人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用
专利汇可以提供人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了人抗苗勒氏管 激素 的流式检测 试剂 及其制备方法和应用，特点是该试剂包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的 抗体 Ab1‑微球偶联物和抗体Ab2‑ 荧光 分子标记物，其制备方法步骤包括针对人抗苗勒管激素单克隆抗体的制备和 配对 ，人抗苗勒管激素单克隆抗体与载体微球的偶联以及单克隆抗体的荧光分子标记，优点是根据荧光值的强弱直接判断AMH含量的高低，只需往试剂中添加 血液样本 ，就能得到实验结果，简化了检测过程中的实验操作步骤，同时配合自动加样系统，就可实现高通量多样本的连续检测，极大的提高了检测的效率，检测的灵敏度可达到0.01ng/ml。，下面是人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于包括用于检测人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗体Ab1-微球偶联物和抗体Ab2-荧光分子标记物，其中抗体微球偶联物的结构通式如下：
其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1；
所述的抗体荧光分子标记物的结构通式如下：
其中Ab2为AMH单克隆抗体2，F为荧光分子，所述的抗体Ab1和Ab2为成熟AMH蛋白片段免疫小鼠所制备的AMH单克隆抗体对，所述的抗体Ab1和Ab2能同时与AMH抗原结合，其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：
SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR，所述的AMH单克隆抗体对是从20个鼠源AMH单克隆抗体库中利用十字交叉法筛选配对得到的配对效果最佳一对抗体。
2.根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂，其特征在于：所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯或二氧化硅，所述的单分散微球的外表面功能化修饰有羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键；所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料。
3.一种根据权利要求1所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)AMH单克隆抗体的制备
选取一段成熟AMH蛋白片段序列作为制备抗苗勒管激素抗体库的抗原，将抗原的碱基序列克隆至原核表达载体pET-41a上，E.coli原核表达系统表达出AMH抗原蛋白，用亲和层析的方法纯化带标签的AMH抗原蛋白；其中所述的成熟AMH蛋白片段的氨基酸序列如下：SAGATAADGPCALRELSVDLRAERSVLIPETYQANNCQGVCGWPQSDRNPRYGNHVVLLLKMQARGAALARPPCCVPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECGCR；
将AMH抗原蛋白用水溶性佐剂接种免疫5只6-8周龄Balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分别进行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各
100uL，ELISA检测血清效价；当效价达到1：50000后，选取血清效价最高的小鼠，拉劲处死，取该小鼠的脾脏，获取脾细胞，然后与小鼠Balb/c品系骨髓瘤细胞sp2/0进行3次融合；在融合24小时后，加HAT选择培养基培养两周，采用96孔板克隆化细胞，筛选出杂交瘤细胞；用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25 Flask培养，培养的上清用protein A或protein G纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
(2)双抗夹心法筛选能够配对的AMH抗体对
将20个纯化好的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记，同时将这20个单克隆抗体包被板，采用十字交叉法检测配对效果，以抗原浓度和标记抗体的量为变量因素，设置阴性对照，空白对照，如果测定值为阴性值的2.1倍，则表示为阳性，筛选出一对配对效果最佳的抗体对Ab1和Ab2，作为偶联微球和荧光分子的前期材料；
(3)AMH单克隆抗体Ab1与微球偶联
将碳二亚胺粉末和N-羟基琥珀酰亚胺粉末加入到浓度为1mg/mL的AMH单克隆抗体Ab1溶液中，室温避光反应15分钟，然后向反应溶液中加入浓度为0.5wt％的单分散微球溶液，
30℃避光震荡反应4小时，用含1wt％的SDS溶液洗涤微球2次，浓度为0.5wt％吐温-20的PBS溶液洗涤微球3次，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab1-微球偶联物，其结构通式分别如下：
其中M为高分子材料制成的单分散微球，R为功能结合键，Ab1为AMH单克隆抗体1，将抗体Ab1-微球偶联物保存于含0.5wt％NaCl，PH＝7.4的PB溶液中，待用；
(4)AMH单克隆抗体Ab2的荧光分子标记
将浓度为1-10mg/ml的待交联的AMH单克隆抗体Ab2溶液，于4℃用交联反应液透析三次，至pH＝9.0得到抗体Ab2溶液；将荧光分子溶于二甲基亚砜中配置成浓度为1mg/mL的荧光分子溶液；将荧光分子溶液缓慢加入抗体Ab2溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；然后在反应液中加入5mol/L的NH4Cl直至NH4Cl终浓度为50mmol/L，4℃终止反应2h，然后在PBS缓冲液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于检测血清或血液中AMH含量的抗体Ab2-荧光分子标记物，其结构通式分别如下：
其中Ab2为AMH单克隆抗体2， 其中F为荧光分子，将抗体Ab2-荧光分
子标记物置于pH＝7.4的含有0.1wt％NaN3、1wt％BSA磷酸盐缓冲液中，4℃避光保存。
4.根据权利要求3所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的十字交叉法检测配对效果具体方法如下：
A.将单克隆抗体用0.05M pH＝9.0碳酸盐包被缓冲液稀释得到浓度为1-10μg/ml的抗体溶液，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml所述的抗体溶液，4℃包被过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3次，每次3分钟；
B.加样：取4ng/mL、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四个浓度的AMH抗原样品0.1ml分别上述已包被的反应孔中，放置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
C.加酶标抗体：于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5-1小时，洗涤3次；
D.加底物液显色：于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃显色10-30分钟；
E.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，终止显色反应；
F.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性，重复此实验三次，选取阳性中OD值最大的反应孔所对应的一对抗体，即为配对效果最佳的AMH蛋白的单克隆配对抗体Ab1和Ab2。
5.根据权利要求3所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的单分散微球的直径为3-30微米，材质为聚苯乙烯、二氧化硅，所述的单分散微球的外表面具有功能化修饰羧基、氨基、羟基或巯基；所述的功能结合键为羧基与氨基结合的酰胺键或者羟基与羧基的结合键或者巯基与羟基的结合键。
6.根据权利要求5所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：所述的碳二亚胺、所述的N-羟基琥珀酰亚胺、所述的单分散微球溶液与所述的AMH单克隆抗体Ab1溶液的混合比例为28g：56g：2ml：1ml。
7.根据权利要求3所述的人抗苗勒管激素的流式检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的抗体Ab2蛋白与所述的荧光分子交联时的比例为1mg：15μg，所述的荧光分子为偶联的荧光染料，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、异硫氰酸盐罗丹明B、四甲基异硫氰酸罗丹明或花青染料。
8.权利要求1-7中任一项所述的人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂的应用，其特征在于将流式检测试剂的用于检测人抗苗勒氏管激素含量具体步骤如下：
将待测样本人血清或血液加入到抗体Ab1-微球偶联物溶液中，然后加入一定体积的抗体Ab2-荧光分子标记物溶液，37度孵育30min，样本中的INHB分别与Ab1抗体微球偶联物和Ab2抗体荧光分子标记物结合形成微球-Ab1-AMH-Ab2-荧光分子复合体，经流式细胞仪可以检测出荧光分子发射出的荧光，根据荧光强度与AMH的浓度关系，计算获得样本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中Ab1抗体Ab1-微球偶联物与抗体Ab2-荧光分子标记物的摩尔比为1：
1。
人抗苗勒氏管激素的流式检测试剂及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
发明内容
用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用protein A或protein G纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
具体实施方式
用ELISA检测克隆培养上清，检测出抗原阳性100-500个阳性细胞，扩大培养至48孔板，挑取阳性克隆扩增，ELISA检测克隆培养上清，根据检测结果，挑选40株效价最高的阳性克隆进行亚克隆化，每个亚克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选培养上清，每个母克隆挑选2个阳性亚克隆；阳性克隆扩大培养，ELISA检测上清效价大于1：20000，挑取20个效价最高的克隆做96孔板有限稀释培养，放大培养至T-25Flask培养，培养的上清用protein A或protein G纯化即得到纯度达到90％以上的AMH单克隆抗体库；
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