发明领域

本发明涉及新型人凝固因子VII多肽，以及编码这些多肽的多核苷 酸构建体、包含并表达该多核苷酸的载体和宿主细胞、包含因子VII 多肽的药物组合物、用途、和治疗方法。

                      发明背景

血液凝固是由多种血液成分(或因子)的复杂相互作用组成的过 程，最终导致纤维蛋白凝块。一般而言，参与所谓的凝固“级联反应” 的血液成分是无酶促活性的蛋白质(酶原)，它们在激活剂(其自身 也是活化的凝固因子)的作用下转变成蛋白水解酶。经历了这种转变 的凝固因子通常称为“活性因子”，而且通过在凝固因子的名称后添 加字母“a”(例如因子VIIa)作为标志。

止血过程的启动是通过因血管壁损伤而暴露的组织因子与因子 VIIa之间形成复合物来介导的。然后，该复合物将因子IX和X转变成它 们的活性形式。因子Xa在携带组织因子的细胞上将有限量的凝血酶原 转变成凝血酶。凝血酶激活血小板，并将因子V和VIII转变成因子Va 和VIIIa，二者都是导致全部凝血酶爆发的下一步过程中的辅助因子。 该过程包括由因子IXa(与因子VIIIa相复合)生成因子Xa，而且在活 化血小板表面发生。凝血酶最终将纤维蛋白原转变成纤维蛋白，导致 纤维蛋白凝块的形成。

因子VII是在血液中作为单链酶原循环的痕量血浆糖蛋白。该酶原 没有催化活性。在体外，单链因子VII可以通过因子Xa、因子XIIa、因 子IXa、因子VIIa、或凝血酶而转变成双链因子VIIa。因子Xa被认为是 因子VII的主要生理学激活剂。酶原因子VII向活化双链分子的转变是 通过切割内部Arg152-Ile153肽键而发生的。

常常希望在受试者中激发凝固级联反应。因子VIIa已经被用于控 制具有多种原因的出血紊乱，诸如凝固因子缺乏(例如血友病A和B或 者凝固因子XI或VII缺乏)或凝固因子抑制物。因子VIIa还已被用于控 制在具有正常发挥作用的血液凝固级联反应的受试者(没有凝固因子 缺乏或针对任何凝固因子的抑制剂)中发生的过度出血。这些出血可 能是由例如血小板功能缺陷、血小板减少、或von Willebrand氏病引 起的。出血还是与手术和其它形式组织损伤有关的主要问题。

欧洲专利号200,421(ZymoGenetics)涉及编码人因子VII的核苷 酸序列和因子VII在哺乳动物细胞中的重组表达。

Dickinson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，14379-14384， 1996)公开了因子VII多肽，其中某些氨基酸已单个地被Ala替代。 Iwanaga等(Thromb.Haemost.1999年8月增刊466，摘要1474)涉 及因子VIIa变体，其中残基316-320被缺失或者残基311-322用来自胰 蛋白酶的相应残基所替代。

本领域仍然需要具有促凝固活性的改良型因子VII多肽。具体而 言，就是需要TF非依赖性活性提高的因子VII多肽。

                       发明概述

本发明涉及TF非依赖性活性提高的因子VII多肽，诸如活性与野生 型因子VIIa相同或有所提高且组织因子结合亲和力比重组野生型人因 子VIIa低的新型凝固因子VII多肽。

在第一个方面，本发明涉及组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽，前提是该因子VII多肽不是I69A-FVII.

在第二个方面，本发明涉及包含组织因子结合亲和力比重组野生 型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有 所提高的因子VII多肽的组合物，前提是该因子VII多肽不是 I69A-FVII。

在第三个方面，本发明涉及包含组织因子结合亲和力比重组野生 型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有 所提高的因子VII多肽、并可选地包含制药学可接受载体的药物组合 物。

在另一个方面，本发明涉及编码组织因子结合亲和力比重组野生 型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有 所提高的因子VII多肽的多核苷酸构建体，前提是该因子VII多肽不是 I69A-FVII。

在另一个方面，本发明涉及包含多核苷酸构建体的真核宿主细胞， 所述多核苷酸构建体编码组织因子结合亲和力比重组野生型人因子 VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提高的 因子VII多肽，前提是该因子VII多肽不是I69A-FVII。

在另一个方面，本发明涉及用于生产组织因子结合亲和力比重组 野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同 或有所提高的因子VII多肽的方法，前提是该因子VII多肽不是 I69A-FVII，所述方法包括在容许由所述多核苷酸构建体合成蛋白质的 条件下在合适的生长培养基中培养包含编码因子VII多肽的多核苷酸 构建体的真核宿主细胞，并由培养液回收所述因子VII多肽。

在另一个方面，本发明涉及组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽用于制备治疗出血事件或增强正常止血系统的药物 的用途。

在另一个方面，本发明涉及用于在受试者中治疗出血事件或出血 紊乱或者用于增强正常止血系统的方法，所述方法包括对有此需要的 受试者施用治疗或预防有效量的因子VII多肽，该多肽的组织因子结合 亲和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相 比本质上相同或有所提高。

在另一个方面，本发明涉及组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽选自：

1)相对于SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸而言包含选自下组的一 处或多处氨基酸替代的因子VII多肽：K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、 Q64X5、L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、E77X11、G78X12、R79X13、 K85X14、Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、T307X20、Q308X21、 D309X22、和R379X23，所述不同的氨基酸降低了组织因子结合亲和力，

其中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

和/或

2)因子VII多肽，其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨 基酸对应的一个或多个氨基酸已被半胱氨酸残基替代：K18、R36、K62、 Q64、L65、I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、 F275、R277、M306、Q308、D309、或R379，所述半胱氨酸残基降低了 组织因子结合亲和力，且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合， 所述化学基团可增加所述因子VII多肽的分子量；

和/或

3)在由选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置开始的氨基酸对应处包含 一个或多个通过氨基酸替代导入的N-糖基化位点N-Xaa-S/T的因子VII 多肽：R36、Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、 T307、和D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖 基化位点降低了组织因子结合亲和力。

在另一个方面，本发明涉及包含组织因子结合亲和力比重组野生 型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有 所提高的因子VII多肽的组合物，其中所述因子VII多肽选自：

1)相对于SEQ ID NO：1中各个位置的氨基酸而言包含选自下组的一处 或多处氨基酸替代的因子VII多肽：K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、Q64X5、 L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、E77X11、G78X12、R79X13、K85X14、 Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、T307X20、Q308X21、D309X22、 和R379X23，所述不同的氨基酸降低了组织因子结合亲和力，其中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

和/或

2)因子VII多肽，其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置的氨基 酸对应的一个或多个氨基酸已被半胱氨酸残基替代：K18、R36、K62、 Q64、L65、I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、 F275、R277、M306、Q308、D309、和R379，所述半胱氨酸残基降低了 组织因子结合亲和力，并且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合， 所述化学基团可增加所述因子VII多肽的分子量；

和/或

3)在由选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置开始的氨基酸对应处包含 一个或多个通过氨基酸替代导入的N-糖基化位点N-Xaa-S/T的因子VII 多肽：R36、Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、 T307、和D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖 基化位点降低了组织因子结合亲和力。

在另一个方面，本发明涉及包含组织因子结合亲和力比重组野生 型人因子VIIa低且与重组野生型人因子VIIa相比具有本质上相同或有 所提高的活性的因子VII多肽、并可选地包含制药学可接受载体的药物 组合物，其中所述因子VII多肽选自：

1)相对于SEQ ID NO：1中各个位置的氨基酸而言包含选自下组的一处 或多处氨基酸替代的因子VII多肽：K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、Q64X5、 L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、E77X11、G78X12、R79X13、K85X14、 Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、T307X20、Q308X21、D309X22、 和R379X23，所述不同氨基酸降低了组织因子结合亲和力，其中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

和/或

2)其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸对应的一个 或多个氨基酸被半胱氨酸残基替代的因子VII多肽：K18、R36、K62、 Q64、L65、I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、 F275、R277、M306、Q308、D309、和R379，所述半胱氨酸残基降低了 组织因子结合亲和力，且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合， 所述化学基团增加所述因子VII多肽的分子量；

和/或

3)在由选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置开始的氨基酸对应处包含 一个或多个通过氨基酸替代导入的N-糖基化位点N-Xaa-S/T的因子VII 多肽：R36、Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、 T307、和D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖 基化位点降低了组织因子结合亲和力。

在另一个方面，本发明涉及组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽用于制备治疗出血事件或增强正常止血系统的药物 的用途，其中所述因子VII多肽选自：

1)相对于SEQ ID NO：1中各个位置的氨基酸而言包含选自下组的一处 或多处氨基酸替代的因子VII多肽：K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、Q64X5、 L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、E77X11、G78X12、R79X13、K85X14、 Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、T307X20、Q308X21、D309X22、 和R379X23，所述不同氨基酸降低了组织因子结合亲和力，其中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

和/或

2)其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸对应的一个 或多个氨基酸被半胱氨酸残基所替代的因子VII多肽：K18、R36、K62、 Q64、L65、I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、 F275、R277、M306、Q308、D309、和R379，所述半胱氨酸残基降低了 组织因子结合亲和力，且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合， 所述化学基团增加所述因子VII多肽的分子量；

和/或

3)在由选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置开始的氨基酸对应处包含 一个或多个通过氨基酸替代导入的N-糖基化位点N-Xaa-S/T的因子VII 多肽：R36、Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、 T307、和D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖 基化位点降低了组织因子结合亲和力。

在另一个方面，本发明涉及用于在受试者中治疗出血事件或出血 紊乱或者用于增强正常止血系统的方法，所述方法包括对有所需要的 受试者施用治疗或预防有效量的组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽选自：

1)相对于SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸而言包含选自下组的一 处或多处氨基酸替代的因子VII多肽：K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、 Q64X5、L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、E77X11、G78X12、R79X13、 K85X14、Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、T307X20、Q308X21、 D309X22、和R379X23，所述不同氨基酸降低了组织因子结合亲和力，其 中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

和/或

2)其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸对应的一个 或多个氨基酸被半胱氨酸残基替代的因子VII多肽：K18、R36、K62、 Q64、L65、I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、 F275、R277、M306、Q308、D309、和R379，所述半胱氨酸残基降低了 组织因子结合亲和力，且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合， 该化学基团可增加所述因子VII多肽的分子量；

和/或

3)在由选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置开始的氨基酸对应处包含 一个或多个通过氨基酸替代导入的N-糖基化位点N-Xaa-S/T的因子VII 多肽：R36、Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、 T307、和D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖 基化位点降低了组织因子结合亲和力。

在另一个方面，本发明涉及包含野生型人FVIIa和组织因子结合亲 和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比 本质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于在受试者中治疗出血事件或者用 于增强正常止血系统的方法，所述方法包括对有所需要的受试者施用 治疗或预防有效量的：

a)包含野生型人FVIIa和组织因子结合亲和力比重组野生型人因 子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提高 的因子VII多肽的组合物；或

b)包含野生型人FVIIa的第一组合物和包含组织因子结合亲和力 比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质 上相同或有所提高的因子VII多肽的第二组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于制备包含野生型人FVIIa和组织因 子结合亲和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子 VIIa相比本质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物的工艺，其中 所述工艺包括如下步骤：将野生型人FVIIa与组织因子结合亲和力比重 组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相 同或有所提高的因子VII多肽在水性介质中混合。

在另一个方面，本发明涉及包含野生型人FVIIa和组织因子结合亲 和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比 本质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物用于制备治疗受试者 中出血事件或增强正常止血系统的药物的用途。

                       发明详述

本发明涉及活性与野生型因子VIIa相比本质上相同或有所提高且 组织因子结合亲和力比重组野生型人因子VIIa低的新型凝固因子VII 多肽。越来越多的证据表明，重组野生型人凝固因子VII的治疗性处理 通过不依赖TF的机制发挥作用，其中所述机制因子VII与活化血小板的 直接结合、活化因子Xa的生成、以及最终在组织受损部位的局部纤维 蛋白生成。本发明的因子VII多肽为传统的TF结合因子VII多肽提供了 替换物。当TF的暴露较高时，例如斑块破裂或败血症中，不与TF结合 的因子VII多肽在出血的治疗性处理中可能是一项优势。

在用于本文时，术语“因子VII多肽”或“FVII多肽”指野生型人 因子VII/VIIa(即具有美国专利号4,784,950中公布的氨基酸序列的多 肽)、展示与野生型因子VII相比基本上相同或有所改进的生物学活性 的因子VII变体、因子VII相关多肽、以及因子VII衍生物和因子VII缀 合物。除非另有说明，术语“因子VII”意图涵盖未切割(酶原)形式 的因子VII多肽，以及经过蛋白水解加工而产生相应生物活性形式的因 子VII多肽，后者可以称为因子VIIa。通常，因子VII在第152位与第153 位残基之间受到切割而产生因子VIIa。因子VII的这种变体可以展示与 人因子VII不同的特性，包括稳定性、磷脂结合、改变的比活、诸如此 类。

在用于本文时，“因子VII相关多肽”涵盖其中因子VIIa生物学活 性相对于野生型因子VIIa的活性而言已被本质上改变或降低的多肽， 包括变体。这些多肽包括但不限于其中导入了特定氨基酸序列改变从 而改变或破坏了该多肽的生物活性的因子VII或因子VIIa。

术语“因子VII衍生物”在用于本文时意图指示野生型因子VII、 展示与野生型因子VII相比本质上相同或有所提高的生物学活性的因 子VII变体、和其中亲本肽的一个或多个氨基酸已被化学和/或酶促修 饰的因子VII相关多肽，所述修饰例如是烷化、糖基化、PEG化、酰化、 形成酯、或形成酰胺诸如此类。这包括但不限于PEG化的人因子VIIa、 半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa、及其变体。

可选的化学基团对半胱氨酸残基的缀合包括但不限于：聚乙二醇 (PEG)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二 醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚丙二醇、多氧乙 烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸或其它基于 碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、以及生物素衍生物的共价附 着。在本发明的一个实施方案中，该化学基团是生物相容的、无毒的、 无免疫原性的、且可溶于水的聚合物。优选的是，该化学基团可以所 有比例溶于水。

用于将PEG基团附着到半胱氨酸残基上的方法见Roberts，M.J.等， 2002，Advanced Drug Delivery Reviews 54，459-476。

“N糖基化位点”具有序列N-Xaa-S/T，其中Xaa指除了脯氨酸以外 的任何氨基酸，N指天冬酰胺，而S/T指或是丝氨酸或是苏氨酸，诸如 丝氨酸或苏氨酸，例如苏氨酸。

特别优选用于偶联半胱氨酸残基的活化PEG聚合物的具体实例包 括下列线性PEG：乙烯基砜-PEG(VS-PEG)，诸如乙烯基砜-mPEG (VS-mPEG)；马来酰亚胺-PEG(MAL-PEG)，诸如马来酰亚胺-mPEG (MAL-mPEG)；和正吡啶基(orthopyridyl)-二硫化物-PEG (OPSS-PEG)，诸如正吡啶基-二硫化物-mPEG(OPSS-MPEG)。通常， 这些PEG或mPEG聚合物的分子量是约2kDa，诸如约5kDa，诸如约10kDa， 诸如约12kDa，或诸如约20kDa。

技术人员知道采用的活化方法和/或缀合化学取决于聚合物上的 官能团(例如胺基、羟基、羧基、醛基、巯基、琥珀酰亚胺基、马来 酰亚胺基、乙烯砜、或卤代乙酸酯)。

为了将化学基团缀合到半胱氨酸残基上(例如PEG化)，通常在PEG 化前用还原剂处理FVII多肽，诸如用二硫苏糖醇(DDT)、β-巯基乙 醇、或谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)处理，诸如见Higashi，S.、 Matsumoto，N.、Iwanaga，S.，1997，J.Biol.Chem.272(41)，25724 -25730。随后通过任何常规方法清除还原剂，诸如脱盐。PEG对半胱 氨酸残基的缀合通常在pH6-9的合适缓冲液中在4-25℃进行长达16小 时的一段时间。

在本发明的一个实施方案中，导入的半胱氨酸残基是通过与选自 下组的化学基团形成混合二硫键而缀合的：因子VII多肽生产过程中宿 主细胞或培养基中存在的谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)、γ- 谷氨酰半胱氨酸、和半胱氨酸。

在本发明的一个实施方案中，所述化学基团选自下组：树状聚合 物(dendrimer)、聚环氧烷(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚乙二 醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸 酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、 葡聚糖、羧甲基葡聚糖；血清蛋白质结合配体，诸如与清蛋白结合的 化合物，诸如脂肪酸，C5-C24脂肪酸、脂肪族二酸(例如C5-C24)， 抑制聚糖与受体(例如去唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体)结合的结 构(例如唾液酸衍生物或模拟物)，含有在生理学条件下改变电荷特 性的模块的有机小分子，诸如羧酸或胺，或防止聚糖特异识别的中性 取代基，诸如较小烷基取代基(例如C1-C5烷基)、低分子带电荷有机 基团(例如C1-C25)，可以含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、磷酸、 或其组合；低分子中性亲水性分子(例如C1-C25)，诸如环糊精，或 聚乙烯链，其可选地是分支的；平均分子量2-40KDa的聚乙二醇；精 确限定的聚合物，诸如准确分子量范围700-20,000Da(诸如 700-10,000Da)的树状聚合物；以及基本上没有免疫原性的多肽，诸 如清蛋白或抗体或抗体片段，其中可选地包含Fc结构域。

术语“PEG化人因子VIIa”指其中PEG分子与人因子VIIa多肽缀合 的人因子VIIa。可以理解，PEG分子可以附着于因子VIIa多肽的任何部 分，包括因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物模块。术语“半 胱氨酸-PEG化人因子VIIa”指其中有PEG分子与导入人因子VIIa中的半 胱氨酸的巯基缀合的因子VIIa。

因子VIIa在血液凝固中的生物学活性源自它(1)与组织因子(TF) 结合和(2)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割而生成活化因子IX或X (分别是因子IXa或Xa)的能力。为了本发明目的，可以使用缺乏因子 VII的血浆和促凝血酶原激酶测量制剂促进血液凝固的能力而对因子 VIIa生物学活性进行量化，例如美国专利号5,997,864中所述。在此测 定法中，将生物学活性表述成凝固时间相对于对照样品的缩短，并且 通过与含1个单位/ml因子VII活性的合并人血清标准物进行比较而转 变成“因子VII单位”。或者，可以通过(1)测量因子VIIa在含有包埋 在脂膜中的TF和因子X的系统中生成因子Xa的能力(Persson等，1997， J.Biol.Chem.272，19919-19924)；(2)在水性系统中测量因子X 水解；(3)使用基于表面激元共振的仪器测量它与TF的物理结合 (Persson，1997，FEBS Letts.413，359-363)；和(4)测量合成 底物的水解，从而将因子VIIa生物学活性量化。

生物学活性与野生型因子VIIa相比本质上相同或有所提高的因子 VII变体涵盖在如上所述一种或多种凝固测定法、蛋白水解测定法、或 TF结合测定法中进行测试时展示的比活是相同细胞类型中生成的因子 VIIa的至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、且最优选 至少约90％的那些变体。因子VII的变体，无论是展示的生物活性与野 生型因子VII相比本质上相同还是有所提高，或者是展示的生物活性相 对于野生型因子VII而言本质上不同或有所降低，均包括但不限于氨基 酸序列由于一个或多个氨基酸的插入、缺失、或替代而与野生型因子 VII的序列有所不同的多肽。

术语“变体”在用于本文时意图指示具有序列SEQ ID NO：1的因 子VII，其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已被另一种氨基酸替代和 /或其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已被缺失和/或其中蛋白质中 已插入了一个或多个氨基酸和/或其中亲本蛋白质中添加了一个或多 个氨基酸。这种添加可以发生在亲本蛋白质的N端或C端或二者兼有。 此定义中的“变体”在其活化形式时仍然具有因子VII活性。在一个实 施方案中，变体与SEQ ID NO：1的序列70％相同。在一个实施方案中， 变体与SEQ ID NO：1的序列80％相同。在另一个实施方案中，变体与 SEQ ID NO：1的序列90％相同。在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO： 1的序列95％相同。

生物学活性与野生型因子VII本质上相同的因子VII变体的非限制 性实例包括：S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等，1998，Arch.Biochem. Biophys.352，182-192)；美国专利号5,580,560中公布的展示升 高的蛋白水解稳定性的因子VIIa变体；在残基290与291之间或残基315 与316之间受到蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等，1995， Biotechnol.Bioeng.48，501-505)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt 等，1999，Arch.Biochem.Biophys.363，43-54)；PCT/DK02/00189 中公布的因子VII变体；WO 02/38162中公布的展示升高的蛋白水解稳 定性的因子VII变体(Scripps研究院)；WO 99/20767(明尼苏达大学) 和WO 00/66753(明尼苏达大学)中公布的具有经修饰的Gla结构域且 展示增强的膜结合的因子VII变体；以及WO 01/58935(Maxygen ApS)、 WO 03/93465(Maxygen ApS)、和WO 04/029091(Maxygen ApS)中 公布的因子VII变体。

生物学活性比野生型FVIIa有所提高的因子VII变体的非限制性实 例包括：WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635、 丹麦专利申请PA 2002 01423、丹麦专利申请PA 2001 01627、WO 02/38162(Scripps研究院)中公布的因子VII变体；和JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic研究院)中公布的具有增强的活性的因子 VIIa变体。生物学活性相对于野生型因子VII而言本质上降低或有所改 变的因子VII变体的非限制性实例包括：R152E-FVIIa(Wildgoose等， 1990，Biochem.29，3413-3420)、S344A-FVIIa(Kazama等，1995， J.Biol.Chem.270，66-72)、FFR-FVIIa(Holst等，1998，Eur. J.Vasc.Hndovasc.Surg.15，515-520)、和缺乏Gla结构域的因 子VIIa(Nicolaisen等，1993，FEBS Letts.317，245-249)。因 子VII变体、因子VII、或因子VII相关多肽的实例包括但不限于：野生 型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII， V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q- FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A- FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q- FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，

L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，

L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，

L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，

L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，

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L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，

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S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，

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K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，

K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q- FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，

K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，

K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，

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F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，

F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，

F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，

F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，

F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374T/V158D/E296V-FVII，

F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，

F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，

F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，

F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，

F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，

F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，

F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，

F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，

F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，

F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，

F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，

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F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，

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F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，

F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-因子VII，S60A-因子VII； R152E-FVII、S344A-FVII；缺乏Gla结构域的因子VIIa； P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、 R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、 K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；在233Thr-240Asn的氨基酸序列中 具有替代、添加、或缺失的FVII；和在304Arg-329Cys的氨基酸序列 中具有替代、添加、或缺失的FVII。

所用氨基酸替代的命名如下。第一个字母代表人野生型因子VII 中该位置处天然存在的氨基酸。后面的数字代表人野生型因子VII中的 位置。第二个字母代表用于替代(取代)该天然氨基酸的不同氨基酸。 一个实例是M298Q，其中人野生型因子VII中第298位处的甲硫氨酸被谷 氨酰胺替代。又一实例是，V158T/M298Q，其中人野生型因子VII中第 158位处的缬氨酸被苏氨酸替代且人野生型因子VII中第298位处的甲 硫氨酸被谷氨酰胺替代。

在本发明的另一个实施方案中，因子VII多肽是这样的多肽，其中 因子VII多肽的活性与野生型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约 1.25。在一个实施方案中，因子VII多肽的活性与野生型人因子VIIa 的活性之间的比率至少是约2.0。在另一个实施方案中，因子VII多肽 的活性与野生型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约4.0。

在本发明的另一个实施方案中，因子VII多肽是这样的多肽，其中 在因子VIIa活性测定法中进行测试时，该因子VII多肽的活性与野生型 人因子VIIa的活性之间的比率至少是约1.25。在一个实施方案中，在 因子VIIa活性测定法中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生型人因 子VIIa的活性之间的比率至少是约2.0。在另一个实施方案中，在因子 VIIa活性测定法中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生型人因子 VIIa的活性之间的比率至少是约4.0。因子VIIa活性可以通过下文“测 定法”中描述的测定法进行测量。

在本发明的另一个实施方案中，因子VII多肽是这样的多肽，其中 在“体外水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生型人 因子VIIa的活性之间的比率至少是约1.25。在一个实施方案中，在“体 外水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生型人因子 VIIa的活性之间的比率至少是约2.0。在另一个实施方案中，在“体外 水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生型人因子VIIa 的活性之间的比率至少是约4.0。

在本发明的另一个实施方案中，因子VII多肽是这样的多肽，其中 在“体外蛋白水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生 型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约1.25。在一个实施方案中， 在“体外蛋白水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生 型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约2.0。在另一个实施方案中， 在“体外蛋白水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生 型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约4.0。在另一个实施方案中， 在“体外蛋白水解测定法”中进行测试时，因子VII多肽的活性与野生 型人因子VIIa的活性之间的比率至少是约8.0。

本发明还适合活性比野生型有所提高的因子VII/VIIa变体。可以 通过在下文描述的合适测定法中进行测试而找到活性提高的因子 VII/VIIa变体。可以作为简单的初步体外测试进行这些测定法。由此， “测定法”一节中公布了针对本发明因子VIIa变体的活性的简单测试 法(题为“体外水解测定法”)。基于此，特别关注的因子VIIa变体 是这样的变体，其中在“体外水解测定法”中进行测试时，变体的活 性与野生型因子VII的活性之间的比率高于1.0，例如至少是约1.25， 优选至少是约2.0，诸如至少是约3.0，或甚至更优选至少是约4.0。

还可以使用浓度适当地在100-1000nM的生理学底物诸如因子X来 测量变体的活性(“体外蛋白水解测定法”)(见下文“测定法”)， 其中，在添加合适的显色底物(例如S-2765)后测量生成的因子Xa。 另外，可以在生理学温度进行该活性测定法。

还可以在包含生理学浓度的所有相关凝固因子和抑制剂(在模仿 血友病A的状况时除去因子VIII)以及活化血小板的测定法中测量因子 VIIa变体生成凝血酶的能力(见Monroe等，1997，Brit.J.Haematol. 99，542-547中的第543页，收入本文作为参考)。

正如本领域所知道的，术语“同一性”指通过比较序列而测定的 两种或多种多肽分子或者两种或多种核酸分子的序列之间的相关性。 在本领域，“同一性”还指核酸分子之间或多肽之间的序列相关程度， 视情况而定，可以通过由两个或多个核苷酸残基或者两个或多个氨基 酸残基构成的串之间的匹配数目来测定。“同一性”用于衡量两种或 多种序列的区段之间相同匹配的百分率，其中通过具体的数学模型或 计算机程序(即“算法”)进行缺口比对(如果有的话)。

术语“相似性”是“同一性”的相关概念，但是与后者不同，前 者指包括相同匹配和保守替代匹配在内的序列相关性。若两种多肽序 列具有例如(10/20)的相同氨基酸，且剩余部分都是非保守替代，则同 一性和相似性百分率都将是50％。在同一个例子中，若另有5个位置是 保守替代，则同一性百分率仍然是50％，但相似性百分率将是75％ (15/20)。因此，在存在保守替代的情况中，两种多肽之间的相似性 程度将比这两种多肽之间的同一性百分率高。

术语“分离的多肽”指这样的本发明多肽，其(1)已经与至少约50 ％的天然相关联的多核苷酸、脂质、碳水化合物、或其它物质(即污 染物)分离开；(2)没有与该“分离的多肽”在自然界中相连的完整多 肽或其片段共价相连；(3)与它在自然界中并不共价相连的多肽可操作 地共价连接；或(4)在自然界中不存在。优选的是，该分离的多肽本质 上不含在其天然环境中存在的将会干染其治疗性、诊断性、预防性、 或研究性用途的任何其它污染性多肽或其它污染物。

在所主张的替代位置以外对氨基酸序列SEQ ID NO：1进行保守修 饰(以及对编码多核苷酸的相应修饰)将生成功能和化学特征与天然 存在的因子VII多肽相似的因子VII多肽。相反，通过在氨基酸序列SEQ ID NO：1中选择其效果在维持(1)分子主链在替代区域内的结构，例如 折叠片或螺旋构象；(2)该分子在靶位点的电荷或疏水性；或(3)侧链 的体积方面显著不同的替代，可以实现对因子VII多肽的功能和/或活 性特征的本质修饰。

例如，“保守氨基酸替代”可以包括用非天然残基替代天然氨基 酸，使得对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷的影响很小或没有影 响。另外，还可以用丙氨酸替代多肽中的任何天然残基，正如先前在 “丙氨酸扫描诱变”中所述(见例如MacLennan等，1998，Acta Physiol. Scand.Suppl.643，55-67；Sasaki等，1998，Adv.Biophys.35， 1-24，二者均讨论了丙氨酸扫描诱变)。

通过已知方法可以容易的计算相关多肽的同一性和相似性。这些 方法包括但不限于下列文献中描述的方法：《计算分子生物学》 (Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出 版社，纽约，1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing： Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，Academic出 版社，纽约，1993；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1章，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana 出版社，新泽西，1994；《分子生物学的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，Academic出版社，1987； 《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和 Devereux，J.编，M.Stockton出版社，纽约，1991；以及Carillo等， 1988，SIAM J.Applied Math.48，1073。

用于测定同一性和/或相似性的优选方法被设计成得出所测序列 之间的最大匹配。用于测定同一性和相似性的方法在公众可获得的计 算机程序中有描述。用于测定两种序列之间的同一性和相似性的优选 计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux等，1984， Nucl.Acid.Res.12，387；Genetics Computer Group，威斯康星 大学，麦迪逊，威斯康星)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul 等，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)。BLASTX程序可以由美 国生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(《BLAST手册》(BLAST Manual)，Altschul等，NCB/NLM/NIH，贝塞斯达，马里兰，20894； Altschul等，同上)。还可以使用众所周知的Smith Waterman算法来 测定同一性。

用于比对两种氨基酸序列的某些比对方案可能产生两种序列中只 有较小区域匹配，而且此较小比对区域可能具有非常高的序列同一性， 尽管两种全长序列之间没有显著相关性。因此，在一个优选实施方案 中，选择的比对方法(GAP程序)将产生横跨靶多肽至少50个连续氨基 酸的比对。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，威斯康 星大学，麦迪逊，威斯康星)，对需要测定序列同一性百分率的两种 多肽进行比对，以得到它们各自氨基酸的最佳匹配(“匹配跨度”， 如通过算法测定的)。连同算法一起使用缺口开放罚分(计算为平均 对角线的3倍；“平均对角线”指所用比较矩阵的对角线的平均值；“对 角线”指由具体比较矩阵为每个完全氨基酸匹配赋予的得分或数字) 和缺口延伸罚分(通常是缺口开放罚分的1/10)以及比较矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62。算法中还使用标准比较矩阵(有关PAM 250比较矩阵， 参见Dayhoff等，《蛋白质序列和结构图集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，第5卷，supp.3，1978；有关BLOSUM 62 比较矩阵，参见Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89， 10915-10919)。

多肽序列比较的优选参数包括：

算法：Needleman等，1970，J.Mol.Biol.48，443-453；比 较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89，10915-10919；缺口罚分：12，缺口长度罚分：4，相似性阈 值：0。

GAP程序可与上述参数一起使用。上述参数是使用GAP算法进行多 肽比较的默认参数(对于末端缺口没有罚分)。

用于进行核酸分子序列比较的优选参数包括：

算法：Needleman等，J.Mol Biol.48，443-453，1970；比较 矩阵：匹配＝+10，错配＝0，缺口罚分：50，缺口长度罚分：3。

GAP程序也可与上述参数一起使用。上述参数是进行核酸分子比较 的默认参数。

可以使用其它例示性算法、缺口开放罚分、缺口延伸罚分、比较 矩阵、相似性阈值等，包括1997年9月发布的第9版Wisconsin Package 中的Program Manual中所列的那些。本领域技术人员知道将要做出的 具体选择，而且这取决于将要进行的具体比较，诸如DNA与DNA、蛋白 质与蛋白质、蛋白质与DNA；以及该比较是指定的成对序列之间(在这 种情况下，GAP或BestFit通常是优选的)还是一种序列与大型序列数 据库之间的比较(在这种情况下，FASTA或BLASTA是优选的)。

术语“组织因子结合亲和力”在用于本文时指因子VII多肽与人组 织因子相结合的强度。因子VII多肽的亲和力是通过解离常数Kd测量 的，解离常数被定义为[FVII]×[TF]/[FVII-TF]，其中[FVII-TF] 指FVII/TF复合物的摩尔浓度，[FVII]指未结合的FVII多肽的摩尔浓 度，而[TF]指未结合的人组织因子的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为 1/Kd。

短语“与重组野生型人因子VIIa相比活性本质上相同或有所提高” 在用于本文时指高于重组野生型人因子VIIa活性的50％的活性。在一 个实施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的60％。在一个 实施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的70％。在一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的80％。在另一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的90％。在另一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的100％。在另一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的120％。在另一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的200％。在另一个实 施方案中，活性高于重组野生型人因子VIIa活性的400％。

术语“活性”在用于本文时指因子VII多肽将其底物因子X转变成 活性因子Xa的能力。可以通过“体外蛋白水解测定法”来测量因子VII 多肽的活性。

短语“组织因子结合亲和力比重组野生型人因子VIIa低”在用于 本文时指根据TF结合亲和力测定法(诸如实施例5中描述的生物传感器 测定法)的测量，结合亲和力比重组野生型人因子VIIa低。在一个实 施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa活性的90 ％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子 VIIa活性的80％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于重组 野生型人因子VIIa活性的70％。在一个实施方案中，组织因子结合亲 和力低于重组野生型人因子VIIa活性的60％。在一个实施方案中，组 织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa活性的50％。在一个实 施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa的活性的 40％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因 子VIIa的活性的30％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于 重组野生型人因子VIIa的活性的20％。在一个实施方案中，组织因子 结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa的活性的10％。在一个实施方 案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa的活性的5％。 在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa 的活性的1％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和力低于重组野生 型人因子VIIa的活性的0.1％。在一个实施方案中，组织因子结合亲和 力低于重组野生型人因子VIIa的活性的0.01％。在一个实施方案中， 组织因子结合亲和力低于重组野生型人因子VIIa的活性的0.001％。

术语“聚乙二醇”或“PEG”指聚乙二醇化合物或其衍生物，其中 含有或不含偶联剂、偶联或激活部分(例如含有硫醇、triflate、 tresylate、氮丙啶、环氧乙烷，或者优选含有马来酰亚胺部分)。本 发明的活化PEG化合物的实例有诸如马来酰亚胺单甲氧基PEG等化合 物。

在本发明的一个实施方案中，因子VII多肽是这样的因子VII多肽， 其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸对应的一个或 多个氨基酸被不同氨基酸残基替代：K18、R36、S43、K62、Q64、L65、 I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、F275、R277、 M306、T307、Q308、D309、和R379，所述不同氨基酸降低了组织因子 结合亲和力。

术语“不同氨基酸”在用于本文时指与该位置处天然存在的氨基 酸不同的一种或多种氨基酸。这包括但不限于可以由多核苷酸编码的 氨基酸。优选的是，该不同氨基酸是天然L构型，且可以由多核苷酸编 码。一个具体实例是L-谷氨酸(L-Glu)。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K18处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置K18处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R36的氨基酸对应的氨基酸已被不同氨 基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置R36处的此不 同氨基酸选自下组：E、D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置S43处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置S43处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、F、和N。在一个实施方案中， 此不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。在一个实施方案中， 此不同氨基酸是N。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K62处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置K62处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、A、和F。在一个实施方案中，此不同氨 基酸选自下组：D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q64处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置Q64处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置L65处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置L65处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置I69处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置I69处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。在一个实施方案中，此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置F71处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置F71处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、和A。在一个实施方案中，此不同 氨基酸选自下组：K、R、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置L73处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置L73处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置P74处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置P74处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置E77处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置E77处的此 不同氨基酸选自下组：K、R、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置G78处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置G78处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R79处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置R79处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K85处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置K85处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q88处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置Q88处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置N93处的氨基酸对应的氨基酸已被不同 氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置N93处的此 不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置F275处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置F275处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R277处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置R277处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置T307处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置T307处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、F、和N。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q308处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置Q308处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、F、和N。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R379处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置R379处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置M306处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置M306处 的此不同氨基酸选自下组：E、D、K、R、A、和F。在一个实施方案中， 此不同氨基酸选自下组：E、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置D309处的氨基酸对应的氨基酸已被不 同氨基酸替代。在一个实施方案中，位于SEQ ID NO：1中位置D309处 的此不同氨基酸选自下组：K、R、和A。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是选自下组的因子 VII多肽：S43N-FYII、K62E-FVII、Q64E-FVII、I69F-FVII、 K62E/I69A-FVII、Q64E/I69A-FVII、K62E/Q64E/I69A-FVII、 K62E/I69F-FVII、Q64E/I69F-FVII、和K62E/Q64E/I69F-FVII。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是还包含选自下组的 氨基酸替代的因子VII多肽：

L305V，L305V/M306D/D309S，L305I，L305T，F374P，V158T/M298Q，V158D/E296V/M298Q，

K337A，M298Q，V158D/M298Q，L305V/K337A，V158D/E296V/M298Q/L305V，

V158D/E296V/M298Q/K337A，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A，K157A，E296V，

E296V/M298Q，V158D/E296V，V158D/M298K，and S336G，L305V/K337A，L305V/V158D，

L305V/E296V，L305V/M298Q，L305V/V158T，L305V/K337A/V158T，L305V/K337A/M298Q，

L305V/K337A/E296V，L305V/K337A/V158D，L305V/V158D/M298Q，L305V/V158D/E296V，

L305V/V158T/M298Q，L305V/V158T/E296V，L305V/E296V/M298Q，

L305V/V158D/E296V/M298Q，L305V/V158T/E296V/M298Q，L305V/V158T/K337A/M298Q，

L305V/V158T/E296V/K337A，L305V/V158D/K337A/M298Q，L305V/V158D/E296V/K337A，

L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A，S314E/K316H，

S314E/K316Q，S314E/L305V，S314E/K337A，S314E/V158D，S314E/E296V，S314E/M298Q，

S314E/V158T，K316H/L305V，K316H/K337A，K316H/V158D，K316H/E296V，K316H/M298Q，

K316H/V158T，K316Q/L305V，K316Q/K337A，K316Q/V158D，K316Q/E296V，

K316Q/M298Q，K316Q/V158T，S314E/L305V/K337A，S314E/L305V/V158D，

S314E/L305V/E296V，S314E/L305V/M298Q，S314E/L305V/V158T，

S314E/L305V/K337A/V158T，S314E/L305V/K337A/M298Q，S314E/L305V/K337A/E296V，

S314E/L305V/K337A/V158D，S314E/L305V/V158D/M298Q，S314E/L305V/V158D/E296V，

S314E/L305V/V158T/M298Q，S314E/L305V/V158T/E296V，S314E/L305V/E296V/M298Q，

S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q，

S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A，

S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A，

S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A，

K316H/L305V/K337A，K316H/L305V/V158D，K316H/L305V/E296V，K316H/L305V/M298Q，

K316H/L305V/V158T，K316H/L305V/K337A/V158T，K316H/L305V/K337A/M298Q，

K316H/L305V/K337A/E296V，K316H/L305V/K337A/V158D，K316H/L305V/V158D/M298Q，

K316H/L305V/V158D/E296V，K316H/L305V/V158T/M298Q，K316H/L305V/V158T/E296V，

K316H/L305V/E296V/M298Q，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q，

K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q，

K316H/L305V/V158T/E296V/K337A，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q，

K316H/L305V/V158D/E296V/K337A，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，

K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A，K316Q/L305V/K337A，K316Q/L305V/V158D，

K316Q/L305V/E296V，K316Q/L305V/M298Q，K316Q/L305V/V158T，

K316Q/L305V/K337A/V158T，K316Q/L305V/K337A/M298Q，K316Q/L305V/K337A/E296V，

K316Q/L305V/K337A/V158D，K316Q/L305V/V158D/M298Q，K316Q/L305V/V158D/E296V，

K316Q/L305V/V158T/M298Q，K316Q/L305V/V158T/E296V，K316Q/L305V/E296V/M298Q，

K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q，

K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A，

K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A，

K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A，

F374Y/K337A，F374Y/V158D，F374Y/E296V，F374Y/M298Q，F374Y/V158T，F374Y/S314E，

F374Y/L305V，F374Y/L305V/K337A，F374Y/L305V/V158D，F374Y/L305V/E296V，

F374Y/L305V/M298Q，F374Y/L305V/V158T，F374Y/L305V/S314E，F374Y/K337A/S314E，

F374Y/K337A/V158T，F374Y/K337A/M298Q，F374Y/K337A/E296V，F374Y/K337A/V158D，

F374Y/V158D/S314E，F374Y/V158D/M298Q，F374Y/V158D/E296V，F374Y/V158T/S314E，

F374Y/V158T/M298Q，F374Y/V158T/E296V，F374Y/E296V/S314E，F374Y/S314E/M298Q，

F374Y/E296V/M298Q，F374Y/L305V/K337A/V158D，F374Y/L305V/K337A/E296V，

F374Y/L305V/K337A/M298Q，F374Y/L305V/K337A/V158T，F374Y/L305V/K337A/S314E，

F374Y/L305V/V158D/E296V，F374Y/L305V/V158D/M298Q，F374Y/L305V/V158D/S314E，

F374Y/L305V/E296V/M298Q，F374Y/L305V/E296V/V158T，F374Y/L305V/E296V/S314E，

F374Y/L305V/M298Q/V158T，F374Y/L305V/M298Q/S314E，F374Y/L305V/V158T/S314E，

F374Y/K337A/S314E/V158T，F374Y/K337A/S314E/M298Q，F374Y/K337A/S314E/E296V，

F374Y/K337A/S314E/V158D，F374Y/K337A/V158T/M298Q，F374Y/K337A/V158T/E296V，

F374Y/K337A/M298Q/E296V，F374Y/K337A/M298Q/V158D，F374Y/K337A/E296V/V158D，

F374Y/V158D/S314E/M298Q，F374Y/V158D/S314E/E296V，F374Y/V158D/M298Q/E296V，

F374Y/V158T/S314E/E296V，F374Y/V158T/S314E/M298Q，F374Y/V158T/M298Q/E296V，

F374Y/E296V/S314E/M298Q，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E，

F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E，

F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q，

F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A，

F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E，

F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E，

F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q，

F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A，

F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E，

F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E，

F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A，

F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E，S52A，S60A；R152E，S344A，

P11Q/K33E，T106N，K143N/N145T，V253N，R290N/A292T，G291N，R315N/V317T，

和K143N/N145T/R315N/V317T；或在233Thr-240Asn的氨基酸序列中 具有替代、添加、或缺失；或在304Arg-329Cys的氨基酸序列中具有 替代、添加、或缺失。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中所述因子VII多肽的解离常数Kd高于5nM，诸如高于7nM，诸如 高于10nM，诸如高于20nM，诸如高于30nM，诸如高于50nM，诸如高于 100nM，诸如高于200nM，诸如高于300nM，诸如高于400nM，诸如高于 500nM，诸如高于1μM。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽相对于SEQ ID NO：1 中各个位置处的氨基酸而言包含选自下组的一个或多个氨基酸替代： K18X1、R36X2、S43X3、K62X4、Q64X5、L65X6、I69X7、F71X8、L73X9、P74X10、 E77X11、G78X12、R79X13、K85X14、Q88X15、N93X16、F275X17、R277X18、M306X19、 T307X20、Q308X21、D309X22、和R379X23，所述不同氨基酸降低了组织因 子结合亲和力，其中

X1是E、D、A、或F；

X2是E、D、K、A、F、或N；

X3是E、D、K、R、A、或F；

X4是D、A、或F；

X5是E、D、K、R、A、F、或N；

X6是E、D、K、R、A、或F；

X7是C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X8是A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、或W；

X9是A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X10是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X11是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X12是A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X13是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X14是A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、或Y；

X15是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X16是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X17是A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X18是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y；

X19是A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W、或Y；

X20是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、W、或Y；

X21是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y；

X22是A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、或Y；且

X23是A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与选自下组的SEQ ID NO：1中各个位置处的氨基酸对应的一 个或多个氨基酸已被半胱氨酸残基替代：K18、R36、K62、Q64、L65、 I69、F71、L73、P74、E77、G78、R79、K85、Q88、N93、F275、R277、 M306、Q308、D309、和R379，所述半胱氨酸残基降低了组织因子结合 亲和力，且所述半胱氨酸残基可选地与化学基团缀合，所述化学基团 增加了所述因子VII多肽的分子量。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1 的K18已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的R36 已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的K62已被 半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的Q64已被半胱 氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的L65已被半胱氨酸 残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的I69已被半胱氨酸残基 替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的F71已被半胱氨酸残基替代。 在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的L73已被半胱氨酸残基替代。在一 个实施方案中，SEQ ID NO：1的P74已被半胱氨酸残基替代。在一个实 施方案中，SEQ ID NO：1的E77已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方 案中，SEQ ID NO：1的G78已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中， SEQ ID NO：1的R79已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的K85已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO： 1的Q88已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的 N93已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的F275 已被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的R277已 被半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的M306已被 半胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的Q308已被半 胱氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的D309已被半胱 氨酸残基替代。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的R379已被半胱氨 酸残基替代。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中包含因氨基酸取代而在由选自下组的SEQ ID NO：1中位置处 开始的氨基酸对应处导入的一个或多个N-糖基化位点N-Xaa-S/T：R36、 Q64、I69、F71、P74、E77、G78、Q88、N93、F275、M306、T307、和 D309，其中Xaa指除了P以外的任何氨基酸，所述导入的N-糖基化位点 降低了组织因子结合亲和力。在一个实施方案中，在由SEQ ID NO：1 的R36开始的位置处导入了N糖基化位点N-Xaa-S/T。在一个实施方案 中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的Q64开始的位置 处。在一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO： 1的I69开始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被 导入在由SEQ ID NO：1的F71开始的位置处。在一个实施方案中，N糖 基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的P74开始的位置处。在 一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的 E77开始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入 在由SEQ ID NO：1的G78开始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化 位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的Q88开始的位置处。在一个 实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的N93 开始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在 由SEQ ID NO：1的F275开始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化位 点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的M306开始的位置处。在一个实 施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由SEQ ID NO：1的T307开 始的位置处。在一个实施方案中，N糖基化位点N-Xaa-S/T被导入在由 SEQ ID NO：1的D309开始的位置处。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K18处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：E、D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R36处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：E、D、K、A、F、和N。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置S43处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K62处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：D、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q64处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：E、D、K、R、A、F、和N。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置L65处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：E、D、K、R、A、和F。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置I69处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置F71处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、和W。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置L73处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置P74处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1位置E77的氨基酸对应的氨基酸已被选自下组 的氨基酸残基替代：A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、 W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置G78处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R79处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置K85处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、 和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q88处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置N93处的氨基酸对应的氨基酸已被选自 下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置F275处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、 T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R277处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、 T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置M306处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、 V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置T307处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、 R、S、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置Q308处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、 S、T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置D309处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、 W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是这样的因子VII多 肽，其中与SEQ ID NO：1中位置R379处的氨基酸对应的氨基酸已被选 自下组的氨基酸残基替代：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、 T、V、W、和Y。

在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是选自下组的的因子 VII多肽：FVII-(S43N)、FVII-(K62E)、FVII-(Q64E)、FVII-(I69F)、 FVII-(K62E/I69A)、FVII-(Q64E/I69A)、FVII-(Q62E/Q64E/I69A)、 FVII-(K62E/I69F)、FVII-(Q64E/I69F)、FVII-(K62E/Q64E/I69F)、 FVII-(S43C)、FVII-(I69C)、FVII-(Q64C)、FVII-(M306C)、 FVII-(R277C)、FVII-(I69N/F71T)、FVII-(F71N/L73T)、 FVII-(R277N)、和FVII-(D309N/L311T)。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸构建体是载体。

术语“多核苷酸”指由5′端向3′端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，而且可以 是由天然来源分离的、体外合成的、或通过组合天然和合成分子而制 备的。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写“nt”)或碱基 对(缩写“bp”)表示。术语“核苷酸”在上下文允许的情况下用于 表示单链和双链两种分子。当该术语用于双链分子时，它指全长，而 且应当理解为与术语“碱基对”同义。本领域技术人员将领会，双链 多核苷酸的两条链在长度上可以略有不同，而且它们的末端可以因酶 促切割而交错；由此，双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可能不配对。 这些不配对末端的长度通常不超过20nt。

术语“载体”在用于本文时指能够在宿主细胞中扩增的任何核酸 实体。由此，载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体存在 且其复制不依赖染色体复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是在 导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中且与它所整合的染色体一起 复制的载体。载体的选择常常取决于它将要导入的宿主细胞。载体包 括、但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒或粘粒载体。载体常常包 含复制起点和至少一种选择基因，即所编码的产物易于检测或其存在 为细胞生长所必需的基因。

在一个实施方案中，本发明的真核宿主细胞是哺乳动物起源的。

在另一个实施方案中，本发明的真核宿主细胞选自下组：CHO细胞、 BHK细胞、和HEK细胞。

术语“真核宿主细胞”在用于本文时代表任何细胞，包括杂交细 胞，其中异源DNA能够表达。典型的宿主细胞包括、但不限于昆虫细胞、 酵母细胞、哺乳动物细胞，包括人类细胞，诸如BHK、CHO、HEK、和COS 细胞。在实践本发明时，培养的宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选 已建成的哺乳动物细胞系，包括、但不限于CHO(例如ATCC CCL 61)、 COS-1(例如ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如ATCC CRL 1573；Graham等，1977，J.Gen.Virol.36，59-72)细胞系。

优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga， 1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1106-1110)，下文称为BHK 570 细胞。BHK 570细胞系可以由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；12301 Parklawn Dr.，罗克维尔，马里兰，20852) 以ATCC编号CRL 10314获得。tk-ts13 BHK细胞系还可以由ATCC以编 号CRL 1632获得。

其它合适细胞系包括但不限于大鼠Hep I(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、 和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220)。3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它 细胞的融合体也是有用的。在一个实施方案中，真核宿主细胞是哺乳 动物起源的。在另一个实施方案中，真核宿主细胞选自下组：CHO细胞、 BHK细胞、和HEK细胞。

术语“处理/治疗”在用于本文时指出于预防任何症状或疾病状况 发展的目的或者出于治愈或减轻这些早已形成的症状或疾病状态的目 的而施用有效量的本发明治疗活性化合物。术语“处理/治疗”由此意 图包括预防性处理/治疗。

术语“正常止血系统的增强”指生成凝血酶能力的增强。

术语“出血紊乱”在用于本文时指表现为出血的任何先天的、后 天的、或诱发的细胞或分子起源的缺陷。实例有凝固因子缺乏(例如 血友病A和B或者凝固因子XI或VII缺乏)、凝固因子抑制物、血小板功 能缺陷、血小板减少症、或von Willebrand氏病。

术语“出血事件(bleeding episodes)”意图包括未受控制的和 过度的出血，它在手术和其它形式的组织损伤中都是一个主要问题。 未受控制的和过度的出血可能发生于具有正常凝固系统的受试者以及 患有凝固或出血紊乱的受试者。凝固因子缺乏(血友病A和B、凝固因 子XI或VII缺乏)或凝固因子抑制物可能是出血紊乱的原因。过度的出 血在具有正常的功能性血液凝固级联反应(没有凝固因子缺乏或针对 任何凝固因子的抑制物)的受试者中也会发生，而且可能是由血小板 功能缺陷、血小板减少症、或von Willebrand氏病引起的。在这些情 况中，出血可能与由血友病引起的出血相似，因为与在血友病中一样， 止血系统缺乏或者具有异常的基本凝固“化合物”(诸如血小板或von Willebrand因子蛋白)，从而引起大出血。在经受与手术有关的大面 积组织损伤或大面积外伤的受试者中，正常的止血机制可能不能应付 立即止血的需要，尽管它们具有正常的止血机制，也可能形成出血。 当出血发生于诸如脑、内耳区、和眼等手术止血的可能性受到限制的 器官内时，实现令人满意的止血也是一个问题。相同问题还存在于由 多种器官采集活组织样本的过程(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)以及 腹腔镜检查手术中。这些情况的共同点是难以通过手术技术(缝合、 夹子、等)提供止血，弥漫性出血(出血性胃炎和大量子宫出血)也 是这种情况。急性和大量出血还可能在进行抗凝剂疗法的受试者中发 生，其中所述疗法诱发了止血缺陷。在需要快速抵消抗凝剂作用的情 况中，这些受试者可能需要手术干预。耻骨后前列腺根治切除术是通 常对具有局部前列腺癌的受试者进行的操作。手术常常并发显著、有 时是大量的失血。前列腺切除术中的可观失血主要与复杂的解剖学形 势有关，即具有不易进行手术止血的多个密集血管化部位，而且它可 能导致大面积弥漫性出血。就止血不充分而言可能引起麻烦的另一种 情况是对具有正常止血机制的受试者进行抗凝剂疗法以预防血栓栓塞 性疾病时。这种疗法可以包括肝素、蛋白聚糖的其它形式、华法林或 维生素K拮抗剂的其它形式、以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制物。

在本发明的一个实施方案中，出血与血友病A或B有关。在另一个 实施方案中，出血与具有获得性抑制物的血友病有关。在另一个实施 方案中，出血与血小板减少症有关。在另一个实施方案中，出血与von Willebrand氏病有关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤有 关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一个实施方案 中，出血与手术有关。在另一个实施方案中，出血与腹腔镜检查手术 有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎有关。在另一个实施 方案中，出血是大量子宫出血。在另一个实施方案中，出血发生在机 械止血的可能性受到限制的器官内。在另一个实施方案中，出血发生 于脑、内耳区、或眼内。在另一个实施方案中，出血与进行活组织检 查的过程有关。在另一个实施方案中，出血与抗凝剂疗法有关。

术语“受试者”在用于本文时意图指任何动物，特别是哺乳动物， 诸如人类，而且在适当情况中可以与术语“患者”互换使用。

本文所用氨基酸替代的命名如下。第一个字母代表SEQ ID NO：1 中该位置处天然存在的氨基酸。后面的数字代表SEQ ID NO：1中的位 置。第二个字母代表用于替代该天然氨基酸的不同氨基酸。一个实例 是S43N，其中SEQ ID NO：1中第43位处的丝氨酸被天冬酰胺替代。又 例如，K62E/I69A表示在同一因子VII多肽中，SEQ ID NO：1中第62位 处的赖氨酸被谷氨酸替代且SEQ ID NO：1中第69位处的异亮氨酸被丙 氨酸替代。由此，I69A-FVII指其中SEQ ID NO：1中第69位处的异亮氨 酸被丙氨酸替代的人野生型FVII。

在一个方面，本发明涉及含有野生型人FVIIa和组织因子结合亲和 力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本 质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于在受试者中治疗出血事件或者用 于增强正常止血系统的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用 治疗或预防有效量的：

1)包含野生型人FVIIa和组织因子结合亲和力比重组野生型人因 子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提高 的因子VII多肽的组合物；或

2)包含野生型人FVIIa的第一种组合物和包含组织因子结合亲和 力比重组野生型人因子VIIa低且具有与重组野生型人因子VIIa相比本 质上相同或有所提高的活性的因子VII多肽的第二种组合物。

在另一个方面，本发明涉及用于制备包含野生型人FVIIa和组织 因子结合亲和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因 子VIIa相比本质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物的工艺，其 中所述工艺包括如下步骤：将野生型人FVIIa和组织因子结合亲和力比 重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上 相同或有所提高的因子VII多肽在水性介质中混合。

在另一个方面，本发明涉及包含野生型人FVIIa和组织因子结合 亲和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相 比本质上相同或有所提高的因子VII多肽的组合物用于制备在受试者 治疗出血事件或增强正常止血系统的药物中的用途。

在另一个方面，本发明涉及组织因子结合亲和力比重组野生型人 因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提 高的因子VII多肽在出血的治疗性处理中的用途，其中TF的暴露较高， 诸如存在斑块破裂、经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)程序后的斑块 破裂、败血症或其它出血并发症风险的指征，发现组织因子数量增加 的炎性状况。在一个实施方案中，TF暴露较高的出血是凝固紊乱，诸 如弥漫性血管内凝血(DIC)。

本发明还涵盖提供联合疗法的方法和组合物，其中连同另一种促 凝化合物、抗纤溶化合物、或抗凝化合物调节物一起施用组织因子结 合亲和力比重组野生型人因子VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa 相比本质上相同或有所提高的因子VII多肽。合适的化合物包括但不限 于因子VIII(诸如Refacto(Genetics Institute)、Kogenate FS (Bayer)、Monoclate-P(Aventis Behring))、因子XIII(见例 如WO 01/85198)、组织因子途径抑制物的抑制剂(TFPI抑制剂)(见 例如WO 01/85199)、因子IX(见例如WO 02/062376)、凝血酶可激活 的纤溶抑制剂(TAFI)(见例如PCT/DK02/00734)、PAI-1(见例如 PCT/DK02/00735)、因子V(见例如PCT/DK02/00736)、蛋白C抑制剂 (见例如PCT/DK02/00737)、血栓调节素(见例如PCT/DK02/00738)、 蛋白S抑制剂(见例如PCT/DK02/00739、组织纤溶酶原激活物抑制剂(见 例如PCT/DK02/00740)、α2-抗血纤维蛋白溶酶(见例如 PCT/DK02/00741)、抑肽酶(见例如PCT/DK02/00742)、氨甲环酸(见 例如PCT/DK02/00751)、ε-氨基己酸(见例如PCT/DK02/00752)、 凝血酶原、凝血酶、因子VII、因子X、因子XI、和纤维蛋白原、人工 氧载体(诸如POLYHEME，Northfield lab)、胶体(诸如Hextend， BioTime公司)、去氨加压素(诸如DDAVP片剂(醋酸去氨加压素)， Adventis Pharmaceuticals)、活化的凝血酶原复合物浓缩物(即 Bebulin、Proplex-T、Profiline、Autoplex、FEIBA)、氯吡格雷、 噻氯匹啶、糖蛋白IIB/IIIA拮抗剂(阿昔单抗)、LMWH、华法林、链 激酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)/tPA突变体。

在一个实施方案中，组织因子结合亲和力比重组野生型人因子 VIIa低且活性与重组野生型人因子VIIa相比本质上相同或有所提高的 因子VII多肽是如国际专利申请WO 99/20767、WO 00/66753、WO 01/58935、WO 03/93465、和WO 04/029091(将每一篇完整收入本文 作为参考)中所公布的。

在本说明书中，如表1所示，用IUPAC-IUB生物化学命名委员会 (CBN)批准的缩写表述氨基酸。由名称或下列缩写表述的具有异构体 的氨基酸等指天然L构型，另有说明者除外。另外，肽的氨基酸序列的 左端和右端分别指N端和C端，另有说明者除外。

表1：氨基酸的缩写   氨基酸   三字母缩写   单字母缩写   甘氨酸   Gly   G   脯氨酸   Pro   P   丙氨酸   Ala   A   缬氨酸   Val   V   亮氨酸   Leu   L   异亮氨酸   Ile   I   甲硫氨酸   Met   M   半胱氨酸   Cys   C   苯丙氨酸   Phe   F   酪氨酸   Tyr   Y   色氨酸   Trp   W   组氨酸   His   H   赖氨酸   Lys   K   精氨酸   Arg   R   谷氨酰胺   Gln   Q   天冬酰胺   Asn   N   谷氨酸   Glu   E   天冬氨酸   Asp   D   丝氨酸   Ser   S   苏氨酸   Thr   T

本发明还涉及用于制备上文所述人因子VII多肽的方法。优选通过 重组DNA技术来生产人因子VII多肽。为此，可以依照标准，通过制备 基因组或cDNA文库，并使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码完整 蛋白质或其部分的DNA序列，从而技术分离编码人因子VII的DNA序列 (见Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。为此， 编码所述蛋白质的DNA序列优选是人起源的，即由人基因组DNA或cDNA 文库衍生而来。

还可以通过已经建立的标准方法，例如Beaucage和Caruthers， 1981，Tetrahedron Letters 22，1859-1869中描述的亚磷酰胺 (phosphoamidite)法，或Matthes等，1984，EMBO Journal 3，801 -805中描述的方法，通过合成制备编码人因子VII多肽的DNA序列。依 照亚磷酰胺法，在例如自动化DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火， 连接，并克隆到合适的载体中。

还可以通过聚合酶链式反应，使用特异引物来制备所述DNA序列， 例如US 4,683,202；Saiki等，1988，Science 239，487-491；或 Sambrook等(见上文)中所述。

通常将编码人因子VII多肽的DNA序列插入重组载体，该载体可以 是能够方便的进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择通常取决于它 将要导入的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制型载体，即作为染 色体外实体存在且其复制不依赖染色体复制的载体，例如质粒。或者， 载体可以是在导入宿主细胞后整合到宿主细胞基因组中且与它所整合 的染色体一起复制的载体。

载体优选地是其中编码人因子VII多肽的DNA序列与DNA转录所必 需的额外片段可操作连接的表达载体。一般而言，表达载体衍生自质 粒或病毒DNA，或者可以包含二者的元件。术语“可操作连接”指片段 的排列方式使得它们能够一致发挥功能从而实现它们的预定目的，例 如在启动子处启动转录并前行经过编码多肽的DNA序列。

启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 而且可以衍生自编码对于宿主细胞而言属同源或异源的蛋白质的基 因。

适于在哺乳动物细胞中指导编码人因子VII多肽的DNA转录的启动 子的实例是SV40启动子(Subramani等，1981，Mol.Cell Biol.1， 854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，1983， Science 222，809-814)、CMV启动子(Boshart等，1985，Cell 41， 521-530)、或2型腺病毒主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，1982， Mol.Cell.Biol.2，1304-1319)。

适于在昆虫细胞中使用的启动子的实例是多角体蛋白启动子(US 4,745,051；Vasuvedan等，1992，FEBS Lett.311，7-11)、P10启 动子(J.M.Vlak等，1988，J.Gen.Virology 69，765-776)、苜 蓿银蚊夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子 (EP 397 485)、杆状病毒立即早期基因1启动子(US 5,155,037；US 5,162,222)、或杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US 5,155,037； US 5,162,222)。

适于在酵母宿主细胞中使用的启动子的实例包括来自酵母糖酵解 基因(Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255，12073-12080；Alber 和Kawasaki，1982，J.Mol.Appl.Gen.1，419-434)或醇脱氢酶 基因(Young等，在Hollaender等编的《化学药品的微生物遗传工程》 (Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals)中， Plenum出版社，纽约，1982)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311) 或ADH2-4c(Russell等，1983，Nature 304，652-654)启动子。

适于在丝状真菌宿主细胞中使用的启动子的实例是例如ADH3启动 子(McKnight等，1985，The EMBO J.4，2093-2099)或tpiA启动 子。其它有用启动子的实例是衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋 白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、 黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米赫根霉脂 肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、或构巢曲霉(A. nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。优选TAKA淀粉酶和gluA启动子。 合适的启动子见例如EP 238 023和EP 383 779。

如果需要，还可以将编码人因子VII多肽的DNA序列与合适的终止 子可操作连接，诸如人生长激素终止子(Palmiter等，1983，Science 222，809-814)、TPI1终止子(Alber和Kawasaki，1982，J.Mol.Appl. Gen.1，419-434)、或ADH3终止子(McKnight等，1985，The EMBO J.4，2093-2099)。载体还可以在启动子的下游、因子VII序列自身 插入位点的上游包含一套RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以由腺 病毒和/或免疫球蛋白基因获得。表达载体还包含位于插入位点下游的 多聚腺苷酸化信号。特别优选的多聚腺苷酸化信号包括来自SV40早期 或晚期多聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同上)、来自5型腺病毒 E1b区域的多聚腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等， 1981，Nuc.Acids Res.9，3719-3730)、或来自人因子VII基因或 牛因子VII基因的多聚腺苷酸化信号。表达载体中还可以包含位于启动 子与RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，诸如2型腺病毒三联前 导序列；以及增强子序列，诸如SV40增强子。

重组载体还可以包含使得载体能够在所研究的宿主细胞中复制的 DNA序列。这种序列(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)的实例是SV40 复制起点。

当宿主细胞是酵母细胞时，使得载体能够复制的合适序列是酵母 2μ质粒复制基因REP 1-3和复制起点。

载体中还可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞中的缺陷 的基因，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)TPI基因(P.R.Russell，1985，Gene 40，125-130)的基因，或者赋予对药物(例如氨苄青霉素、卡那霉 素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素、或氨甲蝶呤)的抗性的基因。 对于丝状真菌，选择标记包括amdS、pyrG、argB、niaD、或sC。

为了引导本发明的人因子VII多肽进入宿主细胞的分泌途径，可以 在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列、或前 序列)。将分泌信号序列与编码人因子VII多肽的DNA序列以正确读码 框相连接。分泌信号序列通常位于编码所述肽的DNA序列的5′端。分泌 信号序列可以是通常就与该蛋白质相连的序列，或者可以是来自编码 另一种分泌性蛋白质的基因。

为了由酵母细胞实现分泌，分泌信号序列可以编码确保有效引导 所表达的人因子VII多肽进入该细胞的分泌途径的任何信号肽。信号肽 可以是天然存在的信号肽或其功能片段，或者它可以是合成肽。已经 发现的合适信号肽有α-因子信号肽(见US 4,870,008)、小鼠唾液淀 粉酶信号肽(见O.Hagenbuchle等，1981，Nature 289，643-646)、 经修饰羧肽酶信号肽(见L.A.Valls等，1987，Cell 48，887-897)、 酵母BAR1信号肽(见WO 87/02670)、或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3) 信号肽(见M.Egel-Mitani等，1990，Yeast 6，127-137)。

为了在酵母中实现有效分泌，还可以将编码前导肽的序列插入信 号序列的下游、编码人因子VII多肽的DNA序列的上游。前导肽的功能 是将所表达的肽由内质网引导至高尔基体，继而至分泌小泡，从而分 泌到培养基中(即输出人因子VII多肽穿过酵母细胞的细胞壁或至少是 跨过细胞膜进入周质空间)。前导肽可以是酵母α-因子前导肽(其用 途描述于例如US 4,546,082、US 4,870,008、EP 16 201、EP 123 294、 EP 123 544、和EP 163 529)。或者，前导肽可以是合成的前导肽， 即自然界中不存在的前导肽。合成前导肽可以例如如WO 89/02463或WO 92/11378中所述构建。

为了在丝状真菌中使用，信号肽可以方便的衍生自编码曲霉淀粉 酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米赫根霉的脂酶或蛋白酶的基因、或编 码Humicola lanuginosa脂酶的基因。信号肽优选衍生自编码米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性淀粉酶、或黑曲 霉葡糖淀粉酶的基因。合适的信号肽公布于例如EP 238 023和EP 215 594。

为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以方便的衍生自昆虫基因(见 WO 90/05783)，诸如鳞翅目Manduca sexta脂动激素前体信号肽(见 US 5,023,328)。

本领域技术人员熟知用于分别连接编码人因子VII多肽的DNA序 列、启动子、以及可选地终止子和/或分泌信号序列以及将它们插入包 含复制所必需的信息的合适载体的操作(见例如Sambrook等，《分子 克隆，实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)， 冷泉港，纽约，1989)。

用于转染哺乳动物细胞并在细胞中表达所导入的DNA序列的方法 见例如Kaufman和Sharp，1982，J.Mol.Biol.159，601-621；Southern 和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341；Loyter等，1982， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，422-426；Wigler等，1978，Cell 14，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7，603；Graham 和van der Eb，1973，Virology 52，456；以及Neumann等，1982， EMBO J.1，841-845。

可以将选择标记在分开的质粒上与目的基因同时导入细胞，或者 可以将它们在同一质粒上导入细胞。如果是在同一质粒上，那么选择 标记和目的基因可以处于不同启动子或相同启动子的控制之下，后一 种排布将产生双顺反子信息。本领域知道这类构建体(例如Levinson 和Simonsen，美国专利号4,713,339)。向导入细胞的混合物中添加称 为“载体DNA”的额外DNA可能也是有利的。

在细胞摄取DNA后，将它们在合适培养基中进行培养，通常是1-2 天，以开始表达目的基因。在用于本文时，术语“合适的培养基”指 含有养分和细胞生长与目的人因子VII多肽表达所必需的其它成分的 介质。培养基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需的糖、维生素、 盐、磷脂、蛋白质、和生长因子。为了生成γ-羧化蛋白质，培养基必 须含有维生素K，优选的浓度是约0.1μg/ml-约5μg/ml。然后施加药物 选择，从而选择出以稳定方式表达选择标记的细胞的生长。对于经过 可扩增的选择标记转染的细胞，可以提高药物浓度以选择所克隆序列 的拷贝数的增加，从而提高表达水平。然后对稳定转染细胞的克隆筛 选目的人因子VII多肽的表达。

其中导入了编码人因子VII多肽的DNA序列的宿主细胞可以是能够 生成经过翻译后修饰的人因子VII多肽的任何细胞，包括酵母、真菌、 和高等真核细胞。

用于本发明的哺乳动物细胞系的实例有COS-1(ATCC CRL 1650)、 幼仓鼠肾(BHK)、和293(ATCC CRL 1573；Graham等，1977，J.Gen. Virol.36，59-72)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞 系(Waechter和Baserga，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79， 1106-1110，收入本文作为参考)，下文称为BHK 570细胞。BHK 570 细胞系已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；12301 Parklawn Dr.，罗克维尔，马里兰，20852)， ATCC编号CRL 10314。tk-ts13 BHK细胞系还可以由ATCC以编号CRL 1632获得。另外，本发明还可以使用许多其它细胞系，包括大鼠Hep I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO(ATCC CCL 61)、和DUKX细胞(Urlaub 和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77，4216-4220)。

合适的酵母细胞的实例包括酵母属或裂殖酵母属的细胞，特别是 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)的菌株。用异源DNA转化酵母细胞并由其生产异源多肽的方 法见例如US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743、 和US 4,845,075(都收入本文作为参考)。通过由选择标记决定的表 型来选择受到转化的细胞，通常是药物抗性或在缺少特定养分(例如 亮氨酸)时的生长能力。用于酵母的优选载体有US 4,931,373中公布 的POT1载体。在编码人因子VII多肽的DNA序列的前面可以是信号序列 以及可选地前导序列，例如上文所述。合适的酵母细胞的其它实例有 克鲁维酵母属(诸如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、 汉森酵母属(例如多形汉森酵母(Hansenula polymorpha))、或毕 赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))(见Gleeson 等，1986，J.Gen.Microbiol.132，3459-3465；US 4,882,279) 的菌株。

其它真菌细胞的实例有丝状真菌的细胞，例如曲霉属 (Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、镰孢属(Fusarium)、 或木霉属(Trichoderma)，特别是米曲霉、构巢曲霉、或黑曲霉的菌 株。曲霉用于表达蛋白质的用途见例如EP 272 277、EP 238 023、EP 184 438。尖镰孢(F.oxysporum)的转化可以如例如Malardier等，1989， Gene 78，147-156中所述进行。木霉的转化可以如例如EP 244 234 中所述进行。

在使用丝状真菌作为宿主细胞时，可以用本发明的DNA构建体进行 转化，其可方便的通过将DNA构建体整合到宿主染色体中、得到重组宿 主细胞而实现。通常认为这种整合是有利，因为DNA序列更有可能在细 胞中得到稳定维持。可以依照常规方法将DNA构建体整合到宿主染色体 中，例如通过同源或异源重组。

昆虫细胞的转化及其中异源多肽的生成可以如US 4,745,051、US 4,879,236、US 5,155,037、US 5,162,222、EP 397,485(都收入本 文作为参考)中所述进行。适于用作宿主的昆虫细胞系有鳞翅目细胞 系，诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾 (Trichoplusia ni)细胞(见US 5,077,214)。合适的培养条件见 例如WO 89/01029或WO 89/01028或任何上述参考文献。

然后在合适培养基中，在容许表达人因子VII多肽的条件下培养上 文所述经过转化或转染的宿主细胞，之后可以由培养物回收全部或部 分得到的肽。用于培养细胞的培养基可以是适于培养宿主细胞的任何 常规培养基，诸如含有适当补充物的基本或完全培养基。可以由供应 商处获得合适的培养基，或者可以依照发表的配方(例如美国典型培 养物收藏中心的目录)自行配制。然后可以通过常规流程由培养基回 收由细胞生成的人因子VII多肽，包括通过离心或过滤将宿主细胞与培 养基分开，通过盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液中的蛋白质性质 的成分，根据所研究多肽的类型通过多种层析操作进行纯化，例如离 子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、诸如此类。

为了制备重组人因子VII多肽，使用克隆的野生型因子VII DNA序 列。可以修饰该序列以编码期望的因子VII变体。人因子VII的完整核 苷酸和氨基酸序列是已知的。参阅美国专利号4,784,950(收入本文作 为参考)，其中描述了重组人因子VII的克隆和表达。牛因子VII序列 见Takeya等，1988，J.Biol.Chem.263，14868-14872(收入本文 作为参考)。

氨基酸序列的改变可以通过多种技术来实现。可以通过定点诱变 来修饰DNA序列。定点诱变技术在本领域是众所周知，并描述于例如 Zoller和Smith，1984，DNA 3，479-488。由此，可以使用因子VII 的核苷酸和氨基酸序列来导入所选择的改变。

本发明中使用的DNA序列通常在因子VII蛋白质的氨基端编码前原 肽，以实现正确的翻译后加工(例如谷氨酸残基的γ-羧化)和从宿主 细胞中分泌。前原肽可以是因子VII或另一种维生素K依赖性血浆蛋白 质(诸如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C、或蛋白S)的前原肽。本 领域技术人员将领会，可以在因子VII氨基酸序列的特定部位进行额外 修饰，那里的修饰不会显著削弱蛋白质作为凝固因子发挥作用的能力。 例如，还可以在激活切割位点处修饰催化三联体中的因子VII，从而抑 制酶原因子VII转变成它的活化双链形式，正如美国专利号5,288,629 中所述(收入本文作为参考)。

在本发明中，可以采用转基因动物技术来生产人因子VII多肽。优 选在宿主雌性哺乳动物的乳腺中生成所述蛋白质。在乳腺中表达目的 蛋白、随后分泌到乳汁中克服了由其它来源分离蛋白质中遭遇的许多 困难。乳汁易于收集，可以大量获得，而且在生物化学方面已经充分 鉴定。另外，主要的乳汁蛋白质在乳汁中以高浓度存在(通常是约 1-15g/L)。从商业角度看，显然优选使用乳汁产量大的物种作为宿主。 尽管可以使用诸如小鼠和大鼠等小型动物(而且在原理验证阶段是优 选的)，本发明优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵 羊、和牛。特别优选绵羊，原因是诸如该物种已有的转基因生成历史、 乳汁产量、成本、和采集绵羊乳汁所需设备的易于获得性等因素。影 响宿主物种选择的因素的比较参见WIPO公开号WO 88/00239。通常希望 选择宿主动物中为了乳业用途而培育的品种，诸如East Friesland绵 羊，或者在后来通过转基因系的育种而引入奶畜。在任何情况下，应 当使用有知的、健康状况优良的动物。

为了在乳腺中实现表达，可使用来自乳汁蛋白质基因的转录启动 子。乳汁蛋白质基因包括编码酪蛋白(见美国专利号5,304,489，收入 本文作为参考)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白、和乳清酸性蛋白质的 基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。在绵羊β-乳球蛋白基因的情 况中，通常使用该基因5′侧翼序列至少近端406bp的区域，优选5′侧翼 序列的更大片段，可长达约5kb，诸如涵盖β-乳球蛋白基因5′侧翼启 动子和非编码区的约4.25kb DNA片段。见Whitelaw等，1992，Biochem. J.286，31-39。来自其它物种的启动子DNA的相似片段也是合适的。

还可以将β-乳球蛋白基因的其它区域掺入构建体，正如将要表达 的基因的基因组区域。例如，本领域通常认为，缺少例如内含子的构 建体与包含这些DNA序列的构建体相比表达不佳(见Brinster等，1988， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，836-840；Palmiter等，1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，478-482；Whitelaw等，1991， Transgenic Res.1，3-13；WO 89/01343；以及WO 91/02318，每一 篇都收入本文作为参考)。在这点上，有可能的话，通常优选使用包 含编码目的蛋白质或多肽的基因的所有或一些天然内含子的基因组序 列，因此，还优选进一步包含来自例如β-乳球蛋白基因的至少一些内 含子。这样的一个区域是来自绵羊β-乳球蛋白基因3′非编码区、提供 内含子剪接和RNA多聚腺苷酸化的DNA区段。在替代基因的天然3′非编 码序列时，此绵羊β-乳球蛋白区段既能增强又能稳定目的蛋白质或多 肽的表达水平。在其它实施方案中，将编码人因子VII多肽的序列的起 始ATG周围的区域用来自乳汁特异蛋白质基因的相应序列取代。这种取 代提供了推定的组织特异性起始环境以增强表达。将人因子VII多肽的 整个前原序列和5′非编码序列用例如BLG基因的相应序列取代是方便 的，尽管可以取代更小的区域。

为了在转基因动物中表达人因子VII多肽，将编码人因子VII多肽 的DNA区段与其表达而生成表达单位所必需的额外DNA区段可操作连 接。这些额外区段包括上文所述启动子，以及提供mRNA的转录终止和 多聚腺苷酸化的序列。表达单位还将包含编码分泌信号序列的DNA区 段，它与编码人因子VII多肽的区段可操作连接。分泌信号序列可以是 人因子VII多肽的天然分泌信号序列，或者可以是另一种蛋白质(诸如 乳汁蛋白质)的分泌信号序列。参阅例如von Heinje，1986，Nuc.Acids Res.14，4683-4690；以及Meade等，美国专利号4,873,316，收入 本文作为参考。

用于转基因动物的表达单位的构建可以方便的通过将编码人因子 VII多肽的序列插入包含额外DNA区段的质粒或噬菌体载体来进行，尽 管可以通过基本上任何顺序的连接来构建表达单位。特别方便的是提 供包含编码乳汁蛋白质的DNA区段的载体并用人因子VII多肽的编码序 列取代该乳汁蛋白质的编码序列，从而产生包含所述乳汁蛋白质基因 的表达控制序列在内的基因融合体。在任何情况中，质粒或其它载体 中表达单位的克隆均方便了人因子VII多肽的扩增。扩增可以方便的在 细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中进行，因此，载体通常包含在细菌 宿主细胞中发挥功能的复制起点和选择标记。

然后将表达单位导入所选择宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)。 可以通过数种途径中的一种来实现异源DNA的导入，包括显微注射(例 如美国专利号4,873,191)、逆转录病毒感染(Jaenisch，1988，Science 240，1468-1474)、或使用胚胎干(ES)细胞的定点整合(综述见Bradley 等，1992，Bio/Technology 10，534-539)。然后将卵植入假孕雌 性动物的输卵管或子宫内并使之发育。在其种系中携带所导入的DNA 的后代能够以正常的孟德尔方式将该DNA传给它们的后代，从而能够培 育转基因兽群。

用于生成转基因动物的一般程序在本领域是已知的。参见例如 Hogan等，1986，《小鼠胚胎操作，实验室手册》(Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室；Simons等， 1988，Bio/Technology 6，179-183；Wall等，1985，Biol.Reprod. 32，645-651；Buhler等，1990，Bio/Technology 8，140-143；Ebert 等，1991，Bio/Technology 9，835-838；Krimpenfort等，1991， Bio/Technology 9，844-847；Wall等，1992，J.Cell.Biochem.49， 113-120；美国专利号4,873,191和4,873,316；WIPO发布物WO 88/00239、WO 90/05188、WO 92/11757、和GB 87/00458，收入本文 作为参考。用于将外源DNA序列导入哺乳动物及其生殖细胞的技术最初 是在小鼠中开发的。参见例如Gordon等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77，7380-7384；Gordon和Ruddle，1981，Science 214，1244 -1246；Palmiter和Brinster，1985，Cell 41，343-345；以及Brinster 等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4438-4442。这些技 术随后经修改以适用于大型动物，包括家畜(见例如WIPO公开物WO 88/00239、WO 90/05188、和WO 92/11757；以及Simons等，1988， Bio/Technology 6，179-183。总之，在迄今为止用于生成转基因小 鼠或家畜的最有效途径中，依照已经建立的方法将数百个目的DNA的线 性分子注射到受精卵的一个前核中。也可以采用将DNA注射到合子的细 胞质中。还可以采用在转基因植物中生产。表达可以是普遍的，或者 定向到特定器官，诸如块茎。参见Hiatt，1990，Nature 344，469- 479；Edelbaum等，1992，J.Interferon Res.12，449-453；Sijmons 等，1990，Bio/Technology 8，217-221；以及欧洲专利局公开物EP 255,378。

可以通过使用抗因子VII抗体柱的亲和层析来纯化依照本发明生 成的因子VII。优选的是，免疫吸附柱包含高特异性的单克隆抗体。特 别优选使用钙依赖性单克隆抗体，正如Wakabayashi等，1986，J.Biol. Chem.261，11097-11108；和Thim等，1988，Biochem.27，7785- 7793中所述(收入本文作为参考)。可以通过常规化学纯化方法实现 额外纯化，诸如高效液相层析。本领域知道其它纯化方法，包括柠檬 酸钡沉淀，而且它们可用于纯化本文所述因子VII(见Scopes，R.，《蛋 白质纯化》Protein Purification，Springer-Verlag，纽约，1982)。 制药学用途优选具有至少约90-95％均一性的基本纯的因子VII，最优 选98-99％或更高均一性。一旦部分纯化或正如期望的纯化至均一，则 可以将因子VII用于治疗用途。

单链因子VII向活性双链因子VIIa的转变可以使用因子XIIa来实 现，正如Hedner和Kisiel，1983，J.Clin.Invest.71，1836-1841 所述，或者使用具有胰蛋白酶样特异性的其它蛋白酶(Kisiel和 Fujikawa，1983，Behring Inst.Mitt.73，29-42)来实现。或者， 可以通过让因子VII通过离子交换层析柱而使之自我激活，诸如mono Q.RTM.(Pharmacia Fire Chemicals)等(Bjoern等，1986，Research Disclosures 269，564-565)。本发明的因子VII分子及其药物组合 物特别可用于对人给药以治疗牵涉血管内凝血的多种状况。

本发明还提供了用于选择依照本发明的优选因子VIIa多肽和因子 VIIa衍生物的合适测定法。可以作为简单的初步体外测试进行这些测 定法。

因此，本文实施例3公布了针对本发明因子VIIa多肽活性的简单测 试法(题为“体外水解测定法”)。基于此，特别关注的因子VIIa多 肽是这样的多肽，其中在本文定义的“体外水解测定法”中进行测试 时，该变体的活性与图1所示天然人因子VII的活性之间的比率是约1.0 或更高。

还可以使用合适浓度在100-1000nM的生理学底物诸如因子X来测 量多肽的活性(“体外蛋白水解测定法”)(见实施例4)，其中，在 添加合适的显色底物(例如S-2765)后测量所生成的因子Xa。另外， 可以在生理学温度下进行该活性测定法。

还可以在包含生理学浓度的所有相关凝固因子和抑制剂(在模仿 血友病A的状况时除去因子VIII)以及活化血小板的测定法中测量促凝 因子VIIa多肽生成凝血酶的能力(见Monroe等，1997，Brit.J. Haematol.99，542-547中的第543页，收入本文作为参考)。

依照本发明的促凝因子VII多肽可以用于控制具有数种起因的出 血紊乱，诸如凝固因子缺乏(例如血友病A和B或者凝固因子XI或VII 缺乏)或凝固因子抑制物，或者它们可用于控制在具有正常发挥功能 的凝血级联反应(没有凝固因子缺乏或针对任何凝固因子的抑制物) 的受试者中发生的过度出血。出血可能是由血小板功能缺陷、血小板 减少、或von Willebrand氏病引起的。这种现象还可以在受多种刺激 (物)诱发而纤溶活性提高的受试者中观察到。

在经受与手术有关的大面积组织损伤或大面积外伤的受试者中， 止血机制可能不能应付立即止血的需要，因此，尽管具有正常的止血 机制它们也可能形成出血。当出血发生于诸如脑、内耳区、和眼等器 官内时，实现令人满意的止血也是一个问题，而且在难以鉴定源头的 弥漫性出血(出血性胃炎和大量子宫出血)的情况中也是一个问题。 相同问题还存在于由多种器官采集活组织样品的过程(肝、肺、肿瘤 组织、胃肠道)以及腹腔镜检查手术中。这些情况都难以通过手术技 术(缝合、夹子、等)提供止血。急性和弥散性出血还会在进行抗凝 剂疗法的受试者中出现，其中所述疗法诱发了止血缺陷。在需要快速 抵消抗凝剂作用的情况中，这些受试者可能需要手术干预。就止血不 充分而言可能引起麻烦的另一种情况是对具有正常止血机制的受试者 进行抗凝剂疗法以预防血栓栓塞病之时。这种疗法可以包括肝素、蛋 白聚糖的其它形式、华法林或维生素K拮抗剂的其它形式、以及阿司匹 林和其它血小板聚集抑制物。

凝血级联反应的系统性激活可能导致弥漫性血管内凝血(DIC)。 然而，在因为由因子VIIa与血管壁损伤部位暴露的TF之间形成复合物 诱发的那类局部止血过程而用高剂量重组因子VIIa进行治疗的受试者 中，没有看到这些并发症。由此，依照本发明的促凝因子VII多肽可以 以它们的活性形式用于控制这些与正常止血机制有关的过度出血。

对于联合干预方面的治疗而言，本发明的促凝因子VII多肽通常在 进行干预前约24小时内施用，且此后施用长达7天或更长。可以通过本 文所述多种途径进行促凝剂的给药。

对于体重70kg的受试者，根据状况的严重程度，作为负荷和维持 剂量的因子VII多肽的剂量范围是约0.05mg-500mg/天，优选约 1mg-200mg/天，且更优选约10mg-约175mg/天。

药物组合物主要意图用于预防性和/或治疗性处理的肠胃外施用。 优选的是，经肠胃外施用所述药物组合物，即静脉内、皮下、或肌肉 内，或者可以通过连续或脉动输注进行施用。用于肠胃外施用的组合 物包含本发明的因子VII多肽，连同(优选地溶解于)制药学可接受载 体，优选水性载体。可以使用多种水性载体，诸如水、缓冲水、0.4 ％盐水、0.3％甘氨酸、诸如此类。本发明的因子VII多肽还可以配制 成用于投递或靶向损伤部位的脂质体制剂。脂质体制剂一般地描述于 例如US 4,837,028、US 4,501,728、和US 4,975,282。组合物可以通 过众所周知的常规灭菌技术进行灭菌。可以包装所得到的水溶液以便 使用，或者在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水 溶液混合。为接近生理学条件所需要，组合物中可以包含制药学可接 受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、诸如此类，例 如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、等。

因子VII多肽在这些配方中的浓度可以大幅变化，即由低于约0.5 ％(以重量计)、通常是或至少是约1％(以重量计)至高达15或20 ％(以重量计)，而且主要按照所选具体施用模式，根据液体体积、 粘度、等来选择。

因此，用于静脉内输注的典型药物组合物可以配制成包含250ml 无菌Ringer氏液和10mg因子VII多肽。用于制备可经肠胃外施用的组合 物的实际方法对于本领域技术人员而言是知道的或显而易见的，而且 更加详细的描述于例如《雷明顿制药科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司，伊斯顿，宾 夕法尼亚，1990。

包含本发明因子VII多肽的组合物可以用于预防性和/或治疗性处 理的施用。在治疗性应用中，对早就患有上文所述疾病的受试者以足 以治愈、减轻、或部分阻滞所述疾病及其并发症的量施用组合物。将 适于实现这一目标的量定义为“治疗有效量”。本领域技术人员将领 会，对此目的有效的量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的 体重和总体状况。然而，一般而言，对于体重70kg的受试者，有效量 的范围将是约0.05mg-高达约500mg/天的因子VII多肽，更常用的剂量 是约1.0mg-约200mg/天的因子VII多肽。

要牢记的是，本发明的物质一般用于严重的疾病或损伤状态，即 危及生命或可能危及生命的情形。在这些情况中，考虑到外来物质的 用量最少且人体中一般缺乏人因子VII多肽免疫原性，有可能、并且负 责治疗的医师可能感到值得施用实质上过量的这些因子VII变体组合 物。

在预防性应用中，对易受影响或有风险患上疾病状态或损伤的受 试者施用包含本发明因子VII多肽的组合物，以增强受试者自身的凝固 能力。将这样的用量定义为“预防有效量”。在预防性应用中，精确 用量同样取决于受试者的健康状况和体重，但是对于体重70kg的受试 者而言，剂量范围通常是约0.05mg-约500mg/天，更常用的是约1.0mg- 约200mg/天。

可以一次或多次施用组合物，并且由负责治疗的医师选择剂量水 平和模式。对于需要日常维持剂量的能走动的受试者，可以使用例如 便携式泵系统通过连续输注来施用因子VII多肽。

可以通过例如喷雾、灌注、双气囊导管、支架、掺入血管移植物 或支架、用于包被气囊导管的水凝胶、或其它完全建立的方法来进行 本发明因子VII多肽的局部投递，诸如例如局部施用。在任何情况中， 该药物组合物应提供足以有效治疗受试者的量的因子VII多肽。

本发明的未激活因子VII多肽能够结合细胞表面组织因子。例如， DEGR-因子VIIa以与野生型因子VIIa相当或更高的亲和力结合细胞表 面组织因子。然而，DEGR-因子VIIa没有酶促活性，但它与组织因子结 合担当野生型因子VIIa的竞争性拮抗剂，从而抑制导致凝血酶产生的 外在凝固途径中的后续步骤。

未激活因子VII多肽特别可用于对人给药，以治疗牵涉血管内凝血 的多种状况。例如，尽管可以用常规抗凝剂治疗深静脉血栓和肺部栓 塞，然而可以在已经确定的高风险患者(诸如接受手术的患者或患有 充血性心力衰竭的患者)中使用本文所述的未激活因子VII多肽来预防 血栓栓塞性并发症的发生。另外，未激活的因子VII多肽可以担当由组 织因子介导的凝血诱导的拮抗剂，由此阻断凝血酶的生成和后续纤维 蛋白的沉积。如此，未激活的因子VII多肽可用于抑制组织因子活性， 导致例如对血液凝固、血栓形成、或血小板沉积的抑制。

未激活的因子VII多肽在内膜增生、由急性血管损伤引起的再狭 窄、深部静脉血栓形成、动脉血栓形成、手术后血栓形成、冠状动脉 旁路移植术(CABG)、经皮透皮冠状血管成形术(percutaneous transdermal coronary angioplasty，PTCA)、中风、癌、肿瘤转移、 血管生成、局部缺血/再灌注、类风湿性关节炎、血栓溶解、动脉硬化 和血管成形术后的再狭窄、急性和慢性指征诸如发炎、脓毒性休克、 败血病、低血压、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、弥散性血管内凝血 (DIC)、肺部栓塞、血小板沉积、心肌梗塞的治疗中或在具有动脉粥 样硬化血管、有血栓风险的哺乳动物的预防性处理中可能特别有用。 急性血管损伤指迅速发生的损伤(即历时数天至数月)，这与慢性血 管损伤(例如动脉硬化)不同，后者一生中发展。急性血管损伤常常 是由手术操作引起的，诸如血管重建术，其中采用了血管成形术、动 脉内膜切除术、经皮腔内斑块旋切术、血管移植物安置等技术。增生 还可能作为响应于例如移植物安置或器官移植的延迟应答而发生。由 于未激活的因子VII多肽比肝素更有选择性，一般只与损伤部位处暴露 的组织因子结合，而且因为未激活的因子VII多肽不破坏其它凝固蛋 白，所以它在预防性的用于深部静脉血栓形成的预防时将比肝素更加 有效且更不可能引起出血并发症。

维持组织因子结合的未激活因子VII多肽通过阻断凝血酶的生成 和后续纤维蛋白的沉积而抑制血小板在血管损伤部位处的累积。

由于DEGR-因子VII能够阻断凝血酶生成并限制血小板在急性血管 损伤部位沉积，维持了组织因子结合活性、但缺乏因子VIIa酶促活性 的未激活因子VII多肽可用于抑制血管再狭窄。

包含未激活因子VII多肽的组合物在配制成药物组合物时特别可 用于治疗患者的方法中，其中可以将它们给予患有多种疾病状态的个 体以治疗凝血相关状况。能够结合组织因子、但催化凝固级联反应中 其它因子的活化的能力实质性降低的这些未激活因子VII多肽可能具 有比其它抗凝剂更长的血浆半衰期，由此具有相应地更长的抗凝活性 期。在受试组合物的医学适应症中，有常常用抗凝剂治疗的适应症， 诸如例如深部静脉血栓形成、肺部栓塞、中风、弥漫性血管内凝血 (DIC)、与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺和肾中纤维蛋白沉积、以 及心肌梗塞。组合物可用于抑制机械性血管损伤后发生的血管再狭窄， 诸如由气囊血管成形术、动脉内膜切除术、减少性经皮腔内斑块旋切 术(reductive atherectomy)、支架安置、激光疗法或旋转切除 (rotablation)引起的损伤，或者是由血管移植物、支架、旁路移植 物、或器官移植继发的血管再狭窄。由此，组合物可用于抑制血小板 沉积和相关紊乱。由此，例如，抑制凝固、血管再狭窄、或血小板沉 积的方法包括以足以有效抑制凝固、血管再狭窄、或血小板沉积的用 量对患者施用包含未激活因子VII多肽(诸如在催化三联体Ser344、 Asp242、和His193)中具有至少一个氨基酸替代的变体的组合物。这 些方法还可用于在个体中治疗急性冠状动脉闭合(例如急性心肌梗 塞)，包括连同组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂或链激酶一起施用未 激活因子VII多肽，包括DEGR-因子VII和FFR-因子VII，它们能够促进 由tPA诱发的血栓溶解。未激活因子VII多肽在施用溶栓剂(诸如组织 型血纤维蛋白溶酶原激活剂)之前、同时、或稍后给药。

未激活因子VII多肽的组合物还将在心原性栓塞的预防和血栓性 中风的治疗中具有实质性功效。因为它引起出血并发症的低可能性和 它的选择性，可以给中风患者施用因子VII多肽，而且可以预防堵塞的 动脉血栓扩大。因子VII多肽的施用量将根据中风的性质和严重程度而 随每位患者发生变化，但是剂量通常在下文建议的范围内。

未激活因子VII多肽及其组合物还可用于抑制与局部缺血再灌注 有关的有害事件。组织、器官、或四肢的严重缺血可能是由血流减少 引起的，而且可能与外伤、手术操作、或血压降低有关。与严重的局 部缺血有关的一种并发症是动脉系统中组织因子的上调。组织因子的 这种表达提高被认为可刺激促凝剂应答，主要是在毛细血管床中。对 局部缺血组织再灌注后，可能形成血栓，它可能是闭塞的或非闭塞的。 动脉床中血栓的生成和血小板沿血栓的沉积导致该组织的继发性缺 血。然后血栓的生成和血小板的存在能够引起多种生物活性因子的生 成和释放，包括由凝血途径生成的因子，诸如凝血酶和因子X，以及由 活化血小板释放的因子。继而，这些因子可能诱发由下面的内皮和平 滑肌细胞或者由附近的单核细胞生成额外因子，诸如TNF-α和IL-1。 这些因子继而能够激活内皮细胞，导致与单核细胞和嗜中性粒细胞结 合有关的多种粘附分子的上调。单核细胞和嗜中性粒细胞的结合和迁 移、来自这些细胞的生物活性化合物的释放(包括氧自由基的生成) 能够加剧内皮细胞激活和损伤的水平。最后，若级联反应不受抑制， 则它可能导致系统性并发症，而且可能激发多器官衰竭。通过依照本 发明施用组织因子/因子VII结合的特异抑制物(例如FFR-FVIIa)来阻 断组织因子，从而阻断凝固的外在途径的启动，可以预防级联反应的 启动，从而消除与局部缺血/再灌注有关的有害事件或降至最低。

用于预防深部静脉血栓形成的未激活因子VII多肽的剂量范围对 于体重70kg的患者是约50μg-500mg/天，更通常的是1mg-200mg/天， 且更优选10-约175mg/天，而且至少应当在手术前约6小时开始施用， 并至少持续至患者能走动。在治疗再狭窄时未激活因子VII多肽的剂量 将因每位患者而变化，但是通常是在上述范围内。

包含未激活因子VII多肽的组合物通常在进行干预前约24小时内 施用，且此后施用达7天或更长时间。可以通过本文所述多种路径进行 施用。还可以系统或局部施用包含未激活因子VII多肽的组合物，用于 在吻合术、手术动脉内膜切除术(通常是颈动脉动脉内膜切除术)、 旁路移植等的部位安置血管移植物(例如通过包被合成的或经改性的 天然动脉血管移植物)。

在治疗已形成的深部静脉血栓和/或肺部栓塞时，对于体重70kg 的患者，根据患者的体重和状况的严重程度，作为负荷和维持剂量的 因子VII多肽的剂量范围是约50μg-500mg/天，更通常的是1mg-200mg/ 天，且更优选10mg-约175mg/天。因为输注未激活因子VII多肽并发出 血的可能性较低，可以在血栓切除或栓塞切除手术过程中或手术后用 未激活因子VII多肽取代肝素或减少肝素剂量。

在急性菌血症、内毒素性血症、或DIC的情况中，对于体重70kg 的患者而言，给予的因子VII多肽的负荷剂量是至少约50μg-500mg/ 天，更通常的是1mg-200mg/天，且更优选10mg-约175mg/天，此后的维 持剂量在50μg-500mg/天的范围内，通常是1mg-200mg/天。

优选的是，因子VII多肽的半衰期(t1/2)相对于衍生它的未缀合 因子VII的半衰期而言得到延长。优选的是，因子VII多肽的半衰期相 对于未修饰的亲本因子VII的半衰期而言延长了至少1.5-2倍，更优选 约2-3倍，甚至更优选约5-10倍，最理想的是约100倍，通常是约6倍。

用于将聚乙二醇附着到蛋白质上的一般方法公布于1979年12月18 日授予的美国专利4,179,337(收入本文作为参考，以公布将聚乙二醇 附着到蛋白质上的方法)中。另外，用于附着聚乙二醇的其它方法公 布于1992年6月16日授予的美国专利5,122,614(也收入本文作为参考， 以公布将聚乙二醇附着到蛋白质上的方法)中。马来酰亚胺-PEG可能 是进行半胱氨酸-PEG化的最有用试剂，但是也可以用其它化学法进行 特定半胱氨酸修饰。

                   附图简述

下文实施例将参照附图进一步详细描述本发明，其中：

图1：正确加工的人凝固因子VII的结构，第1-406位氨基酸，具 有γ-羧化Glu残基(γ)和糖基化( )。第152位氨基酸残基处的箭头 显示了单链因子VII受到切割而转变成活化双链因子VII(FVIIa)的位 置。

图2：天然(野生型)人凝固因子VII的完整氨基酸序列(SEQ ID NO： 1)。

下列实施例将进一步举例说明本发明，然而不应将它们解释为限 制保护范围。上文详述和下文实施例中揭示的特色可能以分开的和任 何联合的方式对于以其不同形式实现本发明而言是重要的。

实施例

实施例1：编码FVII-(S43N)、FVII-(K62E)、FVII-(Q64E)、 FVII-(I69F)、FVII-(K62E/I69A)、FVII-(Q64E/I69A)、 FVII-(Q62E/Q64E/I69A)、FVII-(K62E/I69F)、FVII-(Q64E/I69F)、 FVII-(K62E/Q64E/I69F)、FVII-(S43C)、FVII-(I69C)、 FVII-(Q64C)、FVII-(M306C)、FVII-(R277C)、FVII-(I69N/F71T)、 FVII-(F71N/L73T)、FVII-(R277N)、和FVII-(D309N/L311T)的DNA的 构建

使用含有人FVII插入片段的超螺旋双链DNA载体以及两种含有期 望突变的合成引物，通过定点诱变制备编码FVII-(S43N)、 FVII-(K62E)、FVII-(Q64E)、FVII-(I69F)、FVII-(K62E/I69A)、 FVII-(Q64E/I69A)、FVII-(Q62E/Q64E/I69A)、FVII-(K62E/I69F)、 FVII-(Q64E/I69F)、FVII-(K62E/Q64E/I69F)、FVII-(S43C)、 FVII-(I69C)、FVII-(Q64C)、FVII-(M306C)、FVII-(R277C)、 FVII-(I69N/F71T)、FVII-(F71N/L73T)、FVII-(R277N)、和 FVII-(D309N/L311T)的DNA构建体。所用引物如下：

FVII-(S43N)：

5’-GGACGAAGCTGTTCTGGATTAACTACAGTGATGGGGACCAG-3’(SEQ ID NO：2)

5’-CTGGTCCCCATCACTGTAGTTAATCCAGAACAGCTTCGTCC-3’(SEQ ID NO：3)

FVII-(K62E)：

5’-GGGGGCTCCTGCGAGGACCAGCTCCAG-3’(SEQ ID NO：4)

5’-CTGGAGCTGGTCCTCGCAGGAGCCCCC-3’(SEQ ID NO：5)

FVII-(Q64E)：

5’-GGGCTCCTGCAAGGACGAGCTCCAGTCCTATATCTGC-3’(SEQ ID NO：6)

5’-GCAGATATAGGACTGGAGCTCGTCCTTGCAGGAGCCC-3’(SEQ ID NO：7)

FVII-(I69F)：

5’-CCAGCTCCAGTCCTATTTCTGCTTCTGCCTCCC-3’(SEQ ID NO：8)

5’-GGGAGGCAGAAGCAGAAATAGGACTGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO：9)

FVII-(K62E/I69A)：

5’-GGGGGCTCCTGCGAGGACCAGCTCCAGTCCTATGCCTGCTTCTGCCTC-3’(SEQ ID NO：10)

5’-GAGGCAGAAGCAGGCATAGGACTGGAGCTGGTCCTCGCAGGAGCCCCC-3’(SEQ ID NO：11)

FVII-(Q64E/I69A)：

5’-GGGCTCCTGCAAGGACGAGCTCCAGTCCTATGCCTGCTTCTGCCTCC-3’(SEQ ID NO：12)

5’-GGAGGCAGAAGCAGGCATAGGACTGGAGCTCGTCCTTGCAGGAGCCC-3’(SEQ ID NO：13)

FVII-(K62E/Q64E/I69A)：

5’-GGGGGCTCCTGCGAGGACGAGCTCCAGTCCTATGCCTGCTTCTGCCTCC-3’(SEQ ID NO：14)

5’-GGAGGCAGAAGCAGGCATAGGACTGGAGCTCGTCCTCGCAGGAGCCCCC-3’(SEQ ID NO：15)

FVII-(S43C)：

5’-GGACGAAGCTGTTCTGGATTTGCTACAGTGATGGGGAC-3’(SEQ ID NO：16)

5’-GTCCCCATCACTGTAGCAAATCCAGAACAGCTTCGTCC-3’(SEQ ID NO：17)

FVII-(I69C)

5’-CCAGCTCCAGTCCTATTGCTGCTTCTGCCTCCCTG-3’(SEQ ID NO：18)

5’-CAGGGAGGCAGAAGCAGCAATAGGACTGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO：19)

FVII-(Q64C)

5’-GGGCTCCTGCAAGGACTGCCTCCAGTCCTATATCTG-3’(SEQ ID NO：20)

5’-CAGATATAGGACTGGAGGCAGTCCTTGCAGGAGCCC-3’(SEQ ID NO：21)

FVII-(R277C)

5’-GGACGCTGGCCTTCGTGTGCTTCTCATTGGTCAGCG-3’(SEQ ID NO：22)

5’-CGCTGACCAATGAGAAGCACACGAAGGCCAGCGTCC-3’(SEQ ID NO：23)

FVII-(M306C)

5’-CAACGTGCCCCGGCTGTGCACCCAGGACTGCCTGC-3’(SEQ ID NO：24)

5’-GCAGGCAGTCCTGGGTGCACAGCCGGGGCACGTTG-3’(SEQ ID NO：25)

FVII-(I69N/F71T)：

5’-CCAGCTCCAGTCCTATAACTGCACCTGCCTCCCTGCCTTCG-3’(SEQ ID NO：26)

5’-CGAAGGCAGGGAGGCAGGTGCAGTTATAGGACTGGAGCTGG-3’(SEQ ID NO：27)

FVII-(F71N/L73T)：

5’-CCAGTCCTATATCTGCAACTGCACCCCTGCCTTCGAGGGCCG-3’(SEQ ID NO：28)

5’-CGGCCCTCGAAGGCAGGGGTGCAGTTGCAGATATAGGACTGG-3’(SEQ ID NO：29)

FVII-(R277N)

5’-GGACGCTGGCCTTCGTGAACTTCTCATTGGTCAGCGG-3’(SEQ ID NO：30)

5’-CCGCTGACCAATGAGAAGTTCACGAAGGCCAGCGTCC-3’(SEQ ID NO：31)

FVII-(D309N/L311T)

5’-CGGCTGATGACCCAGAACTGCACCCAGCAGTCACGGAAGG-3’(SEQ ID NO：32)

5’-CCTTCCGTGACTGCTGGGTGCAGTTCTGGGTCATCAGCCG-3’(SEQ ID NO：33)

在热循环过程中通过Pfu DNA聚合物延伸各与载体插入片段的相 反链互补的寡核苷酸引物。掺入引物后，生成了含有交错缺刻的突变 质粒。热循环后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物，以 消化亲本DNA模板并选择含突变的合成DNA。

本领域技术人员熟知通过聚合酶链式反应使用特异引物制备DNA 构建体的流程(参阅《PCR方案》(PCR Protocols)，1990年，Academic 出版社，圣迭戈，加利福尼亚州，美国)。

实施例2：FVII-(S43N)、FVII-(K62E)、FVII-(Q64E)、 FVII-(I69F)、FVII-(K62E/I69A)、FVII-(Q64E/I69A)、 FVII-(Q62E/Q64E/I69A)、FVII-(K62E/I69F)、FVII-(Q64E/I69F)、 FVII-(K62E/Q64E/I69F)、FVII-(S43C)、FVII-(I69C)、 FVII-(Q64C)、FVII-(M306C)、FVII-(R277C)、FVII-(I69N/F71T)、 FVII-(F71N/L73T)、FVII-(R277N)、和FVII-(D309N/L311T)的制备

基本上如先前所述(Thim等，1988，Biochemistry 27，7785- 7793；Persson和Nielsen，1996，FEBS Lett.385，241-243)转染 BHK细胞，以获得变体因子VII多肽的表达。如下纯化因子VII多肽：

添加5mM EDTA和10mM Tris、将pH调至8.0、并通过加水将电导率 调至10-11mS/cm后，将条件培养液施加到50ml Q Sepharose Fast Flow 柱(Pharmacia Biotech)上。使用由10mM Tris、50mM NaCl pH8.0 至10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl2 pH8.0的梯度进行蛋白质洗脱。 合并含有变体因子VII多肽的级分，并施加到25ml偶联了单克隆抗体 F1A2(Novo Nordisk，Bagsvrd，丹麦)的CNBr活化Sepharose 4B柱 (Pharmacia Biotech)上。用含有10mM CaCl2和100mM NaCl的50mM Hepes pH7.5平衡柱子。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液进 行清洗后，用含有10mM EDTA替代CaCl2的平衡缓冲液洗脱结合物。在 使用或贮藏前，添加相对于EDTA过量的CaCl2，或者将变体因子VII多 肽转移到含Ca2+缓冲液中。通过因子VII ELISA测量法跟踪每一步的收 率，并通过SDS-PAGE分析纯化后的蛋白质。

实施例3：体外水解测定法

平行测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(下文都称为 “因子VIIa”)，从而直接比较它们的比活。该测定法在微量滴定板 (MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行。向因子VIIa(终浓度100nM，溶于 含有0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4)中加入呈色底物D-Ile-Pro-Arg-P-nitroanilide(终浓度1mM， S-2288，Chromogenix，瑞典)。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量405nm的吸光度。将保温20分钟期间形成 的吸光度减去不含酶的空白孔的吸光度，由此计算变体与野生型因子 VIIa的活性之间的比率：

比率＝(因子VIIa变体的A405nm)/(野生型因子VIIa的A405nm)。

实施例4：体外蛋白水解测定法

平行测定天然(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(下文都称为 “因子VIIa”)，从而直接比较它们的比活。该测定法在微量滴定板 (MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行。将因子VIIa(10nM)和因子X(0.8 μM)(溶于100μl含有0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋 白的50mM Hepes pH7.4)保温15分钟。然后加入50μl含有0.1M NaCl、 20mM EDTA、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4中终止对因 子X的切割。加入呈色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-P-nitroanilide(终浓 度0.5mM，S-2765，Chromogenix，瑞典)，测量所生成的因子Xa的量。 在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量 405nm处的吸光度。将保温10分钟期间形成的吸光度减去不含FVIIa的 空白孔的吸光度，由此计算变体与野生型因子VIIa的蛋白水解活性之 间的比率：

比率＝(因子VIIa变体的A405nm)/(野生型因子VIIa的A405nm)。

实施例5：TF结合亲和力测定法-生物传感器(Biosensor)测定法

在Biacore仪器上，通过使因子VII多肽的标准溶液流过固定有TF 的芯片，测试因子VII多肽。随后是不同浓度的sTF(溶于含有150mM NaCl、10mM CaCl2、和0.0003％聚山梨酸酯20的10mM Hepes pH7.4)。 使用集成的Biacore评估软件由传感器读数(sensorgram)计算Kd。