的HCT116 mTRdm-fLUC亚克隆所产生的39个反应的等级图。下表示出对于二次HCT116 mTRdm-fLUC池的类别命名；39个中有29个(74.4％)标记为I类细胞，39个中有8个(20.5％)表现II类表型，并且39个中有2个(5.1％)显示III类反应。
[0057] 图7E上图是示出来自HCT116 hTRdm-fLUC亚克隆的21个反应的等级图。下表示出对于HCT116 hTRdm-fLUC池的类别命名；21个中有10个(47.6％)归为I类，21个中有7个(33.4％)表现II类反应，并且21个中有4个(19.0％)显示III类表型。
[0058] 图8显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应MDA231细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0059] 图8A上图是由用小鼠mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人乳腺癌MDA231细胞池在用dbcAMP单毒素试验处理之后所产生的9个TR反应的等级图。下表示出对于MDA231 mTRdm-fLUC池的类别命名；9个亚克隆中有9个(100.0％)显示I类反应，9个亚克隆中有0个(0％)表现II类反应，并且9个反应者中有0个(0％)显示III类表型。
[0060] 图8B上图是示出33个MDA231 mTRplp-fLUC亚克隆反应的等级图。下表示出对于MDA231 mTRplp-fLUC池的类别命名；33个中有33个(100.0％)显示I类表型，33个中有0个(0％)显示II类反应，并且33个中有0个(0％)表现III类反应。
[0061] 图8C上图是示出来自MDA231 CMV-fLUC亚克隆的17个反应的等级图。下表示出对于MDA231 CMV-fLUC池的类别命名；17个中有17个(100.0％)标记为I类细胞，17个中有0个(0％)表现II类反应，并且17个中有0个(0％)显示III类表型。
[0062] 图9显示应用毒素试验程序鉴定翻译反应HepG2细胞并把这些细胞指派到确定的类别。
[0063] 图9A示出由用CMV-fLUC、mTRplp-fLUC和mTRdm-fLUC表达载体(从左到右)稳定转化的人肝脏肝细胞癌HepG2细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的fLUC活性的柱状图。
[0064] 图9B上图是由用mTRdm-fLUC(荧火虫荧光素酶)表达载体稳定转化的人肝脏肝细胞癌HepG2细胞池在用TPA单毒素试验处理之后所产生的5个TR反应的等级图。下表示出对于HepG2 mTRdm-fLUC池的类别命名；5个亚克隆中有0个(0％)显示I类反应，5个亚克隆中有3个(60.0％)表现II类表型，并且5个反应者中有2个(40.0％)显示III类表型。
[0065] 图9C示出由HepG2 mTRdm-fLUC#16亚克隆所产生的TR反应的15-试验柱状图。此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。使用微量酶标仪分析测定fLUC蛋白活性，将其表达为处理样本与未处理样本的比率(即，诱导倍数)。在TPA+泰素的二毒素试验中观察到fLUC活性的较大增加，这证实TPA+泰素处理是用于产生最大幅度TR特异性翻译反应的最佳毒素试验。
[0066] 图10示出对确定类别的细胞系应用15-试验程序。
[0067] 图10A示出经历15-试验程序的U2OS mTRdm-fLUC#40(浅色柱)和#109(深色柱)亚克隆的柱状图。使用单毒素试验在图4中对两个亚克隆指派II类命名，但使用如实施例中所描述的细胞计数接种程序进行再分析。此图中毒素的组成和浓度如表3中所描述。两个亚克隆继续表现II类反应。应注意，图10中的Y轴显示为未处理对照的诱导百分比，而非先前图中的诱导倍数。可通过用百分比除以100来把诱导百分比变换为诱导倍数(例如，对照的1000％是10倍诱导)。
[0068] 图10B示出使用细胞计数接种程序对四个HCT116 mTRdm-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前已在图7中对这些亚克隆指派I类命名。此柱状图说明由用TPA+泰素的二毒素试验处理的HCT116 mTRdm-fLUC 12-15、12-3、7-5和12-16亚克隆(从左到右)在15-试验程序中所产生的增强TR反应。HCT116 mTRdm-fLUC 12-15和12-3亚克隆继续表达I类表型，而HCT116 mTRdm-fLUC 7-5和12-16亚克隆显示III类表型。
[0069] 图10C示出使用细胞计数接种程序对三个HCT116 mTRplp-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，在图7B中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由HCT116 mTRplp-fLUC11-20、3-11和3-9亚克隆(从左到右)所产生的增强TR反应。HCT116 mTRplp-fLUC 11-20亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中表达II类表型，而HCT116 mTRplp-fLUC 3-11和3-9亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中表现III类反应。
[0070] 图10D示出使用细胞计数接种程序对两个HCT116 CMV-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图，使用亚最佳单毒素试验已在图7C中对所述两个亚克隆指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由HCT116 CMV-fLUC 4-1和4-20亚克隆所产生的fLUC活性(从左到右)。在TPA+泰素的二毒素试验中HCT116 CMV-fLUC 4-1亚克隆继续表达I类表型，而HCT116 CMV-fLUC 4-20亚克隆表现II类反应。
[0071] 图10E示出使用细胞计数接种程序对四个MDA231 mTRdm-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8A中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验方案中由MDA231 mTRdm-fLUC 4-23、4-8、4-7和3-1亚克隆(从左到右)所产生的TR反应。在TPA+泰素的二毒素试验中，MDA231 mTRdm-fLUC 4-23、4-8和4-7亚克隆继续显示I类表型，而MDA231 mTRdm-fLUC 3-1亚克隆表现II类反应。
[0072] 图10F示出使用细胞计数接种程序对四个MDA231 mTRplp-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8B中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验程序中由MDA231 mTRplp-fLUC 3-12、5-2、5-13和2-17亚克隆(从左到右)所产生的TR反应。在TPA+泰素的二毒素试验中，MDA231 mTRplp-fLUC 3-12、5-2和5-13亚克隆仅表达I类表型，而MDA231 mTRplp-fLUC 2-17亚克隆表现II类反应。
[0073] 图10G示出使用细胞计数接种程序对三个MDA231 CMV-fLUC亚克隆进行再分析的柱状图。使用亚最佳单毒素试验，先前在图8C中对这些细胞指派I类命名。此柱状图说明在15-试验方案中由MDA231 CMV-fLUC 1-21、2-5和1-20亚克隆(从左到右)所产生的fLUC活性。虽然MDA231 CMV-fLUC 1-21、2-5和1-20亚克隆表现增加的fLUC水平，但每个亚克隆仍表达I类表型。
[0074] 图11示出用于通过集落形成和亚克隆来恢复确定类别的表型的方案。
[0075] 图11A左图是由从II类MDA231 mTRplp-fLUC 2-17细胞系(用TPA单毒素试验处理)分离的113个二次亚克隆所产生的等级图。如实施例中所描述分离亚克隆。等级图示出TR反应为等级顺序(x轴上从最低到最高)与诱导倍数(y轴)的函数。虚线是如图10F中所示的TPA特异性TR反应。显著比例的亚克隆显示相对于亲代细胞系的TR反应的增加。虽然大多数亚克隆表现II类TR活性，但仍有一小比例表现III类反应。右图是使用泰素单毒素试验对113个MDA231 mTRplp-fLUC 2-17亚克隆的分析。虚线示出来自图10F的泰素特异性TR活性。如上所述，显著比例的亚克隆显示II类表型，但一个亚组产生III类反应。两个箭头指示在每个试验中的最大反应亚克隆是相同细胞系。
[0076] 图11B左图是由从III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系(用TPA单毒素试验处理)分离的70个二次亚克隆所产生的等级图。虚线是如图10B中所示的TPA特异性TR反应。大部分亚克隆显示III类TR活性，其中一小群表现与亲代细胞相比显著较大的TR反应。右图是使用泰素单毒素试验对相同的70个HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆的分析。虚线示出来自图10B的泰素特异性TR活性。所有亚克隆都显示III类反应，其中一个显著比例表现与亲代细胞系相比增强的TR活性。
[0077] 图11C示出从MCF7 mTRplp-fLUC#43细胞系(用泰素单毒素试验处理)分离的95个二次亚克隆的等级图。在图5B中对MCF7 mTRplp-fLUC#43细胞系指派III类命名。虚线是在15-试验程序中(未显示)由亲代细胞系所产生的TPA特异性TR反应。一定比例的二次亚克隆清楚地表现大于亲代细胞系的III类表型。
[0078] 图11D示出从MCF7 mTRdm-fLUC#64细胞系(用泰素单毒素试验处理)分离的22个二次亚克隆的等级图。在图5A中对MCF7 mTRdm-fLUC#64细胞系给定III类命名。虚线是在15-试验方案中(未显示)由亲代细胞系所产生的泰素特异性TR反应。大多数二次亚克隆保留III类表型，并且显著比例显示与亲代细胞系相比增强的TR活性。
[0079] 图12示出通过对表达盒中的抗生素抗性标记物进行再选择来恢复确定类别的表型的结果。
[0080] 图12A示出先前均被指派III类表型的4个HCT116亚克隆的柱状图。HCT116 mTRdm-fLUC 7-2和12-16是初级HCT116分离株。HCT116 mTRdm-fLUC亚克隆#30和亚克隆#38是从12-16原代细胞系分离的高反应二次亚克隆(图11B)。浅色柱示出用TPA+泰素的二毒素试验处理的高传代细胞系(P10–P20)。深色柱是用G418进行再选择以去除分离TR表达质粒的细胞的相同培养物，其也已经用TPA+泰素的二毒素试验处理过。为进行比较，利用最右侧的柱来示出由70个二次12-16亚克隆(图11B)产生的平均反应。下表示出在再选择之后所观察到的TR特异性活性的高度显著性增加。
[0081] 图12B示出由用TPA单毒素试验处理过的所述细胞系所产生的TR活性的柱状图。下表示出在再选择过程之后的TR特异性反应的高度显著性增加。
[0082] 图13示出通过机械操纵对基础的非帽依赖性翻译的调节。
[0083] 图13A示出由使用汇合(浅色柱)和细胞计数(深色柱)程序接种的未处理MDA231细胞系所产生的基础翻译活性的柱状图。把三个MDA231 CMV-fLUC细胞系(1-21、2-5、1-20)与四个mTRplp-fLUC(2-17、3-12、5-2、5-13)和四个mTRdm-fLUC细胞系(4-23、3-1、4-8、4-7)进行比较。将细胞裂解，不用毒素处理进行分析，并把酶标仪值作为相对光单位绘图。大体上，每种细胞系都显示，相比于细胞计数方案(其产生分汇合的有丝分裂细胞培养物)，汇合接种程序(其使每平方厘米培养面积的细胞数最大化并导致产生汇合的有丝分裂后细胞培养物)导致显著更高的基础fLUC水平。
[0084] 图13B示出相同未处理细胞的柱状图，其中去除了CMV结果来通过图解强化TR表达细胞系中的较低值。如前所述，大体趋势是汇合接种方法把更多细胞引入试验中并增加了基础水平的fLUC活性；然而，两个细胞系(mTRplp-fLUC 5-2和mTRdm-fLUC 4-8)在通过细胞计数程序接种的未处理细胞中表现增强的fLUC活性。
[0085] 图14示出在标准毒素试验中所产生的TR特异性报告蛋白活性与TR来源的翻译蛋白的相关性。
[0086] 图14A上图示出由从III类HCT116 mTRdm-fLUC 7-5亚克隆制备的细胞提取物所产生的fLUC活性的15-试验柱状图。下图示出用来指派III类命名的HCT116 mTRdm-fLUC 7-5细胞系的15-试验柱状图。在每个试验中检验相等数量的细胞。
[0087] 图14B示出使用抗荧火虫荧光素酶抗体显现的上述15-试验细胞提取物的Western免疫印迹。在每个凝胶泳道中分析等量的总蛋白质。
[0088] 图14C示出对Western免疫印迹上的谱带强度的光密度测定分析的柱状图。高谱带强度处在x光片反应的线性范围之外并产生与直接细胞测定值相比的较低值。
[0089] 图15示出TR特异性报告蛋白活性与TR来源的翻译产物的相关性。
[0090] 图15A示出重组fLUC蛋白浓度(Sigma)作为相对光单位的函数的剂量反应曲线图。对于此曲线图，制备fLUC蛋白的连续稀释液并使用标准酶标仪程序进行测定。
[0091] 图15B示出使用15-试验程序，从III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆制备的细胞提取物的表。从每个提取物中取固定细胞数(总细胞数的1/10)并在酶标仪试验中测定。由每个样本提取物产生的相对光单位可通过图解与图15A中的已知蛋白质浓度进行比较。
对于用确定的毒素试验处理6小时的III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞，使用总细胞数的1/10来确定fLUC蛋白浓度，并变换成定义为光单位/μg fLUC蛋白的比活性。
对于用确定的毒素试验处理6小时的III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞，使用总细胞数的1/10来确定fLUC蛋白浓度，并变换成定义为光单位/μg fLUC蛋白的比活性。
[0092] 图15C是由用15-试验程序处理的HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞所产生的蛋白质提取物的Western免疫印迹。谱带强度(fLUC蛋白水平)与上面计算的蛋白质浓度良好相关。在每个凝胶泳道中分析等量的总蛋白质。
[0093] 图16-25分别是质粒pCMV-gLuc、pCMV-fLuc、phTRdm-fLuc、phTRdm-gLuc、phTRplp-fLuc、phTRplp-gLuc、pmTdm-fLuc、pmTRdm-gLuc、pmTRplp-fLuc和pmTRplp-gLuc的示意图。功能性质粒元件(限制性酶位点、复制起点、开放阅读框等)按需要用竖线、框和箭头表示。
mDM＝鼠DM20 cDNA；mP＝鼠PLP cDNA；mTRd＝鼠TRdm；mTRp＝鼠TRplp；hDM＝人DM20；hP＝人PLP；hTRd＝人TRdm,hTRp＝人TRplp,fLuc＝荧火虫荧光素酶；gLuc＝Gaussia荧光素酶。
mDM＝鼠DM20 cDNA；mP＝鼠PLP cDNA；mTRd＝鼠TRdm；mTRp＝鼠TRplp；hDM＝人DM20；hP＝人PLP；hTRd＝人TRdm,hTRp＝人TRplp,fLuc＝荧火虫荧光素酶；gLuc＝Gaussia荧光素酶。
[0094] 图26是鼠与人PLP/DM20编码序列和其TR元件的序列比对图。关键词：mDM＝鼠DM20 cDNA；mP＝鼠PLP cDNA；mTRd＝鼠TRdm[SEQ ID NO:1]；mTRp＝鼠TRplp[SEQ ID NO:2]；hDM＝人DM20；hP＝人PLP；hTRd＝人TRdm[SEQ ID NO:3]和hTRp＝人TRplp[SEQ ID NO:4]。因为DM20序列省略了全长PLP编码序列中存在的一部分序列，所以图26中DM20序列的编号是不连续的，并且在省略的区段之后，DM20编号在比对序列的下面显示为连续的。在参照图26描述本文的序列时，在一些情况下利用对PLP/DM20核苷酸位置的双重编码，例如残基560/455；此用法指在替代者中的PLP和DM20编码，其中PLP编码如比对序列上面所示，并且DM20编码如比对序列下面所示。
[0095] 图27示出应用毒素试验程序来在MCF7乳腺癌细胞中区分蛋白激酶C(PKC)激活剂组(属特异性分子靶)内的毒素特异性影响(种特异性毒素作用)。
[0096] 图27A示出剂量反应试验，其中用不同剂量的TPA(剂量范围1nM到500nM)处理MCF7 CMV-fLuc亚克隆#44和#48的三个重复样本。在暴露于单毒素TPA试验6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对原始值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。两个细胞系都显示fLuc蛋白合成随着TPA浓度增加的线性增加，在100nM TPA剂量下达到最大报告蛋白水平。随后使用此TPA浓度作为图27B中所示的苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验的对照。
[0097] 图27B示出剂量反应曲线，其中在单毒素试验中用100nM TPA，或用不同剂量的苔藓抑制素1(500pM到500nM的剂量范围)(上图)或苔藓抑制素2(1nM到2.5uM的剂量范围)(下图)处理MCF7 CMV-fLuc亚克隆#44和#48的三个重复样本。虚线代表由100nM TPA单毒素试验所产生的翻译反应水平。苔藓抑制素1的浓度(上图)涵盖图27A中所用的TPA浓度。虽然在100nM苔藓抑制素1试验中观察到最大翻译反应，但报告蛋白活性的幅度从未达到由100nM TPA试验所产生的fLuc活性水平。苔藓抑制素2剂量反应曲线(下图)采用更高的药物浓度(最大测试剂量是TPA和苔藓抑制素1最大量的5倍)。在最高测试剂量下(2.5uM)，苔藓抑制素2产生与用100nM TPA所观察到的水平相一致的fLuc活性。
[0098] 图27C示出剂量反应曲线，其中用不同剂量的TPA(1nM到500nM)处理MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#8、#27和#45的三个重复样本以定义TR翻译反应。在用TPA单毒素试验培养6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。所有细胞系都显示fLuc蛋白活性随着TPA浓度增加的线性增加，在100nM TPA剂量下达到峰值。使用此TPA浓度作为图27D中所示的苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验的标准。
[0099] 图27D示出剂量反应曲线，其中在单毒素试验中用100nM TPA或用不同剂量的苔藓抑制素1(500pM到500nM的剂量范围)(上图)或苔藓抑制素2(1nM到2.5uM的剂量范围)(下图)处理MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#8、#27和#45的三个重复样本。和图27B一样，虚线代表在每个细胞系中由100nM TPA试验所达到的翻译反应水平。苔藓抑制素1的浓度(上图)涵盖图27C中所示的TPA剂量反应曲线，并且在100nM苔藓抑制素1试验中表现最大活性。虽然苔藓抑制素2试验(下图)覆盖甚至更大的浓度范围，但在相似剂量下，TR特异性表达水平与苔藓抑制素1没有显著差异。苔藓抑制素1和苔藓抑制素2试验中的翻译反应的幅度从未达到在100nM TPA测试中所产生的fLuc活性。在此研究和其它类似工作中，100nM TPA、苔藓抑制素1和苔藓抑制素2单毒素试验之间的翻译差异在非帽依赖性试验中比图27B中的帽依赖性试验中大得多。帽依赖性试验与非帽依赖性试验之间的进一步差异是观察到增加的苔藓抑制素2浓度(最大TPA剂量的5倍)从未产生与100nM TPA试验相当的fLUC活性。因此，毒素试验程序可检测到激活PKC活性的化合物在帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译之间的统计学显著差异。
[0100] 图28示出使用单毒素与组合毒素试验来在MCF7乳腺癌细胞中区分拓扑异构酶I抑制剂属(喜树碱药物种类)内的毒素特异性翻译反应。这些结果还提供不具有对蛋白质翻译有先前已知作用的物质的例子，其选择性地降低翻译。
[0101] 图28A示出用不同剂量(10nM到10uM的范围)的下列拓扑异构酶1抑制剂处理的MCF7 CMV-fLuc亚克隆#65的剂量反应试验。喜树碱、拓扑替康、伊立替康和鲁比替康。在单毒素试验中孵育6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理细胞样本中翻译反应的水平。喜树碱和鲁比替康显示类似的剂量反应，其中fLuc蛋白质表达在～1uM时达到峰值，而在更高剂量下下降到基础水平。相比之下，拓扑替康和伊立替康在单毒素试验中都没有显著改变帽依赖性翻译。
[0102] 图28B示出使用组合试验来检验拓扑异构酶1抑制剂对帽依赖性翻译的影响。在利用恒定的100nM TPA剂量的二毒素试验中使用不同剂量的拓扑异构酶1抑制剂(10nM到10uM的范围)对MCF7 CMV-fLuc亚克隆#65进行一系列剂量反应试验。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。按照类似方式，喜树碱和鲁比替康与TPA协同作用来增加fLUC蛋白活性直到1uM剂量，但在更高浓度下仅表现fLUC活性的最低增加，而伊立替康未产生TPA特异性翻译反应的任何显著变化，拓扑替康仅在高剂量(即，5uM和10uM)显示TPA抑制作用。
[0103] 图28C示出使用单毒素试验来在MCF7细胞中测定拓扑异构酶1抑制剂对非帽依赖性翻译的影响。用不同浓度(10nM到10uM的范围)的拓扑异构酶1抑制剂(喜树碱、鲁比替康、伊立替康和拓扑替康)处理MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#27的三个重复样本。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理对照中翻译反应的水平。四种化合物均在低剂量下(10nM和100nM)刺激非帽依赖性翻译，但只有喜树碱、鲁比替康和拓扑替康在较高剂量下(5uM和10uM)表现降低的fLUC活性。具体来说，在高浓度喜树碱和鲁比替康试验中的fLUC活性导致蛋白质水平低于未处理的对照细胞(<100％)。这些结果与伊立替康在所有测试浓度下都表现恒定量的fLUC活性形成对比。
[0104] 图28D示出对用100nM TPA加不同剂量(10nM到10uM的范围)的拓扑异构酶1抑制剂处理的MCF7 mTRdm-fLuc亚克隆#27使用二毒素组合试验。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。四种抑制剂在10nM二毒素试验中均与TPA协同作用来增加蛋白质活性。然而在较高的抑制剂浓度下，喜树碱、鲁比替康和拓扑替康拮抗TPA活性并表现降低的fLUC表达。对于喜树碱和鲁比替康，在10uM二毒素试验中的这一拮抗作用导致fLUC蛋白水平低于未处理对照细胞(<100％)。在最高剂量下，拓扑替康表现基础水平的表达。相比之下，伊立替康二毒素试验显示与TPA的协同作用以及在所有测试剂量下增强的fLUC活性。这些结果显示，除了它们对拓扑异构酶1的已知作用之外，高剂量的这些药物会抑制蛋白质合成，其中最大幅度的变化发生于毒素刺激的TR表达细胞系中。
[0105] 图29示出应用单毒素试验来在HEK293胚肾细胞中区分微管破坏剂药物种类内的药物特异性表型。动态细胞骨架结构对于正常细胞功能具有重要性。在微管的情况下，干扰微管蛋白亚单位蛋白的重塑会通过阻断细胞周期进程而产生显著的抗增殖活性。然而，破坏微管的药物在微管蛋白结合之后表现显著的生物学差异。例如，诺考达唑和秋水仙碱结合不全相同的重叠蛋白序列下的微管，但两种化合物都阻断防止聚合和促进解聚的微管组装位点。长春花生物碱(诸如长春新碱与长春花碱)结合微管蛋白并诱导微管蛋白聚集形成防止微管组装的不溶性晶体。最后，泰素结合微管并使完整微管稳定，这干扰了它们在细胞分裂期间的解组装。
[0106] 图29A示出使用单毒素试验来测定微管破坏剂对用不同剂量(5nM到5uM的范围)的下列试剂处理的HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3的影响：诺考达唑、秋水仙碱、长春新碱和泰素。在暴露6小时后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。诺考达唑、秋水仙碱和长春新碱在100nM与5uM的浓度之间表现报告蛋白活性增加。相比之下，仅在最高泰素剂量下(2.5uM和5uM)观察到fLUC表达的显著变化。
[0107] 图29B示出用不同浓度(5nM到5uM的范围)的图29A中所列微管破坏剂处理的HEK293 hTRdm-fLuc#53(上图)和HEK293 mTRdm-fLuc#12(下图)亚克隆的剂量反应曲线。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。由人(hTRdm，上图)和小鼠(mTRdm，下图)TR盒产生高度类似的TR表达谱。如同图29A中的帽依赖性试验，秋水仙碱和长春新碱在大于100nM的所有剂量表现增加的报告蛋白活性。相比之下，仅在高于250nM的诺考达唑浓度下才观察到报告蛋白活性的显著增加。如同帽依赖性试验，仅在2.5uM和5uM剂量下观察到泰素特异性报告蛋白增加。尽管秋水仙碱和长春新碱在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中展示了类似的翻译反应，但诺考达唑产生了独特的非帽依赖性反应。即使在两个试验中都在高泰素剂量下观察到了显著的翻译增加，但这种药物仍产生所有测试的微管破坏剂药物中最小的反应谱，这与它的独特活性相一致。
[0108] 图30示出人HEK293细胞系对更新的15-试验方案的TR特异性反应。
[0109] 图30A示出由HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3产生的帽依赖性翻译反应的15-试验柱状图。这些研究中所用的毒素的组成和浓度如表3中所示。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。除了TPA+拓扑替康(高剂量或HD)二毒素试验之外，在所有其它TPA组合试验中观察到显著的帽依赖性fLuc产生。
[0110] 图30B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亚克隆#13产生的TR翻译反应的15-试验柱状图。使用标准微量酶标仪试验测定fLUC蛋白活性并表示为处理培养物与未处理培养物的比率(即，诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。除了TPA+拓扑替康(HD)的二毒素试验，在其它所有组合TPA试验中观察到TR调节翻译的高度显著性增加。
[0111] 图30C示出由HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79产生的TR翻译反应的15-试验柱状图。如前所述，在药物施用6小时后在条件培养基中测定分泌性Gaussia荧光素酶(gLUC)活性并将蛋白质活性表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理细胞中的翻译反应。虽然fLuc蛋白是一种经受胞内蛋白降解系统的胞浆蛋白并且gLuc是一种逃脱胞内降解并在细胞外累积的分泌性蛋白，但在图30B与图30C中的非帽依赖性表达谱强烈相关并表现与图30A中帽依赖性试验类似的差异。在TPA+卡西霉素二毒素试验中的非帽依赖性反应显示15-试验组中的最大翻译增加，这与在图30A的帽依赖性试验中观察到的最小诱导形成对比。此外，拓扑替康(HD)的抑制作用在所有单毒素与二毒素试验中是明显的，其中在TPA+拓扑替康(HD)试验中观察到最大变化。
[0112] 图31显示使用21-毒素试验程序来表征未知或先前未确定的物质对人HEK293胚肾细胞的影响。和在标准15-毒素试验中一样，21-试验配置采用5种毒素的单个和配对组合应用，并加入第六种物质。包括进第六种化合物需要把试验组扩增到21个单毒素与二毒素试验的总数。各种毒素的组成和浓度如表3中所描述。在本实施例中，先前未确定的物质是泰素。在此试验之前，未曾在HEK293细胞中于更新的15-毒素试验方案中测定组合泰素反应。
[0113] 图31A示出由HEK293 CMV-fLuc亚克隆#3产生的帽依赖性翻译反应的21-毒素柱状图。在暴露于化合物6小时之后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对三个重复的酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。虽然泰素在单毒素试验中(未知的)对帽依赖性fluc蛋白产生具有最小影响，但TPA+泰素的二毒素试验(TPA+未知的)表现协同相互作用以及此组中最大的翻译反应。在二毒素试验中未观察到其它显著变化。
[0114] 图31B示出由表达fLUC报告蛋白的HEK293 hTRdm-fLuc亚克隆#13所产生的TR特异性翻译反应的21-毒素柱状图。虚线代表由未处理细胞样本所产生的翻译反应。在此组中，泰素(未知)在单毒素以及秋水仙碱+泰素、卡西霉素+泰素、硼替佐米+泰素的二毒素试验中表现fLUC活性的较小协同增加，但在TPA+泰素或拓扑替康+泰素试验中没有。
[0115] 图31C示出由表达gLUC报告蛋白的HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79所产生的21-试验柱状图。在培养6小时之后，使用标准微量酶标仪试验在条件培养基中测定分泌性gLuc活性并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。虚线代表未处理样本中翻译反应的水平。已知gLuc蛋白被分泌到培养基中，它逃脱了作用于fLUC蛋白的胞浆蛋白周转过程。因此，表观TR反应的任何差异可能是报告蛋白合成、分泌或降低的蛋白质周转方面的差异的结果。然而，尽管在fLuc与gLuc蛋白加工中存在差异，但由HEK293 hTRdm-fLuc亚克隆#13和HEK293 hTRdm-gLuc亚克隆#79产生的反应谱显示强相关性。在秋水仙碱+泰素的二毒素试验中观察到最显著的变化，这可能是因两种微管蛋白结合药物对微管的组合作用而引起的蛋白质分泌改变的结果。
[0116] 图32示出使用21-试验程序来检测与HepG2肝细胞癌和HEK293胚肾细胞的抗生素治疗相关的任何慢性影响。支原体去除试剂(MRA)或4-氧喹啉-3-羧酸衍生物是普遍应用于培养的哺乳动物细胞以治疗支原体污染的抗生素。MRA表现最低的毒性并且可应用较长的培养时期。本实施例中，在21-试验程序之前将MRA处理细胞(+MRA)与～150nM MRA一起孵育7天。虽然把+MRA细胞维持在补充抗生素的培养基中，但将另一MRA剂量用作未知化合物。未处理的-MRA培养物从未暴露于抗生素。标准毒素的名称和浓度在表3中给出。图32A示出HepG2细胞中持续MRA暴露的影响，而图32B示出HEK 293细胞中MRA的影响。
[0117] 图32A上图示出由HepG2 mTRdm-fLuc亚克隆#16产生的TR反应的21-试验柱状图，所述亚克隆#16用～150nM MRA处理7天(浅色柱)或未用～150nM MRA处理(深色柱)。在用标准毒素处理6小时后，将细胞裂解并使用标准微量酶标仪试验测定fLuc蛋白活性。对酶标仪值求平均并表示为处理样本与未处理样本的比率(诱导倍数)。下图示出相同数据组，其中去除了TPA试验以突出在其它试验中观察到的反应。与单毒素和二毒素TPA试验相比而言，抗生素处理的HepG2细胞表现fLUC活性的最小差异。对于TPA试验，在每个测试中观察到显著的拮抗作用，并在TPA+秋水仙碱的二毒素试验中观察到fLUC表达的极大减少，其中与–MRA细胞相比，+MRA培养物表现fLUC活性约减少到1/2.5。
[0118] 图32B示出由HEK293 mTRdm-fLuc亚克隆#45产生的非帽依赖性翻译反应的21-试验柱状图，所述亚克隆#45用～150nM MRA处理7天(浅色柱)或未用～150nM MRA处理(深色柱)。与图32A中的HepG2细胞相比而言，HEK293细胞的慢性MRA暴露在21-试验方案中导致fLUC表达的近似均匀降低。然而，如图32A中一样，在TPA单毒素与二毒素试验中观察到最大幅度降低。这些结果支持以下理论：对抗生素氟喹诺酮的长时暴露会以可测定的程度影响TR试验，具体地说，检测到了强的拮抗毒素特异性表型，涉及TPA毒素。
[0119] 图33示出应用毒素试验程序来鉴定HEK293细胞中与翻译抑制剂相关的毒素特异性和细胞特异性影响。
[0120] 图33A示出剂量反应柱状图，其中用各种浓度(剂量范围10nM到25uM)的下列翻译抑制剂处理HEK293 CMV-fLUC亚克隆#3(上图)、hTRdm-fLUC亚克隆#13(中图)和mTRdm-fLUC亚克隆#45(下图)：放线菌酮、茴香霉素、嘌呤霉素和吐根碱。在足够大的剂量下，这些抑制剂立即停止蛋白质翻译，并且所得蛋白质周转使报告蛋白水平降低到未处理细胞水平以下(<100％对照)。
[0121] 翻译抑制剂对帽依赖性翻译(HEK293 CMV-fLUC亚克隆#3数据，上图)和非帽依赖性翻译(HEK293 hTRdm-fLUC#13和mTRdm-fLUC#45亚克隆，中图和下图)表现一些类似影响。例如，250nM浓度的每种抑制剂足以把蛋白质合成降低到对照细胞水平以下。此外，抑制剂剂量的额外增加(高至25uM，或100×)仅产生报告蛋白活性的最小额外降低。另外，嘌呤霉素需要2.5uM的浓度来把报告蛋白水平降低到与其它三种抑制剂可比较的水平。与这些相似性形成对比，茴香霉素和吐根碱在HEK293 CMV-fLUC#3(上图)与mTRdm-fLUC#45(下图)亚克隆中表现明显不同的活性。在这些细胞中，低剂量的茴香霉素(～25nM)和吐根碱(100nM)足以把报告蛋白水平降低到未处理对照细胞的水平以下。最后，在单毒素25uM试验中fLUC蛋白活性下降30-40％表明，fLUC蛋白在HEK293细胞中表现超过6小时的半衰期。
[0122] 图33B示出用100nM TPA与各种浓度(剂量范围10nM到25uM)的图33A所列翻译抑制剂相组合的二毒素试验处理的HEK293 CMV-fLUC#3(上图)、hTRdm-fLUC#13(中图)和mTRdm-fLUC#45(下图)亚克隆的剂量反应柱状图。对于HEK293 CMV-fLUC#3(上图)和mTRdm-fLUC#45(下图)亚克隆，茴香霉素和吐根碱在最低测试剂量下(10nM)拮抗TPA反应并且与TPA单毒素试验相比降低报告蛋白水平50-300％。这与嘌呤霉素形成对比，在三个细胞系中嘌呤霉素都需要250nM的浓度(25×)来起初把蛋白质合成降低到TPA单毒素试验水平以下。单毒素结果暗示，嘌呤霉素需要相当高的剂量来把报告蛋白水平降低到与其它三种抑制剂可比较的水平。例如，CMV-fLUC#3亚克隆需要2.5uM的嘌呤霉素剂量来与其它抑制剂相关联，这与hTRdm-fLUC#13和mTRdm-fLUC#45亚克隆需要25uM嘌呤霉素浓度(10×增加)形成对比。如图
33A中一样，在二毒素试验中于25uM抑制剂浓度下报告蛋白水平下降40％支持fLUC半衰期估计值为约6小时。
33A中一样，在二毒素试验中于25uM抑制剂浓度下报告蛋白水平下降40％支持fLUC半衰期估计值为约6小时。
[0123] 图33B中在HEK293 hTRdm-fLUC#13与HEK293 mTRdm-fLUC#45亚克隆之间观察到明显的细胞特异性差异，而在最高测试剂量下(25uM)观察到另一显著差异。为突出这一差异，图33C示出仅在25uM抑制剂剂量下对于HEK293 hTRdm-fLUC#13和HEK293 mTRdm-fLUC#45亚克隆的单毒素与二毒素试验的反应柱状图。与在两个试验中显示相当的报告蛋白水平的HEK293 hTRdm-fLUC#13亚克隆形成对比，HEK293 mTRdm-fLUC#45亚克隆对于在此剂量下的放线菌酮、嘌呤霉素和吐根碱，所表现的降低很少或没有低于未处理对照细胞水平。统计分析(下表)确认在二毒素试验中两个亚克隆之间的这一差异的显著性。因为对于HEK293 mTRdm-fLUC#45亚克隆的单毒素试验显示此细胞系对此剂量下的这三种抑制剂敏感，所以这一结果与暴露于TPA之后在这些细胞中的蛋白质代谢改变相一致。
[0124] 整个附图中对应的参考字符表示对应的部分。
[0125] 定义
[0126] 术语“基因”指包含对于产生多肽或前体或RNA(例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)即可。本术语还涵盖结构基因的编码区和在5'与3'端两者上与编码区相邻的序列，使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'端并存在于mRNA上的序列称为5'非翻译序列。位于编码区的3'端或编码区下游并存在于mRNA上的序列称为3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA与基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有编码区，其可穿插有称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列。内含子从细胞核或初级转录物去除或“剪接掉”，并因此在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。mRNA在翻译期间起作用来指定新生多肽中氨基酸的次序或顺序。
[0127] 术语“表达载体”指包含核酸表达盒的病毒和非病毒载体。
[0128] 术语“表达盒”用来定义含有可操作地连接到编码序列的调节元件的核苷酸序列，所述调节元件导致编码序列在细胞中的转录与翻译。
[0129] “哺乳动物启动子”指在哺乳动物细胞中起作用或来源于哺乳动物细胞的转录启动子，或二者兼而有之。
[0130] “哺乳动物最小启动子”指经由RNA聚合酶结合来正确起始转录所必需的‘核心’DNA序列，但其在不存在任何可操作地连接的转录效应子序列时仅表现象征性的转录活性。
[0131] 用语“开放阅读框”或“编码序列”指编码多肽或蛋白质的核苷酸序列。在真核生物中编码区在5'侧邻接编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”，而在3'侧邻接指定终止密码子的三个三联体(即，TAA、TAG和TGA)之一。
[0132] “可操作地连接”定义为意指使核酸与另一核酸序列处于功能关系。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录则将其可操作地连接到该编码序列；或者如果核糖体结合位点的定位以便于翻译则将其可操作地连接到编码序列。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的。不过，增强子并不必需是邻接的。连接是通过在便利的限制性位点处的接合来完成。如果这类位点不存在，那么根据常规实践使用合成性的寡核苷酸衔接子或接头。
[0133] “重组的”指方法、试剂和实验室操纵的结果，其中将核酸或其它生物分子用酶学方法、化学方法或生物学方法裂解、合成、组合或以其它方式离体操纵以在细胞或其它生物系统中产生所需产物。术语“重组DNA”指由借助于分子生物学技术接连在一起的DNA片段构成的DNA分子。
[0134] “转染”是用来描述向真核细胞中引入外源物质(诸如外源DNA)的术语。它与“转化”和“转导”可交换地使用，但后一术语在它的更狭窄范围内指通过病毒(充当载体)向细胞中引入DNA的过程。因此，经历转染的细胞称为“转染的”、“转化的”或“转导的”细胞。
[0135] 本文中使用的术语“质粒”指DNA的独立复制小片。它通常是圆形的和双链的。
[0136] “报告基因”指可使用本领域技术人员已知的常规技术检测或测定其表达的任何基因。
[0137] 术语“调节元件”或“效应子元件”指转录启动子、增强子、沉默子或终止子，以及指任何翻译调节元件、聚腺苷酸化位点等等。可排列调节元件和效应子元件使得它们允许、增强或便于选择性产生经它们调节的成熟编码序列。
[0138] 术语“载体”指外源DNA片段可插入其中的DNA分子。一般来说，它们含有目标调节序列和编码序列。术语载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体和穿梭载体。
[0140] 本文中使用的术语“物质”指具有明确的化学组成的物质。它在本文中与术语“化合物”可交换地使用。
[0141] 术语“病毒载体”指含有外源遗传物质以供递送到它感染的细胞中的病毒。
[0142] “复制缺陷型”病毒载体不能够在“野生型”或以其它方式未操纵的哺乳动物细胞中复制。大量此类病毒的产生要求生产细胞系用辅助病毒共转染或以其它方式修饰来提供或补充缺失的功能。
[0143] “复制竞争型”病毒载体是能够感染细胞并经历DNA复制、病毒包装和从被感染细胞释放的载体。
[0144] 本文中使用的“条件复制型”病毒载体是设计成在特定细胞类型中选择性表达使得避免非所需广谱感染的复制竞争型载体。条件复制可通过在载体中包括可操作地连接到早期病毒基因的组织特异性、肿瘤特异性或细胞类型特异性或其它选择性诱导的调节性控制序列来实现。
[0145] 术语“应激”和“毒性”用来指代对细胞天然的生物化学和生物物理稳态的干扰。然而应激一般导致细胞稳态的恢复，而毒性反应最终导致细胞死亡。
[0146] 优选实施方案的描述
[0147] 本发明涉及表现独特核糖体谱的哺乳动物细胞亚群，这通过不同的翻译活性来证明。一旦哺乳动物细胞或细胞系用本文中描述的表达盒稳定转化，就可鉴定出所需的细胞亚群。重要的是，可操纵这些细胞亚群来表现帽依赖性翻译或非帽依赖性翻译。
[0148] 因此，在一个实施方案中，本发明是针对用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法。方法包括以下步骤。用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，哺乳动物细胞用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型。如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物。使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群。任选地，用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群，并重复测定、分离和生长步骤直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群。
[0149] 本发明中所采用的翻译调节(TR)序列(又称为“TR元件”)是IRES元件，其可通过(a)它的核酸序列文本和(b)调节翻译的细胞活性(第2006/0173168号美国公布的专利申请，其以引用的方式并入本文)与5'UTR IRES相区别。这两个特点相结合形成用于可操作地连接到此IRES序列的下游编码序列在受胁迫和/或垂死哺乳动物细胞中选择性翻译的基础。因此，本发明涵盖任何哺乳动物IRES作为TR元件的用途，所述TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中选择性表达。
[0150] 在一些实施方案中，本发明的IRES元件具有非帽依赖性翻译活性，其位于哺乳动物蛋白脂质蛋白(plp)基因的ORF内。在其天然环境中，plp IRES活性存在于含有数个上游ORF("uORF")的多顺反子RNA内，所述数个上游ORF有效阻断正常细胞中对内部AUG密码子的核糖体扫描。然而，将细胞暴露给毒剂导致核糖体结合和从特异性内部RNA序列的翻译使得内部氨基酸序列从plp ORF的3'端翻译(例如，PIRP-M和PIRP-L肽)。在另一实施方案中，TR元件来源于DM20变体。
[0151] 在一些实施方案中，本发明的TR元件来源于plp基因的外显子1-7。尽管不受具体理论的束缚，但仍认为外显子1到4足以基于突变分析数据来编码功能IRES活性。此外，认为TR调节系统(其参与应激/死亡特异性翻译)位于外显子6和/或7内。
[0152] 在一些实施方案中，TR元件来源于小鼠。与US 2006/0173168中公开的在垂死细胞中表达的IRES元件相比，本发明的来源于PLP/DM20的小鼠来源TR元件在所有以下特点方面有所不同：
[0153] 1)核苷酸1(在SEQ ID Nos.1和2中)由A突变为T以去除髓鞘蛋白脂质蛋白PLP和DM20 cDNA中指导全长PLP和DM20的合成的野生型AUG起始密码子以阻止这种合成发生；
[0154] 2)核苷酸4由G突变为A以便在PLP和DM20 cDNA的第二可能阅读框中产生终止密码子来阻止其全长合成；
[0155] 3)核苷酸6、7和8分别由C突变为T、由T突变为G和由T突变为A以在PLP和DM20 cDNA的第三可能阅读框中产生终止密码子来阻止全长PLP和DM20的合成；
[0156] 4)核苷酸17和18分别由G突变为A和由T突变为G以在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)开放阅读框中产生第一终止密码子来阻止它们的全长合成；
[0157] 5)核苷酸21由T突变为A以便在PLP和DM20 cDNA的主要(第一)开放阅读框中产生第二终止密码子来阻止其全长合成；
[0158] 6)核苷酸27由A突变为T以便从PLP和DM20 cDNA的第三可能阅读框中去除AUG密码子从而在不存在野生型AUG密码子时阻止框外(out-of frame)翻译起始；和
[0159] 7)从PLP和DM20 cDNA中缺失终止密码子以减少对下游开放阅读框的翻译的干扰。
[0160] 如下面所讨论，本发明的来源于鼠PLP/DM20的TR元件不＝指导PIRP-M或PIRP-L肽的翻译。除以上变化之外，也将下列突变引入来自cDNA的DM 20变体的TR元件中：
[0161] 1)核苷酸511由A突变为T以便去除DM20变体中指导PIRP-M蛋白合成的第一框内(in-frame)内部AUG起始密码子来阻止这种合成发生；和
[0162] 2)核苷酸598由A突变为T以去除DM20变体中指导PIRP-L蛋白质合成的第二框内内部AUG起始密码子以便阻止这种合成发生。
[0163] 类似地，将下列突变引入来自cDNA的鼠PLP变体的TR元件中：
[0164] 1)核苷酸616由A突变为T以便去除PLP变体中指导PIRP-M蛋白质合成的第一框内内部AUG起始密码子来阻止这种合成发生；和
[0165] 2)核苷酸703由A突变为T以去除PLP变体中指导PIRP-L蛋白质合成的第二框内内部AUG起始密码子以便阻止这种合成发生。
[0166] 在优选的实施方案中，TR元件选自人或小鼠TR元件。更优选地，TR元件选自鼠序列TRdm(SEQ ID NO:1)和TRplp(SEQ ID NO:2).
[0167] TRdm核酸序列(SEQ ID NO:1)来源于小鼠蛋白脂质蛋白基因1的DM20剪接变体cDNA，但在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598处进行了修饰。此外，编码终止密码子的最后3个核苷酸被去除。
[0168] TRplp核酸序列(SEQ ID NO:2)来源于小鼠蛋白脂质蛋白基因1的PLP剪接变体cDNA，并且它在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703处含有修饰。TRplp与TRdm的不同之处在于存在核苷酸349-453。编码终止密码子的最后3个核苷酸被去除。
[0169] 在一些实施方案中，TR元件来源于人。举例来说(但不限于)，IRES元件来源于人PLP/DM20序列。更优选地，来自人PLP序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID NO:3，而来自人DM20序列的TR元件具有核酸序列SEQ ID NO:4。
[0170] 在一些实施方案中，TR元件包含与参照序列的突变变体相同的核苷酸序列，其中参照序列包含
[0171] A)对应于图26 PLP序列的至少核苷酸1-831并且与其具有至少62％序列同一性的PLP核苷酸序列，或
[0172] B)对应于图26 DM20序列的至少核苷酸1-726并且与其具有至少62％序列同一性的DM20核苷酸序列；并且参照序列包含
[0173] C)在图26 PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、251-257和563-570，或在与其对应位置上的多聚嘧啶束(polypyrimidine tract)，
[0174] D)在图26 PLP核苷酸位置1-3、616-618、703-705和811-813，或在与其对应位置上的ATG序列，
[0175] E)在图26 PLP核苷酸位置130-133、142-145、190-193、220-223和305-308，或在与其对应位置上的GNRA序列，和
[0176] F)在图26 PLP核苷酸位置503-512，或在与其对应位置上的18S rRNA结合位点；其中(G)突变变体
[0177] (1)包含参照序列的突变，所述突变
[0178] (a)消除ATG1、ATG616和ATG703，和
[0179] (b)在图26 PLP核苷酸位置2-4、6-8、16-18和19-21，或在与其对应位置上引入终止密码子序列；和
[0180] (2)保留多聚嘧啶束(C)、GNRA序列(E)和18S rRNA结合位点(F)。在一个优选的实施方案中，(A)或(B)的序列同一性为至少或约70％，并且更优选地为至少或约80％。在另一实施方案中，突变(G1)通过将每一ATG转变为TTG来消除ATG1、ATG616和ATG703。在一个实施方案中，参照序列是脊椎动物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID NO:5)或脊椎动物DM20共有序列，后者包含从其中缺失核苷酸349-453的所述脊椎动物PLP共有序列。在另一实施方案中，参照序列是哺乳动物PLP共有核苷酸序列(SEQ ID NO:10)或哺乳动物DM20共有序列，后者包含从其中缺失核苷酸349-453的所述哺乳动物PLP共有序列。在哺乳动物序列中，对核苷酸使用下列标准缩写：m是a或c、r是a或g、w是a或t、s是c或g、y是c或t、k是g或t、v是a或c或g、h是a或c或t、d是a或g或t、b是c或g或t、x/n是a或c或g或t。
[0181] 在某些实例中，可操作地连接到TR序列的序列元件可能干扰由TR表达盒所展示的选择性翻译活性或表现次佳的翻译活性。为减轻所连接ORF对TR活性的任何影响，本发明提供所公开核苷酸序列的密码子使用变体(codon-usage variant)，其采用不改变所表达多肽的多肽序列(因而不影响其生物活性)的替代密码子。这些变体是基于遗传密码的简并性，借此几种氨基酸由不止一个密码子三联体来编码。一个例子是密码子CGT、CGG、CGC和CGA，其均编码氨基酸精氨酸(R)。因此，一种蛋白质可由精确序列不同但仍编码具有相同氨基酸序列的多肽的变体核酸序列来编码。基于密码子利用/偏好，可对密码子进行选择来优化ORF的翻译效率，而不影响由TR表达盒进行的调节翻译。
[0182] 定点诱变是一种用于通过改变一个或多个所需位置上的核苷酸序列来产生序列变体的特别有用的方法。定点(或位点特异性)诱变使用包含具有所需突变以及足够数目的相邻核苷酸的DNA序列的寡核苷酸序列来提供具有足够尺寸和复杂度的序列以在所提议突变的两侧上形成稳定双链体。通常，优选的是长约20到25个核苷酸的合成引物，其中在序列中所提议突变的两侧上的约5到10个残基被改变。适用于定点诱变的典型载体包括所公开的载体，以及任何商业上或学术上可利用的质粒载体。一般来说，通过使适当的DNA寡核苷酸序列与靶DNA退火并通过本领域中已知的PCR程序扩增靶序列来引入核苷酸取代。本发明涵盖在编码序列中使用每个可能的密码子以用于产生根据本发明使用的所需ORF序列。
[0183] 可使用定向进化技术来制备具有改进TR功能的序列变体。在定向进化技术中，可从含TR的多核苷酸开始，进行至少一轮核酸突变或核酸剪接或同源重组。突变、剪接和同源重组可按定向或随机方式进行。例如，可设计一个或多个寡核苷酸用于如上所述的TR元件的定点诱变，或者可使一个或多个随机产生的寡核苷酸与起始的含TR多核苷酸模板接触。替代地或此外，可在允许误差的条件和/或易错的聚合酶下进行起始模板的PCR扩增以允许引入突变，这种技术称为“错误倾向”PCR("sloppy"PCR)。
[0184] 类似地，可按定向或随机方式对一组同源的含TR元件的多核苷酸进行剪接或重组。例如，可使用一种或多种限制性核酸内切酶来随机地或按预定方式消化同源多核苷酸模板，并接着将所得片段接合在一起。替代地或此外，可在体外或体内，将这组含TR元件的多核苷酸在有助于它们之间的同源重组的条件下合并并处理。特别是，可在数目上组合或扩增对于TR特异性翻译效率较为重要的调节序列，使得产生含有多个拷贝的序列。对此工作，可采用突变和剪接或重组技术的任何组合。这些技术中的任一项可进行一轮或不止一轮。
[0185] 在一轮或多轮突变、剪接和/或重组之后，接着测试所得的多核苷酸以针对TR活性进行筛选。通常，这可通过将报告分子编码序列置于已经产生的一个或多个TR变体的可操作控制之下来进行。接着使所得构建体在置于可发生TR翻译的条件(诸如应激条件)之下的细胞中表达。所述测试可用来检测在TR元件功能方面的所需改进。例如，在TR元件翻译对应激条件的特异性、TR元件激活对细胞应激反应的敏感性(例如，在细胞应激和/或死亡之前的生物化学变化)或在TR元件激活之后翻译起始的效率(即，幅度)的方面中任一方面的改进可以是所述试验的焦点。
[0187] 在本文的各个实施方案中，TR元件可包含或可通过PLP/DM20多核苷酸的突变制得，所述突变包含以下碱基或对应于以下碱基的碱基：图26鼠或人PLP/DM20 DNA序列的约27到约615/510；并且这可进一步包含以下碱基或对应于以下碱基的碱基：约616/511到约
702/597的碱基、约703/598到约772/666的碱基和/或约773/667到约810/705的碱基。例如，TR元件可包含或可通过PLP/DM20多核苷酸的突变制得，所述突变包含约27到约810/705的碱基或对应于碱基约27到约810/705的碱基，其中省略或不省略碱基约616/511到约702/
597，参照图26编号。
702/597的碱基、约703/598到约772/666的碱基和/或约773/667到约810/705的碱基。例如，TR元件可包含或可通过PLP/DM20多核苷酸的突变制得，所述突变包含约27到约810/705的碱基或对应于碱基约27到约810/705的碱基，其中省略或不省略碱基约616/511到约702/
597，参照图26编号。
[0188] 在PLP/DM20编码序列和其TR元件或由其构建的TR元件中，可在对应于参照图26陈述的下列PLP/DM20位置的一个或多个位置上进行突变，但对TR元件功能无不利影响，即位置：01、02、03、04到21(包括此片段全部或一部分缺失)、25、26、314、332、560/455、614/509、622/518到696/591(包括此片段全部或一部分缺失，其去除外显子5)、616/511、703/598、
806/701、811/706、817/712、818/713和827/722。在各个实施方案中，除前述以外的其它核碱基在PLP/DM20编码序列中可为保守的。例如，在各个实施方案中，PLP/DM20编码序列的核碱基序列由此可在对应于PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、
251-257和563-570的核苷酸位置上包含多聚嘧啶基序。在一些实施方案中，这种序列可进一步在PLP位置270-274、299-303、490-494、578-582、597-601中的一个或多个上包含多聚嘧啶基序；而在一些实施方案中，还在PLP位置626-632、642-648、669-674、707-712、755-
761、767-771和800-804中的一个或多个位置上包含多聚嘧啶基序。
806/701、811/706、817/712、818/713和827/722。在各个实施方案中，除前述以外的其它核碱基在PLP/DM20编码序列中可为保守的。例如，在各个实施方案中，PLP/DM20编码序列的核碱基序列由此可在对应于PLP核苷酸位置41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、
251-257和563-570的核苷酸位置上包含多聚嘧啶基序。在一些实施方案中，这种序列可进一步在PLP位置270-274、299-303、490-494、578-582、597-601中的一个或多个上包含多聚嘧啶基序；而在一些实施方案中，还在PLP位置626-632、642-648、669-674、707-712、755-
761、767-771和800-804中的一个或多个位置上包含多聚嘧啶基序。
[0189] 类似地，在各个实施方案中，PLP/DM20编码序列的核碱基序列由此可在对应于PLP核苷酸位置130-133、142-145、190-193、220-223、305-308的核苷酸位置上包含GNRA基序；并且在一些实施方案中进一步在635-638上包含GNRA基序；以及在其它实施方案中，进一步在位置329-332、343-346和572-575中的一个或多个位置上包含GNRA基序；而又在一些实施方案中，进一步在位置650-653和683-686中的一个或多个位置上包含GNRA基序。
[0190] 然而，如上文所述，可在下列位置进行突变而无不利影响并且在一些情况下具有增强作用：01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些实施方案中，这些突变可为以下中的一个或多个：01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a和27t。可进行突变但对功能无不利影响的其它位置包括在以下PLP位置中的一个或多个位置：25、26、314、332、560/455、616/511、703/598、806/701、811/706、817/712、818/713和827/722。在一些实施方案中，这些可为以下中的一个或多个：25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、811/706t、
817/712a、818/713a和827/722g。此外，可在PLP位置614/509上插入例如多达或约5个核苷酸，而对功能无不利影响。此外，与位置831/726的融合，例如报告基因或其它靶基因编码序列与其的框内融合，未表现对TR元件功能的任何不利影响。
817/712a、818/713a和827/722g。此外，可在PLP位置614/509上插入例如多达或约5个核苷酸，而对功能无不利影响。此外，与位置831/726的融合，例如报告基因或其它靶基因编码序列与其的框内融合，未表现对TR元件功能的任何不利影响。
[0191] 在另一实施方案中，本发明的TR元件来源于脊椎动物PLP或DM20序列而非人或小鼠。在一些实施方案中，这可以是灵长类、马、牛、羊、猪、犬、猫、兔、有袋类、鸟类、鱼类、两栖类或爬虫类动物序列。在各个实施方案中，脊椎动物序列可为天然序列，野生型的或是变异的；在一些实施方案中，脊椎动物序列可为野生型序列。
[0192] 本文中关于PLP/DM20序列所使用的“脊椎动物共有序列”指DNA序列SEQ ID NO:5。“脊椎动物特异性序列”指属种智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、猕猴(Macaca mulatta)、食蟹猕猴(Macaca fascicularis)、猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、负鼠(Monodelphis domestica)、兔(Oryctolagus cuniculus)、牛(Bos taurus)、狗(Canis familiaris)、鸡(Gallus gallus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、壁虎(Gekko japonicus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)和腔棘鱼(Latimeria chalumnae)的PLP或DM20序列。在一些实施方案中，脊椎动物特异性序列可包含或编码具有以下基因库编号的氨基酸序列中的任一序列：
P60201(人)、Q5R6E6(猩猩)、XP_001140782(黑猩猩)、XP_001088537(猕猴)、Q8HXW7(食蟹猕猴)、NP_999139(猪)、NP_035253(小鼠)、NP_112252(大鼠)、XP_001374483(负鼠)、P47789(兔)、CAA08909(牛)、39025(狗)、CAA43839(鸡)、P47790(斑胸草雀)、AAW79015(壁虎)、CAA79582(蛙)或BAA84207(腔棘鱼)。
P60201(人)、Q5R6E6(猩猩)、XP_001140782(黑猩猩)、XP_001088537(猕猴)、Q8HXW7(食蟹猕猴)、NP_999139(猪)、NP_035253(小鼠)、NP_112252(大鼠)、XP_001374483(负鼠)、P47789(兔)、CAA08909(牛)、39025(狗)、CAA43839(鸡)、P47790(斑胸草雀)、AAW79015(壁虎)、CAA79582(蛙)或BAA84207(腔棘鱼)。
[0193] 本领域的技术人员通过在http万维网ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez网站上的核苷酸菜单中检索NCBI基因库，可容易获得编码这些的DNA序列。例如，有用的DNA序列包括列在以下基因库登录号之下的那些序列：AJ006976(人)、CR860432(猩猩)、XM_001140782(黑猩猩)、XM_001088537(猕猴)、AB083324(食蟹猕猴)、NM_213974(猪)、NM_011123(小鼠)、NM_030990(大鼠)、XM_001374446(负鼠)、NM_001082328(兔)、AJ009913(牛)、X55317(狗)、X61661(鸡)、NM_001076703(残基113-946，斑胸草雀)、AY880400(壁虎)、Z19522(蛙)和AB025938(腔棘鱼)。
[0194] 本发明的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译。术语在受胁迫和/或垂死细胞中“选择性地翻译”或“选择性翻译”意指在翻译活性的峰值处，例如在用诱导细胞应激和/或死亡的急性毒剂处理之后的约6到约18小时内，在用本发明的TR表达盒转化的任何细胞系的95％以上的细胞中观察到mRNA翻译活性，以及意指本发明表达盒的第一ORF的翻译水平上升到在用所述急性毒剂处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一ORF表达水平的至少50％。例如，在用浓度为5μM的钙离子载体A23187处理之后的约9小时内，本发明表达盒内的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译，其中在用表达盒转化的HEK293细胞系的95％以上的细胞中观察到mRNA翻译，并且表达盒的第一ORF的翻译水平是在处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一ORF的翻译水平的至少50％。在一些实例中，在用浓度为5μM的钙离子载体A23187处理之后的约6到约9小时内，本发明表达盒内的TR元件在受胁迫和/或垂死细胞中表现选择性翻译，其中在用表达盒转化的HEK293细胞系的约96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的细胞中观察到mRNA翻译，并且表达盒的第一ORF的翻译水平是在处理之后由缺乏可操作地连接的TR元件的相同表达盒转录和翻译时同一ORF的翻译水平的约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0195] 在本发明的一些实施方案中，TR元件是plp IRES元件，其不指导PIRP-M或PIRP-L的翻译。在其它实施方案中，TR元件不是来源于plp IRES。
[0196] 在一些实施方案中，哺乳动物细胞用核酸表达盒稳定转化，所述核酸表达盒包含组成型启动子和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。用这种表达盒转化允许鉴定出表现不同翻译谱的所需的哺乳动物细胞亚群。在一个优选的实施方案中，这种细胞亚群表现不同的帽依赖性翻译谱。可使用在哺乳动物细胞中可操作的任何组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子选自由劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、巨细胞病毒即刻早期基因(CMV)启动子、猿猴病毒40早期(SV40E)启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子、腺病毒主要晚期启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子组成的群组。在一些优选的实施方案中，组成型启动子选自由SV40E启动子、CMV启动子和细胞质β-肌动蛋白启动子组成的群组。在更优选的实施方案中，组成型启动子是细胞质β-肌动蛋白启动子。在又一优选实施方案中，组成型启动子是CMV启动子。
[0197] 本发明的核酸表达盒在5'到3'方向上具有以下元件：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。另外，表达盒还可包括以下元件：TR元件5'端的至少一个转录效应子序列；含有本领域中常见的限制性酶位点的侧接TR元件的3'序列；和/或聚腺苷酸化序列。
[0198] 在一些所述实施方案中，本发明的表达盒包含调节基因表达的上游转录效应子序列。在一个实施方案中，转录效应子序列是哺乳动物启动子。此外，转录效应子还可包括额外启动子序列和/或转录调节子，诸如增强子和沉默子或其组合。这些转录效应子序列可包括已知与细胞组分结合的部分，该细胞组分调节任何可操作地连接的编码序列的转录。例如，增强子或沉默子序列可包括与已知细胞组分(诸如转录调节蛋白)结合的序列。转录效应子序列可选自任何适合的核酸，诸如基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何适合的生物体(例如，病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)。基于所利用的转录和/或翻译系统来选择适当的转录效应子序列在本领域的技能范围之内。任何个别调节序列都可按野生型排列(如按天然基因组的顺序存在)或按人工排列来排列在转录效应子元件内。例如，经过修饰的增强子或启动子序列可包括调节序列的重复单元使得来自载体的转录活性通过这些变化而修饰。
[0199] 在一个实施方案中，含TR的表达盒中所使用的启动子选自组成型、组织特异性和肿瘤特异性启动子。组成型启动子可选自例如劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子、巨细胞病毒即刻早期基因(CMV)启动子、猿猴病毒40早期(SV40E)启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子、腺病毒主要晚期启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一个优选实施方案中，组成型启动子是CMV启动子。在另一优选实施方案中，组成型启动子是SV40E启动子。
[0200] 组织特异性启动子可选自例如转铁蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌肌酸激酶(CKM)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和突触蛋白I(SYN1)启动子。在一优选实施方案中，组织特异性启动子是突触蛋白I(SYN1)启动子。在另一优选实施方案中，组织特异性启动子是ALB启动子。
[0201] 肿瘤特异性启动子包括但不限于用于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(即，KDR、E-选择素或endoglin)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2(v-erb-b2成红细胞白血病病毒同源癌基因2)、骨钙素(骨γ-羧基谷氨酸蛋白；BGLAP)、SLP1(分泌性白细胞蛋白酶抑制剂或抗白细胞蛋白酶1)、低氧反应元件(HRE)、L-plastin(淋巴细胞胞浆蛋白1)和己糖激酶II(HK2)的启动子。在一个优选实施方案中，肿瘤特异性启动子是α-甲胎蛋白(AFP)启动子。在另一优选实施方案中，肿瘤特异性启动子是SLP1启动子。
[0202] 在一些实施方案中，分离特异性转录效应子元件并且然后可操作地连接到最小启动子以产生转录活性依赖于单一类型或有限类型细胞反应(例如，热休克反应或金属调节元件)的表达盒。
[0203] 在附加的实施方案中，表达盒可包含物种特异性转录调节序列。这种DNA调节序列可基于表达盒将会插入其中的细胞类型来选择，并且可从原核或真核细胞(包括但不限于细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞)分离或从病毒分离。在此类例子中，将选择哺乳动物启动子以在哺乳动物细胞中表达所选的核酸。
[0204] 用于报告蛋白的开放阅读框序列置于表达盒中TR元件或组成型启动子的3'端。用于报告蛋白的核酸序列可为全基因组序列(例如，包括内含子)、合成核酸或编码报告蛋白的基因的cDNA拷贝。在一个优选实施方案中，报告蛋白的cDNA序列由于通过去除mRNA剪接位点使基因组复杂度降低而用于本发明的目的。
[0205] 如本文所述，报告基因编码赋予细胞可检测的生物化学或可视觉观察的(例如，荧光)表型的产物。报告蛋白还可包括融合或杂合多肽，其中另一多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端融合。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其一部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其一部分)一起在框内克隆来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括接合编码多肽的编码序列使得它们是框内的，并且融合多肽的翻译处在TR盒的控制之下或它的转录处在组成型启动子的控制之下。例如，将plp ORF与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)ORF一起在框内克隆产生融合蛋白，其被用于监测所述融合蛋白在培养细胞中的表达、亚细胞定位和生物效应(Ghandour S等Glia(2002)40(3):300-11；Boucher S等J Neurosci(2002)22(5):1772-83)。
[0206] 一种常用类型的报告基因编码酶或其它生物化学标志物，其在哺乳动物细胞中表达时引起细胞或细胞环境中的可视变化。这种变化可被直接观察，可涉及添加被转化成可检测产物的适当底物，或者涉及代谢示踪剂的添加和结合。这些报告基因的例子有编码β-半乳糖苷酶(β-gal)的细菌lacZ基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧火虫荧光素酶(鞘翅目甲虫)、海肾荧光素酶(海肾)、Gaussia荧光素酶、单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV1-TK)和突变的单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV1-sr39tk)基因。在β-gal的情况下，用卤素衍生化半乳糖孵育表达细胞产生可用组织化学方法或荧光法检测和定量的着色或荧光产物。在CAT的情况下，用放射性标记的氯霉素或另一乙酰基供体分子诸如乙酰辅酶A孵育细胞裂解物，并用色谱分析法测定乙酰化的氯霉素产物。其它有用的报告基因编码天然发荧光的蛋白质，包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)或单体红色荧光蛋白(mRFP1)。
[0207] 如以上可见，示例性报告基因可选自荧光素酶、GFP、EYFP、mRFP1、β-Gal和CAT，但也可使用本领域中已知的任何其它的报告基因。在一个优选的实施方案中，报告基因是荧火虫荧光素酶。在另一优选的实施方案中，报告基因是海肾荧光素酶。在又一优选的实施方案中，报告基因是Gaussia荧光素酶。
[0208] 可用于本发明中的另一报告蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)，它是一种将激素或配体结合转变为细胞内信号的整合膜蛋白。在所有动物、昆虫和植物中都发现有GPCR。GPCR信号转导在调节多种生理功能(包括光转导、嗅觉、神经传递、血管张力、心输出量、消化、疼痛和体液与电解质平衡)中起作用。尽管GPCR参与多种生理功能，但它们共享许多共同的结构特点。它们含有七个膜域，其通过交替的胞内环与胞外环和可变长度的胞内羧基末端尾来桥接。GPCR的羧基末端尾开始于跨膜7之后，并且在许多GPCR中，它在紧接标志第七个跨膜域的末端的保守NPXXY基序之后开始。羧基末端尾可较长(大约数几十到几百个氨基酸)、较短(大约几十个氨基酸)或几乎不存在(少于大约十个氨基酸)。它还可含有(多个)棕榈酰化的半胱氨酸残基。
[0209] 任何G蛋白偶联受体(GPCR)都可用于本发明的方法中，诸如已知的GPCR、未知的或孤儿GPCR，和嵌合的或修饰的GPCR，但优选是对其存在已知配体或针对受体的抗体的GPCR。
[0210] 可与本发明一起使用的已知GPCR的非限制性列表示出在表1。
[0211] 表1
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217] 修饰的GPCR包括在羧基末端尾中具有一个或多个修饰、在(多个)胞内环中具有修饰和/或在跨膜区的细胞质端中具有修饰的GPCR。
[0218] GPCR受体可根据经典分类方法基于结构相似性和配体来分组。举例来说，针对已知受体已经鉴定出三种主要类型的GPCR：A类受体、B类受体和具有几乎不存在的羧基末端尾的受体。受体可基于它们在HEK-293细胞中对于大鼠β-抑制蛋白-2的具有亲和性的相互作用来分类，并且可基于在它们羧基末端尾中的氨基酸残基和它们羧基末端尾的长度来预测。B类受体是具有一个或多个适当位于其羧基末端尾中的磷酸化位点(例如，磷酸化位点簇)，使得它在HEK-293细胞中在如第5,891,646号美国专利、Oakley,等(Journal of Biological Chemistry,275卷,No.22,17201 17210页,2000年6月2日)和Oakley等,(Journal of Biological Chemistry,276卷,No.22,19452 19460页,2001)中所述的条件下将大鼠β-抑制蛋白-2募集到核内体的GPCR。A类受体是不具有一个或多个适当位于其羧基末端尾中的磷酸化位点(例如，成磷酸化位点簇)使得它在HEK-293细胞中在如上对于B类受体所述的条件下不会将大鼠β-抑制蛋白2募集到核内体的GPCR。具有几乎不存在的羧基末端尾的受体包括例如嗅觉受体和味觉受体。
[0219] 可用来进行本发明方法的已知GPCR的说明性、非限制性列表如下所示。A类G蛋白偶联受体包括但不限于：A1腺苷受体(登录号AAB25533)、肾上腺素能受体α1B(登录号NP_000670)、肾上腺素能受体α2A(登录号AAG00447)、肾上腺素能受体α2B(登录号A37223)、肾上腺素能受体α2C(登录号A31237)、肾上腺素能受体β1(登录号NP_000675)、肾上腺素能受体β2(登录号P07550)、多巴胺受体D1(登录号NP_000785)、多巴胺受体D2(登录号P14416)、多巴胺受体D3(登录号G01977)、多巴胺受体D4(登录号DYHUD4)、多巴胺受体D5(登录号DYHUD5)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M1(登录号NP_000729)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M2(登录号NP_
000730)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3(登录号NP_000731)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M4(登录号NP_
000732)、毒蕈碱受体M5(登录号AAA51569)、5-羟色胺(血清素)受体1A(登录号BAA90449)、
5-羟色胺(血清素)受体1B(登录号BAA94455)、5-羟色胺(血清素)受体1E(登录号
BAA94458)、嗅觉受体6A1(登录号O9522)、嗅觉受体2C1(登录号O95371)、甘丙肽受体3(登录号10879541)、edg-1(登录号A35300)、中枢大麻素受体(登录号NP-057167)、δ阿片受体(登录号I38532)和蛋白酶激活受体2[PAR-2](登录号P55085)。B类G蛋白偶联受体包括但不限于：血管紧张素受体1(登录号NP_033611)、血管紧张素受体2(登录号NP_000677)、白介素8受体β[CXCR2](登录号NM_001557)、CX3C趋化因子受体1[CX3CR1](登录号P49238)、神经降压素受体(登录号S29506)、物质P受体[SPR，NK-1受体](登录号P25103)、血管加压素2型受体(登录号AAD16444)、促甲状腺素释放激素受体(登录号JN0708)、催产素受体(登录号A55493)、神经介素U受体(登录号AAG24793)、胃泌素受体(登录号AAC37528)和血管加压肠肽受体[VIPR](登录号NM_012685)。
000730)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3(登录号NP_000731)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M4(登录号NP_
000732)、毒蕈碱受体M5(登录号AAA51569)、5-羟色胺(血清素)受体1A(登录号BAA90449)、
5-羟色胺(血清素)受体1B(登录号BAA94455)、5-羟色胺(血清素)受体1E(登录号
BAA94458)、嗅觉受体6A1(登录号O9522)、嗅觉受体2C1(登录号O95371)、甘丙肽受体3(登录号10879541)、edg-1(登录号A35300)、中枢大麻素受体(登录号NP-057167)、δ阿片受体(登录号I38532)和蛋白酶激活受体2[PAR-2](登录号P55085)。B类G蛋白偶联受体包括但不限于：血管紧张素受体1(登录号NP_033611)、血管紧张素受体2(登录号NP_000677)、白介素8受体β[CXCR2](登录号NM_001557)、CX3C趋化因子受体1[CX3CR1](登录号P49238)、神经降压素受体(登录号S29506)、物质P受体[SPR，NK-1受体](登录号P25103)、血管加压素2型受体(登录号AAD16444)、促甲状腺素释放激素受体(登录号JN0708)、催产素受体(登录号A55493)、神经介素U受体(登录号AAG24793)、胃泌素受体(登录号AAC37528)和血管加压肠肽受体[VIPR](登录号NM_012685)。
[0220] 本发明的修饰GPCR包括已经在DRY基序中进行修饰来以激动剂非依赖性方式位于胞吞泡或核内体的GPCR。本发明的修饰GPCR的多肽序列包括具有一个或多个添加、缺失、取代或突变的序列。这些突变可为按保守方式(即，通过将来自属于具有特定大小或特性的氨基酸分组的氨基酸的密码子改变为属于同一分组的氨基酸)进行的取代突变。这种保守的变化一般导致所得蛋白质结构和功能的较少变化。本发明包括含有不显著改变所得蛋白质活性或结合特性的保守变化的序列。它还包括含有不显著改变所得蛋白质活性或结合特性的非保守变化的序列。
[0221] GPCR可经过修饰而包含一个或多个适当位于它们羧基末端尾中或正确定位在氨基酸序列中其它位置上(例如，在第三胞内环中)的磷酸化位点(例如，磷酸化位点簇)。此修饰允许改变的GPCR与将要内在化到核内体中的抑制蛋白形成稳定的复合体。
[0222] 本发明的修饰GPCR还可包括在它们羧基末端尾中包含一个或多个修饰的GPCR。许多GPCR的羧基末端尾都在紧接标志第七个跨膜域的末端的保守NPXXY基序之后开始。许多GPCR的羧基末端尾都包含在NPXXY基序下游大约10到25个氨基酸残基(例如15到20个氨基酸残基)的假定棕榈酰化位点。
[0223] 本领域的技术人员将容易地认识到，任何聚腺苷酸化(polyA)信号都可并入本文所描述的含TR或含组成型启动子的表达盒的3'非翻译区(3'UTR)中。适用于本发明的polyA序列的例子包括SV40早期与晚期基因、HSV-TK和人生长激素(hGH)序列。在一个优选的实施方案中，polyA序列是SV40早期基因序列。
[0224] 在其它实施方案中，本发明表达盒的3'UTR可包含一个或多个通过改变mRNA稳定性来调节基因表达的元件。通常，mRNA衰变由mRNA polyA尾的丧失、脱腺苷酸化RNA向外来体的募集和核糖核酸酶(RNAse)降解来示例。在选定mRNA中，此过程通过促进细胞降解系统对mRNA的选择性识别的特定RNA不稳定元件来促进。在本发明中，表达盒mRNA可含有这样的元件，诸如来源于编码细胞反应/恢复基因的mRNA种类的3'UTR AU富含元件("ARE")序列。
[0225] 可用于本发明的ARE序列的例子包括来自c-fos、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、c-jun、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-8mRNA的3'UTR序列。在一个优选的实施方案中，使用来自c-fos基因的ARE序列。
[0226] 本发明的核酸表达盒还可包含5'非翻译区(5'UTR)，其位于启动子的3'端和TR元件的5'端。在一些实施方案中，此区包含mRNA转录起始位点。在其它实施方案中，5'非翻译区包含内含子序列，其指导mRNA剪接并且是一些mRNA种类在体内的高效加工所必须的。在在真核细胞中mRNA剪接的一般机制被定义并概括于Sharp(Science 235:736-771(1987))中。有四种核酸序列是mRNA剪接所必需的：5'剪接供体、分支点、多聚嘧啶束和3'剪接受体。共有5'和3'剪接结点(Mount,Nucl.Acids.Res.10:459-472(1992)和分支位点序列(Zhuang等,PNAS 86:2752-2756(1989))在本领域中是已知的。
[0227] 在一些实施方案中，5'UTR序列包含存在于天然基因序列中的天然内含子，或人工内含子，诸如存在于pAAV-MCS载体(Stratagene)中的人β-球蛋白-免疫球蛋白序列。
[0228] 另外，本发明的表达盒可包含以下中的一项或多项：
[0229] 位于启动子5'端的介于约15到50个核苷酸之间的序列，其包含一个或多个限制性位点用于将表达盒插入质粒、穿梭载体或病毒载体中；
[0230] 位于TR元件或组成型启动子3'端和报告序列5'端的介于约15到50个核苷酸之间的序列，其包含一个或多个限制性位点用于TR元件或组成型启动子和报告序列的插入和可操作连接；
[0231] 位于报告序列3'端和聚腺苷酸化信号5'端的介于约15到50个核苷酸之间的序列，其包含一个或多个限制性位点用于ORF序列和聚腺苷酸化序列的插入和可操作连接；和[0232] 位于聚腺苷酸化序列3'端的介于约15到50个核苷酸之间的序列，其包含一个或多个限制性位点用于将核酸表达盒插入质粒、穿梭载体或病毒载体中。
[0233] 取决于用来复制表达盒的宿主细胞，本文描述的核酸表达盒可插入质粒或病毒(“穿梭”)载体中。一般来说，使用本领域中已知的技术将本发明的DNA表达盒插入所公开载体中的适当限制性核酸内切酶位点中。适用于此目的的众多载体是广为人知的(Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis和Anderson,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev和Anderson,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991；Cornetta等,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等,Biotechniques 7:
980-990,1989；Le Gal La Salle等,Science 259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:
77S-83S,1995)。
980-990,1989；Le Gal La Salle等,Science 259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:
77S-83S,1995)。
[0234] 部分地基于用质粒待转化的宿主细胞来选择质粒载体。例如，存在于质粒中的细菌或哺乳动物的选择标记的存在、复制起点、质粒拷贝数、指导与染色体DNA的随机或位点特异性重组的能力等会影响适当载体的选择。在一些实施方案中，采用细菌质粒(诸如pBluescript II、pET14、pUC19、pCMV-MCS和pCMVneo)在细菌细胞中使本发明的表达盒增殖。在一个优选的实施方案中，质粒是pCMVneo载体。在另一优选的实施方案中，质粒是pBluescript II载体。
[0235] 在另一实施方案中，本发明的表达盒插入哺乳动物或病毒穿梭载体中。哺乳动物穿梭载体含有哺乳动物选择标记并提供含有稳定基因组要素的细胞的分离，而病毒穿梭载体提供使用重组或遗传互补进行的病毒基因组的重构。在一些实施方案中，哺乳动物穿梭载体选自pCMV、pEYFP-N1、pEGFP-N1或pEGFP-C1质粒。在一个优选的实施方案中，哺乳动物穿梭载体是pEYFP-N1。在一些实施方案中，病毒穿梭载体选自pAAV-MCS(腺伴随病毒血清型2或AAV2基因组)或pBac-1、pBacPAK8/9(苜蓿银纹夜蛾杆状病毒基因组)质粒。在一个优选的实施方案中，病毒穿梭载体是pAAV-MCS。在另一优选的实施方案中，病毒穿梭载体是pBac-1质粒。
[0236] 为确保表达盒向特定细胞、组织或器官的有效传递，可将它并入非病毒传递系统中，这利于细胞靶向。例如，可将包含本发明表达盒的哺乳动物穿梭质粒封装到脂质体中。脂质体包括乳剂、泡沫剂、微胶粒、不溶性单层、液晶、磷脂分散物、层状层(lamellar layer)等等。使用脂质体载体进行的DNA序列向靶细胞的传递在本领域中众所周知，用于制备这些脂质体的方法也是一样。
[0237] 适用于实践本发明的病毒包括重组修饰的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，优选地选自杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、小核糖核酸病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herpesviridiae)、痘病毒科(poxviridiae)和腺病毒科(adenoviridiae)病毒。在一些实施方案中，重组病毒是杆状病毒科病毒。在一个优选的实施方案中，杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾衍生病毒。在其它实施方案中，病毒是细小病毒科病毒。在一个优选的实施方案中，腺伴随病毒("AAV")是AAV血清型2。在另一实施方案中，AAV是AAV血清型1。
[0238] 病毒基因组优选通过重组DNA技术来修饰以包含本发明的表达盒，并且可被改造成复制缺陷型、条件复制型或复制竞争型。例如，使用条件复制型病毒来限制对于特定、受调节细胞培养条件的病毒复制可证明是有用的。
[0239] 本文包括利用具有不止一种“亲代”病毒性质的有利元件的嵌合病毒载体。也可产生其中病毒骨架仅含有病毒载体包装所需要的序列并且任选地包含表达盒的最小载体系统并用于本发明中。一般优选采用来自待治疗物种的病毒，诸如在用它转导人细胞或人细胞系时的人疱疹病毒。在一些实例中，可使用源自于待用其转导的物种之外的物种的病毒。例如，来源于非人来源的血清型的腺伴随病毒(AAV)可适用于治疗人，因为非人血清型应不被天然的或已存在的人抗体立即识别。通过将对载体的免疫反应最小化，避免载体的快速全身清除并且增加载体在体内的有效性的持续时间。
[0240] 可将上述任一哺乳动物穿梭载体中的含TR或含组成型启动子的表达盒可转化到哺乳动物细胞中。可通过本领域的技术人员可用的任何技术将穿梭载体引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于化学转染(例如，氯化钙法，磷酸钙法)、脂质转染、电穿孔、细胞融合、显微注射和用病毒感染(Ridgway,A.“Mammalian Expression Vectors”第24章，第470-
472页,Rodriguez和Denhardt编著.,Butterworhs,Boston MA 1988)。
472页,Rodriguez和Denhardt编著.,Butterworhs,Boston MA 1988)。
[0241] 哺乳动物细胞可以是从动物(即，原代细胞)或哺乳动物细胞系分离的哺乳动物细胞。用于从动物分离细胞的方法在本领域中众所周知。在一些实施方案中，原代细胞分离自小鼠。在其它实施方案中，原代细胞分离自人。而在其它实施方案中，可使用哺乳动物细胞系。示例性细胞系包括HEK293(人胚肾)、HT1080(人纤维肉瘤)、NTera2D(人胚性畸胎瘤)、HeLa(人宫颈腺癌)、Caco2(人结肠腺癌)、HepG2(人肝细胞癌)、HCT116(人结肠肿瘤)、MDA231(人乳腺癌)、U2 OS(人骨骼骨肉瘤)、DU145(人前列腺癌)、LNCaP(人前列腺腺癌)、LoVo(人结肠癌)、MiaPaCa2(人胰腺癌)、AsPC1(人胰腺腺癌)、MCF-7(人乳腺癌)、PC3、Capan-2(人胰腺腺癌)、COLO201(人结肠癌)、COLO205(人结肠肿瘤)、H4(人大脑神经胶质瘤)、HuTu80(人十二指肠腺癌)、HT1080(人结缔组织纤维肉瘤)和SK-N-MC(人大脑神经上皮瘤)。
[0242] 宿主细胞系通常可从例如美国组织培养收藏中心(ATCC)、任何获批准的布达佩斯条约地点或其它生物保存场所获得。
[0243] 而在其它实施方案中，可使用哺乳动物胚胎干(ES)细胞，诸如小鼠ES细胞mES-D3。
[0244] 干细胞也可应用于本发明的方法中。多能(Pluripotent)、成体、胚泡来源、性腺、畸胎瘤来源、全能、专能(multipotent)、胚胎(ES)、胚胎生殖(EG)、诱导多能干细胞(iPS)、脐带血和胚胎癌(EC)细胞都是用于这些方法中的干细胞的例子。诸如肿瘤来源的干细胞的癌干细胞也可用于本发明的方法中。
[0245] 多能干细胞可由任何动物(诸如任何哺乳动物)的胎儿材料产生。不过，在一个实施方案中，哺乳动物是啮齿动物，诸如小鼠、豚鼠或大鼠。在优选的实施方案中，小鼠ES细胞是mES-D3。胎儿材料可来自家畜，诸如牛、马、猪、绵羊、山羊等。胎儿材料也可来自灵长类动物。多能干细胞系已经报道于(例如，但不限于)鸡(Pain,B.等,(1996)Development(Cambridge,U.K.)122,2339-2348)、貂(Sukoyan,M.A.等,(1993)Mol.Reprod.Dev.36,148-158)、仓鼠(Doetschman,T.等,(1988)Dev.Biol.127,224-227)、猪(Wheeler,M.B.(1994)Reprod.Fertil.Dev.6,563-568；Shim,H.等,(1997)Biol.Reprod.57,1089-1095)、猕猴(Thomson,J.A.等,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,7844-7848)和普通狨猴(Thomson,J.A.等,(1996)Biol.Reprod.55,254-259)。干细胞系的衍生在以上段落中所引用的参考文献中有所描述。
[0246] 干细胞表现多种独特性质和多种类型的性质。例如，在一些形式中，干细胞系能够在未分化状态持续离体增殖(>1年)。干细胞还能在增殖和/或分化的同时维持正常的核型(karyotype)。干细胞还可表现在生物体中形成任何细胞类型的能力(即，全能特征)。其它干细胞保留分化成中胚层、内胚层和外胚层组织(包括生殖细胞、卵子和精子)的能力。一些干细胞可在某些生长条件下形成胚状体(EB)，诸如不维持未分化状态的培养条件。另外，干细胞经常可通过与胚泡融合来形成嵌合体，这正是产生转基因动物所需要的。
[0247] 除了保持在未分化状态外，还可通过改变生长条件以诱导分化成特定细胞类型(称为“定向分化”)来操纵ES细胞。例如，可通过分子(诸如药物、前药、肽和核酸)将多能干细胞引导向特定谱系，所述分子1)激活调节分化的内源转录程序；2)引入广泛地表达分化特异性转录因子的外源核酸；3)利用含有诱导分化的生长因子/调节分子的培养基提供细胞培养物；或4)允许干细胞与能够进行谱系诱导的细胞类型的共培养。上面描述了许多外胚层衍生物(ED)指导的分化方法，并且可用于本发明的方法中。
[0248] 可使用遗传操纵来改变干细胞的性质。修饰干细胞是具有不同于细胞的原始基因型的遗传背景的干细胞。例如，修饰干细胞可以是表达来自染色体外或整合的DNA序列的蛋白序列的干细胞。可使用对显性选择标记的选择来改变干细胞的性质。例如，使用编码抗生素抗性基因的载体的转化/转导可用来选择能经受住抗生素应用的细胞群。表达所述标记基因的细胞还可整合顺式连接的转基因(诸如TR盒)使得这些转基因被稳定并入基因组中。本领域中存在多种方法来制备基因改造干细胞的细胞系。本发明的一种应用是采用能够表达所述TR盒的基因改造干细胞系用于基于细胞的毒理学试验的方法。在一个实施方案中，TR盒从CMV启动子编码报告基因(诸如荧火虫荧光素酶)，从而提供用于细胞应激与死亡的组成型测定的方法。在另一实施方案中，TR盒从EGR-1启动子编码报告基因(诸如荧火虫荧光素酶)，从而提供用于检测随早期应激反应变化的细胞死亡的方法。可以预料，熟练的技术人员能够设计出基于测定和/或诱导细胞死亡的特定需要或过程来测定转基因干细胞中细胞死亡的类似方法。举例来说，本领域中描述了许多用于离体产生干细胞定向分化的方法。这些方法中的一些在随后章节中概述。外胚层衍生物细胞的形成在自发分化干细胞中是常见的并且一般被认为是默认的发育途径。可选择性地促进神经外胚层命运以产生神经祖细胞和分化的神经细胞类型(例如神经元、星形神经胶质和少突神经胶质)(Carpenter M K,等2001)。可使用FGF(例如FGF2)和表皮生长因子(EGF)，随后补充视黄酸(RA)来由干细胞系产生少突胶质细胞。这些少突胶质细胞前体能够使神经元成熟和再髓鞘化(Nistor G I,等2005)。替代性的多步骤方法可通过在RA和FGF-2、接着在RA和音猬因子(SHH)、最后在脑源性神经生长因子(BDNF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、胰岛素样生长因子-1(IGF1)和低水平SHH中培养干细胞，来产生多巴胺能神经元(Park S,等2004；Perrier A L,等2004)和运动神经元。
[0249] 相比之下，用骨形态发生蛋白(BMP)(一种拮抗剂Noggin)处理干细胞培养物产生具有平坦上皮形态和胚外内胚层特有的基因表达模式的干细胞，即一种通常与发育中的胚胎中的卵黄囊和胎盘相关的细胞类型。因此，在无血清培养基中用BMP4持续培养干细胞将会产生表达与滋养层或胎盘发育相关的基因(例如，MSX2)和蛋白质(例如，人绒膜促性腺激素)的平坦上皮细胞。
[0250] 类似地，干细胞与表达基质细胞来源的诱导活性(SDIA)的小鼠骨髓间充质PA6细胞系的共培养将会产生呈酪氨酸羟化酶阳性(TH+)并表达nurr1与LMX1b基因的中脑神经元的混合物(Kawasaki H,等2002；Mizuseki K,等2003)，以及视网膜色素上皮细胞。对利用BMP4的培养条件的进一步操纵诱导神经嵴细胞和最背部(dorsal-most)中枢神经系统细胞的形成。对SHH的抑制促进运动神经元的形成(Trounson A.2004)。当与小鼠骨髓间充质细胞系(例如，MS5和S2细胞)一起生长时干细胞也可被引导成为中脑多巴胺神经元，其中响应于FGF-8、SHH、抗坏血酸/维生素C和BDNF，存在Pax2、Pax5和engrailed-1转录因子的连续表达(Perrier A L,等2004)。
[0251] 部分分化的神经上皮衍生物暴露于FGF-8和SHH促进具有前脑表型的多巴胺能神经元的产生；然而，在神经上皮特异化期间早期暴露于FGF-8促进中脑表型和导致产生中脑多巴胺能神经元的分化途径。因此，FGF-8与SHH的施用顺序可决定神经元的命运。
[0252] 也已经使用共培养方法来由干细胞产生分化的心肌细胞。与小鼠内脏内胚层END-2型细胞一起生长的干细胞的培养物中15-20％形成跳动的心肌集落(例如，心肌细胞)(Mummery C,等2002；Mummery C,等2003)。来源于干细胞的跳动心肌细胞表达心肌细胞标志物，包括α肌球蛋白重链、心肌肌钙蛋白和心房利钠因子以及心肌细胞特有的转录因子(例如GATA4和MEF3)(Kehat I,等2001；Xu C,等2002)。这些细胞对药理性药物作出反应并表现在人胎儿左心室心肌细胞中最常观察到的心肌细胞动作电位，这可容易地与小鼠心肌细胞相区分(Mummery C,等2003；He J Q,等2003)。在分化中的干细胞培养物中还可形成心房与起搏样细胞。这些干细胞来源的心肌细胞通常整合进移植的啮齿动物和猪心肌中，在干细胞肌细胞与受体小鼠成体心肌细胞之间形成正常的间隙连接(Xue T,等2005；Kehat I,等2004；Hassink R J,等2003)。
[0253] 表达表面活性蛋白C(SPC)(一种呼吸道特异性标志物)的II型肺细胞可通过干细胞与小鼠胚胎前肠间充质的共培养来产生(Denham M,等2002)。当分化为胚状体或在1型胶原上生长时干细胞也可被诱导形成气道上皮组织，接着所得Clara细胞在气-液界面中生长形成假复层表面上皮(Coraux C,等2005)。
[0254] 角质形成细胞可通过再接种胚状体而来源于干细胞(Green H,等2003)。在继代培养物的外周中表达转录因子p63的细胞鉴定产生更成熟细胞类型的角质形成细胞祖细胞，在所述更成熟细胞类型中检测到细胞角蛋白14和碱性核蛋白。这些细胞可形成终分化的复层上皮，但与从新生儿或成人皮肤分离的角质形成细胞上皮不同。
[0255] 利用造血细胞因子与BMP-4的混合物，胚状体(EB)也可用来产生造血祖细胞(Kaufman D S,2001,Chadwick K,等2003)。EB通过从ES细胞培养物中分离出白血病抑制因子(LIF)来形成，并且表现为细胞团或球状多细胞聚集体。生长因子，诸如干细胞因子(SCF)、白介素-3与-6(IL-3、IL-6)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、Flt-3配体以及血管内皮生长因子(VEGF-A)(Cerdan C,等2004)在EB发育期间加强造血细胞命运和谱系提交。这些祖细胞在免疫上类似于背主动脉的造血祖细胞。
[0256] 在暴露于活化素A以后可在干细胞培养物中检测到内胚层细胞(Kubo A,等2004)。胰岛素产生细胞可通过使用Lumelsky等(Lumelsky N,等2001)的方法使神经外胚层细胞分化来形成。类似地，Segev等(Segev H,等2004)通过在含有胰岛素、转铁蛋白、硒和纤连蛋白的培养基中培养胚状体产生了岛样细胞团。使解聚集的培养物在含有FGF-2的培养基中形成细胞团并接着在悬浮培养物中暴露于含低葡萄糖的烟酰胺。类似于未成熟胰腺细胞，大部分细胞团表达了胰岛素、胰高糖素和生长抑素。对葡萄糖和其它拮抗剂的反应性表明这些细胞是非成熟的类似于胎儿的(fetal-like)胰腺β-岛细胞。
[0257] Rambhatla等(2003)报道了干细胞分化为表达肝细胞标志物(白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白8和18)并累积糖原的细胞。用丁酸钠处理胚状体或者先后用二甲基亚砜和丁酸钠处理粘附性干细胞培养物导致产生肝前体(hepatic-like)内胚层细胞(Lavon N,等2004)。可使用在分化的粘附性干细胞培养物中的细胞形态来对表达胎儿肝脏标志物的内胚层细胞群进行选择(Stamp L A,等2003)。
[0258] 如上所述，本发明利用本文所描述的表达盒来鉴定具有独特核糖体谱的哺乳动物细胞亚群。本发明的一个方面是意外发现，用本发明表达盒稳定转化的哺乳动物细胞可基于蛋白质翻译的水平而划分为三个类别。将三个细胞类别任意命名为I类、II类和III类细胞，并且可如下分类。经至少一种毒素处理后，I类细胞的特征在于报告蛋白的水平大于参照标准中报告蛋白水平高达500％，其中参照标准代表用核酸表达盒稳定转化而未用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白的水平。类似地，II类细胞的特征在于报告蛋白的水平大于参照标准中报告蛋白水平的500％以上但不超过1400％，而III类细胞的特征在于报告蛋白的水平大于参照标准中报告蛋白水平的1400％以上。在一个优选的实施方案中，III类细胞的特征在于报告蛋白的水平大于参照标准中报告蛋白水平的1400％以上但不超过75000％。
[0259] 本领域中通常采用两种方法来建立、表征和储存表达细胞。第一种方法涉及被转化耐药细胞的整个群的建立、收集和储存，其中每个细胞包含赋予耐药性的转基因的至少一个整合事件，称之为“细胞池”。第二种方法涉及来源于单个耐药细胞的个别细胞集落/克隆的分离，针对所需性状进行筛选和储存为细胞原液，称之为“细胞系”。
[0260] 相比于提供具有广泛基因表达水平的耐药细胞的混合群的第一种方法，第二种方法要求从数百个分离的细胞集落中选择独特克隆以鉴定在所需水平上表达所需基因产物的一组选定集落。一旦鉴定出这些细胞，就对它们进行扩增，并保持在细胞培养物中或者冷冻备用。
[0261] 因此，在用于鉴定所需的哺乳动物细胞亚群的方法中，用核酸表达盒稳定转化的细胞可包含细胞池或细胞系，其中细胞系是通过对来自细胞池的个别细胞进行亚克隆来获得。接下来用至少一种毒素处理细胞。由于毒素对细胞是破坏性的和/或致命的，所以将稳定转化细胞的亚组用于毒性测试，而剩余的细胞保持在培养物中或者冷冻备用。因此，所述细胞亚组一般可用一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种或十五种个别毒素或毒素的任何组合进行处理。在一些实施方案中，用一种毒素处理细胞。在其它实施方案中，用两种毒素处理细胞。而在其它实施方案中，用三种毒素或用五种毒素处理细胞。任何毒素，诸如植物毒素、动物毒素或合成毒素都可用于本发明的目的。举例来说，但非限制性地，所述毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇(paclitaxel)(泰素(Taxol))、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑(nocodazole)、长春花碱、钙离子载体A23187、硼替佐米(bortezomib)(万珂(Velcade))、和美新(hycamtin)(拓扑替康(Topotecan))、秋水仙碱、4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、乙醇和甲醇组成的组。在一些实施方案中，毒素选自由cAMP、TPA、泰素、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、硼替佐米、和美新、秋水仙碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素组成的组。
[0262] 当使用至少两种毒素时，可使用毒素的任何组合。本领域的技术人员可基于它们的作用机制来容易地确定哪些毒素组合可能特别有用。下面详述两种毒素、三种毒素和五种毒素的示例性组合。举例来说，两种毒素的组合包括但不限于cAMP和TPA；cAMP和紫杉醇、cAMP和毒胡萝卜素、cAMP和诺考达唑、cAMP和长春花碱、cAMP和秋水仙碱、cAMP和MG132、cAMP和硼替佐米(万珂)、cAMP和钙离子载体A23187、cAMP和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、cAMP与和美新；TPA和紫杉醇、TPA和毒胡萝卜素、TPA和诺考达唑、TPA和长春花碱；TPA和秋水仙碱、TPA和MG132、TPA和硼替佐米、TPA和钙离子载体A23187、TPA和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、TPA与和美新；紫杉醇和毒胡萝卜素；紫杉醇和诺考达唑；紫杉醇和长春花碱；紫杉醇和秋水仙碱、紫杉醇和MG132、紫杉醇和硼替佐米、紫杉醇和钙离子载体A23187、紫杉醇和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、紫杉醇与和美新；MG132和毒胡萝卜素；MG132和诺考达唑；
MG132和长春花碱；MG132和秋水仙碱；MG132和硼替佐米、MG132和钙离子载体A23187、MG132和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、MG132与和美新；毒胡萝卜素和诺考达唑、毒胡萝卜素和长春花碱；毒胡萝卜素和秋水仙碱、毒胡萝卜素和硼替佐米、毒胡萝卜素和钙离子载体A23187、毒胡萝卜素和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、毒胡萝卜素与和美新；诺考达唑和长春花碱；诺考达唑和秋水仙碱、诺考达唑和钙离子载体A23187、诺考达唑和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、诺考达唑与和美新；长春花碱和秋水仙碱、长春花碱和硼替佐米、长春花碱和钙离子载体A23187、长春花碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、长春花碱与和美新；秋水仙碱和硼替佐米、秋水仙碱和钙离子载体A23187；秋水仙碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、秋水仙碱与和美新；硼替佐米和钙离子载体A23187；硼替佐米和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、硼替佐米与和美新；钙离子载体A23187和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、钙离子载体A23187与和美新；和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素与和美新。
MG132和长春花碱；MG132和秋水仙碱；MG132和硼替佐米、MG132和钙离子载体A23187、MG132和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、MG132与和美新；毒胡萝卜素和诺考达唑、毒胡萝卜素和长春花碱；毒胡萝卜素和秋水仙碱、毒胡萝卜素和硼替佐米、毒胡萝卜素和钙离子载体A23187、毒胡萝卜素和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、毒胡萝卜素与和美新；诺考达唑和长春花碱；诺考达唑和秋水仙碱、诺考达唑和钙离子载体A23187、诺考达唑和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、诺考达唑与和美新；长春花碱和秋水仙碱、长春花碱和硼替佐米、长春花碱和钙离子载体A23187、长春花碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、长春花碱与和美新；秋水仙碱和硼替佐米、秋水仙碱和钙离子载体A23187；秋水仙碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、秋水仙碱与和美新；硼替佐米和钙离子载体A23187；硼替佐米和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、硼替佐米与和美新；钙离子载体A23187和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、钙离子载体A23187与和美新；和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素与和美新。
[0263] 示例性的三种毒素的组合包括但不限于cAMP、TPA和紫杉醇；cAMP、TPA和MG132；cAMP、TPA和硼替佐米；cAMP、TPA和毒胡萝卜素；cAMP、TPA和诺考达唑；cAMP、TPA和长春花碱；
cAMP、TPA和秋水仙碱；cAMP、TPA和钙离子载体A23187；cAMP、TPA和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、TPA与和美新；cAMP、紫杉醇和MG132；cAMP、紫杉醇和硼替佐米；cAMP、紫杉醇和毒胡萝卜素；cAMP、紫杉醇和诺考达唑；cAMP、紫杉醇和长春花碱；cAMP、紫杉醇和秋水仙碱；cAMP、紫杉醇和钙离子载体A23187；cAMP、紫杉醇和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；
cAMP、紫杉醇与和美新；cAMP、MG132和硼替佐米；cAMP、MG132和毒胡萝卜素；cAMP、MG132和诺考达唑；cAMP、MG132和长春花碱；cAMP、MG132和秋水仙碱；cAMP、MG132和钙离子载体A23187；cAMP、MG132和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、MG132与和美新；cAMP、毒胡萝卜素和硼替佐米；cAMP、毒胡萝卜素和诺考达唑；cAMP、毒胡萝卜素、长春花碱；cAMP、毒胡萝卜素和秋水仙碱；cAMP、毒胡萝卜素和钙离子载体A23187；cAMP、毒胡萝卜素和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、毒胡萝卜素与和美新；cAMP、硼替佐米和诺考达唑；cAMP、硼替佐米和长春花碱；cAMP、硼替佐米和秋水仙碱；cAMP、硼替佐米和钙离子载体A23187；cAMP、硼替佐米和
4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、硼替佐米与和美新；cAMP、诺考达唑和长春花碱；
cAMP、诺考达唑和秋水仙碱；cAMP、诺考达唑和钙离子载体A23187；cAMP、诺考达唑和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、诺考达唑与和美新；cAMP、长春花碱和秋水仙碱；cAMP、长春花碱和钙离子载体A23187；cAMP、长春花碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、长春花碱与和美新；cAMP、秋水仙碱和钙离子载体A23187；cAMP、秋水仙碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、秋水仙碱与和美新；cAMP、钙离子载体A23187和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、钙离子载体A23187与和美新；cAMP、卡西霉素与和美新；以及cAMP、4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素与和美新。
cAMP、TPA和秋水仙碱；cAMP、TPA和钙离子载体A23187；cAMP、TPA和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、TPA与和美新；cAMP、紫杉醇和MG132；cAMP、紫杉醇和硼替佐米；cAMP、紫杉醇和毒胡萝卜素；cAMP、紫杉醇和诺考达唑；cAMP、紫杉醇和长春花碱；cAMP、紫杉醇和秋水仙碱；cAMP、紫杉醇和钙离子载体A23187；cAMP、紫杉醇和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；
cAMP、紫杉醇与和美新；cAMP、MG132和硼替佐米；cAMP、MG132和毒胡萝卜素；cAMP、MG132和诺考达唑；cAMP、MG132和长春花碱；cAMP、MG132和秋水仙碱；cAMP、MG132和钙离子载体A23187；cAMP、MG132和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、MG132与和美新；cAMP、毒胡萝卜素和硼替佐米；cAMP、毒胡萝卜素和诺考达唑；cAMP、毒胡萝卜素、长春花碱；cAMP、毒胡萝卜素和秋水仙碱；cAMP、毒胡萝卜素和钙离子载体A23187；cAMP、毒胡萝卜素和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、毒胡萝卜素与和美新；cAMP、硼替佐米和诺考达唑；cAMP、硼替佐米和长春花碱；cAMP、硼替佐米和秋水仙碱；cAMP、硼替佐米和钙离子载体A23187；cAMP、硼替佐米和
4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、硼替佐米与和美新；cAMP、诺考达唑和长春花碱；
cAMP、诺考达唑和秋水仙碱；cAMP、诺考达唑和钙离子载体A23187；cAMP、诺考达唑和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、诺考达唑与和美新；cAMP、长春花碱和秋水仙碱；cAMP、长春花碱和钙离子载体A23187；cAMP、长春花碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、长春花碱与和美新；cAMP、秋水仙碱和钙离子载体A23187；cAMP、秋水仙碱和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、秋水仙碱与和美新；cAMP、钙离子载体A23187和4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素；cAMP、钙离子载体A23187与和美新；cAMP、卡西霉素与和美新；以及cAMP、4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素与和美新。
[0264] 五种毒素的组合的例子包括但不限于cAMP、TPA、紫杉醇、MG 132和毒胡萝卜素；cAMP、TPA、紫杉醇、MG 132和诺考达唑；cAMP、TPA、紫杉醇、MG 132和长春花碱；cAMP、TPA、紫杉醇、MG 132和钙离子载体A23187；TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素和诺考达唑；TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素和长春花碱；TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素和钙离子载体A23187；紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑和长春花碱；紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑和钙离子载体A23187；和MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱和钙离子载体A23187；TPA、紫杉醇、MG132、钙离子载体A23187、和美新；TPA、诺考达唑、MG132、钙离子载体A23187、和美新；
TPA、长春花碱、MG132、钙离子载体A23187、和美新；TPA、秋水仙碱、MG132、钙离子载体A23187、和美新；TPA、紫杉醇、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、诺考达唑、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、长春花碱、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、秋水仙碱、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、紫杉醇、MG132、卡西霉素、和美新；以及TPA、长春花碱、MG132、卡西霉素、和美新。
TPA、长春花碱、MG132、钙离子载体A23187、和美新；TPA、秋水仙碱、MG132、钙离子载体A23187、和美新；TPA、紫杉醇、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、诺考达唑、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、长春花碱、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、秋水仙碱、硼替佐米、钙离子载体A23187、和美新；TPA、紫杉醇、MG132、卡西霉素、和美新；以及TPA、长春花碱、MG132、卡西霉素、和美新。
[0265] 按照本领域中的标准，用至少一种毒素来处理细胞。取决于细胞与毒素孵育的时间长短，毒素试验一般可分成急性和慢性毒素试验。急性毒素试验一般指细胞与毒素一起孵育较短时间，例如，至多24小时，而慢性毒素试验一般指细胞与毒素一起孵育较长时间，例如从超过24小时到约15天。例如，在急性毒素试验中，将一种或多种毒素添加到培养细胞的培养基中，并且使一种或多种毒素保持在培养基中达至少5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、10.5小时、11小时、11.5小时或12小时。在一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育4小时。
在另一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育6小时。在又一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育24小时。
在另一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育6小时。在又一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育24小时。
[0266] 在一个慢性毒素试验的例子中，按照本领域中的标准，用至少一种毒素处理细胞。例如，将一种或多种毒素添加到培养细胞的培养基中，并且使一种或多种毒素保持在培养基中达至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育3天。在另一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育7天。在又一个优选的实施方案中，使一种或多种毒素与细胞一起孵育14天。类似地，可如此进行慢性毒素试验，即首先使细胞与评估其对翻译的影响的毒素或化合物一起孵育，接着进行5-、15-或21-试验程序，这将显示翻译反应的幅度。举例来说，可使细胞与环丙沙星一起孵育7天，接着进行15-试验程序以便测定环丙沙星对细胞的翻译反应的影响。
[0267] 在毒素处理以后，测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型。适当的参照标准可由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施方案中，参照标准是由未用毒素处理过的相同的稳定转化哺乳动物细胞所表达的报告蛋白的水平。在一些实施方案中，当mRNA翻译活性处于其峰值时测定报告蛋白的水平。本领域的技术人员可通过进行跟踪报告蛋白随时间的累积的试验来容易地确定翻译活性的峰值。在一个实施方案中，在用至少一种毒素处理哺乳动物细胞后至少6小时测定报告蛋白的水平。在另一实施方案中，在用至少一种毒素处理哺乳动物细胞后6小时到约30小时的时间点测定哺乳动物细胞亚群中报告蛋白的水平。
[0268] 本领域的技术人员将容易认识到，不同毒素或不同毒素的组合将对特定的细胞系产生最佳结果，即最高的报告基因表达。待使用的最佳毒素可通过用不同量的不同毒素测试细胞来容易地确定。如图1、2和10中所示，5-毒素试验和15-毒素试验适用于测定最佳毒素。在这些筛选中所用的毒素也列在所述图中；然而，应当注意可通过在筛选中包括不同毒素来容易地设计不同的5-毒素和15-毒素试验。本领域的技术人员可容易地确定应针对特定细胞系进行筛选的最适当的毒素。例如，如果所测试的细胞系是乳腺癌细胞系，那么应优选将紫杉醇包括在内作为单毒素试验。
[0269] 用于测定报告蛋白水平的方法是众所周知的。在本领域中已知各种各样的离体蛋白质检测方法。例如，可使用在本领域中已知的对所述多肽特异的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。因此，报告蛋白的检测可使用本领域中已知的任何标准方法来实现，诸如发光读数、荧光显微镜技术、免疫组织化学、微量酶标仪分析、ELISA试验、FACS(荧光激活细胞分选)或分光光度法。例如，可使用荧光显微镜技术来检测EYFP和mRFP1。类似地，可使用针对荧火虫荧光素酶或β-半乳糖苷酶的抗体在免疫荧光染色后检测其存在。再举一例，在报告蛋白是例如荧火虫荧光素酶或Gaussia荧光素酶时，可使用发光微量酶标仪来测定报告蛋白的水平。
[0270] 另外,本领域中有许多无创性方法可供用于在体内检测蛋白质合成。举例来说，利用代谢示踪剂，位于TR元件下游的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)ORF可用来检测体内细胞死亡。不同于哺乳动物胸苷激酶，此酶可高效地磷酸化核苷类似物(例如，更昔洛韦(ganciclovir)、喷昔洛韦(penciclovir))，以及各种放射性衍生物，诸如(9-(4-[18F]-氟-3-羟甲基丁基)鸟嘌呤；[18F]FHBG)，其随后保留并累积在表达细胞内。因此，如果细胞正经历应激/死亡，那么HSV1-TK将由TR盒翻译，从而导致放射性示踪剂的累积。可使用正电子发射断层扫描术(PET)检测放射性，该技术允许监测报告基因表达的详细位置、幅度和持久性。也提供多种方法用于突变的HSV1-TK酶(例如，TKsr39)，其表现增强的酶活性和/或结合常数，通过增强放射性示踪剂的细胞累积来提高PET成像的灵敏度。
[0271] 当报告基因ORF是G蛋白偶联受体时，可使用GPCR结合试验来检测和测定报告基因水平。这些试验在本领域中众所周知，并且在下文简要描述。
[0272] 举例来说，对特异的GPCR的已知配体进行标记，随后将标记配体与含有本发明表达盒的哺乳动物细胞(或细胞组分，诸如膜裂解物)一起孵育使得过量添加标记配体。可使用任何适合的标记，例如，放射性标记，诸如3H、32P、125I等，和非放射性标记。标记还可包含任何标记分子，诸如附加表位、荧光基团和化学发光基团。在孵育标记配体(例如，放射性标记配体)与含有表达盒的哺乳动物细胞(或细胞组分，诸如膜裂解物)以后，去除过量配体(例如，通过洗涤)并测定细胞以确定与GPCR结合的标记配体的量，从而指示细胞中GPCR的量。结合试验可使用包含特异的GPCR的细胞来进行或者可使用无细胞形式(例如，使用含有特异的GPCR的膜制剂)来进行。在使GPCR转化细胞和标记配体与特异的GPCR竞争结合之后，测定与GPCR结合的标记配体的量。可使用允许测定标记配体的任何方法，诸如放射性结合试验、FACS分析、ELISA等等。当配体标记是荧光和生物发光分子时，也可使用生物发光共振能量转移(BRET)和荧光共振能量转移(FRET)技术来检测结合。
[0273] 对于本发明，荧光素酶特别适合作为报告蛋白用于在活细胞和生物体中生物发光的微光成像。尽管分辨率比用MRI或PET小，但通常利用灵敏的电荷耦合装置(CCD)相机的生物发光成像，允许在体内快速、高通量(同时从多动物的简单数据采集)、渐进的(同一动物的重复分析)、无创和无损的数据采集。在本领域中可利用有各种各样的检测装置、图像处理器和图像分析系统。
[0274] 一旦测定报告蛋白的表达，其水平与参照标准相比时表明处理细胞亚组的类别表型。基于如实施例中所述利用细胞系进行的试验，细胞池内的反应细胞(即从完整TR盒产生mRNA)可表现分为I类、II类和III类种类的不同划分。如图2中所见，HEK293 mTdm-fLUC转化细胞池内大约60-90％的反应细胞属于I类，大约10-30％属于II类，而大约1-10％分属于III类。再举一例，大约50-90％的细胞属于I类，5-40％属于II类，而0-15％属于III类。带有等级图的图示出许多不同的I类、II类和III类分布。本领域的技术人员将认识到，如果所分析的细胞样本的数量具有统计相关性，那么可获得最准确的类别分布。优选地，利用最佳毒素试验分析至少约40个、更优选至少约50个并且甚至更优选至少约60个反应克隆产生类别表型的随机分布，并且向池数据中添加额外亚克隆不会显著改变类别等级。
[0275] 表现所需类别特性的细胞亚组显示它所来源于的细胞池一般将属于相同种类。然而，如本领域中众所周知，初始细胞池含有许多不同的细胞克隆，并且一般理想的是进一步亚克隆来自细胞池的细胞以便获得纯细胞培养物。亚克隆按照本领域中的标准进行，并且一般完成后获得纯细胞群，其表现未由亲代细胞最佳表现的优选特性。因此，本领域的技术人员将认识到，在获得最准确类别分布中起作用的另一因素包括在细胞池中具有足够大数量的亚克隆。在一个优选的实施方案中，可能适用的是筛选含有超过约500个初级转化体的原代细胞池，和进一步筛选至少约30个独立亚克隆、更优选至少约40个独立亚克隆、又更优选至少约50个独立亚克隆、甚至更优选至少约60个独立亚克隆的亚克隆组。
[0276] 因此，本发明方法进一步包括从所需细胞池中分离至少一个细胞，并使它在培养物中生长以获得具有所需类别表型的细胞亚群。应注意，亚克隆可进行不止一次以便提高细胞群的纯度和/或改进任何相关特性或性状。在每个亚克隆步骤之后，理想的是用至少一种毒素再次测试亚克隆细胞的亚组，并重复如上所述的测定、分离和生长步骤以便确保亚克隆细胞表现所需类别的特性。在一些实施方案中，亚克隆重复至少两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或十五次。包括多轮亚克隆的用于分离所需哺乳动物细胞亚群的方法在实施例中详细描述。
[0277] 除上文描述的方法之外，本发明还涉及根据前述方法鉴定和/或分离的哺乳动物细胞亚群。在一个实施方案中，本发明涉及I类哺乳动物细胞。在另一实施方案中，本发明涉及II类哺乳动物细胞。在又一实施方案中提供如本文描述的III类哺乳动物细胞。包括原代细胞、细胞系和干细胞在内的上述任何哺乳动物细胞都可通过操纵来获得其I类、II类和III类亚群。在一些实施方案中，哺乳动物细胞系选自人癌细胞系；原代细胞是人或鼠的，并且干细胞是癌干细胞或鼠胚胎干细胞。
[0278] 如本文描述的哺乳动物细胞亚群在许多不同方法中具有用途。在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质是否对哺乳动物细胞有毒性的方法。在另一实施方案中，本发明涉及用于测定一种物质对哺乳动物细胞的毒性的方法。在两种方法中，首先用本文描述的核酸表达盒转化待测试的细胞系或原代细胞，所述核酸表达盒包含TR元件或组成型启动子和可操作地连接到其的核苷酸序列，该序列编码报告基因。核酸表达盒的引入可通过上文描述的任何方法进行，诸如脂质转染或电穿孔。在一个实施方案中，表达盒中的TR元件选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。在另一实施方案中，表达盒包含CMV组成型启动子。在又一实施方案中，报告蛋白是荧光素酶，并且更优选地，它是海肾荧光素酶、荧火虫荧光素酶或Gaussia荧光素酶。
[0279] 一旦所需细胞被转化，就如上文在用于鉴定所需哺乳动物细胞亚群的方法中所述按相同方式操纵细胞。简单地说，用至少一种毒素处理转化细胞的亚组，测定毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，并进一步亚克隆表现所需细胞亚群的表型的细胞的亚组。一旦获得所需的细胞亚群，使其与待测试的物质接触，并在暴露于所述物质之后测试报告蛋白的水平。在一个实施方案中，将物质添加到细胞维持于其中的培养物中。在另一实施方案中，使物质与细胞一起孵育至少5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、10.5小时、11小时、11.5小时或12小时。在一个优选的实施方案中，使物质与细胞一起孵育4小时。在另一优选的实施方案中，使物质与细胞一起孵育6小时。在又一优选的实施方案中，使物质与细胞一起孵育24小时。对上述两种方法的目的来说可测试任何物质。优选地，物质是为治疗或研究目的而测试的化合物，诸如新的小分子药物。
[0280] 物质的毒性和与未暴露于物质的对照哺乳动物细胞相比的报告蛋白的存在或水平增加相关。类似地，与未暴露于物质的对照哺乳动物细胞相比不存在报告蛋白或报告蛋白水平降低和哺乳动物细胞翻译对物质的抗性缺乏相关。另外，与未暴露于物质的对照哺乳动物细胞相比报告蛋白的存在或报告蛋白水平增加和哺乳动物细胞翻译对物质的抗性相关。
[0281] 对本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在用于鉴定哺乳动物细胞翻译是否对一种物质有抗性或用于测定一种物质是否对哺乳动物细胞有毒性的方法中可使用I类、II类或III类细胞中的任一类细胞。然而，由于与I类细胞相比在II类和III类细胞中存在更高的翻译和随后的报告蛋白表达，所以在前述方法中优选使用II类和III类细胞。
[0282] 如上所述，III类细胞的特征在于报告蛋白的水平大于参照标准中报告蛋白水平的1400％(14倍的诱导)，其中参照标准代表用核酸表达盒稳定转化而未用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白的水平。因此，可将III类细胞用作“细胞工厂”来产生大量的任何目标多肽。为了用作细胞工厂，用第二核酸表达盒转化III类细胞，所述第二核酸表达盒包含以下任一项：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。因此，第一核酸表达盒可用来监测细胞系的翻译效率，而第二表达盒用来提供用于待表达的目标多肽的核酸序列。第二核酸表达盒向III类细胞中的引入可通过上述标准转化技术中的任一种技术进行，例如，化学转染、脂质转染和电穿孔。在一个实施方案中，第二核酸表达盒被瞬时转化。在另一实施方案中，第二核酸表达盒被稳定转化到III类细胞中。第一表达盒可为上文描述的任何表达盒，其包含TR元件或组成型启动子和可操作地连接到其的核酸，该核酸编码报告基因。在一个实施方案中，第一表达盒包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的TR元件，和荧光素酶报告基因，诸如海肾荧光素酶、荧火虫荧光素酶或Gaussia荧光素酶。在另一实施方案中，第一表达盒包含CMV组成型启动子和荧光素酶报告基因。第二表达盒可含有与第一表达盒相同或不同的TR元件或组成型启动子。第一与第二表达盒的示例性组合列于下表2中，其中n.a.表示目标多肽的核酸，而CMVp是CMV启动子。
[0283] 表2
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288] 本领域的技术人员可容易地确定应当使用哪些III类细胞系来表达目标多肽。细胞类型的选择将取决于许多不同的因素，诸如目标多肽、待用于筛选的毒素、所表达蛋白质的翻译后修饰、细胞类型特异性蛋白质加工等。熟练的技术人员可由如上文所讨论的任何细胞系制备III类细胞或者可使用试剂盒中可用的III类细胞。举例来说，但非限制性地，可使用III类HEK293和HCT116细胞来表达许多不同的目标多肽。
[0289] 在如上文描述的III类细胞中可表达任何多肽。在一个实施方案中，待表达的多肽是治疗上可使用的多肽，诸如抗体、抗体片段、受体、受体片段、酶等。优选地，目标多肽的cDNA序列可用于表达。因此，可使含有第二表达盒的III类细胞在培养基中在允许目标多肽表达的条件下生长，该第二表达盒具有目标多肽的核酸序列。本领域的技术人员可通过改变多种因素(诸如孵育时间、培养基组分、对不同毒素的暴露、暴露持续时间等)来确定对于每一III类细胞系和特定目标多肽的最适合条件。接下来根据本领域中使用的标准方案纯化表达的多肽。取决于多肽是细胞内的或被分泌，使用不同的纯化方法来纯化多肽。这类方法包括亲和色谱法、超速离心法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和电泳技术。
[0290] 含TR的表达盒与含有此表达盒的细胞在用于鉴定非帽依赖性翻译的调节中所涉及的蛋白质的方法中也具有用途。如已经讨论的，TR元件编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子。因此，可操作地连接到TR元件的编码报告蛋白的核酸在细胞应激/死亡条件下(诸如暴露于至少一种毒素)被翻译。TR-报告基因盒的这一性质用来鉴定非帽依赖性翻译中所涉及的蛋白质。简单地说，用核酸表达盒稳定转化待研究的细胞，所述核酸表达盒包含TR元件和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译。替代地，可使用已经用这种表达盒转化的任何细胞。接下来用至少一种毒素处理转化细胞以便诱导TR-报告序列翻译，并从毒素处理细胞获得细胞裂解物。细胞裂解物可通过本领域中已知的用于未变性或变性蛋白质提取物的任何方法来分离，诸如化学裂解(例如，使用基于清洗剂的裂解缓冲液)、声波处理或重复的冷冻与解冻循环。在一个实施方案中，通过使细胞与细胞裂解缓冲液一起孵育来进行细胞裂解。接下来，分离编码TR元件和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列的mRNA并与细胞裂解物接触以便允许来自裂解物的任何蛋白质与TR-报告基因mRNA结合，因为与此mRNA结合的蛋白质将可能在非帽依赖性翻译中起作用。接触步骤一般可通过使mRNA与细胞裂解物一起孵育来进行。熟练的技术人员可通过改变多种因素(诸如mRNA浓度、使用的细胞裂解物的量、温度、先前细胞对毒素的暴露等)的因素，来容易地确定这种孵育的最适合条件。接下来按本领域中已知的来分离和鉴定与mRNA结合的任何蛋白质。举例来说，但非限制性地，可使用琼脂糖珠与柱、基于磁性珠的分离、蛋白质印迹、免疫亲和性等来分离蛋白质，并且可使用例如蛋白质测序、质谱分析法(MS)等来鉴定蛋白质。
[0291] 与此方法相关，本领域的技术人员将认识到，可进一步使用本发明的表达盒来鉴定抑制蛋白质翻译的物质(例如，图28和图33)。应注意，包含以下项的核酸表达盒被用来测定物质抑制非帽依赖性翻译的能力：编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；而包含以下项的核酸表达盒被用来测定物质抑制帽依赖性翻译的能力：组成型启动子，和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。可使用任何前述的TR元件、组成型启动子和报告序列。
[0292] 因此，本发明提供用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法(例如，图28和图33)。在一个实施方案中，如果I、II或III类哺乳动物细胞不能容易地得到并且需要首先进行分离，那么所述方法可包括以下步骤。用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚组以形成毒素处理细胞，用包含以下任一项的核酸表达盒稳定转化哺乳动物细胞：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的毒素处理细胞中由报告基因编码的报告蛋白的水平，以鉴定哺乳动物细胞亚组是否表现所需哺乳动物细胞亚群的表型。如果哺乳动物细胞的毒素处理细胞表现所需哺乳动物细胞亚群的表型，那么从哺乳动物细胞分离至少一个细胞以形成细胞培养物。使细胞培养物生长以形成哺乳动物细胞亚群。任选地，用至少一种毒素处理哺乳动物细胞亚群，并重复测定、分离和生长步骤直到鉴定出所需的哺乳动物细胞亚群。使所需的哺乳动物细胞亚群与所述物质接触。在与物质接触后，测定相比于由未曾用物质处理的细胞产生的报告蛋白表达的由所需的哺乳动物细胞亚群产生的报告蛋白的表达。与由未曾用物质处理的细胞产生的报告蛋白表达相比，由物质处理细胞所产生的报告蛋白表达的减少表明物质抑制蛋白质翻译。在前述章节中已经解决了用毒素处理细胞、测定报告蛋白水平、分离所需的细胞亚群和使细胞与物质接触的步骤。
[0293] 替代地，所述用于测定一种物质抑制哺乳动物细胞中蛋白质翻译的能力的方法可利用I类、II类或III类细胞中的任一类细胞，而不必首先分离所需的细胞亚群。因此，所述方法包括使I类、II类或III类哺乳动物细胞与所述物质接触；和测定相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白表达的与物质接触后哺乳动物细胞所产生的报告蛋白的表达，其中由物质处理细胞所产生的报告蛋白的表达相比于未曾用物质处理的细胞所产生的报告蛋白表达的减少表明物质抑制蛋白质翻译。
[0294] 当需要它们增加的翻译活性用于增强型检测和灵敏性或生物相关性时，优选使用II类或III类细胞。在另一实施例中，测定一种物质抑制蛋白质翻译的能力将使用I类细胞来检测在一般对毒素暴露有抗性的细胞中的物质反应。因此，虽然不束缚于具体理论，但仍认为通过使用II类或III类细胞来检测被测试物质对蛋白质翻译的影响比使用I类细胞更容易。
[0295] 本领域的技术人员将认识到，对I类、II类和III类细胞来说改变类别或完全丧失报告基因表达是有可能的。例如，在培养中长期传代(例如，使传代数增加10-20次传代)可能导致III类细胞转变成II类细胞，II类细胞转变成I类细胞以及I类细胞转变成无反应细胞。因此，本发明还涉及用于验证I类、II类或III类哺乳动物细胞保留它们的表型的方法。简单地说，这一筛选方法包括以下步骤。用至少一种或两种毒素处理I类、II类和/或III类哺乳动物细胞的亚组。测定相比于参照标准所表达的报告蛋白水平的哺乳动物细胞亚组中由报告基因编码的报告蛋白的水平。随后关于细胞是否保留它们的表型来验证哺乳动物细胞，其中I类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达高达500％，II类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的500％以上到1400％，而III类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的1400％以上到约75000％。
[0296] 在一个实施方案中，用至少两种毒素处理细胞。在另一实施方案中，用至少三种毒素处理细胞。在又一实施方案中，用至少五种毒素处理细胞。举例来说，但非限制性地，毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱、钙离子载体A23187、硼替佐米、和美新、秋水仙碱、4-氧喹啉-3-羧酸衍生物抗生素、甲醇和乙醇组成的组。在一些实施方案中，毒素选自由cAMP、TPA、紫杉醇、MG132、毒胡萝卜素、诺考达唑、长春花碱和钙离子载体A23187组成的组。示例性的毒素组合在前述章节中有所描述。
[0297] 除验证I类、II类和III类细胞的表型之外，本发明还提供用于在类别命名明显丧失的情况下复原I类、II类和III类细胞的表型的方法。简单地说，所述方法是基于以下的事实：已经明显丧失它们表型的细胞最有可能是因为TR反应质粒或启动子-TR表达盒的分离或破坏而发生。方法包括培养已经丧失它们类别表型的哺乳动物细胞的至少一个亚组以形成培养细胞，其中用本发明的核酸表达盒，即包含以下项的核苷酸序列的表达盒稳定转化哺乳动物细胞：(1)编码在受胁迫和/或垂死细胞中选择性翻译的mRNA分子的TR元件，和可操作地连接到TR元件的核苷酸序列，该序列编码报告基因并从TR元件翻译；或(2)组成型启动子和可操作地连接到启动子的核苷酸序列，该序列编码报告基因。表达盒还含有选择标记基因的核苷酸序列，其赋予适合于细胞选择的性状。
[0298] 表达盒可含有正选择标记基因和/或负选择标记基因。在各个实施方案中，构建体含有正负选择标记基因二者。在一个方面，使用依赖于选择标记基因的表达的方法，例如通过添加适当底物来只选择表达正选择标记基因的产物的那些细胞或者来消除表达负选择标记基因的那些细胞。例如，在正选择标记基因编码新霉素抗性时，以增加的剂量将G418添加到含有具有本发明表达盒的哺乳动物细胞的培养基中。类似地，在使用负选择标记基因时，将适合的底物(例如，更昔洛韦(gancyclovir)，如果负选择标记基因编码HSV-TK)添加到细胞培养物中。在使用适当底物选择之前或之后，还可通过其它方法，例如杂交、放射性标记核苷酸的检测、PCR等来测定受体细胞中正和/或负选择标记基因的存在。在一个优选的实施方案中，选择标记基因是正选择标记基因，并且更优选地它是抗生素抗性基因。在其它优选的实施方案中，抗生素抗性基因选自由新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、潮霉素B、灭瘟素和G418组成的组。
[0299] 接下来用所述选择标记基因对其提供抗性的物质处理培养细胞，使得已经分离核酸表达盒的培养细胞死亡。举例来说，如果选择标记基因是新霉素抗性基因，那么将G418添加到细胞培养基中导致已经丧失表达盒的细胞的死亡和仍含有表达盒的细胞的增殖(生长)。在用抗生素(或选择标记基因对其提供抗性的任何其它物质)处理之后留下来的细胞是类别表型可能得到复原的细胞亚群。任选地，可重复细胞的培养、处理和生长步骤直到复原的表型高度类似于类别表型丧失之前原始亲代细胞系的表型。例如，如果III类细胞系的特征在于报告蛋白的水平在丧失报告基因表达之前比参照标准的高50倍，并且它的报告基因表达在其表型复原之后比参照标准高25倍，那么可能理想的是重复复原方法的步骤直到报告基因表达接近于亲代的报告基因表达(即，50倍)。如图12所示，Sub#30和Sub#38亚克隆与用TPA+泰素2-毒素试验处理的所有二级12-16个亚克隆相比较发现，在亚克隆Sub#30和Sub#38中报告基因表达显著增加，表明培养物再选择可改善TR特异性反应。
[0300] 在TR质粒上利用选择标记基因的再选择不提供类别复原(即，断裂性突变已经使TR盒失活)的情形下，可根据如上文所述用于鉴定所需哺乳动物细胞亚群的方法对细胞进行再亚克隆和再筛选。
[0301] 本文还提供试剂盒，其包含在任何数量的单独容器、小包、试管、小瓶等中的本文所述的一种或多种组分，或者所述组分可按任何组合在这类容器中组合。在一个实施方案中，试剂盒含有II类哺乳动物细胞或其细胞裂解物，和用于使用试剂盒的说明书。在另一实施方案中，试剂盒含有III类哺乳动物细胞或其细胞裂解物，和用于使用试剂盒的说明书。优选地，此试剂盒中的多个细胞来源于单细胞系。当II类或III类细胞含有TR-报告基因表达盒时，本发明的试剂盒还可任选地包含一种或多种试剂，其适用于检测TR盒的转录(诸如适用于PCR扩增的盒特异性寡核苷酸)、从TR盒的翻译(诸如抗体或酶底物)；一种或多种已知诱导或抑制启动子活性(并由此诱导或抑制TR盒的表达)的对照化合物；一种或多种产生确定毒性反应(并由此促进TR盒的应激/死亡特异性翻译)的对照化合物；一种或多种抑制、影响或激活从TR盒表达的药物靶标或药物代谢酶的分子或其它化合物和/或关于试剂盒中的载体、细胞或其它组分用于药物筛选或验证的书面信息。本发明的上述试剂盒和方法中所采用的寡核苷酸是基于它们在高严格度条件下与从TR盒合成的转录产物特异性杂交的能力来选择。本领域中已知选择寡核苷酸序列的各种方法。
[0302] 在本发明试剂盒中提供的II类和III类细胞可用来实践本文所述的方法。此外，来自II类和III类细胞的细胞裂解物在许多不同试验中具有用途。
[0303] 如本文所述的II类和III类细胞的细胞裂解物可用来表征来自RNA转录物的蛋白质产物、研究转录与翻译控制，和鉴定mRNA物种。细胞裂解物通过利用任何标准裂解方法裂解细胞来获得，所述方法诸如化学裂解(例如，使用基于清洗剂的裂解缓冲液)、声波处理或重复的冷冻与解冻循环。在一个实施方案中，通过使细胞与细胞裂解缓冲液一起孵育来进行细胞裂解。细胞裂解物可为经核酸酶处理的，或未经核酸酶处理的。
[0304] 经核酸酶处理的裂解物可用微球菌核酸酶来处理以破坏内源性mRNA，并且含有蛋白质合成所必需的细胞组分(tRNA、核糖体、氨基酸以及起始、延伸与终止因子)。
[0305] 可通过添加以下一项或多项来针对mRNA翻译进一步优化经核酸酶处理的细胞裂解物：
[0306] 1)由经预先资格审查的(prequalified)磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶组成的能量产生系统；
[0307] 2)用于扩展可翻译的mRNA范围的tRNA混合物；
[0308] 3)氯高铁血红素(用于防止对翻译起始的抑制)；和
[0309] 4)乙酸钾和乙酸镁。
[0310] II类和III类细胞的经核酸酶处理的细胞裂解物还可含有许多其它成分，诸如酶，其参与各种各样的翻译后加工活性，包括乙酰化、异戊二烯化和一些磷酸化活性。可通过将犬胰腺微粒体膜(例如，可从Promega购得)添加到标准翻译反应中来检测诸如信号肽裂解和核心糖基化的加工事件。未处理的细胞裂解物含有蛋白质合成所必需的细胞组分(tRNA、核糖体、氨基酸以及起始、延伸与终止因子)，但未曾用微球菌核酸酶处理。未处理的裂解物可主要用于这些组分的分离并用作内源性球蛋白mRNA的丰富来源。
[0311] 在一个实施方案中，未处理裂解物没有补充tRNA、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶、DTT、乙酸钾、氯化镁或氯高铁血红素。在另一实施方案中，未处理裂解物补充有tRNA、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶、DTT、乙酸钾、氯化镁或氯高铁血红素。熟练的技术人员将认识到，未经补充的裂解物在没有首先添加补充剂时不建议用于体外翻译。
[0312] 在另一实施方案中，细胞裂解物可经由转录-翻译偶联方案用来指导非帽依赖性翻译。可使用含有可操作地连接到细菌或病毒启动子(即，SP6、T7等启动子)的TR-ORF RNA序列的表达载体作为用于体外RNA合成的模板。因为经毒素处理的裂解物应含有受损的帽依赖性翻译系统，所以非帽依赖性TR RNA的翻译将得到增强。在另一实施方案中，细胞裂解物可补充有天然或人工合成的非帽依赖性TR RNA，其将指导如上述任何可操作地连接的ORF的选择性合成。
[0313] II类和III类哺乳动物细胞的细胞裂解物都可用于以下示例性应用：
[0314] 1)药物筛选(对于影响翻译速率的药物)
[0315] 2)突变与检测分析(即，酶动力学)
[0316] 3)蛋白质间的相互作用(例如，使用GST融合蛋白)
[0317] 4)蛋白质复合体的免疫沉淀
[0318] 5)配体结合区测定/确认/竞争试验
[0319] 6)蛋白质结构分析
[0320] 7)用于蛋白质-DNA相互作用的电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobility shift assays；EMSAs)
[0321] 8)DNA足迹与蛋白质交联研究
[0322] 9)蛋白质-DNA结合试验
[0323] 10)翻译后修饰测试
[0324] 11)克隆基因产物的验证/表征，和
[0325] 12)蛋白质二聚化试验。
[0326] 上述程序在本领域中是已知的，并且可容易地进行调整来用于II类和III类细胞裂解物。举例来说，熟练的技术人员可在不用过度实验的情况下用本发明的细胞裂解物替换用于上述任何应用的兔网织红细胞裂解物系统(例如，可从Promega购得)。
[0327] 如本文所使用的分子生物学技术、生物化学技术和微生物技术在本领域中众所周知并且普遍使用，在例如以下文献中有所描述：Sambrook J.等(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor and its 3rd Ed.(2001)；Ausubel,F.M.(1987),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-interscience；Ausubel,F.M.(1989),Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-interscience；Innis,M.A.(1990),PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press；Ausubel,F.M.(1992),Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates；Ausubel,F.M.(1995),Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates；Innis,M.A.等(1995),PCR Strategies,Academic Press；Ausubel,F.M.(1999),Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates；Sninsky,J.J.等(1999),PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press；Special issue,Jikken Igaku[Experimental Medicine]"Idenshi Donyu&Hatsugenkaiseki Jikkenho[Experimental Method for Gene introduction&Expression Analysis]",Yodo-sha,1997；等。这些出版物中各自的相关部分(或可能是全部)以引用的方式并入本文。
[0328] 本文中可使用任何技术来将核酸分子引入细胞中，包括，例如，转化、转导、转染等。这种核酸分子引入技术在本领域中众所周知并且普遍使用，在例如以下文献中有所描述：Ausubel F.A.等,editors,(1988),Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,New York,N.Y.；Sambrook J.等(1987)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.and its 3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Special issue,Jikken Igaku[Experimental Medicine]Experimental Method for Gene introduction&Expression Analysis",Yodo-sha,1997；等。基因引入可通过本文所述的方法加以确认，诸如Northern免疫印迹分析和Western免疫印迹分析，或其它众所周知的常用技术。
[0329] 可通过众所周知的技术—位点特异性诱变方法来进行本发明多肽的氨基酸缺失、取代或添加。可根据以下文献中描述的方法来进行一个或数个氨基酸缺失、取代或添加：Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1 to
38,John Wiley&Sons(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)；
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,5662(1984)；Science,224,1431(1984)；PCT WO85/00817(1985)；Nature,316,601(1985)；等。
38,John Wiley&Sons(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)；
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,5662(1984)；Science,224,1431(1984)；PCT WO85/00817(1985)；Nature,316,601(1985)；等。
[0330] 虽然已经详细描述了本发明，但显而易见的是，在不偏离附加权利要求中所定义的本发明范围时的修改与变更是可能的。此外，应理解，虽然本公开内容中的所有实施例说明了本发明，但它们仅是作为非限制性实施例而提供，因此不应视为限制由此说明的本发明的各个方面。实施例
[0331] 提供以下非限制性实施例来进一步说明本发明。
[0332] 材料与方法
[0333] A细胞培养
[0334] 将所有哺乳动物细胞维持在37℃、5％CO2下适当的完全生长培养基中(下文对每种细胞系进行详细说明)，培养基中补充有10％胎牛血清(Hyclone)和30-50mg/L硫酸庆大霉素(Invitrogen Life Technologies)。
[0335] 培养基配方：
[0336] DMEM:
[0337] 1小包/升DMEM粉末(Invitrogen Life Technologies)
[0339] 30-50mg/L硫酸庆大霉素
[0340] 10％FBS
[0341] MEM:
[0342] 1小包/升含厄尔(Earle's)盐的MEM粉末(Invitrogen Life Technologies)[0343] 1.5g/L碳酸氢钠
[0344] 10mL/L 100mM丙酮酸钠溶液(Invitrogen Life Technologies)
[0345] 10mL/L 10mM MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen Life Technologies)
[0346] 30-50mg/L硫酸庆大霉素
[0347] 10％FBS
[0348] RPMI:
[0349] 1小包/升RPMI 1640粉末(Invitrogen Life Technologies)
[0350] 10mL/L 100mM丙酮酸钠溶液(Invitrogen Life Technologies)
[0351] 30-50mg/L硫酸庆大霉素
[0352] 10％FBS
[0353] McCoy's 5A:
[0354] 1L McCoy's 5A液体(Invitrogen Life Technologies)
[0355] 30-50mg/L硫酸庆大霉素
[0356] 10％FBS
[0357] Ham's F12K:
[0358] 1L F12K,Kaighn's改性液体(Invitrogen Life Technologies)
[0359] 30-50mg/L硫酸庆大霉素
[0360] 10％FBS
[0361] 细胞系的培养基要求：
[0362] DMEM:HEK293、MCF7、H4、Hs 683、NTERA-2 cl.D、HeLa、MIA PaCa-2、PC3[0363] MEM:HepG2、CaCo-2、HeLa、A-498、RPMI 2650、HT-1080、SK-N-MC、HuTu 80、IMR32[0364] RPMI:SupT 1、A3.01、CCF-STTG1、Colo201、Colo205、DU145、LNCaP clone FGS、PC3、HCT116、AsPC-1、H1299、MDA231
[0365] McCoy's 5A:A-204、Capan-2、U2 Os、HT29
[0366] Ham's F12K:AGS、A549、BeWo、LoVo
[0367] B.稳定转化的哺乳动物细胞池的转染与分离
[0368] 使用非脂质Transfectol转染试剂(Continental Lab Products)或FuGENE6脂质基转染试剂(Roche Applied Science)按照供应商的建议进行哺乳动物细胞转染。
[0369] 质粒DNA：
[0370] 使用下列质粒转染哺乳动物细胞：pCMV-fLuc、pCMV-gLuc、pmTRplp-fLuc、pmTRplp-GLuc、pmTRdm-fLuc、pmTRdm-GLuc、phTRdm-fLuc、phTRdm-GLuc。
[0371] Transfectol程序概述：
[0372] 转染之前，使哺乳动物细胞在100mm培养皿中生长至50％汇合并且在添加DNA/转染试剂混合物之前1-3小时加入补充有2.5-5％FBS的适当生长培养基。通过首先把1mL稀释剂与15μg质粒DNA组合并形成涡流，然后添加60μL Transfectol并进行涡流搅拌5秒钟来制备所述混合物。将每种DNA/转染试剂混合物在室温下孵育15分钟，然后滴加到细胞中。使细胞在DNA/Transfectol混合物存在下生长2-16小时。此时，用完全生长培养基(10％FBS)替换培养基，并且在添加G418选择性培养基之前使细胞再生长24小时。
[0373] FuGENE6程序概述：
[0374] 转染之前，使哺乳动物细胞在T-25培养瓶中生长至50％汇合并且在添加DNA/转染试剂混合物之前1-3小时加入适当的完全生长培养基(10％FBS)。对于每种质粒DNA使用1:3、2:3和1:6的DNA:FuGENE6比率制备三种DNA/转染试剂混合物。为建立DNA/FuGENE6混合物，如下在适当的无血清生长培养基中稀释FuGENE6：
[0375] 1:3比率混合物：242.5μL SFM+7.5μL FuGENE6
[0376] 2:3比率混合物：242.5μL SFM+7.5μL FuGENE6
[0377] 1:6比率混合物：235μL SFM+15μL FuGENE6
[0378] 对FuGENE6稀释液进行涡流搅拌并在室温孵育5分钟。然后如下添加质粒DNA：
[0379] 1:3比率混合物：2.5μg
[0380] 2:3比率混合物：5μg
[0381] 1:6比率混合物：2.5μg
[0382] 对DNA/FuGENE6混合物在添加到细胞之前进行涡流搅拌并在室温下孵育15分钟。使细胞在DNA/FuGENE6混合物存在下生长过夜。此时，用完全生长培养基(10％FBS)替换培养基，并且在添加G418选择性培养基之前使细胞再生长24小时。
[0383] G418选择概述：
[0384] 转染后约48小时施加G418选择性培养基(补充有500μg/mL G418的完全生长培养基)。随后，每两天更换一次选择培养基持续2-3周，在此期间大部分细胞分离而G418抗性“原代”集落显露。取决于集落的数量与密度，使存活细胞在无G418培养基中生长数天直到培养板50-60％汇合。此时，将选择培养板上的所有“原代”集落一起收集在一个样本中，转移到100mm培养皿，接种24小时后补料，并生长直到～80％汇合。此集落收集被称为稳定细胞“池”，第1代(P1)。使用5-毒素与15-毒素试验来测试此稳定转化哺乳动物细胞合并群对毒素的翻译反应。通过无限稀释或手工集落亚克隆，使用反应性池来分离具有独特核糖体表型的克隆细胞系，然后在液氮中低温保存。
[0385] C.测定稳定转化的哺乳动物细胞池中TR介导的核糖体反应
[0386] 荧火虫荧光素酶(fLuc)池：
[0387] 使用两种生长程序中的任一种程序(例如，细胞计数或汇合生长试验)对细胞池应用5-试验和15-试验程序。对于细胞计数试验，对来自P1池培养皿的细胞进行计数并以每孔25,000个细胞的密度送入白色透明底96孔微量滴定盘(microtiter tray)中；剩余细胞送入第2代(P2)培养皿。使微量滴定板中的细胞在与毒剂一起孵育之前生长约40小时以达到～75％细胞汇合。然后用不含毒素或含有最佳毒素(定义为产生最大翻译反应的单或多毒素试验(取自表3))的完全生长培养基处理微量滴定板中的细胞，并在37℃孵育6小时。每一处理在三个重复孔上进行。
[0388] 对于汇合试验，加工汇合的P1培养物用于传代并且将固定体积的细胞悬液(大约总量的1％或者每孔～60,000个细胞)送入白色透明底96孔微量滴定盘中。使微量滴定板中的细胞生长40小时直到所有样本孔达到汇合(即，每平方厘米的最大细胞数量)。毒素处理和样本分析如上文对于细胞计数试验所描述。
[0389]
[0390]
[0391]
[0392] 1双丁酰环化腺苷酸(Dibutyryl-cyclic AMP)
[0393] 2 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯
[0394] 3 Z-Leu-Leu-Leu-乙醛
[0395] 4钙离子载体A23187，卡西霉素
[0396] 5(S)-10-[(二甲氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮单盐酸盐；拓扑替康
[0397] 6 N-[(7S)-1,2,3,10-四甲氧基-9-氧-5,6,7,9-四氢苯并[a]庚搭烯-7-基]乙酰胺
[0398] 7支原体去除试剂，4-氧喹啉-3-羧酸衍生物
[0399] 8[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸；万珂
[0400] 21-试验程序采用与升级15-试验方案相同的标准毒素。额外的6个试验涉及一种未知或未表征的化合物和它与五种毒素的配对组合：未知的、未知的+TPA、未知的+乙酰胆碱、未知的+硼替佐米(万珂)、未知的+低剂量CaIon和未知的+和美新(拓扑替康)。
[0401] 在毒素孵育后，利用相差显微镜检查法来检验细胞中的脱落迹象。如果大于～10％的细胞脱落，那么以1200rpm离心96孔培养板3分钟来使脱落细胞沉淀。去除培养基并用50μL细胞裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐(pH7.8)、10％甘油、1％Triton X-100、1mg/ml BSA、2mM EGTA和2mM DTT)替换。将细胞与细胞裂解缓冲液一起在室温下孵育10分钟，并使用相差显微镜验证细胞裂解。为确保完全裂解，使用多道移液器剧烈搅拌裂解物。用注射器针头手动去除因搅拌而形成的任何气泡。使用FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪测定发光。为了显现发光，向孔中注入溶解于反应缓冲液(25mM双甘氨肽(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EDTA、15mM磷酸钾、1mM DTT、1mM辅酶A、6.7mM ATP和3.35mM D-荧光素)中的D-荧光素溶液。振荡4秒后，使用透镜过滤器以2500-4000的增益测定发光值。
[0402] 使用由处理细胞与未处理细胞产生的值的比率将光值转换成诱导倍数。使用由5-毒素或15-毒素试验产生的最大TR特异性翻译反应来指派最佳毒素试验(最大翻译反应)，随后将其用于筛选来源于此池的亚克隆并指派类别命名。
[0403] 尽管依赖于细胞系，但当在毒素未处理孔中在3500的增益下总相对光单位(RLU)不低于值50,000并且处理细胞中的诱导是1.5到2.5倍时，将组成型CMV-fLuc池判定为反应性的。类似地，当在毒素未处理与处理孔中在3500的增益下总相对光单位(RLU)不低于值1000并且处理细胞中的诱导是3到100倍时，将TRplp-fLuc和TRdm-fLuc池判定为反应性的。
[0404] Gaussia荧光素酶(gLuc)池：
[0405] 如对于荧火虫荧光素酶池所描述使细胞生长，只是不按常规用毒素筛选CMV-gLuc细胞，而是当细胞达到汇合时直接从100mm培养皿测试。如对于荧火虫荧光素酶池所描述加工并用毒素处理mTRplp-gLuc、mTRdm-gLuc和hTRdm-gLuc细胞，但在毒素孵育期之后不进行细胞裂解。此时，去除50μL条件培养基，转移到新的白底培养板，并通过直接向条件培养基中添加5.5μL腔肠素(Coelenterazine)(2.5mM的HCL/MeOH溶液，在含有1mM EDTA和0.60M NaCl的10mM Tris，pH7.8中稀释)来在FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪中测定发光。
[0406] 尽管依赖于细胞系，但当在毒素未处理孔中在3500的增益下总相对光单位(RLU)不低于值5,000,000时，将组成型CMV-gLuc池判定为反应性的。类似地，当在毒素未处理与处理孔中在3500的增益下总相对光单位(RLU)不低于值1000并且处理细胞中的诱导与类别定义相一致时，将mTRplp-gLuc、mTRdm-gLuc和hTRdm-gLuc池判定为反应性的。
[0407] D.具有独特核糖体表型的克隆细胞系的分离
[0408] 为了从反应性合并样本制备稳定集落，在集落亚克隆之前稀释并再接种来自P3-P4培养板的细胞。取决于细胞类型，接种密度从每100mm培养皿500到10,000个细胞不等。生长缓慢的低密度敏感性细胞类型以较高细胞数接种，而生长较快的密度不敏感细胞以较低细胞数接种。使细胞生长成集落(1-4周，取决于细胞类型)。一旦集落达到适当尺寸(肉眼可见)，就对集落培养板进行标注以供亚克隆。用高真空油脂的薄涂层处理经火焰灭菌的克隆环并在集落周围放置。通过用1X胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理来去除细胞，并送入24孔培养盘并标记1代或P1。每个池加工足够的集落(～150-400个独立分离株)以回收～50-75个翻译反应性亚克隆。当每个亚克隆达到汇合时，将每个分离株送入T-25培养瓶(标记为P2)，生长至汇合，并使用最佳毒素处理进行分析。
[0409] E.使用汇合试验的快速亚克隆筛选
[0410] 荧火虫荧光素酶(fLuc)亚克隆：
[0411] 使用汇合试验方案在96孔培养盘中测定在T-25培养瓶中生长的汇合的P2亚克隆。在将传代(约总细胞群的1％或～60,000个细胞)放入孔中并使其生长到汇合之后，用不含毒素或含有一种或多种毒素(即，最佳毒素试验)的完全生长培养基处理细胞，并在37℃孵育6小时。对三个重复孔进行每个处理。
[0412] 在毒素孵育后，利用相差显微镜检查法来检验细胞中的脱落迹象。如果大于～10％的细胞脱落，那么以1200rpm离心96孔培养板3分钟来使脱落细胞沉淀。去除培养基并用50μL细胞裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐(pH7.8)、10％甘油、1％Triton X-100、1mg/ml BSA、2mM EGTA和2mM DTT)替换。将细胞与细胞裂解缓冲液一起在室温孵育10分钟，并使用相差显微镜验证细胞裂解。为确保完全裂解，使用多道移液器剧烈搅拌裂解物。用注射器针头手动去除因搅拌而形成的任何气泡。在注入溶解于反应缓冲液(25mM双甘氨肽(pH 7.8)、
15mM MgSO4、4mM EDTA、15mM磷酸钾、1mM DTT、1mM辅酶A、6.7mM ATP和3.35mM D-荧光素)中的5μL D-荧光素溶液之后，使用FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪测定发光。振荡4秒后，使用透镜过滤器以2500-4000的增益测定发光值。
15mM MgSO4、4mM EDTA、15mM磷酸钾、1mM DTT、1mM辅酶A、6.7mM ATP和3.35mM D-荧光素)中的5μL D-荧光素溶液之后，使用FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪测定发光。振荡4秒后，使用透镜过滤器以2500-4000的增益测定发光值。
[0413] 基于发光读数，计算每个亚克隆的诱导倍数。把这些值排列成从最低值到最高值的等级并按等级次序与诱导倍数值的函数绘图(即，等级图)。为了指派类别命名，使用在这些图上鉴定的几何与线性趋势来为每个样本定义类别命名。基于最低等级系列(最低翻译反应)，将细胞亚克隆归入I类。使用类似的程序，也鉴定了II类和III类细胞亚克隆。使用所有可用类别命名的汇编来建立I类、II类和III类定义。
[0414] 利用如下的细胞计数方案选择每一类别的代表用于低温保存和定量测试：I类：不少于2到3个代表加所有边界克隆(I类与II类接界的类别命名)；II类：不少于3到4个代表，包括所有边界克隆；III类：选择所有亚克隆。将每个选定亚克隆(P3-P4)送入多个100mm培养皿中，使用其制备两种低温原液。将大部分细胞系维持为活性培养物以用于继续测试和二次亚克隆。
[0415] Gaussia荧光素酶(GLuc)亚克隆：
[0416] 如对于荧火虫荧光素酶亚克隆所描述制备亚克隆细胞，只是将CMV-gLuc细胞接种于24孔培养盘中、生长至汇合(>5天)并且不用毒素处理来进行测定。在培养基中分泌的gLUC蛋白的累积允许从24孔培养盘直接测试gLUC活性。在此情况下，取出50μL培养基，转移到新的白底培养板，并通过直接向培养基中添加5.5μL腔肠素(2.5mM的HCL/MeOH溶液，并且在含有1mM EDTA和0.60M NaCl的10mM Tris，pH7.8中稀释)来在FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪中测定发光。相比之下，如对于荧火虫荧光素酶亚克隆所描述加工并用毒素处理汇合的TRplp-gLuc和TRdm-gLuc亚克隆；但是，在毒素孵育之后不进行细胞裂解。至于CMV-gLUC表达细胞，将50μL培养基转移到新鲜的96孔微量滴定板并如上测定发光。
[0417] F.定量5-试验程序
[0418] 在已经利用5-试验程序定义了最佳毒素试验之后，通过对使用细胞计数程序制备的培养物应用5-试验程序来检验TR特异性翻译反应的定量分析。基本上如上所述进行5-试验程序。细胞培养物按常规处于它们的P5-P6代。基于在三个独立试验中由三个重复样本产生的发光值，使用诱导倍数值将亚克隆归类。
[0419] G.定量15-毒素试验
[0420] 以与5-试验程序相同的方式进行使用15-试验方法的类别指派。对维持在连续培养物中的P7-P8细胞或者从冷冻的P4原液回收的P5-P6细胞按常规进行这些测试。基于在三个独立试验中由三个重复样本产生的发光值，使用诱导倍数值将亚克隆归类并验证最佳毒素试验以用于随后的应用。H.确定类别的亚克隆的再亚克隆与纯化
[0421] 有时，确定类别的细胞系将需要再纯化与再测试。为了进一步纯化确定类别的细胞，对亚克隆进行先前所述的无限稀释或手动接种、如上所述的亚克隆、繁殖与再测试。一般来说，此程序会导致TR特异性反应的增强(例如，蛋白质表达比亲代亚克隆有3-5倍提高)。
[0422] I.选定亚克隆的Western免疫印迹分析与使用重组荧火虫荧光素酶蛋白作为标准的蛋白质浓度评估
[0423] 荧火虫荧光素酶(fLuc)亚克隆：
[0424] 在一些情况下，可能有必要将酶标仪发光读数(即，荧光素酶活性)与响应于毒素处理所产生的荧光素酶蛋白的量相关联。为此，通过将最佳毒素处理中TR调节蛋白的比活性与使用纯化的重组荧火虫荧光素酶(Sigma)产生的标准剂量反应曲线相关联来测定荧光素酶的量。在此情形下，将fLUC比活性表示为在确定的毒素处理6小时后的相对光单位(RLU)/μg蛋白质/细胞。
[0425] 为了产生剂量反应曲线，对已知蛋白质浓度(如通过Lowry试验所测定)的重组荧火虫荧光素酶蛋白(Sigma)进行连续稀释并使用标准酶标仪试验进行测定。在不含ATP与荧光素的40μL反应缓冲液(25mM双甘氨肽(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EDTA、15mM磷酸钾、1mM DTT、1mM辅酶A)中制备连续稀释液，并使用溶解于反应缓冲液(25mM双甘氨肽(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EDTA、15mM磷酸钾、1mM DTT、1mM辅酶A、6.7mM ATP和3.35mM D-荧光素)中的5μL D-荧光素溶液在FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪中测定活性。这提供每微克蛋白质的相对光单位值。
[0426] 为了测定重组荧火虫荧光素酶蛋白的纯度，利用SDS PAGE分析确定的蛋白质的量，在Preblot凝胶固定剂(25％异丙醇、10％乙酸)中固定过夜，并在0.05％考马斯蓝(0.05％亮蓝R、50％甲醇、10％乙酸)中室温下染色20分钟。使凝胶在10％乙酸中脱色并真空干燥。使用干燥凝胶来评估蛋白质的浓度，将其判定为>98％纯。这种可忽略不计的污染太过微小而不会影响连续稀释的计算。使用产生线性剂量反应的连续稀释液由每一蛋白质标准浓度的相对光单位作图(图15A)。
[0427] 通过在标准酶标仪分析中测定相对光单位的数值来测定由在15-毒素试验中培养的确定细胞数所产生的荧光素酶的量。在此测试中，对III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系进行计数，以每孔200,000个细胞的密度送入12孔培养盘中，并在与毒剂一起孵育之前培养约24小时。用不含毒素或表3中所列的标准单或双毒素试验的完全生长培养基处理细胞并在37℃孵育6小时。对三个重复孔进行每一个处理。在孵育期结束时，将来自三个重复孔中每一孔的细胞收集在1mL冰冷1X PBS中，并且再用200μL的1XPBS洗涤每个孔(总共1200μL)。然后，取出60μL每一细胞悬液(5％)并以10,000rpm离心1分钟。将细胞沉淀(pellet)重悬于40μL细胞裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐(pH7.8)、10％甘油、1％TritonX-100、1mg/ml BSA、2mM EGTA和2mM DTT)中，在室温孵育10分钟，并使用前文所述的标准程序在FLUOstar Optima(BMG Labtech)微量酶标仪中测定荧光素酶活性。把这些值定位在从重组蛋白质制成的线性剂量反应曲线图上(图15A)，此曲线图提供由重组蛋白质产生的相对光单位与由毒素处理HCT116细胞产生的相对光单位的相关性。这提供了重组蛋白质的量与毒素处理细胞中蛋白质的量之间的相关性。知道了用来产生细胞沉淀的细胞的数量，使得能够计算在确定的毒素试验中6小时后的相对光单位/微克fLUC蛋白/细胞。
[0428] 如上所述离心剩余的细胞悬液，并将沉淀储存在-70/-80℃用于随后的蛋白质提取和Western免疫印迹分析。对于蛋白质提取，在冰上融化细胞并重新悬浮于等体积的悬浮缓冲液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl[pH 7.6]、1mM EDTA、1mg/mL抑肽酶、100μg/mL PMSF)和2×SDS缓冲液(100mM TrisHCl(pH6.8)、4％SDS、20％甘油、20mM DTT、10mM EDTA、2X Roche蛋白酶抑制剂混合物)中。通过剧烈混合并煮沸3分钟使提取物均质化。使样本通过配备有26G针的注射器来实现额外均质化(需要时)。此时，利用SDS-PAGE凝胶来分析提取物或者将其储存在-80℃。
[0429] 为了产生近似定量的Western免疫印迹分析，在Western免疫印迹上加载相等的蛋白质浓度。为了建立总蛋白质量，使用初步的SDS-PAGE凝胶来分析10μL的每种蛋白质提取物。将凝胶在Preblot凝胶固定剂(25％异丙醇、10％乙酸)中固定过夜，并在0.05％考马斯蓝(0.05％亮蓝R、50％甲醇、10％乙酸)中室温下染色20分钟。使凝胶在10％乙酸中脱色并真空干燥。使用干燥凝胶，在Western免疫印迹之前对样本进行任何必要的体积调整。使用12％SDS-PAGE凝胶来分析已调整体积的样本。使用标准方法来完成通过电泳向固体支撑膜的蛋白质转移。将膜干燥过夜，并且Western免疫印迹分析包括在1X PBS-T中的膜再水化、在过滤器上用蛋白质溶液(5％奶粉或3％BSA)洗涤以阻断杂散的(stray)蛋白质结合位点、与识别TR调节ORF的抗体一起孵育，和使用标记的二抗的化学发光检测。使用抗fLUC一抗(Sigma；1:1000稀释)检测fLUC蛋白。在与一抗一起孵育并用1X PBS-T充分洗涤之后，通过与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔二抗(Amersham；1:10000稀释)一起孵育来检测与一抗结合的蛋白质。在与二抗一起孵育并充分洗涤之后，利用ECL试剂系统(Amersham)按照供应商所描述检测反应性蛋白质。使用来自SYNGENE的Gene Tools分析软件进行光密度分析。
[0430] J.池与亚克隆的低温保存
[0431] 一般使用第2或3代(P2-P3)池原液和P4亚克隆原液来制备低温保存原液。使这些原液生长至汇合，用1X胰蛋白酶-EDTA(1min，RT)洗涤至少两次，收集于每个100mm培养皿中的2mL冷冻培养基(90％胎牛血清，10％DMSO)中，并转移到冷冻小瓶(每小瓶1ml细胞；每小瓶～1Exp7个细胞)。将冷冻小瓶放在处于-70/-80C冷冻机中的慢速冷冻容器中16-24小时，然后转移到液氮中进行长期储存。
[0432] 实施例I—组合毒性筛选程序
[0433] 本实施例描述对表达翻译调节序列(TR)盒的哺乳动物细胞应用毒素使得在非帽依赖性翻译过程期间选择性翻译TR-ORF mRNA。尽管非帽依赖性翻译是一种广泛接受的生物过程，但在本发明之前核糖体对毒素和毒性环境的定量反应仍是很不确定的。为了证明基于TR的毒素筛选过程作为细胞应激与死亡的指示物的可行性与功效，本文描述的初始研究采用多种毒性筛选程序。这些研究包括使用影响确定生物过程的毒素(即，信号转导激活剂、微管破坏剂、蛋白酶体抑制剂、细胞内钙离子调节剂等)，所述过程提供关于调节细胞死亡的受影响生物系统的信息。
[0434] 本本实施例中，将一组的此类毒素单独(单毒素试验)和组合(二毒素试验)施用于细胞，使得反应细胞途径能够提供关于核糖体活性与确定细胞死亡反应的关联信息(表3)。用mTRdm-fLUC表达盒稳定转化人结肠直肠癌HCT116细胞系，并使用上述程序进行亚克隆。
此表达载体由偶联于荧火虫荧光素酶编码序列(fLUC)的小鼠dm20衍生化TR序列(SEQ ID NO:1)所组成。
此表达载体由偶联于荧火虫荧光素酶编码序列(fLUC)的小鼠dm20衍生化TR序列(SEQ ID NO:1)所组成。
[0435] 在一个测试中，将5-试验程序(表3)应用于HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#30细胞(图1A)。此亚克隆是亲代12-16细胞系的二次亚克隆。把25,000个细胞接种于96孔培养盘的三个重复孔中，培养48小时，并用溶解于新鲜培养基中的确定毒素处理6小时。然后用裂解缓冲液加工样本并在酶标仪中读取。在TPA试验中观察最大的TR特异性反应(报告基因活性增加800％-1200％的范围)。在5-试验程序的第二个应用中，测试HCT116 mTRdm-fLUC 12-16亚克隆#38细胞的三个重复样本。如上加工细胞。在TPA和泰素处理的样本中观察最大的TR特异性毒素反应。在TPA与泰素处理的细胞中未观察到显著差异(p>0.05)。
[0436] 替代地，成对应用毒素(表3中所示的15-试验方法)。使用标准酶标仪方案，用二毒素试验培养HCT116 mTRdm-fLUC 12-16 Sub#30细胞的三个重复样本(图1C)。相比于所有其它的毒素试验(报告基因活性增加8,000％-11,500％)，在用TPA+泰素的二毒素试验处理的细胞中观察到极为显著的TR介导的反应(p<<0.05)。类似地，用15-试验毒素筛选测试HCT116 mTRdm-fLUC 12-16 Sub#38细胞的样本(图1D)。如前所述，在用TPA和泰素的二毒素组合处理的细胞中观察到极为显著的差异(p<<0.05)。
[0437] 这些结果表明，TR调节的翻译实际上与细胞应激和死亡相关联。与标准细胞死亡标志物(未显示)相比较时，这些TR特异性反应与半胱天冬酶(caspase)激活或线粒体功能障碍一样早或比半胱天冬酶激活或线粒体功能障碍更早。此外，在一些试验中观察到的极度的TR反应(特别是，在图1C和1D中的TPA+泰素的二毒素反应)是出乎意料的。所述反应的幅度不是相加的(10倍加上10倍得到20倍)，而看似是一个倍增过程(10倍乘以10倍得到>100倍)。15-试验结果提供了在非帽依赖性翻译、蛋白激酶C激活、微管破坏与细胞应激/死亡之间先前未知的联系。
[0438] 另外，在TR介导的反应趋势中毒素处理未产生显著性差异(比较图1C与1D)；然而，TR调节的反应的幅度甚至在这些密切相关的亚克隆之间也看似各异。总之，这些结果表明，除了TR特异性反应中的细胞差异之外，在毒素试验的操纵过程中的机械性差异可能在调节反应程度中起作用。因此，优选的很有启发性的试验的产生涉及测定对影响TR读数的“最佳”与“亚最佳”因素。
[0439] 实施例II—对TR反应细胞系应用组合毒素筛选
[0440] 本实施例描述对用特异性TR盒转化的哺乳动物细胞池应用毒素。制备表达mTRdm-fLUC和hTRdm-fLUC表达载体的HEK293细胞池。在繁殖与低温保存后，用15-试验程序筛选每个池(图2A)。由于在含有不同物种的TR表达盒的HEK293细胞中在TR介导的反应的趋势或幅度上未观察到显著差异(图2B)，所以除TR表达盒的序列之外的其它因素可能显著促成TR反应差异。
[0441] 实施例III—使用毒素试验程序来鉴定TR反应细胞并指派到类别
[0442] A.定义TR特异性反应中的差异并对非帽依赖性和帽依赖性反应指派类别命名[0443] 在本实施例中，报道毒素试验中主要变体的定义。不用毒素(对照，图中标记为UNT)或用TPA(样本)使用标准酶标仪试验处理来自HEK293 hTRdm-fLUC池的九个随机亚克隆的三个重复样本(图2C)。将TR反应表达为诱导倍数值(样本光单位(LU)值的平均值除以对照LU值的平均值)。检查原始数据发现，个别样本差异在三个重复试验中不显著。对于具有统计上超出剩余两个重复值的范围的任何值的样本，指派可疑反应并在随后试验中对这些样本进行再筛选(标注问号)。随后的测试表明，此样本差异是孔间可变细胞分布的产物。所以，在本试验中的主要可变度量在每个试验的诱导倍数值(在4.1到17.4的范围内)和其次的细胞数方面看似存在差异。
[0444] 为了进一步研究诱导倍数的主要调节因子，对HEK293 mTRdm-fLUC转化的细胞进行综合分析。对于本实施例，分离95个随机集落并使用标准TPA单毒素处理进行测定。评估43个反应亚克隆并呈现每个克隆的诱导倍数(图2D)。对反应克隆的整个组进行等级排列(最低值到最高值)并展示在相对于诱导倍数的图表上(最大的统计可变度量)。此图已称作等级图。上图显示所有反应细胞亚克隆的等级图(图2D)。在此分析中，最高反应者中极大的TR反应(异常值物种)压缩了剩余的值。在中间图中，去除了异常值后对等级图重新作图以说明三个独特的诱导倍数趋势。第一个诱导倍数趋势与表现适度TR特异性翻译反应的一组细胞相关，该组细胞已被称作I类细胞。对I类细胞的随后研究(例如，图10B)发现，这些细胞一致地对毒素处理无反应。第二个诱导倍数趋势是由相比于I类细胞在TR特异性报告基因活性上显示统计学显著增加(p<0.05)的一组细胞产生。这组反应细胞已被称作II类细胞。
剩余细胞系表现与I类和II类组存在统计学差异(p<0.05)的诱导倍数反应。这些高反应细胞系已被称作III类细胞。对于HEK293 mTRdm-fLUC细胞池，43个反应者中有25个(58.1％)显示I类表型，43个反应者中有13个(30.2％)显示II类表型，并且43个反应者中有5个(11.6％)标记为III类。
剩余细胞系表现与I类和II类组存在统计学差异(p<0.05)的诱导倍数反应。这些高反应细胞系已被称作III类细胞。对于HEK293 mTRdm-fLUC细胞池，43个反应者中有25个(58.1％)显示I类表型，43个反应者中有13个(30.2％)显示II类表型，并且43个反应者中有5个(11.6％)标记为III类。
[0445] 在补充分析中，回收120个随机的HEK293 hTRdm-fLUC转化集落，并使用TPA单毒素试验进行测定。评估82个反应亚克隆并指派到三个趋势(图2E)。第一个趋势包括50个适度反应I类克隆，第二个趋势由27个反应II类细胞系产生，而最后的III类趋势显示5个亚克隆(6.1％)。此外，对HEK293 mTRplp-fLUC转化细胞的类似分析发现，107个随机的HEK293 mTRplp-fLUC转化集落产生65个反应亚克隆(图2F)。对于HEK293 mTRplp-fLUC细胞池，65个反应者中有51个(78.5％)显示I类表型，65个反应者中有13个(20％)显示II类反应，并且65个反应者中有1个(1.5％)标记为III类。
[0446] 尽管如本文所述，非帽依赖性翻译过程与细胞从应激与死亡信号的恢复存在明显联系，但认为诱导倍数将受直接升高或降低核糖体活性的分子过程的调节。对核糖体蛋白的直接修饰预期会负面或正面地影响蛋白质合成的速率(例如，图33)。为了测试这一理论，本实施例提供对HEK293 CMV-fLUC转化细胞的综合分析(图2G)。这些细胞组成型地表达缺失了所有TR调节序列的基因盒。对于本实施例，使用标准TPA毒素试验测试71个随机集落，并使用39个反应亚克隆来定义诱导倍数值。对于HEK293 CMV-fLUC细胞池，39个反应者中有34个显示I类表型，39个反应者中有4个显示II类反应，并且39个反应者中有1个(2.6％)显示假设的III类表型。
[0447] 这些结果支持以下观点：毒素处理可诱导细胞应激与死亡，但也会直接影响一些敏感细胞中核糖体活性的速率。因此，可对非帽依赖性TR表达细胞系与帽依赖性组成型表达细胞系应用类别命名。
[0448] 通过汇编所有可用数据(图2-9)，可为两个组得出用于类别命名的定义。因此，I类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达高达500％，II类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的500％以上到1400％，并且III类细胞的特征在于报告蛋白的表达大于未曾用毒素处理的哺乳动物细胞中报告蛋白表达的1400％以上到约75000％。
[0449] (A)使用亚最佳毒素试验指派类别命名
[0450] 基于5-试验与15-试验方法，把“亚最佳”试验定义为产生最小翻译反应的任何试验。
[0451] 在本实施例中，使用亚最佳的dbcAMP单毒素试验对HCT116 mTRdm-fLUC转化细胞进行分析(表3)。对于本实施例，回收80个随机集落，并评估21个反应亚克隆(图7A)。具体来说，从表达组中回收少量的II类与III类细胞。然而，已知此测试组中少量的反应克隆(n＝21)和dbcAMP试验中的最小翻译反应，这些结果不太可能代表HCT116细胞中潜在mTRdm-fLUC反应的显著分布。第一个趋势包括20个适度反应I类克隆，第二个趋势含有1个反应II类细胞系，并且III类组中检测到0个亚克隆。
[0452] 这一非随机分布在扩展研究中得到验证(图7D)，其中使用TPA单毒素试验筛选了39个反应亚克隆。这些较大数量提供了不同的类别分布，并且现在包括显著数量的具有II类(20.5％)与III类(5.1％)表型的亚克隆。总体来说，用最佳毒素试验分析～50-60个反应克隆产生类别表型的随机分布，因为把额外亚克隆添加到池数据不会显著改变类别等级。
[0453] 在补充研究中，评估了表达基因盒的HCT116 mTRplp-fLUC转化细胞，该基因盒将mTRplp序列可操作地连接到荧火虫荧光素酶报告基因(图7B)。对于本实施例，回收91个随机集落并且评估12个反应亚克隆，并将诱导倍数值呈现在等级图中。如上所述，此细胞池中少量的反应性克隆不太可能代表HCT116细胞中潜在mTRplp-fLUC反应的显著比例。对于HCT116 mTRplp-fLUC细胞池，12个反应者中有11个显示I类表型，12个中有0个显示II类反应，并且12个中有1个(8.3％)足够大而被称作III类细胞类型。
[0454] 接下来的工作使用来自HCT116 CMV-fLUC转化池的68个随机集落和dbcAMP单毒素试验来定义类别顺序(图7C)。仅回收6个反应亚克隆，并把诱导倍数值显示于等级图中。如上所述，此细胞池中少量的反应克隆不太可能代表HCT116细胞中潜在CMV-fLUC反应的显著比例。对于此HCT116 CMV-fLUC细胞池，6个反应者中有6个显示I类表型，并且没有检测到II类或III类表型。
[0455] 在用最佳毒素试验进行池筛选的另一实施例中，用TPA单毒素试验处理来自HCT116 hTRdm-fLUC池的21个反应亚克隆，并鉴定出显著比例的I类(47.6％)、II类(33.4％)和III类(19％)表型。
[0456] 在相关实验中，对MDA231 mTRdm-fLUC转化细胞的分析采用亚最佳的dbcAMP单毒素试验(图8A)。在本实施例中，回收60个随机集落，并且仅有9个反应亚克隆可用于定义类别趋势。然而，此少量的反应克隆不太可能代表MDA231细胞中潜在mTRdm-fLUC反应的显著比例，因为未观察到II类或III类表型。
[0457] 使用对MDA231 mTRplp-fLUC细胞池(其表达将mTRplp序列可操作地连接到荧火虫荧光素酶报告基因的基因盒)的进一步分析来分离83个随机集落，使用亚最佳的dbcAMP单毒素试验对此83个随机集落进行评估(图8B)。33个反应亚克隆之中，将33个反应者均归入I类，并且未检测到II类或III类细胞。
[0458] 最后，对MDA231 CMV-fLUC转化细胞池的分析检验60个随机集落并使用亚最佳的dbcAMP单毒素试验测试翻译反应(图8C)。17个反应亚克隆之中，17个反应者均归入I类组，并且未检测到II类或III类细胞。
[0459] 在本实施例中，亚最佳的毒素试验未能产生最大翻译反应，并且当与最小数量的反应克隆联合时，产生不适当的类别分布。这通过随后的研究来验证(图10)，其中用最佳毒素试验进行的再筛选建立了更为准确的类别分布。因此，尽管不受具体理论束缚，但仍认为可利用最佳毒素试验，使用适当数量的反应克隆(至少约40个)获得最准确的类别分布。
[0460] (A)使用亚最佳的池尺寸指派类别命名
[0461] 任何统计学测量都是依赖于无偏差、随机分布和足够大的样本尺寸。已知分离用于类别定义的集落所使用的随机方法和测定所有克隆的事实，在这些研究中实现了无偏差和随机分布。如图7D中所示，增大样本尺寸提高了鉴定诱导倍数趋势的能力和对类别命名准确地指派幅度的能力。
[0462] 在本实施例中，使用MCF7 mTRdm-fLUC转化细胞池回收103个随机集落，使用TPA毒素试验对此103个随机集落进行测定(图5A)。回收并分析11个反应亚克隆，虽然少量的反应克隆不太可能代表MCF7细胞中潜在mTRdm-fLUC反应的显著比例。第一个趋势包括6个适度反应I类克隆，第二个趋势只含有4个反应II类细胞系，并且最后的III类趋势只包括1个亚克隆(9.1％)。
[0463] 在样本尺寸对类别分布的影响的实施例中，图5E示出，即使在采用完全相同的毒素试验时，池尺寸从11个亚克隆增加到92个亚克隆会显著改变类别等级。类别分布改变使得50.0％的反应克隆显示III类表型，相比之下较小的筛选为9％。
[0464] 在补充工作中，使用MCF7 mTRplp-fLUC转化细胞分离106个随机集落(图5B)。在此数量之中，评估36个反应亚克隆并归入类别。对于MCF7 mTRplp-fLUC细胞池，36个反应者中有31个(86.1％)显示I类表型，36个反应者中有3个显示II类反应(8.3％)，而36个反应者中有2个(5.6％)标记为III类。对于在MCF7 hTRdm-fLUC细胞池中的89个反应克隆(图5D)，89个中有68个(76.4％)显示I类表型，这与II类(89个中有17个；19.1％)和III类(89个中有4个；4.5％)分布形成对比。尽管后一池含有的亚克隆大于前一池中亚克隆总数量的两倍，但仍检测到非常类似的类别分布。类似地，使用MCF7 CMV-fLUC转化细胞测定帽依赖性改变(图5C)。在本实施例中，使用标准TPA毒素试验测试58个随机集落。如上所述，测定50个反应亚克隆并把诱导倍数值示出在等级图中。与上文相比而言，较大数量的反应亚克隆可能代表MCF7细胞中潜在CMV-fLUC反应的显著比例。对于此MCF7 CMV-fLUC细胞池，50个反应者中有45个显示I类表型，50个中有5个显示II类反应，并且没有检测到III类细胞。
[0465] 在小亚克隆计数的另一实施例中，测试DU145 mTRdm-fLUC转化细胞，回收119个随机集落，并使用TPA毒素试验对此119个随机集落进行测定(图6A)。评估22个反应亚克隆并使用等级图来鉴定三个假设的类别趋势。第一个趋势包括5个适度反应I类克隆(22.7％)，第二个趋势由13个反应II类细胞系产生(59.1％)，并且最后的III类趋势表现4个亚克隆(18.2％)。
[0466] 在本实施例中，把池尺寸增加到65个亚克隆仅仅使I类和II类分布减少约10％(图6B)。然而，这些减少各自都被输入III类组中，其从18.2％增加到33.8％。这一影响与图5E中观察到的趋势非常类似，这表明，在较小池中的非随机分布可能有不明确的生物组分涉及增加的生存力，这在较大样本尺寸的加工过程中被克制。
[0467] 为了进一步测试这一假设，使用78个随机集落对DU145 CMV-fLUC转化细胞进行初始分析，鉴定16个反应亚克隆(图6C)。如上所述，此细胞池中少量的反应克隆不太可能代表DU145细胞中潜在CMV-fLUC反应的显著比例。对于此DU145 CMV-fLUC细胞池，16个反应者中有14个显示I类表型(87.5％)，16个中有2个(12.5％)显示II类反应，并且没有检测到III类细胞。
[0468] 此池尺寸随后从16扩大到55(图6D)导致明显的类别分组的变动：87.5％到54.5％(I类)、12.5％到40％(II类)和0％到5.5％(III类)。在这些情况下，趋势是从由适度反应I类细胞占主要地位的小样本组移动到II类与III类比例增加的更随机分布的池。所以对于这些细胞系，取样误差显然导致产生具有无反应细胞类型的小池，这可能是在集落形成期间毒性作用的量度。
[0469] 然而，取样误差也很可能产生涉及II类与III类细胞的非随机分布。对于生长缓慢的细胞，与II类和III类细胞相关的增强生长表型可能导致产生具有最小I类表现的小池。对这一理论的支持示出在此最后实施例中(图9)，其中回收并分析来自HepG2 mTRdm-fLUC池的反应亚克隆的小群(n＝5)。与在较大研究中产生的正态分布形成对比，5个回收克隆均表现II类或III类表型(图9B)。随后使用15-试验程序对亚克隆#16的此类别指派进行确认(图9C)。
[0470] 最后，取样误差还会因低转染效率以及用于分离亚克隆细胞系的尺寸不适当的原代细胞池的制备与使用而产生。U2OS骨肉瘤细胞系可能表现这种类型的取样误差的一个例子。重复的转染程序仅导致适度数量的稳定集落(<250)，这些集落在合并时明显导致潜在克隆类型的非随机分布。在本实施例中，使用U2OS mTRdm-fLUC转化细胞池分离122个随机集落，使用TPA毒素试验对此122个随机集落进行测定(图4A)。106个反应亚克隆中，95个表现I类反应(89.6％)，11个是II类细胞系(10.4％)，并且未检测到III类亚克隆。
[0471] 在相关研究中，使用U2OS mTRplp-fLUC转化细胞池回收106个随机集落，使用标准TPA毒素试验对此106个随机集落进行评估(图4B)。82个反应亚克隆产生81个I类亚克隆(98.8％)、1个II类亚克隆(1.2％)，并且无III类细胞。
[0472] 最后，使用U2OS CMV-fLUC转化细胞池分离83个随机集落，使用标准TPA毒素试验对此83个随机集落进行测试。79个反应亚克隆中，78个表现I类表型(98.7％)，无一个是II类，而79个中有1个(1.2％)显示III类活性。即使检验了大量的个别亚克隆(每项工作中>80)，每项U2OS研究仍产生非随机类别等级，其中过多的亚克隆显示I类表型。
[0473] 因此，较小的样本尺寸可为影响类别指派的主要误差。取样误差可能会产生于尺寸不适当的稳定转化原代细胞池中或产生于为类别指派所测试的少量亚克隆的情况中(见上文)。在汇编所有池数据组时，可通过使用含有>500个初级转化体的原代细胞池和筛选具有30-60个独立亚克隆(来源于从多个独立稀释板分离的亚克隆)的亚克隆组来产生随机分布。
[0474] (A)接种条件对诱导倍数的影响
[0475] 使用最大细胞密度(汇合方法)或细胞限制程序(细胞计数方法)接种细胞培养物以供分析。认为使细胞密度最大化也将会使基础水平或背景翻译活性最大化，并且这可能对诱导倍数计算的共同特征具有显著影响。
[0476] 本实施例显示，与分汇合的(subconfluent)25,000个细胞计数相比，使用细胞汇合方法接种表达CMV-fLuc、mTRdm-fLuc和mTRplp-fLuc表达盒的未处理MDA231细胞增加了孔中细胞的绝对数量并且大体上提升了基础水平报告基因值(图13A)。然而在TR表达细胞系中，使用细胞计数程序相对于汇合方法，在6个细胞系中有2个表现基础水平报告蛋白活性的显著增加(图13B)。这表明对于一些细胞系，分汇合培养物可能表现调节基础水平TR特异性翻译的一些生物学效应。
[0477] E.证实类别指派不是报告蛋白的产物
[0478] 在本实施例中，测试报告序列对诱导倍数值和最终对类别命名的影响。本实施例采用将mTRdm序列可操作地连接到gaussia荧光素酶报告基因的替代性TR表达盒。使用HEK293 mTRdm-gLUC转化细胞池，回收129个随机集落并使用TPA毒素试验进行测定(图3A)。81个反应性亚克隆中检测到三个类别趋势。第一个趋势包括56个适度反应I类克隆(69.1％)，第二个趋势由23个反应II类细胞系产生(28.4％)，并且最后的III类趋势表现2个亚克隆(2.5％)。
[0479] 在相关研究中，使用HEK293 hTRdm-gLUC转化细胞分离110个随机集落，使用标准TPA毒素试验对此110个随机集落进行评估(图3B)。评估89个反应亚克隆，89个反应者中有56个显示I类表型(62.9％)，30个显示II类反应(33.7％)，并且3个(3.4％)标记为III类。
[0480] 最后，使用HEK293 mTRplp-gLUC转化细胞分离104个随机集落，用TPA毒素试验对此104个随机集落进行测试(图3C)。来自HEK293 mTRplp-gLUC细胞池的69个反应亚克隆之中，69个反应者中有58个显示I类表型(84.1％)，9个显示II类反应(13.0％)，并且69个中有2个(2.9％)显示III类表型。
[0481] 比较HEK293 gLuc(图2)与fLuc研究(图2)，很清楚的是，用含有gLuc报告序列的表达载体转化的细胞在HEK293类别等级上未显示任何显著差异。因此，类别等级是基于细胞的表型而不是载体盒的产物。
[0482] 实施例IV—对确定类别的细胞系应用15-试验程序
[0483] A.验证使用最佳条件进行的类别命名保留在低传代培养物中的类别命名
[0484] 本实施例评估类别命名是否是在细胞传代期间得以维持的可遗传表型。图4含有对U2OS细胞系的详细分析，即使在使用最佳试验与培养条件进行筛选试验时此U2OS细胞系也仍产生很少量的III类细胞。很难确定这是否是非重复U2OS翻译反应或取样误差的结果。为了更详细地检验此过程，使用15-试验细胞计数程序再次检验低传代(P5-P8)细胞系(图
10A)。尽管U2OS mTRdm-fLUC#109和#40亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中在翻译反应方面表现～50％的增加，但变化的幅度并未改变II类命名。
10A)。尽管U2OS mTRdm-fLUC#109和#40亚克隆在TPA+泰素的二毒素试验中在翻译反应方面表现～50％的增加，但变化的幅度并未改变II类命名。
[0485] (A)验证使用亚最佳条件进行的类别命名会转换类别命名
[0486] 在本实施例中，对HCT116 mTRdm-fLUC 12-15、7-5、12-3和12-16细胞系应用15-试验方法(图10B)以再次评估类别指派。起初，使用通过亚最佳dbcAMP单毒素试验筛选的少量的亚克隆对每个细胞系指派I类命名(图7)。HCT116 mTRdm-fLUC 12-15和12-3亚克隆继续表达I类表型，而HCT116 mTRdm-fLUC 7-5和12-16亚克隆显示清楚的III类表型(>1500％的诱导)。
[0487] 在相关工作中，对三个HCT116 mTRplp-fLUC亚克隆11-20、3-11和3-9的再分析示出在图10C中。起初，使用dbcAMP单毒素试验对每个细胞系指派I类命名(图7B)；然而，再分析显示，在TPA+泰素的二毒素试验中，HCT116 mTRplp-fLUC 11-20亚克隆表达II类表型(>500％但<1400％的诱导)，而HCT116 mTRplp-fLUC 3-11和3-9亚克隆表现III类反应(>
1400％的诱导)。
1400％的诱导)。
[0488] 类似地，对HCT116 CMV-fLUC 4-1和4-20亚克隆应用15-试验方法发现，在TPA+泰素的二毒素试验中，HCT116 CMV-fLUC 4-1亚克隆继续表达I类表型，而HCT116 CMV-fLUC 4-20亚克隆表现II类反应(图10D)。
[0489] 为确认类别转换不是HCT116细胞类型的独特性质，在MDA231 mTRdm-fLUC 4-23、4-8、4-7和3-1亚克隆中检验TR类别命名(图10E)。虽然起初指派I类命名(图8A)，但随后的再分析发现，在TPA+泰素的二毒素试验中，MDA231 mTRdm-fLUC 4-1、4-8和4-7亚克隆继续表达I类表型，而MDA231 mTRdm-fLUC 3-1亚克隆表现II类反应。
[0490] 由对MDA231 mTRplp-fLUC 3-12、5-2、5-13和2-17亚克隆的再筛选提供进一步的证据(图10F)。虽然对每个细胞系指派I类命名，但随后的测试显示，3-12、5-2和5-13亚克隆保留它们的I类反应，而2-17亚克隆表现II类表型。
[0491] 最后，对MDA231 CMV-fLUC 1-21、2-5和1-20亚克隆应用15-试验方法(图10G)发现，虽然每个亚克隆在二毒素试验中表现升高的翻译活性，但这些亚克隆中无一改变类别而是保持为I类细胞。
[0492] 实施例V—通过亚克隆与再选择在高传代培养物中的类别恢复
[0493] A.通过亚克隆来恢复确定类别的表型的方案
[0494] 本实施例通过再亚克隆检验TR特异性类别命名的恢复和/或增强。高传代数细胞培养物在许多细胞过程中累积改变。有丝分裂期间的染色体丢失和基因组改组会改变不赋予该细胞选择性生长优势的任何重组表达系统。对于高传代数细胞培养物来说分离可选择质粒并非常见。
[0495] 本实施例检验一种用于使用二次亚克隆恢复类别表型以恢复有价值的细胞性状的方法。在本实施例中，从II类MDA231 mTRplp-fLUC 2-17细胞系分离二次亚克隆的综合(n＝113)汇集，并使用TPA或泰素单毒素试验进行测定(图11A)。此池中，大多数亚克隆继续显示II类反应；然而，少量的细胞系在两个试验中都表现增强的翻译反应以及III类表型。
[0496] 类似地，从III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系分离较大系列的二次亚克隆，并用TPA或泰素单毒素试验进行测试(图11B)。尽管绝大多数亚克隆显示III类反应，但显著比例的回收细胞系与亲代细胞系相比表现增强的TR活性，其中一些亚克隆表现翻译活性是亲代细胞系的三倍。
[0497] 在另一实施例中，用泰素单毒素试验处理从III类MCF7 mTRplp-fLUC#43细胞系分离的95个二次亚克隆(图11C)。尽管此高传代培养物中的大部分亚克隆表现减少的翻译反应，但一小比例的二次亚克隆(～7％)表现与亲代细胞系相比报告蛋白活性更高的III类表型。
[0498] 类似地，使用泰素单毒素试验测定从III类MCF7 mTRdm-fLUC#64细胞系分离的一定数量的二次亚克隆(图11D)。大多数二次亚克隆保留III类表型，并且显著比例(～35％)显示与亲代细胞系相比增强的TR活性。
[0499] 因此，从高传代细胞培养物恢复类别命名可通过二次亚克隆来完成。此外，虽然不束缚于某种理论，但这些数据表明，在这些高传代培养物中遗传变异的累积产生类似于亲代细胞系的翻译活性的混合物。虽然大部分二次亚克隆继续表达亲代类别等级，但在许多情况中，可观察到TR表型的增强。这表明，二次亚克隆提供一种用于回收表达原始类别等级的细胞的方法，还允许分离更高反应的亚克隆。
[0500] (A)通过再选择来恢复确定类别的表型的方案
[0501] 高传代数细胞往往分离未选择的表达载体。在许多情况下，这将导致用于产生原始细胞池的可选择抗生素抗性基因的丧失。在本实施例中，把mTRdm-fLUC转化HCT116亚克隆7-2与12-16以及称作Sub#30与Sub#38的12-16的两个亚克隆(浅色柱)的高传代数培养物维持在培养中，直到它们的TR特异性翻译表型明显丧失(图12)。使用在TR表达盒中的G418抗生素抗性标记对每个高传代细胞培养物进行再选择，直到用显微镜检测不到显著的细胞死亡。使用TPA单毒素试验(图12B)与TPA+泰素的二毒素试验(图12A)检验这些再选择的细胞系。使用学生T检验(Student's T-test)进行统计分析发现，在再选择过程之后翻译活性具有统计学上显著的增加(p<0.05)。
[0502] 实施例VI—使TR特异性报告基因活性与TR来源的翻译产物及其使用相关联[0503] A.验证毒素诱导的TR比活性的增加是由增加的蛋白质产生而产生
[0504] 本实施例中，在许多毒素试验中检验到由TR盒产生的极大的TR特异性反应以表明这些酶活性的增加与蛋白质浓度的增加相关。此测试中，使III类HCT116 mTRdm-fLUC 7-5细胞系经历15-试验程序，并且每一试验都产生未变性的细胞裂解物。针对fLUC活性测定每一种细胞裂解物的确定比例(10％)并与通过直接测定所测定的相同细胞系相比较(图14A–14B)。尽管15-试验趋势不变，但对于TPA+泰素的二毒素试验的诱导倍数的幅度在细胞提取物中发生变化。
[0505] 使剩余的毒素处理细胞样本(总细胞的90％)沉淀，并使用1×SDS裂解缓冲液(50mM TrisHCl(pH6.8)、2％SDS、10％甘油、10mM DTT、5mM EDTA、1X Roche蛋白酶抑制剂混合物)制备总蛋白质样本。利用考马斯蓝染色的12％SDS-PAGE凝胶建立每个蛋白质样本的完整度和浓度。在第二个SDS-PAGE凝胶上分析等量的蛋白质浓度，并使用抗荧火虫荧光素酶一抗和适当标记的二抗(见上文)，利用Western免疫印迹分析来检测fLUC蛋白水平(图14B)。尽管在MG132、TPA+泰素、TPA+MG132和泰素/CaIon试验中观察到显著的fLUC蛋白水平，但谱带强度与图14A中所示的酶标仪结果相一致。
[0506] 如上所述，对Western免疫印迹的光密度扫描(图14C)在TR特异性蛋白质水平的趋势上相比于酶标仪测定值未发现显著变化，表明由酶标仪程序测定的报告蛋白活性与TR介导的蛋白质合成之间存在强关联性。但是，在由用MG132单毒素试验(一种可扩散的蛋白酶体抑制剂)处理的细胞制备的裂解物的Western免疫印迹分析中检测到了报告蛋白水平在统计学上显著的增加(p<0.05)。虽然不束缚于任何具体理论，但仍认为这一结果表明，影响蛋白质周转的毒素可能通过经由蛋白质变性或修饰来降低报告蛋白活性而人为地降低酶标仪试验中TR介导的反应。
[0507] (A)采用毒素调节的TR比活性的增加用于重组蛋白选择性表达的程序
[0508] 人细胞系中高浓度重组蛋白的产生在生物技术制造过程中提供相当大的优势。在本实施例中，检验人III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系作为用于重组蛋白的TR调节表达的潜在资源。
[0509] 为了量化细胞系中重组蛋白的量，把所表达蛋白质的比活性与纯化蛋白质的已确定比活性进行比较。对于本实施例，使用重组荧火虫荧光素酶蛋白质(Sigma；1mg；4.6mg/1ml，利用Bradford试验所测定)的连续稀释产生剂量反应曲线(图15A)。
[0510] 观察到线性剂量反应，其产生每毫克重组fLuc蛋白3×1011个光单位的比活性。使用考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，验证重组fLUC蛋白原液至少具有98％的纯度并且至少每微升5微克fLUC蛋白。
[0511] 使III类HCT116 mTRdm-fLUC 12-16细胞系经历15-试验毒素方案(图15B)。用溶解于培养基中的所指示毒素处理汇合的12孔培养盘并孵育6小时。将3个孔中的细胞回收于1ml的1×PBS中，将100ul(总细胞数的1/10)转移到新鲜的微量离心管中，在10,000rpm下离心1分钟。将此细胞沉淀重新悬浮于40ul荧光素酶裂解缓冲液中，并使用标准酶标仪程序测定荧火虫荧光素酶活性。把每个毒素试验中产生的相对光单位与重组蛋白连续稀释图中观察到的线性反应进行比较(图15A)。使用这些值计算12孔培养盘的3个孔中所表达蛋白质的量的估计值(图15B)。例如，假设12孔培养盘的每个孔平均含有400,000个细胞，那么将TPA+泰素试验的比活性转换为每细胞442毫微微克(fg)fLUC蛋白的保守估计值。
[0512] 把剩余细胞沉淀(毒素处理细胞的90％)溶解于200ul的1×SDS缓冲液中，并制备总蛋白质样本。在12％SDS-PAGE凝胶上分析5ul的每种样本，并使用抗fLUC一抗，利用Western免疫印迹分析显现(图15C)。虽然在MG132、TPA+泰素和TPA+MG132试验中观察到极高的蛋白质水平，但谱带强度与细胞提取物中所计算fLUC报告蛋白浓度相一致，如图15B中所示。
[0513] 使用本发明的TR表达系统产生重组蛋白具有许多优点。例如，这些优点包括：1)能够在人源中合成蛋白质(去除了关于异基因蛋白的问题)，2)通过使用细胞特异性毒素而提供的固有调节过程刺激TR特异性翻译，从而允许潜在致死蛋白的受调节表达，3)翻译过程的速度(例如，毒素处理进行相对较短的时间，例如6小时)，和4)本发明表达系统可应用于广范围的哺乳动物细胞，因此基本上消除了关于蛋白质加工、翻译后修饰和周转的问题。
[0514] 实施例VII—使用毒素试验程序与反应性细胞系来鉴定和定义翻译调节
[0515] A.使用采用PKC激活剂的对比性剂量反应试验的程序来检测帽依赖性与非帽依赖性翻译调节
[0516] 除了测定帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译影响、类别特异性翻译活性和毒素定义的作用之外，先前所述的材料与方法允许设计各种各样的应用来检测和表征调节核糖体活性的试剂与过程。本实施例中，使用对比性剂量反应试验来检测MCF7细胞中的帽依赖性与非帽依赖性翻译调节。此应用的基础是观察到不同剂量下的化合物产生明显不同的翻译反应。当一组化合物作用于共同的分子靶时，可把它们归入相关药物种类。通过在确定的剂量范围上比较化合物种类的个别种，可确定在翻译调节上的差异。此外，这些翻译差异往往会与生物学差异存在联系。
[0517] 图27示出应用剂量反应程序来在MCF7乳腺癌细胞中区分蛋白激酶C(PKC)激活剂种类内的化合物特异性影响。这一组由佛波醇酯(TPA)和大环内脂类内酯(苔藓抑制素(Bryostatin)1与苔藓抑制素2)构成。虽然先前研究显示苔藓抑制素类似于TPA可诱导短暂的细胞形态变化并抑制细胞生长，但其它性状(诸如对DNA合成与PKC转位到质膜的抑制等)却降低很多。大环内酯类内酯还显示内部差异，其中苔藓抑制素2表现比苔藓抑制素1大10倍的抑制常数(Ki)。
[0518] 本实施例中(图27)，三个PKC激活剂在帽依赖性试验中产生类似的剂量反应趋势。在1nM到250nM的范围上，每种激活剂表现帽依赖性翻译的线性增加，其在100nM剂量下达到峰值。然而，大环内酯类内酯产生的翻译增加大体上是TPA翻译反应的60％-70％(图27B)。
事实上，要产生类似于100nM TPA试验的翻译幅度，需要苔藓抑制素2的浓度增加25倍(2.5uM)(图27B)。
事实上，要产生类似于100nM TPA试验的翻译幅度，需要苔藓抑制素2的浓度增加25倍(2.5uM)(图27B)。
[0519] 在非帽依赖性试验中，在1nM到250nM的范围上观察到类似的剂量反应趋势，其中翻译峰值出现在100nM剂量。然而，苔藓抑制素增加的幅度大体上是100nM TPA反应的30％。与帽依赖性试验的另一差异在于：把苔藓抑制素2剂量增加到2.5uM仅导致产生100nM TPA反应的～50％。
[0520] 虽然苔藓抑制素药物在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中表现类似反应，但在TPA与苔藓抑制素之间检测到明显差异。在每个试验类型中，TPA表现增加的翻译反应，其可能只能由极高浓度下的苔藓抑制素2在帽依赖性测试中来重现。对于非帽依赖性试验，利用TPA观察到更大幅度的差异，这可能即使在高剂量下的苔藓抑制素2也不能重现。因此，对比性剂量反应试验显示，TPA激活的翻译反应与苔藓抑制素的翻译反应存在显著差异，这一事实与这些化合物的已知生物学活性相一致。相比之下，苔藓抑制素显示高度类似的剂量反应趋势，只是在高剂量下(>500nM)存在差异，这也与它们先前描述的生物学效应相一致。
[0521] (A)使用采用微管破坏剂的比较剂量反应试验的程序来检测帽依赖性与非帽依赖性翻译调节
[0522] 已经使用比较剂量反应试验的另一应用在HEK293胚肾细胞中区分微管破坏剂(MTD)药物之间的药物特异性表型(图29)。利用自身防御增殖细胞侵袭的植物所开发，生物碱(诸如MTD药物)通过阻断微管功能使细胞停滞在有丝分裂期间。如本领域中已知的，动态细胞骨架结构对于正常细胞功能具有重要性。在微管情况下，干扰微管蛋白亚单位蛋白的重塑会通过阻断细胞周期进程而产生显著的抗增殖活性。然而，破坏微管的药物在微管蛋白结合之后表现显著的生物学差异。例如，诺考达唑和秋水仙碱结合不全相同的重叠蛋白序列下的微管并阻断防止聚合和促进解聚的微管组装位点。长春花生物碱(诸如长春新碱与长春花碱)结合微管蛋白并诱导它聚集形成防止微管组装的不溶性晶体。最后，泰素结合微管并使完整微管稳定，这干扰了它们在细胞分裂期间的解组装。
[0523] 本实施例中，用不同剂量的MTD药物处理HEK293细胞来检测化合物特异性翻译调节。暴露6小时以后，帽依赖性试验显示，诺考达唑、秋水仙碱和长春新碱在100nM与5uM剂量之间表现报告蛋白活性的一致性增加。相比之下，仅在最高泰素剂量下(2.5uM和5uM)观察到fLUC表达的显著变化。
[0524] 由每个TR表达细胞系产生了高度类似的非帽依赖性翻译谱(图29B与C)。如同图29A中的帽依赖性试验，秋水仙碱和长春新碱在大于100nM的所有剂量下表现增加的报告蛋白活性。这与诺考达唑反应形成对比，在诺考达唑反应中，仅在大于250nM的浓度下观察到显著增加。如前所述，仅在2.5uM和5uM剂量下观察到泰素特异性翻译增加。
[0525] 尽管秋水仙碱和长春新碱在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中展示了类似的翻译反应，但诺考达唑产生了明显不同的非帽依赖性反应。虽然在高泰素剂量下观察到显著的翻译增加，但这种药物仍一贯地产生了MTD药物的最小翻译反应。因此，单毒素剂量反应试验可用来比较具有同一分子靶标的药物和检测翻译调节上的差异。在这些试验中，可以把这些差异与每个药物种类所表现的独特生物学活性相关联。
[0526] C.使用采用拓扑异构酶I抑制剂的组合毒素试验的程序来检测帽依赖性与非帽依赖性翻译调节
[0527] 本实施例说明应用单毒素与二毒素试验来使用拓扑异构酶I抑制剂在MCF7乳腺癌细胞中区分化合物特异性翻译反应(图28)。喜树碱和它的化学相关类似物属于产生减弱的DNA解旋和抑制DNA复制与转录的一类拓扑异构酶I(TopoI)抑制剂。虽然伊立替康(irinotecan)在结构上与其它TopoI抑制剂相关，但其不同之处在于它需要存在肝脏或胃肠的羧酸酯酶以供代谢为称作SN38的活性形式。这种代谢活性在MCF7细胞中缺失并且提供用于检测化合物特异性翻译调节的基础。这些结果还提供选择性降低核糖体活性的药物的例子，尽管它们的分子靶标不改变蛋白质翻译。
[0528] 图28A示出使用不同剂量(10nM到10uM的范围)的下列TopoI抑制剂处理的MCF7细胞的帽依赖性剂量反应试验：喜树碱、拓扑替康、伊立替康和鲁比替康。喜树碱和鲁比替康显示类似的剂量反应，其中增加的fLuc蛋白质表达在～1uM时达到峰值，而在更高剂量下下降到基础表达水平。虽然改变的伊立替康反应可能已经基于它的代谢需求量进行预测，但是拓扑替康在单毒素试验中对帽依赖性翻译没有作用是出乎意料的。
[0529] 应用二毒素剂量反应试验检验在TPA翻译激活剂存在下通过TopoI抑制剂进行的帽依赖性调节(图28B)显示，喜树碱和鲁比替康与TRA协同作用来增加fLUC蛋白活性直到1uM剂量，但在更高浓度下拮抗TPA的活性。由于在单毒素试验中类似剂量抑制翻译(图
28A)，所以这一影响可能代表对翻译的直接影响。伊立替康不显著改变TPA特异性翻译反应，而相比之下，拓扑替康仅在高剂量下(即，5uM和10uM)显示TPA拮抗作用。这些结果使喜树碱和鲁比替康置于类似的翻译调节组，其在表型上与拓扑替康产生的反应相重叠，但不同于伊立替康的反应。
28A)，所以这一影响可能代表对翻译的直接影响。伊立替康不显著改变TPA特异性翻译反应，而相比之下，拓扑替康仅在高剂量下(即，5uM和10uM)显示TPA拮抗作用。这些结果使喜树碱和鲁比替康置于类似的翻译调节组，其在表型上与拓扑替康产生的反应相重叠，但不同于伊立替康的反应。
[0530] 与帽依赖性试验形成对比，四种化合物都在低剂量下(10nM和100nM)增加非帽依赖性翻译，但只有喜树碱、鲁比替康和拓扑替康在更高剂量下(5uM和10uM)降低fLUC活性(图28C)。特别值得注意的是高浓度的喜树碱和鲁比替康导致fLUC水平低于未处理对照细胞中的水平的影响(<100％)。这不同于高剂量拓扑替康试验，后者仅是把翻译活性降低到对照细胞水平。如所预期的，这些结果不同于伊立替康所获得的结果，伊立替康展示在所有测试浓度下恒定水平的fLUC活性。
[0531] 图28D示出与100nM TPA翻译激活剂组合使用不同剂量的TopoI抑制剂的二毒素剂量反应试验的使用。四种抑制剂都在低剂量下与TPA协同作用来增加蛋白质翻译。在高于100nM的浓度下，喜树碱、鲁比替康和拓扑替康拮抗TPA反应并降低fLUC表达。如上所述，高剂量喜树碱和鲁比替康拮抗总fLUC翻译，并导致报告蛋白水平低于未处理对照细胞(<
100％)。相比之下，高剂量拓扑替康反应表现报告蛋白的基础水平表达。伊立替康二毒素试验显示与TPA的协同作用，以及在所有测试剂量下增强的fLUC活性。
100％)。相比之下，高剂量拓扑替康反应表现报告蛋白的基础水平表达。伊立替康二毒素试验显示与TPA的协同作用，以及在所有测试剂量下增强的fLUC活性。
[0532] 虽然不束缚于具体理论，但仍认为这些结果显示，除了它们对拓扑异构酶1的已知作用之外，低剂量的TopoI药物可单独或与TPA组合刺激蛋白质合成。相比之下，高剂量的TopoI药物抑制翻译活性，其中最大幅度变化发生于受刺激的TR表达细胞系中。如所预期的，MCF7细胞缺乏酶系统以把伊立替康转变为其活性形式并且导致明显不同的翻译调节谱。然而，出乎意料的结果是低剂量的这种非活性前体能够单独或与TPA组合增强翻译活性。这一应用提供了一种系统来明智地设计和测试特异性调节翻译反应的TopoI抑制剂药物结构的分子模型。
[0533] D.使用采用翻译延伸抑制剂的组合毒素试验的程序来检测帽依赖性与非帽依赖性翻译调节
[0534] 在本实施例中(图33)，使用单毒素与二毒素剂量反应来定义与翻译抑制剂相关的翻译反应。蛋白质生物合成的抑制剂一般通过干扰翻译起始(翻译所必需的组件或结构的组装)或延伸(肽合成的酶促过程和核糖体内的链运动)来起作用。存在影响这些阶段中每一阶段的各种各样的翻译抑制剂。由于帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译显示明显不同的翻译起始机制，所以本实施例集中于与肽延伸相关的翻译抑制剂。因为这些酶促过程中大多数都是帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译所共有的，所以在链延伸上的任何显著差异都反映肽合成上的差异。
[0535] 对于本实施例，延伸抑制剂的组包括放线菌酮(阻断蛋白质合成中的转位步骤)、茴香霉素(阻断80S核糖体中酶促肽酰转移酶活性)、嘌呤霉素(通过阻断核糖体A位点来引起过早的肽链终止)和吐根碱(结合40S核糖体亚单位的S14蛋白并防止EF2依赖性肽转位)。虽然每种药物改变共同的核糖体活性，但各自可能影响明显不同的生物学过程。
[0536] 使用剂量反应单毒素试验在HEK293细胞中检验翻译调节(图33A)。虽然在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中注意到许多共同影响，但延伸抑制剂的一个具体性状是它们阻断总蛋白质合成的能力。例如，翻译抑制停止报告蛋白产生，并且蛋白质周转使报告蛋白活性降低到基础水平以下。本实施例中，在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中250nM浓度的每种抑制剂足以使蛋白质合成降低到对照细胞水平以下(图33A)。此外，2.5uM以上的任何剂量都只产生报告蛋白活性极小的额外降低，从而支持了这些试验中的翻译已经停止的理论。使用这些试验的结果，fLUC蛋白活性下降30-40％表明，fLUC蛋白在HEK293细胞中表现超过6小时的半衰期。
[0537] 除了这种广义翻译调节之外，还观察到了明显不同的抑制剂特异性和细胞特异性反应。例如，嘌呤霉素需要2.5uM的浓度来把帽依赖性与非帽依赖性报告蛋白活性降低到由其它三种抑制剂产生的水平。这表明，在这些试验中可检测到嘌呤霉素的结合或活性方面的广义差异。类似地，茴香霉素和吐根碱在HEK293 CMV-fLUC#3(上图)与mTRdm-fLUC#45(下图)亚克隆中表现明显不同的活性(图33A)。在这些细胞系中，低剂量的茴香霉素(～25nM)和吐根碱(100nM)足以把报告蛋白水平降低到未处理对照细胞的水平以下。因为这一影响在hTRdmfLuc#13亚克隆中未观察到(中间图)，所以可能是翻译调节中的细胞特异性差异导致对这些化合物的敏感性增强(细胞翻译的抗性缺乏)。
[0538] 在第二项工作中，通过改变延伸抑制剂的浓度并结合100nM TPA激活剂来进行二毒素剂量反应试验(图33B)。设计此组合试验来检验优先翻译TR转录本的受刺激细胞中的蛋白质合成。如同在单毒素试验中一样，利用2.5uM嘌呤霉素遏制帽依赖性翻译(上图)，而相比之下在非帽依赖性试验中，需要增加10倍的嘌呤霉素浓度(25uM)来阻止新的蛋白质合成。然而，即使在此最高测试剂量下，在任何细胞系中都未观察到立即的翻译抑制(图33C)。
[0539] 比较HEK293 mTRdm-fLUC#45与hTRdm-fLUC#13亚克隆显示，前者在TPA激活细胞中对于放线菌酮、嘌呤霉素和吐根碱来说表现很少或没有降低到未处理对照细胞水平以下。统计分析(下表)确认了此差异的显著性。虽然fLUC蛋白周转估计值在TPA处理的HEK293 CMV-fLUC#3和hTRdm-fLUC#13亚克隆中保持一致(6小时)，但在mTRdm-fLUC#45亚克隆中蛋白质水平没有任何下降与此时期中的蛋白质周转不一致。因为单毒素试验显示HEK293 mTRdm-fLUC#45亚克隆对这三种抑制剂敏感，所以这一结果支持蛋白质周转在暴露于TPA之后降低的理论。
[0540] 在此组合试验中检测的其它抑制剂特异性与细胞特异性影响中，最明显的是在帽依赖性试验与非帽依赖性试验中10nM茴香霉素对TPA反应的拮抗作用(与TPA单毒素试验相比下降50％-300％)。在未受刺激细胞中未观察到类似的作用。
[0541] 由于大多数酶促过程应是帽依赖性翻译与非帽依赖性翻译所共有的，所以在TPA+抑制剂的二毒素试验中检测到的链延伸的显著差异证明肽合成中未预料到的基本差异。这些差异看来可能涉及核糖体结构或活性的微妙变化。
[0542] E.使用更新的15-试验程序检测帽依赖性与非帽依赖性翻译调节
[0543] 把新的化学试剂从研究中推动到药品配置中的进展因缺乏高信息量毒理学与安全评价程序而受到阻碍。具体来说，药物开发中的预测毒理学可通过含有临床相关试验的反应的数据库来增强。为解决这些需要，图30展示更新的15-试验的例子，其采用从人相关来源(诸如临床试验和人批准药物)取得的测试试剂(表3)。本实施例还包括表达替代性报告蛋白(gLUC)的细胞系。此报告蛋白提供蛋白质合成、转运和分泌的独特读数，这在fLUC表达系统中是不可得的。本实施例中描述的方法与程序显示，可使用具有已知或未知翻译调节性质的药物或过程的任何组合来开发无限数量的试验程序。
[0544] 使用在更新的15-试验方案中应用的单毒素和二毒素试验来在HEK293 CMV-fLuc#3亚克隆中定义帽依赖性翻译反应(图30A)。虽然在大部分TPA试验中观察到帽依赖性fLuc合成的显著增加，但未检测到协同作用。事实上，万珂、卡西霉素，并且特别是高剂量(HD)拓扑替康对TPA反应有拮抗作用。剩余试验中的极小变化表明，帽依赖性翻译对这些试剂没有显著反应。
[0545] 图30B和图30C示出由HEK293 mTRdm-fLuc#13和mTRdm-gLuc#79亚克隆产生的翻译反应。虽然fLuc蛋白是一种经历胞内蛋白质降解系统的胞浆蛋白而gLuc是一种逃脱胞内降解并在细胞外累积的分泌性蛋白，但这两种亚克隆的非帽依赖性表达谱显示强相关性并表现与图30A中帽依赖性试验的类似差异。除了TPA+拓扑替康(HD)的二毒素试验，在其它所有TPA试验中观察到TR特异性翻译的显著增强。
[0546] 与在TPA+卡西霉素的二毒素试验中观察到的帽依赖性拮抗作用相比而言，两个非帽依赖性试验都显示由TPA和卡西霉素引起的协同反应，而TPA和卡西霉素在更新的15-试验程序中产生最大翻译增加。这表明，TR介导的翻译受HEK293细胞中PKC与钙离子浓度的调节。由于MTD秋水仙碱应阻止gLUC转运和分泌，所以在二毒素试验中由TPA和卡西霉素产生的主导作用看似表明HEK293细胞中的微管活性受PKC活性和钙离子浓度的调节。
[0547] F.使用15-试验程序检测由对照化合物引起的帽依赖性与非帽依赖性翻译调节，称作21-试验方案
[0548] 本实施例中描述的组合方法提供一种用于测试由未知化合物产生的翻译调节的系统。在本实施例中，描述21-试验配置，其和标准15-毒素试验中一样采用5种毒素的单一和配对组合应用，并加入第六种物质。包括进第六种物质需要把试验组扩增到总共21个单毒素与二毒素试验。对于本实施例，从原15-试验系统中选择对照物质(泰素)。本实施例中描述的方法与程序显示，可使用任何数量的药物或过程或者其任何组合开发无限数量的试验程序来定义已知或未知翻译调节活性。
[0549] 图31示出使用对照泰素的21-试验程序。比较图30A与图31A显示CMV-fLUC#3亚克隆的类似的翻译谱，其中TPA+泰素的二毒素试验除外。在此试验中，观察到显著的协同作用，其超过了由TPA+秋水仙碱的二毒素试验产生的翻译反应。在剩余试验中未观察到其它显著变化。
[0550] 如图30中一样，非帽依赖性HEK293 mTRdm-fLuc#13(图31B)和mTRdm-gLuc#79(图31C)亚克隆产生类似的反应谱。与图31A相比而言，泰素与TPA和卡西霉素组合表现较小的协同增加。比较21-试验方案中的秋水仙碱和泰素反应，进一步提供在图29所示的这些MTD药物中先前所述差异的证据。在HEK293细胞中，由泰素在单毒素剂量反应试验中表现的翻译活性降低导致在二毒素试验系统中的泰素特异性协同反应。这一影响可能是由这些微管蛋白结合药物对微管明显不同的生物学活性而产生。G.使用15-试验程序检测由未知化合物引起的帽依赖性与非帽依赖性翻译调节，称作21-试验方案
[0551] 本节中描述的组合方法提供一种用于测试由未知化合物引起的翻译调节的系统。本实施例中，未知化合物是抗生素氟喹诺酮，其通过抑制细菌DNA促旋酶和阻断细胞分裂来起作用。由于所述哺乳动物酶等效物表现极小结合，所以这些抗生素一般表现低毒性。然而，长期慢性处理与药物间相互作用会产生显著毒性和细胞死亡。本实施例研究对抗生素氟喹诺酮的慢性暴露是否产生帽依赖性或非帽依赖性翻译反应。对于本实施例，使用21-试验程序检测与HepG2肝细胞癌和HEK293胚肾细胞的慢性抗生素处理相关的翻译反应。支原体去除试剂(MRA)或4-氧喹啉-3-羧酸衍生物是普遍应用于培养的哺乳动物细胞以治疗支原体污染的抗生素。MRA表现极小毒性并且可应用较长的培养时期。
[0552] 本实施例中，在21-试验程序之前将MRA处理细胞(+MRA)与约150nM MRA一起孵育7天。
[0553] 对于HepG2 mTRdm-fLuc#16亚克隆的未处理培养物(-MRA)，在大部分单毒素与二毒素TPA试验中观察到TR介导的非帽依赖性fLuc合成的显著增加(图32A中上图)。然而，对MRA的持续暴露拮抗TPA的作用并在TPA+秋水仙碱的二毒素试验中产生fLUC表达的极大减少，其中与未处理的–MRA细胞相比，+MRA培养物表现fLUC活性约减少到1/2.5。此翻译反应的特异性示出在图32A中(下图)，其中去除了TPA试验组。在剩余15个试验中未观察到显著的MRA特异性影响。
[0554] 在经历慢性MRA培养条件的HEK293 mTRdm-fLuc#45亚克隆中观察到细胞特异性反应。在此试验中(图32B)，在所有21-试验结果中均观察到fLUC表达近似均匀的降低。然而，如图32A一样，在TPA单毒素与二毒素试验中观察到最大幅度的翻译下降。这些结果支持以下理论：对抗生素氟喹诺酮的持续暴露会通过拮抗毒素特异性表型(具体地说，TPA毒素)而以可测的程度影响TR翻译反应。
[0555] 因此，对未知分子和过程应用单毒素与组合毒素试验程序提供了用于快速鉴定和定义帽依赖性与非帽依赖性翻译调节剂的平台，这可帮助促进药物发现与设计，以及提高临床前测试的预测价值。
[0556] 当介绍本发明的元素或其优选实施方案时，词语“一个”、“一种”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个所述元素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的并意指可能存在除所列元素以外的额外元素。
[0557] 鉴于以上情况，将可见，本发明的数个目的得以实现并且获得了其它有利结果。
[0558] 因为在不偏离本发明范围的情况下可对上述组合物和方法做出各种改变，所以在以上描述中所含的和在附图中所示的所有物质均应理解为说明性的而不具有限制性的意思。
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