技术领域
[0001] 本
申请涉及真菌感染检测领域，具体地涉及一种白带霉菌
荧光染色检测试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 近年来，霉菌性
阴道炎发病率呈上升趋势，已取代滴虫病成为了白带异常增多最主要的原因之一，严重威胁到女性身体健康。目前临床上实验室诊断霉菌性阴道炎还主要依靠直接涂片镜检，在普通
显微镜下寻找霉菌孢子和菌丝的感染证据，但缺点在于阳性率太低，有很高比例的患者临床症状符合霉菌感染但镜检阴性。常规镜检的
缺陷主要在于：1)普通显微镜下孢子或菌丝形态易与同样卵圆形的白细胞、红细胞、脱落上皮细胞或其他干扰物相混淆，难以观察到典型的菌丝和出芽细胞相连成链状或分枝状，或聚集的透亮卵圆形孢子结构，给检验医生造成判断困难；2)由于患者就医前自主用药或用药不规范等因素，很多阳性临床样本中霉菌含量很低(只有零星散在的真菌孢子)，让检验科医生镜检缺乏信心无法确诊，导致漏诊率增加。
[0003] 目前技术中，使用
荧光增白剂28来进行真菌荧光染色。其原理为荧光增白剂28能够与真菌细胞壁中的几丁质结合，在荧光显微镜下使用UV照射后，真菌细胞壁能够发射蓝色荧光，从而达到真菌检测的目的，由于临床
微生物中几丁质主要存在于真菌中，人
体细胞、病毒和细菌不含有几丁质，因此，使用此方法可以较特异性地检测真菌的感染。该方法步骤主要为：将真菌感染的标本置于
载玻片上，将含有荧光增白剂28的试剂滴加到标本上，染色1min后，盖上盖玻片，然后置于荧光显微镜下进行观察。可以观察到真菌菌体发射的蓝色荧光。
[0004] 但是，
现有技术中存在的主要问题有：荧光单一，非细胞结构的干扰物被染上荧光后容易干扰观察；染色后，临床标本中人体细胞的非特异性荧光干扰结果的观察；丝状菌的分生孢子头的结构不易观察。
[0005] 因此，需要能够容易的在荧光显微镜下观察到真菌的菌体或菌丝；能够使得样本中的人体细胞不易干扰真菌的观察。
发明内容
[0006] 以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制
权利要求的保护范围。
[0007] 本申请通过荧光双染色的方法，一方面通过荧光增白剂(例如
钙荧光白，calcium fluorescent white)染料对白带霉菌细胞壁的几丁质和
纤维素的特异性荧光染色，在荧光显微镜下可以清晰地观察到霉菌孢子和菌丝的形态，而来自于病人本身的上皮细胞或血细胞不着色；另一方面通过活细胞染色剂进行细胞核染色，确认该形态为细胞形态，从而快速实现对霉菌的高效鉴定。
[0008] 具体地，本申请提供一种真菌检测试剂盒，包括荧光增白剂，活细胞染色剂，
固定剂，甘油和NaCl。
[0009] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒包括0.01％-0.02％
质量份的荧光增白剂，0.25μM-0.35μM的活细胞染色剂，55％-60％质量份的固定剂，1％-2％质量份的甘油和20％-28％质量份的NaCl。
[0010] 在本申请中，μM指的是μmol/L。
[0011] 在本申请中，所述荧光增白剂为荧光增白剂或荧光染色剂28或CFW，优选地CFW。
[0012] 在本申请中，所述真菌染色剂可以为CFW，用于真菌细胞壁的荧光染色。CFW染色剂主要与真菌细胞壁成分几丁质的β-1，4糖苷键特异性结合的荧光染色剂，紫外线激发后呈蓝色荧光。
[0013] 在本申请中，所述活细胞染色剂为SYTOX Green、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚或Hoechst。
[0014] 在本申请中，所述活细胞染色剂可以为SYTOX Green，用于细胞核的染色。SYTOX Green是一种不可以透过活细胞的DNA荧光染剂，488蓝
光激发后呈绿色荧光。
[0015] 在本申请中，所述固定剂为丙
酮、或多聚甲
醛和Triton X-100。
[0016] 在本申请中，甘油使待检样本不易干，便于图片长期保存，甘油浓度过高也会导致液体分层，优选地，质量分数为2％左右。丙酮适当破坏孢子细胞壁与细胞膜，利于核染色剂的进入，同时可以起到固定细胞形态和细胞的打孔的作用。
[0017] 在本申请中，使用生理盐
水作为
溶剂均，尽量维持细胞稳定的形态，利于样本的储存。
[0018] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒包括0.01％-0.02％质量份的荧光增白剂，0.25μM-0.35μM的SYTOX Green，55％-60％质量份的丙酮，1％-2％质量份的甘油和20％-28％质量份的NaCl。
[0019] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒包括0.01％-0.02％质量份的CFW，0.25μM-0.35μM的SYTOX Green，55％-60％质量份的丙酮，1％-2％质量份的甘油和20％-28％质量份的NaCl。
[0020] 染色结果：真菌孢子或菌丝为细胞壁CFW+(蓝色)，同时细胞核SYTOX Green+(绿色)，人类细胞为CFW-，SYTOX Green+。
[0021] 在本申请中，在进行检测时，用荧光增白剂和活细胞染色剂同时进行染色，或先用活细胞染色剂进行染色，再用荧光增白剂进行染色。
[0022] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒可以应用于检测体液中的真菌。
[0023] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒可以应用于检测尿液、
肺泡灌洗液、胸
腹腔积液中的真菌。
[0024] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒可以应用于检测念珠菌或丝状菌。
[0025] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒可以应用于白带检测以及肺脏、泌尿系统和胸腹腔中的感染性
疾病的辅助检测。
[0026] 在本申请中，所述真菌检测试剂盒应用于检测尿液、肺泡灌洗液、胸腹腔积液中的真菌。所述真菌检测试剂盒可以应用于霉菌性阴道炎的真菌病原体检测，还可以用于其它真菌感染的临床标本，例如组织、其它体液或分泌物等，包括尿液中的真菌，肺泡灌洗液中的真菌或者胸腹腔积液中的真菌等。
[0027] 由于荧光染色基本不受样本中上皮细胞和白细胞存在的干扰，本试剂应用无需使用KOH破坏上皮细胞和白细胞(使用KOH也可能破坏孢子和菌丝而使检出率降低)，极大提高了霉菌检测的灵敏度和可靠性。
[0028] 相比于现有技术，本申请可以先进行SYTOX Green染色，再进行CFW染色，也可以CFW和SYTOX Green同时进行染色
[0029] 本申请具有以下优点，1)操作简单：可以直接加入两种染色剂的
混合液，约10分钟后就可以进行镜下观察，简化了操作步骤，缩短了检测时间；2)形态明确，可降低错判率：荧光显微镜下霉菌孢子和菌丝形态图像清晰典型，不受上皮细胞、白细胞或其他干扰物的干扰，重叠亦不影响观察，减少了检测人员的主观判断带来的错判率；3)可以从细胞核染色情况来区分单细胞真菌和多细胞真菌，图1-图4中是单个真菌细胞，而有些丝状菌的孢子(如图中的单个细胞)会呈多层聚集生长或包裹在一个囊中生长，这时染色后会发现，整个聚集区域呈高亮的蓝色光，这时只能鉴定可能为真菌，但是不能鉴定是否为丝状菌。用SYTOX Green染色，如果聚居区呈现多个绿色荧光斑
块或点，那么综合就可以鉴定为丝状菌(图5)。
[0030] 本申请的其它特征和优点将在随后的
说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及
附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0031] 附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的
实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
[0032] 图1是400x高倍镜下观察到的白带的荧光双染色图。
[0033] 图2是400x高倍镜下观察到的白带的荧光双染色图。
[0034] 图3是1000x油镜下观察到的白带的荧光双染色图。
[0035] 图4是400x高倍镜下观察到的白带的白光图和荧光染色图。
[0036] 图5是400x高倍镜下观察的到的曲霉的荧光双染色图。
具体实施方式
[0037] 为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0038] 实施例
[0039] 一次性白带拭子
采样器，由专业医护人员用无菌的
棉拭子在患者阴道上1/3段
侧壁或阴道穹隆后部、
宫颈管口等处取材。2小时内送到检验人员处。
[0040] 检测流程
[0041] 1)将已取样棉拭子放入采样器内，再加入生理盐水，至少没过样本(1.5ml左右)反复洗涮，使采样样本尽量混在生理盐水中，制成样本悬液；
[0042] 2)取500μl样本悬液，加入1000μl丙酮，震荡混匀后，静置15分钟；
[0043] 3)5000rpm离心10分钟，吸出上清后，加入250微升生理盐水悬浮，震荡混匀；
[0044] 4)依次加入10μl的SYTOX Green和125μl的CFW染剂，混匀后直接用加样器吸取20μl左右液体滴在载玻片上(可选项：加盖玻片
覆盖以免污染镜头)荧光显微镜观察(Leica DMI3000B)。
[0045] 对比例
[0046] 1)将已取样棉拭子放入采样器内，再加入1.5mL左右生理盐水中(至少没过样本)反复洗涮，使采样样本尽量混在生理盐水中；
[0047] 2)用加样器吸取20μl左右液体滴在载玻片上，盖上盖玻片；
[0048] 3)白光镜下进行观察。
[0051] 将试剂样品置于37℃温箱3天，无分层加一滴于载玻片上观察，确认无晶体析出，再按上述操步骤作进行试验，发现染色效果没有减弱。
[0052] 2)冷稳定性测试
[0053] 将试剂样品置于-20℃
冰箱避光1月，期间反复冻融数次，取出，肉眼发现出现无分层，加一滴于载玻片上观察，确认无晶体析出，再按上述操步骤作进行试验，发现染色效果没有减弱。
[0054] 3)常温稳定性测试
[0055] 将试剂样品置于常温避光1个月，肉眼发现出现无分层，加一滴于载玻片上观察，确认无晶体析出，再按上述操步骤作进行试验，发现染色效果没有减弱。
[0056] 结合实施例和附图可以看出，在图1中：使用CFW染色后，念珠菌和右上的干扰物均呈蓝色，因此干扰物有可能会干扰结果的观察(左图)。但使用SYTOX Green染色后，念珠菌呈现绿色，而干扰物不能够被染色(右图)。在图2中：使用CFW染色后，念珠菌染色较弱，但是左上的干扰物染色较强，干扰了结果的判定。但使用SYTOX Green染色后，念珠菌能够被染为绿色，而干扰物不能够被染色(右图)。在图3中：CFW染色后，均呈现强染色(左图)。但是使用SYTOX Green染色后，念珠菌染色明显，而干扰物染色很弱。在图4中，左图为普通光镜下(白光)的图片，念珠菌和干扰物在白光下很难进行区分(左图)。但使用CFW或SYTOX Green染色后，念珠菌在荧光下呈现蓝色或绿色，而干扰物不被染色(中间和右图)。
[0057] 因此，综合以上四组图片，可以说明使用CFW和SYTOX Green对念珠菌进行双染色，能够明显的排除干扰物对结果的观察判定，更有利于对白带中念珠菌感染的诊断。
[0058] 虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的
修改与变化，但本申请的
专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
