一种紫外荧光分子探针的合成及其对亚硝酸根的检测
阅读：693发布：2023-02-26
专利汇可以提供一种紫外荧光分子探针的合成及其对亚硝酸根的检测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种检测亚 硝酸 根的紫外 荧光 分子探针N,N’‑5‑二吲哚‑2,6‑吡啶二甲酰胺的合成方法及其在各类实际样品的亚硝酸根检测中的应用。这种以双吲哚为荧光团，吡啶二甲酰胺为 支架 的双臂穴状化合物N,N’‑5‑二吲哚‑2,6‑吡啶二甲酰胺的合成，实现了对亚硝酸根的专一性识别。探针具有光学性质稳定，特异性好，灵敏度高，易制备，成本低的特点，并且可以在更温和的pH值条件下（2~5）检测亚硝酸根。用N,N’‑5‑二吲哚‑2,6‑吡啶二甲酰胺测定各类实际样品中的亚硝酸根的含量，可以通过 颜色 的变化定性的判断样品中是否含有亚硝酸根，同时可以通过紫外荧光 光谱 测定样品的亚硝酸根含量。，下面是一种紫外荧光分子探针的合成及其对亚硝酸根的检测专利的具体信息内容。
1.一种紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的合成方法，其步骤是：
将5-氨基吲哚置于250 mL圆底烧瓶中，将其溶于无水乙腈中，室温搅拌，氮气保护下，加入三乙胺及4-二甲氨基吡啶，将2,6-吡啶二甲酰氯溶于无水乙腈中，并将其滴入上述混合溶液中，立即有白烟生成，室温搅拌12小时，直到有固体析出，反应完成后将溶剂蒸除，固体用水洗涤，过滤后继续用无水乙腈洗涤三次，30℃真空干燥，得到紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺。
2.用权利要求1所合成的紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺对黄河水、湖水及自来水样中的亚硝酸根进行检测，其步骤是：
a．将紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，溶于10 mM、pH=3的HEPES缓冲溶液中，用紫外吸收光谱和荧光发射光谱分别测定紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-
2,6-吡啶二甲酰胺的吸收和发射光谱，经测定，其紫外吸收最大波长为270 nm处，最强荧光发射在360 nm处；向其中加入亚硝酸根，放于37 ℃恒温水浴中孵化30分钟后，其紫外吸收最大波长仍处于270 nm处，同时在520 nm可见光区出现了一个新的吸收峰，导致了溶液颜色由无色变为粉色，因此，紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可用于对亚硝酸根进行裸眼可视识别；加入亚硝酸根后，最强荧光发射仍处于360 nm处，同时荧光发生猝灭； 紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以在紫外-可见吸收和荧光发射两种模式下对亚硝酸根进行定量分析；
b．将紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，溶于10 mM、pH=3的HEPES缓冲溶液中，向溶液中加入浓度为0-100 μM的亚硝酸根，放于37 ℃恒温水浴中孵化30分钟后，溶液颜色由无色变为粉色，同时用紫外吸收光谱和荧光发射光谱检测，记录其在270 nm处的紫外吸收强度和360 nm处的荧光发射强度，根据亚硝酸根的浓度和紫外吸收光谱的强度建立标准曲线，其方程为y = 0.0687 + 0.552 × [NO2﹣], R = 0.994，检出限可以达到
0.166 μM ，同时，根据亚硝酸根的浓度和荧光发射光谱的强度建立标准曲线，其方程为y = -0.00124 + 0.0572 × [NO2-]， R=0.994，检出限可以达到0.10 μM 。
一种紫外荧光分子探针的合成及其对亚硝酸根的检测
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的合成及其对亚硝酸根的检测，属于有机发光材料领域。
背景技术
[0002] 亚硝酸盐主要指亚硝酸钠（NaNO2）和亚硝酸钾(KNO2)，为白色或微黄色结晶或颗粒状粉末，称为工业食盐。亚硝酸盐广泛分布于自然界，是自然界中分布最广的含氮化合物之一，由于亚硝酸盐在人体内易与蛋白质作用形成致癌物质N-亚硝胺类化合物，因此摄入过量的亚硝酸盐容易导致多种疾病，如：食道癌、婴儿的高铁血红蛋白症、自然流产及中枢神经的出生缺陷等等疾病。因此亚硝酸盐含量的测定在水质监测上就显得尤为重要。目前，格里斯试剂（Griess）比色法和2,3-二氨基萘试剂荧光法是检测亚硝酸根离子最常用的两种方法。但是这两种方法检测亚硝酸根离子时，都需要多种试剂组合，其中格里斯方法的试剂是由对氨基苯磺酰胺水溶液和萘乙二胺的磷酸溶液混合制得，检测步骤繁琐、复杂，需要避光冷藏储存，半小时内用完，试剂储存困难，耗时长，且需要在强酸作用下反应。因此建立一种简便、温和、高灵敏度检测亚硝酸根的方法对于保障人体生命安全具有重要的应用价值。
发明内容
[0003] 鉴于上述，本发明的目的旨在提供一种紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的合成。
[0004] 本发明的另一目的在于提供紫外荧光分子探针对亚硝酸根的检测方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
[0006] 一种紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的合成
[0007] 将661 mg 5-氨基吲哚置于250 mL圆底烧瓶中，将其溶于100 mL无水乙腈中，室温搅拌，氮气保护下，加入7.5 mL三乙胺及18 mg 4-二甲氨基吡啶。将510 mg 2,6-吡啶二甲酰氯溶于无水乙腈中，并将其滴入上述溶液中，立即有白烟生成，室温搅拌12小时，直到有固体析出，反应完成后将溶剂蒸除，固体用水洗涤，过滤后继续用乙腈洗涤三次，30℃真空干燥，得到紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺。
[0008] 紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的合成结构式如下：
[0009]
[0010] 紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的理化性质：
[0011] N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺（C24H21N5O3）呈深棕色固体，其分子量为395.1462，熔点为324-325摄氏度。
[0012] 紫外荧光分子探针测定亚硝酸根的机理。
[0013]
[0014] 紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，由于酰胺键的p-π共轭，电子云离域到C-N键上，使得其带有部分双键的性质，共轭范围扩大，分子刚性增强，具有较强的荧光。而N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺中酰胺键氮上的氢作为氢键供体容易通过氢键与亚硝酸根阴离子结合，因此，在酸性条件下，亚硝酸根与N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺中酰胺键氮上的氢通过氢键结合，打断了共轭大π键，并且由于氢键作用，使分子不再处于同一平面，最终导致荧光猝灭。通过体系荧光信号的改变与亚硝酸根离子浓度间的线性关系，实现对黄河水、湖水及自来水样中亚硝酸根的快速定性定量检测。同时，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用后，紫外吸收发生了红移，在可见区出现了新的吸收峰，致使其颜色变为淡粉色，说明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺探针可以通过颜色变化对﹣NO2实现定性的识别。
[0015] 本发明的优点和产生的有益效果：
[0016] 本发明克服了现有技术的不足之处。利用5-氨基吲哚，2,6-吡啶二甲酰胺，三乙胺，4-二甲氨基吡啶，采用室温一步法合成了紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，探针的合成非常简单且条件温和，可操作性强。本发明测定亚硝酸根的操作步骤简单，相较步骤繁琐的传统方法更有优势。本发明可以同时用紫外和荧光两种方法检测水样中的亚硝酸根含量，探针与亚硝酸根通过氢键作用后，其紫外吸收最大波长在270 nm处，最强荧光发射在360 nm处。本发明用于各类自然水体中亚硝酸根的含量测定，可以检测出黄河水、湖水及自来水样中亚硝酸根的含量，最低检测限分别为166 nM和100 nM，对于监测自然水体中有害的亚硝酸根含量，从而预防及保障人体健康产生积极的作用。本发明合成的紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，光学性质稳定，储存时间长，特异性好，灵敏度高，是一种简单有效的检测亚硝酸根的方法。附图说明
[0017] 图1为本发明所合成的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的1H谱。
[0018] 图2为本发明所合成的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的13C谱。
[0019] 图3为本发明所合成的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的高分辨质谱图。谱图+中395.1462 [M+H]为N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的分子离子峰。
[0020] 图4为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与亚硝酸根反应后产物的高分辨质谱图，谱图中515.1516[M+H+]为N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与亚硝酸根反应后产物的分子离子峰。
[0021] 图5为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的紫外吸收光谱。
[0022] 图6为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与亚硝酸根反应后产物的紫外吸收光谱(b)，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=3 HEPES缓冲溶液。
[0023] 图7为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的荧光发射光谱。
[0024] 图8为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与亚硝酸根反应后产物的荧光发射光谱，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=3 HEPES缓冲溶液。
[0025] 图9为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣在不同作用时间下的荧光强度变化，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=3 HEPES缓冲溶液。
[0026] 图10为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用前后在不同pH值下的荧光强度变化，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=012 HEPES缓冲溶液。
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[0027] 图11为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与各种被分析物作用的紫外可见吸收光谱，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=3 HEPES缓冲溶液。
[0028] 图12为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与各种被分析物作用的荧光发射光谱，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，200 μM NaNO2，pH=3 HEPES缓冲溶液。
[0029] 图13为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与不同浓度的NO2﹣作用后的紫外-可见吸收光谱变化
[0030] 图14为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与不同浓度的NO2﹣作用后的紫外最大吸收强度与NO2﹣浓度的线性关系，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，pH=3 HEPES缓冲溶液，NO2﹣: 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10 μM。
[0031] 图15为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与不同浓度的NO2﹣作用后的荧光发射光谱变化
[0032] 图16为本发明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与不同浓度的NO2﹣作用后的最大荧光强度与NO2﹣浓度的线性关系，测试体系为10 μM N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，pH=3 HEPES缓冲溶液， NO2﹣: 0, 0.1, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 12, 15, 20, 50, 100 μM。
具体实施方式
[0033] 下面结合附图和实施例及实验例对本发明技术方案再做进一步说明：
[0034] 实施例1
[0035] 将661 mg 5-氨基吲哚置于250 mL圆底烧瓶中，将其溶于100 mL无水乙腈中，室温搅拌，氮气保护下，加入7.5 mL三乙胺及18 mg 4-二甲氨基吡啶。将510 mg 2,6-吡啶二甲酰氯溶于无水乙腈中，并将其滴入上述溶液中，立即有白烟生成，室温搅拌12小时，直到有固体析出，反应完成后将溶剂蒸除，固体用水洗涤，过滤后继续用乙腈进行洗涤三次，30℃真空干燥，得到紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，产率72%。
[0037] 探针合成后用核磁共振波谱仪对产物进行测试，得到其氢谱图1，证明有17个氢原子，其化学位移数据为：
[0038] 1H NMR (400 MHz，d6-DMSO) δ 10.95 (s, 2H), 10.88 (s, 2H ), 8.37 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 8.24 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 8.06 (s, 2H), 7.51 (dd, J = 8.6, 1.0 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.32 (s, 2H), 6.45 (s, 2H)。
[0039] 得到其碳谱图2，证明有23个碳原子其化学位移数据为：
[0040] 13C NMR (101 MHz, ) δ 162.02 (s), 150.07 (s), 140.08 (s), 134.07 (s), 130.41 (s), 128.12 (s), 126.58 (d, J = 14.8 Hz), 125.21 (s), 117.44 (s),
113.85 (s), 111.64 (s), 101.81 (d, J = 9.1 Hz)。
113.85 (s), 111.64 (s), 101.81 (d, J = 9.1 Hz)。
[0041] 高分辨质谱图3显示其分子量为ESI-MS m/z (M + H+) =395.1462。
[0042] 以上表征证明了化合物N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺合成成功。
[0043] 下面，本发明通过高分辨质谱、紫外吸收光谱、荧光发射光谱实验对紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺对亚硝酸根的检测性能进行了试验。
[0044] 1. 高分辨质谱试验
[0045] N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺分子合成成功后，首先本发明研究了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺分子与亚硝酸根的作用机理。
[0046] 向N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺中加入200 μM的NO2﹣，37℃水浴中孵化30分钟(pH=3,HEPES)后，在m/z: 515.1516处出现分子离子峰（图4），分子离子峰的出现证明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与亚硝酸根发生作用，这与推测的反应机理是一致的。
[0047] 2. 紫外荧光试验
[0048] 分别测定N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺中加入NO2-前后的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。
[0049] 在pH=3的HEPES缓冲溶液中测定N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用前后的紫外和荧光性质变化。首先本发明测定了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用前后的紫外-可见吸收光谱，如图5所示， N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在270 nm处有强烈的紫外吸收，而N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用后，图6显示在520 nm处出现新的紫外吸收峰。
[0050] 本发明还测定了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用前后的荧光发射光-谱，图7显示N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在360 nm处有强烈的荧光发射，当加入NO2后，荧光发生猝灭（如图8）。
[0051] 3. 响应时间实验
[0052] 确定了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用前后的吸收和发射光谱性质﹣后，本发明对N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2的作用时间进行了研究。图9表明，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以在30分钟内与NO2-达到反应平衡，其360 nm处的荧光完全猝灭（λex = 270 nm）。
[0053] 4. pH值的选择
[0054] 分别测定了pH=0~12范围内N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2-作用前后的荧光强度变化（如图10）。实验结果表明， 当pH=7 12范围内，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲~酰胺与NO2-作用前后均几乎无荧光，而pH为3时探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺荧光强度达到最大值，此刻当加入NO2-后，荧光基本猝灭，因此，选择在pH=3.0的HEPES缓冲溶液中进行测试。
[0055] 5. 选择性实验
[0056] 为了研究N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺探针对NO2﹣的识别能力，本发明将N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺分别与被分析物F-, Cl-，Br-，I-，HCO3-， SO42-，SO32-， H2PO4-， P2O74-，CH3COO-，ClO4-，NO3-， NO2﹣在37℃水浴中孵化30 min，孵化完成后，分别测定了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与各种被分析物的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。如图11所示，用紫外-可见分光光度计记录紫外吸收光谱，当N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2﹣作用时，其紫外吸收光谱在520 nm处出现新的吸收峰，而与其他被分析物作用后，其紫外光谱没有发生较大变化，且在520 nm的可见光区没有出现新的吸收峰。如图12所示，用荧光分光光度计记录N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在270 nm激发波长下，在360 nm﹣处的荧光发射光谱，当N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺与NO2 作用时，其荧光发射光谱在
360 nm处的荧光发生猝灭，而与其他被分析物作用后，其荧光发射光谱没有发生任何变化。
这一结果证明，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以对NO2-实现特异性的识别。
360 nm处的荧光发生猝灭，而与其他被分析物作用后，其荧光发射光谱没有发生任何变化。
这一结果证明，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以对NO2-实现特异性的识别。
[0057] 6. 浓度滴定实验
[0058] 本发明研究了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺对于NO2﹣的定量检测能力。本发明分别用紫外吸收和荧光发射光谱对其定量性能进行了考察。向不同体积的10 mmol/L NaNO2中分别加入20.0 μL、1 mM 的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，用10 mol/L的pH=3的HEPES缓冲溶液定容至2 mL，37℃水浴中孵化30 min。孵化完成后，用紫外-可见分光光度计记录N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺及其与亚硝酸钠反应后产物的紫外吸收光谱，用紫外可见分光光度计记录N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在270 nm波长下的紫外吸收光谱。由图13可以看出，随着NO2﹣浓度的增加，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在270 nm处的紫外吸收增强，在520 nm处出现新的紫外吸收峰，并且逐渐增强，此外，270 nm处的吸收强度与NO2﹣(0-4 μmol/L)的浓度呈现出了良好的线性关系（回归方程y = 0.0687 + 0.552 × [NO2-], R = 0.994），检出限(LOD, S/N = 3)可以达到166 nM (σ = 0.00144)（图14）。
[0059] 同时，本发明还用荧光光度计记录N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺及其与亚硝酸钠反应后产物的荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰﹣胺在270 nm激发波长下的荧光发射光谱，如图15所示，随着NO2 浓度的增加，N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺在360 nm处的荧光发射强度逐渐降低，并且与NO2﹣(0-10 μmol/L)的浓度呈现出了良好的线性关系（回归方程y = -0.00124 + 0.05721 × [NO2-], R =
0.993），检出限(LOD, S/N = 3)可以达到100 nM (σ = 0.428)（图16）。这一结果表明，N,﹣
N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以在紫外-可见吸收和荧光发射两种模式下对NO2进行定量分析。
0.993），检出限(LOD, S/N = 3)可以达到100 nM (σ = 0.428)（图16）。这一结果表明，N,﹣
N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以在紫外-可见吸收和荧光发射两种模式下对NO2进行定量分析。
[0060] 7. 黄河水、湖水和自来水中亚硝酸根含量的测定实验
[0061] 在系统的研究了N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺的光学性质以后，本发明将其应用于实际样品——黄河水、湖水和自来水中样品中NO2﹣含量的测定。为此，本发明直接测定了黄河水样中NO2﹣的含量，并且采用加标回收的方法测定了黄河水、兰州大学毓秀湖湖水和自来水样中NO2﹣的含量。实验测得的三种不同实际样品中NO2﹣的含量与传统的Griess方法测定的结果相近（表1, 2），证明N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺可以应用于实际样品中NO2﹣的定量测试。具体方法为：
[0062] a.样品处理
[0063] 黄河水样取自黄河兰州段，所取得水样用0.45 μm的微孔滤膜过滤；移取50 μL NaNO2(10 mM)，用过滤后的黄河水定容至10 mL。
[0064] 湖水水样取自兰州大学毓秀湖，所取得水样用0.45μm的微孔滤膜过滤，移取25 μL NaNO2(10 mM)，用过滤后的湖水定容至10 mL。
[0065] 自来水样取自实验室用水，移取25 μL NaNO2(10 mM)，自来水定容至10 mL。
[0066] b. 紫外法测定实际样品中NO2﹣含量
[0067] 取1980 μL上述处理好的实际样品，用1 mol/L的HCl调节pH值为3.0，分别加入20 μL的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，摇匀，37 ℃下孵化30 min，用紫外-可见分光光度计记录其紫外吸收光谱。
[0068] c. 荧光法测定实际样品中NO2﹣含量
[0069] 取1980 μL上述处理好的实际样品，用1 mol/L的HCl调节pH值为3.0，分别加入20 μL的N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺，摇匀，37 ℃下孵化30 min，用荧光分光光度计分别采集360 nm处发射光谱强度（270 nm激发）。
[0070] d. Griess法测定实际样品中NO2﹣含量
[0071] Griess试剂配制：
[0072] 称取50 mg对氨基苯磺酰胺，用超纯水定容至50 mL得1%的对氨基苯磺酰胺；称取500 mg萘乙二胺，用5%的磷酸定容至50 mL得到1%的萘乙二胺。将1%对氨基苯磺酰胺与1%萘乙二胺按照体积比1:1混合，得到Griess试剂，避光冷藏储存，半小时内用完。
[0073] 标准曲线建立，向100 μL的Griess试剂中，分别加入(0,15, 30, 75, 150, 225, 300.0 μL、1 mM)的NaNO2，用超纯水定容至1 mL，摇匀，室温孵化30 min后，记录其在波长为
548 nm处的吸光度数值。并根据浓度与吸光度的关系绘制标准曲线。
548 nm处的吸光度数值。并根据浓度与吸光度的关系绘制标准曲线。
[0074] 建立曲线后，取2.9 mL上述处理好的实际样品，加入100 μL的Griess试剂，摇匀，室温孵化30 min，记录其在波长为548 nm处的吸光度数值。根据标准曲线计算实际样品中的亚硝酸根含量。
[0075] Griess法与本发明测定黄河水样中亚硝酸根含量的比照结果：
[0076] 表1. Griess法与本发明测定黄河水样中的NO2﹣含量的比照
[0077]
[0078] Griess法与本发明加标回收法测定黄河水、湖水及自来水样中亚硝根含量的比照结果：
[0079] 表2 Griess法与本发明加标回收法测定黄河水、湖水及自来水样中NO2﹣含量的比照
[0080]
[0081] 通过对紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶二甲酰胺及其与亚硝酸根反应前后光学性质的研究，证明了本发明合成的紫外荧光分子探针N,N’-5-二吲哚-2,6-吡啶﹣二甲酰胺可以通过紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的分析方式实现对NO2的测定，相比传统的Griess方法，本发明合成非常简单，光学性质稳定，特异性好，灵敏度高，仅需一步即可以完成对亚硝酸根的检测，探针更易于保存，操作更加简单，在检测自然水中的亚硝酸根无疑是一种简便方法。
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