基于电致变色材料的H2S激活型探针及其生物应用
阅读：1027发布：2021-01-01
专利汇可以提供基于电致变色材料的H2S激活型探针及其生物应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种基于 电致变色 材料的H2S激活型探针及其 生物 应用。本 发明 利用电致变色材料，采取纳米沉淀技术，结合 肿瘤 靶向技术设计了一种新型的基于电致变色材料的H2S激活型探针，该探针包含电致变色材料、 荧光 染料、肿瘤细胞特异性靶向物质和两亲性 聚合物 。所述探针可应用于体内H2S检测和活体成像，具有高灵敏度、高组织穿透深度、高 信噪比 和实时无创等优势。另外，本发明还使用 光敏剂 作为 荧光染料 ，得到基于电致变色材料的H2S激活型光敏探针，同时结合靶向功能，能有效进入肿瘤细胞，在被H2S激活后，激光照射产生较好光动 力 学 治疗 效果，能够抑制肿瘤生长，通过调节内源性H2S的含量，可实现肿瘤的完全消除。，下面是基于电致变色材料的H2S激活型探针及其生物应用专利的具体信息内容。
1.基于电致变色材料的H2S激活型探针，包含电致变色材料、荧光染料、肿瘤细胞特异性靶向物质和两亲性聚合物。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述电致变色材料为具有如下通式(I)的化合物或其盐，所述化合物包括其对映异构体、非对映异构体、外消旋体或其混合物，其中：
Ar为苯基、取代苯基、或5-7元芳杂环，其中所述取代苯基为包括1～5个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基、磺酰基、氨基磺酰基和C1-C4取代的磺酰基；所述
5-7元芳杂环含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并至少含有一个选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和C5-C10芳香基的取代基；
X为阴离子，选自卤素离子、BF4-、SbF6-、NO3-、OH-、磷酸根、碳酸根、氨基酸阴离子、草酸根离子和柠檬酸离子。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述化合物为二阳离子型四芳基丁二烯(dicationic 1,1,4,4-tetraarylbutadiene)，结构式如下：
4.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光染料为半导体聚合物。
5.根据权利要求4所述的探针，其特征在于，所述半导体聚合物为MEH-PPV、PFDPP或PCPDTBT。
6.根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述肿瘤细胞特异性靶向物质是指能与肿瘤细胞特异性结合的物质，如叶酸、半乳糖。
7.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述荧光染料为光敏剂。
8.根据权利要求7所述的探针，其特征在于，所述光敏剂为罗丹明6G和NIR775等。
9.如权利要求4或5所述的探针在H2S检测和成像分析中的应用。
10.如权利要求7或8所述的探针在光动力学疗法中的应用。
基于电致变色材料的H2S激活型探针及其生物应用
技术领域
背景技术
[0002] H2S是继NO和CO之后的第三个气体信号分子，该分子在许多生物过程中起着至关重要的作用，例如神经传递，血管舒张和抗炎、内源性H2S具有松弛血管、抑制血管平滑肌细胞增殖。但异常H2S水平与多种疾病密切相关，例如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、糖尿病、肝硬化、肝炎和癌症等。因此，如何通过高选择性、高灵敏的方法检测生物体内H2S的水平已受到来自现代生物医学研究人员越来越多的关注。
[0003] 目前已经报道的H2S检测的方法，例如亚甲基蓝法、溴甲烷的色谱法、比色法和荧光探针法，其中前三种方法均需要牺牲活组织或细胞，对生物体会造成不同程度的损害，在医学应用上具有较大的限制。相较之下，荧光探针法因其快速简便、灵敏度高、对组织细胞无损等优点而倍受青睐。通过光学检测技术制备出的H2S响应性荧光探针，不仅可以检测出生物体内H2S的含量，还可以实现活细胞、组织和体内生物分子的可视化和监测。因此，激活型探针的设计和制备是H2S含量检测和生物成像技术发展的关键。
[0004] 目前的H2S激活型探针设计原理主要有利用叠氮化物反应、亲核加成反应和硫化铜沉淀法等，其在生物应用上存在许多问题和局限性，比如响应波长较短、组织穿透深度低、反应速率慢、不易修饰，缺少靶向性、以及缺少在活体上H2S相关疾病(肝炎和肿瘤)的影像。
[0005] 此外，激活型光敏剂可增强光动力学治疗(PDT)效果用于治疗癌症等疾病也具有重要的研究价值与意义。然而，常亮型光敏剂不仅对肿瘤组织具有光毒性，对正常组织也有光毒性。因此，目前研究重点在于选用特定的癌症相关的生物标志物来激活光敏剂，从而可控产生氧化性物种(ROS)选择性杀死肿瘤细胞，同时减少对正常组织的光毒性。在过去几年，可利用的生物信号包括pH、生物巯基、ATP等设计激活型光敏剂的探针引起研究者的大量关注。考虑到，H2S在许多癌症(如结肠癌、乳腺癌和卵巢癌)中大量存在。因此，利用H2S激活光敏剂用于可控释放ROS为癌症的精确治疗提供了一种有效的方法。
[0006] 电致变色材料可在电场作用或氧化还原刺激下发生电子转移过程，进而发射光谱性能变化，其已广泛应用于多个领域，比如氧化还原流电池和太阳能电池、光学传感器，彩色显示器和存储元件等。电子变色材料具有环境友好、生物毒性低等优点，其在生物分子检测和分子影像领域内的应用尚未报道。
发明内容
[0007] 发明人发现电致变色材料具有很强的光吸收，且可被还原剂还原变色，比如可以在生物体内还原剂(如H2S,Cys,Hcy,Vc,GSH等)的作用下发生快速颜色变化，且通过纳米沉淀法将电致变色材料包封制备成纳米颗粒后，可成功被H2S进行特异性还原，具有高选择性。基于此，本发明利用电致变色材料，采取纳米沉淀技术，结合肿瘤靶向技术设计了一种新型的基于电致变色材料的 H2S激活型探针，该探针包含电致变色材料、荧光染料、肿瘤细胞特异性靶向物质和两亲性聚合物；所述荧光染料的荧光光谱和电致变色材料的吸收光谱重叠。
[0008] 本发明的电致变色材料可为具有如下通式(I)的化合物或其盐，所述化合物包括其对映异构体、非对映异构体、外消旋体或其混合物，
[0009] 其中，Ar可为苯基、取代苯基、或5-7元芳杂环，其中所述取代苯基可为包括1～5个取代基，该取代基选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基、磺酰基、氨基磺酰基和C1-C4取代的磺酰基；所述5-7元芳杂环含有1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，并至少含有一个选自卤素、C1-C6 直链或支链烃基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、C1-C4烷氧基、巯基、C1-C4酰基和C5-C10芳香基的取代基；
[0011] 在本发明的实施例中，所述电致变色材料具体可为二阳离子型四芳基丁二烯(dicationic 1,1,4,4-tetraarylbutadiene)，其结构式如下：
[0013] 在本发明的实施例中，所述肿瘤靶向特异性物质是指能与肿瘤细胞特异性结合的物质，可为叶酸(FA)或半乳糖等。
[0014] 在本发明的实施例中，所述两亲性聚合物是含有聚乙二醇作为亲水基团的聚合物，具体可为DSPE-PEG。
[0015] 本发明提供的基于电致变色材料的H2S激活型近红外荧光成像探针可应用于体内H2S检测和活体成像，其克服了目前报导的H2S激活型探针的荧光发射波长较短，组织穿透深度低，反应速率慢等弱点，具有高灵敏度、高组织穿透深度、高信噪比和实时无创等优势。另外，由于H2S在多数肿瘤中大量存在，本发明又设计了基于电致变色材料的H2S激活型双发射光敏探针，具有较高的激活倍数，较快的反应速率等优点。同时结合靶向功能，探针能有效进入肿瘤细胞，探针在被H2S激活后，激光照射产生较好光动力学治疗效果，能够抑制肿瘤生长，通过调节内源性H2S的含量，可实现肿瘤的完全消除。综上，本发明为活体成像分析、癌症等疾病诊断检测和有效治疗提供了新的技术支撑。附图说明
[0016] 图1表示电致变色材料EM 12+在还原剂作用下转化为化合物2。
[0017] 图2为经包封的电致变色材料纳米颗粒12+-NPs的性能表征，以及其与 H2S和不同还原剂的反应性能图。其中，(a)表示通过纳米沉淀法制备纳米颗粒 12+-NPs，并将其在还原剂作用转化为2-NPs；(b)为12+和12+-NPs的紫外吸收光谱；(c)为纳米颗粒的透射电子显微照片；(d)为12+-NPs的动态光散射后得到粒径与数量占比；(e)为12+-NPs和12+-NPs(8μg/mL)2+
与NaHS反应后的紫外吸收光谱变化；(f)为1 -NPs与还原剂(Cys,Hcy,Vc,1mM；GSH,DTT,
5mM； NaHS,100μM)的反应动力学；(g)为12+-NPs与NaHS的反应动力学；(h)为表观速率常数(Kobs/S-1)与NaHS浓度的函数关系。
与NaHS反应后的紫外吸收光谱变化；(f)为1 -NPs与还原剂(Cys,Hcy,Vc,1mM；GSH,DTT,
5mM； NaHS,100μM)的反应动力学；(g)为12+-NPs与NaHS的反应动力学；(h)为表观速率常数(Kobs/S-1)与NaHS浓度的函数关系。
[0018] 图3为电致变色材料12+的荧光光谱图。其中，(a)为电致变色材料12+的紫外吸收与2+
半导体聚合物(MEH-PPV,PFDPP,PCPDTBT)的荧光光谱；(b)为 SPN830和1 -SPN830的荧光光谱；(c)为SPN700和12+-SPN700的荧光光谱； (d)为SPN580和12+-SPN580的荧光光谱。
半导体聚合物(MEH-PPV,PFDPP,PCPDTBT)的荧光光谱；(b)为 SPN830和1 -SPN830的荧光光谱；(c)为SPN700和12+-SPN700的荧光光谱； (d)为SPN580和12+-SPN580的荧光光谱。
[0019] 图4为探针12+-SNP830的结构及反应性能表征。其中，(a)为探针12+- SNP830的动态光散射后得到粒径与数量占比；(b)为探针12+-SNP830的透射电子显微照片和原子力显微成像图；(c)为探针12+-SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4-)2)与NaHS(350μM)还原的紫外吸收变化；(d)为探针 12+-SNP830与NaHS反应的荧光光谱的变化；(e)为探针12+-SNP830与不同浓度NaHS反应10min的荧光光谱；(f)为探针12+-SNP830与不同氧化剂和还原剂反应的荧光光谱(各反应物浓度1:350μM NaHS；2:1.25mM L-Cys；3:10mM GSH；4:1mM Hcy；5:1.25mM VC；6:1.25mM DTT；7:10μg/mL BSA；8:1mM H2O2；9:1mM ClO-；10:O2.-(100μM xanthine+22mU XO)；11:1O2(1mM H2O2+ 1mM ClO-)；12:ONOO-(1mM NaNO2+1mM H2O2)；13:300μM t-BuOOH；14: 300μM CuOOH)。
[0020] 图5为不同浓度NaHS下的荧光光谱变化图和荧光强度关系图，其中，(a)为人血清和12+-SNP830及12+-SNP830与0、5、10、20、30、40and 50 μM NaHS孵育10min后的荧光光谱变化图；(b)为不同浓度NaHS与荧光强度关系图。
[0021] 图6为活RAW264.7细胞中H2S的影像图和细胞荧光强度图。其中，(a) 为细胞在显示的条件下的荧光影像。显示的条件分别ZnCl2(300μM,10min), NaHS(1mM,1h),L-Cys(200μM,1h),PAG(50mg/L,0.5h)和L-Cys(200μM,1h), LPS(1μg/mL,6h)和L-Cys(200μM,1h),或PAG2+
(50mg/L,0.5h),LPS(1μg/mL, 6h)和L-Cys(200μM,1h)，探针1 -SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4- )2)，孵育细胞3h；(b)为细胞荧光强度的定量；(c)为溶酶体共定位分析。
(50mg/L,0.5h),LPS(1μg/mL, 6h)和L-Cys(200μM,1h)，探针1 -SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4- )2)，孵育细胞3h；(b)为细胞荧光强度的定量；(c)为溶酶体共定位分析。
[0022] 图7为探针12+-SNP830用于活体成像分析的图示。其中，(a)和(b)为探针 12+-SNP830(78.4/134μg PCPDTBT/12+(BF4-)2,100μL)对盐水和L-Cys(5 mmol/kg)和PAG(5mg/kg)处理的小鼠肝脏的实时影像及荧光强度的定量； (c)为药物处理的小鼠模型图；(d)为不同浓度LPS诱导的肝炎模型鼠的肝脏的影像；(f)为不同浓度LPS诱导的裸鼠肝脏中的CSE酶表达的凝胶电泳。
[0023] 图8为叶酸靶向探针12+-SNP830-FA的设计及被细胞摄取说明图。其中， (a)为叶酸靶向探针12+-SNP830-FA的设计；(b)为靶向探针12+-SNP830-FA通过叶酸受体(FR)介导被细胞摄取的说明图。
[0024] 图9为12+-SNP830-FA的理化性能表征。其中，(a)为12+-SNP830-FA的动态光散射；(b)为12+-SNP830-FA的透射电子显微照片；(c)为12+-SNP830-FA 的原子力显微照片；(d)为
12+-SNP830-FA的Zeta电位分析；(e)为12+-SNP830- FA和12+-SNP830的紫外吸收光谱；(f)为
12+-SNP830-FA与NaHS反应后的荧光光谱。
12+-SNP830-FA的Zeta电位分析；(e)为12+-SNP830- FA和12+-SNP830的紫外吸收光谱；(f)为
12+-SNP830-FA与NaHS反应后的荧光光谱。
[0025] 图10为12+-SNP830-FA对L-Cys上调的H2S的响应。其中，(a)为12+- SNP830-FA(28μg/mL PCPDTBT,48μg/mL 12+(BF4-)2)在显示条件下对活KB 细胞中H2S的影像，显示的条件分别是ZnCl2(300μM,10min),NaHS(1mM,1 h),L-Cys(200μM,1h),PAG(50mg/L,0.5h)和L-Cys(200μM,1h)；(b)为细胞荧光强度的定量。
[0026] 图11为靶向探针实现肿瘤实时影像的说明。其中，(a)为靶向探针12+- SNP830-FA、12+-SNP830-FA+L-Cys(1mM，25μL)和12+-SNP830的肿瘤实时影像；(b)为肿瘤荧光强度的定量；(c)为肿瘤的荧光信噪比。
[0027] 图12为H2S激活型靶向光敏探针12+-PSs-FA的结构图和物化性能表征。 (a)电致变2+
色材料1 的吸收光谱、光敏剂罗丹明6G和光敏剂NIR775的荧光光谱；(b)为光敏探针的透射电子显微照片；(c)为光敏探针原子力显微照片；(e) 为叶酸靶向的探针和非靶向探针的Zeta电位分析；(f)为靶向探针和非靶向探针的紫外吸收光谱。
色材料1 的吸收光谱、光敏剂罗丹明6G和光敏剂NIR775的荧光光谱；(b)为光敏探针的透射电子显微照片；(c)为光敏探针原子力显微照片；(e) 为叶酸靶向的探针和非靶向探针的Zeta电位分析；(f)为靶向探针和非靶向探针的紫外吸收光谱。
[0028] 图13为光敏探针与不同还原剂和氧化剂反应的表征。其中，(a)为光敏探针(48μg/mL 12+)与NaHS反应不同时间的吸收光谱；(b)光敏探针与NaHS反应不同时间的荧光光谱；(c)为光敏探针(48μg/mL 12+)与不同还原剂和氧化剂反应后的荧光光谱；(d)为光敏探针与不同还原剂和氧化剂反应后在780nm 的荧光强度。
[0029] 图14为光敏探针与NaHS反应的表征。其中，(a)为光敏探针(48μg/mL 12+)与不同浓度的NaHS反应10min的荧光光谱；(b)为光敏探针与NaHS反应 10min在555nm处的检测限；(c)为光敏探针与NaHS反应10min在555nm处的检测限；(d)为光敏探针与NaHS反应10min在
780nm处的检测限。
780nm处的检测限。
[0030] 图15为单线态氧荧光探针的表征。其中，(a)为被NaHS激活的光敏探针、未激活光敏探针(48μg/mL 12+)和单线态氧荧光探针(SOSG)分别在1W/cm2的808nm激光照射1min后，SOSG在528nm处的荧光强度变化；(b)为被不同浓度NaHS激活的光敏探针在1W/cm2的808nm激光照射1min后，SOSG的荧光光谱的变化；(c)为光敏探针在不同条件下的磷光光谱。
[0031] 图16为叶酸靶向光敏探针(48μg/mL 12+)对活KB细胞中NaHS的影像。显示的条件分别是ZnCl2(300μM,10min),NaHS(1mM,1h)和L-Cys(200μM,1 h)。
[0032] 图17为验证叶酸靶向光敏探针在活KB细胞内产生单线态氧能力荧光影像。
[0033] 图18经叶酸靶向光敏探针处理后的细胞凋亡分析。
[0034] 图19为叶酸靶向光敏探针进行活体上肿瘤的光动力学治疗的表征。其中， (a)为叶酸靶向光敏探针在活体上肿瘤的光动力学治疗示意图；(b)和(c)分别为小鼠注射探针12h后的荧光影像图和荧光强度定量；(d)和(e)分别为小鼠注射探针 12h的各离体器官的荧光影像图和荧光强度定量图(T:肿瘤,Li:肝脏,Ki:肾脏, Sp:脾脏,St:胃,Lu:肺H:心脏,In:肠,Bl:膀胱,Ut:子宫)；(f)为小鼠经16天处理前后的白光图(显示条件1-6分别为1:盐水；2:盐水+光照；3:12+-PSs-FA；4: ZnCl2+12+-PSs-FA+光照；5:12+-PSs-FA+光照；6:L-Cys+
12+-PSs-FA+光照)；(g) 为小鼠16天的对照组和治疗组的肿瘤组织白光图；(h)为图(f)中显示条件处理小鼠后，小鼠肿瘤体积和小鼠体重的变化；(j)为小鼠在(f)图中显示的条件处理2天后的H&E和TUNEL染色。
12+-PSs-FA+光照)；(g) 为小鼠16天的对照组和治疗组的肿瘤组织白光图；(h)为图(f)中显示条件处理小鼠后，小鼠肿瘤体积和小鼠体重的变化；(j)为小鼠在(f)图中显示的条件处理2天后的H&E和TUNEL染色。
具体实施方式
[0035] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0037] 实施例一.基于电致变色材料的H2S激活型探针的构建
[0038] 1.合成电致变色材料。
[0039] 根据下述路线合成电致变色材料12+(EM 12+)。
[0040] 2.包封EM 12+，制备纳米颗粒12+-NPs。
[0041] 本实施例中为了制备12+-NPs，0.43mg 12+(BF4-)2和10mg的DSPE- PEG2000溶于1mL的四氢呋喃中。然后在超声过程中将此溶液迅速注射入9 mL的二次水中，继续超声10min。接着，四氢呋喃在65℃、氮气鼓泡去除。获得的溶液用10K超滤管在3500rpm下超滤15min洗涤样品，获得的溶液放于4℃的冰箱中保存待用。由图2(b)所示，成功制备了纳米颗粒12+-
2+
NPs；图2 中，(c)和(d)显示制备得到的纳米颗粒1 -NPs具有均一的粒径和形貌；(e)-(h)显示包封后的纳米颗粒12+-NPs能被H2S特异性还原，反应速率高达96.6M-1s-1。
2+
NPs；图2 中，(c)和(d)显示制备得到的纳米颗粒1 -NPs具有均一的粒径和形貌；(e)-(h)显示包封后的纳米颗粒12+-NPs能被H2S特异性还原，反应速率高达96.6M-1s-1。
[0042] 3.制备H2S激活型探针
[0043] 为了制备H2S激活的不同发射波长的半导体聚合物纳米颗粒12+-SPNs, 0.43mg 12+-(BF4)2、PCPDTBT或MEH-PPV或PFDPP(0.25mg)和10mg的 DSPE-PEG2000溶于1mL的四氢呋喃中。然后在超声过程中将此溶液迅速注入 9mL的二次水中，继续超声10min。接着，四氢呋喃在65℃、氮气鼓泡去除。获得的溶液用10K超滤管在3500rpm下超滤15min。获得的溶液放于4℃的冰箱中保存待用。本实施例将电致变色材料12+和多种发射波长的半导体聚合物 (MEH-PPV,PFDPP,PCPDTBT，对应的荧光发射波长分别为580nm，700nm 和830nm)包封在两亲性聚合物DSPE-PEG中，分别制备了H2S激活型探针 12+-SPN830、12+-SPN700、12+-SPN580。
[0044] 图3中，(a)显示电致变色材料12+的吸收光谱与半导体聚合物MEH-PPV、 PFDPP、PCPDTBT的荧光光谱具有较好的光谱重叠；(c)-(d)显示电致变色材料 12+能使半导体聚合物MEH-PPV，PFDPP和PCPDTBT荧光猝灭，且荧光猝灭倍数可达25,60和15倍。
[0045] 4.H2S激活型探针12+-SPN830的性能表征
[0046] 本实施例对12+-SPN830的结构和光谱性能做了进一步研究。
[0047] 图4中，(a)和(b)显示12+-SPN830粒径在40-80nm，TEM图和AFM图显示粒径均一；(c)和(d)的紫外吸收光谱图和荧光光谱图显示，探针12+-SNP830 (28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4-)2)能被与H2S(350μM)在10min还原；另外，(e)和(f)显示该探针的检测限在0.7μM，且具有极好的选择性。
[0048] 实施例二.探针12+-SNP830对人血清中H2S的检测
[0049] 本实施例利用探针12+-SNP830对人血清中H2S进行了检测。
[0050] 具体方法：使用外源性H2S作为内标来测定血浆中H2S的浓度，具体方法为在200μL的人血浆中加入1μL的ZnCl2来清除血浆中的H2S，然后在其它 6组200μL的人血浆中依次加入1μL的二次水，5,10,20,30,40和50μΜ的 HS-，之后，在上述的血浆样品中加入12+-SNP830(终浓度为28μg/mL PCPDTBT,48μg/mL 12+(BF4-)2)，处理后的样品在37℃下孵育10min，用荧光仪测定溶液的荧光光谱，激发波长为650nm.
[0051] 图5中，(a)和(b)均显示探针12+-SNP830可以被人血清中的H2S激活，且可以定量出人血清中H2S的浓度为12.7±3.2μM。
[0052] 实施例三.探针12+-SNP830对活RAW264.7细胞内H2S的检测及活体成像分析[0053] 本实施例利用探针12+-SNP830对活RAW264.7细胞内H2S进行了检测。
[0054] 具体方法：RAW264.7细胞(～5×104)接种于共聚焦培养皿中，培养过夜。在细胞中加入12+-SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4-)2)，探针在 37℃下孵育3h，培养基被移除，用冷的PBS洗涤细胞1次，加入NaHS(1 mM)孵育1h，用冷PBS洗涤细胞3次。为了调控内源性的H2S的产生，未经任何处理的RAW264.7细胞中加入L-Cys(0,0.1,0.2和0.5mM)，然后孵育不同时间(0,0.5,1和2h)。同时为了清除内源性H2S，未经任何处理的的细胞中加入ZnCl2(0.3mM)，细胞孵育10min。为了抑制CSE酶的活性从而减少H2S的产生，细胞经PAG(50mg/L)处理0.5h，然后加入L-Cys(0.2mM)，细胞孵育1 h。为了上调CSE的含量，加入LPS(1.0μg/mL)孵育细胞6h，然后用L-Cys (0.2mM)孵育细胞1h。为了抑制CSE酶的活性，细胞用LPS(1.0μg/mL)孵育 6h，后加入PAG(50mg/L)孵育细胞0.5h，紧接着加入L-Cys(0.2mM)孵育细胞1h。上述处理后，细胞中加入12+-SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4- )2)，探针在37℃下孵育3h，然后探针被移除，用冷PBS洗涤细胞3次，之后，用共聚焦培养皿对细胞进行成像。激发滤光片为630-670nm，发射滤光片在 690nm以上。
[0055] 图6中，(a)和(b)显示探针12+-SNP830能够被内源性的H2S激活，且在L- Cys上调的H2S后，荧光进一步增强。同时，LPS上调CSE后，加入底物L- Cys后，H2S被上调，且荧光进一步增强。另外，与H2S的清除剂或CSE酶的抑制剂孵育后，细胞中H2S较少，探针在细胞中的荧光减弱。因此，探针12+- SNP830能够指示活细胞中H2S的浓度的变化。利用12+-SNP580对细胞共定位分析，发现探针的荧光能与溶酶体示踪剂的荧光重合，图6(c)显示探针能够有效的进入细胞溶酶体。
[0056] 实施例四.探针12+-SNP830对活体肝脏内的H2S的检测及或活体成像分析[0057] 本实施例利用探针12+-SNP830对活体肝脏内的H2S进行了检测。
[0058] 具体方法：小鼠经腹腔注射盐水(100μL)、L-Cys(1mM,100μL)或PAG (1mg/mL,100μL)。30min之后，经尾静脉注入探针12+-SNP830(78/134μg PCPDTBT/12+(BF4-)2，100μL)。为了监控LPS上调的肝脏的H2S的产生。小鼠经腹腔注射不同剂量的LPS(0,5,10和20mg/kg)，6h后，生理盐水(100μL) 或PAG(1mg/mL,100μL)经腹腔注射，30min后经腹腔注射L-Cys(1mM,100 μL)，30min后，探针12+-SNP830(78μg PCPDTBT and 134μg 12+(BF4-)2，100 μL)经尾静脉注入。用IVIS Lumina XR III成像仪对小鼠在不同时间进行成像，激发波长为780nm，发射波长为845nm。每一组实验执行3次重复实验。
[0059] 图7中，(a)和(b)显示探针12+-SNP830能够被肝脏内源性H2S激活，且能够被L-Cys上调的H2S进一步激活。(f)显示通过利用LPS上调肝脏CSE酶的表达，底物L-Cys存在时，能够对上调的H2S做出响应，肝脏的荧光增强，且对 LPS有浓度依赖性(图7(d)(e))。因此，本实施例证明探针12+-SNP830能够进行活体成像分析，且成功指示由炎症引起的肝脏内H2S含量的变化。
[0060] 实施例五.靶向探针12+-SNP83-FA的制备和物理表征
[0061] 本实施例在原探针中引入了肿瘤靶向特异性物质叶酸，制备了靶向探针 12+-SNP830-FA，并对其结构和光谱性能作了研究。
[0062] 具体方法：将0.43mg 12+(BF4-)2、PCPDTBT(0.25mg)和9.9mg的 DSPE-PEG2000和0.1mg的FA-DSPE-PEG2000溶于1mL的四氢呋喃中。然后，在超声过程中将此溶液迅速注入9mL的二次水中，继续超声10min。接着，四氢呋喃在65℃、氮气鼓泡去除。获得的溶液用10K超滤管在3500rpm下超滤15min。获得的溶液放于4℃的冰箱中保存待用。
[0063] 图9(a)-(e)显示靶向12+-SNP830-FA纳米探针成功制备，且粒径均一；图 9(f)显示叶酸靶向的探针荧光能够被H2S激活，激活倍数为15倍。
[0064] 实施例六.靶向探针12+-SNP83-FA对活KB肿瘤细胞内H2S的检测
[0065] 本实施例利用靶向探针12+-SNP830-FA对活KB细胞内的H2S进行了检测。
[0066] 具体方法：将KB细胞(～5×104)接种于共聚焦培养皿中，培养过夜。在细胞中加入FA-12+-SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4-)2)，探针在37℃下孵育1h，培养基被移除，用冷的PBS洗涤细胞1次，加入NaHS(1mM)孵育1h，用冷PBS洗涤细胞3次。为了调控内源性的H2S的产生，未经任何处理的KB细胞中加入L-Cys(0.2mM)，然后孵育不同时间(1h)。同时为了清除内源性H2S，未经任何处理的的细胞中加入ZnCl2(0.3mM)，细胞孵育10min。为了抑制CSE酶的活性从而减少H2S的产生，细胞经PAG(50mg/L)处理0.5h，然后加入L-Cys(0.2mM)，细胞孵育1h。上述处理后，细胞中加入FA-12+- SNP830(28/48μg/mL PCPDTBT/12+(BF4-)2)，探针在37℃下孵育1h，然后探针被移除，用冷PBS洗涤细胞3次，之后，用共聚焦培养皿对细胞进行成像。激发滤光片为630-670nm，发射滤光片在690nm以上。
[0067] 图10中，(a)和(b)均显示12+-SNP830-FA能够被内源性的H2S激活，对L- Cys上调的H2S做出响应，能够指示活KB细胞中H2S浓度的变化。
[0068] 实施例七.靶向探针12+-SNP830-FA对KB肿瘤组织的活体成像
[0069] 本实施例利用靶向探针12+-SNP830-FA对活KB肿瘤组织进行了活体成像。
[0070] 具体方法：将探针12+-SNP830-FA或12+-SNP830(78μg PCPDTBT and 134μg 12+(BF4-)2)经尾静脉注入带有肿瘤的裸鼠，3.5h后，生理盐水(25μL)、 ZnCl2(1mM,25μL)或L-Cys(1mM,25μL)注入肿瘤，用小动物成像仪对小鼠进行荧光成像，激发波长为780nm,发射波长为845nm。
[0071] 图11中，(a)、(b)和(c)均显示靶向探针12+-SNP830-FA能够被内源性H2S 激活，且存在酶的底物L-Cys时，探针被进一步激活，能够指示H2S浓度的变化，且L-Cys处理的小鼠的荧光信噪比达到3.9。因此，对小鼠尾静脉注射的 12+-SNP830-FA探针，实现了无创、实时影像肿瘤组织。
[0072] 实施例八.H2S激活型光敏探针的制备和物理表征
[0073] 本实施例利用电致变色材料12+、光敏剂、两亲性聚合物和叶酸进一步制备了靶向2+
型H2S激活的光敏探针1 -PSs-FA，并对其结构和光谱性能作了研究。
型H2S激活的光敏探针1 -PSs-FA，并对其结构和光谱性能作了研究。
[0074] 具体方法：将0.43mg 12+(BF4-)2、罗丹明6G(8.6μg)、NIR775(50μg)、 DSPE-PEG2000(9.9mg)和DSPE-PEG2000-FA(0.1mg)溶于1mL的四氢呋喃中。然后在超声过程中将此溶液迅速注入9mL的二次水中，继续超声10min。接着，四氢呋喃在65℃、氮气鼓泡去除。获得的溶液用10K超滤管在3500rpm 下超滤15min。获得的溶液放于4℃的冰箱中保存待用。
[0075] 图12(a)显示电致变色材料12+的吸收光谱能够与光敏剂罗丹明6G和光敏剂NIR775的荧光具有很好的光谱重叠；图12(b)-(d)所示制备的光敏探针具有均一的粒径和形貌；图12(e)(f)的Zeta电位分析和紫外吸收光谱证明了叶酸靶向的光敏探针12+-PSs-FA的成功制备。
[0076] 实施例九.H2S激活型光敏探针与H2S的反应性能研究
[0077] 本实施例对光敏探针与H2S的反应性能作了进一步研究。
[0078] 具体方法：将350μM NaHS加入到光敏探针(5.5μg/mL NIR775)中，每隔1min用紫外吸收光谱仪监测探针的紫外吸收变化。同时，利用荧光光谱仪监测了光敏探针12+-PSs-FA与350μM NaHS反应不同时间的荧光光谱。另一方面，考察了光敏探针(5.5μg/mL NIR775)与不同还原剂和氧化剂的反应性能, 光敏探针与还原剂(1)350μM NaHS；(2)0μM NaHS(control)；(3)1.25mM L-Cys； (4)10mM GSH；(5)1mM DL-Homocystein(Hcy)；(6)1.25mM
2-mercaptothanol (BME)；(7)1.25mM VC；(8)1.25mM DTT或氧化剂(9)1mM H2O2；(10)1mM ClO-；(11)O2.-(100μM xanthine+22mU XO)；(12)1O2(1mM H2O2+1mM ClO-)； (13)ONOO-(1mM NaNO2+1mM H2O2)；(14)tert-butylm hydroperoxide(t- BuOOH,300μM)；(15)cumene hydroperoxide(CuOOH,300μM)孵育10min，用荧光光谱仪监测光敏探针的荧光光谱。接着，本实施例考察了光敏探针对H2S 的检测限，光敏探针12+-PSs-FA与不同浓度的NaHS反应
10min，测定光敏探针的荧光光谱。
2-mercaptothanol (BME)；(7)1.25mM VC；(8)1.25mM DTT或氧化剂(9)1mM H2O2；(10)1mM ClO-；(11)O2.-(100μM xanthine+22mU XO)；(12)1O2(1mM H2O2+1mM ClO-)； (13)ONOO-(1mM NaNO2+1mM H2O2)；(14)tert-butylm hydroperoxide(t- BuOOH,300μM)；(15)cumene hydroperoxide(CuOOH,300μM)孵育10min，用荧光光谱仪监测光敏探针的荧光光谱。接着，本实施例考察了光敏探针对H2S 的检测限，光敏探针12+-PSs-FA与不同浓度的NaHS反应
10min，测定光敏探针的荧光光谱。
[0079] 图13中，(a)和(b)显示光敏探针与H2S反应在10min即可完成，具有较高的反应速率；(c)和(d)证明了光敏探针能够被H2S特异性激活。图14中，(a) 所示光敏探针与H2S的反应具有浓度依赖性，且具有较高的激活倍数，对于罗丹明6G检测限为19nM(图(b))，NIR775检测限为39nM(图(c))。
[0080] 实施例十.H2S激活型光敏探针产生单线态氧能力的研究
[0081] 本实施例对光敏探针产生单线态氧能力作了进一步研究。
[0082] 具体方法：将20μM的单线态氧荧光探针(SOSG)加入200μL的PBS、含光敏探针(5.5μg/mL NIR775)的PBS(200μL)或含用350μM NaHS与光敏探针(5.5μg/mL NIR775)反应10min中后的PBS中，用荧光仪监测SOSG 的荧光。同时，本实施例也考察了光敏探针(5.5μg/mL NIR775)与不同浓度的NaHS反应后，单线态氧的产生能力。具体方法为将20μM的SOSG加入含用不同浓度NaHS与光敏探针(5.5μg/mL NIR775)反应10min中后的PBS中，用荧光仪监测SOSG的荧光。另外，本实施例测定了探针12+-PSs-FA、12+-PSs- FA+NaHS或12+-PSs-FA+NaHS+NaN3(30mM)的磷光光谱。
[0083] 图15中，(a)显示探针在被H2S激活后，在1W/cm2的808nm激光照射 1min后，产生单线态氧，氧化SOSG产生荧光,且单线态氧的产生具有浓度依赖性(图(b))；同时，单线态氧的磷光光谱也证明了单线态氧的产生(图(c))。
[0084] 实施例十一.H2S激活型光敏探针的细胞摄取研究和对活细胞内H2S的检测[0085] 本实施例对光敏探针的细胞摄取作了进一步研究，并验证了其可检测活细胞内H2S含量。
[0086] 具体方法：KB细胞(～5×104)接种于共聚焦培养皿中，培养过夜。在细胞中加入12+-PSs-FA(5.5μg/mL NIR775)，探针在37℃下孵育1h，培养基被移除，用冷的PBS洗涤细胞1次，加入NaHS(1mM)孵育1h，用冷PBS洗涤细胞3次。为了调控内源性的H2S的产生，未经任何处理的KB细胞中加入L-Cys(0.2mM)，然后孵育不同时间(1h)。同时为了清除内源性H2S，未经任何处理的的细胞中加入ZnCl2(0.3mM)，细胞孵育10min。为了抑制CSE酶的活性从而减少H2S的产生，细胞经PAG(50mg/L)处理0.5h，然后加入L-Cys (0.2mM)，细胞孵育1h。上述处理2+
后，细胞中加入1 -PSs-FA，探针在37℃下孵育1h，然后探针被移除，用冷PBS洗涤细胞3次，之后，用共聚焦培养皿对细胞进行成像。
后，细胞中加入1 -PSs-FA，探针在37℃下孵育1h，然后探针被移除，用冷PBS洗涤细胞3次，之后，用共聚焦培养皿对细胞进行成像。
[0087] 图16证明了叶酸靶向光敏探针12+-PSs-FA能够有效进入细胞，且能被内源性H2S激活，同时能够影像内源性H2S的浓度变化。
[0088] 实施例十二.H2S激活型光敏探针在活细胞内产生单线态氧能力的研究[0089] 本实施例利用DCF-DA验证光敏探针在活细胞产生单线态氧能力。
[0090] 具体方法：设置多个实验组，在12+-PSs-FA+NaHS组中，探针12+-PSs- FA(5.5μg/mL NIR775)孵育细胞1h，然后用1mM NaHS孵育细胞1h。在 12+-PSs-FA+L-Cys组中，KB细胞用L-Cys(0.2mM)孵育1h，然后用探针12+- PSs-FA孵育细胞1h。在12+-PSs-FA+ZnCl2组中，KB细胞用ZnCl2(0.3mM) 孵育10min，然后探针12+-PSs-FA孵育细胞1h。上述处理后，细胞用DCFH- DA(20μM)孵育20min，接着用1W/cm2的808nm激光照射细胞5min。
[0091] 图17证明了光敏探针能够被细胞摄取，且被内源性H2S激活，在光照下产生单线态氧，进而将DCFH-DA氧化成DCF，释放出DCF的荧光，证明了单线态的产生。
[0092] 实施例十三.H2S激活型光敏探针的肿瘤细胞毒性研究
[0093] 本实施例说明了H2S激活型光敏探针对肿瘤细胞的毒性作用。
[0094] 具体方法：设置多个实验组，在12+-PSs-FA+NaHS，探针12+-PSs-FA (5.5μg/mLNIR775)孵育细胞1h，然后用1mM NaHS孵育细胞1h。在12+- PSs-FA+L-Cys组，KB细胞用L-2+
Cys(0.2mM)孵育1h，然后用探针孵育细胞1 h。在1 -PSs-FA+ZnCl2组，KB细胞用ZnCl2(0.3mM)孵育10min，然后探针12+-PSs-FA孵育细胞1h，接着用1W/cm2的808nm激光照射细胞
5min。对于对照组，细胞不作任何处理。对于12+-PSs-FA组，细胞用探针孵育1h，但不经光照。
最后，每个组的细胞均用Annexin V-FITC(5.0μL)和propidium iodide (PI)(5.0μL)染色，用流式细胞仪对细胞进行凋亡分析。
Cys(0.2mM)孵育1h，然后用探针孵育细胞1 h。在1 -PSs-FA+ZnCl2组，KB细胞用ZnCl2(0.3mM)孵育10min，然后探针12+-PSs-FA孵育细胞1h，接着用1W/cm2的808nm激光照射细胞
5min。对于对照组，细胞不作任何处理。对于12+-PSs-FA组，细胞用探针孵育1h，但不经光照。
最后，每个组的细胞均用Annexin V-FITC(5.0μL)和propidium iodide (PI)(5.0μL)染色，用流式细胞仪对细胞进行凋亡分析。
[0095] 图18所示在无探针存在时，有无光照都不会影响细胞的存活，加入探针后无暗毒性，在808nm激光照射下，细胞存活率下降，具有较高的光毒性，且在L-Cys存在时，其暗毒性增加，因此验证了本发明提供的光敏探针具有较好的光动力学效果。实施例十四.H2S激活型光敏探针的肿瘤成像与治疗
[0096] 本实施例验证了靶向H2S激活型光敏探针12+-PSs-FA对小鼠肿瘤的光动力学治疗作用。
[0097] 具体方法：待裸鼠KB肿瘤长成80-110mm3时分成6组，分别为1(生理盐水)，2(生理盐水和光照)，3(探针12+-PSs-FA)，4(探针12+-PSs-FA、硫化锌和光照)，5(探针12+-PSs-FA和光照)，6(探针12+-PSs-FA、L-Cys和光照)。生理盐水(200μL)或者探针12+-PSs-FA(55μg/mL NIR775,200μL)经尾静脉注入小鼠体内。对于4和6实验组，ZnCl2(1mM,25μL)和L-Cys(1mM,25μL)在注射探针3.5h瘤内注入。12h后，用小动物成像仪对小鼠进行成像，激发波长为740nm,发射波长为790nm。在成像引导下，对2,4,5和6组的小鼠的肿瘤用808nm激光器照射10min，激光的功率为1W/cm2。照射后，小鼠放于暗室 10min，接着，小鼠继续用808nm激光器照射2
10min，激光的功率为1W/cm。每2天监测一次小鼠的体重和肿瘤的体积直到16天为止。
10min，激光的功率为1W/cm。每2天监测一次小鼠的体重和肿瘤的体积直到16天为止。
[0098] 图19中，(b)-(e)显示本发明提供的靶向H2S激活型光敏探针能够影像内源性H2S的浓度变化，且能在肿瘤内源性H2S作用下荧光激活，经激光照射后，能够抑制肿瘤的生长；另外，(f)-(h)显示可以通过调节H2S的含量，基本实现肿瘤的消除；(i)显示治疗过程中小鼠的体重基本保持不变；(j)的H&E染色图显示了探针在不同条件下的治疗效果。
[0099] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变通和改进，这些都属于本发明的保护范围。
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