凝固因子VII多肽
阅读：388发布：2020-05-13
专利汇可以提供凝固因子VII多肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有凝血剂活性的修饰的人 凝固 因子VII多肽，特别是与野生型FVIIa相比当活化时具有较高的蛋白 水 解 活性和降低的抗凝血酶 反应性 (对由抗凝血酶所致失活的抗性增加)的变体。所述变体具有在成熟人FVII的 位置 T293处的某些置换，以及在L288、W201和/或K337处的特定置换。本发明还涉及所述因子VII多肽的药物组合物和医学用途。，下面是凝固因子VII多肽专利的具体信息内容。
1. 一种包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的两个或更多个置换的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)；和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp W，和/或W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)，和/或K337被替换为Ala (A)或Gly (G)。
2. 权利要求1的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)。
3. 权利要求1或2的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Phe (F)。
4. 权利要求1或2的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Tyr (Y)。
5. 权利要求1或2的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Phe (F)。
6. 权利要求1或2的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Tyr (Y)。
7. 权利要求1-6中任一项的因子VII多肽，其中K337被替换为Ala (A)。
8. 权利要求1的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
9. 权利要求8的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和W201被替换为Arg (R)。
10.前述权利要求中任一项的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽与至少一个半寿期延长部分偶联。
11. 权利要求10的因子VII多肽，其中所述半寿期延长部分选自生物相容性脂肪酸和其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于膦酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽和其任何组合。
12.权利要求11的因子VII多肽，其中所述半寿期延长部分是heparosan聚合物。
13. 权利要求1-12中任一项的FVII多肽，在缺少可溶性组织因子的情况下，其具有野生型人因子VIIa (SEQ ID NO: 1)的蛋白水解活性的至少110%的蛋白水解活性，如体外蛋白水解测定法所测量；和在存在低分子量肝素和缺少可溶性组织因子的情况下，与野生型人因子VIIa相比，其具有少于20%的抗凝血酶反应性，如抗凝血酶抑制测定法所测量。
14.权利要求1-13中任一项所定义的因子VII多肽，其用作药物。
15.权利要求14所定义的因子VII多肽，其用作治疗凝血病的药物。
凝固因子VII多肽
技术领域
[0003] SEQ ID NO. 2：人凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0004] SEQ ID NO. 3：类人(黑猩猩)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0005] SEQ ID NO. 4：犬科(狗)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0006] SEQ ID NO. 5：猪科(猪)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0007] SEQ ID NO. 6：牛科(牛)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0008] SEQ ID NO. 7：鼠科(小鼠)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0009] SEQ ID NO. 8：鼠科(大鼠)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0010] SEQ ID NO. 9：兔科(兔)凝固因子VII的蛋白酶结构域。
[0011] 发明背景对血管的损伤活化止血系统，其涉及细胞和分子组分之间的复杂相互作用。最终引起出血停止的过程称为止血。止血的重要部分是在损伤部位处的血液凝固和凝块形成。凝血过程高度依赖几种蛋白质分子的功能。这些称为凝血因子。凝血因子中的一些是可以以失活酶原或酶促活性形式存在的蛋白酶。通过由另一种蛋白酶解活性凝血因子催化的多肽链的特异性切割，酶原形式可以转换为其酶促活性形式。
[0012] 因子VII是在肝中合成且作为单链糖蛋白分泌到血液内的维生素K依赖性血浆蛋白质。通过在单个位点处即在SEQ ID NO: 1的R152和I153之间的特异性蛋白酶解切割，因子VII酶原转换为活性形式(因子VIIa)，产生由单个二硫键连接的双链分子。因子VIIa中的两条多肽链被称为轻和重链，分别对应于SEQ ID NO: 1(野生型人凝血因子VII)的残基1-152和153-406。因子VII主要地作为酶原循环，但较少部分呈活化形式(因子VIIa)。
[0013] 血液凝固过程可以分成三个时期：初始、扩大和传播。初始和传播期促使凝血酶形成，所述凝血酶是在止血中具有许多重要功能的凝血因子。如果排列在血管内表面的内皮细胞的单层屏障发生受损，则凝血级联起始。这暴露出血液中的血小板将与之粘附的内皮下细胞和血管外基质蛋白质。如果这发生，则存在于内皮下细胞表面上的组织因子(TF)变得暴露于在血液中循环的因子VIIa。TF是膜结合蛋白质，并且充当因子VIIa的受体。因子VIIa是具有固有的低活性的酶，即丝氨酸蛋白酶。然而，当因子VIIa与TF结合时，它的活性极大增加。因子VIIa与TF相互作用也将因子VIIa定位于具有TF的细胞的磷脂表面上，并且将其最佳放置用于将因子X活化为Xa。当这发生时，因子Xa可以与因子Va组合，以在具有TF的细胞的表面上形成所谓的“凝血酶原酶”复合物。凝血酶原酶复合物随后通过切割凝血酶原而生成凝血酶。通过使TF暴露于循环的因子VIIa而活化且导致凝血酶的初始生成的途径称为TF途径。TF:因子VIIa复合物也催化因子IX至因子IXa的活化。随后活化因子IXa可以扩散至血小板表面，所述血小板粘附至损伤部位且已活化。这允许因子IXa与FVIIIa组合，以在活化血小板的表面上形成“tenase”复合物。由于其在将因子X活化为Xa中的显著功效，该复合物在传播期中起关键作用。有效的tenase催化的因子Xa活性的产生，进而又导致由凝血酶原酶复合物催化的凝血酶原至凝血酶的有效切割。
[0014] 如果在因子IX或因子VIII中存在任何缺陷，则它损害重要的tenase活性，并且降低凝血所需的凝血酶产生。最初由TF途径形成的凝血酶充当促凝信号，其鼓励血小板在损伤部位处的召募、活化和聚集。这导致松散的初级血小板塞的形成。然而，该初级血小板塞是不稳定的且需要强化以支持止血。塞的稳定涉及将血小板锚定且缠在纤维蛋白纤维网中。
[0015] 坚固且稳定的凝块的形成依赖于产生局部凝血酶活性的强爆发。因此，在血管损伤后导致凝血酶生成的过程中的缺陷可以导致出血障碍，例如A和B型血友病。具有A和B型血友病的人分别缺乏功能性因子VIIIa或因子IXa。在传播期中的凝血酶生成严重依赖tenase活性，即需要因子VIIIa和FIXa两者。因此，在具有A或B型血友病的人中，无法进行初级血小板塞的适当固结，且持续出血。
[0016] 替补疗法是用于A和B型血友病的传统治疗，并且涉及因子VIII或因子IX的静脉内给予。然而，在许多情况下，患者产生针对输注蛋白质的抗体(也称为抑制物)，这降低或取消治疗的功效。重组因子VIIa (Novoseven®)已被批准用于治疗具有抑制物的A或B型血友病患者，并且还用于终止出血发作或预防与创伤和/或手术相关的出血。重组因子VIIa也已被批准用于治疗具有先天性因子VII缺陷的患者。已提出重组FVIIa通过不依赖TF的机制运转。根据该模型，重组FVIIa由于其Gla结构域导向活化血液血小板的表面，在此处，它随后将因子X蛋白酶解活化为Xa，因此绕过功能性tenase复合物的需要。在不存在TF的情况下，FVIIa的低酶促活性以及Gla结构域对膜的低亲和力可以解释在具有血友病的人中实现止血所需的超生理学水平的循环的FVIIa的需要。
[0017] 重组因子VIIa具有2-3小时的体内功能性半衰期，其可能需要频繁给予以解决患者中的出血。进一步地，患者通常仅在出血已开始后接受因子VIIa疗法，而不是作为预防措施，这通常影响其一般生活质量。具有更长的体内功能性半衰期的重组因子VIIa变体将降低所需给予数目，支持更不频繁的给药且因此保留显著改善的因子VIIa疗法对患者和护理持有者(care-holder)的利益的承诺。
[0018] WO02/22776公开了与野生型FVIIa相比具有提高的蛋白水解活性的因子VIIa变体。临床试验已经证实，在具有提高的蛋白水解活性的变体的功效方面，包含WO02/22776中公开的置换的因子VII多肽显示有利的临床结果(de Paula等(2012) J Thromb Haemost, 10:81-89)。
[0019] WO2007/031559公开了对由抗凝血酶导致的抑制具有降低的易感性的因子VII变体。
[0020] WO2009/126307公开了具有改变的促凝血活性的修饰的因子VII多肽。
[0021] 总体上，在患有凝血病的人中存在许多未满足的医学需求。重组因子VIIa促进凝块形成的使用强调了其作为治疗剂的日益增长的重要性。然而，重组因子VIIa疗法仍留下显著的未满足的医学需求，具有改进的药学性质(例如增加的体内功能性半寿期和提高的或更高的活性)的重组因子VIIa多肽将满足这些需求中的一些。
[0022] 发明简述本发明提供因子VII多肽，其经设计具有改进的药学性质。在一个广泛的方面，本发明涉及因子VII多肽，与人野生型因子VIIa相比，其显示增加的体内功能性半寿期。在另一广泛的方面，本发明涉及与人野生型因子VIIa相比具有提高的活性的因子VII多肽。在又一广泛的方面，本发明涉及因子VII多肽，与人野生型因子VIIa相比，其显示对由内源性血浆抑制物，特别是抗凝血酶导致的失活的抗性增加。
[0023] 本文提供具有增加的体内功能性半寿期的因子VII多肽，其包含赋予对抗凝血酶失活的抗性和提高的蛋白水解活性或蛋白水解活性几乎没有损失或没有损失的突变的组合。在本发明的一个特别引人关注的方面，因子VII多肽与一个或多个“半寿期延长部分”偶联以增加体内功能性半寿期。
[0024] 在一个方面，本发明涉及因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)或Ala (A)，和/或W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)，和/或K337被替换为Ala (A)或Gly (G)。
[0025] 本发明的因子VII多肽可包含T293至Lys (K)的置换和L288至Phe (F)的置换。因子VII多肽可包含T293至Lys (K)的置换和L288至Tyr (Y)的置换。因子VII多肽可包含T293至Arg (R)的置换和L288至Phe (F)的置换。因子VII多肽可包含T293至Arg (R)的置换和L288至Tyr (Y)的置换。因子VII多肽可包含，或可还包含K337至Ala (A)的置换。因子VII多肽可包含T293至Lys (K)的置换和W201至Arg (R)的置换。
[0026] 在一个引人关注的实施方案中，本发明涉及与至少一个半寿期延长部分偶联的因子VII多肽。
[0027] 在另一方面，本发明涉及用于制备本发明的因子VII多肽的方法。
[0028] 在又一方面，本发明涉及包含本发明的因子VII多肽的药物组合物。
[0029] 本发明的总体目标是改善在患有凝血病的人中当前可用的治疗选择和获得具有改进的治疗效用的因子VII多肽。
[0030] 本发明的一个目标是获得这样的因子VII多肽，其具有延长的体内功能性半寿期，同时保持药学上可接受的蛋白水解活性。为实现这一目标，本发明的因子VII多肽包含赋予对由血浆抑制物抗凝血酶导致的失活的易感性降低同时基本上保留蛋白水解活性的突变的组合；在本发明的特别引人关注的实施方案中，因子VII多肽还与一个或多个“半寿期延长部分”偶联。
[0031] 用本发明的修饰的因子VII多肽的医学治疗提供优于当前可用的治疗方案的许多优势，例如注射之间更长的持续时间、更低的剂量、更方便的给药和注射之间可能改善的止血保护。
[0033] 图2显示体外抗凝血酶反应性与FVIIa-抗凝血酶复合物的体内积累之间的相关性。
[0035] 图4显示FVIIa变体W201R T293Y双突变体的位置293处的酪氨酸与抗凝血酶之间相互作用的假定模型。这基于棍状示意图中显示的在抗凝血酶和FVIIa变体W201R T293Y双突变体之间的复合物的理论模型。抗凝血酶氨基酸用前缀“AT”表示；而FVIIa氨基酸用前缀“FVIIa”表示。
[0037] 图6：通过SDS-PAGE评估缀合物纯度。(A)最终FVIIa缀合物的SDS-PAGE分析。凝胶上上样有HiMark HMW标准(泳道1)；FVIIa (泳道2)；13k-HEP-[C]-FVIIa (泳道3)；27k-HEP-[C]-FVIIa (泳道4)；40k-HEP-[C]-FVIIa (泳道5)；52k-HEP-[C]-FVIIa (泳道6)；60k-HEP-[C]-FVIIa (泳道7)；65k-HEP-[C]-FVIIa (泳道8)；108k-HEP-[C]-FVIIa (泳道
9)和157k-HEP-[C]-FVIIa407C (泳道10)。(B)糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa的SDS-PAGE。凝胶上上样有HiMark HMW标准(泳道1)、ST3Gal3 (泳道2)、FVIIa (泳道3)、脱唾液酸（asialo）FVIIa (泳道4)和52k-HEP-[N]-FVIIa (泳道5)。[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
9)和157k-HEP-[C]-FVIIa407C (泳道10)。(B)糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa的SDS-PAGE。凝胶上上样有HiMark HMW标准(泳道1)、ST3Gal3 (泳道2)、FVIIa (泳道3)、脱唾液酸（asialo）FVIIa (泳道4)和52k-HEP-[N]-FVIIa (泳道5)。[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
[0038] 图7：heparosan缀合物和糖聚乙二醇化的FVIIa参照物的FVIIa凝固活性水平分析。
[0039] 图8：heparosan缀合物和糖聚乙二醇化的FVIIa参照物的蛋白水解活性。
[0040] 图9：在Sprague Dawley大鼠中的PK结果(LOCI)。未修饰的FVIIa (2次研究)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa (2次研究)和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)的比较。数据在半对数曲线中显示为平均值± SD (n = 3-6)。
[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
[0041] 图10：在Sprague Dawley大鼠中的PK结果(凝固活性)。未修饰的FVIIa (2次研究)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖缀合的52k-HEP-[N]-FVIIa和参考分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa (2次研究)和40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)的比较。数据在半对数曲线中显示。[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
[0042] 图11：对于大量HEP-[C]-FVIIa407C缀合物而言，HEP-大小和平均滞留时间(MRT)之间的关系。来自PK研究的MRT值对缀合物的heparosan聚合物大小作图。曲线表示未缀合的FVIIa、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C和157k-HEP-[C]-FVIIa407C的值。MRT (LOCI)通过非分区方法使用Phoenix WinNonlin 6.0
(Pharsight Corporation)计算。[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
(Pharsight Corporation)计算。[N]-表示因子缀合物，其中Heparosan与N-聚糖连接。[C]-表示因子缀合物，其中Heparosan与半胱氨酸残基连接。
[0044] 图13：heparosan (HEP)聚合物用苯甲醛基团官能化，和随后在还原胺化反应中与甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)反应。
[0045] 图14：甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)用硫醇基团(thio group)官能化，随后与马来酰亚胺官能化的Heparosan (HEP)聚合物反应。
[0046] 图15：Heparosan (HEP) -甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)。
[0047] 图16：在Sprague Dawley大鼠中的PK结果(LOCI)。2x20K-HEP-[N]-FVIIa、1x40K-HEP-[N]-FVIIa和1x40k-PEG-[N]-FVIIa在半对数曲线中的比较。数据显示为平均值± SD (n = 3-6)。
[0048] 图17：在Sprague Dawley大鼠中的PK结果(凝固活性)。2x20K-HEP-[N]-FVIIa、1x40K-HEP-[N]-FVIIa和1x40k-PEG-[N]-FVIIa在半对数曲线中的比较。
[0049] 图18：反应方案，其中脱唾液酸FVIIa糖蛋白与HEP-GSC在ST3GalIII唾液酸转移酶的存在下反应。
[0050] 详细描述本发明涉及显示改进的药学性质的因子VII多肽的设计和用途。
[0051] 在一个方面，本发明涉及显示增加的体内功能性半寿期、对由血浆抑制物抗凝血酶导致的失活的易感性降低和提高的或维持的蛋白水解活性的因子VII多肽的设计和用途。本发明的发明人已发现，人因子VII的特定的突变组合联合与半寿期延长部分缀合，赋予上述性质。本发明的因子VII多肽具有在血液中延长的功能性半寿期，这在其中需要较长持续的促凝血活性的情况下具有治疗用途。这样的因子VII多肽包含T293至Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)的置换。在该方面，本发明涉及因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)。本发明还涉及因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。此外，本发明涉及因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和K337被替换为Ala (A)或Gly (G)。任选地，本发明的因子VII多肽还可包含Q176至Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)的置换。任选地，本发明的因子VII多肽还可包含Q286至Asn (N)的置换。
[0052] 在另一方面，本发明涉及显示提高的蛋白水解活性的因子VII多肽的设计和用途。本发明的发明人已发现，人因子VII在位置L288和/或W201处的特定的突变赋予因子VII多肽提高的蛋白水解活性。在该方面，本发明涉及这样的因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的一个或多个置换，其中L288被替换为Phe (F)、Tyr(Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)，前体条件是所述多肽不具有以下一对置换：L288N/R290S或L288N/R290T。此外根据该方面，本发明涉及这样的因子VII多肽，其包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的一个或多个置换，特征在于一个置换是其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
[0053] 因子VII凝固因子VII (因子VII)是主要在肝脏中产生的糖蛋白。该成熟蛋白由SEQ ID NO: 1定义的406个氨基酸残基组成(亦公开于例如美国专利号4784950)，和由四个结构域构成。
存在N-末端γ-羧基谷氨酸(Gla)富集结构域，接着两个表皮生长因子(EGF)-样结构域和C-末端胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域。因子VII主要作为单链分子在血浆中循环。因子VII通过在残基Arg152和Ile153之间裂解被活化成因子VIIa，产生通过二硫键保持在一起的双链蛋白。轻链包含Gla和EGF-样结构域，而重链是蛋白酶结构域。因子VII中的特定Glu (E)残基，即根据SEQ ID NO: 1的E6、E7、E14、E16、E19、E20、E25、E26、E29和E35，可在翻译后被γ-羧化。Gla结构域中的γ-羧基谷氨酸残基对于大量钙离子的配位是必需的，其维持Gla结构域呈介导与磷脂膜的相互作用的构象。
存在N-末端γ-羧基谷氨酸(Gla)富集结构域，接着两个表皮生长因子(EGF)-样结构域和C-末端胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域。因子VII主要作为单链分子在血浆中循环。因子VII通过在残基Arg152和Ile153之间裂解被活化成因子VIIa，产生通过二硫键保持在一起的双链蛋白。轻链包含Gla和EGF-样结构域，而重链是蛋白酶结构域。因子VII中的特定Glu (E)残基，即根据SEQ ID NO: 1的E6、E7、E14、E16、E19、E20、E25、E26、E29和E35，可在翻译后被γ-羧化。Gla结构域中的γ-羧基谷氨酸残基对于大量钙离子的配位是必需的，其维持Gla结构域呈介导与磷脂膜的相互作用的构象。
[0054] 术语FVII和“因子VII”在本文中是指未裂解的单链酶原，因子VII，以及裂解的双链的和由此活化的蛋白酶因子VIIa。“因子VII”包括因子VII的天然等位基因变体，其可存在并在个体间彼此不同。人野生型因子VII序列在SEQ ID NO: 1中提供。术语“因子VII多肽”在本文中是指因子VII的未裂解的单链酶原多肽变体(如本文中所述)，以及裂解的双链的和由此活化的蛋白酶。
[0055] 因子VII和因子VII多肽可以是血浆-来源的或使用众所周知的制备和纯化方法重组产生的。糖基化、γ-羧化和其它翻译后修饰的程度和位置可根据选择的宿主细胞和其生长条件而不同。
[0056] 因子VII多肽术语"因子VII"或"FVII"表示因子VII多肽。
[0057] 术语“因子VII多肽”包括野生型因子VII分子以及因子VII变体、因子VII缀合物和经化学修饰的因子VII。相对于野生型人因子VIIa，这样的变体、缀合物和化学修饰的因子VII可显示基本上相同或改进的活性。
[0058] 术语因子VII多肽的“活性”，如本文中所用，是指野生型人因子VII显示的任何活性，和包括但不限于，凝固或凝固剂活性、促凝血活性、蛋白水解或催化活性例如以实现因子X激活或因子IX激活；结合TF、因子X或因子IX的能力；和/或结合磷脂的能力。这些活性可使用公认的测定法，例如通过测量体外或体内凝固进行体外或体内评价。这样的测定法的结果表明多肽显示可与多肽的体内活性有关的活性，其中体内活性可被称为生物活性。测定因子VII多肽的活性的测定法是本领域技术人员已知的。评价FVII多肽的活性的示例性的测定法包括体外蛋白水解测定法，例如下文实施例中描述的那些。
[0059] 术语“提高的或维持的活性”，如本文中所用，是指与野生型人因子VIIa相比，显示基本上相同或增加的活性的因子VIIa多肽，例如i) 在TF的存在和/或不存在下与重组野生型人因子VIIa相比基本上相同或增加的蛋白水解活性；ii) 与重组野生型人因子VIIa相比具有基本上相同或增加的TF亲和力的因子VII多肽；iii) 对活化的血小板具有基本上相同或增加的亲和力的因子VII多肽；或iv) 与重组野生型人因子VIIa相比，对因子X或因子IX具有基本上相同或增加的亲和力/结合能力的因子VII多肽。例如，维持的活性意指与野生型人因子VIIa相比，保留的活性量是或是大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高的活性。例如提高的活性意指与野生型人因子VIIa相比，保留的活性量是或是大约110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、1000%、
3000%、5000%、10 000%、30 000%或更高活性。
3000%、5000%、10 000%、30 000%或更高活性。
[0060] 术语“因子VII变体”，如本文中所用，意指具有SEQ ID NO: 1的序列的因子VII，其中母体蛋白的一个或多个氨基酸被另一天然存在的氨基酸置换，和/或其中母体蛋白的一个或多个氨基酸缺失，和/或其中一个或多个氨基酸插入到蛋白中，和/或其中一个或多个氨基酸添加到母体蛋白中。这样的添加可发生在母体蛋白的N-或C-末端或两者上。在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列具有至少95 %同一性。在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 1的序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性。如本文中所用，对特定位置的任何提及是指在SEQ ID NO: 1中的相应位置。
[0061] 在一些实施方案中，与野生型人因子VIIa相比，本发明的因子VII变体具有提高的或维持的活性。
[0062] 对本说明书中使用的氨基酸置换的术语如下。第一个字母表示SEQ ID NO:1的位置上天然存在的氨基酸。接着的数字表示SEQ ID NO:1中的位置。第二个字母表示置换天然氨基酸的不同的氨基酸。实例为K197A-因子VII，其中SEQ ID NO:1的位置197上的赖氨酸被替换为丙氨酸。
[0063] 在本上下文中，氨基酸的三字母或单字母缩写以其常规含义使用，如下所示。除非明确说明，否则本文提及的氨基酸是L-氨基酸。
[0064] 氨基酸缩写：如本文中所用的术语“因子VII缀合物”意指因子VII多肽，其中一个或多个氨基酸和/或一个或多个连接的聚糖部分被化学和/或酶修饰，例如通过烷基化、糖基化、酰化、酯形成、二硫键形成或酰胺形成。
[0065] 在一些实施方案中，相对于野生型因子VII，本发明的因子VII缀合物显示基本上相同或提高的生物活性。
[0066] 提高的蛋白水解活性本发明人出人意料地证明，具有残基L288和W201的某些突变的因子VII多肽显示提高的蛋白水解活性。
[0067] 已经描述，如WO02/22776中所述的因子VII变体K337A具有提高的蛋白水解活性。还已经描述，如WO03/027147中所述的因子VII变体L305V和L305I具有较高的内在活性。
[0068] 蛋白水解活性可通过本领域已知的任何合适的方法测定，如下文进一步论述。
[0069] 例如，提高的蛋白水解活性意指与野生型人因子VIIa相比，保留的活性量是或是大约110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、1000%、3000%、5000%、10 000%、30 000%或更高的活性。
[0070] 半寿期–对由血浆抑制物导致的失活的抗性除了体内清除率之外，体内功能性半寿期对化合物在体内“治疗有效”的时间具有重要性。重组人野生型因子VIIa的循环的半寿期是约2.3小时(“Summary Basis for Approval for NovoSeven©", FDA参考文献号96 0597)。
[0071] 术语“体内功能性半寿期”以其正常含义使用，即，在末期降低保留在身体/靶器官中的因子VII多肽的生物活性至50%所需的时间，或因子VII多肽的活性是其初始值的50%的时间。体内半寿期的替代术语包括终末半寿期、血浆半寿期、循环(circulating)半寿期、循环(circulatory)半寿期和清除半寿期。半寿期可通过本领域已知的合适的方法测定，例如实施例17中描述的，和药动学和药效学的介绍：药物疗法的定量基础（Introduction to Pharmacokinetics and Pharmacodynamics: The Quantitative Basis of Drug Therapy） (Thomas N. Tozer, Malcolm Rowland)中描述的那些。
[0072] 关于体内功能性半寿期或血浆半寿期使用的术语“增加的”用于表示多肽的相关半寿期相对于参考分子例如野生型人因子VIIa而增加，如在相当的条件下所测定的。
[0073] 在一些实施方案中，相对于野生型人因子VIIa，本发明的因子VII多肽显示增加的体内功能性半寿期。例如，相关半寿期可增加至少大约25%，例如至少大约50%，例如至少大约100%、150%、200%、500%、1000%、3000%、5000%、10 000%、30 000%或更多。
[0074] 尽管对凝固级联的生物化学和病理生理学有详细理解，但单个凝固因子从循环中清除的机制基础在很大程度上仍然未知。与其它维生素K-依赖性蛋白的酶原和酶形式相比，因子VII和其活化形式因子VIIa的循环半寿期的显著差异表明对于因子VIIa，存在特定和不同的清除机制。两个类型的途径显示是在因子VIIa的清除中可行的 – 一个类型导致消除完整蛋白，另一个类型由血浆抑制物介导和导致蛋白水解失活。
[0075] 抗凝血酶III (抗凝血酶, AT)是一种丰富的血浆抑制物并靶向凝固系统的大多数蛋白酶，包括因子VIIa。其以微摩尔浓度存在于血浆中，和属于serpin家族的丝氨酸蛋白酶抑制物，其通过自杀底物机制不可逆地结合和失活靶蛋白酶。由抗凝血酶所致的抑制显示构成在静脉内给予后重组因子VIIa在体内主要的清除途径。在血友病患者中重组因子VIIa的药代动力学的最新研究中，总清除率的大约60%可能归因于该途径(Agerso等(2011) J Thromb Haemost, 9, 333-338)。
[0076] 在一些实施方案中，相对于野生型人因子VIIa，本发明的因子VII多肽显示对由内源血浆抑制物特别是抗凝血酶导致的失活的抗性增加。
[0077] 本发明的发明人已经发现，通过组合上文提及的两组突变，即赋予增加的AT抗性的突变和赋予提高的蛋白水解活性的突变，实现增加的或维持的活性，同时保持对抑制物失活的高的抗性。即是说，包含突变的组合的本发明的因子VII多肽显示对抗凝血酶失活的抗性增加，以及基本上维持的蛋白水解活性。当本发明的因子VII多肽与一个或多个半寿期延长部分缀合时，对半寿期延长实现令人惊讶的改进效果。鉴于这些性质，本发明的这样的缀合的因子VII多肽显示增加的循环半寿期，同时保持药学上可接受的蛋白水解活性。因此，可能需要较低剂量的这样的缀合的因子VII多肽以在作用位点处获得功能上足够的浓度和由此将有可能给予较低剂量和/或以较低频率给予具有出血事件或需要增强正常的止血系统的受试者。
[0078] 另外的修饰本发明的因子VII多肽可包含另外的修饰，具体而言，赋予因子VII多肽另外的有益性质的另外的修饰。因此，除了上述氨基酸置换之外，本发明的因子VII多肽可例如包含另外的氨基酸修饰，例如一个另外的氨基酸置换。在一个这样的实施方案中，本发明的因子VII多肽具有另外的突变或添加，其选自R396C、Q250C和407C，如例如在WO2002077218中所述。
[0079] 本发明的因子VII多肽可包含另外的修饰，其在或不在因子VII多肽的一级序列中。另外的修饰包括但不限于添加碳水化合物部分、添加半寿期延长部分，例如添加PEG部分、Fc结构域等。例如，可进行这样的另外的修饰以增加因子VII多肽的稳定性或半寿期。
[0080] 半寿期延长部分或基团术语“半寿期延长部分”在本文中可互换使用和理解为是指与一个或多个氨基酸侧链（site chain）官能团例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2和/或一个或多个N-和/或O-聚糖结构连接的一个或多个化学基团，并且当与这些蛋白/多肽缀合/偶联时，其可增加蛋白/多肽的体内功能性半寿期。
[0081] 体内功能性半寿期可通过本领域已知的任何合适的方法测定，如下文进一步论述的(实施例17)。
[0082] 半寿期延长部分的实例包括：生物相容性脂肪酸和其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于膦酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽和其任何组合。
[0083] 在特别引人注意的实施方案中，本发明的因子VII多肽与一个或多个半寿期延长部分偶联。
[0084] 在一个实施方案中，半胱氨酸-缀合的本发明的因子VII多肽具有一个或多个疏水半寿期延长部分与引入至因子VII多肽的半胱氨酸的巯基缀合。此外有可能将半寿期延长部分与其它氨基酸残基连接。
[0085] 在一个实施方案中，本发明的因子VII多肽通过二硫键连接组织因子，如例如在WO2007115953中所述。
[0086] 在另一个实施方案中，本发明的因子VII多肽是具有增加的血小板亲和力的因子VIIa变体。
[0087] Heparosan缀合物本发明的因子VII多肽Heparosan缀合物可具有一个或多个Heparosan聚合物(HEP)分子与FVII多肽的任何部分连接，所述部分包括因子VII多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。这样的缀合物的实例提供在WO2014/060397，其通过引用结合到本文中。化学和/或酶方法可用于缀合HEP至因子VII多肽上的聚糖。酶缀合方法的实例描述于例如
WO03031464。聚糖可以是天然存在的，或其可以是经工程改造的，例如通过使用本领域众所周知的方法在因子VII的氨基酸序列中引入N-糖基化基序(NXT/S，其中X是任何天然存在的氨基酸)。
WO03031464。聚糖可以是天然存在的，或其可以是经工程改造的，例如通过使用本领域众所周知的方法在因子VII的氨基酸序列中引入N-糖基化基序(NXT/S，其中X是任何天然存在的氨基酸)。
[0088] 本发明的"半胱氨酸-HEP因子VII多肽缀合物"具有一个或多个HEP分子与存在于或引入至FVII多肽的半胱氨酸残基的巯基缀合。
[0089] 在本发明的一个引人注意的实施方案中，因子VII多肽与HEP聚合物偶联。在一个实施方案中，与因子VII多肽偶联的HEP聚合物具有范围选自13-65kDa、13-55kDa、25-55kDa、25-50kDa、25-45kDa、30-45kDa、36-44kDa和38-42kDa的分子量或40kDa的分子量。
[0090] 在本发明的一个引人注意的实施方案中，因子VII多肽与HEP聚合物在因子VII多肽的N-聚糖上偶联。
[0091] 在本发明的另外的实施方案中，两个HEP聚合物与同一因子VII多肽经过N-聚糖偶联。在该实施方案中，与因子VII多肽偶联的各HEP聚合物具有范围选自13-65kDa、13-55kDa、25-55kDa、25-50kDa、25-45kDa、30-45kDa、36-44kDa和38-42kDa的分子量或40kDa的分子量。优选地，聚合物具有相同的分子量。
[0092] 在一个具体的实施方案中，两个20kDa-HEP聚合物与同一因子VII多肽经过其N-聚糖偶联。
[0093] 在一个具体的实施方案中，两个30kDa-HEP聚合物与同一因子VII多肽经过其N-聚糖偶联。
[0094] 在一个具体的实施方案中，两个40kDa-HEP聚合物与同一因子VII多肽经过其N-聚糖偶联。
[0095] Heparosan聚合物Heparosan(HEP)是天然的糖聚合物，其包含(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)重复 (见图
5A)。它属于葡糖胺聚糖多糖家族，并且在生理pH下是带负电荷的聚合物。它可存在于某些细菌的荚膜中，但它也存在于高等脊椎动物，其中它充当天然聚合物肝素和硫酸类肝素的前体。尽管未详细证实，但认为heparosan在溶酶体中降解。注射用Bolton-Hunter试剂标记的100 kDa heparosan聚合物显示，heparosan作为较小的片段在体液/废物中分泌(US
2010/0036001)。
5A)。它属于葡糖胺聚糖多糖家族，并且在生理pH下是带负电荷的聚合物。它可存在于某些细菌的荚膜中，但它也存在于高等脊椎动物，其中它充当天然聚合物肝素和硫酸类肝素的前体。尽管未详细证实，但认为heparosan在溶酶体中降解。注射用Bolton-Hunter试剂标记的100 kDa heparosan聚合物显示，heparosan作为较小的片段在体液/废物中分泌(US
2010/0036001)。
[0096] Heparosan聚合物和制备所述聚合物的方法描述于US 2010/0036001，其内容通过引用结合到本文中。根据本发明，heparosan聚合物可以是US 2010/0036001中描述或公开的任何heparosan聚合物。
[0097] 对于在本发明中的应用，heparosan聚合物可通过任何合适的方法产生，例如描述于US 2010/0036001或US 2008/0109236中的任何方法。Heparosan可使用细菌来源的酶产生。例如，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) D型的heparosan合酶PmHS1通过转运GlcUA和GlcNAc两者来聚合heparosan糖链。大肠杆菌(Escherichia coli) K5酶KfiA (α GlcNAc转移酶)和KfiC (β GlcUA转移酶)也可一起形成heparosan的二糖重复。
[0098] 用于本发明的heparosan聚合物通常是具有式(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)n的聚合物。
[0099] heparosan聚合物的大小可通过在该式中的重复数n来定义。所述重复数n可以是例如2-大约5000。重复数可以是例如50-2000个单位、100-1000个单位或200-700个单位。重复数可以是200-250个单位、500-550个单位或350-400个单位。这些范围的任何下限可与这些范围的任何上限组合以形成heparosan聚合物的单位数的合适范围。
[0100] heparosan聚合物的大小可通过其分子量定义。分子量可以是heparosan聚合物分子群体的平均分子量，例如重量平均分子量。
[0101] 本文所述的关于heparosan聚合物的大小的分子量值在实践中可以不严格地是所列的大小。由于在heparosan聚合物生产期间批次间的差异，应预期到一些变化。为包括批次间的差异，因此应理解，应预期围绕靶HEP聚合物大小大约+/- 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的变化。例如40 kDa的HEP聚合物大小表示40 kDa +/- 10%，例如40 kDa在实践中可例如意指38.8 kDa、41.5 kDa或43.8 kDa。
[0102] heparosan聚合物可具有例如500 Da-1,000kDa的分子量。聚合物的分子量可以是500 Da-650 kDa、5 kDa-750 kDa、10 kDa-500 kDa、15 kDa-550 kDa或25 kDa-250 kDa。
[0103] 可以特定的水平在这些范围内选择分子量，以在因子VII多肽的活性和缀合物的半寿期或平均滞留时间之间实现合适的平衡。例如，聚合物的分子量可以在选自15-25 kDa、25-35 kDa、35-45 kDa、45-55 kDa、55-65 kDa或65-75 kDa的范围内。
[0104] 可选择更具体的分子量范围。例如，分子量可以是20 kDa-35 kDa，例如22 kDa-32 kDa，例如25 kDa-30 kDa，例如大约27 kDa。分子量可以是35-65 kDa，例如40 kDa-60 kDa，例如47 kDa-57 kDa，例如50 kDa-55 kDa，例如大约52 kDa。分子量可以是50-75 kDa，例如60-70 kDa，例如63-67 kDa，例如大约65 kDa。
[0105] 在特别引人注意的实施方案中，本发明的因子VII缀合物的heparosan聚合物具有范围选自13-65 kDa、13-55 kDa、25-55 kDa、25-50 kDa、25-45 kDa、30-45 kDa和38-42 kDa的大小。
[0106] 这些分子量范围的任何下限可与这些范围的任何上限组合，以形成本发明的heparosan聚合物的分子量的合适范围。
[0107] heparosan聚合物可具有窄的大小分布(即单分散性)或宽的大小分布(即多分散性)。多分散性的水平(PDI)可在数值上根据式Mw/Mn表示，其中Mw = 重量平均分子量和Mn = 数量平均分子量。对于理想的单分散性聚合物，使用该等式的多分散性值是1。优选地，用于本发明的heparosan聚合物是单分散性的。因此，聚合物可具有大约1的多分散性，多分散性可以是少于1.25，优选地少于1.20，优选地少于1.15，优选地少于1.10，优选地少于1.09，优选地少于1.08，优选地少于1.07，优选地少于1.06，优选地少于1.05。
[0108] heparosan的分子量大小分布可通过与单分散性大小标准品(HA Lo-Ladder, Hyalose LLC)比较进行测量，其可在琼脂糖凝胶上移动（run）。
[0109] 或者，heparosan聚合物的大小分布可通过高效大小排阻色谱-多角激光散射(SEC-MALLS)测定。这样的方法可用于评价heparosan聚合物的分子量和多分散性。
[0110] 可在酶制备方法中调整聚合物大小。通过控制heparosan受体链与UDP糖的摩尔比，有可能选择需要的最终heparosan聚合物大小。
[0111] heparosan聚合物还可包含允许其与因子VII多肽连接的反应性基团。合适的反应性基团可以是例如，醛、炔、酮、马来酰亚胺、硫醇、叠氮化物、氨基、酰肼、羟胺、碳酸酯、螯合剂或其任何组合。例如，图5B显示了包含马来酰亚胺基团的heparosan聚合物。
[0112] 如实施例中所述(set out)，确定大小的马来酰亚胺或醛官能化的heparosan聚合物可通过酶(PmHS1)聚合反应使用等摩尔量的两种糖核苷酸UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA制备。引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2可用于启始该反应，和进行聚合直到耗尽糖核苷酸结构块。末端胺(源自引发剂)然后可用合适的反应性基团官能化，所述反应性基团例如上述的反应性基团，例如马来酰亚胺官能团(用于缀合至游离的半胱氨酸)或醛(用于还原胺化成氨基)。heparosan聚合物的大小可通过糖核苷酸:引发剂化学计量的变化预设定（pre-determined）。US 2010/0036001中详细描述了该技术。
[0113] 反应性基团可存在于还原或非还原端或整个糖链中。当缀合heparosan聚合物至多肽时，优选仅存在一个这样的反应性基团。
[0114] 用于制备FVII-HEP缀合物的方法例如，WO 03/031464描述了用于重塑多肽(例如因子VII或因子VIIa多肽)的聚糖结构的方法，和用于添加修饰基团例如水溶性聚合物至所述多肽的方法。这样的方法可用于连接heparosan聚合物至本发明的因子VII多肽。
[0115] 如实施例中所述，因子VII多肽可使用唾液酸转移酶缀合至其聚糖部分。为实现该方法，首先HEP聚合物需要与唾液酸胞苷一磷酸连接。甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)是对于这样的化学的合适起点，但可使用其它唾液酸胞苷一磷酸或其片段。实施例显示（set out）了用于共价连接HEP聚合物至GSC分子的方法。通过共价连接，产生HEP-GSC (HEP缀合的甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸)分子，其可转移至FVIIa的聚糖部分。
[0116] 因子VII-heparosan缀合物一旦产生就可纯化。例如，纯化可包括亲和色谱，其使用固定的针对因子VII多肽的mAb，例如针对FVIIa的钙化gla-结构域的mAb。在这样的亲和色谱方法中，未缀合的HEP-聚合物可通过充分洗涤柱来除去。通过从抗体上释放FVII，FVII可自柱上释放。例如，在抗体对钙化gla-结构域特异性的情况下，自柱上释放可通过用包含EDTA的缓冲液洗涤来实现。
[0117] 大小排阻色谱可用于分离因子VII-heparosan缀合物与未缀合的因子VII。
[0118] 纯的缀合物可通过超滤来浓缩。
[0119] 自制备方法产生的因子VII-heparosan缀合物的终浓度可通过例如HPLC量化，例如FVII轻链的HPLC量化来测定。
[0120] 结合本发明表明，有可能经过马来酰亚胺基团连接碳水化合物聚合物例如HEP至硫醇修饰(thio-modified)的GSC分子，并通过唾液酸转移酶转移该试剂至糖蛋白上完整的糖基，从而产生包含环状琥珀酰亚胺基团的连键（linkage）。
[0121] 然而，当缀合物在水溶液中长期贮存时，基于琥珀酰亚胺的连键可经过水解开环(Bioconjugation Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 第3版2013 p. 309)和尽管连键仍可保持完整，但开环反应将增加呈区域和立体异构体形式的不合需要的异质性至最终的缀合物。
[0122] 从上文可知，优选以以下方式将半寿期延长部分连接至糖蛋白：1) 糖蛋白的聚糖残基保持完整形式，和2) 完整糖基残基和半寿期延长部分之间的接头部分不存在异质性。
[0123] 本领域对缀合两种化合物(例如半寿期延长部分例如HEP与蛋白或蛋白聚糖)的方法存在需要，其中所述化合物经连接使得获得稳定的和无异构体的缀合物。
[0124] 在一个方面，本发明提供稳定的和无异构体的接头，其用于HEP与FVII的基于甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)的缀合。用于当前发明的GSC起始材料可经化学合成(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1467-1482)或其可通过描述于WO07056191中的化学酶途径来获得。GSC结构显示如下：在一个实施方案中，本发明的缀合物包含接头，其包含以下结构：
下文亦称为亚接头或亚连键，其以以下方式之一连接HEP-胺和GSC：
因此，突出显示的4-甲基苯甲酰基亚接头构成了连接半寿期延长部分至靶蛋白的完整连接结构的一部分。与替代品(例如基于琥珀酰亚胺的接头(自马来酰亚胺与巯基反应制备的))相比，亚接头本身是稳定的结构，因为当缀合物在水溶液中长期贮存时，具有环状连键的所述替代品具有进行水解开环的趋势(Bioconjugation Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 第3版2013 p. 309)。即使在该情况下连键(例如HEP和糖蛋白的唾液酸之间)可仍保持完整，但开环反应将增加呈区域和立体异构体形式的异质性至最终的缀合物组合物。
下文亦称为亚接头或亚连键，其以以下方式之一连接HEP-胺和GSC：
因此，突出显示的4-甲基苯甲酰基亚接头构成了连接半寿期延长部分至靶蛋白的完整连接结构的一部分。与替代品(例如基于琥珀酰亚胺的接头(自马来酰亚胺与巯基反应制备的))相比，亚接头本身是稳定的结构，因为当缀合物在水溶液中长期贮存时，具有环状连键的所述替代品具有进行水解开环的趋势(Bioconjugation Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, 第3版2013 p. 309)。即使在该情况下连键(例如HEP和糖蛋白的唾液酸之间)可仍保持完整，但开环反应将增加呈区域和立体异构体形式的异质性至最终的缀合物组合物。
[0125] 因此，与本发明的缀合物有关的一个优点是获得同质的组合物，即由于接头结构和稳定性所致异构体形成的趋势被显著降低。另一优点是本发明的接头和缀合物可以简单的方法产生，优选一步法。
[0127] 用于本发明的在HEP和GSC之间的4-甲基苯甲酰基亚连键不能形成立体或区域异构体。HEP聚合物可如早期提及通过同步的酶聚合反应制备(US 20100036001)。该方法使用来自多杀巴斯德氏菌的类肝素合成酶I (PmHS1)，其可在大肠杆菌中作为麦芽糖结合蛋白融合构建体表达。当将其添加至糖核苷酸(GlcNAc-UDP和GlcUA-UDP)的等摩尔混合物中时，纯化的MBP-PmHS1能够在同步的化学计算控制的反应中产生单分散性聚合物。三糖起始剂(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)用于引发该反应，和聚合物长度由引发剂:糖核苷酸比率决定。进行聚合反应直至消耗大约90%的糖核苷酸。通过阴离子交换色谱自反应混合物分离聚合物，和随后冻干成稳定的粉末。
[0128] 用于制备官能HEP聚合物的方法描述于US 20100036001，其列举了例如醛-、胺-和马来酰亚胺官能化的HEP试剂。US 20100036001通过引用以其整体结合到本文中，如同在本文完全阐明一样。一些列其它官能修饰的HEP衍生物可使用类似的化学获得。用于本发明的某些实施方案的HEP聚合物最初根据描述于US20100036001的方法在还原末端上带上伯胺柄（amine handle）而产生。
[0129] 根据US20100036001制备的胺官能化的HEP聚合物(即具有胺-柄的HEP)可通过与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应转化成HEP-苯甲醛，和随后通过还原胺化反应与GSC的甘氨酰氨基偶联。得到的HEP-GSC产物可随后使用唾液酸转移酶经酶缀合至糖蛋白。
[0130] 例如，根据以下方案通过与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应，所述在HEP上的胺柄可转化成苯甲醛官能团：在上述方案中，HEP胺(1)转化成4-甲酰基苯甲酰胺化合物(2)可通过与4-甲酰基苯甲酸的酰基活化形式反应进行。
[0131] 可选择N-琥珀酰亚胺基作为酰基激活基团，但许多其它酰基激活基团是技术人员已知的。非限制性实例包括1-羟基-7-氮杂苯并三唑-、1-羟基-苯并三唑-、五氟苯基-酯，如肽化学已知的。
[0132] 当以干燥形式冷冻贮存(-80℃)时，用苯甲醛官能团修饰的HEP试剂可保持长期稳定。或者，苯甲醛部分可与GSC化合物连接，从而产生适合于缀合至胺官能化半寿期延长部分的GSC-苯甲醛化合物。该合成路线描述于图12。
[0133] 例如，GSC可在pH中性条件下与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应，以提供包含反应性醛基团的GSC化合物(参见例如WO2011101267)。该醛衍生的GSC化合物(GSC-苯甲醛)然后可与HEP-胺和还原剂反应，形成HEP-GSC试剂。
[0134] 上述反应可被逆转，使得HEP-胺首先与N-琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯反应，形成醛衍生的HEP-聚合物，其随后在还原剂的存在下直接与GSC反应。在实践中，这消除了GSC-CHO的繁琐的色谱操作。该合成路线描述于图13。
[0135] 因此，在本发明的一个实施方案中，HEP-苯甲醛与GSC通过还原胺化偶联。
[0136] 还原胺化是一个两步反应，其如下进行：首先，在醛组分和胺组分(在本实施方案中，为GSC的甘氨酰氨基)之间形成亚胺(亦称为Schiff碱)。然后在第二步中将亚胺还原为胺。选择还原剂使得它选择性地还原形成的亚胺成胺衍生物。
[0137] 许多合适的还原剂是技术人员可得的。非限制性实例包括氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、硼氢化钠(NaBH4)、吡啶硼烷复合物(BH3:Py)、二甲基硫化物硼烷复合物(Me2S:
BH3)和甲基吡啶硼烷复合物。
BH3)和甲基吡啶硼烷复合物。
[0138] 尽管对碳水化合物的还原端(例如对HEP聚合物的还原末端)进行还原胺化是可能的，但其通常被描述一种缓慢和无效的反应(JC. Gildersleeve, Bioconjug Chem. 2008 July; 19(7): 1485–1490)。副反应，例如Amadori反应，其中初始形成的亚胺重排成酮胺也是可能的，并将产生异质性，其如先前所述在本发明的情况下是不需要的。
[0139] 芳族醛例如苯甲醛衍生物不能形成这样的重排反应，因为亚胺不能烯醇化和还缺少所需的通常存在于碳水化合物来源的亚胺中的邻近羟基。芳族醛例如苯甲醛衍生物因此特别用于还原胺化反应，以产生无异构体的HEP-GSC试剂。
[0140] 任选使用过量的GSC和还原剂以驱动还原胺化化学快速完成。当反应完成时，过量的(未反应的) GSC试剂和其它小分子组分例如过量的还原剂可随后通过透析、切线流动过滤或分子排阻色谱除去。
[0141] 唾液酸转移酶的天然底物，Sia-CMP和GSC衍生物两者都是带电荷和高度亲水的多官能分子。另外，它们在溶液中不能长时间稳定，尤其是如果pH低于6.0时。在这样的低pH下，对于底物转移所必需的CMP激活基团由于酸催化的磷酸二酯水解而丢失。因此，选择性修饰和分离GSC和Sia-CMP衍生物需要小心控制pH以及快速和有效的分离方法，以避免CMP-水解。
[0142] 在本发明中，使用还原胺化化学将大的半寿期延长部分与GSC缀合。对于该类型的修饰，已发现芳基醛例如苯甲醛修饰的半寿期延长部分是最佳的，因为它们可有效地与GSC在还原胺化条件下反应。
[0143] 因为GSC可在酸性介质中经历水解，所以重要的是，在与HEP-苯甲醛偶联期间保持接近中性或略微碱性的环境。HEP聚合物和GSC都是高度水溶的，因此对于保持接近中性水平的pH，含水缓冲液系统是优选的。可使用许多有机缓冲液和无机缓冲液，然而，缓冲液的组分在还原胺化条件下应优选不具有反应性。这排除了例如包含伯氨基和(在较小程度上)仲氨基的有机缓冲液系统。技术人员将知道哪些缓冲液是合适的和哪些是不合适的。一些合适的缓冲液的实例显示在下文表1中：表1 –缓冲液
通过应用该方法，具有无异构体稳定连键的用半寿期延长部分修饰的GSC试剂可在简单方法中有效地制备和分离，其使CMP激活基团水解的机会最小化。
通过应用该方法，具有无异构体稳定连键的用半寿期延长部分修饰的GSC试剂可在简单方法中有效地制备和分离，其使CMP激活基团水解的机会最小化。
[0144] 通过任一所述化合物彼此反应，可产生包含4-甲基苯甲酰基亚接头部分的HEP-GSC缀合物。
[0145] GSC还可与硫代丁内酯反应，从而产生硫醇修饰的GSC分子(GSC-SH)。如本发明所示，所述试剂可与马来酰亚胺官能化HEP聚合物反应，以形成HEP-GSC试剂。该合成路线描述于图15。得到的产物具有包含琥珀酰亚胺的连键结构。
[0146] 然而，基于琥珀酰亚胺的(亚)连键可经历水解开环，尤其是当修饰的GSC试剂在水溶液中长期储存时，并且尽管连键可保持完整，但开环反应将增加不需要的呈区域和立体异构体形式的异质性。
[0147] 糖缀合的方法HEP-GSC缀合物与(多)-肽的缀合可通过(多)-肽主链的残基上存在的聚糖进行。该形式的缀合亦称为糖缀合。
[0148] 这些年来，已经证明对于在血液凝固因子例如凝固因子FVII上修饰N-聚糖或O-聚糖，基于唾液酸转移酶的方法是温和的和高度选择性的。
[0149] 与基于半胱氨酸烷基化、赖氨酸酰化和涉及蛋白主链中的氨基酸的类似缀合的缀合方法相反，通过聚糖的缀合是一种将较大结构例如蛋白/肽片段的聚合物与生物活性蛋白连接的有吸引力的方法，其具有较少的生物活性扰乱。这是因为在溶液中高度亲水的聚糖通常趋于朝向远离蛋白表面和外面，使对蛋白活性重要的结合表面游离。
[0150] 聚糖可以是天然存在的，或其可以使用本领域众所周知的方法通过例如插入N-连接的聚糖而插入。
[0151] GSC是唾液酸衍生物，其可通过使用唾液酸转移酶转移至糖蛋白。它可用取代基例如PEG在甘氨酰氨基上选择性地修饰，并仍通过使用唾液酸转移酶经酶转移至糖蛋白。GSC可通过酶方法大规模地有效制备(WO07056191)。
[0152] 唾液酸转移酶唾液酸转移酶是一类糖基转移酶，其从天然活化的唾液酸(Sia) – CMP (胞苷一磷酸)化合物转移唾液酸至例如蛋白上的半乳糖基-部分。许多唾液酸转移酶(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)能够转移已在C5乙酰胺基上尤其被大基团例如40 kDa PEG修饰的唾液酸 – CMP (Sia-CMP)衍生物(WO03031464)。可与本发明一起使用的有关的唾液酸转移酶的广泛但非限制性的列表公开于WO2006094810，其通过引用以其整体结合到本文中。
[0153] 在本发明的一个方面，糖蛋白上的末端唾液酸可通过唾液酸酶处理而除去，以提供脱唾液酸糖蛋白。脱唾液酸糖蛋白和用半寿期延长部分修饰的GSC一起将用作唾液酸转移酶的底物。反应产物是具有经过完整的糖基连接基团(在该情况下是完整的唾液酸接头基团)连接的半寿期延长部分的糖蛋白缀合物。其中脱唾液酸FVIIa糖蛋白与HEP-GSC在唾液酸转移酶的存在下反应的反应方案显示在图18中。
[0154] 术语"唾液酸"是指9碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3,5-二脱氧-D-甘油- D-半乳壬酮吡喃糖-1-酸(常简写为Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc或NANA)。该家族的第二成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuNAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN) (Nadano等(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori等, J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990))。还包括9-取代的唾液酸，例如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac，例如9-O-乳酰基Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac。在唾液酸化程序中唾液酸化合物的合成和用途公开于1992年10月1日公布的国际申请WO92/16640中。
[0155] 术语“唾液酸衍生物”是指上文定义的唾液酸，其被一个或多个化学部分修饰。修饰基团可以是例如烷基例如甲基、叠氮基-和氟代基团、或可用作连接其它化学部分的柄的官能团例如氨基或硫醇基。实例包括9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。该术语还包括缺少一个或多个官能团例如羧基或一个或多个羟基的唾液酸。其中羧基被羧酰胺基团或酯基团置换的衍生物也包括在该术语中。该术语还指其中一个或多个羟基被氧化成羰基的唾液酸。此外，该术语是指缺少C9碳原子或C9-C8二者的碳链，例如在用高碘酸氧化处理后的唾液酸。
[0156] 甘氨酰唾液酸是根据上文定义的唾液酸衍生物，其中NeuNAc的N-乙酰基被置换为甘氨酰基团(亦称为氨基乙酰基)。甘氨酰唾液酸可表示为以下结构：术语“CMP-活化的”唾液酸或唾液酸衍生物是指含有唾液酸部分和胞苷一磷酸(CMP)的糖核苷酸。
[0157] 在本说明书中，术语“甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸”用于描述GSC，并且是相同CMP活化的甘氨酰唾液酸的可选命名的同义词。可选命名包括CMP-5’-甘氨酰唾液酸、胞苷-5′-一磷酸-N-甘氨酰神经氨酸、胞苷-5′-一磷酸-N-甘氨酰唾液酸。
[0158] 术语"完整的糖基连接基团"是指源自糖基部分的连接基团，其中插入在多肽和HEP部分之间和与它们共价连接的糖单体在缀合物形成期间不被降解，例如氧化(例如，通过高碘酸钠)。"完整的糖基连接基团"可通过加入糖基单元或从母体糖结构除去一个或多个糖基单元，而衍生自天然存在的寡糖。
[0159] 术语"脱唾液酸糖蛋白"意欲包括其中一个或多个末端唾液酸残基已被除去的糖蛋白，例如通过用唾液酸酶处理或通过化学处理，从半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺的基础"层"暴露至少一个半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基("暴露的半乳糖残基")。
[0160] 结构式中的点线表示打开的价键(即，连接该结构与其它化学部分的键)。
[0161] PEG化的衍生物本发明的"PEG化的因子VII多肽变体/衍生物"可具有一个或多个聚乙二醇(PEG)分子与FVII多肽的任何部分连接，包括因子VII多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。化学和/或酶方法可用于缀合PEG或其它半寿期延长部分至因子VII多肽上的聚糖。酶缀合方法的实例描述于例如WO03031464。聚糖可以是天然存在的，或它可以按上文对HEP缀合物所述的进行工程改造。本发明的"半胱氨酸-PEG化的因子VII多肽变体"具有一个或多个PEG分子与FVII多肽中存在或引入的半胱氨酸残基的巯基缀合。
[0162] 融合蛋白融合蛋白是通过框内（in-frame）连接两个或更多个DNA序列产生的蛋白，所述DNA序列最初编码单独的蛋白或肽或其片段。融合蛋白DNA序列的翻译将产生单一蛋白序列，其可具有源自各个原蛋白或肽的功能性质。编码融合蛋白的DNA序列可通过标准分子生物学方法例如重叠PCR或DNA连接人工产生，和在除去第一个5’-末端DNA序列的终止密码子，同时保留3’-末端DNA序列的终止密码子的情况下进行装配。得到的融合蛋白DNA序列可被插入至合适的表达载体，其支持在标准宿主生物体(例如细菌、酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中异源融合蛋白表达。
[0163] 融合蛋白可包含接头或间隔肽序列，其将定义融合蛋白的蛋白或肽部分分分开。
[0164] 在本发明的一个引人注意的实施方案中，因子VII多肽是融合蛋白，其包含因子VII多肽和融合伴侣蛋白/肽，例如Fc结构域或白蛋白。
[0165] Fc融合蛋白术语“Fc融合蛋白”在本文中意指包括与Fc结构域融合的本发明的因子VII多肽，所述Fc结构域可源自任何抗体同种型。IgG Fc结构域经常是优选的，因为IgG抗体的相对长的循环半寿期。Fc结构域可进一步被修饰以调整某些效应器功能，例如补体结合和/或结合至某些Fc受体。与wt FVII多肽的半寿期相比，FVII多肽与Fc结构域(其具有结合至FcRn受体的能力)的融合，通常会导致融合蛋白的延长的循环半寿期。IgG Fc结构域的位置234、235和
237中的突变通常会导致与FcγRI受体、和还可能与FcγRIIa和FcγRIII受体的结合降低。
这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过内吞再循环途径促进长的循环半寿期。优选地，本发明的融合蛋白的修饰的IgG Fc结构域包含一个或多个以下突变，其分别导致与某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q-介导的补体固定减少(A330S和P331S)。或者，Fc结构域可以是IgG4 Fc结构域，其优选地包含S241P/S228P突变。
237中的突变通常会导致与FcγRI受体、和还可能与FcγRIIa和FcγRIII受体的结合降低。
这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过内吞再循环途径促进长的循环半寿期。优选地，本发明的融合蛋白的修饰的IgG Fc结构域包含一个或多个以下突变，其分别导致与某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q-介导的补体固定减少(A330S和P331S)。或者，Fc结构域可以是IgG4 Fc结构域，其优选地包含S241P/S228P突变。
[0166] 因子VII多肽的制备本发明的因子VII多肽可使用众所周知的制备和纯化方法重组产生；这些方法的一些实例描述于下文；制备和纯化方法的再进一步的实例尤其描述于WO2007/031559。
[0167] 在一个方面，本发明涉及用于制备因子VII多肽的方法。本文描述的因子VII多肽可通过重组核酸技术产生。一般来说，将克隆的人野生型因子VII核酸序列修饰，以编码所需的蛋白。然后将该修饰的序列插入至表达载体，其进而转化或转染至宿主细胞。高等真核细胞，特别是培养的哺乳动物细胞，优选作为宿主细胞。
[0168] 在又一方面，本发明涉及含有和表达多核苷酸构建体的转基因动物。
[0169] 人野生型因子VII的完整的核苷酸和氨基酸序列是已知的(参见U.S. 4,784,950，其中描述了重组人因子VII的克隆和表达)。
[0170] 氨基酸序列改变可通过各种已知的技术实现。核酸序列的修饰可通过位点特异性诱变。位点特异性诱变的技术是本领域众所周知的和描述于例如，Zoller和Smith (DNA 3:479-488, 1984)或"通过延长重叠而剪接（Splicing by extension overlap）", Horton等, Gene 77, 1989, 第61-68页。因此，使用因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可引入选择的改变。同样，使用特定引物，使用聚合酶链反应制备DNA构建体的程序是本领域技术人员众所周知的(参照PCR方法（PCR Protocols）, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。
[0171] 编码本发明的因子VII多肽的核酸构建体可合适地具有基因组或cDNA来源。编码因子VII多肽的核酸构建体还可通过已建立的标准方法，例如Beaucage 和Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 – 1869描述的亚磷酰胺法，经合成制备。编码人因子VII多肽的DNA序列还可通过聚合酶链反应使用特定引物制备，例如描述于US 4,683,202；Saiki等, Science 239 (1988), 487 – 491；或Sambrook等，同上（supra）。
[0172] 此外，核酸构建体可具有混合的合成和基因组来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其通过连接合成、基因组或cDNA来源(合适时)的片段、对应于整个核酸构建体的各部分的片段，按照标准技术制备。
[0173] 核酸构建体优选地是DNA构建体。用于制备本发明的因子VII多肽的DNA序列通常会编码因子VII的氨基-末端的前-原多肽（pre-pro polypeptide）以获得正确的翻译后加工(例如谷氨酸残基的γ-羧化)和从宿主细胞分泌。前-原多肽可以是因子VII或另一维生素K-依赖性血浆蛋白，例如因子IX、因子X、凝血酶原、蛋白C或蛋白S的前-原多肽。如本领域技术人员将理解的，在因子VII多肽的氨基酸序列中可进行其它修饰，其中所述修饰不显著损坏蛋白用作凝固剂的能力。
[0174] 编码人因子VII多肽的DNA序列通常插入在重组载体中，所述载体可以是可方便进行重组DNA程序的任何载体，和载体的选择经常会取决于其待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是这样的载体，当其引入至宿主细胞中时，其整合入宿主细胞基因组并与其已整合入的染色体一起复制。
[0175] 载体优选地是表达载体，其中编码人因子VII多肽的DNA序列与DNA转录所需的其它区段可操作连接。一般而言，表达载体源自质粒或病毒DNA，或可包含这两种元件。术语“可操作连接”表示区段经排列使得它们为其预期的目的而一致起作用，例如转录在启动子处起始和通过编码多肽的DNA序列继续进行。
[0176] 用于表达因子VIIa多肽变体的表达载体将包含能够指导克隆基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，和可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。
[0177] 用于在哺乳动物细胞中指导编码人因子VII多肽的DNA的转录的合适的启动子的实例是SV40启动子(Subramani等, Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864)、MT-1 (金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等, Science 222 (1983), 809 - 814)、CMV启动子(Boshart等, Cell 41:521-530, 1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)。
[0178] 若需要的话，编码因子VII多肽的DNA序列还可操作地连接至合适的终止子，例如人生长激素终止子(Palmiter等, Science 222, 1983, pp. 809-814)或TPI1 (Alber和Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434)或ADH3 (McKnight等, The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099)终止子。表达载体还可包含位于启动子的下游和因子VII序列本身的插入位点的上游的一组RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可获自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。表达载体中还包含位于插入位点下游的多腺苷酸化信号。特别优选的多腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，如上)、来自腺病毒5 Elb区的多腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981)或来自人因子VII基因或牛因子VII基因的多腺苷酸化信号。表达载体还可包括非编码的病毒前导序列，例如位于启动子和RNA剪接位点之间的腺病毒2三重前导序列；和增强子序列，例如SV40增强子。
[0179] 为指导本发明的因子VII多肽进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(亦称为前导序列、前原序列或前序列)。将分泌信号序列与编码人因子VII多肽的DNA序列在正确的阅读框内连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5'。分泌信号序列可以是通常与蛋白缔合的序列，或可以来自编码另一分泌蛋白的基因。
[0180] 用于分别连接编码因子VII多肽的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列和将它们插入至含有复制所需信息的合适的载体的程序是本领域技术人员众所周知的(参照例如，Sambrook等, 分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。
[0181] 转染哺乳动物细胞和表达引入至细胞中的DNA序列的方法描述于例如，Kaufman和Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern 和Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler等, Cell 14 (1978), 725; Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham和van der Eb, Virology 52 (1973), 456；和Neumann等, EMBO J. 1 (1982), 841 – 845。
[0182] 通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等, Cell 14:725-732, 1978; Corsaro 和Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham 和Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)或电穿孔(Neumann等, EMBO J. 1:841-845, 1982)，将克隆的DNA序列引入至培养的哺乳动物细胞。为鉴定和选择表达外源DNA的细胞，通常将赋予可选择表型(可选择标记)的基因与目的基因或cDNA一起引入至细胞中。优选的可选择标记包括赋予耐药性的基因，例如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤。可选择标记可以是可扩增的可选择标记。优选的可扩增的可选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。可选择标记可在单独的质粒中与目的基因同时引入至细胞中，或它们可在相同的质粒中引入。如果在相同的质粒中，可选择标记和目的基因可在不同启动子或相同启动子的控制下，后一排列产生双顺反子信息。该类型的构建体是本领域已知的(例如，Levinson和Simonsen, U.S. 4,713,339)。还可能有利的是，向引入至细胞中的混合物中加入称为"载体DNA"的另外的DNA。
[0183] 在细胞接纳DNA后，它们在合适的生长培养基中生长通常1-2天，以开始表达目的基因。如本文中所用的术语"合适的生长培养基"意指含有细胞生长和目的因子VII多肽表达所需的营养物和其它组分的培养基。培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白和生长因子。为制备γ-羧化蛋白，培养基将含有维生素K，优选地浓度为大约0.1 μg/ml至大约5 μg/ml。然后应用药物筛选，以选择以稳定方式表达可选择标记的细胞的生长。对于用可扩增的可选择标记转染的细胞，可增加药物浓度以选择增加拷贝数的克隆序列，从而增加表达水平。然后针对目的人因子VII多肽的表达筛选稳定转染的细胞的克隆。
[0184] 编码因子VII多肽的DNA序列所引入的宿主细胞可以是能够产生翻译后修饰的人因子VII多肽的任何细胞，并包括酵母、真菌和高等真核细胞。
[0185] 用于本发明的哺乳动物细胞系的实例是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如ATCC CCL 61)、CHO DUKX细胞(Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,
1980)、幼仓鼠肾(BHK)和293 (ATCC CRL 1573; Graham等, J. Gen. Virol. 36:59-72,
1977)细胞系。
1980)、幼仓鼠肾(BHK)和293 (ATCC CRL 1573; Graham等, J. Gen. Virol. 36:59-72,
1977)细胞系。
[0186] 然后将上述的转化或转染的宿主细胞在合适的营养培养基中在允许表达因子VII多肽的条件下培养，在此之后可从培养物中回收所有或部分的所得肽。用于培养细胞的培养基可以是合适用于生长宿主细胞的任何常规培养基，例如最低限度培养基或含有合适的添加物的复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得，或可根据公布的配方制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。然后可从培养基中通过常规程序回收由细胞产生的因子VII多肽，所述常规程序包括从培养基中通过离心或过滤分离宿主细胞，通过盐例如硫酸铵将上清液或滤液中的蛋白含水组分沉淀，通过各种色谱程序例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等纯化，取决于所涉及多肽的类型。
[0187] 转基因动物技术可用于产生本发明的因子VII多肽。优选在宿主雌性哺乳动物的乳腺内产生蛋白。目的蛋白在乳腺中表达和随后分泌至乳汁中，解决了从其它来源分离蛋白所遇到的许多困难。乳汁易于收集，可大量获得，和在生物化学上良好表征。此外，主要的乳蛋白在乳汁中以高浓度存在(通常大约1至15 g/l)。
[0188] 从商业视角，明显优选使用具有大的产乳量的物种作为宿主。尽管可使用较小的动物例如小鼠和大鼠(并且在原理阶段的证明时是优选的)，但优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵羊、和牛。绵羊是特别优选的，因为这样因素，例如在该物种中先前的转基因历史、产乳量、成本和用于收集绵羊乳的装备的易于可得性(为比较影响宿主物种选择的因素，参见例如，WO 88/00239)。通常需要选择已被饲养用于乳品用途的宿主动物品种，例如East Friesland绵羊，或在后期通过培育转基因系而引进乳用家畜。在任何事件中应使用具有已知的良好健康状态的动物。
[0189] 为获得在乳腺中表达，使用来自乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括编码酪蛋白(参见U.S. 5,304,489)、β-乳球蛋白、a-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的那些基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。在绵羊β-乳球蛋白基因的情况下，通常会使用基因的5'侧翼序列的至少接近406 bp的区域，尽管5'侧翼序列的更大部分(直至大约5 kbp)是优选的，例如包含β-乳球蛋白基因的5'侧翼启动子和非编码部分的约4.25 kbp DNA区段(参见Whitelaw等, Biochem. J. 286: 31-39 (1992))。来自其它物种的启动子DNA的类似片段也是合适的。
[0190] β-乳球蛋白基因的其它区域也可掺入构建体中，作为待表达的基因的基因组区。例如，本领域通常公认，与含有内含子的构建体相比，缺少这样的DNA序列的构建体表达差(参见Brinster等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw等, Transgenic Res. 1:
3-13 (1991); WO 89/01343; 和WO 91/02318，其各自通过引用结合到本文中)。在该方面，在合适时，通常优选使用含有编码目的蛋白或多肽的基因的所有或一些天然内含子的基因组序列，因此优选进一步包含来自例如β-乳球蛋白基因的至少一些内含子。一个这样的区域是提供内含子剪接和RNA多腺苷酸化的DNA区段，其来自绵羊β-乳球蛋白基因的3'非编码区。当置换基因的天然的3'非编码序列时，该绵羊β-乳球蛋白区段可增强和稳定该目的蛋白或多肽的表达水平。在其它实施方案中，变体因子VII序列的起始ATG周围的区域被置换为来自乳特异性蛋白基因的相应序列。这样的置换提供推定的组织特异性起始环境，以增强表达。方便的是，置换整个变体因子VII前-原和5'非编码序列为例如BLG基因的那些，尽管可置换较小的区域。
3-13 (1991); WO 89/01343; 和WO 91/02318，其各自通过引用结合到本文中)。在该方面，在合适时，通常优选使用含有编码目的蛋白或多肽的基因的所有或一些天然内含子的基因组序列，因此优选进一步包含来自例如β-乳球蛋白基因的至少一些内含子。一个这样的区域是提供内含子剪接和RNA多腺苷酸化的DNA区段，其来自绵羊β-乳球蛋白基因的3'非编码区。当置换基因的天然的3'非编码序列时，该绵羊β-乳球蛋白区段可增强和稳定该目的蛋白或多肽的表达水平。在其它实施方案中，变体因子VII序列的起始ATG周围的区域被置换为来自乳特异性蛋白基因的相应序列。这样的置换提供推定的组织特异性起始环境，以增强表达。方便的是，置换整个变体因子VII前-原和5'非编码序列为例如BLG基因的那些，尽管可置换较小的区域。
[0191] 对于因子VII多肽在转基因动物中的表达，编码变体因子VII的DNA区段可操作连接至其表达所需的另外的DNA区段以产生表达单元。这样的另外的区段包括上述启动子以及提供转录终止和mRNA的多腺苷酸化的序列。该表达单元会另外包括可操作连接编码修饰的因子VII的区段的编码分泌信号序列的DNA区段。分泌信号序列可以是天然的因子VII分泌信号序列或可以是另一蛋白例如乳蛋白的分泌信号序列(参见例如，von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); 和Meade等, U.S. 4,873,316，其通过引用结合到本文中)。
[0192] 用于转基因动物的表达单元的构建通过将变体因子VII序列插入至含有另外的DNA区段的质粒或噬菌体载体中方便地进行，尽管表达单元可通过基本上连接任何序列来构建。特别方便的是，提供含有编码乳蛋白的DNA区段的载体和置换乳蛋白的编码序列为因子VII变体的编码序列；从而产生包括乳蛋白基因的表达控制序列的基因融合物。在任何事件中，表达单元在质粒或其它载体中的克隆有利于变体因子VII序列的扩增。扩增在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中方便地进行，因此载体通常包括在细菌宿主细胞中起作用的复制起点和可选择标记。然后将表达单元引入至所选宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)。异源DNA的引入可通过数种途径之一实现，包括显微注射(例如美国专利号4,873,191)、逆转录病毒感染(Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988))或使用胚胎干(ES)细胞定点整合(综述见Bradley等, Bio/Technology 10: 534-539 (1992))。然后将卵植入假孕雌性动物的输卵管或子宫，和允许发育至足月。在其种系中带有引入的DNA的幼仔可将该DNA以正常的孟德尔方式传递到它们的后代，允许发育成转基因群。产生转基因动物的一般性程序是本领域已知的(参见例如，Hogan等, 操作鼠胚胎：实验室手册（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons等, Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall等, Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler等, Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert等, Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort等, Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall等, J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239, WO
90/05188, WO 92/11757; 和GB 87/00458)。用于引入外源DNA序列至哺乳动物和它们的生殖细胞的技术最初在小鼠中开发(参见例如，Gordon等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77: 7380-7384 (1980); Gordon和Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter 和Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 4438-4442 (1985); 和Hogan等(出处同上))。这些技术随后经改编以用于大型动物，包括家畜物种(参见例如，WO 88/00239, WO 90/05188, 和WO 92/11757; 和Simons等, Bio/Technology 6: 179-183 (1988))。简言之，在迄今用于产生转基因小鼠或家畜的最有效的途径中，根据已建立的技术将目的DNA的数百个线性分子注入受精卵的原核之一。也可将DNA注入接合子的细胞质。
90/05188, WO 92/11757; 和GB 87/00458)。用于引入外源DNA序列至哺乳动物和它们的生殖细胞的技术最初在小鼠中开发(参见例如，Gordon等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77: 7380-7384 (1980); Gordon和Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter 和Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 4438-4442 (1985); 和Hogan等(出处同上))。这些技术随后经改编以用于大型动物，包括家畜物种(参见例如，WO 88/00239, WO 90/05188, 和WO 92/11757; 和Simons等, Bio/Technology 6: 179-183 (1988))。简言之，在迄今用于产生转基因小鼠或家畜的最有效的途径中，根据已建立的技术将目的DNA的数百个线性分子注入受精卵的原核之一。也可将DNA注入接合子的细胞质。
[0193] 纯化本发明的因子VII多肽从细胞培养基中回收。本发明的因子VII多肽可通过本领域已知的各种程序纯化，包括但不限于色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和分子排阻)、电泳程序(例如，制备型等电位聚焦(IEF)、差别溶解(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见例如，Protein Purification, J.-C. Janson和Lars Ryden编辑, VCH Publishers, New York,
1989)。优选地，因子VII多肽可通过亲和色谱在抗-因子VII抗体柱上纯化。使用钙依赖性单克隆抗体，如Wakabayashi等, J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986)和Thim等, Biochemistry 27: 7785-7793, (1988)所述，是特别优选的。另外的纯化可通过常规化学纯化方式，例如高效液相色谱实现。其它纯化方法，包括柠檬酸钡沉淀，是本领域已知的，和可应用于本文所述的新的因子VII多肽的纯化(参见例如，Scopes, R., Protein
Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982)。
1989)。优选地，因子VII多肽可通过亲和色谱在抗-因子VII抗体柱上纯化。使用钙依赖性单克隆抗体，如Wakabayashi等, J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986)和Thim等, Biochemistry 27: 7785-7793, (1988)所述，是特别优选的。另外的纯化可通过常规化学纯化方式，例如高效液相色谱实现。其它纯化方法，包括柠檬酸钡沉淀，是本领域已知的，和可应用于本文所述的新的因子VII多肽的纯化(参见例如，Scopes, R., Protein
Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982)。
[0194] 为治疗目的，优选本发明的因子VII多肽是基本上纯的。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的因子VII多肽纯化至至少大约90-95%同质性，优选地至少大约98%同质性。可通过本领域已知的数种方法例如HPLC、凝胶电泳和氨基-末端氨基酸测序评价纯度。
[0195] 因子VII多肽在其活化位点上被裂解，以将其转化成其双链形式。活化可根据本领域已知的程序，例如Osterud等, Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, 美国专利号4,456,591; Hedner 和Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983);或Kisiel 和Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)中公开的那些进行。或者，如Bjoern等(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)所述，因子VII可通过让其通过离子交换色谱柱，例如Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals)等活化。得到的活化的因子VII变体然后可按下文所述配制和给予。
[0196] 测定法本文提供了合适的体外蛋白水解和抗凝血酶反应性测定法，用于选择优选的本发明的因子VII多肽。这样的测定法详细描述于实施例5。简言之，所述测定法可作为简单的初步体外测试进行，如下：
FVIIa多肽的蛋白水解活性可使用生理学基质血浆-衍生的因子X (X)作为底物在生理pH下和在钙和由磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰丝氨酸(PS)构成的囊泡(以支持反应)的存在下测量。通过以低于反应Km的底物浓度孵育FVIIa与FX一段足够长的时间进行测定，所述时间允许产生可测量的量的FXa同时保持FX转化低于20%。在加入合适的发色底物例如S-2765后定量产生的FXa，和在根据测试的FVIIa变体的浓度标准化后相对于野生型FVIIa进行报告。
FVIIa多肽的蛋白水解活性可使用生理学基质血浆-衍生的因子X (X)作为底物在生理pH下和在钙和由磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰丝氨酸(PS)构成的囊泡(以支持反应)的存在下测量。通过以低于反应Km的底物浓度孵育FVIIa与FX一段足够长的时间进行测定，所述时间允许产生可测量的量的FXa同时保持FX转化低于20%。在加入合适的发色底物例如S-2765后定量产生的FXa，和在根据测试的FVIIa变体的浓度标准化后相对于野生型FVIIa进行报告。
[0197] FVIIa多肽的抗凝血酶反应性可在生理pH下在拟-一阶条件（pseudo-first order condition）下在存在过量的血浆-衍生的抗凝血酶、低分子量(LMW)肝素和钙存在下测量。在抑制反应的整个时间过程中使用发色底物例如S-2288间断地测量残留的FVIIa活性。通过将数据非线性最小二乘方拟合至单指数衰变函数获得抑制速率，并在根据所用的抗凝血酶浓度将抑制速率标准化后相对于野生型FVIIa报告。血液凝固蛋白酶被抗凝血酶的肝素-催化和未催化抑制的动力学特征描述于Olson等(1993), Methods Enzymol. 222, 525-
559。
559。
[0198] 药物组合物在一个方面，本发明涉及包含本发明的因子VII多肽的组合物和制剂。例如，本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的因子VII多肽的药物组合物。
[0199] 因此，本发明的一个目标是提供包含以0.25 mg/ml至100 mg/ml的浓度存在的因子VII多肽的药物制剂，和其中所述制剂具有2.0-10.0的pH。所述制剂还可包含缓冲系统、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂或表面活性剂中的一种或多种，以及其各种组合。药物组合物中防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂、抗氧化剂和表面活性剂的使用是技术人员众所周知的。可参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995。
[0200] 在一个实施方案中，药物制剂是含水制剂。这样的制剂通常是溶液或混悬液，但也可包括胶体、分散液、乳液和多相物质。术语“含水制剂”定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样，术语“含水溶液”定义为包含至少50 % w/w水的溶液，和术语“含水混悬液”定义为包含至少50% w/w水的混悬液。
[0202] 在又一方面，药物制剂包含因子VII多肽的水溶液和缓冲液，其中多肽以等于或大于1 mg/ml的浓度存在，和其中所述制剂具有大约2.0至大约10.0的pH。
[0203] 在又一方面，药物制剂可以是WO2014/057069中公开的任何制剂，其通过引用结合到本文中；或其可以是实施例18中描述的制剂。
[0204] 本发明的因子VII多肽可经胃肠外给予，例如静脉内，例如肌内，例如皮下。或者，本发明的FVII多肽可通过非注射途径给予，例如口服或局部。本发明的多肽可预防性地给予。本发明的多肽可治疗性地(按需求)给予。
[0205] 治疗用途在一个广泛的方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可用作药物。
[0206] 在一个方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可用于治疗患有凝血病的受试者。
[0207] 在另一方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可用于制备用于治疗出血障碍或出血事件或用于增强正常的止血系统的药物。
[0208] 在又一方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可用于治疗血友病A、血友病B或具有获得性抑制物的血友病A或B。
[0209] 在另一方面，本发明的因子VII多肽或包含所述多肽的药物制剂可用于在受试者中治疗出血障碍或出血事件或增强正常的止血系统的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗上或预防上有效量的本发明的因子VII多肽。
[0210] 如本文中所用的术语“受试者”包括任何人患者或非人脊椎动物。
[0211] 如本文中所用的术语“治疗”是指有需要的任何人或其它脊椎动物受试者的医学疗法。所述受试者预期已经经历医学从业者或兽医学从业者的身体检查，所述从业者给予试验性或确定性诊断，其表明使用所述特定治疗有益于所述人或其它脊椎动物的健康。根据受试者的健康状态（status quo），所述治疗的时限和目的可在个体之间改变。因此，所述治疗可以是预防性的、姑息性的、针对症状的和/或治疗性的。就本发明而言，预防性的、姑息性的、针对症状的和/或治疗性的治疗可代表本发明的单独的方面。
[0212] 如本文中所用的术语“凝血病”是指增加的出血倾向，其可由正常凝血级联的任何促凝血组分的任何定性或定量缺乏或纤维蛋白溶解的任何增量调节引起。这样的凝血病可以是先天性的和/或获得性的和/或医源性的，和由本领域技术人员鉴定。先天性的亚凝血病的非限制性实例是血友病A、血友病B、因子VII缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、冯维勒布兰德氏病和血小板减少症，例如Glanzmann血小板功能不全和Bernard-Soulier综合征。血友病A或B的临床严重性通过血液中的FIX/因子VIII的功能单位的浓度来测定，和分类为轻度、中度或重度。重度血友病定义为凝固因子水平<0.01 U/ml，对应于<1%的正常水平，而具有中度和轻度血友病的人分别具有1-5%和>5%的水平。具有“抑制物” (即，针对因子VIII的异体抗体（allo-antibody）)的血友病A和具有“抑制物” (即，针对因子IX的异体抗体)的血友病B是部分先天性和部分获得性的凝血病的非限制性实例。
[0213] 获得性凝血病的非限制性实例是由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏；这样的维生素K-缺乏可由给予维生素K拮抗剂引起，例如华法林。获得性凝血病也可在广泛创伤后发生。在另外称为“血液恶性循环”的该情况中，其特征为血稀释(稀释性血小板减少症和凝固因子的稀释)、低体温、凝固因子的消耗和代谢错乱(酸中毒)。流体疗法和增加的纤维蛋白溶解可加重该情况。所述出血可来自身体的任何部分。
[0214] 医源性凝血病的非限制性实例是超剂量的抗凝固剂药物治疗– 例如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制物 – 其可以是处方指示（prescribe）以治疗血栓栓塞性疾病。医源性凝血病的第二个非限制性实例是由过度和/或不适当的流体疗法引起的凝血病，例如可能由输血引起的凝血病。
[0215] 在本发明的一个实施方案中，出血与血友病A或B有关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制物的血友病A或B有关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少症有关。在另一个实施方案中，出血与冯维勒布兰德氏病有关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤有关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤有关。在另一个实施方案中，出血与手术有关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎有关。在另一个实施方案中，出血是大量的子宫出血，例如在胎盘早剥中。在另一个实施方案中，出血在对机械止血具有有限可能性的器官中发生，例如颅内、耳内（intraaurally）或眼内。在另一个实施方案中，出血与抗凝固剂疗法有关。
[0216] 本发明通过以下实施方案的非限制性列表进一步描述：实施方案1：因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的两个或更多个置换，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)和/或W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)和/或K337被替换为Ala (A)或Gly (G)；任选地，其中Q176被替换为Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)；或Q286被替换为Asn (N)。
[0217] 实施方案1(i)：根据实施方案1的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)；和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)和/或W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)和/或K337被替换为Ala (A)或Gly (G)。
[0218] 实施方案1(ii)：根据实施方案1的因子VII多肽，其中L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)或Ala (A)。
[0219] 实施方案1(iii)：根据实施方案1的因子VII多肽，其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
[0220] 实施方案1(iv)：根据实施方案1的因子VII多肽，其中K337被替换为Ala (A)或Gly (G)。
[0221] 实施方案2：根据实施方案1的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)。
[0222] 实施方案2(i)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)、Ala (A)或Trp (W)。
[0223] 实施方案2(ii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Phe (F)。
[0224] 实施方案2(iii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Tyr (Y)。
[0225] 实施方案2(iv)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Asn (N)。
[0226] 实施方案2(v)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Ala (A)。
[0227] 实施方案2(vi)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和L288被替换为Trp (W)。
[0228] 实施方案2(vii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Phe (F)。
[0229] 实施方案2(viii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Tyr (Y)。
[0230] 实施方案2(ix)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Asn (N)。
[0231] 实施方案2(x)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Ala (A)。
[0232] 实施方案2(xi)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和L288被替换为Trp (W)。
[0233] 实施方案2(xii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)；和L288被替换为Phe (F)。
[0234] 实施方案2(xiii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)；和L288被替换为Tyr (Y)。
[0235] 实施方案2(xiv)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和L288被替换为Asn (N)。
[0236] 实施方案2(xv)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和L288被替换为Ala (A)。
[0237] 实施方案2(xvi)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和L288被替换为Trp (W)。
[0238] 实施方案2(xvii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和L288被替换为Phe (F)。
[0239] 实施方案2(xviii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和L288被替换为Tyr (Y)。
[0240] 实施方案2(xix)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和L288被替换为Asn (N)。
[0241] 实施方案2(xx)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和L288被替换为Ala (A)。
[0242] 实施方案2(xxi)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和L288被替换为Trp (W)。
[0243] 实施方案2(xxii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和K337被替换为Ala (A)。
[0244] 实施方案2(xxiii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和K337被替换为Ala (A)。
[0245] 实施方案2(xxiv)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和K337被替换为Ala (A)。
[0246] 实施方案2(xxv)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和K337被替换为Ala (A)。
[0247] 实施方案2(xxvi)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和K337被替换为Gly (G)。
[0248] 实施方案2(xxvii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和K337被替换为Gly (G)。
[0249] 实施方案2(xxviii)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和K337被替换为Gly (G)。
[0250] 实施方案2(xxix)：根据实施方案1-2中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和K337被替换为Gly (G)。
[0251] 实施方案2(xxx)：根据实施方案2(ii)-2(xxii)中任一项的因子VII多肽，其中K337被替换为Ala (A)。
[0252] 实施方案3：根据实施方案2的因子VII多肽，其中多肽包含以下各组置换之一：L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293K/L305V、L288F/T293K/L305I、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288F/T293R/L305V、L288F/T293R/L305I、L288F/T293Y、L288F/T293Y/K337A、L288F/T293Y/L305V、L288F/T293Y/L305I、L288F/T293F、L288F/T293F/K337A、L288F/T293F/L305V、L288F/T293F/L305I、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293K/L305V、L288Y/T293K/L305I、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288Y/T293R/L305V、L288Y/T293R/L305I、L288Y/T293Y、L288Y/T293Y/K337A、L288Y/T293Y/L305V、L288Y/T293Y/L305I、L288Y/T293F、L288Y/T293F/K337A、L288Y/T293F/L305V、L288Y/T293F/L305I、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T293K/L305V、L288N/T293K/L305I、L288N/T293R、L288N/T293R/K337A、L288N/T293R/L305V、L288N/T293R/L305I、L288N/T293Y、L288N/T293Y/K337A、L288N/T293Y/L305V、L288N/T293Y/L305I、L288N/T293F、L288N/T293F/K337A、L288N/T293F/L305V、L288N/T293F/L305I、L288A/T293K、L288A/T293K/K337A、L288A/T293K/L305V、L288A/T293K/L305I、L288A/T293R、L288A/T293R/K337A、L288A/T293R/L305V、L288A/T293R/L305I、L288A/T293Y、L288A/T293Y/K337A、L288A/T293Y/L305V、L288A/T293Y/L305I、L288A/T293F、L288A/T293F/K337A、L288A/T293F/L305V或L288A/T293F/L305I。
[0253] 实施方案4：根据实施方案2的因子VII多肽，其中多肽具有以下置换：L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T293R或L288N/T293R/K337A。
[0254] 实施方案5：根据实施方案1的因子VII多肽，其中Q176被替换为Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)。
[0255] 实施方案6：根据实施方案5的因子VII多肽，其中多肽包含以下各组置换之一：L288F/Q176K/K337A、L288Y/Q176K/K337A、L288N/Q176K/K337A或L288A/Q176K/K337A。
[0256] 实施方案7：根据实施方案1的因子VII多肽，其中Q286被替换为Asn (N)。
[0257] 实施方案8：因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的一个或多个置换，特征在于一个置换为其中L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)或Ala (A)，前提条件是多肽不具有以下一对置换：L288N/R290S或L288N/R290T。
[0258] 实施方案9：根据实施方案1-2(xxx)、5和7-8中任一项的因子VII多肽，其中因子VII多肽还包含一个或多个以下置换L305I、L305V或K337A。
[0259] 实施方案10：因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)，和其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)；其中Q176被替换为Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)；或Q286被替换为Asn (N)。
[0260] 实施方案10(i)：根据实施方案1-1(ii)或10中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
[0261] 实施方案11：根据实施方案10的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)。
[0262] 实施方案11(i)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)，和W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
[0263] 实施方案11(ii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和W201被替换为Arg (R)。
[0264] 实施方案11(iii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和W201被替换为Met (M)。
[0265] 实施方案11(iv)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Lys (K)，和W201被替换为Lys (K)。
[0266] 实施方案11(v)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和W201被替换为Arg (R)。
[0267] 实施方案11(vi)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和W201被替换为Met (M)。
[0268] 实施方案11(vii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Arg (R)，和W201被替换为Lys (K)。
[0269] 实施方案11(viii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和W201被替换为Arg (R)。
[0270] 实施方案11(ix)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和W201被替换为Met (M)。
[0271] 实施方案11(x)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Tyr (Y)，和W201被替换为Lys (K)。
[0272] 实施方案11(xi)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和W201被替换为Arg (R)。
[0273] 实施方案11(xii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和W201被替换为Met (M)。
[0274] 实施方案11(xiii)：根据实施方案1-2、10或11中任一项的因子VII多肽，其中T293被替换为Phe (F)，和W201被替换为Lys (K)。
[0275] 实施方案12：根据实施方案11的因子VII多肽，其中多肽包含以下各组置换之一：W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293K/L305V、W201R/T293K/L305I、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293R/L305V、W201R/T293R/L305I、W201R/T293Y、W201R/T293Y/K337A、W201R/T293Y/L305V、W201R/T293Y/L305I、W201R/T293F、W201R/T293F/K337A、W201R/T293F/L305V、W201R/T293F/L305I、W201K/T293K、W201K/T293K/K337A、W201K/T293K/L305V、W201K/T293K/L305I、W201K/T293R、W201K/T293R/K337A、W201K/T293R/L305V、W201K/T293R/L305I、W201K/T293Y、W201K/T293Y/K337A、W201K/T293Y/L305V、W201K/T293Y/L305I、W201K/T293F、W201K/T293F/K337A、W201K/T293F/L305V、W201K/T293F/L305I、W201M/T293K、W201M/T293K/K337A、W201M/T293K/L305V、W201M/T293K/L305I、W201M/T293R、W201M/T293R/K337A、W201M/T293R/L305V、W201M/T293R/L305I、W201M/T293Y、W201M/T293Y/K337A、W201M/T293Y/L305V、W201M/T293Y/L305I、W201M/T293F、W201M/T293F/K337A、W201M/T293F/L305V或W201M/T293F/L305I。
[0276] 实施方案13：根据实施方案11的因子VII多肽，其中多肽具有以下置换：W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293Y、W201R/T293F、W201K/T293K或W201M/T293K。
[0277] 实施方案14：根据实施方案10的因子VII多肽，其中Q176被替换为Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)。
[0278] 实施方案15：根据实施方案14的因子VII多肽，其中多肽包含以下各组置换之一：W201R/Q176K、W201R/Q176R、W201K/Q176K、W201K/Q176R、W201M/Q176K或W201M/Q176R。
[0279] 实施方案16：根据实施方案10的因子VII多肽，其中Q286被替换为Asn (N)。
[0280] 实施方案17：根据实施方案10-11、14和16中任一项的因子VII多肽，其中因子VII多肽还包含一个或多个以下置换：L305I、L305V或K337A。
[0281] 实施方案18：因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的一个或多个置换，特征在于一个置换是其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)。
[0282] 实施方案19：因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个或更多个置换，其中L288被替换为Phe (F)、Tyr (Y)、Asn (N)或Ala (A)；其中W201被替换为Arg (R)、Met (M)或Lys (K)，和任选地，其中T293被替换为Lys (K)、Arg (R)、Tyr (Y)或Phe (F)；Q176被替换为Lys (K)、Arg (R)或Asn (N)；或Q286被替换为Asn (N)。
[0283] 实施方案20：根据实施方案19的因子VII多肽，其中多肽包含以下各组置换之一：L288F/W201K、L288F/W201R、L288F/W201M、L288N/W201K、L288N/W201R、L288N/W201M、L288Y/W201K、L288Y/W201R、L288Y/W201M、L288A/W201K、L288A/W201R、L288A/W201M、L288F/W201K/T293K、L288F/W201K/T293Y、L288F/W201R/T293K、L288F/W201R/T293Y、L288F/W201M/T293K、L288F/W201M/T293Y、L288N/W201K/T293K、L288N/W201K/T293Y、L288N/W201R/T293K、L288N/W201R/T293Y、L288N/W201M/T293K、L288N/W201M/T293Y、L288A/W201K/T293K、L288A/W201K/T293Y、L288A/W201R/T293K、L288A/W201R/T293Y、L288A/W201M/T293K、L288A/W201M/T293Y、L288Y/W201K/T293K、L288Y/W201K/T293Y、L288Y/W201R/T293K、L288Y/W201R/T293Y、L288Y/W201M/T293K或L288Y/W201M/T293Y。
[0284] 实施方案21：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，其中因子VII多肽还包含一个或多个以下置换：R396C、Q250C或407C。
[0285] 实施方案22：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽是裂解的双链因子VIIa多肽。
[0286] 实施方案22(i)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的两个氨基酸置换。
[0287] 实施方案22(ii)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的三个氨基酸置换。
[0288] 实施方案22(iii)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的四个氨基酸置换。
[0289] 实施方案22(iv)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的五个氨基酸置换。
[0290] 实施方案22(v)：根据实施方案22(i)-(iv)中任一项的因子VII多肽，包含相对于人因子VII的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的最多十个氨基酸置换。
[0291] 实施方案22(vi)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，在缺少可溶性组织因子的情况下，其蛋白水解活性为野生型人因子VIIa的至少110%、例如至少120%、例如至少130%、例如至少140%、例如至少150%、例如至少160%、例如至少170%、例如至少180%、例如至少190%、例如至少200%、例如至少300%、例如至少400%、例如至少500%、例如至少1000%、例如至少3000%、例如至少5000%、例如至少10 000%、例如至少30 000%，如体外蛋白水解测定法所测量。
[0292] 实施方案22(vii)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，在存在低分子量肝素和缺少可溶性组织因子的情况下，与野生型人因子VIIa (SEQ ID NO: 1)相比，其具有少于20%、例如少于19%、例如少于18%、例如少于17%、例如少于16%、例如少于15%、例如少于14%、例如少于13%、例如少于12%、例如少于11%、例如少于10%、例如少于9%、例如少于8%、例如少于7%、例如少于6%、例如少于5%的抗凝血酶反应性，如抗凝血酶抑制测定法所测量。
[0293] 实施方案23：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，其中因子VII多肽与至少一个半寿期延长部分偶联。
[0294] 实施方案24：根据实施方案23的因子VII多肽，其中半寿期延长部分选自生物相容性脂肪酸和其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于膦酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样(ELP)肽、XTEN聚合物、PAS聚合物、PA聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽、FcRn结合肽和其任何组合。
[0295] 实施方案25：根据实施方案24的因子VII多肽，其中半寿期延长部分是heparosan聚合物。
[0296] 实施方案26：根据实施方案25的因子VII多肽，其中heparosan聚合物具有范围选自13-65kDa、13-55kDa、25-55kDa、25-50kDa、25-45kDa、30-45kDa和38-42kDa的分子量或40kDa的分子量。
[0297] 实施方案26(i)：根据实施方案25-26中任一项的FVII多肽，其包含式I所示的结构片段，其中n是95-115的整数。
[0298] 实施方案26(ii)：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，与野生型人因子VIIa (SEQ ID NO: 1)相比，其具有增加至少100%的半寿期。
[0299] 实施方案27：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，其中所述因子VII多肽与组织因子经二硫键连接。
[0300] 实施方案28：根据前述实施方案中任一项的因子VII多肽，其中所述多肽具有另外的氨基酸修饰，其增加多肽的血小板亲和力。
[0301] 实施方案29：根据实施方案1-22中任一项的因子VII多肽，其中所述多肽是包含根据实施方案1-22中任一项的因子VII多肽和融合伴侣蛋白/肽例如Fc结构域或白蛋白的融合蛋白。
[0302] 实施方案30：编码实施方案1-22和28-29中任一项定义的因子VII多肽的多核苷酸。
[0303] 实施方案31：包含根据实施方案30的多核苷酸的重组宿主细胞。
[0304] 实施方案32：用于制备实施方案1-22和28-29中任一项定义的因子VII多肽的方法，所述方法包括在允许表达多核苷酸构建体的条件下在合适的培养基中培养细胞，和从培养基中回收得到的多肽。
[0305] 实施方案33：药物组合物，包含实施方案1-29中任一项定义的因子VII多肽和药学上可接受的载体。
[0306] 实施方案34：用于治疗受试者中出血障碍或出血事件或用于增强正常的止血系统的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗上或预防上有效量的如实施方案1-29中任一项定义的因子VII多肽。
[0307] 实施方案35：实施方案1-26中任一项定义的因子VII多肽，用作药物。
[0308] 实施方案35(i)：实施方案1-26中任一项定义的因子VII多肽，用于治疗凝血病。
[0309] 实施方案36：根据实施方案35(i)的因子VII多肽，用作治疗血友病A或B的药物。
[0310] 本发明还通过以下实施例举例说明，然而，所述实施例不应解释为限制保护范围。前文的描述和后面的实施例中公开的特征，分别地和以其任何组合地，可以是用于以其不同形式实现本发明的材料。
实施例
实施例
[0311] 蛋白人血浆-衍生的因子X (FX)和因子Xa (FXa)获自Enzyme Research Laboratories
Inc. (South Bend, IN)。可溶性组织因子1-219 (sTF)或1-209根据公布的程序
(Freskgard等, 1996)制备。重组野生型FVIIa的表达和纯化按之前所述进行(Thim等,
1988; Persson 和Nielsen, 1996)。人血浆-衍生的抗凝血酶(Baxter)通过肝素琼脂糖色谱(GE Healthcare)根据公布的程序(Olson等, 1993)重新纯化。牛血清白蛋白(BSA)获自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)。
Inc. (South Bend, IN)。可溶性组织因子1-219 (sTF)或1-209根据公布的程序
(Freskgard等, 1996)制备。重组野生型FVIIa的表达和纯化按之前所述进行(Thim等,
1988; Persson 和Nielsen, 1996)。人血浆-衍生的抗凝血酶(Baxter)通过肝素琼脂糖色谱(GE Healthcare)根据公布的程序(Olson等, 1993)重新纯化。牛血清白蛋白(BSA)获自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)。
[0312] 实施例1 – FVIIa变体设计为设计对作为底物的FX具有较高蛋白水解活性的FVIIa变体，采用一种双向策略(two-pronged strategy)。选择活性位点区域周围的FVIIa环和单个氨基酸分别用于与来自不同物种的相应的FVII氨基酸(图1)交换和点诱变。FVIIa蛋白水解活性按实施例5中所述测量。
对于三种环-交换的FVIIa变体的蛋白水解活性显示在表1中，其中位置287和289的残基分别被突变成苏氨酸和谷氨酸，同时改变位置288的氨基酸。观察到，尽管在位置287和289上保持相同氨基酸，但位置288的变化显著影响蛋白水解活性。还观察到，置换位置201的氨基酸为大鼠和兔FVII携带的亮氨酸或牛FVII携带的精氨酸，影响蛋白水解活性。此外，观察到，置换位置337的氨基酸为马携带的谷氨酰胺或较小体积的氨基酸例如丙氨酸，影响蛋白水解活性(表1)。这些观察结果表明，位置288和201的氨基酸可能参与FX识别和活化。因此，位置288和201进一步通过饱和诱变进行研究，和代表性的结果显示在表2中。
对于三种环-交换的FVIIa变体的蛋白水解活性显示在表1中，其中位置287和289的残基分别被突变成苏氨酸和谷氨酸，同时改变位置288的氨基酸。观察到，尽管在位置287和289上保持相同氨基酸，但位置288的变化显著影响蛋白水解活性。还观察到，置换位置201的氨基酸为大鼠和兔FVII携带的亮氨酸或牛FVII携带的精氨酸，影响蛋白水解活性。此外，观察到，置换位置337的氨基酸为马携带的谷氨酰胺或较小体积的氨基酸例如丙氨酸，影响蛋白水解活性(表1)。这些观察结果表明，位置288和201的氨基酸可能参与FX识别和活化。因此，位置288和201进一步通过饱和诱变进行研究，和代表性的结果显示在表2中。
[0313] 表1：选择的FVIIa变体的蛋白水解活性。结果表示为野生型FVIIa的百分比(%)。
[0314] 实施例2 – FVIIa变体的克隆使用基于定点诱变PCR的方法使用来自Novagen的KOD Xtreme™ Hot Start DNA聚合酶或来自Stratagene的QuickChange® Site-Directed Mutagenesis试剂盒，将突变引入至编码FVII cDNA的哺乳动物表达载体。来自Icosagen Cell Factory (Estonia)的pQMCF表达载体和CHOEBNALT85用作表达系统。引入所需的突变通过DNA测序证实(MWG Biotech. Germany)。
[0315] 实施例3 – FVIIa表达FVII变体在来自Icosagen Cell Factory (Estonia)的CHOEBNALT85细胞中表达。简言之，CHOEBNALT85悬浮细胞通过电穿孔瞬时转染(Gene Pulse Xcell, Biorad,
Copenhagen, DK)。转染的细胞用700 µg/l Geneticin® (Gibco by Life Technologies)选择，和扩增得到总共300 ml至10升上清液。根据制造商的说明书，将细胞在补充有5 mg/l维生素K1 (Sigma-Aldrich)的培养基中培养。根据规模，将细胞在摇瓶中(37℃. 5-8% CO2和85-125 rpm)或摇动培养袋中(37℃. 5% CO2和30 rpm)培养。通过离心收获小规模的上清液，接着通过0.22 µm PES滤器过滤(Corning; Fischer Scientific Biotech, Slangerup, DK)，和通过深度过滤收获更大体积，接着通过0.22 µm完全过滤(3 µm Clarigard, Opticap XL10; 0.22 µm Durapore, Opticap XL10, Merck Millipore, Hellerup, DK)。
Copenhagen, DK)。转染的细胞用700 µg/l Geneticin® (Gibco by Life Technologies)选择，和扩增得到总共300 ml至10升上清液。根据制造商的说明书，将细胞在补充有5 mg/l维生素K1 (Sigma-Aldrich)的培养基中培养。根据规模，将细胞在摇瓶中(37℃. 5-8% CO2和85-125 rpm)或摇动培养袋中(37℃. 5% CO2和30 rpm)培养。通过离心收获小规模的上清液，接着通过0.22 µm PES滤器过滤(Corning; Fischer Scientific Biotech, Slangerup, DK)，和通过深度过滤收获更大体积，接着通过0.22 µm完全过滤(3 µm Clarigard, Opticap XL10; 0.22 µm Durapore, Opticap XL10, Merck Millipore, Hellerup, DK)。
[0316] 实施例4 – FVIIa纯化和浓度测定FVII变体通过指向Gla-结构域的抗体亲和色谱法纯化，基本上按它处所述(Thim等
1988)。简言之，方案包括3个步骤。第1步，将5 mM CaCl2加入条件培养基中和将样品载入亲和柱上。在用10 mM His, 2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.005% Tween 80, pH 6.0广泛洗涤后，结合的蛋白用50 mM His, 15 mM EDTA, 0.005% Tween80, pH 6.0洗脱到(步骤2)阴离子交换柱(Source 15Q, GE Healthcare)。在用20 mM HEPES, 20 mM NaCl, 0.005% Tween80, pH 8.0洗涤后，结合的蛋白用20 mM HEPES, 135 mM NaCl, 10 mM CaCl2,
0.005% Tween80, pH 8.0洗脱到(步骤3) CNBr-Sepharose Fast Flow柱(GE
Healthcare)，根据制造商的说明书，人血浆-衍生的FXa已经以1 mg/ml的密度与该柱偶联。
优化流速以确保基本上完全将纯化的酶原变体激活为活化形式。对于能够在条件培养基中或在阴离子交换柱上自体活化（auto-activation）的具有提高的活性的FVIIa变体，省略步骤2和/或步骤3以阻止蛋白水解降解。纯化的蛋白在-80℃储存。蛋白质量通过SDS-PAGE分析评价，和功能分子的浓度通过活性位点滴定或通过下文所述的rpHPLC量化轻链含量来测量。
1988)。简言之，方案包括3个步骤。第1步，将5 mM CaCl2加入条件培养基中和将样品载入亲和柱上。在用10 mM His, 2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.005% Tween 80, pH 6.0广泛洗涤后，结合的蛋白用50 mM His, 15 mM EDTA, 0.005% Tween80, pH 6.0洗脱到(步骤2)阴离子交换柱(Source 15Q, GE Healthcare)。在用20 mM HEPES, 20 mM NaCl, 0.005% Tween80, pH 8.0洗涤后，结合的蛋白用20 mM HEPES, 135 mM NaCl, 10 mM CaCl2,
0.005% Tween80, pH 8.0洗脱到(步骤3) CNBr-Sepharose Fast Flow柱(GE
Healthcare)，根据制造商的说明书，人血浆-衍生的FXa已经以1 mg/ml的密度与该柱偶联。
优化流速以确保基本上完全将纯化的酶原变体激活为活化形式。对于能够在条件培养基中或在阴离子交换柱上自体活化（auto-activation）的具有提高的活性的FVIIa变体，省略步骤2和/或步骤3以阻止蛋白水解降解。纯化的蛋白在-80℃储存。蛋白质量通过SDS-PAGE分析评价，和功能分子的浓度通过活性位点滴定或通过下文所述的rpHPLC量化轻链含量来测量。
[0317] 通过活性位点滴定测量FVIIa变体浓度基本上按它处所述(Bock P.E., 1992. J. Biol. Chem. 267. 14963-14973)，根据在用亚化学计量水平的d-Phe-Phe-Arg-氯甲基甲酮(FFR-cmk; Bachem)滴定时酰胺分解活性的不可逆损失，在纯化的制备物中功能性分子的浓度通过活性位点滴定来测定。简言之，所有蛋白在测定缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2. 1 mg/mL BSA和0.1% w/v PEG8000)中稀释。在96-孔板中，终浓度为150 nM的FVIIa变体与500 nM的可溶性组织因子(sTF)一起预孵育10分钟，接着加入终浓度为0-300 nM的FFR-cmk (n=2)，总反应体积为100 µL。将反应物在室温下孵育过夜。在另一96-孔板中，将20 µL的各反应物在含有1 mM S-2288 (Chromogenix, Milano, Italy)的测定缓冲液中稀释10倍。在装配有SOFTmax PRO软件的Spectramax 190微板分光光度计中在405 nM处持续测量吸光度增加10分钟。酰胺分解活性报告为在扣除空白后线性发展曲线的斜率。活性位点浓度作为完全废除酰胺分解活性所需的FFR-cmk的最小浓度通过外推法测定。
[0318] 使用反相HPLC根据轻链含量测量FVIIa变体浓度 – 在替代的方法中，在纯化的制备物中功能性FVIIa分子的浓度通过反相HPLC (rpHPLC)量化FVIIa轻链(LC)含量来测定。用野生型FVIIa的校准曲线使用范围为0-3 µM的FVIIa浓度制备，同时未知浓度的样品以
1.5 µM的估计浓度制备(n=2)。所有样品使用0.5 M三(2-羧乙基)膦(TCEP; Calbiochem/Merck KGaA, Darmstadt, Germany)和甲酸的1:1混合物(加入样品至浓度为20% (v/v))，接着在70℃加热样品10分钟而还原。将还原的FVIIa变体载入保持在30℃的C4柱(Vydac.
300 Å, 粒径5 µM, 4.6 mm, 250 mm)。移动相由含0.09% TFA的水(溶剂A)和含0.085% TFA的乙腈(溶剂B)组成。在注入80 µL样品后，该系统在25%溶剂B中等度运行4分钟，接着25-
46% B的线性梯度10分钟。分别使用280和348 nm的激发和发射波长通过荧光检测峰值。通过峰积分进行轻链量化，和基于野生型FVIIa标准曲线计算FVIIa变体的相对量。
1.5 µM的估计浓度制备(n=2)。所有样品使用0.5 M三(2-羧乙基)膦(TCEP; Calbiochem/Merck KGaA, Darmstadt, Germany)和甲酸的1:1混合物(加入样品至浓度为20% (v/v))，接着在70℃加热样品10分钟而还原。将还原的FVIIa变体载入保持在30℃的C4柱(Vydac.
300 Å, 粒径5 µM, 4.6 mm, 250 mm)。移动相由含0.09% TFA的水(溶剂A)和含0.085% TFA的乙腈(溶剂B)组成。在注入80 µL样品后，该系统在25%溶剂B中等度运行4分钟，接着25-
46% B的线性梯度10分钟。分别使用280和348 nm的激发和发射波长通过荧光检测峰值。通过峰积分进行轻链量化，和基于野生型FVIIa标准曲线计算FVIIa变体的相对量。
[0319] 实施例5 –赋予活性增加的突变的筛选如实施例1，表1中所述，和为评价位置201和288的FVIIa氨基酸的作用，将这些位置进行严格的定点饱和诱变。为了进一步鉴定具有提高的蛋白水解活性的FVIIa变体，还选择其它氨基酸位置305和337进行饱和诱变。简言之，在磷脂囊泡的存在下作为各变体蛋白水解活化大分子底物因子X的能力测量活性(体外蛋白水解测定法)。在辅助因子组织因子(sTF)的存在或不存在下进行各反应，以模拟重组FVIIa的可能的TF依赖性和非依赖性作用机制。
此外，为理解这些置换对抗凝血酶导致的FVIIa抑制的作用，将抗凝血酶抑制在拟-一阶条件下在用以模拟内源肝素-样葡萄糖胺聚糖(GAG)加速体内反应的能力的低分子量肝素的存在下定量化。这些结果概述在表2中。如图2所示，发现测量的体外抗凝血酶反应性与FVIIa-抗凝血酶复合物的体内累积相关，从而确认了该体外筛选程序的预测性。
此外，为理解这些置换对抗凝血酶导致的FVIIa抑制的作用，将抗凝血酶抑制在拟-一阶条件下在用以模拟内源肝素-样葡萄糖胺聚糖(GAG)加速体内反应的能力的低分子量肝素的存在下定量化。这些结果概述在表2中。如图2所示，发现测量的体外抗凝血酶反应性与FVIIa-抗凝血酶复合物的体内累积相关，从而确认了该体外筛选程序的预测性。
[0320] 表2：选择的氨基酸位置的饱和诱变。结果表示为野生型FVIIa的百分比(%)。
[0321] 在位置201上包括谷氨酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸的氨基酸，对于获得在磷脂的存在下对作为底物的FX的蛋白水解活性是必需的。W201R提供在磷脂的存在下和在sTF的缺失或存在下蛋白水解活性的最大获益。另一方面，与FVIIa WT相比，包括苯丙氨酸、亮氨酸和天冬酰胺的氨基酸降低蛋白水解活性。在位置288的情况下，丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸提供在磷脂的存在下对作为底物的FX的蛋白水解活性的获益。L288F和L288Y提供在磷脂的存在下蛋白水解活性的最大获益。表2中呈现的数据证实了先验（a priori）预测蛋白水解活性和抗凝血酶反应性的挑战。因此，调整我们使用饱和诱变的方法以探索在FVIIa变体中不同氨基酸造成的活性影响的所有组成部分。
[0322] 使用因子X作为底物测量蛋白水解活性(体外蛋白水解测定法) – FVIIa变体的蛋白水解活性使用血浆-衍生的因子X (FX)作为底物进行评价。将所有蛋白在50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA和0.1% w/v PEG8000中稀释。相对蛋白水解活性，通过在25 µM 75:25磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸(PC:PS)磷脂(Haematologic technologies, Vermont, USA)存在时在室温下以总反应体积100 µL在96-孔板中用40 nM FX孵育1-10 nM的各FVIIa缀合物30分钟进行测定(n = 2)。在室温下以总反应体积100 µL，通过在25 µM PC:PS磷脂存在下用30 nM FX孵育5 pM的各FVIIa缀合物20分钟，测定在sTF存在下的FX激活(n = 2)。在孵育后，通过加入100 µL的含1 mM S-2765 (Chromogenix, Milano, Italy)的终止缓冲液(50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 80 mM EDTA)淬灭反应。淬灭后立即在Envision微板阅读器(PerkinElmer, Waltham, MA)中持续测量在405 nM处的吸光度增加。所有的添加、孵育和移板通过与Envision微板阅读器在线连接的Hamilton Microlab Star自动机械(Hamilton, Bonaduz, Switzeland)进行。表观催化速度值(kcat/Km)通过将数据拟合至简单形式的Michaelis Menten方程(v = kcat * [S] * [E] / Km)使用线性回归进行评价，这是因为FX底物浓度([S])低于激活反应的Km。产生的FXa的量根据在相同条件下用人血浆-衍生的FXa制备的标准曲线评价。在根据使用的FVIIa变体的浓度对测量的FXa产生速率进行标准化后，相对于野生型FVIIa报告估计的kcat/Km值。结果在表1、表2、表3和表7中给出。
[0323] 测量抗凝血酶导致的FVIIa抑制– 在拟-一阶条件下在低分子量(LMW)肝素(Calbiochem/Merck KGaA, Darmstadt, Germany)的存在下，使用间断方法来测量由人血浆-衍生的抗凝血酶(AT)导致的体外抑制速率。在96-孔板中使用含有50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA和0.1% w/v PEG8000的缓冲液以总反应体积200 µL进行该测定法。向200 nM FVIIa和12 µM LMW肝素的混合物中加入5 µM抗凝血酶，总反应体积为100 µL。在不同的时间，通过转移20 µL的反应混合物至含有180 µL的sTF (200 nM)、聚凝胺(0.5 mg/mL; 溴化己二甲铵, Sigma-Aldrich)和S-2288 (1 mM)的另一微量滴定板淬灭反应。在不同的时间转移后立即在Envision微板阅读器中在405 nm处监测底物裂解10分钟。通过将数据非线性最小二乘方拟合至指数衰变函数获得拟-一阶速率常数(kobs)，和二阶速率常数(k)根据以下关系k = kobs/[AT]获得。所有的添加、孵育和移板通过与Envision微板阅读器(PerkinElmer, Waltham, MA)在线连接的Hamilton Microlab Star自动机械(Hamilton, Bonaduz, Switzeland)进行。抑制速率相对于野生型FVIIa报告。结果在表2、表3和表7给出。
[0324] 实施例6 –将赋予增加的活性和抗凝血酶抗性的FVIIa突变组合为了设计具有高的蛋白水解活性和抗凝血酶抗性的FVIIa变体，将经鉴定的提高FVIIa蛋白水解活性的变体的选择与赋予抗凝血酶抗性的FVIIa变体组合。具体地，制备具有位置
293和201、288、305、337、176和/或286的置换的FVIIa组合变体。使用实施例5中描述的体外蛋白水解和抗凝血酶抑制测定法的组合FVIIa纯化蛋白制备物的表征概述于表3。
293和201、288、305、337、176和/或286的置换的FVIIa组合变体。使用实施例5中描述的体外蛋白水解和抗凝血酶抑制测定法的组合FVIIa纯化蛋白制备物的表征概述于表3。
[0325] 表3显示，一些组合产生显示所需的高活性同时具有所需的低抗凝血酶反应性的FVIIa变体。例如，与野生型FVIIa相比，FVIIa变体L288F T293K显示在磷脂的存在下600%蛋白水解活性和在低-分子量肝素的存在下仅6%抗凝血酶反应性。同样地，与野生型FVIIa相比，FVIIa变体L288Y T293K显示在磷脂的存在下447,8%蛋白水解活性和在低-分子量肝素的存在下仅5,8%抗凝血酶反应性。此外，与野生型FVIIa相比，W201R T293K显示在磷脂的存在下609%蛋白水解活性和在低-分子量肝素的存在下仅9%抗凝血酶反应性。
[0326] 令人感兴趣的是，组合两个FVIIa突变L288F和K337A提供极度提高的活性，与野生型FVIIa相比，测量蛋白水解活性增加2646%。在进一步共引入突变T293K后，提高的活性得到保留，同时获得低的抗凝血酶反应性。与野生型FVIIa相比，该变体显示在磷脂的存在下1310%蛋白水解活性和在低-分子量肝素的存在下仅17%抗凝血酶反应性。
[0327] 总之，可得出结论，T293K、T293R和T293Y突变当与W201R或L288F组合时，与野生型FVIIa相比有效降低抗凝血酶反应性，同时与野生型FVIIa相比提供较高的蛋白水解活性。
[0328] 表3：FVIIa组合变体的蛋白水解活性和抗凝血酶反应性。结果显示为野生型FVIIa的百分比(%)。
[0329] 实施例7 – FVIIa效力和血浆水平的评价使用市售的FVIIa特异性凝固测定法，来自Diagnostica Stago的STACLOT®VIIa-rTF评价效力。该测定法基于J. H. Morrissey等Blood. 81:734-744 (1993)中公开的方法。它测量在FVII缺乏的血浆中在磷脂的存在下sTF起始的FVIIa活性-依赖性的纤维蛋白凝块形成的时间。凝固时间在ACL9000 (ILS)凝固仪器上测量和基于FVIIa校准曲线以双对数标度使用线性回归计算结果。使用相同的测定法测量来自动物PK研究的血浆样品中的FVIIa凝固活性。评价血浆中的量化下限(LLOQ)为0.25 U/ml。使用比活性将血浆活性水平转化成nM。
[0330] 实施例8 – FVIIa变体的结晶学分析为探索鉴定的置换影响蛋白水解活性和抗凝血酶识别的机制，测定了代表性的FVIIa变体L288Y T293K、L288F T293K、W201R T293K、W201R T293Y和L288F T293K K337A的晶体结构。
[0331] 当在三维水平上比较结构时，与可溶性组织因子复合的野生型(WT) FVIIa的1DAN结构[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 41-46]具有根据SEQ ID NO: 1的编号方案重编号的FVIIa的其重链残基。
[0332] 纯化的H-D-Phe-Phe-Arg氯甲基甲酮(FFR-cmk; Bachem, Switzerland)活性位点抑制的与可溶性组织因子复合的FVIIa变体(片段1-219)按照[Kirchhofer, D.等, Proteins Structure Function and Genetics, (1995), Vol. 22, pages 419-425]使用悬滴方法结晶。蛋白缓冲溶液是10 mM Tris于25℃ pH 7.5, 100 mM NaCl, 15 mM CaCl2的混合物。用于FVIIa变体的蛋白浓度以及沉淀剂溶液和混合条件显示在表4中。利用悬滴方法，使用24-孔VDX-板和1.0ml的孔溶液。液滴用1.5 µl的蛋白溶液和0.5 µl的孔溶液的混合物产生（set up）。使用刻痕(streak)引晶技术以启动核化过程。
[0333] 冷冻条件显示在表4中。将晶体浸泡在冷冻溶液中大约30秒，之后将晶体转移至液氮中并在其中快速冷冻。结晶学数据通过XDS数据归约（reduction）软件处理[Kirchhofer, D.等, Proteins Structure Function and Genetics, (1995), Vol. 22, pages 419-425]使用Karplus等[Karplus, P. A.等, Science (New York, N.Y.), (2012), Vol.
336, 第1030-1033页]所述的分辨率截止(cut-off)。
336, 第1030-1033页]所述的分辨率截止(cut-off)。
[0334] 表4：FVIIa变体的结晶和冷冻条件基于自蛋白数据库(PDB) [Berman, H. M.等,Nucleic Acids Res., (2000), Vol.
28, 第235-242页]的1DAN条目的结晶学坐标[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol.
380, 第41-46页]，内部产生的坐标(未公布)用作phenix.phaser中的分子置换计算的起始模型[Mccoy, A. J.等, J.Appl.Crystallogr., (2007), Vol. 40, 第658-674页]或用PHENIX软件包[Adams, P. D.等, Acta Cryst.D, (2010), Vol. 66, 第213-221页]的phenix.refine软件[Afonine, P. V.等, Acta Crystallogr.Sect.D-
Biol.Crystallogr., (2012), Vol. 68, 第352-367页]直接进入精修。精修后在计算机制图软件COOT [Emsley, P.等, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2010), Vol. 66, 第486-501页]中进行相互作用模型校正。5个FVIIa变体的结晶学数据、精修和模型统计显示在表5中。
28, 第235-242页]的1DAN条目的结晶学坐标[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol.
380, 第41-46页]，内部产生的坐标(未公布)用作phenix.phaser中的分子置换计算的起始模型[Mccoy, A. J.等, J.Appl.Crystallogr., (2007), Vol. 40, 第658-674页]或用PHENIX软件包[Adams, P. D.等, Acta Cryst.D, (2010), Vol. 66, 第213-221页]的phenix.refine软件[Afonine, P. V.等, Acta Crystallogr.Sect.D-
Biol.Crystallogr., (2012), Vol. 68, 第352-367页]直接进入精修。精修后在计算机制图软件COOT [Emsley, P.等, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2010), Vol. 66, 第486-501页]中进行相互作用模型校正。5个FVIIa变体的结晶学数据、精修和模型统计显示在表5中。
[0335] 表5：数据采集、精修和模型统计。最高分辨率壳(shell)的统计显示在括号中。
[0336] 三维结构分析总体上，在野生型(WT) FVIIa分子1DAN结构[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 第41-46页]和FVIIa变体的结构之间没有主要差别。在1DAN FVIIa重链和L288Y T293K、L288F T293K、W201R T293K、W201R T293Y和L288F T293K K337A FVIIa变体之间的通过gesamt [Krissinel, E., Journal of Molecular Biochemistry, (2012), Vol. 1, 第76-85页]计算的总体均方根偏差(RMSD)分别为0.424、0.365、0.451、0.342和0.289 Å。在计算中使用的Cα-原子配对数分别是254、254、251、254和254。
[0337] W201R T293Y FVIIa变体突变FVIIa W201R：
在详细水平上，双突变体的重链FVIIa Arg 201残基位于“60-环” (糜蛋白酶编号)中。
在以1.0 σ为截止的似然加权的2mFo-DFc电子密度图中，存在主链环伸展的指示，而对于Arg 201残基(在野生型FVIIa中为Trp残基)的侧链以及前和后的残基(分别为Asn和Arg残基)的侧链，其不可见。这表明这些侧链的高度柔韧性。为帮助结构解析，使用来自CCP4软件程序包的软件[Collaborative Computational Project, N. Acta crystallographica, Section D, Biological crystallography, 1994, 50, 760-763]，在自内部野生型蛋白晶体观察的结构因素和自FVIIa双突变体观察的结构因素之间计算差异电子密度图[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]。使用来自野生型数据或双突变体数据的相位，得到类似的差异图。在差异图的正侧，来自野生型FVIIa的Trp残基的侧链可清楚可见(在5.6 σ水平的最大峰，使用来自野生型数据的相位)，而在差异图的负侧不存在Arg侧链的清楚的指示。这也表明Arg残基比野生型蛋白的Trp残基更柔韧。然而，应注意，使用似然加权的2mFo-DFc电子密度图，在Trp残基之前和之后的无一侧链可在1DAN结构中清楚见到，这类似于来自FVIIa W201R T293Y/sTF晶体结构的结果，而Trp 201的位置在FVIIa WT结构中清楚可见。
在详细水平上，双突变体的重链FVIIa Arg 201残基位于“60-环” (糜蛋白酶编号)中。
在以1.0 σ为截止的似然加权的2mFo-DFc电子密度图中，存在主链环伸展的指示，而对于Arg 201残基(在野生型FVIIa中为Trp残基)的侧链以及前和后的残基(分别为Asn和Arg残基)的侧链，其不可见。这表明这些侧链的高度柔韧性。为帮助结构解析，使用来自CCP4软件程序包的软件[Collaborative Computational Project, N. Acta crystallographica, Section D, Biological crystallography, 1994, 50, 760-763]，在自内部野生型蛋白晶体观察的结构因素和自FVIIa双突变体观察的结构因素之间计算差异电子密度图[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]。使用来自野生型数据或双突变体数据的相位，得到类似的差异图。在差异图的正侧，来自野生型FVIIa的Trp残基的侧链可清楚可见(在5.6 σ水平的最大峰，使用来自野生型数据的相位)，而在差异图的负侧不存在Arg侧链的清楚的指示。这也表明Arg残基比野生型蛋白的Trp残基更柔韧。然而，应注意，使用似然加权的2mFo-DFc电子密度图，在Trp残基之前和之后的无一侧链可在1DAN结构中清楚见到，这类似于来自FVIIa W201R T293Y/sTF晶体结构的结果，而Trp 201的位置在FVIIa WT结构中清楚可见。
[0338] 关于研究的环的主链定向，相对于公开的1DAN结构[Banner. D. W.,等, Nature, 1996, 380, 41-46]，似然加权的2mFo-DFc电子密度图和phenix.refine精修将200、201和
202残基放置在更接近置换的Trp侧链残基的位置。具体而言，残基Asn 200已经移动，和其Cα位置距其在野生型结构图3中的位置3.1 Å。此外，在描述的[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]差异图中，存在指示残基Asn 200的这样的移动的峰。接近野生型环构象的位置的一个5.7 σ正峰和轻微在精修的双突变体构象的内部的另一4.3 σ负峰。
这支持了主链已经向更接近WT Trp侧链的位置和相对更朝向FVIIa重链的中心移动。
202残基放置在更接近置换的Trp侧链残基的位置。具体而言，残基Asn 200已经移动，和其Cα位置距其在野生型结构图3中的位置3.1 Å。此外，在描述的[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]差异图中，存在指示残基Asn 200的这样的移动的峰。接近野生型环构象的位置的一个5.7 σ正峰和轻微在精修的双突变体构象的内部的另一4.3 σ负峰。
这支持了主链已经向更接近WT Trp侧链的位置和相对更朝向FVIIa重链的中心移动。
[0339] 对于重链FVIIa的残基200、201和202，在野生型结构和双突变蛋白之间见到的结构差异可能取决于由在WT结构中向内指向的Trp 201残基侧链导致的稳定作用，其在FVIIa蛋白中填充了主要疏水体积和从而锚定在野生型结构中的环。在FVIIa W201R T293Y中相应的残基Arg的侧链不形成具有紧密结合的侧链的同样的刚性结构，而是更加柔韧，因此不以与WT FVIIa结构相同的方式锚定环。
[0340] 图3显示比较两种晶体结构的棍状图示：1) 具有浅色碳原子，与组织因子复合的FVIIa野生型蛋白，使用来自与PDB结构1DAN [Banner. D. W.,等, Nature, 1996, 380, 41-46]相同类型的晶体的内部数据集；和2) 具有深色碳原子，与组织因子复合的FVIIa双突变体W201R T293Y。一些残基用氨基酸单字母代码标记，和对于1)和2)，末端分别标有“-wt”或“-m”。数个侧链已被截短(Cβ之外的原子已被除去)，因为似然加权的2mFo-DFc电子密度图未显示那些侧链的任何电子密度。例如FVIIa双突变体W201R T293Y的残基N200、R201和R202因该原因而都被截短。该图通过分子作图软件PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System. Version 1.6.0.0 Schrödinger, LLC]制作。
[0341] 突变FVIIa T293Y：重链FVIIa Tyr 293残基位于活化环1中。以1.0 σ截止的似然加权的2mFo-DFc电子密度图清楚显示在精修的结构中Tyr残基的主链和侧链。Tyr侧链原子Cβ-Cγ遵循与野生型Thr残基中的Cβ-Cγ2原子相同的方向。对于双突变体和WT形式的FVIIa残基293，C-Cα-Cβ-Cγ和C-Cα-Cβ-Cγ2二面角分别是165和173°。因此，双突变体的Tyr 293残基指导其侧链在催化结构域的方向和朝向FFR-cmk结合抑制物的结合位点。计算的[Fobs(WT FVIIa/sTF)-Fobs(FVIIa W201R T293Y/sTF)]差异图证实了Tyr侧链的取向，具有在Tyr环系处的负峰(4.7 σ高)和在失去的Thr Oγ1原子处的正峰(4.2 σ高)。
[0342] 为了研究在抗凝血酶和FVIIa突变的T293Y分子之间可能的相互作用，在FVIIa双突变体上制作因子Xa分子复合物与抗凝血酶 (PDB-代码2GD4)的叠印[Johnson. D. J. D.,等, Embo J., 2006, 25, 2029-2037]。分子制图软件PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.6.0.0 Schrödinger, LLC]用于FXa和FVIIa分子的叠印，和产生针对1194个原子的0.769 Å的RMSD。根据该骑式(riding)抗凝血酶分子模型，然后清楚的是，在产生的理论分子复合物(FVIIa W201R T293Y/抗凝血酶III)中FVIIa W201R T293Y突变体的Tyr 293残基与，特别是，抗凝血酶分子图4的残基Leu 395还有Arg 399形成空间重叠。这在FVIIa双突变体的Tyr 293和骑式抗凝血酶分子之间，在CCP4程序套件的接触软件（contacts software）中进行的间距计算得到证实。在突变体FVIIa分子的Tyr 293残基和抗凝血酶分子之间使用截止间距3.5 Å，和结果显示在表6中。在表6中概述了在来自抗凝血酶-S195A FXa-戊糖复合物PDB:2GD4 [Johnson. D. J. D.,等, Embo J., 2006, 25, 2029-2037]的FVIIa W201R T293Y双突变体的残基Tyr 293和抗凝血酶之间的所有间距，
3.5 Å或更短，其在FXa复合物已被叠印在FVIIa突变体(W201R T293Y)/sTF结构上后使用FVIIa (W201R T293Y)和FXa作为共同分子。空间重叠将最可能对抗凝血酶将其反应中心环(RCL)放置在FVIIa的活性位点中的可能性产生负面影响。因此，T293Y突变的FVIIa分子将对抗凝血酶导致的抑制较不易感。这与实验观察到的显示对抗凝血酶导致的失活的抗性增加和延长的半寿期一致，并对其作出了解释。
3.5 Å或更短，其在FXa复合物已被叠印在FVIIa突变体(W201R T293Y)/sTF结构上后使用FVIIa (W201R T293Y)和FXa作为共同分子。空间重叠将最可能对抗凝血酶将其反应中心环(RCL)放置在FVIIa的活性位点中的可能性产生负面影响。因此，T293Y突变的FVIIa分子将对抗凝血酶导致的抑制较不易感。这与实验观察到的显示对抗凝血酶导致的失活的抗性增加和延长的半寿期一致，并对其作出了解释。
[0343] 图4是在抗凝血酶(以浅色碳原子表示)和FVIIa W201R T293Y双突变体(以深色碳原子表示)之间复合物的理论模型的棍状图示。FVIIa突变体W201R T293Y的残基Tyr 293、Gln 255、Lys 341、Gln 286的相对位置和对于抗凝血酶分子残基Leu 395、Arg 399、Glu 295、Tyr 253和V317显示和标记。模型基于抗凝血酶/FXa复合物[Johnson. D. J. D.,等, Embo J., 2006, 25, 2029-2037], PDB代码2GD4的结构构建，其中具有抗凝血酶骑乘（let riding）的FXa分子叠印在FVIIa W201R T293Y变体分子的重链上。FVIIa W201R T293Y和抗凝血酶的残基分别具有前缀“FVIIa”和“AT”，接着是单字母氨基酸代码和残基号。该图通过分子作图软件PyMOL [The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.6.0.0 Schrödinger, LLC]制作。
[0344] 表6：在两个分子之间所述的理论模型中，在FVIIa (W201R T293Y)双突变体的残基Tyr 293和抗凝血酶氨基酸之间所有间距，3.5 Å或更短。
[0345] W201R T293K FVIIa变体FVIIa的残基201周围的区域：在详细水平上，双突变体的重链FVIIa Arg 201残基位于“60-环” (糜蛋白酶编号)中。在以1.0 σ截止的似然加权的2mFo-DFc电子密度图中，主链环伸展清楚可见。Arg 201残基(野生型FVIIa的Trp残基)的侧链也清楚可见。然而，Arg 202残基的外侧部分胍鎓基团，在似然加权的2mFo-DFc电子密度图中和以所选的截止，丢失了电子密度，这指示较高的移动性或混乱。关于研究的环(“60-环”)的主链取向，显示在W201R T293K和1DAN结构[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 第41-46页]之间转化。在叠印两个结构后观察到，当沿多肽从残基197移动至203时，在相等的Cα位置处分别存在0.64、2.48、3.63、6.41、4.15和0.81 Å的差异。环的主链已经向更接近1DAN WT Trp侧链位置[Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 第41-46页]中的位置移动，和还朝向FVIIa重链的中心(催化结构域)移动。W201R T293K FVIIa的Arg 201残基在叠印的结构中位于朝向公开的1DAN结构的置换的WT Trp侧链残基的位置。
[0346] 在重链“60-环”的野生型结构和W201R T293K FVIIa变体之间见到的结构差异有可能取决于在WT结构中向内指向的Trp 201残基侧链导致的稳定作用，其填充FVIIa蛋白中主要的疏水体积和因此锚定野生型结构中的环。在FVIIa W201R T293K中相应的较小残基Arg的侧链不以与WT FVIIa结构中的Trp相同的方式锚定环。
[0347] FVIIa的残基293周围的区域：重链FVIIa Lys 293残基位于活化环1中。以1.0 σ截止的似然加权的2mFo-DFc电子密度图清楚显示在精修的结构中的Lys残基的主链和侧链。Lys侧链原子Cβ-Cγ遵循与野生型Thr残基的Cβ-Cγ2原子相同的方向。对于双突变体和WT形式的FVIIa残基293，C-Cα-Cβ-Cγ和C-Cα-Cβ-Cγ2二面角分别是169和173°。Lys 293显示“mttt”旋转异构体取向，这是Lys的最常见的旋转异构体取向[Lovell, S. C.等, Proteins, (2000), Vol. 40, 第389-408页]，如通过计算机作图软件COOT [Emsley, P.等, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2010), Vol. 66, 第486-501页]所见的。此外，W201R T293K FVIIa变体的Lys 293残基Nζ原子与残基Gln 176 Oε1原子形成间距2.68 Å的强的氢键，从而稳定这两个侧链。与WT FVIIa 1DAN结构相比，Gln 176残基因此改变了其侧链构象，以优化其与W201R T293K FVIIa变体的Lys 293残基形成的氢键。旋转异构体从WT结构的“tt0°”构象变成不是描述于[Lovell, S. C.等, Proteins, (2000), Vol. 40, 第389-408页]中的标准构象中的旋转异构体构象。因此，双突变体的Lys 293残基指导其侧链在催化结构域的方向和朝向FFR-cmk结合抑制物的结合位点，和填入裂开的FVIIa活性位点的主要位点。
[0348] L288Y T293K FVIIa变体FVIIa的残基288周围的区域：
该区域清楚可见在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中。在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体的重链中在Tyr 288残基之后的环中的残基，残基289至
292，显示主链构象的变化，最大的差异在残基Arg 290上，其中在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体和FVIIa的WT结构1DAN [Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 第
41-46页]的叠印分子之间Cα原子差异2.87 Å。Tyr 288残基的Cα原子与在叠印的WT FVIIa中的Leu 288残基的等同原子显示0.80 Å差异。在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体中的Tyr
288的侧链旋转异构体是“p90°”，而WT FVIIa 1DAN结构的Ley侧链旋转异构体显示“mt”旋转异构体[Lovell, S. C.等, Proteins, (2000), Vol. 40, 第389-408页]。这产生在不同方向上的两个等同的侧链点，其在C-Cα-Cβ-Cγ二面角的差异中观察到，对于L288Y T293K FVIIa变体和WT FVIIa分别为-69°和157°。L288Y T293K FVIIa变体中Tyr 288侧链的羟基有利地与在晶体结构中有序的（ordered）周围水分子相互作用，和侧链在FVIIa L288Y T293K变体的Tyr 288之后的环外折叠(fold over)。残基288之后环的结构主链改变和残基
288自身的突变可能至少部分地解释该FVIIa变体所见到的活性改进。
该区域清楚可见在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中。在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体的重链中在Tyr 288残基之后的环中的残基，残基289至
292，显示主链构象的变化，最大的差异在残基Arg 290上，其中在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体和FVIIa的WT结构1DAN [Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol. 380, 第
41-46页]的叠印分子之间Cα原子差异2.87 Å。Tyr 288残基的Cα原子与在叠印的WT FVIIa中的Leu 288残基的等同原子显示0.80 Å差异。在FVIIa L288Y T293K FVIIa变体中的Tyr
288的侧链旋转异构体是“p90°”，而WT FVIIa 1DAN结构的Ley侧链旋转异构体显示“mt”旋转异构体[Lovell, S. C.等, Proteins, (2000), Vol. 40, 第389-408页]。这产生在不同方向上的两个等同的侧链点，其在C-Cα-Cβ-Cγ二面角的差异中观察到，对于L288Y T293K FVIIa变体和WT FVIIa分别为-69°和157°。L288Y T293K FVIIa变体中Tyr 288侧链的羟基有利地与在晶体结构中有序的（ordered）周围水分子相互作用，和侧链在FVIIa L288Y T293K变体的Tyr 288之后的环外折叠(fold over)。残基288之后环的结构主链改变和残基
288自身的突变可能至少部分地解释该FVIIa变体所见到的活性改进。
[0349] FVIIa的残基293周围的区域：该残基和与其接触的其它残基的3D结构高度类似于针对W201R T293K FVIIa变体所述的3D结构。因此，对该变体的T293K突变得出的所有结论也适用于L288Y T293K FVIIa变体的T293K突变。
[0350] L288F T293K FVIIa变体FVIIa的残基288周围的区域：
该区域在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中清楚可见。该区域的3D结构高度类似于L288F T293K FVIIa变体。例如，这两个变体享有相同的主链取向。
在这两个FVIIa变体之间差异的一个方面是Phe 288侧链具有另一优选的对其侧链的旋转异构体(“m-85°”)，事实上指向与WT FVIIa的Leu 288侧链相同的取向。L288F T293K FVIIa变体的Phe 288侧链的不寻常性质是对于Phe残基，其不寻常地暴露(145 Å2，根据通过CCP4结晶学程序套件的AREAIMOL的计算[Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-
Biol.Crystallogr., (1994), Vol. 50, 第760-763页])于周围的溶剂。
该区域在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中清楚可见。该区域的3D结构高度类似于L288F T293K FVIIa变体。例如，这两个变体享有相同的主链取向。
在这两个FVIIa变体之间差异的一个方面是Phe 288侧链具有另一优选的对其侧链的旋转异构体(“m-85°”)，事实上指向与WT FVIIa的Leu 288侧链相同的取向。L288F T293K FVIIa变体的Phe 288侧链的不寻常性质是对于Phe残基，其不寻常地暴露(145 Å2，根据通过CCP4结晶学程序套件的AREAIMOL的计算[Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-
Biol.Crystallogr., (1994), Vol. 50, 第760-763页])于周围的溶剂。
[0351] FVIIa的残基293周围的区域：该残基和与其接触的其它残基的3D结构高度类似于对W201R T293K FVIIa变体所述的
3D结构。因此，对该变体的T293K突变得出的所有结论也适用于L288F T293K FVIIa变体的T293K突变。
3D结构。因此，对该变体的T293K突变得出的所有结论也适用于L288F T293K FVIIa变体的T293K突变。
[0352] L288F T293K K337A FVIIa变体FVIIa的残基288周围的区域：
该区域在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中清楚见到。该区域的3D结构高度类似于L288F T293K FVIIa变体。例如，这两个变体享有相同的主链取向。
在这两个FVIIa变体之间差异的一个方面是Phe 288侧链具有另一优选的对其侧链的旋转异构体(“m-85°”)，事实上指向与WT FVIIa和L288F T293K FVIIa变体的Leu 288侧链相同的取向。因此，对该变体的L288F突变得出的所有结论也适用于L288F T293K K337A FVIIa变体的L288F突变。
该区域在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中清楚见到。该区域的3D结构高度类似于L288F T293K FVIIa变体。例如，这两个变体享有相同的主链取向。
在这两个FVIIa变体之间差异的一个方面是Phe 288侧链具有另一优选的对其侧链的旋转异构体(“m-85°”)，事实上指向与WT FVIIa和L288F T293K FVIIa变体的Leu 288侧链相同的取向。因此，对该变体的L288F突变得出的所有结论也适用于L288F T293K K337A FVIIa变体的L288F突变。
[0353] FVIIa的残基293周围的区域：该残基和与其接触的其它残基的3D结构高度类似于对W201R T293K FVIIa变体所述的3D结构。因此，对该变体的T293K突变得出的所有结论也适用于L288F T293K K337AFVIIa变体的T293K突变。
[0354] FVIIa的残基337周围的区域：该区域在以1.0 σ截止的晶体结构似然加权的2mFo-DFc电子密度图中清楚可见。该区域的3D结构类似于FVIIa的WT结构，1DAN [Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol.
380, 第41-46页]和本实施例的其它FVIIa变体。总体的主链和侧链取向接近WT FVIIa
1DAN结构和其它FVIIa变体结构，然而存在小的差异，略微大于基于phenix.refine最大-可能性的计算，其晶体结构具有0.40 Å的坐标误差。残基337的等同Cβ原子在FVIIa的WT结构
1DAN和L288F T293K K337A FVIIa变体中相距0.8 Å。相同残基的Cα原子相距0.4 Å。在叠印的FVIIa的WT结构1DAN和L288F T293K K337A FVIIa变体中残基336的等同Cα原子相距0.6 Å。对于Phe 332残基，与FVIIa的WT结构1DAN [Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol.
380, 第41-46页]相比，侧链向L288F T293K K337AFVIIa变体的Ala 337残基移动大约0.5 Å。还可得出结论，本实施例的其它FVIIa变体显示与FVIIa的WT结构1DAN向L288F T293K K337A FVIIa变体的大致相同偏移。此外，与L288F T293K K337AFVIIa变体相比，其它FVIIa变体簇更接近WT FVIIa 1DAN结构。这可能至少部分上解释了该变体改变的性质。
380, 第41-46页]和本实施例的其它FVIIa变体。总体的主链和侧链取向接近WT FVIIa
1DAN结构和其它FVIIa变体结构，然而存在小的差异，略微大于基于phenix.refine最大-可能性的计算，其晶体结构具有0.40 Å的坐标误差。残基337的等同Cβ原子在FVIIa的WT结构
1DAN和L288F T293K K337A FVIIa变体中相距0.8 Å。相同残基的Cα原子相距0.4 Å。在叠印的FVIIa的WT结构1DAN和L288F T293K K337A FVIIa变体中残基336的等同Cα原子相距0.6 Å。对于Phe 332残基，与FVIIa的WT结构1DAN [Banner, D. W.等, Nature, (1996), Vol.
380, 第41-46页]相比，侧链向L288F T293K K337AFVIIa变体的Ala 337残基移动大约0.5 Å。还可得出结论，本实施例的其它FVIIa变体显示与FVIIa的WT结构1DAN向L288F T293K K337A FVIIa变体的大致相同偏移。此外，与L288F T293K K337AFVIIa变体相比，其它FVIIa变体簇更接近WT FVIIa 1DAN结构。这可能至少部分上解释了该变体改变的性质。
[0355] 实施例9-14 – FVIIa变体的化学修饰实施例9-14中使用的缩写：
AUS: 产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶
CMP-NAN: 胞苷-5’-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸
CV: 柱体积
GlcUA: 葡萄糖醛酸
GlcNAc: N-乙酰基葡糖胺
GSC: 5’-甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸
GSC-SH: 5’-[(4-巯基丁酰基)甘氨酰]唾液酸胞苷一磷酸
HEP: HEParosan聚合物
HEP-GSC: GSC-官能化heparosan聚合物
HEP-[N]-FVIIa: 经N-聚糖与FVIIa缀合的HEParosan
HEPES: 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
His: 组氨酸
PABA: p-氨基苯甲脒
ST3GalIII N-聚糖特异性的a2,3-唾液酸转移酶
TCEP: 三(2-羧乙基)膦
UDP: 尿苷二磷酸
实施例9-14中使用的定量方法：
通过HPLC分析本发明的缀合物的纯度。还使用HPLC基于FVIIa参考分子定量测定分离的缀合物的量。以非还原或还原形式分析样品。使用Zorbax 300SB-C3柱(4.6x50 mm; 3.5 µm Agilent, Cat. No.: 865973-909)。柱在30℃下操作。注入5 µg样品，和柱用含有0.1%三氟乙酸的水(A) – 乙腈(B)溶剂系统洗脱。梯度程序如下：0 min (25% B)；4 min (25% B)；14 min (46% B)；35 min (52% B)；40 min (90% B)；40.1 min (25% B)。通过加入10 µl TCEP /甲酸溶液(在水中70 mM三(2-羧乙基)膦和10 %甲酸)至25 µl / 30 µg FVIIa (或缀合物)制备还原样品。将反应物在70℃放置10分钟，然后在HPLC上分析它们(5 µl注射液)。
AUS: 产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶
CMP-NAN: 胞苷-5’-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸
CV: 柱体积
GlcUA: 葡萄糖醛酸
GlcNAc: N-乙酰基葡糖胺
GSC: 5’-甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸
GSC-SH: 5’-[(4-巯基丁酰基)甘氨酰]唾液酸胞苷一磷酸
HEP: HEParosan聚合物
HEP-GSC: GSC-官能化heparosan聚合物
HEP-[N]-FVIIa: 经N-聚糖与FVIIa缀合的HEParosan
HEPES: 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
His: 组氨酸
PABA: p-氨基苯甲脒
ST3GalIII N-聚糖特异性的a2,3-唾液酸转移酶
TCEP: 三(2-羧乙基)膦
UDP: 尿苷二磷酸
实施例9-14中使用的定量方法：
通过HPLC分析本发明的缀合物的纯度。还使用HPLC基于FVIIa参考分子定量测定分离的缀合物的量。以非还原或还原形式分析样品。使用Zorbax 300SB-C3柱(4.6x50 mm; 3.5 µm Agilent, Cat. No.: 865973-909)。柱在30℃下操作。注入5 µg样品，和柱用含有0.1%三氟乙酸的水(A) – 乙腈(B)溶剂系统洗脱。梯度程序如下：0 min (25% B)；4 min (25% B)；14 min (46% B)；35 min (52% B)；40 min (90% B)；40.1 min (25% B)。通过加入10 µl TCEP /甲酸溶液(在水中70 mM三(2-羧乙基)膦和10 %甲酸)至25 µl / 30 µg FVIIa (或缀合物)制备还原样品。将反应物在70℃放置10分钟，然后在HPLC上分析它们(5 µl注射液)。
[0356] 用于实施例9-14的起始材料：HEP-马来酰亚胺和HEP-苯甲醛聚合物
确定大小的马来酰亚胺和醛官能化的HEP聚合物通过酶聚合反应制备，如US 2010/
0036001中所述。使用两种糖核苷酸(UDP-GlcNAc 和UDP-GlcUA)和用于起始反应的引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2，和进行聚合直到耗尽糖核苷酸结构块。该方法产生具有单一末端氨基的HEP聚合物。HEP聚合物的大小由糖核苷酸与引发剂的比率决定。末端胺(源自引发剂)然后被马来酰亚胺官能团官能化以缀合至GSC-SH，或被苯甲醛官能团官能化以还原胺化化学至GSC的甘氨酰末端。
确定大小的马来酰亚胺和醛官能化的HEP聚合物通过酶聚合反应制备，如US 2010/
0036001中所述。使用两种糖核苷酸(UDP-GlcNAc 和UDP-GlcUA)和用于起始反应的引发三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2，和进行聚合直到耗尽糖核苷酸结构块。该方法产生具有单一末端氨基的HEP聚合物。HEP聚合物的大小由糖核苷酸与引发剂的比率决定。末端胺(源自引发剂)然后被马来酰亚胺官能团官能化以缀合至GSC-SH，或被苯甲醛官能团官能化以还原胺化化学至GSC的甘氨酰末端。
[0357] HEP-苯甲醛可通过将胺官能化HEP聚合物与过量的N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸(Nano Letters (2007), 7(8), 2207-2210)在中性水溶液中反应制备。苯甲醛官能化聚合物可通过离子交换色谱、分子排阻色谱或HPLC分离。HEP-马来酰亚胺可通过将胺官能化HEP聚合物与过量的N-马来酰亚胺基丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS; Fujiwara, K.,等(1988), J. Immunol. Meth. 112, 77-83)反应制备。
[0358] 苯甲醛或马来酰亚胺官能化聚合物可通过离子交换色谱、分子排阻色谱或HPLC分离。用末端伯胺官能团(HEP-NH2)官能化的任何HEP聚合物可用于本发明的实施例。两个选择显示如下：多糖的非还原末端的末端糖残基可以是N-乙酰基葡糖胺或葡萄糖醛酸(葡萄糖醛酸在上面所绘)。通常，如果等摩尔量的UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA被用于聚合反应，两种糖残基的混合物在非还原末端上是预期的。
[0359] 5’-甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC)：用于本发明的GSC起始材料可经化学合成(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000,
1467-1482)或其可通过化学酶途径获得，如WO07056191中所述。GSC结构显示如下：
实施例9 – 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的制备
步骤1：[(4-巯基丁酰基)甘氨酰]唾液酸胞苷一磷酸(GSC-SH)的合成
将甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(200 mg; 0.318 mmol)溶于水(2 ml)，并加入硫代丁内酯(325 mg; 3.18 mmol)。将该两相溶液在室温下轻轻混合21h。然后反应混合物用水(10 ml)稀释和施用于反相HPLC柱(C18, 50 mm x 200 mm)。柱以流速50 ml/min用如下的水(A)、乙腈(B)和250 mM碳酸氢铵(C)的梯度系统洗脱：0 min (A: 90%, B: 0%, C:10%); 12 min (A: 90%, B: 0%, C:10%); 48 min (A: 70%, B: 20%, C:10%)。收集各流分(20 ml大小)和通过LC-MS分析。合并纯的流分，和缓慢通过短的呈钠形式的Dowex 50W x 2 (100 – 200目)树脂垫，然后冻干成干粉。呈冷冻干粉形式的标题物质的含量然后通过HPLC使用260 nm处的吸光度和甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸作为参考物质测定。对于HPLC分析，使用Waters X-Bridge phenyl柱(5 µm 4.6mm x 250mm)和水乙腈系统(经30 min，0-85%乙腈的线性梯度，含有0.1%磷酸)。收率：61.6 mg (26 %)。LCMS: 732.18 (MH+); 427.14 (MH+-CMP)。当在-80℃下储存时化合物可长期(>12个月)稳定。
1467-1482)或其可通过化学酶途径获得，如WO07056191中所述。GSC结构显示如下：
实施例9 – 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的制备
步骤1：[(4-巯基丁酰基)甘氨酰]唾液酸胞苷一磷酸(GSC-SH)的合成
将甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(200 mg; 0.318 mmol)溶于水(2 ml)，并加入硫代丁内酯(325 mg; 3.18 mmol)。将该两相溶液在室温下轻轻混合21h。然后反应混合物用水(10 ml)稀释和施用于反相HPLC柱(C18, 50 mm x 200 mm)。柱以流速50 ml/min用如下的水(A)、乙腈(B)和250 mM碳酸氢铵(C)的梯度系统洗脱：0 min (A: 90%, B: 0%, C:10%); 12 min (A: 90%, B: 0%, C:10%); 48 min (A: 70%, B: 20%, C:10%)。收集各流分(20 ml大小)和通过LC-MS分析。合并纯的流分，和缓慢通过短的呈钠形式的Dowex 50W x 2 (100 – 200目)树脂垫，然后冻干成干粉。呈冷冻干粉形式的标题物质的含量然后通过HPLC使用260 nm处的吸光度和甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸作为参考物质测定。对于HPLC分析，使用Waters X-Bridge phenyl柱(5 µm 4.6mm x 250mm)和水乙腈系统(经30 min，0-85%乙腈的线性梯度，含有0.1%磷酸)。收率：61.6 mg (26 %)。LCMS: 732.18 (MH+); 427.14 (MH+-CMP)。当在-80℃下储存时化合物可长期(>12个月)稳定。
[0360] 步骤2：具有琥珀酰亚胺连键的38.8 kDa HEP-GSC试剂的合成HEP-GSC试剂通过以1:1摩尔比偶联步骤1的GSC-SH([(4-巯基丁酰基)甘氨酰]唾液酸胞苷一磷酸)与HEP-马来酰亚胺来制备，如下：向溶于50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 (50 µl)的GSC-SH (0.68 mg)加入35 mg的溶于50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0 (1,
35 ml)的38.8k-HEP-马来酰亚胺。澄清溶液在25℃放置2小时。未反应的GSC-SH使用具有
10kD截止的Slide-A-Lyzer套盒(Thermo Scientific)通过透析除去。透析缓冲液是50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0。将反应混合物透析两次2.5小时。回收的物质原样用于下文的步骤4，假定在GSC-SH和HEP-马来酰亚胺之间定量反应。通过该程序制备的HEP-GSC试剂将含有与唾液酸胞苷一磷酸经过琥珀酰亚胺连键连接的HEP聚合物。
35 ml)的38.8k-HEP-马来酰亚胺。澄清溶液在25℃放置2小时。未反应的GSC-SH使用具有
10kD截止的Slide-A-Lyzer套盒(Thermo Scientific)通过透析除去。透析缓冲液是50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0。将反应混合物透析两次2.5小时。回收的物质原样用于下文的步骤4，假定在GSC-SH和HEP-马来酰亚胺之间定量反应。通过该程序制备的HEP-GSC试剂将含有与唾液酸胞苷一磷酸经过琥珀酰亚胺连键连接的HEP聚合物。
[0361] 步骤3：FVIIa L288F T293K的脱唾液酸化作用向FVIIa L288F T293K(30 mg)加入含唾液酸酶(AUS, 100 ul, 20 U)的10 mM His,
100 mM NaCl, 60 mM CaCl2, 10 mM PABA pH 5.9 (10 ml)，和在室温下放置1小时。然后反应混合物用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (30 ml)稀释，和在冰上冷却。将250 mM EDTA溶液(2.6 ml)分成小部分加入，通过加入氢氧化钠保持pH在中性。然后将EDTA处理的样品施用于用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0平衡的
2x5 ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences, GE Healthcare)。未结合的蛋白用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (4 CV)洗脱，接着用50 mM HEPES,
150 mM NaCl, pH 7.0 (8 CV)洗脱，然后用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (20 CV)洗脱脱唾液酸FVIIa L288F T293K。脱唾液酸FVIIa L288F T293K分离在50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0中。收率(19.15 mg)通过在三(2-羧乙基)膦还原后使用反相HPLC针对FVIIa标准品定量FVIIa L288F T293K轻链含量测定。
100 mM NaCl, 60 mM CaCl2, 10 mM PABA pH 5.9 (10 ml)，和在室温下放置1小时。然后反应混合物用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (30 ml)稀释，和在冰上冷却。将250 mM EDTA溶液(2.6 ml)分成小部分加入，通过加入氢氧化钠保持pH在中性。然后将EDTA处理的样品施用于用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0平衡的
2x5 ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences, GE Healthcare)。未结合的蛋白用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 (4 CV)洗脱，接着用50 mM HEPES,
150 mM NaCl, pH 7.0 (8 CV)洗脱，然后用50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (20 CV)洗脱脱唾液酸FVIIa L288F T293K。脱唾液酸FVIIa L288F T293K分离在50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0中。收率(19.15 mg)通过在三(2-羧乙基)膦还原后使用反相HPLC针对FVIIa标准品定量FVIIa L288F T293K轻链含量测定。
[0362] 步骤4：具有琥珀酰亚胺连键的38.8 kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的合成向含脱唾液酸FVIIa L288F T293K(19.2 mg)的50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0 (18.0 ml)中加入含38.8kDa-HEP-GSC (35 mg，来自步骤2)的50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (2.3 ml)，和含大鼠ST3GalIII酶(5 mg; 1.1个单位/mg)的20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 50 %甘油, pH 7,0 (7.2 ml)。将反应混合物在32℃在缓慢搅拌下孵育过夜。然后将反应混合物施用于用Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV = 24 ml)和首先用2柱体积的缓冲液A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4) 然后2柱体积的缓冲液B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上遵循Thim, L等Biochemistry (1988) 27, 7785-779描述的原理。收集具有未折叠的Gla-结构域的产物和直接施用于2x5 ml HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences, GE Healthcare)。柱用10 mM His,
100 mM NaCl, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3柱体积)和10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3.5柱体积)洗涤。然后用10 mM His, 100 mM NaCl,
10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0 (3柱体积)降低pH至6.0，和HEP化的物质用5柱体积的包含60%缓冲液A (10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH
6.0)和40%缓冲液B (10 mM His, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0)的缓冲液混合物洗脱。回收的脱唾液酸FVIIa L288F T293K (未修饰)再循环，即再次如步骤4所述的经HEP化，和以如刚才所述的相同方式纯化。汇集自两次hep化运行合并的流分和通过超滤(Millipore Amicon Ultra，截止10kD)浓缩。
100 mM NaCl, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3柱体积)和10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 7.5 (3.5柱体积)洗涤。然后用10 mM His, 100 mM NaCl,
10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0 (3柱体积)降低pH至6.0，和HEP化的物质用5柱体积的包含60%缓冲液A (10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH
6.0)和40%缓冲液B (10 mM His, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0)的缓冲液混合物洗脱。回收的脱唾液酸FVIIa L288F T293K (未修饰)再循环，即再次如步骤4所述的经HEP化，和以如刚才所述的相同方式纯化。汇集自两次hep化运行合并的流分和通过超滤(Millipore Amicon Ultra，截止10kD)浓缩。
[0363] 步骤5：单糖缀合的heparosan 38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的加帽最后，将38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的未唾液酸化的N-聚糖用ST3GalIII酶和CMP-NAN加帽(即唾液酸化)，如下：38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K (5.85 mg)与含ST3GalIII (0.18 mg/ml)；CMP-NAN (4.98 mM)的8.4 ml的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01% Tween80, pH 6.0在32℃孵育1 h。然后将反应混合物施用到用Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱，和首先用2柱体积的缓冲液A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4)然后用2柱体积的缓冲液B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)分步洗脱。将汇集的含有38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的流分合并，和使用具有10kD截止的Slide-A-Lyzer套盒(Thermo Scientific)透析。透析缓冲液是10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01 % Tween80, pH 6.0。蛋白浓度通过轻链HPLC分析在TCEP还原后测定。38.8k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的总收率是
2.46 mg (13%)。
2.46 mg (13%)。
[0364] 实施例10 - 41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A的制备步骤1：具有4-甲基苯甲酰基连键的41.5 kDa HEP-GSC试剂的合成
向含甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC) (20 mg; 32 µmol)的5.0 ml 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2缓冲液, pH 7.0加入41.5 kDa HEP-苯甲醛(99.7 mg; 2.5 µmol)。
轻轻搅拌混合物，直到所有HEP-苯甲醛溶解。在接下来2小时期间，分几部分(5x50 µl)加入氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，达到终浓度48 mM。在室温下放置反应混合物过夜。
然后通过透析除去过量的GSC，如下：将总反应体积(5250 µl)转移至透析套盒(Slide-A-Lyzer透析套盒, Thermo Scientific Prod No. 66810，具有截止10 kDa容量：3 -12 ml)。
将溶液针对2000 ml的25 mM Hepes缓冲液(pH 7.2)透析2小时，和针对2000 ml的25 mM Hepes缓冲液(pH 7.2)再次透析17h。从内室完全除去过量GSC通过HPLC用Waters X-Bridge phenyl柱(4.6mm x 250mm, 5 µm)和水乙腈系统(经30 min，0-85%乙腈的线性梯度，含有
0.1%磷酸)使用GSC作为参考验证。收集内室物质和冻干，得到作为白色粉末的41.5 kDa HEP-GSC。HEP-GSC试剂通过NMR和在SEC色谱上分析。通过该程序制备的HEP-GSC试剂包含与唾液酸胞苷一磷酸经过4-甲基苯甲酰基连键连接的HEP聚合物。
向含甘氨酰唾液酸胞苷一磷酸(GSC) (20 mg; 32 µmol)的5.0 ml 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2缓冲液, pH 7.0加入41.5 kDa HEP-苯甲醛(99.7 mg; 2.5 µmol)。
轻轻搅拌混合物，直到所有HEP-苯甲醛溶解。在接下来2小时期间，分几部分(5x50 µl)加入氰基硼氢化钠在MilliQ水中的1M溶液，达到终浓度48 mM。在室温下放置反应混合物过夜。
然后通过透析除去过量的GSC，如下：将总反应体积(5250 µl)转移至透析套盒(Slide-A-Lyzer透析套盒, Thermo Scientific Prod No. 66810，具有截止10 kDa容量：3 -12 ml)。
将溶液针对2000 ml的25 mM Hepes缓冲液(pH 7.2)透析2小时，和针对2000 ml的25 mM Hepes缓冲液(pH 7.2)再次透析17h。从内室完全除去过量GSC通过HPLC用Waters X-Bridge phenyl柱(4.6mm x 250mm, 5 µm)和水乙腈系统(经30 min，0-85%乙腈的线性梯度，含有
0.1%磷酸)使用GSC作为参考验证。收集内室物质和冻干，得到作为白色粉末的41.5 kDa HEP-GSC。HEP-GSC试剂通过NMR和在SEC色谱上分析。通过该程序制备的HEP-GSC试剂包含与唾液酸胞苷一磷酸经过4-甲基苯甲酰基连键连接的HEP聚合物。
[0365] 步骤2：FVIIa L288F T293K K337A的脱唾液酸化作用：向FVIIa L288F T293KK337A (43.5 mg)在21 ml的10 mM His, 100 mM NaCl, 60 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 6.7缓冲液中的溶液加入唾液酸酶(产脲节杆菌，9个单位/ml)。在室温下将反应混合物孵育1小时。然后将反应混合物在冰上冷却，和加入14 ml的10 mM His, 100 mM NaCl pH 7.7。然后加入50 ml的100 mM EDTA溶液，同时保持中性pH。然后反应混合物用50 ml的MilliQ水稀释，和施用到4x5ml互联的用50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.0平衡的HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences, GE Healthcare)。包括唾液酸酶的未结合的蛋白用5 CV的50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0洗脱。脱唾液酸化的蛋白用12 CV的50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, pH 7.0洗脱。合并含有蛋白的流分和加入0.5M PABA，达到终浓度浓度10 mM。蛋白收率通过如上所述在三(2-羧乙基)膦还原后使用反相HPLC针对FVIIa标准品定量FVIIa L288F T293K K337A轻链测定。以该方式分离32.5 mg脱唾液酸FVIIa L288F T293K K337A (2.83 mg/ml)在11.5 ml的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0中。
[0366] 向含脱唾液酸FVIIa L288F T293K K337A(16.3 mg)的5.75 ml的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 30 mM CaCl2, 10 mM PABA, pH 7.0中加入含41.5 kDa HEP-GSC (3当量,
41.5 mg)和大鼠ST3GalIII酶(2.93 mg; 1.1个单位/mg)的4.2 ml 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 50 %甘油, pH 7.0。然后用0.5M PABA水溶液调整PABA浓度至10 mM，和用1N NaOH调整pH至6.7。将反应混合物在32℃在缓慢搅拌下孵育过夜。然后加入在50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (356 µl)中的157 mM CMP-NAN溶液，和将反应物在32℃孵育另外1小时。HPLC分析表明含有未反应的FVIIa L288F T293K K337A(68%)、单HEP化的FVIIa (25%)和各种多HEP化形式(7%)的产物分布。
41.5 mg)和大鼠ST3GalIII酶(2.93 mg; 1.1个单位/mg)的4.2 ml 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 50 %甘油, pH 7.0。然后用0.5M PABA水溶液调整PABA浓度至10 mM，和用1N NaOH调整pH至6.7。将反应混合物在32℃在缓慢搅拌下孵育过夜。然后加入在50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 (356 µl)中的157 mM CMP-NAN溶液，和将反应物在32℃孵育另外1小时。HPLC分析表明含有未反应的FVIIa L288F T293K K337A(68%)、单HEP化的FVIIa (25%)和各种多HEP化形式(7%)的产物分布。
[0367] 然后将整个反应混合物施用至用Gla-结构域特异性抗体修饰的FVIIa特异性亲和柱(CV = 24 ml)和首先用2柱体积的缓冲液A (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4)然后2柱体积的缓冲液B (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4)分步洗脱。该方法基本上遵循Thim, L等Biochemistry (1988) 27, 7785-779描述的原理。
[0368] 收集具有未折叠的Gla-结构域的产物和直接施用至3x5ml互联的用含有10 mM His, 100 mM NaCl, pH 6.0的缓冲液平衡的HiTrap Q FF离子交换柱(Amersham Biosciences, GE Healthcare)。该柱用4柱体积的10 mM His, 100 mM NaCl, pH 6.0洗涤。未修饰的FVIIa L288F T293K K337A用12 CV的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 (洗脱缓冲液A)洗脱。然后41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A用15 CV的10 mM His, 325 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0洗脱。合并纯的流分，和蛋白浓度通过前述的HPLC量化方法测定。分离得到3.42 mg (21%)纯的41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A。最后，将含有41.5 kDa-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A的合并的流分针对10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0使用具有10kD截止的Slide-A-Lyzer套盒(Thermo Scientific)透析，和通过加入透析缓冲液将浓度调整至(0.40 mg/ml)。
[0369] 实施例11 - 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293K的制备该物质基本上按实施例10中所述制备。开始，将FVIIa W201R T293K (40 mg)脱唾液酸化，和脱唾液酸FVIIa W201R T293K (27.2 mg)通过Gla-特异性离子交换方法分离。然后将脱唾液酸化的类似物用41.5 kDa HEP-GSC (如实施例10中所述产生)和ST3GalIII孵育。然后缀合产物通过离子交换色谱分离。最后，缓冲液交换得到含2.9 mg (7.5%)的41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293K的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0。
[0370] 实施例12 - 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K的制备该物质基本上按实施例10中所述制备。开始，将FVIIa L288Y T293K(19.9 mg)脱唾液酸化，和脱唾液酸FVIIa L288Y T293K(16.9 mg)通过Gla-特异性离子交换方法分离。然后将脱唾液酸化的类似物用41.5 kDa HEP-GSC (按实施例10中所述产生)和ST3GalIII孵育。
然后，缀合产物通过离子交换色谱分离。最后，缓冲液交换得到含1.95 mg (11.5%)的41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0。
然后，缀合产物通过离子交换色谱分离。最后，缓冲液交换得到含1.95 mg (11.5%)的41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293K的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0。
[0371] 实施例13 - 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R的制备该物质基本上按实施例10中所述制备。在脱唾液酸化后，脱唾液酸FVIIa L288Y T293R(30 mg)与41.5 kDa HEP-GSC (按实施例10中所述产生)和ST3GalIII反应。然后，缀合产物通过离子交换色谱分离。最后，缓冲液交换得到含4.33 mg (14.4%) 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa L288Y T293R的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0。
[0372] 实施例14 - 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa T293K K337A的制备该物质基本上按实施例10中所述制备。在脱唾液酸化后，脱唾液酸FVIIa L288Y T293R(8 mg)与41.5 kDa HEP-GSC (按实施例10中所述产生)和ST3GalIII反应。缀合产物通过离子交换色谱分离。最后，缓冲液交换得到含1.72 mg (15%) 41.5 kDa HEP-[N]-FVIIa T293K K337A的10 mM His, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0。
[0373] 实施例15 –修饰的组合FVIIa变体的功能性质将如实施例9-14中所述的与PEG或heparosan(HEP)糖缀合的FVIIa组合变体针对蛋白水解活性和抗凝血酶反应性进行表征，如实施例中所述。结果概述在表7中。这些数据表明，在用PEG或HEP的情况下，FVIIa的化学修饰降低FVIIa变体蛋白水解活性，但对于一些变体，允许保留高于野生型FVIIa的蛋白水解活性和还允许保留抗凝血酶抗性。
[0374] 表7：修饰的FVIIa变体的功能性质。结果表示为野生型FVIIa的百分比(%)。
[0375] 实施例16 –血友病A-样全血血栓弹性描记法中的评价选择血栓弹性描记法(TEG)测定来通过与FVIIa比较，评价FVIIa变体在血友病A-样全血中的活性。TEG测定提供整个凝固过程的概况 – 起始、扩展和最终凝块强度测量。除了剪切力在血流和脉管系统中的可能影响之外，TEG测定模拟凝固的体内条件，因为该方法测量凝固全血的黏弹性性质(Viuff, E.等, Thrombosis Research, (2010), Vol. 126, 第
144-149页)。各TEG测定通过使用高岭土起始，和TEG参数凝固时间(R)和最大血栓产生速度(MTG)记录和报告在表8中。凝固时间(R)表示自血液置于样品杯中直到凝块开始形成(2 mm幅度)的等待时间；而最大血栓产生(MTG)表示凝块形成的速度。凝固时间(R) (以秒计)使用标准TEG软件测定；而MTG计算为TEG轨迹的一阶导数（first derivative）乘以100 (100 x mm/秒)。
144-149页)。各TEG测定通过使用高岭土起始，和TEG参数凝固时间(R)和最大血栓产生速度(MTG)记录和报告在表8中。凝固时间(R)表示自血液置于样品杯中直到凝块开始形成(2 mm幅度)的等待时间；而最大血栓产生(MTG)表示凝块形成的速度。凝固时间(R) (以秒计)使用标准TEG软件测定；而MTG计算为TEG轨迹的一阶导数（first derivative）乘以100 (100 x mm/秒)。
[0376] 血样获自正常的健康供体，其为Danish National Corps of Voluntary Blood Donors的成员和满足献血标准。采集血液在3.2%柠檬酸盐采血真空管(Vacuette ref. 455322, Greiner bio-one, Lot A020601 2007-02)中和在60分钟内分析。血友病A-样血液通过加入抗-人FVIII (绵羊抗-人FVIII, Lot AA11-01, Haematologic Technologies, VT, USA)抗体至终浓度10个Bethesda单位(BU)/ml (最终0.1mg/ml)和在室温下以2 rpm/min轻轻旋转30分钟，自正常人全血制备。除了FVIIa L288Y T293K以0.069、0.69、6.9、17.3 nM测试和FVIIa W201R T293K以0.076、0.76、7.6、19.1 nM测试之外，试验化合物以0.1、1、
10和25 nM终浓度加入。
10和25 nM终浓度加入。
[0377] 自高岭土诱导的TEG的数据表明，在血友病A-样血液中所有化合物剂量依赖性地降低凝固时间(R-时间)和增加最大血栓产生(MTG) (表8)。当以最高测试浓度评价时，与FVIIa相比，所有的40k-HEP-[N]-FVIIa-变体显示较短或类似的凝固时间。同时，变体的最大血栓产生相对于FVIIa类似或增加。此外，数据表明当与它们相应的FVIIa变体(未40k-HEP化)相比，FVIIa变体的40k-HEP化降低40k-HEP化的化合物的活性。
[0378] 表8显示在血友病A-样全血中在高岭土诱导的TEG中试验化合物的R-时间(凝固时间)和MTG (最大血栓产生)。除了FVIIa L288Y T293K以17.3 nM试验和FVIIa W201R T293K以19.1 nM试验之外，试验化合物的最高浓度是25 nM。FVIIa、40k-PEG-[N]-FVIIa和40k-HEP-[N]-FVIIa在四个单独的供体中测试(n=4)，而其余的化合物在两个单独的供体中测试(n=2)。方括号中的数据表示来自四个单独供体的参数的范围。
[0379] 表8：在血友病A-样全血中用于选择的FVIIa变体的血栓弹性描记法参数。
[0380] 实施例17 –在大鼠中评价PK在大鼠中进行鉴定的呈未修饰的形式或与PEG或heparosan (HEP)糖缀合的FVIIa变体的药代动力学分析，以评价它们对FVIIa的体内残存的影响。Sprague Dawley大鼠(三只/组)经静脉内给药。在合适的时间点作为全分布型收集Stabylite™ (TriniLize Stabylite Tubes; Tcoag Irel and Ltd, Ireland)稳定的血浆样品和冷冻直至进一步分析。分析血浆样品的凝固活性(如实施例7中所述)和通过ELISA定量测定FVIIa-抗凝血酶复合物。药代动力学分析使用Phoenix WinNonlin 6.0 (Pharsight Corporation)通过非分区方法进行。评价以下参数：FVIIa-抗凝血酶复合物的Cmax (最大浓度)、凝固活性的T½ (功能性终末半寿期)和MRT (功能性平均滞留时间)。
[0381] 简言之，通过使用酶免疫测定法(EIA)测量FVIIa–抗凝血酶复合物。结合EGF-结构域的N-末端和不阻断抗凝血酶结合的单克隆抗-FVIIa抗体用于捕获复合物(Dako Denmark A/S, Glostrup; 产品编号O9572)。多克隆抗-人AT抗体过氧化物酶缀合物用于检测(Siemens Healthcare Diagnostics ApS, Ballerup / Denmark; 产品编号OWMG15)。人野生型或变体FVIIa和血浆-衍生的人抗凝血酶形成的纯化复合物用作标准品，以建立EIA校准曲线。将血浆样品稀释和分析，和计算重复测量的平均浓度。EIA的内部测定精确度为1 – 8 %。
[0382] 药代动力学评价参数列于表9。相对于野生型FVIIa，测试的变体显示FVIIa-抗凝血酶复合物(大鼠AT复合物)的积累减少，血浆水平接近检测水平。此外，与40k-PEG-[N]-FVIIa (在大鼠中7.4小时)相比，观察到40k-HEP-[N]-FVIIa L288F T293K的显著延长的功能性半寿期(在大鼠中18.4小时)。
[0383] 总之，在位置293处存在Lys增加了在大鼠中的T½和减少了FVIIa-抗凝血酶复合物形成。此外，引入糖缀合的heparason实质性改进了大鼠中的T½。
[0384] T½：在IV给药后活性分子的终末半寿期MRT：在IV给药后活性分子的平均滞留时间
AT复合物Cmax/剂量：化合物-抗凝血酶复合物的最大测量水平除以剂量
表9：在大鼠中用于选择的FVIIa变体的药代动力学评价参数
实施例18 –通过活性位点稳定的FVIIa L288Y T293K的液体制剂
在溶液中FVIIa的稳定性受对多肽链的众多修饰的限制，结果造成自体蛋白水解、氧化、脱酰胺、异构化等。先前的研究鉴定了在重链上对自体蛋白水解攻击易感的三个位点；
这些是Arg290-Gly291、Arg315-Lys316和Lys316-Val317 (Nicolaisen等, FEBS, 1993,
317:245-249)。无钙条件还促进轻链的前38个残基的蛋白水解释放，其包括γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域。
AT复合物Cmax/剂量：化合物-抗凝血酶复合物的最大测量水平除以剂量
表9：在大鼠中用于选择的FVIIa变体的药代动力学评价参数
实施例18 –通过活性位点稳定的FVIIa L288Y T293K的液体制剂
在溶液中FVIIa的稳定性受对多肽链的众多修饰的限制，结果造成自体蛋白水解、氧化、脱酰胺、异构化等。先前的研究鉴定了在重链上对自体蛋白水解攻击易感的三个位点；
这些是Arg290-Gly291、Arg315-Lys316和Lys316-Val317 (Nicolaisen等, FEBS, 1993,
317:245-249)。无钙条件还促进轻链的前38个残基的蛋白水解释放，其包括γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域。
[0385] 此处，我们使用小分子PCI-27483-S (2-{2-[5-(6-氨甲酰亚胺酰基-1H-苯并咪唑-2-基)-6,2'-二羟基-5'-氨磺酰基-联苯基-3-基]-乙酰基氨基}-琥珀酸)，其通过非共价相互作用稳定FVIIa的活性位点和在液体制剂中防止重链的自体蛋白水解(对于关于PCI-27483-S的其它细节，参见WO2014/057069)。
[0386] 重链裂解的定量测定通过用反相HPLC (RP-HPLC)分析还原的FVIIa L288Y T293K来评价。将测定溶液在127mM二硫苏糖醇(DTT)和3M盐酸胍中还原，其在60℃孵育15分钟，接着加入1µL浓乙酸(每50 µL的原始测定溶液)和冷却至25℃。25 µg还原的FVIIa L288Y T293K然后注入到在40℃温度平衡的ACE 3 µM C4柱上(300Å, 4.6x100mm; Advanced Chromatography Technologies LTD, Scotland)。蛋白片段用具有由含0.05%三氟乙酸(TFA)的水组成的流动相A和35-80%运行（going from 35-80%）的由含0.045% TFA的80%乙腈组成的流动相B的线性梯度分离。梯度时间为30分钟，流速为0.7 mL/min和洗脱峰用215nm的吸光度测量。
[0387] FVIIa L288Y T293K的制剂由以下构成：1.47 mg/mL CaCl2, 7.5 mg/mL NaCl, 1.55 mg/mL L-组氨酸, 1.32 mg/mL甘氨酰甘氨酸, 0.5 mg/mL L-甲硫氨酸, 0.07 mg/mL Polysorbate 80, 0.021 mg/ml PCI-27483-S, 蛋白浓度为1 mg/ml (即蛋白抑制物摩尔比1:1.75)和终pH为6.8。将溶液在静止条件下并避光在30℃孵育1个月。如表10中可见，存在PCI-27483-S导致几乎完全抑制FVIIa L288Y T293K的重链裂解；而未加入PCI-27483-S导致在位置315-316和290-291处裂解的显著增加。
裂解位点 含PCI-27483-S 无PCI-27483-S
315-316 20 % 287 %
290-291 17 % 675 %
裂解位点 含PCI-27483-S 无PCI-27483-S
315-316 20 % 287 %
290-291 17 % 675 %
[0388] 表10：含和不含PCI-27483-S抑制物的情况下在28天孵育后对应于两个不同裂解位点，相对于第0天重链片段的峰面积的百分比增加，如在RP-HPLC色谱图中测定的。
[0389] 实施例19 –免疫原性风险的生物信息学评价生物信息学研究调查了从为了产生FVIIa类似物的蛋白工程改造得到的新的肽序列是否能够生成能够结合主要组织相容性复合物II类(MHC-II)（其在人中亦称为HLA-II）的肽序列。这样的结合是T-细胞表位存在的前提。用于本研究的肽/HLA-II结合预测软件基于两种算法，进行HLA-DR预测的NetMHCIIpan 2.1 (Nielsen等2010)和进行HLA-DP/DQ预测的NetMHCII 2.2 (Nielsen等2009)。
[0390] 计算免疫原性风险评分(IRS)以能够关于免疫原性风险潜力比较不同的FVIIa类似物。如下进行计算：FVIIa野生型用作参比，和分析中包括不在参比(FVIIa野生型)中的仅预测的15mers，其具有等于或小于10的预测等级。HLA-II等位基因分类为三类：第1类(等级<= 1)，具有2的权重；第2类(1 > 等级 <= 3)，具有0.5的权重；和第3类(3 > 等级 <= 10)，具有0.2的权重。类权重(2、0.5或0.2)乘以等位基因频率(对于各群体)得到IRS。对各群体和各HLA-II (DRB1、DP和DQ)，计算IRS的总和。
[0391] 对于选择的单一和组合变体的计算的风险评分在表11中给出。特别是，有利的组合包括L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288Y/T293K和L288Y/T293K/K337A，其同时显示高的蛋白水解活性以及对由抗凝血酶导致的抑制的易感性降低。FVIIa变体 风险评分
FVIIa L288F T293K 0.10
FVIIa L288F T293K K337A 0.10
FVIIa L288F T293K L305I 0.40
FVIIa L288F T293K L305V 0.35
FVIIa L288F T293R 0.12
FVIIa L288F T293R K337A 0.12
FVIIa L288F T293R L305I 0.42
FVIIa L288F T293R L305V 0.37
FVIIa L288F T293Y 0.32
FVIIa L288F T293Y K337A 0.32
FVIIa L288N T293K 0.06
FVIIa L288N T293R 0.08
FVIIa L288N T293Y 0.26
FVIIa L288Y T293K 0.06
FVIIa L288Y T293K K337A 0.06
FVIIa L288Y T293R 0.09
FVIIa L288Y T293R K337A 0.09
FVIIa L305V T293K 0.28
FVIIa L305V T293Y 0.49
FVIIa T293K K337A 0.02
FVIIa T293K L305I 0.32
FVIIa T293K L305V K337A 0.28
FVIIa T293R K337A 0.06
FVIIa T293R L305I 0.36
FVIIa T293R L305V 0.32
FVIIa T293R L305V K337A 0.32
FVIIa T293Y K337A 0.23
FVIIa T293Y L305V K337A 0.49
FVIIa W201K T293K 0.19
FVIIa W201K T293R 0.23
FVIIa W201K T293Y 0.39
FVIIa W201M T293K 1.03
FVIIa W201M T293R 1.06
FVIIa W201M T293Y 1.23
FVIIa W201R L288F T293K 0.32
FVIIa W201R L288F T293R 0.34
FVIIa W201R T293K 0.25
FVIIa W201R T293K L305I 0.55
FVIIa W201R T293R 0.29
FVIIa W201R T293R L305I 0.58
FVIIa W201R T293Y 0.45
FVIIa L288F T293K 0.10
FVIIa L288F T293K K337A 0.10
FVIIa L288F T293K L305I 0.40
FVIIa L288F T293K L305V 0.35
FVIIa L288F T293R 0.12
FVIIa L288F T293R K337A 0.12
FVIIa L288F T293R L305I 0.42
FVIIa L288F T293R L305V 0.37
FVIIa L288F T293Y 0.32
FVIIa L288F T293Y K337A 0.32
FVIIa L288N T293K 0.06
FVIIa L288N T293R 0.08
FVIIa L288N T293Y 0.26
FVIIa L288Y T293K 0.06
FVIIa L288Y T293K K337A 0.06
FVIIa L288Y T293R 0.09
FVIIa L288Y T293R K337A 0.09
FVIIa L305V T293K 0.28
FVIIa L305V T293Y 0.49
FVIIa T293K K337A 0.02
FVIIa T293K L305I 0.32
FVIIa T293K L305V K337A 0.28
FVIIa T293R K337A 0.06
FVIIa T293R L305I 0.36
FVIIa T293R L305V 0.32
FVIIa T293R L305V K337A 0.32
FVIIa T293Y K337A 0.23
FVIIa T293Y L305V K337A 0.49
FVIIa W201K T293K 0.19
FVIIa W201K T293R 0.23
FVIIa W201K T293Y 0.39
FVIIa W201M T293K 1.03
FVIIa W201M T293R 1.06
FVIIa W201M T293Y 1.23
FVIIa W201R L288F T293K 0.32
FVIIa W201R L288F T293R 0.34
FVIIa W201R T293K 0.25
FVIIa W201R T293K L305I 0.55
FVIIa W201R T293R 0.29
FVIIa W201R T293R L305I 0.58
FVIIa W201R T293Y 0.45
[0392] 表11：对于选择的单一和组合FVIIa变体计算的风险评分。
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