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细胞和病毒的快速灵敏检测

阅读：232发布：2021-06-21

专利汇可以提供细胞和病毒的快速灵敏检测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供快速并灵敏地鉴定医学、工业、和环境样品中的细胞和病毒靶的有效方法。本发明标记靶，然后利用大面积成像检测它们。基于本发明的诊断试验是快速、超灵敏、定量、多路、且自动化的。该试验可使样品制备减到最少，而且无需核酸扩增或细胞培养。本试验可检测多种细胞和病毒。基于本发明的试验可提供核酸扩增试验的高 水 平灵敏度，用户容易掌握使用，而且可提供 免疫测定 法的速度，以及由 微 生物 试验提供的低成本及量化。本发明实现现有诊断技术的最佳特征，同时解决了诊断系统中的 缺陷 。，下面是细胞和病毒的快速灵敏检测专利的具体信息内容。

1.一种检测样品中靶细胞或病毒的方法，其中所述靶
a.在至少两个正交维数中的测量值小于50微米，且
b.随机分散在检测区中，该检测区包括一个密度小于100个靶细 胞/mm2的检测面积，
其中所述方法包括下列步骤：
a.照射所述靶细胞，产生可检测的信号，并
b.利用小于或等于20倍的放大率同时检测所述检测面积一部分 中的信号，其中所述部分的最长线性尺寸大于1mm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，在使类目 结合分子与所述靶上的类目特异性结合位点特异性结合的条件下，使 所述靶与类目结合分子接触，从而形成复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用一个或多个信号传递部分直 接或间接标记类目结合分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述检测是检测所述复合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品与信号传递部分接 触，该信号传递部分与所述靶细胞直接或间接缔合。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述复合物以小于10个复合 物/mm2检测面积的密度随机分散在检测区中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶以小于1个复合物/mm2 检测面积的密度随机分散在检测区中。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测无需放大超过5X。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述检测无需放大超过2X。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述检测无需放大超过1X。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述检测无需放大超过 0.2X。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶是细菌或真核生物细 胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶是病毒。
14.根据权利要求1所述的方法，其中类目复杂度为。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶细胞包括来源于下列 两个或多个分类群的细胞：病毒，细菌，真菌，植物，多细胞动物， 和原生生物。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测并鉴定靶的 一个以上非重叠类目。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子特异性结 合天然或重组的抗体或适体。
19.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子特异性结 合DNA，RNA，或PNA探针。
20.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子特异性结 合与核酸多态性，包括单核苷酸多态性紧邻的位点。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品含有从多细胞生物 获得的液体或组织。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品含有动物的体液或 组织。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品来源于人类。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品来源于非人脊椎动 物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品是下列的一员、或 来源于：呼吸道，泌尿生殖道，生殖道，中枢神经系统，尿液，血液， 皮肤，血浆，血清，唾液，创伤组织，创伤渗出物，活组织检查物， 粪便，和实体组织的样品。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来源于植物。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是通过从环境空气 或水，或与环境接触的表面，物体，或生物采集样品而获得的。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品选自、来源于、或 从下列成分获得：在药物，化妆品，血液，或表面或内部用于人或动 物中的其它产品的制造过程中的原料，成品或半成品；食品或饮料制 造过程中的原料，成品或半成品；医疗或体外诊断装置制造过程中的 原料，半成品或成品；化学品；工业表面；仪器；和机械。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法检测一种或多种物 质或处理对所述靶细胞的作用。
30.根据权利要求1所述的方法，其中选择法用于将所述靶沉积在 所述检测表面上，且其中所述选择法是磁性选择，离心，沉降，和过 滤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括使样品接触与 类目结合分子偶联的磁性粒子。
32.根据权利要求30所述的方法，其中在不使用选择部分的情况 下，利用所述选择法中的一种使靶沉积在所述检测区中。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述靶与靶特异性选择部分 在液体中接触，该靶特异性选择部分的平均密度大于所述液体的平均 密度，且随后利用重力，离心力，或向心力在所述检测表面上沉积。
34.根据权利要求1所述的方法，其中处理所述样品使其液化和/或 均化。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触发生在液相中。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触发生在液相和固相 之间的界面上。
37.根据权利要求1所述的方法，其中处理所述样品，从而将所述 靶之外的物质或物体除去。
38.根据权利要求2所述的方法，其中在所述接触之前，将所述靶 固定在所述检测表面上。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶通过与检测区的基质 或底物结合的类目结合分子而特异性结合在检测区中。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶通过与检测区的基质 或底物形成化学键而特异性结合在检测区中。
41.根据权利要求1所述的方法，其中利用选自风干、热固定、和 化学固定法的方法将所述靶固定在所述检测区中。
42.根据权利要求2所述的方法，其中处理所述样品，从而使所述 靶上的类目特异性结合位点更容易与所述类目结合分子接触。
43.根据权利要求3所述的方法，其中在所述检测之前，除去所述 复合物中的未结合信号传递部分。
44.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分具有光子 信号传递特征，且其中可加入胶态或可溶性物质来吸收由不在所述检 测区中的信号传递部分发射的信号。
45.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品细分成用于平行 测试靶的不同非重叠类目的存在的各个等分试样。
46.根据权利要求45所述的方法，其中使每份等分试样与标记粒子 群接触，而所述标记粒子群与类目结合分子的不同非重叠家族偶联。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述样品与特异性结合靶实 体的非重叠类目的类目结合分子不同家族连续接触。
48.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测区包括选自固体玻 璃，固体塑料，微量滴定平板孔的表面，吸水薄膜，塑料带，毛细管 的表面，微流室的表面和微流通道的表面的物质。
49.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括侧流色谱法。
50.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法自动在一系列样品 上重复。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述样品可自动加样到包括 所述检测工具的仪器上。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述样品可自动沉积在一系 列检测区中，其中所述一系列检测区在物理上关联，并可自动连续加 样到包括所述检测工具的仪器上。
53.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法检测由于所述复合 物的照射而发射，散射，反射，或吸收的光。
54.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测荧光。
55.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测非照射的化 学发光。
56.根据权利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一束或多 束激光。
57.根据权利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一个或多 个发光二极管。
58.根据权利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括白光源。
59.根据权利要求1所述的方法，其中所述照射工具包括一个或多 个滤光器，该滤光器适合用波长适于检测所述复合物的光照射所述样 品。
60.根据权利要求3所述的方法，其中所述照射工具包括一个或多 个滤光器，该滤光器适合用波长适于检测所述信号传递部分的光照射 所述样品。
61.根据权利要求3所述的方法，其中用于检测所述发射、散射、 透射、或吸收光的工具包括滤光器，该滤光器适于检测源于所述信号 传递部分的照射的信号。
62.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测热辐射。
63.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测吸光度。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述吸光度是指红外区中 的。
65.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测荧光。
66.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测细胞自发荧 光。
67.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测荧光偏振。
68.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测光反射。
69.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测光散射。
70.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测是检测拉曼散射。
71.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子直接或间 接与标记粒子偶联。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述标记粒子小于20微米。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述标记粒子小于10微米。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述标记粒子小于5微米。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述标记粒子小于1微米。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述标记粒子小于100nm。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述标记粒子小于10nm。
78.根据权利要求71所述的方法，其中所述标记粒子含有平均密度 大于或等于2个酶信号传递部分/立方微米粒子体积的酶信号传递部 分。
79.根据权利要求71所述的方法，其中所述含有信号传递部分的标 记粒子是用信号传递部分染色或与信号传递部分偶联的粒子，所述信 号传递部分具有荧光信号特征，并选自：有机荧光团，上调型磷光体， 镧系元素，量子点，和从非荧光底物产生荧光产物的酶。
80.根据权利要求71所述的方法，其中所述标记粒子是胶乳粒子， 二氧化硅粒子，量子点，共振光散射粒子，向上转换型磷光体，或主 要由金或银组成的粒子。
81.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分是酶信号 传递部分。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述信号传递部分是碱性磷 酸酶或辣根过氧化物酶。
83.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分选自有机 荧光团，上调型磷光体，镧系元素，量子点，以及从非荧光底物产生 荧光产物的酶。
84.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分具有荧光 信号传递特征。
85.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分具有化学 发光信号传递特征。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述分子是acridinium酯。
87.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分具有产色 信号传递特征。
88.根据权利要求3所述的方法，其中所述信号传递部分具有光散 射信号传递特征。
89.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子包括抗体。
90.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子包括适体。
91.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子包括核酸 或肽核酸。
92.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子包括配体。
93.根据权利要求2所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于100kD的分子。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于10kD的分子。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述类目结合分子包括分子 量小于1kD的分子。
96.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品与所述类目结合分 子的整体接触，其中所述整体包括对所要检测的靶实体的每个非重叠 类目特异的其中一个类目结合分子家族。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子的所有家 族都用信号传递部分标记，该信号传递部分可发射相同信号特征和信 号传递种类的信号。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子的每个家 族是用发射不同种类信号的信号传递部分标记的。
99.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子整体的家 族复杂度为1。
100.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子整体的 家族复杂度大于1。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述整体的家族复杂度 ≥5。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述整体的家族复杂度 ≥10。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述整体的家族复杂度 ≥20。
104.根据权利要求96所述的方法，其中所述整体含有至少10种不 同类型的类目结合分子。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述整体含有至少50种 不同类型的类目结合分子。
106.根据权利要求96所述的方法，其中类目结合分子的每个类目 特异性家族含有至少2种不同的类目结合分子。
107.根据权利要求106所述的方法，其中每个类目特异性家族含有 至少10种不同的类目结合分子。
108.根据权利要求96所述的方法，其中所述靶细胞的非重叠类目 是通过它们在所述检测面积中的差别定位鉴定的。
109.根据权利要求96所述的方法，其中类目结合分子的每个家族 具有相同的信号标志。
110.根据权利要求96所述的方法，其中所述靶细胞的非重叠类目 是通过检测并区别由所述信号传递部分赋予所述类目结合分子的类目 特异性家族的不同信号标志而鉴定的。
111.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记粒子含有不同的群 体，其中每个群体与类目结合分子的不同非重叠家族偶联。
112.根据权利要求96所述的方法，其中所述每个家族特异性结合 靶的类目，该靶的类目特异性结合类目结合分子的家族，而该类目结 合分子的家族与检测区的一部分稳定结合，其中与检测区结合的所述 每个家族结合不同的位点，其中所述位点可通过所述检测区别。
113.根据权利要求96所述的方法，其中所述每个家族具有相同的 信号传递种类和信号传递标志。
114.根据权利要求96所述的方法，其中所述每个群体具有不同的 信号传递标志或信号传递种类。
115.根据权利要求96所述的方法，其中所述方法包括适于区别所 述类目结合分子家族的信号标志的滤光器。
116.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度大于1。
117.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度≥5。
118.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度≥10。
119.根据权利要求96所述的方法，其中所述类目结合分子家族的 家族复杂度≥20。
120.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测发生在容器中，该 容器是条形码或用于自动追踪样品的等同标记。
121.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测发生在具有登记标 记的表面上，便于多个像在同一表面上排列。
122.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法可检测检测区的指 定区域中的对照标记或对照细胞。
123.根据权利要求53所述的方法，其中用于检测所述发射，散射， 透射，或吸收光的工具包括滤光器，该滤光器适于检测源于所述复合 物的照射的信号。
124.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电检测器的 使用。
125.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电阵列检测 器的使用。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述光电检测器包括CCD 或CMOS检测器。
127.根据权利要求53所述的方法，其中所述用于检测发射，散射， 或吸收光的工具不包括像增强器。
128.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电倍增管检 测器的使用。
129.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括光电二极管检 测器的使用。
130.根据权利要求1所述的方法，其中检测和鉴定所述靶的工具包 括光敏胶片。
131.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括直接目测。
132.根据权利要求1所述的方法，其中靶的数目是通过分析由所述 检测获得的像而从所述检测推断的。
133.根据权利要求1所述的方法，其中靶的类目是使用像分析软件 根据所述检测推断的。
134.根据权利要求123所述的方法，其中所述像分析软件还包括用 于分辨由所述复合物产生的信号与其它信号的功能。
135.一种检测样品中靶细胞的方法，其中所述靶细胞
a.在至少两个正交维数中的测量值小于50微米，且
b.以小于100个靶细胞/mm2的密度随机分散在基本处于一个平 面上的检测面积中，
c.其中所述方法包括在不照射的条件下，使用不包括像增强器的 光电检测器同时检测所述检测面积一部分中的靶实体，其中所述部分 的最长线性尺寸大于1mm。
136.一种检测样品中靶细胞的方法，其中所述靶细胞
a.在至少两个正交维数中的测量值小于50微米，且
b.以小于100个靶细胞/mm2的密度随机分散在含有检测面积、 基本处于一个平面上的检测表面中，
c.其中所述方法同时检测所述检测面积一部分中的靶细胞，其中 所述部分的最长线性尺寸大于1mm，且其中所述检测不包括：
i.使用光检测器，或
ii.照射所述检测面积，
iii.细胞或病毒培养。

说明书全文

发明背景

本发明涉及医学、工业、或环境样品中细胞和病毒的鉴定。

概述

检测、计算、和鉴定低水平的特定细胞及病毒是常规医学、工业、 和环境诊断的基础。例如，对样品进行分析从而检测感染剂，癌细胞， 食物病原体，药物和化妆品的微生物污染物，以及水和环境中的微生 物。

简言之，下面的讨论集中在常规的医学诊断上；类似的方法可用 于工业和环境应用。

微生物学方法

微生物培养通过利用它们迅速大量繁殖的趋势而进行微生物(例 如，细菌，病毒，和真菌)的简单目测。例如，单一细菌细胞因为太 小(约百万分之一米)而不能用内眼看到，当放在营养肉汤中时，肉 汤在24小时内明显变浑浊。

相关的微生物培养技术，也被称作微生物计数或集落计数，可量 化样品中的微生物细胞数。以原位微生物复制为基础的微生物计数方 法，通常相对于样品中的每种微生物细胞产生一个可目测的“集落”。 因此，计算可见集落数可使微生物学家准确测定样品中的微生物细胞 数。为了进行微生物计数，可将细菌细胞分散在陪替氏培养皿中营养 琼脂(“琼脂平板”)的表面上，并在可以进行原位细菌复制的条件下 培养。单一的，不可目测的微生物反复复制，在祖代微生物细胞沉积 的位置产生大量相同的子代微生物。子代细胞持续与原始细胞共同-定 位(基本相连)，这样子代细胞群(它们可生长至几千万或几亿个细 胞)最终在平板上形成肉眼可见的集落。

微生物培养是一种非常成功的方法，这是因为即使在一个多世纪 后，该方法仍然支配着医学微生物学和工业微生物学中的质量控制试 验(例如，药物，食品，和饮料的制造)。该方法便宜，相对简单， 而且超-灵敏。微生物培养的灵敏度可在绞细牛肉中的食源性病原体的 普通试验中观察到。单一显微细菌病原体细胞可利用微生物培养，在 25g绞细牛肉中检测。微生物培养的其它优点是其检测各种具有医学 和工业重要性的微生物的能力。

某些病毒可在培养物中生长。病毒培养已经特别用于研究中的速 生噬菌体(感染细菌的病毒)。病毒培养有时用于诊断临床感染，尽 管现在正越来越多地使用核酸扩增替代该方法。

传统的微生物培养较慢—它要花费较长时间来产生病毒检测所需 数量的细胞或病毒。微生物培养所需的较长生长周期是保健和工业中 的重要问题。例如，因为它需要几天时间来培养并鉴定导致患者血液 感染的微生物，因此真菌血液感染的患者甚至可能在开始抗-真菌治疗 之前就已经死亡。某些感染剂，如引起肺结核的细菌，通常需要在培 养物中生长几周。检测结核分枝杆菌所需的较长时间可导致肺结核患 者感染很多其它高度传染性的疾病，或导致没有肺结核的患者在检疫 期的花费较高。在食物的制造中，较长的试验周期可能增加食物变质。 缓慢的微生物培养还会不利地影响生物药和疫苗的生产。

现在已经发展了很多更快速进行微生物计数的微生物培养方法。 其中一种较为快速的方法可使细菌细胞沉积在涂覆了营养培养基的显 微镜载玻片上。利用显微镜检查，可比用肉眼更早地检测微生物生长， 这是因为显微镜可检测由于少数细胞分裂产生的小菌落。商业化系统 Colifast Rapid Microcolony Counter(Colifast)可在肉眼看到之前几小 时检测少量荧光标记的大肠埃希氏菌集落。Colifast系统利用包含在 营养琼脂培养基中的荧光化合物(非荧光的，直到被大肠埃希氏菌代 谢的物质)提高检测。利用生物发光标记快速计算微生物集落数的系 统近来已经商业化。MicroStar系统(Millipore)利用小菌落中的细胞 ATP，经由所用荧光素酶和底物的作用产生光。该方法可大大减少检 测时间。MicroStar成像系统已经与标记探针联合用于鉴定特定的细菌 (Stender，H.等，(2001)J.Microbiol Methods 46：69-75)。

免疫学方法

免疫学试验，或免疫测定法，在医学诊断中常常用于鉴定特定的 细胞和病毒。免疫测定法可检测抗体与靶和病毒分子成分上的位点的 特异性结合。血清学试验属于免疫测定法，它不是直接测试抗原，而 是测试宿主对先前与抗原接触的免疫应答—例如，它们可测试宿主对 特定细胞和病毒的抗体的存在。有很多免疫测定系统都可使用，例如 从大型自动化中心实验室系统，到可直接进行的合法妊娠试验。该试 验包括多种形式，如凝集测定法，沉淀素测定法，酶联免疫测定法， 直接发荧光测定法，免疫-组织学试验，补体结合测定法，血清学试验， 免疫-电泳测定法，和快速“带状”试验(例如，侧流和流通试验)。 免疫学试验可以非常简单而且快速。因此，绝大多数理想试验，例如 可在医生办公室或由患者在家进行的那些，是免疫学试验。

基因方法

基因方法是用于检测并鉴定细胞和病毒中核酸分子的普通且有效 的工具。近来已经发展了以核酸扩增为基础、超灵敏检测并区别细胞 和病毒的核酸含量的革命性新方法。例如，商业试验可检测少数亚显 微HIV病毒粒子的核酸(例如，50个粒子/ml)。扩增技术包括聚合酶 链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)， 转录介导的扩增(TMA)，和滚环扩增(RCA)。扩增法可提供令人印 象深刻的分析灵敏度，而且中等快速，例如，Smart Cycler(Cepheid) 可在一小时内产生结果(Belanger，S.D.等，(2002)Journal of Clinical Microbiology 40：1436-40)。

显微成像方法

显微成像是检测细胞和病毒的一种最普遍的方法。例如，通过用 染料，抗体，或核酸探针标记，可在显微镜下观察靶。显微分析的灵 敏度可利用如催化报道基因沉积(CARD)的方法来提高，其已经用 于检测人细胞中单一拷贝水平的病毒基因组(Huang，C.C.等，Modern Pathology 11：971-7，1998)。用于增加原位杂交灵敏度的其它方法依 赖于原位扩增或复制，或利用，例如，支链DNA的信号扩增或dendrimer 技术(例如，Orentas，R.J.等，Journal of Virological Methods 77：153-63， 1999)。

多重荧光标记可用于使用原位分析立刻检测多种病原体。例如， 不同类目(category)特异性抗原的抗体可用不同的荧光标记来标记。 组合标记策略也已经与显微镜检查联合用于同时鉴定多种细菌病原体 (Amann，R.等，Journal Of Bacteriology 178：3496-500，1996；美国 专利号第6,007,994)。

人们已经研究出了很多商业系统，它们可获得高流通量的显微靶 的原位显微镜分析(例如，WO 98/22618和WO 93/21511)。通常，微 生物或细胞沉积于载玻片上或多孔平板的孔底。然后使孔中的标记靶 在显微镜下成像。

非-显微成像方法

非-显微成像可测量较大面积中细胞的存在。例如，Hamamatsu Corporation(Masuko，M.等，FEMS Microbiol Lett 67：231-8，1991； Masuko，M.等，FEMS Microbiol Lett 65：287-90，1991；Yasui，T.等， Appl Environ Microbiol 63：4528-33，1997)的研究人员研制了一种不 用放大即可使单一细菌细胞成像的系统。该系统使用了与光学纤维系 统连接的超灵敏光子-计数CCD照相机，像增强器，和像-处理器。Elisa 斑点试验方法是一种专门用于计算产生特定抗体(或其它大量分泌的 产物；Logtenberg，T.等，Immunol Lett 9：343-7，1985)的单一细胞数 的技术。该方法的灵敏度是由于大量靶(分泌的蛋白分子)在分泌细 胞周围定位。

流式细胞术方法

流式细胞术是一种用于在临床诊断实验室中描绘细胞的重要工 具。流式细胞术方法根据它们的物理性质以及它们结合标记探针(例 如，染料，抗体，或核酸)的能力，可用于定量检测特定的细胞类型。 单一细胞或粒子被强迫流过狭窄的通道，每次流过一个，通过激光束。 荧光发射和大小/形状的信息是通过分析光谱和由生物体/粒子引起的 光散射而搜集的。每分钟可分析上千单一的细胞或粒子。例如，流式 细胞术可用于量化AIDS患者中淋巴细胞类的群体大小。可检测并鉴 定非-细胞分子，如蛋白或核酸的多路流式细胞术方法已经由Luminex 商业化(美国专利号第5,981,180)。

激光扫描方法

激光扫描是用于检测沉积在表面上的细胞和病毒的有效且灵敏的 方法。通常，显微激光束(例如，直径20μm)可追踪二维样品，所 述二维样品在大量连续线性通道中的固体表面上含有荧光标记靶，其 中每个线性通道都稍稍偏离于前一个，如此最终可扫描整个样品区 域。当荧光标记靶落在光束下时，所发射荧光的闪烁可用检测装置， 如光电倍增管检测。显微靶的数目和位置可通过激光微束扫描获得。

人们已经研制了很多激光扫描系统。ScanRDI系统(Chemunex) 使用非-特异性荧光染料标记滤器上的微生物细胞(美国专利号第 5,663,057；Mignon-Goderfroy，K.等，Cytometry 27：336-44，1997)。 荧光微体积测定技术(FMAT；PE Biosystems and Biometric Imaging； Miraglia，S.等，J Biomol Screen 4：193-204，1999)也已经用于检测微 量滴定孔中的细胞。尖端的激光扫描系统已经由CompuCyte Corporation(Kamentsky，L.，2001，激光扫描细胞术，Cytometry，Z. Darzynkiewicz，H.Crissman和J.Robinsnon编辑，Methods in Cell Biology Vol.63，Part A，3rd版，Series Eds.L.Wilson和P.Matsudaira.(San Diego：Academic Press))研制并商业化。可检测液体样品(例如，全 血)中单一显微靶的微束激光扫描系统已经由Immunicon Corporation 及Twente University的合作者(Tibbe，A.G.等，Nat Biotechnol 17：1210-3，1999)研制出来。

生物化学、化学、及物理方法

灵敏检测细胞和病毒，或它们的分子成分，细胞和病毒的分子成 分的其它技术包括流式细胞术，质谱，生物传感器，吸光光谱，荧光 偏振，荧光波动光谱，电泳，色谱等。

生物传感器技术可持续灵敏检测细胞和病毒。生物传感器使用物 理方法将生物事件，例如，抗体与抗原的结合，转换成可检测的信号。 其中一种用于分子检测的普及生物传感器使用表面等离子共振 (Mullett，W.M.等，(2000)Methods 22：77-91)。热BioStar’s光学免 疫测定法(Schultze，D.等(2001)Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20：280-3)利用光干涉原理检测抗原与抗体的结合。BARC生物传感 器技术是磁阻检测(硬盘存储)单一磁性微粒标记的分析物(Edelstein， R.L.等，Biosens Bioelectron 14：805-13，2000)。

细胞和病毒检测的未满足的需要

虽然很多用于常规检测低水平细胞和病毒的不同且有效的方法已 经商业化，但是在测试系统中仍然存在缺陷。特别是，需要一种试验 能够快速检测非常低水平的细胞和病毒，而且该试验无需实验室生 长，用户容易掌握使用，而且成本低。

发明背景

本发明提供快速并灵敏地鉴定医学、工业、和环境样品中的细胞 和病毒靶的有效方法。本发明标记靶，然后利用大面积成像检测它们。 基于本发明的诊断试验是快速、超灵敏、定量、多路、且自动化的。 该试验可使样品制备减到最少，而且无需核酸扩增或细胞培养。本试 验可检测多种细胞和病毒。基于本发明的试验可提供核酸扩增试验的 高水平灵敏度，用户容易掌握使用，而且可提供免疫测定法的速度， 以及由微生物试验提供的低成本及量化。本发明实现现有诊断技术的 最佳特征，同时解决了诊断系统中的缺陷。
本发明能够快速并低成本检测低水平靶和病毒的能力源于联合使 用高强度标记，促进快速反应动力学的形式，和大面积成像的优点， 该大面积成像使用由现有商业元件制造的仪器，或根本不用仪器。表 1列出本发明某些优点。
            表1 本发明的选择的优点 ·快速出结果 ·超灵敏 ·易于使用 ·节省成本 ·同时分析多个靶 ·扫描所有类型的细胞和病毒 ·分析大体积或小体积 ·自动定量分析 ·将样品减到最少
本发明通过特异性标记低水平的细胞和病毒，产生高强度信号而 检测它们。可使用各种产生信号的复合物，包括荧光染色的，光-散射， 量子点，磷光体，和酶-涂覆的粒子。这些粒子可产生各类型的信号， 包括荧光，化学发光，和比色。同样，可使用各种分子获得产生信号 的标记，包括抗体，核酸，配体，和适体的特异性结合。
当检测某些临床，环境，和制造样品时，需要检测较大体积中的 少数靶和病毒。本发明检测大量样品中低水平靶的能力部分取决于其 在不放大的情况下，检测单一细胞和病毒的能力。不放大的检测可检 测大面积中少数粒子的单一像。大面积成像对于本发明有效分析较大 样品体积的能力至关重要。使用高倍显微镜或微流检测较大体积中的 标记粒子时，需要浓缩步骤或对上千个像进行分析。使用微束扫描少 数粒子的方法非常浪费时间，且大面积使用时较为昂贵。
计算单一显微标记可增加基于本发明的试验结果的稳定性。与很 多用于分析细胞和病毒靶的大面积成像方法形成对照，本发明通常直 接将单一信号与较小的邻接区进行比较。与求大面积中总信号和背景 积分的方法相比，这种比较可提高含有少数标记靶的样品的信号背景 比。
检测单一细胞或病毒的其它优点是在不牺牲速度的前提下，通过 适当增加检测区大小来增加样品体积，从而增加试验的灵敏度。
计算大面积像中的单一信号数还可减少产生假阳性结果的机会。 (假阳性结果是不存在实际靶时产生的阳性试验结果)。与检测单一 积分信号的方法，如测量样品中分子(例如，ATP，抗原，或核酸) 总量的方法相比，这种计数方法是有利的。当使用依赖于信号积分的 方法时，引起信号的任何人工制品都可产生假阳性结果。含有482个 正信号的样品，每个都可产生100个荧光单位。积分方法的结果是单 一的数字(48,200个荧光单位)。产生相似荧光单位数的人工制品， 例如，较大的荧光尘粒是不能区别的。相反，本发明可很容易地区分 单一较大的荧光尘粒和482个正信号。
使用本发明构造的试验可检测各种浓度，从非常低的水平到高水 平的靶和病毒。本发明的这种性质，其较大的动态范围，可让用户取 消样品的制备步骤(例如，多次稀释)，而这一步骤常常是具有较小 动态范围的技术所需的。
基于本发明的试验可利用各种有效的形式，包括简单、非-仪器、 且低成本的一次性带状试验，和尖端的自动化台式系统。
本发明可使用的各种检测方法包括目测，基于胶片的检测，和电 子检测。检测方法的范围对于提出广泛的诊断问题和试验地点是有利 的。
本发明的其它特征和优点可从下列说明书和权利要求书很明显地 看出。
靶是指可能存在于样品中的细胞或病毒，它的存在是通过本发明 测试的。
靶的类目是指共有一个或多个特征，且为了使用本发明构造试验 的目的，被认为相同的多个靶。例如，对于被设计检测所有HIV病毒 的试验而言，类目只是HIV。这种试验可检测所有HIV病毒，而不区 分HIV-1和HIV-2变体。在这种情况下，靶的类目包括HIV-1和HIV-2。 其它试验的目的可能是区分HIV-1和HIV-2。在这种情况下，每种类 型的HIV被看作是不同的类目。
靶的非重叠类目是指其并集为空集的靶的类目。所有大肠埃希氏 菌类目，所有假单胞菌类目，所有真菌类目，以及所有HIV病毒类目 属于非重叠类目。也就是说，任一类目都没有哪个成员是其它任一组 的成员。相反，HIV-1病毒的类目和HIV病毒的类目是靶的重叠类目， 这是因为HIV-1类目的每个成员也是所有HIV病毒类目的成员。
检测并鉴定多个类目的试验通常可检测靶的多个非重叠类目。例 如，设计试验来鉴定血液中的HIV，HCV，和HBV病毒。这种试验 可区分靶的三个非重叠类目，即三种类型的病毒。值得注意的是，每 种类型的病毒仅仅属于三个类目中的一个(例如，在HCV类目中没 有HIV病毒)。
试验的类目复杂度是指在试验中检测的靶的非重叠类目数。
类目特异性结合位点是指靶上的位点，它可在特异性-结合条件下 (见斜体字的术语定义)特异性结合类目结合分子，而且可把在试验 中鉴定的特定类目成员与不是该类目成员，但可能也存在于试验样品 中的靶区分开来。也就是说，该位点通常存在于一个类目的所有成员 上，而且通常不存在于非重叠类目的任何成员上。类目特异性结合位 点特异性结合类目特异性结合分子。
类目特异性结合位点常常与靶相关。在ELISA斑点测定法中，分 泌单一抗体的杂交瘤细胞是通过检测大量抗体蛋白鉴定的，所述抗体 蛋白可结合荧光抗原，并靠近分泌细胞源固定。在这种情况下，含有 抗原结合位点的分泌抗体分子与杂交瘤细胞不相关。因此，游离抗体 上的抗原结合位点不是类目特异性结合位点。
如果试验扫描含有构成分类群的靶类目样品，那么类目特异性结 合位点基本存在与该分类群的所有成员中，但基本不存在于试验样品 中其它分类群的所有成员中。其中一个例子是结合特定单克隆抗体的 HIV膜蛋白上的位点。
可选择性地，试验可扫描包括了由不同分类群成员共有的类目特 异性结合位点的样品。这种类型的类目特异性结合位点的例子包括各 种大分子(例如，DNA)和基因，mRNA，和蛋白，它们可产生抗生 素抗性，毒性，或显示活力。类目特异性结合位点常常是较大分子或 复合物的一部分。例如，在试验中，可将类目特异性基因组序列用作 类目特异性结合位点。这种类目特异性结合位点是更大基因组的一部 分，它可含有：(1)不是类目特异性的部分；(2)是类目特异性结合 位点，但试验不能扫描的部分；和(3)试验可扫描的、不同类目特 异性序列的其它部分。
类目特异性结合位点是指在属于类目成员的靶中以80％，90％，95 ％，或超过99％存在，但在属于相同种类所有其它类目成员的靶中， 以80％，90％，95％，或超过99％缺少的结合位点。值得注意的是， 属于类目成员的靶可能一般或异常缺少类目特异性结合位点。
同样，类目特异性结合位点可一般或异常存在于不属于类目成员 的靶中。例如，认为蛋白位点基本存在于所有大肠埃希氏菌中，而不 存在于其它细菌种类中。如果，在上百万个细菌中少于一个细胞，导 致不产生蛋白的突变，那么标记将不存在于大肠埃希氏菌中。然而， 这种蛋白位点仍然被认为是类目特异性结合位点。可选择性地，利用 重组DNA技术或自然方式(例如，利用病毒转导)可将相同蛋白的 基因转移到不同种类细菌的菌株中。在这种情况下，不属于大肠埃希 氏菌类目成员的细菌菌株将表达什么仍然被认为是大肠埃希氏菌-特异 性结合位点。
类目结合分子是指特异性结合类目特异性结合位点的分子或分子 复合物。类目结合分子的例子是与基因组DNA杂交的核酸探针；已 经被选择或“推断”体外特异性结合蛋白上位点的核酸适体；结合细 胞抗原或血清蛋白的抗体；以及特异性结合激素受体或结合分子，如 抗生物素蛋白的配体，如表皮生长因子或生物素。如果它们结合不同 且非重叠的类目特异性结合位点，那么这两个类目结合分子被认为是 不同的。根据它们的分子组成，类目结合分子可被称作，例如，类目 结合寡核苷酸，探针，抗体，配体等。
捕获分子是指与表面，薄膜，或不是颗粒的其它基质稳定结合的 类目结合分子。
特异性结合靶类目的类目结合分子是指在规定的结合条件下，基 本结合可由试验扫描的类目成员的所有靶，但基本不结合不属于该类 目成员，但可能存在于样品中的其它种类靶的类目结合分子。与不是 通过这种类目中的靶结合的数目相比，通过所扫描类目中的靶结合的 类目结合分子数要高2倍，5倍，10倍，或50倍。
结合条件是指在试验中使用的、获得类目结合分子与类目特异性 结合位点的特异性结合的条件。例如，当类目结合分子是类目特异性 DNA探针时，特定试验的结合条件是严格的DNA杂交条件。适宜的 严格DNA杂交条件取决于探针的性质，这是本领域那些技术人员熟 知的。例如，对于长度大于500个碱基的典型DNA探针而言，适宜 的结合条件(在杂交中被称作“清洗条件”)是65℃，0.2X SSC。对 于抗体与抗原的结合而言，典型的结合条件是室温，PBS-TB。
类目结合分子的家族是指一组特异性结合靶特定类目的类目结合 分子。
针对丙型肝炎病毒培养的多克隆抗体制品构成类目特异性分子的 家族，这是因为它含有特异性结合靶-HCV相同类目的多个不同抗体。 多克隆抗体通常构成类目结合分子的家族，这是因为它们通常包括结 合靶相同类目的多个不同类目结合分子。值得注意的是，除非使用亲 和纯化，多克隆抗体制品通常还含有不与靶的选定类目结合的抗体， 而且可含有结合其它类目的抗体，这是因为动物的抗体系统是通过动 物的感染史确定的。因此，优选利用亲和法纯化多克隆抗体。
家族中的类目结合分子可能与类目中的某些靶结合，但不与其它 靶结合。例如，HIV-1特异性抗体不与HIV-2交叉反应，HIV-2-特异 性抗体不与HIV-1交叉反应。在不区分HIV-1或HIV-2的条件下，如 果HIV作为试验中的类目被检测，那么可用具有相同信号标志的信号 传递部分标记两种类型抗体的混合物。当在试验中使用该家族的类目 结合分子，即两种抗体制品的混合物时，不论存在HIV-1还是HIV-2， 都可获得相同的信号。(值得注意的是，如果使用抗体捕获本实施例 中检测区位点的HIV靶，那么在该位点使用抗-HIV-1和抗-HIV-2捕 获抗体的混合物)。
类目结合分子家族的其它例子是一组80个类目特异性基因组DNA 序列，它们存在于所有大肠埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在于其 它种类细菌的成员中。该家族的类目结合分子可与适当制备的大肠埃 希氏菌O157:H7细胞杂交，但是不与细胞的其它类目杂交。家族可包 括不同类型的类目结合分子。例如，上述类目结合分子家族还可包括 特异性结合O157抗原的单克隆抗体，以及结合intimin蛋白(毒性因 子)的一类。类目结合分子的家族可包括任何数量的类目结合分子 (即，一个或多个)。
类目结合分子的非重叠家族是指这样的类目结合分子家族，其中 每个家族特异性结合一组非重叠类目中的一个，而且仅仅一个类目。 也就是说，一组类目结合分子的非重叠家族对应于一组非重叠类目。 例如，在扫描4USP有害生物大肠埃希氏菌，沙门氏菌，假单胞菌， 和金黄色葡萄球菌的试验中，有4个非重叠类目。这种试验可掺入4 种不同的非-交叉反应多克隆抗体，每种抗体对其中一个试验类目特 异。因此，该试验包括类目结合分子的4个非重叠家族。试验中的类 目结合分子的非重叠家族被称作类目结合分子的整体(ensemble)(见 下面的定义)。
类目结合分子的整体是指类目结合分子的一个或多个非重叠家族 组，对于特定的试验而言，将它们在混合物中混合。扫描靶的多个非 重叠类目的试验包括每个类目的一个类目结合分子家族。包含这些家 族的类目结合分子的整个组被称作整体。例如，可使用5种病毒-特异 性单克隆抗体扫描5种类型上呼吸道病毒(RSV，甲型流感病毒，乙 型流感病毒，副流感和腺病毒)的存在。这5个单克隆抗体构成类目 结合分子的5个非重叠家族。抗体的联合组是类目结合分子的整体。
整体的类目结合分子复杂度是指一个整体中的不同类目结合分子  或部分的数目。例如，如果一个类目结合分子的整体包括234个寡核 苷酸探针，那么该整体的类目结合分子复杂度为234。
整体的家族复杂度是指一个整体中的类目结合分子的非重叠家族 数。家族复杂度与结合整体中每个家族的类目结合分子所需的最小靶 数相等。试验的家族复杂度与试验的分类学复杂度—即，所扫描样品 的不同类目数相对应。DNA探针的整体包括3个探针家族。其中一个 家族包括一组12个大肠埃希氏菌类目结合DNA序列，另外一个家族 包括一组10个轮状病毒类目结合DNA序列，另外一个家族包括一组 15个贾第虫类目结合DNA序列。该探针整体的家族复杂度为3，这 是因为结合整体中的所有探针时，需要不少于3种类型靶的基因组(大 肠埃希氏菌，轮状病毒，和贾第虫)。
信号元件是指直接产生可检测信号的分子或粒子。术语“直接产 生”是指信号元件是可检测信号的直接来源或决定性调节子。因此， 如果信号是由荧光团产生的光子，那么荧光团是光子的直接来源，并 因此是信号元件。如果信号是由RLS散射的光子，那么RLS粒子是 信号元件。可选择性地，如果信号是从辣根过氧化物酶的产色沉淀产 物发射或散射的光，那么产色产物是信号元件。
信号元件的特征在于这种元件不能被分成若干部分，以致每个部 分产生可与整体(特征，而不必是强度方面)比较的信号。因此，2nM 直径的量子点也是一种信号元件，随着分开，它可改变所得纳米晶体 的特征(发射谱)。用荧光染料，如荧光素浸渗的5μm粒子不是信号 元件，这是因为它可被分成若干部分，以致每个部分具有可与完整粒 子相比较的信号特征。相反，分子荧光素是信号元件。产生信号的酶 (例如，荧光素酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)的可检测产物也 被认为是信号元件。这种信号元件(或它们的前体，当存在前体向信 号元件化学转化时)可以是扩散性物质，不溶性产物，和/或不稳定的 中间体。例如，碱性磷酸酶可将化学发光底物CDP-Star(NEN；目录 号NEL-601)转化成活化产物，它是发射光子的信号元件。
信号传递部分是指含有或产生(在酶情况下)一种或多种信号元 件的分子，粒子，或物质，而且它与类目结合分子偶联。信号传递部 分可与类目结合分子共价或非-共价和直接或间接(例如，经由一个或 多个连接物或“化学键”或通过与同一粒子偶联的两个部分)偶联。 信号传递部分的例子包括羧化量子点；被修饰用于结合核酸探针或抗 体探针的荧光团如Texas Red；涂覆链霉抗生物素的荧光聚苯乙烯粒 子(其可与生物素化的类目特异性结合蛋白偶联)；含有重复核酸序 列的滚环复制产物，其中每个核酸序列都可与用荧光修饰的核苷酸追 踪的若干寡核苷酸杂交，并在5’末端含有类目特异性结合寡核苷酸。 信号传递部分可含有完全不同的元件。例如，在某些情况下，信号传 递部分是与类目结合分子(例如，抗体)偶联的酶(例如，碱性磷酸 酶)。当碱性磷酸酶的底物(例如，分别来源于NEN和Roche的 CDP-Star，或BM紫)转化成信号元件产物(例如，发射光子的不稳 定中间体，或可沉淀的产色产物)时，产生信号。对于类目结合分子， 酶信号传递部分，和在不同反应时间所用的底物而言，它是不寻常的。
信号传递部分复合物是指含有一个以上信号传递部分和一个以上 类目结合分子的物质实体。信号传递部分与类目结合分子在信号传递 部分复合物中的缔合必须是稳定的(例如，信号传递部分和类目结合 分子的复合物应在4℃的PBS中具有至少1天的平均半衰期)。信号 传递部分复合物的其中一个例子是涂覆两种类型的上千个分子的聚苯 乙烯微粒：靶特异性抗体和碱性磷酸酶。这种信号传递部分复合物经 由偶联的抗体类目结合分子与靶结合。当与产色碱性磷酸酶底物(信 号元件；例如，BM紫，Roche)培养时，产生肉眼可检测的有色斑点。 可选择性地，相同的信号传递部分复合物，当与化学发光或荧光碱性 磷酸酶底物培养时，可产生化学发光或荧光信号。信号传递部分复合 物的其它例子包括：与荧光素标记抗体偶联的纳米金粒子，与寡核苷 酸类目结合分子及acridinium酯偶联的胶乳粒子，它可在加入过氧化 氢后化学发光。
粒子是指小于50微米的物体或基质。一群或一批粒子的大小被定 义为粒子样品最长一对正交维数的平均测量值。正交维数最长那对是 指正交维数如下的这样一对粒子：其长度总和是粒子所有这种总和的 最大值。如果2个粒子的样品分别具有1微米×2微米和2微米×3 微米的最长一对正交维数，那么最长那对正交维数的平均测量值是2 微米[(1+2+2+3)/4＝2微米]。粒子样品最长那对正交维数的平均测 量值是，例如，小于50微米，小于20微米，或小于5微米。
很多粒子都具有某些固体的性质。然而，分子骨架或复合物，虽 然不是刚性的，但也可被定义为粒子。例如，dendrimer或其它支链分 子结构也被认为是粒子。同样，脂质体是另外一种类型的粒子。粒子 可用信号元件染色或与信号元件偶联。常常可用术语反映粒子的大小 或几何形状。例如，术语纳米球，纳米粒，或纳米珠用于指代沿着任 何规定轴测量时，小于1微米的粒子。同样，术语微球，微粒或微珠 用于指代沿着任何规定轴测量时，小于1毫米的粒子。粒子的例子包 括胶乳粒，聚丙烯酰胺粒，磁铁矿微粒，铁流(磁性纳米粒)，量子 点等。
标记粒子是指可特异性结合靶并产生信号的粒子。标记粒子与信 号传递部分和类目结合分子偶联或稳定缔合。
靶：标记粒子复合物是指特异性结合一个或多个靶的标记粒子。
靶：标记复合物是指特异性结合一个或多个类目结合分子并与一个 或多个信号传递部分缔合的靶。
标记比是指在接触步骤过程中，靶与标记粒子的比例。例如，如 果1×107个标记粒子与含有1×108个靶的样品接触，那么标记比为 10。
信号元件或信号传递部分的信号特征是指由信号元件信号传递部 分产生的信号情况，可用于区别它与其它信号元件或信号传递部分。 例如，用荧光素和若丹明标记的信号传递部分的信号特征是荧光。无 线电询答器的特征是无线电频率。光子信号传递特征的例子是荧光， 光散射，磷光，反射比，吸光度，化学发光，和生物发光。除后两者 外，所有光子信号传递的特征取决于外部照射(例如，白光源，激光 源，或日光)。相反，化学发光和生物发光是不依赖外部光源的信号 特征。
信号元件或信号传递部分的种类是指信号的不同性质，可用于区 别它与其它信号元件或信号传递部分。例如，用红色染料标记的脂质 体就可与带有不同颜色的脂质体区别开来。红色是它的种类。对于传 播特定无线电频率信号的微型发送器而言，将微型传送器与其它微型 传送器区别开来的无线电频率信号的性质构成信号元件的种类。
信号标志是指试验中，结合靶类目的信号传递部分组合的区别信 号性质。与4种类型抗体结合的靶，即其中一个与荧光素分子偶联， 另外3个与若丹明分子偶联，它们的信号标志由荧光素和若丹明的组 合加权的吸光度和发射谱描述。
试验或标记类目结合分子整体的信号复杂度是指可在试验中或通 过与整体结合而区别标记的靶类目数。可选择性地，如果靶的每个类 目成员都存在，信号复杂度被定义为预期出现的不同信号标志数。对 于某些试验而言，类目结合分子整体的信号复杂度与试验扫描的类目 数相等。扫描多种类目的其它试验所具有的信号复杂度只为1。
选择力是指用于捕获，分离，移动，或汇集靶的力。选择力的例 子包括重力，磁力，电力，离心力，向心力，浮力密度，和压力。通 过将选择力单独作用于靶上可使靶移动。可选择性地，选择力可特定 作用在与选择部分缔合的靶上(见下面的定义)。
应用选择力使靶移动的例子包括靶的离心；与磁性粒子结合的靶 的磁性选择；用金属粒子标记的靶的重力沉降；和利用真空过滤使靶 在多孔膜上沉积。选择力使用的其它例子包括在下面的实施例中。
选择部分是指可与类目结合分子偶联并赋予类目结合分子利用选 择力而被选择性捕获，分离，移动，或汇集能力的原子，分子，粒子， 或其它实体。当类目结合分子：选择性部分的复合物与靶特异性结合 时，通常可利用选择力选择性捕获，分离，移动，或汇集靶。这里所 用的选择性是指和与选择部分无关的实体相比，利用选择力优先赋予 选择部分和相关实体的移动灵敏度。
顺磁粒子和铁蛋白是选择部分的例子。在溶液中渗透的密集二氧 化硅粒子是另外一种类型的选择部分。这种粒子，当涂覆类目结合分 子或与靶结合时，可使靶在水溶液中渗透，从而将结合靶与其它样品 的未结合成分分离。
选择性特征是指用于捕获，选择或移动选择部分的选择部分的情 况。例如，顺磁粒子的选择特征是磁力。迅速渗透在水溶液中的二氧 化硅粒子的选择特征是聚集。
基本处于同一平面上的表面或底物是指可与虚平面平行排列的表 面，这样当测量从表面上任何一个1mm×1mm正方形中的点到虚平 面上最近点的距离时，平均距离的绝对值小于50微米。
检测表面是指靶在上面沉积的、基本处于同一平面上的底物表面。 在利用光子信号传递特征的实施方案中，如果检测表面是光学透明 的，那么检测可经由检测表面的任何一面进行。如果检测表面是不透 明的，那么检测可经由沉积了靶的检测表面进行。
检测面积是指由本发明同时分析的检测表面或检测区的面积。检 测面积的最长线性尺寸通常大于1mm，例如，大于5mm，大于10mm， 或大于15mm。例如，由光学装置同时成像的载玻片的一部分可测量 0.8cm×0.5cm，其中的光学装置包括一个聚光透镜和一个CCD芯片。 检测面积为0.4cm2。
检测区是指靶在其中检测的体积。检测区具有与检测面积相同的 尺寸，深度与信号传递部分在其中检测并鉴定的深度相应。因此，检 测区的深度取决于评价正信号的临界标准。当利用光学检测时，检测 区深度取决于视野的光学深度。
检测面积的最长尺寸是指检测面积周长上两个点之间的最大直线 长度。例如，如果检测面积是0.3cm×0.4cm的长方形，那么检测面 积的最长尺寸是0.5cm的对角线。如果检测面积是一个半-主轴长度为 7mm，半-副轴长度为2.5mm的椭圆形，那么检测面积的最长尺寸是 14mm。
大面积检测或大面积成像是指一种用于检测显微靶的方法，其中 检测面积(由检测装置同时分析的面积)大于靶。大面积检测的检测 面积具有至少1个≥1mm的线性尺寸。相反，显微靶基本较小，通常 在至少2个正交维数中具有小于50μm的测量值。大面积检测的例子 包括用CCD照相机使一个9mm直径的检测面积成像；通过用CCD 线扫描仪扫描而使一个2cm×1m的长方形成像，其中该扫描仪的长 尺寸为1cm；利用在照相胶片上直接曝光而使一个含有微生物靶的4cm ×4cm滤器成像；和在快速侧流带状试验中，目测与1cm×3cm试验 区域上的显微靶相对应的有色斑点。
很多技术都可扫描含有显微靶的样品，但不能利用大面积检测。 例子包括：流式细胞术；固相激光微束扫描细胞术；液相扫描(Tibbe 等，Nat Biotechnol 17：1210-3，1999)；以及利用高倍显微镜，使载玻 片上的多个视野成像并检测。
偶联或稳定缔合是指两个实体之间的缔合，其中在4℃的PBS中， 缔合的平均半衰期最少为1天。例如，被动蛋白吸附聚苯乙烯粒子。 有很多不同种类的吸附蛋白。某些蛋白与表面稳定缔合，具有几个月 的半衰期。其它蛋白，如松散结合在吸附蛋白外层上的那些，可能并 不与粒子稳定缔合，而且可在几小时内浸出。
像增强器或映像管是指放大光子信号传递的装置，见Inoué的专业 词典，Shinya等，Video microscopy：the fundamentals(Plenum Press， New York，1997；p.665)：“一种(通过纤维光学或透镜)与摄像管连 接从而增加灵敏度的装置”。增强器是一个在前端具有光电阴极的真 空管，它可根据聚焦在它上面的像发射电子，它还具有一个将电子聚 焦在后端磷光体上的电子透镜和/或微通道板，以及一个增加电子能量 的高压加速器。可以是单级或多级的。各种像增强器在同一篇参考文 献的第8章中详细描述。
对检测面积一部分中的靶同时检测是指一步检测来源于基本处于 同一平面的检测表面部分的信号。同时检测的例子是用CCD芯片、 目测、或基于光电二极管的信号积分来检测在检测面积中大面积成像 的靶。
静止期的靶是指不移动的靶。例如，固定于载玻片上的靶就处于 静止期。被微量滴定皿孔底上的固定位置中的类目结合分子捕获的靶 也处于静止期。甚至是没被固定在表面上，而且可通过流体动力或其 它力移动的靶也被认为处于静止期，在检测/成像过程中，以大于10 秒的间隔拍摄的连续像基本可检测基本处于同一相对位置的相同靶。 流式细胞术中的靶不处于静止期。然而，由与侧流试验的固相试验区 结合的抗体所捕获的靶处于静止期。
均相测定法或均相免疫测定法是指反应物没有从已完成测定法的 产物中完全除去的测定法或免疫测定法。
鉴定是指确定属于其中成员的靶的类目。例如，扫描靶多个类目 的侧流试验中，每个都可能存在于样品中。属于特定类目的靶在结合 了相应类目特异性抗体的薄膜区被捕获。已知薄膜区含有捕获抗体， 靶可由发生捕获的区鉴定。
样品是指可利用本发明扫描其中是否存在靶的物质。
直接目测是指除了佩戴矫正透镜外，在不借助仪器的情况下目测。 例如，直接目测可用于检测某些快速侧流试验中，纳米金粒子的微红 反射信号。
光电检测器是指将光子信号传递转换成电信号的人造装置或仪 器。光电检测器的例子包括CCD检测器，光电倍增管检测器，和光 电二极管检测器，例如，雪崩光电二极管。
环绕能或ensquared能是指来源于无限小光源的光子百分比，它 们可被捕获在光检测器阵列的像素上。
热辐射是指黑体辐射。
细胞自发荧光或自发荧光是指由于天然固有细胞成分，如NADH 和氧化黄素蛋白的荧光，而由细胞发出的荧光。由于重组荧光蛋白， 如绿色荧光蛋白而发出荧光的细胞不被认为是自发荧光。
照射是指用电磁辐射照射。可使用各种波长的电磁辐射照射。它 包括，例如，用光谱的X-射线，UV，可见，或红外区照射，值得注 意的是，在可见范围中，照射不是必需的。
具有光子信号传递特征的信号元件或信号传递部分是指可通过光 子的发射，反射，散射，折射，吸收，捕获，或重定向，或光子行为 的任何其它调制或组合而检测的信号元件或信号传递部分。具有光子 信号传递特征的信号元件或信号传递部分的一些例子包括：荧光团 Texas Red(荧光信号特征)；CDP-Star(化学发光信号传递特征)；荧 光素酶(生物发光信号特征)；共振光散射粒子(光散射信号特征)； BM紫(光吸收或产色信号传递特征)；和正向-转换的磷光体(两个 较长波长光子的吸收和一个较短波长光子的发射)。
‘数目’ב溶液名称’是指这样一种水溶液，它的溶液浓度为 这个数目的倍数(水除外)。例如，10×EE含有10mM EDTA/100mM EPSS(EE，或1×EE，含有1mM EDTA/10mM EPPS)。
EE是1mM EDTA/10mM EPPS溶液。在将它们混合之前，用NaOH将两个成分的共轭酸调节至pH8.0。
HYB是用于杂交的溶液，含有：1M NaCl，50mM EPSS pH8.0，2 ％封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml酵母 tRNA(Sigma)。
UBB(通用结合缓冲液)是用于结合各种类型类目结合分子(如 抗体及核酸)的混合物的溶液，含有：250mM NaCl，50mM EPPS pH 8.0，2％封闭试剂(Boehringer Mannheim)；0.5％v/v Tween，20μg/ml 酵母tNRA(Sigma)。
BB(封闭缓冲液)含有100mM EPPS pH8.0/150mM NaCl/2％封闭 试剂(Boehringer Mannheim)。
PB是0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4。
PBS是磷酸盐-缓冲生理盐水溶液，含有：120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸盐缓冲液(钠盐)pH7.4。
PBS-B是BSA的0.1％PBS溶液(没有IgG；Sigma目录号A-7638)。
PBS-T是Triton X-100的0.05％PBS溶液(Sigma目录号X-100)
PBS-TB是PBS/0.1％BSA/0.05％Triton X-100。
PBT是PBS/0.1％BSA(没有IgG；Sigma目录号A-7638)/0.05％ Tween-20(Sigma目录号X-100)
LB是用于生长细菌并按照先前所述(Ausubel 1987，supra)制备 的Luria肉汤
SSC是用HCl调节至pH7.0的150mM NaCl/15mM柠檬酸钠
MES是(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)
MESB是0.05M MES(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸)，pH6.1
EDAC是(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基))碳二亚胺
连接缓冲液是10mM MgCl2/50mM Tris-HCl/10mM二硫苏糖醇 /1mM ATP/25μg/μl牛血清白蛋白。
预溶解溶液：该溶液是按照Graves，L等(1993)通用细菌DNA 分离过程诊断分子微生物学：原理和应用，D.Persing，T.Smith， F.Tenover和T.White，编辑(Washington，D.C.：American Society for Microbiology)。新鲜制备并在冰上保存的该溶液含有：0.25ml 2M Tris (pH7.0)，3.1ml的胰脂肪酶(将6.1mg胰脂肪酶(Sigma)溶解在59.8ml 水中，然后加入1.2ml 0.1M CaCl2；以3.1ml的等分试样在-20℃贮存)， 0.3ml 1％牛磺胆酸钠(Difco)，0.5ml 0.1M CaCl2，5.25ml蔗糖，和0.05g 溶菌酶。
标准PCR方案：(除非另有说明)所有PCR反应是在Perkin-Elmer Geneamp 9700热循环器中的50mM KCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris HClpH8.3，250μM(各种)dNTP，和10μM(各种)引物中循环30次， 然后在72℃培养10分钟。循环是由3个步骤组成的：94℃，30秒； 55℃，30秒；72℃，90秒。
AP：碱性磷酸酶
BAL：支气管肺泡的灌洗
BSA：牛血清白蛋白
CCD：荷电耦联装置  
CFTR：囊性纤维化跨膜电导调节器
cfu：集落形成单位(与活细菌细胞数对应的细菌浓度测量值)
CMV：巨细胞病毒
FITC：异硫氰酸荧光素
HBV：乙型肝炎病毒
HCV：丙型肝炎病毒
HIV：人免疫缺损病毒
pfu：噬斑形成单位(与感染病毒粒子数对应的病毒浓度测量值)
PNA：肽核酸
RSV：呼吸道合胞病毒
TCID50：烧瓶50％感染的组织培养感染剂量
除非另有说明，寡核苷酸序列是按照5’-3’方向表示的。
除非另有说明，说明书中描述的微生物株是从美国典型培养物保 藏中心(ATCC)，Manassas，VA获得的。
附图简述
图1.用CCD阵列对产生信号的各个粒子进行不放大的大面积成像的 原理
该图表示使用CCD阵列检测器使各个靶成像的原理。
图2.利用不放大的大面积成像检测结核分枝杆菌
该图表示以本发明为基础的试验，它可扫描痰液样品中是否存在 结核分枝杆菌，即可引起肺结核的细菌病原体。将痰液样品热固定在 显微镜载玻片上后，用特异性结合结核分枝杆菌的标记抗体(抗-MTB Ab)培养样品。除去未结合的抗体，只留下与结核分枝杆菌结合的抗 体。用荧光团标记抗体，这样当用一束有色光(激发光谱)照射时， 它们可发出第二种颜色(发射光谱)。用激发光谱照射载玻片，使抗 体在发射光谱中发光，所述抗体位于载玻片上固定了细菌的位置。发 射的光聚焦在CCD芯片上的像素阵列上。照射位于荧光细菌下的像 素，并向计算机传输电信号，然后使电信号在计算机中作为像保存。 用软件对像进行分析，然后由用户界面报告在扫描时发现的细菌数。
图3.进行大面积成像的CCD成像装置
图中描述的CCD成像器用于收集在实施例中描述的大量数据(见 详述部分的步骤6)。激发光是通过将光从高强度白光源(1000瓦Xenon 弧光灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)引入到液体光导(芯直径5mm，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)中提供的。液体光 导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)并将滤过的光束(通常直径为9mm)对准含有标记 靶的检测表面。该仪器可检测各种检测表面(例如，多孔膜，显微镜 载玻片，微量滴定皿，盖玻片，和底部平坦，且光学透明的试管)上 的标记靶。入射光穿透检测表面，诱导信号传递部分中的荧光，该信 号传递部分经由类目结合分子与靶结合，并沉积在光学透明的表面 上。发射荧光的一部分是通过高-收集效率的透镜系统收集的，并通过 发射滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics)传输给CCD照相机(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。
图4.进行不放大的大面积成像的CCD成像系统
该图表示具有角形照射结构的CCD成像器，其中光被传到收集透 镜侧面斜角处的检测表面(这里表示为微量滴定平板的孔底)上。选 择适当角度从而优化收集效率，并避免收集透镜对入射光束的阻碍。 这种结构的优点在于源于样品支持物底部表面的反射没有被收集透镜 收集，因此不会造成荧光背景干扰。
图5.利用组合标记检测不同的病原体
使用多个信号传递部分(标记)的组合标记可用于获得较高的信 号复杂度(即，大量不同的信号标志；还可见详述部分第2步中的讨 论)。图中给出的三个病原体是用不同的量子点组合标记的。因此， 每个病原体可发射不同编码的信号(在病原体右侧，用有色条形码表 示)。所示的类目结合分子是与基因组DNA杂交的病原体-特异性寡 核苷酸探针。每个探针与荧光量子点偶联。许多类型的类目结合分子 (例如，抗体，配体，PNA探针等)都可用于组合标记，其它类型的 信号传递部分(例如，荧光团，荧光粒子，RLS光-散射粒子等)也可。
图6.使用标记互补序列偶联信号传递部分
该图描述了间接标记类目特异性寡核苷酸类目结合分子的方法。 合成含有类目特异性结合部分和标记序列部分的双寡核苷酸.信号传 递部分与第二个寡核苷酸偶联，被称作标记互补序列，它与标记序列 互补。使用该系统间接标记，可很容易用信号传递部分组合编码而合 成具有标记的类目特异性寡核苷酸家族。
图7.用荧光DNA-结合染料标记的各个细菌的大面积成像
该图表示在多孔膜支持物上检测各个荧光染色的细菌细胞。细胞 是用核酸染料Sybr Green I染色的，并通过黑色聚碳酸酯薄膜过滤。 用配有FITC滤光器装置、基于不放大的大面积成像器的CCD使荧光 信号成像。左面表示大约100个大肠埃希氏菌细胞的荧光像。点数与 加入到薄膜上的细胞数相关。右面表示薄膜上没有加细胞的阴性对照 组。
图8.利用各种类目结合分子和信号传递部分标记的各个细菌细胞的大 面积成像
该图表示用4种类型的信号传递部分(Syber Green I，实施例2)； 荧光团-标记的寡核苷酸探针，实施例3；荧光团标记的PNA探针， 实施例4；荧光团标记的抗体，实施例5)标记盖玻片上的大肠埃希 氏菌细胞的实验结果。各个细胞是使用图3所示的装置，通过不放大 的大面积成像检测的。将标记细胞的稀释物点在涂覆聚-L-赖氨酸的盖 玻片上。用CCD成像器使标记细胞成像后，通过荧光显微镜检查证 实了成像的物体含有各个细胞或若干细胞的临时群。上面的像表示通 过CCD成像检测的标记细胞。亮点与标记细胞相对应。下面表示在 荧光显微镜(1000X放大率)中看到的相同标记的细胞。
图9.利用不放大的大面积成像检测各个的活细菌细胞
该图表示本发明可利用荧光染料检测活细菌。亮的荧光点是活的 大肠埃希氏菌细胞(左面)，而死亡的大肠埃希氏菌细胞(右面)没 有可检测的荧光信号。在左面的成像区域中存在大约400个活的大肠 埃希氏菌细胞，右面的成像区域中存在大约400个死亡的大肠埃希氏 菌。
图10.用高度荧光粒子标记的各个细菌的大面积不放大成像
该图表示实验(实施例7)的结果，其中致病性大肠埃希氏菌细胞 与微量滴定皿孔的光学透明表面结合，用荧光粒子标记，并进行不放 大的大面积成像。将大肠埃希氏菌O157细胞(用Syber Green I染色) 热固定在96-孔平板的底部，并通过与涂覆了抗-大肠埃希氏菌O157 抗体的荧光粒子结合而被标记。左面表示在CCD成像器中见到的细 胞：粒子复合物。中间表示利用低倍荧光显微镜(50X放大率)看见的 相同样品。通过高倍荧光显微镜(右面；1000X放大率)可以看到， 染色的大肠埃希氏菌O157被很多荧光粒子围绕。
图11.利用荧光粒子:病毒:磁性粒子复合物的液相磁性选择和不放大的 大面积成像对病毒(HCV)进行均相免疫测定
该图表示用于扫描液相样品中的显微靶—丙型肝炎病毒(HCV) 的有效方法。将涂覆特异性结合病毒的抗体的磁性和荧光粒子混合在 可能含有病毒的样品的微量滴定皿孔中。然后使样品中的病毒与粒子 结合。从图中的放大投影可以看出，有些病毒与磁性粒子结合，有些 与荧光粒子结合。所述磁性粒子:病毒:荧光粒子复合物具有通过磁力 和高度荧光选择的性质。将微量滴定皿放在磁铁上，这样磁性粒子， HCV病毒和与磁性粒子缔合的荧光粒子就会沉到孔光学透明底部的表 面。利用CCD成像装置(如图3所示)，使孔的底部成像。由于高度 荧光粒子与病毒结合，因此像中的亮点表现为病毒复合物。像的软件 分析可量化检测表面上的复合物数目，并将标记复合物的信号总强度 积分(均相免疫测定法的代表性结果见实施例8和图12)。
图12.利用不放大的大面积成像检测各个细菌的均相免疫测定
该图表示利用实施例8所述不放大的大面积成像灵敏检测大肠埃 希氏菌的免疫测定结果。涂覆了类目特异性抗体的磁性和荧光粒子首 先与细菌细胞结合，然后利用磁力使复合物沉在光学透明孔的底部表 面(检测区域)上，然后利用不放大的大面积CCD成像检测复合物。 该图表示在血液中进行的均相免疫测定(下面)，和在血液(上面) 及缓冲液(中间)中进行的非均相(洗过的)免疫测定的结果比较。 最简单的形式，均相免疫测定法可有效检测具有极好信号背景比的 细胞(见图下面右侧的均相测定法的量化)。
最左面两个表示利用不放大的大面积CCD成像获得的像。当大肠 埃希氏菌存在(左侧)时，三次测定都产生了较强的信号，但当没有 加入大肠埃希氏菌时，背景信号较低。使用CCD照相机获得、与涂 覆了粒子的大肠埃希氏菌细胞对应的信号是利用高倍荧光显微镜 (1000X；上面两排，最右面两行)检查分析获得的。像表示含有大 肠埃希氏菌细胞，磁性粒子，和荧光粒子的典型复合物。每种复合物 的两个像是使用两个滤器装置产生的：一个观察DNA荧光(Syber Green I；右数第2行)，一个观察荧光粒子(最右面那行)。该图表 示被磁性粒子和荧光粒子围绕的大肠埃希氏菌细胞组成的复合物。
像的定量分析是通过软件进行的，该软件可计算荧光物体数(图 12，下面，左侧的柱形图)并将所有物体的强度积分(图12，下面， 右侧的柱形图)。所示数据表示6个样品的分析：3个样品含有1000 个大肠埃希氏菌细胞，3个样品不含细胞。在两次测量中，含有大肠 埃希氏菌(1000个细胞)的样品明显比不含大肠埃希氏菌的样品数值 要高。柱的高度表示三个样品的平均值。误差柱表示三个样品平均值 左右的三个标准偏差。
图13.“模拟痰液”中抗酸染色的分枝杆菌的大面积成像
该图表示实施例9所述试验的结果，其中与导致肺结核的病原体 紧密相关的分枝杆菌是利用抗酸杆菌(AFB)染色法联合不放大的大 面积成像检测的。用金胺-若丹明将“模拟痰液”中含有分枝杆菌细胞 (瘰疠分枝杆菌；左面：1A，2A)或大肠埃希氏菌(右面：1B，2B) 的市售载玻片染色，并利用不放大的大面积CCD成像观察(上面：1A， 1B)。与含有大肠埃希氏菌样品中的背景斑点数较少相比，在含有分 枝杆菌细胞的样品中检测到较多的物体。荧光显微镜检查分析(400X； 下面：2A，2B)证实了，在不放大的情况下，CCD照相机捕获的信 号与单一的分枝杆菌细胞相对应。
图14.利用大面积成像进行的快速抗微生物灵敏度试验
该图表示实验结果，该实验利用不放大的大面积成像(实施例10) 测定抗生物对大肠埃希氏菌生长的最小抑制浓度(MIC)。一式两份将 细胞的等分试样，于各个时间点在LB琼脂上培养，然后沉积在96孔 微量滴定皿孔的光学透明表面上，用CCD成像器成像(图3)。生长 (在图中用+/-符号定量表示)是通过LB琼脂平板上的集落数(图中 没有表示)和CCD照相机捕获的像的物体和强度测量值而测量的。 第18小时的培养时间点与NCCLS标准方案相对应。图中还给出了4 小时培养结果和4小时CCD成像结果。通过培养和CCD成像检测的， 取决于抗性和敏感株生长的抗生物浓度比较表明，两个方法具有可比 性。
图15.已经过磁性选择的、各个荧光标记的白色念珠菌的大面积检测
该图表示实施例11所述实验的结果。白色念珠菌细胞是用核酸染 料(YOYO-1)和兔抗-念珠菌多克隆抗体预标记的。将标记的细胞加 入到玻璃底微量滴定盘孔中的、涂覆了山羊抗-兔IgG抗体的磁性粒子 中。利用磁场，使细胞在孔底均匀排列。该细胞是使用CCD成像器 和适于YOYO-1荧光染料的激发和发射滤器(FITC装置，480/40nm 激发，535/50nm发射)，通过使孔的整个底部表面成像而检测的。
如上所述含有用YOYO-1染色的白色念珠菌细胞的微量滴定盘孔 的不放大的大面积CCD像。通过在高倍放大率(1000X)的荧光显微 镜下检测微量滴定孔，所示荧光信号(图中的白点)与单一或一小簇 白色念珠菌细胞相对应。
没加白色念珠菌细胞的微量滴定盘不放大的大面积CCD像(阴性 对照)。
图16.特异性结合荧光和顺磁聚苯乙烯粒子的各个白色念珠菌细胞的 大面积检测
该图表示实施例12所述实验的结果。将细胞加入到微量滴定皿中， 涂覆了抗-念珠菌抗体的磁性和红色荧光粒子的混合物中。利用磁场和 流体清洗将与磁铁结合的细胞与未结合的粒子分离。细胞-荧光粒子复 合物是通过使用CCD成像器(A和B)或荧光显微镜检查(C-E)以 及适于荧光粒子的激发和发射滤器，使孔的整个底部表面成像而检测 的。
A.含有用多个红色荧光粒子标记的白色念珠菌细胞的微量滴定孔 的不放大的大面积CCD像。
B.没有加入白色念珠菌细胞时，微量滴定孔的不放大的大面积CCD 像(阴性对照)。
C.在A.中成像的、相同孔面积的放大荧光显微像(100X放大率)。 多个红色荧光粒子围绕在单一或一小簇白色念珠菌细胞(绿色) 周围。
D.在B.中成像的、相同孔面积的放大荧光显微像(100X放大率) (没有加入细胞的阴性对照)。
E.和F.图A中所示相同样品面积的高倍放大率(1000X)荧光显 微像。多个1μm直径的红色荧光粒子围绕在白色念珠菌细胞(大 约5μm直径，绿色)周围。没有见到磁性粒子。
图17.特异性结合荧光抗体和磁性粒子的各个白色念珠菌的大面积检 测
该图表示实施例13所述实验的结果。在玻璃底的微量滴定盘中， 将白色念珠菌细胞与涂覆了抗-白色念珠菌或抗-大肠埃希氏菌抗体的 磁性粒子混合。30分钟后，加入荧光团标记的抗-白色念珠菌或抗-大 肠埃希氏菌抗体。清洗磁性复合物，然后利用磁场使它们均匀排列在 孔底。细胞是利用本发明的CCD成像器和适于荧光团的激发和发射 滤器，使孔的整个底部表面成像而检测的。
A.含有用荧光抗-白色念珠菌抗体标记的白色念珠菌细胞的反应孔 的不放大的大面积CCD像。
B.没有加入细胞的反应孔的不放大的大面积CCD像。
C.含有用荧光抗-大肠埃希氏菌抗体标记的大肠埃希氏菌细胞的反 应孔的不放大的大面积CCD像。
D.没有加入细胞的反应孔的不放大的大面积CCD像。
注意：使用红色荧光核酸-结合染料(YOYO-3)染色，并在高倍 放大(1200X)荧光显微镜下检测微量滴定孔可知，点荧光信号与单 一细胞或一小簇细胞对应。
图18.使用CCD照相机对各个化学发光的酵母细胞进行不放大的大面 积检测
该图表示实施例14所述实验的结果。白色念珠菌细胞是用FITC- 偶联的抗-白色念珠菌抗体标记的，其与抗-荧光素抗体：碱性磷酸酶偶 联物结合。将标记细胞的稀释物点在覆盖了尼龙薄膜的载玻片上，加 入化学发光底物CDP-Star。在不放大的情况下，使细胞在CCD成像 器中成像。单一细胞的位置是通过荧光显微镜检查证实的。
从左到右分别表示大约200，60，和20个各个白色念珠菌细胞。 在中间和右面成像的各个细胞较多。较大较亮的点表示紧密在一起的 两个或多个细胞。
图19.利用瞬时胶片直接曝光对各个化学发光酵母细胞进行不放大的 大面积检测
该图表示实施例15所述实验的结果。白色念珠菌细胞是用FITC- 偶联的抗-白色念珠菌抗体标记的，其与抗-荧光素抗体:碱性磷酸酶偶 联物结合。将标记细胞的稀释物点在尼龙薄膜上，加入化学发光底物 CDP-Star。将尼龙薄膜装在Spot Light照相机(Boston Probes)中， 用ASA2000 Polaroid Film成像。
从左到右分别表示图15所示大约200，60，和20个白色念珠菌细 胞。已知所点的细胞数，就可推断出很多点代表各个细胞，特别是在 最右面中。
图20.利用不放大的大面积成像检测涉及下呼吸道感染的生物
该图表示利用不放大的大面积成像捕获的像结果，它可灵敏检测 从实施例16所述的荧光标记的下呼吸道生物产生的信号。该图表示 利用不放大的大面积成像(最左侧两行)，从各种下呼吸道病原体产 生的信号，这些病原体从上到下依次为：肺炎衣原体，肺炎支原体和 侵肺军团菌。最右侧两行表示利用荧光显微镜检查获得的像。
图21.利用不放大的大面积成像同时扫描含有3种不同微生物的样品 的多路直接荧光免疫测定法
该图表示实施例17所述实验的结果。将含有3种不同微生物(大 肠埃希氏菌，白色念珠菌和酿脓链球菌)的3份样品固定在盖玻片上， 与类目特异性(在这种情况下，是种类-特异性的)抗体的整体培养。 整体中的每个抗体家族与不同的荧光团偶联(大肠埃希氏菌＝绿色， 白色念珠菌＝蓝色，酿脓链球菌＝红色)。洗去未结合的抗体后，使 用三个不同的滤器装置(绿色，蓝色，和红色道)捕获样品的像。对 于所有这3种样品而言，最强的信号都是在与结合样品中微生物的标 记抗体相对应的通道中获得的。
图22.腺病毒的固相捕获测定法
该图表示使用与固相结合的抗体捕获病毒，扫描含有腺病毒的样 品的试验结果(实施例18)。微量滴定平板的孔用抗-腺病毒抗体涂覆。 将固定的腺病毒样品或固定的RSV样品连同抗-腺病毒涂覆的荧光粒 子一起加入到孔中。培养1小时后，洗去所有未结合的粒子，在不放 大的情况下，在CCD成像器中观察剩余的结合粒子。
阴性对照(RSV那幅)的孔中剩余的粒子非常少。在腺病毒那幅 中，孔中已经捕获了上千个荧光粒子，这是由于抗-腺病毒涂覆孔，腺 病毒，和抗-腺病毒涂覆粒子的相互作用。
图23.血液中病毒的固相捕获
该图表示使用与固相结合的抗体捕获病毒，扫描含有腺病毒的血 液样品的试验结果(实施例19)。微量滴定平板的孔用抗-腺病毒抗体 涂覆。将固定的腺病毒样品或固定的RSV样品加入到含50％小鼠血 液的孔中。培养1小时后，洗去所有未结合的粒子，将抗-腺病毒涂覆 的荧光粒子加入到孔中。清洗后，在不放大的情况下，在CCD成像 器中观察结合粒子。
阴性对照(RSV那幅图)的孔中剩余的粒子非常少。在腺病毒那 幅图中，孔中已经捕获了上千个荧光粒子，这是由于抗-腺病毒涂覆孔， 腺病毒，和抗-腺病毒涂覆粒子的相互作用。在腺病毒捕获期间，血液 的存在不会干扰测定。
图24.腺病毒的液相测定法
该图表示利用“双粒子”试验形式检测腺病毒的试验结果(实施 例20，还可见图11的表)。将固定的腺病毒或固定的RSV与抗-腺病 毒涂覆的磁性和荧光粒子混合。培养4小时后，将磁性粒子和任何结 合粒子与其它物质分离，转移到微量滴定平板上，在没有放大的情况 下，在CCD成像器中观察。
腺病毒那幅图表示由磁性粒子捕获的上千个抗-腺病毒涂覆的荧光 粒子，这是由于它们与腺病毒的相互作用。在RSV那幅图中捕获的 荧光粒子非常少。
图25.同时扫描细菌和病毒的多路大面积成像免疫测定法
该图表示同时扫描样品中是否存在大肠埃希氏菌和腺病毒的实验 结果(实施例22)。在有固定的腺病毒存在，有固定的大肠埃希氏菌 存在，两者都存在或两者都不存在的情况下，将抗-腺病毒涂覆的红色 荧光粒子和磁性粒子，和抗-大肠埃希氏菌涂覆的绿色荧光粒子和磁性 粒子混合。培养1小时后，将磁性粒子和任何结合粒子与其它物质分 离，转移到微量滴定平板上，在没有放大的情况下，在CCD成像器 中观察。
第一排：粒子混合物中只加入了腺病毒。绝大多数信号可使用Texas Red滤器装置看到，该装置可观察红色荧光的抗-腺病毒粒子。
第二排：粒子混合物中只加入了大肠埃希氏菌。绝大多数信号可 使用FITC滤器装置看到，该装置可观察绿色荧光的抗-大肠埃希氏菌 粒子。
第三排：混合物中加入了腺病毒和大肠埃希氏菌。信号可使用Texas Red和FITC滤器装置看到。
图26.利用不放大的大面积成像检测各个细菌的滤器流通测定法
该图表示快速“流通”测定法的结果，该测定法可检测液体样品 中的各个分散细菌(实施例23)。将两块硝化纤维素薄膜浸泡在抗-大 肠埃希氏菌O157抗体中并干燥。一个滤器用于收集已经用荧光大肠 埃希氏菌-特异性粒子(“大肠埃希氏菌”；这些粒子已经用大肠埃希氏 菌O157:H7-特异性抗体涂覆)预培养的大肠埃希氏菌细胞。使含有大 肠埃希氏菌-特异性粒子，但不含大肠埃希氏菌细胞的样品通过另一个 滤器(“没有大肠埃希氏菌”)。通过清洗滤器除去未结合的粒子。CCD 成像装置利用不放大的大面积成像检测荧光信号(上排)。两个滤器 的证实显微镜像在中排(50X放大率)和下排(100X放大率)表示。
图27.利用荧光酯酶底物染色细胞的大面积成像量化细菌
目的：在很多应用中，它用于以较大的动态范围量化活细菌细胞。一 个理想的系统应当能够准确计算从0或1个细菌细胞直到几百万或几 亿个细菌细胞，从而取消连续稀释以及它们固有的、缺少精密度，而 这种精密度是传统微生物平板接种法所需的。在该实施例中，我们说 明如何用荧光底物将活细胞染色，而基于CCD的不放大的大面积成 像可用于量化至少5个数量级以上的细胞。
实验方法：大肠埃希氏菌ATCC 8739细胞是按照实施例Y(Cell Direct 实施例)所述生长并处理的。在PBS中制备细胞的连续10-倍稀释物， 样品一式两份通过黑色聚酯薄膜(Chemunex目录号200-C2010-01) 上过滤，所述黑色聚酯薄膜安装在Millipore 1225多功能过滤装置中 的吸收垫(Chemunex目录号200-C3012-02)上，然后按照实施例Y (Cell Direct实施例)所述染色。此外，一式三份将10μλ的10-5倍 稀释物平板接种在TSA(BD目录号236950)上，37℃生长过夜，达 到细胞滴定度。聚酯薄膜上的荧光信号是用装有FITC滤光器装置 (Chroma/激发470/40nm，发射522/40)的CCD成像器(上面步骤6 所述；图3)捕获的。4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics) 用于捕获并处理来源于CCD成像器的像。从每个滤器产生的信号被 定义为所有物体像素强度的总和(在该特定实施例中定义的物体的像 素强度为350-65301)。限定信号的这种方法可消除不含任何染色细胞 的滤器区背景，但不能掩饰或不完全统计重叠物体强度。(这是因为 细胞很小而且几乎透明，只要细胞层很薄，信号就会累积)。
结果：如图28所示，该方法产生的信号在至少5个数量级以上是线 性的，因而认为本试验具有较大的动态范围。
变化：物体数较少时，除了使用它们像素强度的总和外，准确的量化 可通过计算各个物体而获得，这是因为物体不太可能重叠。该方法可 扩展到准确计算低至1或0个细胞，特别是如果使用多种染料和多种 激发和/或发射波长测定代表活细胞的物体。此外，可使用更高级的物 体查找算法考虑局部背景强度和照射的变化。
利用不放大的大面积成像检测滤器上的各个染色细菌
该图表示利用CCD照相机进行不放大的大面积成像来检测已经沉 积在薄膜上的各个细菌细胞(实施例24)。使Syber Green I染色的大 肠埃希氏菌细胞通过黑色聚碳酸酯滤器过滤。然后用CCD成像器(上 面那排)使滤器成像。下面那排表示荧光显微镜检查，它可证实CCD 像中的发光物体的确是Syber Green染色的大肠埃希氏菌(1000X)。
图28.基于本发明的试验的动态范围
该图表示使用本发明时可能出现的较大动态范围。将大肠埃希氏 菌细胞从几百万个细胞稀释成几百个细胞，过滤，并用荧光酯酶底物 染色。分析通过基于CCD的不放大的大面积成像产生的荧光像，然 后以它们的信号对细胞数绘图。在至少5个数量级以上，信号是线性 的。
图29.在不放大的情况下非-仪器检测少数细菌细胞
该图证实双层涂覆(碱性磷酸酶/抗-大肠埃希氏菌抗体)粒子在液 体捕获测定法中的应用，该测定法可检测各个大肠埃希氏菌细胞(如 实施例26所述)。每排3栏中的像是利用不同的检测方法获得的。上 面那排表示含有100个细胞的样品所用的方法。下面那排表示不含细 胞的样品的结果。与相应“没有细胞”的对照组相比，每排标记的“100 个细胞”具有明显更多的点。对于化学发光信号传递而言，该点在黑 色背景上是白色的，而对于产色信号而言，该点在白色背景上显黑色。 值得注意的是，后者的点即使在用肉眼检查薄膜时，也很明显，无需 放大。因此，该实施例的结果可证实使用双功能珠进行不放大的大面 积成像可能是灵敏检测的有效工具，而且无需复杂的仪器。
图30.砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫测定法；部分1： 检测砂眼衣原体的存在
该图表示实施例31所述的均相免疫测定法，它可扫描共有的性传 播疾病的病原体：砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌。该图表示免疫测定 法如何检测样品中是否存在砂眼衣原体。为了理解本试验如何区别两 个病原体，可参考图31。测定的形式与图11之一相对应。实验详情 与实施例22中用于检测细菌和病毒的多路测定法相似(图25)。
图31.砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫测定法；部分2： 多路检测的原理
该图是图31的接续，可表示实施例31所述的均相免疫测定法， 它可扫描共有的性传播疾病的病原体：砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球 菌。红色粒子的检测表示砂眼衣原体感染，而绿色粒子的检测表示淋 病奈瑟氏球菌感染。
测定的形式与图11之一相对应。实验详情与实施例22中用于检 测细菌和病毒的多路测定法相似(图25)。
图32.利用不放大的大面积成像进行、具有高信号复杂度的多路均相 免疫测定法
该图表示高度多路的均相免疫测定的流程。测定的原理与图30相 同，区别在于除了两对分析物-特异性荧光粒子外，该测定法还掺入了 很多分析物-特异的粒子对，从而同时扫描很多分析物。获得高信号复 杂度(即，大量不同的信号)的方法需要鉴定靶的若干类目，这些在 详述部分的步骤6中讨论。
图33.同时扫描若干下呼吸道病原体的免疫测定法
该图表示实施例33所述的免疫测定法。将下呼吸道样品(例如， 痰液或BAL)固定在显微镜载玻片上。将多孔模板固定于载玻片上后， 向各个孔中加入不同家族的病原体-特异性生物素化抗体(例如，将抗 -肺炎链球菌或抗-军团菌抗体加入到各个孔中)。洗去未结合的抗体， 使涂覆了链霉抗生物素的荧光粒子和已经结合了生物素化抗体的病原 体结合。结合荧光粒子那部分的位置表示病原体的同一性，这是因为 该部分与含有已知病原体的抗体的孔相对应。
图34.在不进行培养的情况下，多路鉴定泌尿道感染
该图表示实施例34描述的试验。将不同泌尿道病原体的捕获抗体 平行固定在载玻片的带上。将载玻片浸入已经用荧光染料处理过的尿 液中，其中所述荧光染料与细菌细胞中的核酸结合。细菌病原体如果 存在，与载玻片上捕获抗体的相应系粘着，然后进行不放大的大面积 成像。
图35.血源性病毒：HIV，HCV，HBV，和CMV的快速多路鉴定
该图表示实施例35描述的试验。被微量滴定皿的光学透明底部吸 收的是含有4种不同捕获抗体的4个不同点，所述4种抗体分别对4 种不同的病毒(HIV，HBV，HCV，和CMV)特异。将血液(图中 含有HIV)加入到孔中，使病毒与捕获抗体结合。除去血液后，将4 种类型的病毒-特异性荧光粒子的混合物加入到孔中。每种类型的粒子 是用具有不同光谱特征的荧光团(信号标志)染色的，然后用不同的 病毒-特异性抗体涂覆。在孔表面上捕获的病毒粒子与相应的荧光粒子 结合，利用基于CCD的不放大的大面积成像检测并量化。结合粒子 的位置和信号标志都可鉴定血液中的病毒。
图36.利用不放大的大面积成像对甲型流感病毒进行超灵敏的侧流试 验
该图表示利用不放大的大面积成像，对用荧光标记粒子标记的甲 型流感病毒进行侧流试验并分析的结果。该图表示在涂覆了样品的试 验带上，捕获及对照系的像，所述样品(从左到右)含有0，105，106， 107和108个病毒/ml。荧光信号随着甲型流感病毒浓度的增加而增加。 该数据表明，所述试验可检测低至105个病毒/ml的浓度。因此，该实 验可证实基于本发明的侧流试验的灵敏度。
图37.目测结核分枝杆菌的快速侧流试验
该图表示实施例36描述的试验。上面表示侧流试验构造的侧视图。 试验区含有与吸水薄膜结合的抗-结核分枝杆菌捕获抗体系。阳性对照 区含有与薄膜结合的结核分枝杆菌。将样品(图中含有结核分枝杆菌) 涂在样品垫上。毛细流沿着薄膜牵引病原体细胞，如此它们就可遇到 并被试验区中的捕获抗体捕获。将与抗-结核分枝杆菌抗体和碱性磷酸 酶偶联的粒子涂在样品垫上。在经由毛细流向吸收垫迁移的过程中， 所述偶联物与试验区中的捕获结核分枝杆菌细胞和对照区中滤器-结合 的结核分枝杆菌结合。这些结合的偶联物可在使用碱性磷酸酶底物进 行产色染色后直接观察。
图38.利用不放大的大面积成像检测很多不同生物竞争剂的快速侧流 试验
该图表示实施例38描述的试验。其策略与图37所述的相似，只 是有下列区别。该试验扫描含有很多不同生物竞争剂，包括细菌，病 毒和毒素的样品。(值得注意的是，为简单起见，该图没有描述实施 例38所述试验中的所有靶，偶联物，和捕获抗体)。在该实施例中， 样品遇到并使偶联物垫中的偶联物移动。最后，该试验利用碱性磷酸 酶的化学发光底物和CCD成像来检测特异性结合的偶联物粒子。
图39.利用基因组扣除分离肺炎链球菌类目特异性序列
该图表示实施例39所述的肺炎链球菌-特异性序列的分离。图39A 表示肺炎链球菌与其最近亲缘之间的种系发生关系(Kawamura等， International Journal Of Systematic Bacteriology 45：406-8，1995)。分离 类目特异性序列的策略可分为两步：基因组扣除(图39B)和筛选(图 39C)。首先，基因组扣除(Straus，1995，supra)是利用致病株(在 这种情况下是肺炎链球菌)的DNA作为“+”基因组差异样品进行 的(图39B)。“-”基因组差异样品是通过将若干最近亲缘菌株(通常 不引起肺炎的菌株)混合而构造的。所得扣除产物是与病原体基因组 杂交，而不是与紧密相关种类的基因组杂交的片段。克隆扣除产物后， 分离类目特异性的亚组。这些是与所有肺炎链球菌菌株杂交，而不与 其它分类群任一菌株杂交的DNA片段。选择与试验过的所有肺炎链 球菌菌株杂交，而不与其它种类的链球菌属菌株杂交的探针。见实施 例39的详细描述。
图40.使用核酸探针全面检测呼吸道病原体
该图表示实施例39描述的试验。病原体-特异性探针的整体与包 括两个部分的载玻片杂交：一个部分含有呼吸道样品，一个部分含有 斑点的阵列，其中每个斑点包括不同类目的对照呼吸道病原体。整体 中的每个探针家族是用不同的信号标志标记的。临床样品中病原体的 信号标志与对照斑点中信号标志的比较可鉴定临床样品中的病原体。 通过像分析软件找到的物体数和强度可量化样品中的病原体数。详细 描述见实施例39。
图41.类目特异性序列的间接组合标记
该图表示实施例40中，用于获得高信号复杂度的方法。类目特异 性寡核苷酸类目结合分子的每个家族是利用与表5相似的方案，用特 定的信号标志标记的。因此，如图所示，肺炎链球菌探针是用紫色或 蓝色量子点间接标记的，而金色链球菌探针是用黄色或绿色量子点标 记的。例如，用紫色量子点标记的探针是用两个相邻部分合成的：即 类目特异性寡核苷酸和“紫色标记”。紫色标记序列可与偶联紫色量 子点的“紫色标记互补序列”杂交。
图42.CNS带状试验
该图表示实施例41描述的试验。
图43.利用实际扣除精确识别用于扩增基因组差异序列的双PCR引物
该图表示实施例43中，用于扩增存在于砂眼衣原体，但不存在于 肺炎衣原体中的区(-200-500bp)的PCR引物。所述PCR引物是用 双结构设计的。“左引物”具有与20bp引物连接的XhoL引物序列(5’ -GGG CCC CCC CTC GAT C-3’)，而所述20bp引物与砂眼衣原体中 插入/缺失区的“左”端相应(5’-XhoL-砂眼衣原体左引物-3’)。“右 引物”具有与20bp引物连接的XhoR引物序列(5’-ATC GAT ACC GTC GAC CTC-3’)，而所述20bp引物与砂眼衣原体中插入/缺失区的“右” 端相应(5’-XhoR-砂眼衣原体右引物-3’)。
发明详述                                                 
发明概述.本发明可迅速并节省成本地扫描含有少量、多种类型(例如， 细胞，病毒，或蛋白分子)的显微和亚显微靶的最少加工样品。本发 明提供的有效特征是由一种新的诊断方法提供的，它结合了现代高-强 度标记，低-成本成像技术，和不放大的大面积检测。
为了理解本发明是如何检测相对较大样品中的少数显微靶，首先 检验具体的实施方案。图1表示本发明其中一个实施方案的简单略图， 它可检测在较大面积上扩散，在这种情况下是指在显微镜载玻片的一 部分上扩散的少数细菌。标记细菌，从而使它们在不久后发光。在下 面很多实施例中使用的、检测“正在发光”细菌的方法使用数字照相 机(CCD芯片)捕获比各个细菌大很多的样品区域的像。CCD芯片 具有光敏像素元件的阵列。来源于样品其中一个位置上的“正在发光” 细菌的光影响CCD芯片相应位置的像素元件。终端用户从计算机接 收有关样品中细菌数的信息，而计算机可加工从CCD芯片获得的像 数据(即，受照像素的数量和强度)。
接下来，实施方案的具体应用(图1)可扫描含有重要细菌病原体 —结核分枝杆菌的呼吸道样品。在该试验中，如图2所述，用荧光化 学品，荧光团标记细菌，如此当用不同颜色的光(激发光谱)照射时， 它们就可发射特定颜色的光(发射光谱)。为了使标记细菌的试剂显 色，首先选择类目结合分子。理想的类目结合分子应当是一种单克隆 抗体，它与结核分枝杆菌结合，但不与可能存在于呼吸道样品中的其 它类型的细菌或物质结合。所述抗体可，例如，特异性结合特定的分 子位点，一种“类目特异性结合位点”，而这种位点只能在结核分枝 杆菌的表面上找到。接下来，通过与荧光团，例如，荧光素偶联而标 记结核分枝杆菌-特异性类目结合分子。荧光素分子也被称作“信号传 递部分”，这是因为它可提供在试验中检测的信号。制备用信号传递 部分(荧光素)标记的类目结合分子(抗-结核分枝杆菌抗体)后，进 行结核分枝杆菌的诊断试验。
图2说明本试验如何确定患者是否感染了结核分枝杆菌。将痰液 样品涂抹并固定于载玻片上。用荧光团-标记抗体培养载玻片后，清洗 除去样品中的未结合抗体。用荧光素激发范围的光照射样品，可引起 涂覆在样品中结核分枝杆菌细胞表面的荧光素-标记抗体发射荧光。收 集细胞的荧光像，在不放大的情况下，将发射的光聚焦在CCD芯片 的表面上。因此，共同扫描涂抹面积较大，通常约1-2cm2样品中的结 合分枝杆菌细胞。每个细胞的荧光会撞击一小簇像素，引起局部电信 号从CCD芯片向计算机传送，并以像文件的形式存储在计算机中。 像分析软件可通过计算响应细胞所发出光的像素簇数，并将响应像素 的总光子强度积分而计算样品中的结核分枝杆菌数。 
本发明利用多种类型的形式，包括标记方法，类目结合分子，和 检测方法构造试验。然而，该试验有若干共有的重要特征。下面将描 述本发明很多实施方案共有的步骤和过程。
本发明应用的一般构造由下列步骤组成：                     
步骤1：设计试验问题，选择用于检测靶的类目结合分子
步骤2：选择并制备信号传递部分
步骤3：制备生物样品
步骤4：使样品中的靶与类目结合分子及信号传递部分结合
步骤5：选择靶以及结合的类目结合分子
步骤6：通过检测与靶结合的信号传递部分而鉴定并量化样品中存在 的靶               
                                                           
步骤1：设计试验问题，选择用于检测靶的类目结合分子          
选择试验所要检测的靶的类目.在功能上，将类目定义为与试验目的相 同的相关靶的范围。选择由试验鉴定的靶的类目相当于确定诊断试验 的目标。选择靶还是确定试验所用的分子试剂，类目结合分子的中心。
当基于本发明构造一个新的试验时，第一步是确定试验所要鉴定 并区别的靶的类目。例如，为了构造一个试验来鉴定引起患者肺炎的 感染剂，选择通常会引起肺炎的病原体类目，如呼吸道合胞病毒和肺 炎链球菌；或，为了试验食源性病原体，选择引起毒性的细菌类目。 本发明可鉴定包括多细胞生物，细菌，和病毒在内的多种靶。此外， 还可在同一测定法中试验各种类目的靶(例如，细菌和病毒)。
本发明的重要用途是鉴定人的体液样品，如血液，尿液，脑脊髓 液，痰液，或粪便中的病原体。(该方法还可用于其它类型的临床样 品，包括组织样品)。根据样品的身体来源和患者症状的不同，可决 定所要鉴定生物的重要类型。例如，在有下呼吸道症状的患者的痰液 样品中，人们可选择检测属于肺炎共同原因的病毒，细菌和真菌。
类目的选择取决于试验提出的诊断问题。因此，当两个试验解答 两个不同的诊断问题时，可选择不同的类目，即使试验可扫描含有相 同靶的同类型样品。当相对于泌尿道感染筛选尿液样品时，诊断问题 常常是：“尿液中有大量的细菌细胞吗？”。对于这种试验而言，试验 类目可能包括所有细菌。即，该试验不能将不同的细菌种类彼此区别 开来。因此，例如，大肠埃希氏菌和Enterococcus facacium落在为了 这种类型筛选试验目的的相同“全-细菌”类目中。相反，不同类型泌 尿道感染试验的目的是鉴定种类水平的病原体。对于这种类型的试验 而言，将通常引起泌尿道感染的细菌的每个种类定义为不同的类目(例 如大肠埃希氏菌和Enterococcus facacium是独立的试验类目)。
对于某些试验而言，选择跨越多界的多个生物类目。确定一组不 同的病原体中哪个是引起患者症状的原因在临床上常常较为重要。本 发明为节省成本的有效试验提出了重要的未满足需要，该试验可同时 扫描患者样品中存在的各种病毒，细菌，和真菌。类目复杂度是试验 所扫描的靶类目数的测量值。(见定义部分)。
类目特异性结合位点和类目结合分子.靶的不同类目是通过它们不 同的分子组分区别的。例如，认为下列不同病原体组中，每个都可引 起下呼吸道疾病：甲型流感病毒，RSV，流感嗜血杆菌，肺炎链球菌， 和结核分枝杆菌。每个病原体类目都具有属于类目特征，但不存在于 其它类目成员或其它呼吸道样品组分中的分子组分。基于本发明的试 验可通过扫描类目特异性分子组分的存在而检测特定类目的成员。
为了检测靶类目的存在，本发明使用特异性结合类目特异性分子 组分的分子。存在于靶上的类目特异性分子组分也被称作类目特异性 结合位点，而特异性结合它们的分子被称作类目结合分子。值得注意 的是，类目特异性结合位点是可能存在于所要检测样品中的靶的性 质。相反，类目结合分子是在诊断试验试剂盒中提供的试剂。
本发明的优点在于可使用广谱的类目结合分子。这一点很重要， 这是因为不同类型的类目结合分子可用于问不同类型的诊断问题(例 如，较宽的界-水平筛选对较窄的-水平鉴定)。类目结合分子(有时也 称作探针)的种类包括：核酸(寡核苷酸，适体，克隆序列，基因组 DNA，RNA等)，与核酸有关的化学变体，如肽核酸(PNA)；抗体； 酶(结合靶底物)；非-酶蛋白，如抗生物素蛋白(结合靶分子生物素)； 特异性结合细胞组分的分子(例如，结合肌动蛋白的毒伞素或结合抗 生物素蛋白的生物素)；染料和着色剂，如碘化丙锭，金胺-若丹明， 或SYTO-17)；配体(例如，表皮生长因子，它可特异性结合表皮生 长因子的受体)；和已经利用体外进化技术(例如，Zhang等，Nat.Biotech. 18：71-74，2000)选择的多肽或核酸结合试剂。
类目结合分子可掺入其它功能结构域或修饰。例如，类目结合分 子常常与信号传递部分(即，标记结构域，如荧光团或染色的微粒) 或选择部分(例如，磁性粒子或固体表面)共价或非-共价缔合。可选 择性地，类目结合分子可与连接物部分连接，促进与其它功能部分的 连接。有时，类目结合分子具有双重不可分开的功能。例如，碘化丙 锭，一种核酸染料，可被用作类目结合分子(例如，类目特异性结合 位点可能是酵母中的细胞核酸)，同时，该结合的染料可发挥信号传 递部分的作用(即，当与类目特异性结合位点结合时，它可发荧光)。 以本发明为基础的试验可掺入不止一种类目结合分子(例如，抗体及 核酸染料，或抗体及寡核苷酸)。
最简单的试验可掺入单一类型的类目结合分子，从而扫描单一类 目的靶。例如，结核分枝杆菌的试验可使用单克隆抗体，它与结核分 枝杆菌表面上的类目特异性结合位点特异性结合。可选择性地，例如， 当筛选泌尿道感染时，单一类目是“所有细胞”—或，如果人类细胞 被溶解，“所有非-人类细胞”—和单一类型的类目结合分子可以是一 种核酸染料(例如，碘化丙锭)。
类目结合分子的家族是一组不同的类目结合分子，它们结合靶相 同类目的成员。例如，相对于丙型肝炎病毒培养的多克隆抗体是抗体 的一个家族，这是因为它含有多个类目结合分子，这些类目结合分子 特异性结合靶—在这种情况下是HCV的相同类目。类目结合分子家 族的另外一个例子是一组80个类目特异性基因组DNA序列，它们存 在于所有大肠埃希氏菌O157:H7菌株中，但不存在于其它分类群细菌 的成员中。该家族的类目结合分子可与适当制备的大肠埃希氏菌 O157:H7细胞杂交，但不与其它类型的细胞杂交。
为了检测靶的多个类目，一个试验包括每个类目的一个类目结合 分子家族。一组类目结合分子家族被称作类目结合分子的整体。例如， 肺炎试验或药物滥用试验必需将靶的若干类目彼此区别开来。类目结 合分子的一个家族被用于靶的每个类目。对于肺炎试验而言，可使用 与引起肺炎的微生物表面上的类目特异性抗原反应的抗体整体。该类 目结合分子整体的其中一个家族含有来源于抗血清免疫球蛋白部分并 针对肺炎链球菌的多克隆抗体，所述抗血清是在兔子宿主中培养的。 另外一个家族可含有针对腺病毒外被蛋白的重组抗体或单克隆抗体。
所检测整体中的靶不同分类群或类目数，即，类目复杂度，是由 整体中的类目结合分子家族数反映的。整体中的家族数可由整体的“最 小类目衍生”量来准确限定。家族复杂度是结合试验整体中类目结合 分子每个家族的薄膜所需的不同靶的最小数。例如，类目特异性抗体 的整体可用于同时检测痰液样品中结核分枝杆菌，军团菌，Coccidoides immitus，流感病毒，及呼吸道合胞病毒的存在。该整体的家族复杂度 可能为5，这是因为最少有5个靶，每个靶来源于一个病原体类目， 这是结合整体中每个类目结合分子家族成员所需的。本发明在单一试 验中鉴定广谱靶的能力是其利用具有较大家族复杂度的类目结合分子 的整体扫描样品的能力。
与本发明联合使用的类目结合分子应当是特异性的，其中它们应 当在测定条件下结合预定的靶(分析物)，而不结合其它类型的靶(是 指由测定法区别的)，或样品或试验的其它可能组分。因此，对于上 呼吸道细菌感染试验而言，筛选可能的类目结合分子，从而除去与上 呼吸道正常(共生的)微生物组分交叉反应的那些。
用于获得并描述类目结合分子的代表性方法包括在下面的实施例 中。               
步骤2：选择并制备信号传递部分                             
用信号传递部分标记类目结合分子。在不进行光学放大或不使用昂贵器 械的情况下，本发明检测各个显微靶的能力取决于以高信号强度特异 性标记靶。标记是经由与类目结合分子缔合使信号传递部分与靶特异 性结合而获得的。然而，应注意的是，对于本发明的某些应用而言， 利用靶的固有性质作为信号传递部分时，无需标记(例如，细胞自身 荧光)。
本发明以两种一般途径区别靶的类目。其中一种方法，也被称作 信号区别，是用信号传递部分标记类目结合分子的每个类目特异性家 族，这样它就具有独特的信号标志。产生并检测大量不同信号标志的 能力(即，高信号复杂度)可构造扫描靶若干类目的试验(即，高度 多路的试验)。区别靶多个类目的其它方法，几何区别，依赖于在检 测面积的不同区中沉积不同类目的靶。可不依赖于信号传递部分的信 号标志的几何区别在下面讨论(步骤5)。
本发明可利用不同类型的信号特征，包括：荧光，散射光，光偏 振，无线电波，粒度，磁场，化学发光和放射性。信号传递部分的例 子和利用各种信号特征的检测方案在下面给出。在一个信号特征内可 有多个信号传递种类。例如，如果信号特征是荧光，各种特征发射光 谱包括信号传递种类(例如，红色荧光，绿色荧光，和蓝色荧光)。 可选择性地，作为另一个例子，认为红色荧光微粒是用不同浓度的相 同荧光团染色的。荧光也是信号特征，然而在这种情况下，不同强度 的粒子构成信号特征的种类，即，荧光强度是区分一组粒子与另一组 粒子的信号特征的性质。
如下面实施例所证实的，多种信号传递部分都可与本发明联合使 用。信号传递部分可包括简单的荧光团，上调型磷光体，天然的荧光 蛋白(如绿色荧光蛋白及其相关物)，染料，酶：底物系统(产生底物： 产物颜色改变或化学发光)，荧光微粒，光散射粒子，磁性粒子，或 无线电传输微型器件。
获得高信号复杂度对于发展扫描若干类型靶的试验(即，具有高 度类目复杂度的试验)很有用。
获得高信号复杂度。混合物中可区别的标记(或信号传递部分)数被称 作信号复杂度。对于高度多路的试验而言，使用具有高信号复杂度的 信号传递部分有时是有利的。可与本发明联合使用产生高信号复杂度 的3种一般方法是：(1)区别标记。(2)组合标记。和(3)比例标记。
1.对于区别标记而言，不同探针家族中的探针是用单一信号传递 部分标记的，其可在所有其它信号传递部分存在的实验中很容易地检 测。迄今为止，很难获得高信号复杂度的区别标记。这是因为绝大多 数标记方法使用光学信号(例如，产色，荧光，化学发光)或放射性 标记。由于光学信号的光谱带宽和现有仪器可检测信号的有限范围， 可使用光学信号分辨的信号复杂度较小。例如，由于光谱重叠，具有 不同发射光谱的很多荧光团的分辨目前是不可能的。
2.本发明所用获得高信号复杂度的其它方法是应用组合标记方 法。组合标记是使用相对少数的不同信号传递部分获得高信号复杂度 的技术。使用这种方法，不同组合的信号传递部分与不同的靶结合。 原理在图5(还可见实施例1)中举例说明。目前，荧光团是分子诊 断学的一类有益信号传递部分。然而，由于涉及分析多个不同荧光团 的复杂情况(出现激发和发射光谱的大部分重叠)，目前在实践中只 能掺入大约7种或更少的常规荧光团。然而，组合使用时，7种荧光 团可用于产生127种不同的信号(N个荧光团产生2N-1种组合)。高 信号复杂度还可利用其它类型的信号传递部分，经由组合标记获得。 例如，用不同染料浸渗的粒子，落在不同离散大小种类中的粒子，或 发射不同无线电信号的转发器都可用于该方法中。使用荧光团的组合 标记近来已经成功用于人类的染色质组型(Speicher等，1996，supra； Schrck等，1996，supra)。用于分析组合标记实验的仪器和软件可从 市场上购买。
3.高信号复杂度还可使用比例标记方法获得(Fulton等，1997， supra)。在比例标记中，就像组合标记那样，很多不同类型的信号传 递部分可使用相对少数的不同信号元件产生。然而，与组合标记相反， 比例标记中的信号传递部分是通过信号传递元件的比例区别的。例 如，两个荧光团X和Y，具有不同的激发/发射特征，可用于将聚苯 乙烯粒子染色。将不同相对浓度的荧光团([X]，[Y])用于不同的粒 子组。例如，8种不同浓度的X和8种不同浓度的Y用于将粒子染色 时，所有组合方式(X1Y1，X1Y2，X8Y7，X8Y8)产生64类可区分的粒 子。比例标记可将简化仪器，只需使用少数信号类型。除了荧光团之 外，还可使用包括非-光学信号元件的信号元件，利用比例标记方法产 生高信号复杂度。
产生较强信号可促进单一显微靶的检测。所需信号强度的水平当然取决 于信号特征的类型(光学，粒度等)和检测方法/仪器(见下面)。
标记类目结合分子的各种方法都可用于获得所需的灵敏度。优化 信号强度的其中一个方法是用高度荧光信号传递部分标记靶分子。例 如，量子点，荧光染色的纳米球，及聚合的荧光团分子都可产生较强 的荧光信号。掺入若干信号元件可增加信号传递部分的荧光强度。例 如，荧光纳米球(-20nm直径；Molecular Probes)可产生与大约180 个荧光素分子相等的信号。荧光染色的聚苯乙烯微粒(例如，1μm直 径)可掺入上百万个荧光团信号元件。用于在信号传递部分中掺入多 个荧光团的方法与在克隆类目特异性序列的PCR扩增过程中，在荧光 团-dNTP偶联物中掺入核酸类目结合分子有关。将多个荧光团掺入到 核酸类目结合分子中的可选择性方法包括：使用与多个信号传递部分 结合的dendrimer，支链DNA，或滚环模板，或用若干聚合荧光团标 记的核苷酸加尾。类目结合分子与多个信号传递部分的偶联也可增加 信号强度。例如，信号扩大还可通过使大量信号酶(例如，碱性磷酸 酶或辣根过氧化物酶)与纳米粒子偶联而获得。
获得强信号的其它方法是使若干标记的类目结合分子与每个靶结 合。这一点可通过各种方式做到，包括：使用多个类目结合分子(识 别同一靶中的多个类目特异性结合位点)或选择与在靶中占多数的靶 分子结合的类目结合分子。例如，标记的微生物-特异性多克隆抗体可 通过结合微生物靶上的若干不同抗原决定部位而获得高信号强度(例 如，见实施例11)。实施例1还描述了使用标记的类目结合分子，它 们可结合每个靶生物中的多个不同类目特异性结合位点。选择在每个 靶中大量存在的类目特异性结合位点的策略先前已经频繁使用过。这 种策略的实施例包括使用核糖体RNA的核酸探针(这取决于靶生物 和以每个细胞中上千个拷贝存在的细胞类型)。同样，某些抗原靶分 子是以成百上千个拷贝存在于每个靶生物细胞中的。本发明可利用这 些策略。作为另一个例子，当使用核酸-结合荧光染料Syber Green I 作为类目结合分子/信号传递部分时，细菌中存在的大量类目特异性结 合位点可产生较强的信号强度(例如，见实施例)。
使若干信号传递部分与靶结合不仅能够增加信号强度，而且它可 赋予本发明稳定性，这是因为在没有靶存在的情况下，使用预期的复 合信号标志观察大量信号传递部分若干聚簇的机会比较小。
使信号传递部分与类目结合分子偶联。本发明可利用本领域那些技术人 员熟知的各种方法掺入直接与类目结合分子偶联的若干类型的信号传 递部分(见，例如，Hermanson，G.，Bioconjugate Techniques(Acadamic Press，1996)和下面的具体实施例)。例如，抗体或寡核苷酸类目结 合分子可与荧光团或量子点信号传递部分直接偶联。可选择性地，例 如，抗体或寡核苷酸类目结合分子可用于涂覆基于荧光微粒或光散射 纳米粒子的信号传递部分。信号传递部分可间接与类目结合分子偶 联。例如，如图6所示，信号传递部分可与标记互补序列直接偶联， 然后标记互补序列与标记序列杂交，其是含有类目-偶联序列的寡核苷 酸的一部分。可选择性地，例如，抗生物素蛋白可与多个信号元件直 接偶联，构成信号传递部分。然后，标记的抗生物素蛋白分子与生物 素化的类目特异性抗体结合。在结合步骤之前，之中，或之后，信号 传递部分可与类目结合分子偶联。例如，在本发明其中一个实施方案 中，洋地黄毒苷-标记的核酸探针可用作类目结合分子。类目结合分子 与样品中靶的类目特异性结合位点结合之后，洗去未结合的探针。然 后使抗-洋地黄毒苷抗体：碱性磷酸酶偶联物(信号传递部分)与结合 的洋地黄毒苷-标记探针偶联。然后将碱性磷酸酶底物(例如，化学发 光底物CDP-Star；NEN)加入到结合的碱性磷酸酶中，产生信号。
                                                            
步骤3：制备生物样品                                         
样品的制备.本发明的重要特征是其快速且简单的样品制备方案。与其 它灵敏的诊断方法，如基于核酸扩增的技术相比，它具有更多的优点， 而基于核酸扩增的技术对样品制备过程有更多的要求，从而除去酶抑 制剂。
根据样品性质和试验形式的不同，样品制备可有若干功能。在某 些情况下，样品制备可使靶浓缩和/或沉积在底物上。例如，水源性微 生物试验可利用过滤浓缩微生物，并使细胞沉积在滤纸上用于检测。 其它样品涂抹在固体底物(例如，显微镜载玻片)上。
利用类目结合分子使靶上的类目特异性结合位点更容易结合是样 品制备的一个重要功能。在某些情况下，需要进行很少的处理或不进 行处理，例如，当类目特异性结合位点是自由接近类目特异性抗体的 含水样品中微生物表面上的抗原决定部位时(例如，见实施例8)。在 其它情况中，需要进行样品制备从而使内部的类目特异性结合位点容 易接近。例如，当类目特异性DNA序列用于结合基因组DNA上的类 目特异性结合位点时。所制备的靶细胞必需可渗透探针，且它们的基 因组DNA必须是变性的。当检测同一样品中大量不同类型的靶时， 样品制备对于靶的整个谱都必须有效。样品制备方法的其它具体实施 例在下面的实施例中详细描述。
如果测定法产生了负结果，那么它对于了解样品是否真的没有靶 生物，或测定法本身失败，即，结果是否是假阴性而言很重要。为了 鉴定假阴性结果，可向实验样品中加入一种或多种阳性对照靶。阳性 对照靶含有的类目特异性结合位点并不存在于所检测靶的范围中。与 阳性对照靶相应的类目结合分子也包括在试验所用的其它类目结合分 子中。这些靶将在所有测定法中检测，除非一个或多个测定步骤不成 功。检测阳性对照信号失败可表示假阴性结果。
                                                        
步骤4：使样品中的靶与类目结合分子及信号传递部分结合     
在该步中，类目结合分子及缔合的信号传递部分在促进特异性结 合的条件下与样品中的靶接触。例如，在该步中，类目特异性核酸序 列的整体与样品中的互补靶序列杂交。同样，样品中的类目特异性抗 原与相应的类目特异性抗体结合。对于结合步骤而言，存在很多可能 的物理结构。例如，结合可在显微镜载玻片上的液相中进行(例如， 见实施例8)，或在硝酸纤维素带上进行，使用侧流色谱(例如，见实 施例38)。优化类目结合分子的浓度，从而获得快速结合动力学。用 于选择特异性结合的选择条件取决于类目结合分子的特征及其与靶分 子的相互作用。具体条件和过程在下面的实施例中描述。
                                                           
步骤5：选择与类目结合分子及信号传递部分复合的靶            
将与信号传递部分结合的靶与未结合的信号传递部分进行物理分 离可提高随后的检测过程。选择步骤的另外一个目的是使靶沉积在检 测区(例如，成像装置焦面中的范围)中。复合物通常与固相结合， 而未结合的类目结合分子和信号传递部分仍留存在液相中。在某些情 况下，洗去未结合的物质。在其它试验形式(例如，均相液相形式和 基于薄膜的测定法)中，无需清洗。
对于在结合步骤之前，将样品固定在固体底物上的测定法而言， 未结合的类目结合分子和信号传递部分通常通过清洗除去。下面代表 性的实施例包括使用原位杂交和免疫细胞化学方法。
其它试验形式是在液相，例如，微量滴定孔中进行的。在这些实 施例中，靶/类目结合分子/信号传递部分复合物通常在结合步骤之后 沉积在表面上(见，例如，实施例8)。使靶复合物沉积在表面上的方 法包括离心，过滤，重力沉降，磁性选择，或与表面结合的类目结合 分子(例如，捕获抗体，如实施例18)结合。在某些情况下(例如， 磁性分离不同的部分)，使用选择部分。涂覆了类目特异性抗体的磁 性微粒是选择部分的例子(见，例如实施例8)。未结合的类目结合分 子和信号传递部分通常留存在液相中，而且可除去。如果选择过程(例 如，光学成像)可选择性分析具有狭窄视野深度的固体表面，那么有 时无需除去未结合的物质(位于焦面外部)(例如，见实施例8)。这 些和其它方法的其它例子在下面给出。
在关注点(point-of-care)试验中，侧流和流通形式是可论证的最 成功的试验形式。这些形式利用吸水薄膜中毛细流的优点。它们通常 使用表面-结合的类目结合分子选择靶复合物。未结合的类目结合分子 和信号传递部分通过毛细作用流到捕获区外面。基于薄膜测定法的其 它重要优点是很容易利用几何区别而成为多路的。
构造多路试验的几何区别。当扫描靶的多个类目时，几何区别是一个重 要的方法(即，在多路试验中)。与高信号复杂度的多路试验(见步 骤2)相比，几何区别具有下列优点，即对于多路试验而言，只需要 单一的信号标志。在使用几何区别的典型免疫测定法中，不同的类目 特异性捕获抗体沉积在检测区的不同范围中(例如，侧流试验中的不 同带或流通试验或基于微量滴定孔的试验中的不同斑点)。因此，靶 的不同类目在捕获区的不同预定范围被捕获。与捕获抗体类似的其它 类型捕获部分包括抗原，配体，及核酸。几何区别的若干实施例在下 面给出(例如，见实施例38和实施例34)。
                                                             
步骤6：通过检测与样品中靶结合的信号传递部分而检测，鉴定，并 量化样品中存 在的靶生物                                         
本发明的重要优点，包括其灵敏度及其量化靶的能力，来源于利 用大面积成像检测单一靶的能力。一旦复合物位于检测区中，则用信 号传递部分标记的靶的检测就会受到影响。所用的检测过程取决于信 号传递部分的信号特征的类型(例如，荧光，化学发光，或光散射)。 对于某些信号特征(例如，光散射和荧光)而言，检测区中的复合物 必须接受光源的照射。对于其它(例如，化学发光，无线电传输，或 磁场)而言，无需照射。可以使用的各种检测模式包括CCD照相机， 胶片，和直接目测。
非-显微镜检查的大面积成像可大大增加灵敏度。不使用显微镜检 测靶是本发明的其中一个重要方面，在很多情况下，它可获得比标准 原位分析方法中所用的显微镜检查法更为快速，有效，且灵敏的样品 分析。与显微镜检测相比，不使用显微镜的大面积检测的灵敏度增加 是由于扫描更大体积含靶样品的能力。例如，本发明可使显微镜载玻 片上的区域成像，而这个区域要比利用显微镜成像的典型区域大几千 倍。灵敏度的最终增加可由来源于肺结核患者的、含有10,000个细菌 /毫升的痰液样品来说明。进行原位分析时，将样品的一部分(例如， 10μl含有大约100个结核分枝杆菌)在显微镜载玻片上涂抹为大约1cm2 大小的面积。在这种情况下，本发明可使整个1cm2大小的范围成像， 同时检测100个单一细胞。相反，当使用显微镜分析时，由于检测的 视野较小，单一区域根本不含细菌的可能性很高。因此，当使用显微 镜分析时，必须仔细检测多个视野(常常是上百个)。这是一种增加 成本-，费力-，和费时间-的方法，可由本发明的试验避免。
单一靶的检测很自然就是定量的。在检测或成像步骤的过程中， 本发明可检测规定体积样品中的单一靶。定量可通过计算照相或数字 图像中的单一细胞数人工完成或通过对数字图像进行软件分析而自动 完成。对样品的信号强度积分也可用于量化靶。信号积分对于含有高 浓度靶或相关靶(丝状真菌)的样品特别有效。在这些情况下，分辨 即时信号常常是不可能的。当适于共同使用它们(例如，当靶水平足 够低，从而可区别分散的靶)时，自动信号积分和粒子计数可提供一 种稳定，并因此优选的量化方式。
将标记探针家族的标志解译可鉴定靶的若干类目。这一步的重要 目标是通过测定与样品粘着的标记类目结合分子的标志而鉴定样品中 靶的类目。
成像对照标准品可提供鉴定基准并表明该测定法是正确发挥作用 的。稳定性和再现性可通过在本发明中很容易地掺入内部标准品和对 照品的能力而大大提高。例如，当扫描含有通常引起肺炎的24种病 原体的下呼吸道样品时，可同时扫描一组含有各种病原体的内部标准 品(例如，见实施例1)。除了为所有试剂和过程提供全面且过多的检 查之外，内部标准品还可提供一组基准信号，从而与样品信号比较而 鉴定。
当使用荧光作为信号特征时，基于CCD照相机的成像器，如图3 所示，是一种用于大面积成像的有效装置。这种装置用于收集下面很 多实施例的数据。激发光是通过从高强度白光源(1000W Xenon弧光 灯，Model A-6000，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)将光引入到液体光导中(5mm芯直径，Model 380，Photon Technology Incorporated，Monmouth Junction，NJ)而提供的。液体光 导可将光传送给激发滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics， Hawthorne，NY)，并将滤过的光束(通常直径9mm)对准含有标记 靶的检测表面。图3所示装置可检测各种检测表面(例如，微量滴定 孔，显微镜载玻片，盖玻片，和平坦、光学透明底部的试管)上的标 记靶。入射光穿透检测表面，诱导经由类目结合分子与靶结合的信号 传递部分中的荧光。所发射荧光的一部分是由高-收集效率的透镜系统 收集的，并通过发射滤器盘(BioPoint FW，Ludl Electronics)传输给 CCD照相机(Orca II，Hamamatsu，Bridgewater，NJ)。光学装置的 设计和构造是与本领域技术人员已知的原理和实践为基础的。
下面实施例中的试验使用图3所示的仪器，其中装有X-Y定位平 台(BioPoint XY，Ludl Electronics)，从而在激发和收集的光学器件 (图中没有标出)上移动样品容器(例如，微量滴定平板)。Image-Pro 和Image-Pro附件可控制所有的仪器元件及像的获得。滤器盘是用 ScopePro附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)控制的，StagePro 附件(Media Cybernetics，Baltimore MD)操纵平台的定位，而照相 机的控制是通过Hamamatsu Orca II驱动器(Hamamatsu，Bridgewater， NJ)进行的。Image-Pro Plus也可用于像-处理和下面所述的分析。
可使用捕获样品区域的中等分辨像的低成本照相机。对于典型的 感染性疾病而言，在20×20mm的样品面积上，分散了1-10,000个靶。 预期单一、非-丝状的原核生物细胞以直径小于10μm的点源出现。对 于在成本已知的医学诊断实验室中进行的常规试验而言，可使用中等 分辨率的照相机。例如，具有极好的灵敏度和干扰指数的便宜照相机 (例如，来源于Roper Scientific的SenSys CCD)很容易获得。这些 系统通常具有500×500或更高像素的分辨率。用500×500像素的分辨 率使20mm2的样品区域成像可提供250,000个像素，超过了典型测定 法中预期的，足以区别1个靶-10,000个靶的大半。
成像系统的灵敏度可通过选择更灵敏的照相机(例如，冷却至低 温的照相机，或使用后面较薄的芯片的照相机)来增加。可选择性地， 检测灵敏度和分辨率可通过使用线扫描系统(例如，BT Image Array； Hamamatsu)增加。进行线扫描时，线性CCD或光电二极管阵列(例 如，1×500或1×1000个像素)用于捕获像。一维分辨率与阵列元件数 相对应，而第二维常常通过在线性阵列下垂直移动样品载玻片而捕 获。因为元件较少，相似灵敏度的线性阵列通常比区域形式的CCD 照相机要便宜。
本发明使用白光照射的实施方案利用光谱滤器为每个荧光团提供 最佳激发峰。白光的光谱较大，可选择各种荧光团来消除发射光谱的 重叠。通常使用白光照明装置获得的斑点大小，例如，2mm-5mm，对 于大面积成像是适宜的。因为滤器更换相对简单，而且可以是自动化 的，因此白光系统非常适宜，可在使用不同荧光团组的试验中使用相 同的仪器。
图3所示系统的收集效率是通过插入由两个元件组成的、常规设 计的收集光学器件而最大化的，这两个元件是：收集物镜和聚焦元件。 收集物镜具有高收集效率(≥f#/1.2)，并输出相对准直的光束。聚焦 透镜可捕获从收集物镜输出的光，并将它聚焦在CCD的检测表面上。 光学器件被设计成两部分，从而使滤器盘插在收集透镜的路径中。对 于本发明的某些实施方案而言，例如，对于某些不需要更换滤器的实 施方案而言，它可包括一个用于获得高收集效率的锥形光纤束。光纤 束包括收集近样品光的纤维和光直接对准CCD芯片的通道。可选择 性地，本发明可利用直接近检测而非常灵敏地检测信号，其中样品直 接涂在CCD芯片上，或与CCD芯片紧密接近(对后面变薄的CCD 芯片的后面高度灵敏)。
除了白光、上述多-光谱系统之外，我们还可研制了一种更简单的 单色荧光成像系统，用于不放大的大面积成像。在该系统中，激发光 是由532nm的Frequency-Doubled Diode Laser(50mW，Model#BWT- 50E，B & W Tek，Newark，DE)提供的。所用角形照射系统在图3中 表示。
因为图3所示的检测系统是单色的，因此无需滤器盘。单一的激 发滤器可除去源于激光输出的谐波光谱(Model HQ532/10x，Chroma Technology，Brattleboro，VT)，且单一发射滤器(Model HQ620/60m， Chroma Technology，Brattleboro，VT)只能允许特异性荧光信号通过 CCD照相机。这些系统还可使用较之先前所述更便宜的CCD照相机 (Model KX-2E，Apogee CCD，Auburn，CA)来捕获像。通过插入 多个激光和滤器装置，这些图中所示的仪器很容易适合进行多色分 析。
检测系统中还可插入使靶沉积在检测表面上的工具。例如，可在 仪器中插入磁站。还可装配磁铁(Dexter Laboratories)而使磁珠沉积 在96-孔微量滴定皿的底面上。使用自动平台，将微量滴定皿移动到 磁铁上的位置中，时间要足以使磁珠和缔合的靶沉积在孔的底面(通 常几分钟足以)。然后将微量滴定皿从磁站移开，使孔单独成像。
在包括检测仪器的系统中还可插入其它选择工具。例如，过滤站 可用于使靶沉积在滤器上，然后自动成像。同样，还可通过在机载离 心机中离心而使靶沉积在检测表面上。用密集粒子标记的靶的重力选 择只需要简单在检测仪器内培养。
在包括检测装置的仪器系统中还可连接或插入其它组件。操纵样 品容器，如微量滴定皿的自动组件是其中一个例子。
插入到本发明中的CCD照相机通常冷却至-5℃--20℃，对于具有 最小照相机干扰累积的10秒-约2分钟的积分时间(取决于照相机的 灵敏度)而言足够。通过长时间收集荧光团发射的光子，较长的积分 时间通常产生更高的灵敏度。较长的积分时间对于线扫描是不适宜 的；然而，存在着后面变薄的线性阵列，它具有非常高的量子效率， 可增加灵敏度。
本发明还可利用基于干涉仪的光谱成像检测和解译信号(Schrock， E.，1997，supra)。使用这种技术，由信号传递部分发射或散射的光 分为两部分：通过棱镜(不同波长行进不同的距离)，从而重组以创 造干涉图样。干涉图样的Fourier分析可相对于像中的每个点产生一 个光谱。
可选择性地，便宜的照相用胶片可用于记录样品中靶的像。当信 号特征是化学发光时，该方法更容易实行(例如，见实施例15)。
对于本发明使用像检测器的实施方案而言，计算机软件可鉴定并 量化靶。通常，该软件可：(1)校正照射的不均匀性；(2)如果需要， 校正通过去卷曲基质干扰的荧光；(3)如果需要，利用印在底物上的 登记标记排列像；(4)进行计算，从而将靶与其它信号区别开来；(5) 给样品中每个成像的靶分配同一性；(6)计算每个类目中的靶总数； (7)成像并记录用于样品鉴定的条形码；和(8)将输出的数据(包 括内部标准和样品的数据)，像，和条形码自动保存在数据库中，通 过网络浏览器界面查询。市售的像分析软件包可用于提供这些功能。 可使用多色像分析软件包(例如，Image-Pro，Media Cybernetics； Metamorph，Universal Imaging，MatLab，The Mathworks)。
虽然本发明可计算单一分散的靶，靶可以是完全连接的(例如， 丝状真菌)，或可以是重叠，或同时存在的(常以高密度存在)。因此， 本发明所用的软件分析包优选包括量化靶的组件，它是通过将成像面 积上的信号标志的信号强度积分而进行的。样品中的靶数常常通过将 样品像的积分信号强度与内部标准对照中单一靶的平均信号强度作比 较而确定。通过将若干样品的输出与“金本位”方法进行比较，软件 量化组件优选对于每种类型的靶都是“调谐的”。例如，含丝状真菌 的样品优选使用下列软件模块量化，其已经通过与显微镜量化比较而 校准。或，对于某些细菌而言，通过微生物培养或染色细菌的显微镜 检测而进行的量化可用于校准该软件。下面的实施例提供用本发明获 得的像软件分析的具体例子。
这里描述用于分析在下面很多实施例中收集的荧光数据的软件包 和方法。使检测表面成像，从而测定荧光-标记的复合物数和/或总荧 光信号。荧光是通过CCD照相机从测定容器的底部捕获的，并存储 为TIFF(Tagged Image File Format)像文件，其中包括像素位置和强 度的记录。3种方法都可用于量化测定结果。成像检测区的总积分信 号是通过计算所有像素的荧光信号总和测定的。将样品的积分信号与 阴性对照的进行比较。测量总的积分信号对于含多个靶的样品特别有 效。第2个方法是计算检测区域中的物体数。第3个方法是将荧光物 体内所含的全部像素的强度积分(与计算像中所有像素强度的总和相 反)。所有像分析都是用Image-Pro v 4.0(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)进行的。
获得总积分信号是通过最初确定代表容器底部的像上面积(目标 面积)而获得的。Image-Pro可使目标面积转化成单一物体，其它 Image-Pro工具可计算该物体中像素总信号的总和。然后以相同的方 法分析没有加入靶的测定容器的相似像，并用作阴性对照。将阴性对 照值从含靶样品的值中扣除。这样做可除去两种测定法和电干扰。
第2和第3个量化方法使用了Image-Pro’s物体-发现工具。这种工 具可连接连续的像素，该像素具有高于自动或用户-自定义阈值的值(信 号)。这样可确定物体周长的轮廓线。周长像素和那些内部被定义为 物体，这些像素值的总和产生物体积分值。然后使用分析软件自动计 算代表样品容器底部的目标区域中的所有物体数，此外，计算所发现 所有物体的积分信号强度。
使用IPP Image-Pro宏语言，上述工具可同时自动批量处理若干像。 此外，还可使用其它用户自定义的IPP小型程序处理数据。例如，可 包括或排除低于或高于特定大小(面积)或强度的物体，它是用于除 尘的有效工具。
实施例.下面的实施例为实行本发明的各种实施方案提供了技术细节， 它们可与各种应用联合使用，但不是对本发明的限制。
实施例1.用荧光DNA-结合染料标记的各个细菌的大面积成像      
概述：本实施例证实本发明在不放大的情况下，检测多孔膜上各个细 菌细胞的用途。大肠埃希氏菌的细胞靶是用荧光核酸染料标记的，并 通过薄膜过滤，利用大面积成像，使用CCD照相机捕获荧光像。
实验方法：大肠埃希氏菌ATCC 8739的培养物37℃时，在胰胨豆胨 培养液(TSB，BD目录号#211822)中生长18小时。将细胞的1ml 等分试样在微量离心机中旋转，重悬浮在等体积水中。通过将1ml等 分试样加热至100℃5分钟而杀死细胞。将核酸染料Sybr Green I (Molecular Probes；目录号S-7563)加入到杀死的细胞中，直到终浓 度为“10x”。(Sybr Green I原液为10,000X)。将染色的大肠埃希氏菌 细胞在水中连续稀释，并使用真空过滤装置和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)通过0.22μm的黑色聚 碳酸酯滤膜(Osmonics目录号K02BP04700)过滤。荧光是用装配有 FITC滤光器装置(Chroma/激发470/40nm，发射522/40nm)的大面 积不放大CCD成像器(上面步骤6所述；图3所示)检测的。4.1版 本的Image-Pro Plus软件用于捕获并处理CCD成像器的像。
结果：图7左面表示用Sybr Green I染色，并进行大面积不放大成像 的各个大肠埃希氏菌细胞。可见的白点，即荧光信号数，与预期的大 约100个大肠埃希氏菌细胞数一致，这是以所用的稀释度和视野面积 为基础的。右面表示“没有细胞”的阴性对照通过薄膜过滤，而以 相同方式成像。
实施例2.用DNA-结合荧光染料染色的各个细菌的大面积成像        
概述：在本实施例中，盖玻片上的大面积成像用于检测荧光核酸染料 标记的各个大肠埃希氏菌的细胞靶。染色的细胞是用白光照射，并用 CCD照相机成像的。
实验设计.大肠埃希氏菌MG1655的培养物37℃时在LB肉汤(BD； Sparks，MD)中生长18小时。通过在热传导阻滞区中将18-小时培养 物的1ml等分试样95℃加热5分钟而将细胞固定。向固定的培养物中 加入核酸染料，Syber Green I(Molecular probes；目录号S-7563)，获 得1∶1000稀释的染色原液。(1μl Syber Green I原液(10,000X)，999μl 的热固定培养物)。将大肠埃希氏菌细胞染色10分钟。然后将细胞在 微量离心机中11700g旋转10分钟。弃去上清液，将细胞的颗粒状物 重悬浮在等体积H2O(1型质量)中。将染色细胞连续稀释，从而获 得108-104个细胞/ml的浓度。通过在1∶10稀释(将5ml聚-L-赖氨酸 溶解在45ml的1型H2O中)的聚-L-赖氨酸溶液(Sigma Diagnostics； 目录号P-8920)中浸没盖玻片，可将聚-L-赖氨酸涂覆在Corning No.1 1/2盖玻片上，然后风干。一旦被涂覆，在H2O(1型质量)中清洗盖 玻片，并风干。将稀释过的染色细胞的5μl等分试样吸量到聚-L-赖氨 酸盖玻片上，室温(大约20分钟)干燥。荧光是用装配了FITC滤光 器装置(Chroma/激发470/40nm，发射522/40nm)的CCD成像器(上 面步骤6所述；图3所示)成像而检测的。4.1版本的Image-Pro Plus 软件(Media cybernetics)用于捕获并处理CCD成像器的像。使用装 配有相同滤光器装置的Axioplan II荧光显微镜(Carl，Zeiss Inc.， Thornwood，NY)可证实在成像器上检测的正信号是大肠埃希氏菌。 结果：图8表示用Syber Green I染色的细胞是用大面积不放大成像检 测的。利用高倍荧光显微镜(1000X；图8)观察到的可见白点，即 荧光信号与各个大肠埃希氏菌细胞或聚集的细胞相对应。
实施例3.通过与荧光标记的寡核苷酸类目结合分子杂交而标记的各个 细菌的大面积成像                                                
概述：在本实施例中，大面积成像用于检测各个大肠埃希氏菌细胞的 靶，它是通过使细胞rRNA与荧光标记的寡核苷酸类目结合分子杂交 而标记的。按照实施例2所述使细胞成像。
实验过程：大肠埃希氏菌细胞是按照实施例2所述生长的。室温将细 胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定30分钟。通过以11,700g在微量离 心机中离心10分钟，然后将细胞的颗粒状物重悬浮在等体积PBS中 而“清洗”细胞。按照前面所述旋转细胞，然后重悬浮在50％乙醇中， 20℃放置14小时，按照上述用PBS清洗。然后旋转细胞，并重悬浮 在杂交缓冲液(1M NaCl/50mM EPPS/0.5％ Tween 20/0.4μg/μl酵母t- RNA/2％封闭剂，其中封闭剂是100mM马来酸pH7.65/150mM NaCl/10％封闭剂(Boehringer Mannheim))中。49℃培养细胞30分钟 (预-杂交步骤)。加入FITC偶联的DNA核糖体探针(1μl；合成基 因5’FITC-GCTGCCTCCCGTAGGAGT)，49℃培养细胞1小时(杂 交步骤)。杂交后，用清洗缓冲液(PBS-TB)清洗细胞，49℃培养10 分钟。再重复清洗步骤2次，总共清洗3次。使标记细胞(5μl)沉积 在聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片(实施例2所述)上，并利用CCD成像 器(如在详述部分的步骤6所述，和图3所示)成像。4.1版本的Image-Pro Plus软件用于捕获并处理CCD成像器的像。
利用荧光显微镜(1000X；图8)对样品进行的检测可用于证实 不放大的数字图象中的点与大肠埃希氏菌细胞相对应。
结果.用FITC偶联的大肠埃希氏菌-特异性rRNA寡核苷酸作为探针与 大肠埃希氏菌细胞杂交后，使用CCD成像器可很容易地看到各个细 胞(图8)。通过高倍荧光显微镜(1000X；图8)见到的白点，即荧 光信号与各个大肠埃希氏菌细胞或聚集的细胞相对应。
实施例4.通过与荧光标记的PNA类目结合分子杂交而标记的各个细 菌的大面积成像                                               
概述.在本实施例中，大面积成像用于检测各个大肠埃希氏菌细胞的 靶，它是通过使细胞rRNA与荧光标记的PNA类目结合分子杂交而被 标记的。按照实施例2所述使细胞成像。
实验过程.细胞是按照实施例2所述生长的。制备用于杂交的细胞，并 按照PNA micro Dx Fish Reagent试剂盒(Boston Probes；目录号 KT11000)的制造商所述，与对大肠埃希氏菌特异的PNA探针杂交。 将标记细胞(5μl)点在聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻片上，并按照实施例2 所述成像。4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)用于 捕获并处理CCD成像器的像。
结果.图8表示用荧光标记的种类-特异性PNA探针标记的各个细菌细 胞是在不放大的情况下，利用大面积CCD成像检测的。用CCD获得 的像中的白点与各个大肠埃希氏菌细胞或多个细胞的聚簇相对应，这 是通过利用高倍荧光显微镜(1000X；图8)分析相同样品获知的。
实施例5.通过与荧光标记抗体结合而标记的各个细菌的大面积成像
实验过程.细胞是按照实施例2所述生长的。将FITC标记的兔抗-大肠 埃希氏菌多克隆抗体(1∶200稀释；Biodesign；目录号C65110M)加 入到105-102个细胞/ml的细胞稀释液中，室温培养1小时。然后通过 离心(11,700g，10分钟)使细胞旋转，并在PBT中重悬浮而将细胞 “清洗”两次。然后将清洗过的细胞点在实施例2所述的聚-L-赖氨酸 涂覆的盖玻片上。按照实施例2所述进行CCD成像和显微镜检查。4.1 版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics)用于捕获并处理CCD 成像器的像。
结果.图8表示用荧光团-标记的类目特异性抗体探针标记的各个细菌 细胞是在不放大的情况下，利用大面积CCD成像检测的。用CCD获 得的像中的白点与各个大肠埃希氏菌细胞或多个细胞的聚簇相对应， 这是通过使用高倍荧光显微镜(1000X；图8)分析相同样品而获知 的。
实施例6.用荧光酯酶底物染色的各个活细菌的大面积成像         
概述和目的.在本实施例中，大面积成像用于检测各个活的大肠埃希氏 菌细胞的靶，它是用荧光酯酶底物的组合染色的(信号传递部分)。 底物可通过完整活细胞的细胞膜扩散，当受到在代谢活细胞中发现的 酯酶的作用时，它们会发荧光并带电荷。这些带电荷的荧光产物不再 通过细胞膜被动扩散，并在完整细胞中被捕获。当想要将活细胞与死 细胞区别开时，该技术是有效的，只有具有活性酯酶和完整细胞膜的 细胞可适当染色。在该实施例中，活的或死的大肠埃希氏菌细胞是通 过黑色聚酯膜过滤的，并与荧光底物荧光素二醋酸盐(FDA)和羧基 荧光素二醋酸盐(CFDA)培养，进行不放大的大面积CCD成像。
实验方法：大肠埃希氏菌ATCC 8739在胰胨豆胨培养液(TSB，BD 目录号#211822)中生长过夜，通过离心清洗细胞一次，除去上清液， 将颗粒状物重悬浮在等体积的PBS中。将清洗过的细胞的1ml等分试 样100℃加热20分钟而制备死细胞。在PBS中制备活细胞和死细胞 的适宜稀释物。使用Millipore 1225多功能过滤装置，通过安装在吸 水垫(Chemunex目录号#200-C3012-02)上的黑色聚酯薄膜(Chemunex 目录号#200-C2010-01)过滤细胞。在多功能过滤装置中，用500μl过 滤的TSB覆盖细胞，30℃培养60分钟。透过薄膜吸出培养基，替换 为500μl 20μM CFDA(Molecular Probes目录号#C-195)，10μM FDA (Polysciences目录号00615)的ChemSolB16(Chemunex目录号 #200-R2023-02)溶液，37℃培养60分钟。透过薄膜吸出试剂。拆下 所述多功能过滤装置，将聚酯膜安装在载玻片上，干燥。聚酯膜上的 荧光信号是用装配有FITC滤光器装置(Chroma/激发470/40nm，发 射522/40nm)的CCD成像器(如上面步骤6所述；图3所示)捕获 的。4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics)用于捕获并 处理CCD成像器的像。
结果.图9所示的亮荧光点是活的大肠埃希氏菌细胞(左面)，而死的 大肠埃希氏菌细胞(右面)没有可检测的荧光信号。活细胞区域中的 点数约为400个，与根据加入到滤器中的细胞稀释物和视野面积预期 的细胞数一致。
变化.可使用区别活细胞或死细胞的其它染料。例如，可使用能够或不 能穿过完整细胞膜的其它荧光底物或DNA染料代替或与FDA和CFDA 结合使用。多种着色剂和染料可通过使用多种用于荧光检测的激发和 发射波长来区别。与物体缔合的荧光谱可用于确定计数的细胞是活的 还是死的。此外，对特定类型细菌的生化活性特异的荧光底物可用于 测定其存在。例如，荧光β-半乳糖苷酶底物可被β-半乳糖苷酶裂解 成其荧光产物，它对于大肠菌是特异的。
实施例7.用高度荧光粒子标记的各个细菌的大面积不放大成像    
概述：在该实施例中，大面积成像用于检测各个大肠埃希氏菌细胞的 靶，它们是用高度荧光粒子标记的。各个细菌：粒子复合物是用3种不 同波长的光照射的，并按照实施例2所述用CCD照相机成像。
实验过程：大肠埃希氏菌MG1665的培养物37℃时在LB肉汤(BD， Sparks，MD)中生长18小时。将大肠埃希氏菌细胞加入到具有光学 透明底部的微量滴定平板(Greiner America，Inc.；目录号655896) 中，至终浓度为105个细胞/孔(105个细胞/50μl)。然后在热传导阻滞 区上加热微量滴定平板至95℃，直到含细胞的溶液完全干燥。将核酸 染料，Syber Green I(Molecular probes；目录号S-7563)加入到固定 培养物中，获得1∶1000稀释的染色原液。(1μl Syber Green I原液 (10,000X)，999μl的热固定培养物)。与染料接触10分钟后，用水 “清洗”细胞两次(每次200μl，然后吸出)。将未稀释的绵羊血清 (Fitzgerald；目录号88-NS55)加入到每个孔中，室温培养30分钟。 将孔吸干，然后将在绵羊血清中1∶500稀释的兔抗-大肠埃希氏菌抗体 (Biodesign；目录号C65110M)加入到适当的孔中，37℃培养2小时。 将孔清洗3次，其中用清洗溶液1(PBT)清洗两次，用清洗溶液2 (PBS-B)清洗一次。接着，将在绵羊血清中1∶500稀释的生物素标 记的山羊抗-兔IgG抗体(Jackson；目录号111-005-003)加入到适宜 的孔中。37℃培养抗体2小时。用清洗溶液1清洗孔2次，用清洗溶 液2清洗孔1次。将抗生物素涂覆的Texas Red荧光粒子(0.45μm； Spherotech；目录号VFP-0562-5)加入到所有孔中，到105个粒子/孔 的终浓度。室温培养平板过夜。然后用溶液1清洗孔5次，用水清洗 2次。荧光是通过在装配有FITC滤光器装置(Chroma/激发470/40nm， 发射522/40nm)的CCD成像器(如详述部分步骤6所述，和图3所 示)成像而检测的，其中对抗生物素涂覆的Texas Red粒子使用Syber Green I，Texas Red滤光器(Chroma/激发560/55，发射645/75)，而 对Syber Green染色的细胞和Texas Red粒子使用GFP Long Pass滤器 装置(Chroma/激发470/40，发射500LP)。4.1版本的Image-Pro Plus 软件(Media cybernetics)用于捕获并处理CCD成像器的像。在成像 器上检测到的正信号经证实是各个大肠埃希氏菌细胞，这是用装配有 相同滤器装置的Axioplan II荧光显微镜(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood， NY)获知的。
结果.图10表示利用大面积不放大的CCD成像检测用类目特异性抗体 和荧光粒子信号传递部分标记的各个大肠埃希氏菌细胞。可见的白 点，即荧光信号与具有多个粒子的各个大肠埃希氏菌细胞或被粒子围 绕的细胞聚簇相对应，这是使用高倍荧光显微镜(1000X；图10)观 察到的。这些是抗生物素蛋白-涂覆的粒子。细胞是用分类群-特异性 抗体，然后是抗-抗体-生物素，然后是抗生物素蛋白粒子标记的。
实施例8.使用不放大的大面积成像检测各个细菌的均相免疫测定法
目的：本实施例可证实用于检测各个细菌细胞的免疫测定法，包括用 于检测少数致病性大肠埃希氏菌O157:H7细胞的、用户容易掌握使用 的均相免疫测定法。
图11提供这里使用的均相免疫测定法和随后的实施例。均相免疫 测定法有利于诊断，这是因为它们简单、快速、便宜、且很容易自动 化。(这里所用的均相是指抗体与分析物的结合是在将试剂与样品混 合之后检测的，但没完全除去-例如，吸出-类目结合分子：靶复合物中 未反应的类目结合分子)。然而，绝大多数均相免疫测定法都不灵敏 (与核酸扩增法相比)，不定量，且非多路的(或非常浅的多路)。这 里，相反，本发明可使均相免疫测定法灵敏，定量，且多路。
在实施例中，将含有大肠埃希氏菌O157:H7的样品与磁性和荧光 粒子混合，进行磁性选择，并进行不放大的大面积CCD成像。无需 清洗步骤。
实验方法：抗-大肠埃希氏菌磁性粒子是通过用活性甲苯磺酰基 (Dynal，Oslo，Norway，目录号140.03)，使磁性粒子与相对于大肠 埃希氏菌O157:H7培养的多克隆抗体(BioTrace亲和纯化的；Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，目录号01-95-90)偶联而制 备的。在微量离心机试管(1.5ml)的PB(清洗3次，每次1ml)中 清洗磁性粒子(30mg/ml；100μl；Dynal，Oslo，Norway，Dynaparticles M-280 Tosylactivated目录号140.03)，然后利用粒子的磁性分离除去 上清液(本实施例中的所有磁性分离，除非另有说明，都是利用 Polysciences Inc.的装置进行的，目录号8MB4111S)。将粒子重悬浮在 PB(70μl)中。相对于大肠埃希氏菌O157:H7培养的亲和纯化多克隆 抗体(60μg；Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，目 录号01-95-90)是按照制造商的指导，通过使从制造商处获得的溶液 通过离心过滤装置(Millipore Microcon Model No.YM-30；名义上分 子量限制为30,000道尔顿)而纯化的。将在滤器上收集的抗体重悬浮 在PB(30μl)中。使抗体(30μl)与磁性粒子(70μl)在微量离心机 试管(1.5ml)中结合，短暂涡旋。37℃旋转培养反应物20分钟(除 非另有说明，大约30rpm)。20分钟后，加入BSA(没有IgG)至0.1 ％的终浓度，并于37℃旋转培养过夜。用PBS-B清洗磁性粒子2次 (每次1ml；利用磁性分离)。将磁性粒子重悬浮在缓冲液(补充了0.1 ％(w/v)BSA(没有IgG)的0.2M Tris pH8.5)中，37℃旋转培养4 小时。最后，清洗磁性粒子2次(利用磁性分离在PBS-B中进行)， 并重悬浮(终浓度为在PBS-B中含0.1％固体)。
抗-大肠埃希氏菌荧光粒子是利用涂覆磁性粒子的相同抗体的被动 吸附，涂覆荧光粒子(Fluospheres；Molucular Probes，Sulfate Microspheres，1μm，红色荧光(580/605，目录号F-8851)而制备的。 兔抗-白色念珠菌抗体(1.25nmol A型多克隆纯化IgG；Biodesign目 录号B65411R，Lot No.3B03200)是按照上面所述纯化的。为了使表 面硫酸盐基团被动吸附抗体，通过离心(5分钟；10,200xg；Eppendorf Centrifuge Model 5417C，Eppendorf Swinging Bucket Rotor Model A- 12-11)并将颗粒状物重悬浮(1ml PBS/.15M NaCl)而反复清洗(3 次)粒子(62.5μl；2％固体；Molecular Probes目录号F8851，1μm， 红色荧光(580/605))。将颗粒状物重悬浮在PBS(125μl，1％固体浓 度)中，边涡旋边滴加纯化抗体(1.25nmol，1nmol抗体/mg粒子)。 25℃旋转培养混悬液2小时，接着4℃过夜培养。清洗粒子(3次， 但离心后在PBS-TB中重悬浮)，在PBS-TB(200μl)中重悬浮，旋转 培养(30分钟，25℃)。按照上面所述清洗粒子2次，并重悬浮在PBS-TB (125μl，1％固体的浓度)中。
制备粒子后，培养(200ml LB；4小时；250rpm，37℃)大肠埃 希氏菌O157:H7(Strain DEC 3B，Dr.Tom Whittam，Pennsylvania State University)的接种物(200μl的过夜培养物)，并通过平板接种下列连 续稀释物而滴定。立即将培养物放在冰上，防止进一步生长。直接向 含细菌的培养基中加入福尔马林(终浓度＝2.5％)而将10ml等分试 样固定。(在PBS中，以1∶10)制备培养物等分试样(100μl)的连续 稀释物，平板接种每份稀释物的等分试样，测定固定细菌原液中的细 菌浓度。将这种原液稀释到1×106个细菌/ml的浓度。通过离心(950× g)和重悬浮(1ml；PBS)清洗原液(1ml)，接着将细菌颗粒物重悬 浮在PBS(1ml)中。
对抗-大肠埃希氏菌磁性和荧光粒子(每种类型1×106个/μl)的混 合物进行超声波处理(1分钟；8档；Fisher Scientific 550 Sonic Dismembrator)。用Gel Slick(Biowhittaker Molecular Applications，目 录号50640)处理96孔玻璃底平板的孔(Whatman Inc.，Clifton，NJ， 目录号7706-2370)1分钟。吸出Gel Slick，并通过向每个孔中加入无 菌水，然后吸出而清洗3次。在加入样品前，将孔干燥5分钟。向孔 中加入缓冲液(PBS-TB；6个孔中的每个孔为115μl)或血液(6个孔 中的每个孔为115μl)，接着加入经过超声波处理的粒子浆(每个孔 10μl)。将固定的大肠埃希氏菌O157:H7细胞(1×103个/10μl)加入到 3个含有缓冲液和3个含有血液的孔中。利用保鲜膜(Corning COSTAR，目录号3080)将孔密封。室温旋转(30rpm；Dynal Sample Mixer，Oslo，Norway，目录号947.01)培养样品1小时。使用磁性 分离装置(Dexter Magnetics，Sliver Spring，MD，LifeSep，目录号 2501008)在孔底的检测表面上捕获磁性粒子。
为了测试均相免疫测定法检测血液中各个细菌细胞的效率，使用 图3A所示的CCD成像器使在小鼠血液中进行的免疫测定成像。检测 面积，即微量滴定孔光学透明底部的像是用Texas Red滤器装置(激 发560/55，发射645/75)和Image-Pro Plus数字成像软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)捕获的(20毫秒曝光)。接下来， 为了测试插入清洗步骤的免疫测定法的效率，用缓冲液(PBS-TB； 200μl；上下吸量10次，如此清洗3次)清洗所有样品(即，先前成 像的含有缓冲液的那些，和含有血液的那些)。在清洗步骤过程中， 使用磁性分离装置(Polysciences，Inc.，Warrington，PA，目录号 8MB4111S)将磁性粒子，以及含磁性粒子的复合物捕获并固定在孔 表面。每次清洗后，进行磁性选择(5分钟)，并吸出上清液。将样品 重悬浮在含荧光DNA嵌入染料YOYO-1(10nm；Molecular Probes， 目录号Y-3601)的PBS-TB(200μl)中，(使用Dexter Magnetics的 装置)进行磁性选择。按照上面所述用CCD成像器使96-孔平板成像。 CCD成像后，将平板翻转，并用荧光显微镜(Axioplan II荧光显微镜， Cart，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)检测。从在血液中进行的均相免 疫测定法获得的(即，在清洗步骤之前获得的像)像(一式三份；20 毫秒曝光)是用软件分析量化的。宏(Image-Pro Plus)用于限制含检 测面积的目标区，所述检测面积包含每个孔的周边内。限制范围内的 物体数和物体积分强度是利用一系列Visual Basic小型程序分析 Image-Pro Plus分析数据(如详述部分的步骤6所述)而完成的。绘 制代表了血液中均相测定分析的两个柱形图(图12；Microsoft Excel； Microsoft Crop.)。对于在每个实验中进行比较的样品使用同一阈值。
结果：图12表示利用不放大的大面积成像灵敏检测大肠埃希氏菌的 免疫测定法结果。用类目特异性抗体涂覆的磁性和荧光粒子首先与细 菌细胞结合，然后利用磁力将复合物牵引至光学透明孔的底部表面(检 测面积)，并利用不放大的大面积CCD成像检测该复合物。图12比 较了在血液中进行的均相免疫测定法(下面)与在血液(上面)和缓 冲液(中间)中进行的非-均相(清洗过的)免疫测定法的结果。最简 单的形式，均相免疫测定法，可有效检测具有极好的信号背景比(见 图中均相测定法的量化(下面右侧的条形图))的细胞。
最左面的两幅图表示利用不放大的大面积CCD成像获得的像。当 大肠埃希氏菌存在(左面)时，所有三种测定法都可产生较强的信号， 当没有加入大肠埃希氏菌时，背景信号较低。使用CCD照相机获得 的信号与涂覆了粒子的大肠埃希氏菌细胞相对应的事实是利用高倍荧 光显微镜分析(1000X；上面两排，最右面两栏)获得的。像代表含 有大肠埃希氏菌细胞，磁性粒子，和荧光粒子的典型复合物。每个复 合物的两个像是用两个滤器装置造成的：一个观察DNA荧光(Syber Green I；右数第二幅)，一个观察荧光粒子(最右面那幅)。该图表示 被磁性和荧光粒子围绕的大肠埃希氏菌细胞所组成的复合物。
通过免疫测定法选择的大肠埃希氏菌细胞的百分比始终大于95 ％，这是通过测量未选择的物质以及免疫测定前后样品的显微比较表 示的(这里没有给出)。显微测量显示，含大肠埃希氏菌细胞的选择 复合物与每孔3.33个荧光粒子的平均值相关(n＝10；最小值＝2；最 大值＝10)。
像的定量分析是通过软件进行的，该软件可计算荧光物体数(图 12，下面，左侧的条形图)并求所有物体强度的积分(图12，下面， 右侧的柱形图)。在两次测量中，含大肠埃希氏菌(1000个细胞)样 品的得分明显比不含大肠埃希氏菌的样品要高。应注意的是，软件分 析中的总物体(1.5×104个物体)比样品中的细胞数(1000)高15倍。 此观察结果与下面所述复合物的显微镜分析相一致。通过软件分析可 知，与没有大肠埃希氏菌的样品相比，含有大肠埃希氏菌的样品具有 大于75倍的物体和约400倍的积分强度。分析显示，用样品中1×103 个大肠埃希氏菌细胞获得的信号要比从没有细胞的对照组产生的信号 高3个标准偏差。
虽然，复合物的形成主要取决于免疫测定中大肠埃希氏菌细胞的 存在(可通过比较最左侧两栏的图看出)，但是显微检查还是揭示出 很多复合物都缺少大肠埃希氏菌细胞。这是大肠埃希氏菌免疫测定法 的一致特征。很可能缺少细胞的复合物的形成是由于非-细胞结构的存 在，如不能在显微镜下观察到的大肠埃希氏菌鞭毛的片段。可选择性 地，很可能较大粒子：细胞的复合物在测定过程中断裂成几部分，产生 一些含有细胞的片段和一些没有细胞的片段。除了含有各个细胞的复 合物和缺少细胞的复合物外，显微镜分析还揭示出某些复合物含有一 个以上细胞。
在这些结果的基础上，简单，快速且用户容易掌握使用的均相免 疫测定法可与不放大的大面积成像联合，检测并鉴定血液中的少数细 菌。
变化.如下面的实施例所示，本实施例的方法可用于检测若干样品类型 中的其它靶(生物和非生物)。例如，通过使用适宜的抗体涂覆粒子， 实施例所述的方法可用于检测特定的病毒(例如HIV)，细菌，真菌， 寄生虫，蛋白，小分子，或人的细胞(如癌细胞或感染的细胞)。
其它形式也可与实施例的方法联合使用。通过对本实施例所述仪 器中的磁铁和光学组件进行重新配置，各种容器都适用。例如，可在 其它类型的容器中使用较大或较小体积的样品(例如，具有光学透明 底部和/或侧面的试管)。
标记类目结合分子的各种方法都是可能的。可使用各种大小并具 有各种信号特征的粒子。可使用含有一种或多种具有不同光谱特征的 荧光染料或含有荧光级联的荧光粒子(例如，来源于Molecular Probes 的Transfluorospheres)。还可使用其它类型的荧光粒子，如量子点。 在本实施例中，可用散射光的粒子(例如，RLS，PRP，或纳米金粒 子)替换荧光粒子。可使用可见染料标记的粒子(例如，染色的聚苯 乙烯粒子或含染料的脂质体)。可选择性地，可用荧光团(或其它信 号传递部分)直接标记抗体，或其它类型的类目结合分子。这种直接 标记的抗体可涂覆靶，从而使它们变得可以检测。同样，可用选择部 分直接标记类目结合分子。例如，抗体可与铁蛋白，一种磁性选择部 分偶联。
靶染色还可替代荧光粒子进行检测。在这种情况下，特异性是由 选择部分，类目特异性磁性粒子赋予的。例如，核酸染料(例如，碘 化丙锭，STYO 17，或DAPI)可用于非特异性标记靶。结合病原体- 特异性磁性粒子的靶可被选择带到样品孔的底部，并通过非特异性染 色观察。还可使用类目特异性染色过程(例如，见实施例9)。
将抗体与粒子偶联的可选择性方法也是可行的。这种方法是本领 域那些技术人员已知的，并在很多篇参考文献中详细描述(例如， Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，San Diego，CA， 1996)；和Edwards编辑，(1999)Immunodiagnostics：A Practical Approach.Oxford：Oxford University Press)。
还可使用其它形式的抗体(例如，Fab，Fab’，Fv)。可将不同的 类目特异性抗体组合使用。例如，在上述应用中，不同结核分枝杆菌 抗原的抗体可与单独的黄绿色荧光粒子结合，然后组合。可选择性地， 不同抗体可与相同粒子结合。还可用其它类型的类目结合分子(例如， 凝集素，多肽或配体)替换抗体。
实施例9.“模拟痰液”中抗酸染色的分枝杆菌的大面积成像     
背景：1995年，肺结核导致超过3百万人死亡，是当年AIDS/HIV死 亡的约3倍。在发展中国家，大约25％的可避免死亡是由结核分枝杆 菌感染所引起。不幸地是，诊断结核分枝杆菌感染还有疑问。因此， 对于便宜，快速，简单，和快速的诊断试验还有很广泛的需求。在大 半感染肺结核病的发展中国家占主导地位的抗酸杆菌(AFB)试验方 法不灵敏，并因此耽误了一大部分感染患者。因此，显示假阴性试验 结果且没有经过治疗的肺结核患者继续在社会中传播这种非常容易传 染的疾病。AFB试验还很耗时而且费力，这是因为要仔细检测很多显 微镜视野中是否存在染色细胞。培养，试验的金本位，是非常缓慢的 —在实验室中，通常需要花费几周的时间使结核分枝杆菌的集落生 长。新的基于扩增的分子试验快速而且灵敏，但高昂的花费甚至会限 制它在最富裕国家的使用。
目的：在本实施例中，本发明用于构造一种快速且灵敏的荧光抗酸杆 菌试验。与在基于显微镜的试验中检测相比，本试验可通过使一个更 大的面积成像(少于1秒)而获得其灵敏度，并节省劳力。
实验方法：用金胺O和金胺-若丹明将制备的载玻片(Remel；目录号 40-146)染色，该载玻片含有“模拟痰液”的污迹和与引起肺结核的 试剂非常相似的分枝杆菌(瘰疠分枝杆菌)。每个载玻片的模拟痰液 污迹中都含有阳性(瘰疠分枝杆菌)和阴性对照(大肠埃希氏菌)。 用TB金胺-若丹明染料(Remel目录号40090)或TB金胺O染色试 剂盒(Remel目录号40086)制备载玻片。使载玻片在火焰中短暂穿 过4次。用金胺O染料或金胺-若丹明染料浸没载玻片，室温培养15 分钟，接着在去离子水中清洗3次。用TB脱色剂(Remel目录号40- 107)使载玻片脱色2分钟，接着在去离子水中清洗3次。用高锰酸 钾复染剂(目录号40-092)浸没载玻片3分钟，接着用去离子水清洗 3次。然后将载玻片风干。金胺-若丹明染色的载玻片是用荧光显微镜 (Axioplan II荧光显微镜；Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY；Cy3 通道：激发546/11，发射567/15，400X放大率；500msec曝光)成像 的，以及使用CCD成像器进行不放大的大面积成像(如详述部分的 步骤6所述和图3A所示；使用相对于TRITC优化的滤器装置：(激 发545/30，发射610/75)，1秒曝光)。
结果：图13表示基于荧光的大面积成像可检测用金胺-若丹明试剂染 色的各个分枝杆菌细胞。大面积像中的荧光信号与各个分枝杆菌细胞 或细胞的一小簇相对应，这是通过使用高倍荧光显微镜(1000X；图 13)获知的。经历相同过程的大肠埃希氏菌没有显示出明显的荧光。
变化.结核分枝杆菌感染与其它分枝杆菌种类(例如，鸟分枝杆菌)的 区别通常较为重要。实施例27提出了这个实施例的改变，它可使用 类目特异性抗结核分枝杆菌抗体特异性鉴定结核分枝杆菌。
实施例10.利用大面积成像的快速抗微生物敏感性试验           
概述：抗微生物敏感性试验的目的是确定在中和从患者中分离出来的 病原体时，哪种抗微生物疗法最有效。快速抗微生物敏感性试验是很 重要的—有时可挽救生命—特别是在感染性疾病的诊断中。抗微生物 疗法的及时有效选择取决于抗微生物敏感性试验的结果。
鉴定后，通常测试感染剂抵抗各种浓度的若干抗微生物化合物的 能力。牢固方法的缺点是结果的周转时间较长(从样品取得时间开始， 最快2-4天)。这对于时间-危急的医疗急症，如中枢神经系统和血流 感染而言是成问题的。
在该实施例中，大面积成像用于快速检测模型大肠埃希氏菌细胞 对抗生素四环素的敏感性。测试两株细胞，一株抗性，一株敏感，在 抗生素中生长若干小时的能力。生长是通过用荧光核酸染料染色的各 个细胞的大面积成像检测的。
实验过程.四环素敏感性试验是按照抗微生物敏感性的NCCLS方针中 描述的肉汤稀释法(Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for bacteria That Grow Aerobically，第5版，NCCLS，M7-A5 Vol.20 No.2，2000年1月)，在两个大肠埃希氏菌菌株：MG1655(敏感株) 和MG1655/pLAFRI(抗性株)上进行的。在试验培养基接种后的6 个时间点(0，1，2，4，6，和18小时)，从每种四环素稀释物(对 于抗性和敏感株而言，分别为0μg/ml-320μg/ml，和0μg/ml-4μg/ml) 中采集抗性和敏感株培养物的1ml等分试样。并在这些时间点进行可 见浑浊度生长检查和平板计数。浑浊度检查是按照NCCLS肉汤稀释 方针进行的。“+”表示浑浊的培养物，“-”表示不浑浊的培养物。 然后按照实施例2所述，用Syber Green I将1ml的等分试样染色。将 染色细胞的等分试样(10μl)放在96孔平板(Greiner America，Inc.； 目录号655896)的各个孔(具有光学透明的底部)中，其中含有90μl 水(I型质量)。以600g将平板在离心机(Beckman Allegra)中旋转10 分钟，然后成像。荧光是用装配有FITC滤光器装置(Chroma/激发 470/40nm，发射522/40nm)的CCD成像器(如在详述部分的步骤6 中所述，和图3所示)成像而检测的。4.1版本的Image-Pro Plus软件 (Media cybernetics)用于捕获并处理CCD成像器的像。通过使用装 配有相同滤器装置的荧光显微镜(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY) 可证实：利用大面积成像检测的正信号是各个大肠埃希氏菌细胞。
结果.图14表示利用各个细胞检测并通过不放大的大面积成像量化的 抗微生物敏感性试验的结果。比较下面的两幅图可显示出，对于测定 细胞生长而言，不放大的大面积成像可与培养相比较。(通过计算琼 脂平板上的集落数也可产生可比较的结果)。通过CCD成像和培养测 定的抗生素最小抑制浓度(MIC)是可进行比较的，但多少低于过夜 生长后测定的MIC(图14上数第2幅)。
该图证实了这种快速成像法很容易将抗生素抗性株(图14右面) 和抗生素敏感株(图14左面)区别开来。生长4小时后，抗性株的 急剧生长在抗菌浓度(64μg/ml)下很明显，该浓度比抑制抗生素敏感 株生长的浓度(0.25μg/ml)高几百倍。当利用CCD成像时(下面)， 其结果可与液体培养(下数第2幅)，或集落计数(没有标出)的结 果相比较。
因此，培养4小时后，大面积不放大成像提供可与培养测定法(记 录混浊度)和平板计数相比较的抗微生物敏感性试验结果。
优点和应用.这里描述的方法与传统的抗微生物敏感性试验技术相比， 具有很多在临床上较为重要的优点。通过用类目特异性结合分子标记 (例如，见实施例2-实施例6)，细菌的鉴定可在与抗生素存在条件下 量化细菌生长的同一时间获得。检测和量化少数鉴定细胞的能力可满 足重要的诊断学需要：即在不进行细菌再次培养的情况下，进行抗微 生物敏感性试验。实现此目的可通过显著降低确定适宜抗微生物疗法 所需的时间而为患者提供较大的益处。
实施例11.已经磁性选择的各个荧光标记的白色念珠菌细胞的大面积 检测     
目的：本实施例可证实不放大的大面积成像检测各个细胞的用途，所 述各个细胞已经过磁性选择并沉积在微量滴定平板底部的检测区中。 白色念珠菌是一种常见的人类病原体，它可引起包括血源性感染和阴 道霉菌感染在内的疾病。在该实施例中，白色念珠菌细胞是用荧光核 酸染料染色的，并用兔IgG抗白色念珠菌抗体标记，然后在微量滴定 平板的孔中与用抗兔IgG抗体涂覆的磁性粒子混合。磁场的应用可使 细胞：粒子复合物在孔底部排列。然后利用基于CCD的不放大的大面 积成像检测细胞。
实验过程：白色念珠菌10453(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA)22℃时在YM培养基(BD，Sparks，MD)中生长18小时。将 细胞在2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分钟，在PBS-B中清洗2次， 然后用YOYO-1(1μM)核酸染料(Y-3601 Molecular Probes，Eugene， OR)和兔抗白色念珠菌多克隆抗体(B65411R，Biodesign International， Saco，ME)染色并标记30分钟。然后在PBS-TB中清洗细胞3次， 除去未结合的染料和抗体。使细胞等分试样与具有表面结合的山羊抗- 兔IgG抗体(8430050，Polysciences Inc.，Warrington，PA)的磁性粒 子在PBS-TB缓冲液中的混悬液于光学透明、平坦、玻璃底微量滴定 盘(Uniview；目录号7706-2370，Whatman，Inc.Ann Arbor，MI)的 孔中混合。15分钟后，使用磁铁块(Cortex Biochem，Inc.，San Leandro， CA)的磁场使磁性粒子在孔底的表面上基本均匀排列。孔底的像是用 装配有FITC滤器装置(480/40nm激发，535/50nm发射；Chroma Technology Corp.，Brattleboro，VT)和MetaMorph像捕获软件(Universal Imaging Corp.，West Chester，PA)的CCD成像器(如详述部分的步 骤6所述，和图3所示)捕获的。在大面积成像中见到的离散信号与 各个细胞相对应，这是用1200倍放大的高倍显微镜和具有相同FITC 滤器装置的Zeiss Axioplan II荧光显微镜，Carl Zeiss Inc.，Thornwood， NY)获得的。
结果.图15表示含细胞的微量滴定盘反应孔的不放大的大面积成像可 产生点状的荧光信号。这些荧光信号与各个白色念珠菌细胞或细胞的 一小簇相对应，这是利用相同反应孔的高倍(1200X)荧光显微镜检 查获知的。相反，不含细胞的孔或含有未染色细胞的孔(阴性对照孔) 没有产生(或产生很少的)正信号。阴性对照像中的少数荧光物体很 可能是尘粒或其它非生物物质。
实施例12.特异性结合荧光和顺磁聚苯乙烯粒子的各个白色念珠菌细 胞的大面积检测                                                 
目的.在本实施例中，各个白色念珠菌细胞是用细胞-特异性顺磁粒子 分离并用白色念珠菌-特异性荧光粒子标记后，利用不放大的大面积成 像检测的。
实验过程.下列混合物是在光学透明、平坦、玻璃底的微量滴定盘 (Uniview 7706-2370，Whatman，Inc.，Ann Arbor，MI)的孔中制备 的：含有YOYO-1(50nM)的PBS-TB缓冲液，如先前实施例6所述、 表面吸附了兔抗-白色念珠菌多克隆抗体(B65411R，Biodesign International，Saco，ME)的5×107个磁性粒子(MEO3N 1μm直径； Bangs Labs Inc.，Fishers，IN)，和利用标准EDAC偶联化学，将相同 抗体共价偶联到表面的5×107个荧光粒子(Fluospheres F-8821，1μm 直径，红色荧光，Molecular Probes，Eugene，OR)。为了使抗体与粒 子共价偶联，可通过室温离心(5分钟；11,000xg；Eppendorf Centrifuge Model 5417C，Swinging Bucket Rotor A-12-11)在MESB(2ml)中清 洗荧光羧化粒子(1μm，25ml，2％固体，Red(580/605)，聚苯乙烯， Molecular Probes目录号F-8821)，然后通过涡旋和吸量重悬浮。在利 用磁性粒子进行的偶联实验中，清洗是利用SPHEROTM FlexiMag Separator Jr.装置(Spherotech，目录号FMJ-1000)进行的，它可在5 分钟内，从混悬液中分离出磁性粒子。粒子清洗重复2次后，将粒子 重悬浮在MESB中(500μl；浓度为10mg/ml)。加入新鲜制备的EDAC (Sigma目录号E-6383)至0.2mg/ml的终浓度，室温轻轻混合5分钟。 向该混悬液中涡旋滴加兔抗-白色念珠菌抗体(5nmol；A型多克隆； Biodesign目录号B65411R，Lot No.3B03200；按照实施例8所述纯化)， 室温旋转(约30rpm)培养2小时。按照上面所述，通过离心在MESB 中清洗粒子4次。将粒子重悬浮在含乙醇胺的MESB中(0.03％；Sigma 目录号E9508)，室温旋转培养30分钟。按照上面所述，通过离心在 MESB中清洗粒子4次，在pH4.0的0.1M醋酸钠中清洗3次。最后， 将粒子在PBT中清洗2次，并在PBT中重悬浮至含0.1％固体。
加入重悬浮在PBS-TB缓冲液中的白色念珠菌细胞，使终反应体 积达到200μl。在摇动器上培养混合物60分钟。使钕-铁-硼磁铁与96 孔微量滴定盘(8MB4109S Polysciences Inc.，Warrington，PA)相互 接触，通过3次200μl PBS-TB缓冲液的清洗将所有未结合的荧光粒 子从磁性粒子复合物中分离出来。荧光是通过使用CCD成像器(如 详述部分的步骤6所述，和图3所示)进行不放大的大面积成像检测 的，其中CCD成像器装配有适于红色荧光粒子(Texas Red滤器装置， 560/55nm激发，645/75nm发射；Chroma Technology Corp.，Brattleboro， VT)及核酸-结合染料YOYO-1(FITC滤器装置，480/40nm激发， 535/50nm发射)的滤光器装置。与磁性粒子共同纯化的荧光粒子的存 在可表明白色念珠菌细胞的存在。在CCD成像器上检测的正信号经 证实是细胞，荧光粒子，和磁性粒子的复合物，这是通过使用Axioplan II荧光显微镜(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)获知的，它装配 有观察荧光粒子的相同Texas Red滤器装置和观察YOYO-1染色细胞 核酸的FITC滤器装置。使用Image-Pro Plus像捕获软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)和100ms的曝光时间捕获像。 结果。图16表示含细胞反应物的不放大的大面积成像可产生点状荧光 信号，而没有细胞的反应物则不产生这种信号。这些荧光信号与围绕 在各个YOYO-1(绿色)-染色的白色念珠菌细胞(或一小簇细胞)周 围的红色荧光粒子相对应，这是利用相同反应孔的高倍荧光显微镜检 查获知的。
实施例13.特异性结合荧光抗体和磁性粒子的各个白色念珠菌的大面 积检测     
目的：本实施例可证实不放大的大面积成像利用荧光团标记的抗体(信 号传递部分：类目结合分子)和抗体涂覆的顺磁粒子(选择部分)检 测并鉴定各个细胞的用途。在该实施例中，使顺磁粒子和荧光团标记 抗体与细胞结合后，在微量滴定皿中进行不放大的大面积成像，从而 单独检测白色念珠菌和大肠埃希氏菌细胞。
实验过程：室温时，用‘Block Aid’(B-10710 Molecular Probes， Eugene，OR)封闭光学透明、平坦、玻璃底的微量滴定盘(Uniview 7706-2370，Whatman，Inc.，Ann Arbor，MI)的孔30分钟。将按照 实施例6所述制备的，表面吸附了兔抗白色念珠菌(B65411R，Biodesign International，Saco，ME)或抗-大肠埃希氏菌多克隆抗体(B65003R， Biodesign International，Saco，ME)的大约5×107个磁性粒子(MEO3N 1μm直径，Bangs Labs Inc.，Fishers，IN)加入到孔中的PBS-TB缓冲 液中，使终反应体积达到200μl。将白色念珠菌或大肠埃希氏菌细胞 在2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分钟，在PBS-B中清洗2次。将细 胞加入到顺磁粒子的混悬液中，室温在摇动器上培养混合物30分钟。 加入FITC-标记的抗-白色念珠菌多克隆抗体(5μg)(CR2155RF，Cortex Biochem，San Leandro，CA)或按照制造商的说明用Alexa FlourTM 488 (Molecular Probes，Eugene，OR.，目录号A10235)标记的抗-大肠 埃希氏菌抗体(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65001R)，再培养混合 物15分钟。将未结合的抗体从磁性粒子：细胞复合物中分离出来，分 离是通过反复清洗，并利用磁铁块(CD2001，Cortex Biochem，Inc.， San Leandro，CA)的磁场进行的，利用磁场可使磁性粒子基本均匀 地排列在孔底的表面上。通过利用CCD成像器(如详述部分的实施 例6所述和图3所示)成像来检测荧光，该CCD成像器装配有FITC 滤器装置(480/40nm激发，535/50nm发射滤器，用于检测FITC和 Alexa488荧光团)。与磁性粒子共同纯化的荧光信号可表示白色念珠 菌或大肠埃希氏菌细胞的存在。经证实，在成像器上检测到的正信号 是细胞：荧光抗体复合物，这是用红色荧光的核酸-结合染料YOYO-3 (1μM)(Y-3606，Molecular Probes，Eugene，OR)将细胞核酸染色 后，使用高倍荧光显微镜(1200X)和Axioplan II荧光显微镜(Carl Zeiss Inc.，Thornwood，NY)获知的。
结果.图17表示含有白色念珠菌或大肠埃希氏菌细胞的孔可产生若干 荧光点。这些荧光信号与各个细胞(或细胞的一小簇)相对应，这是 使用红色荧光染料YOYO-3(Molecular Probes，Eugene，OR)将细 胞核酸染色，并利用高倍荧光显微镜(1200X)获知的。不含细胞的 孔则不产生这种信号(或信号非常少)。阴性对照像中的少数荧光物 体很可能是尘粒或其它非生物物质。
实施例14.用CCD照相机对各个化学发光的酵母细胞进行不放大的大 面积检测                                                      
目的：本实施例的目的是利用不放大的大面积成像观察用化学发光信 号传递部分标记的各个细胞。在本实施方案中，白色念珠菌细胞的表 面是用荧光素-偶联抗体涂覆的，然后用碱性磷酸酶偶联的抗-荧光素 抗体，并与CDP Star底物反应产生光。各个细胞在化学发光像中的存 在是利用荧光显微镜检查加以证实的。检测各个细胞时无需像增强 器。
材料和方法：白色念珠菌90028(美国典型培养物保藏中心)25℃时 在YM培养基(VWR目录号DF0711-17)中生长48小时。将细胞在 2.5％甲醛的PBS溶液中固定5分钟，然后在PBS中清洗，4℃贮存。 将10个体积的封闭缓冲液(0.5％NEN封闭试剂，目录号FP329，0.1M Tris-HCl pH8，0.15M NaCl)加入到细胞的等分试样中，培养混悬液30 分钟。加入1/100稀释的多克隆兔抗-白色念珠菌异硫氰酸盐偶联抗体 (BioDesign目录号B65411F)。轻轻混合培养细胞混悬液60分钟。 将细胞旋转，用封闭缓冲液清洗2次，然后在1/25稀释的抗-荧光素， 碱性磷酸酶偶联抗体(NEN目录号NEF-709)的封闭缓冲液中重悬浮。 再次轻轻混合培养细胞60分钟。将细胞旋转，并在0.1M Tris-HCl pH8， 0.15M NaCl中清洗3次，然后在0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl中 清洗。细胞的终混悬液是pH9.5的缓冲液。
进行大面积成像时，将细胞稀释物点在覆盖了CAST尼龙的载玻 片(Schleicher and Schuell目录号10484181)上，该载玻片是用pH9.5 的缓冲液预润湿，并用CDP Star试剂(NEN NEL-601)覆盖的。曝光 10分钟后，用没装配发射滤器的CCD成像器(如详述部分的步骤6 所述和图3所示)观察化学发光。捕获化学发光的像后，将Slow Fade 试剂(Molecular Probes目录号S-2828)点在载玻片上，加上盖玻片。 以400x的放大率，使用具有FITC滤器(Chroma #SP101)的荧光显 微镜观察载玻片，鉴定各个细胞。
结果：如图18所示，用化学发光信号传递部分标记的各个白色念珠 菌细胞可在不放大的情况下检测。从左到右，3个不同的稀释度分别 代表约200，60，和20个细胞。在最低稀释度下，当利用荧光显微镜 观察时，化学发光像上的每个点可能对应于一个细胞或一小簇细胞。 立体定向是在有成束网格线存在和细胞相对位置的帮助下进行的。较 大、较亮的斑点，特别是在左面看到的，代表一个以上细胞。
实施例15.利用瞬时胶片的直接曝光对各个化学发光的酵母细胞进行 不放大的大面积检测                                            
目的：本实施例的目的是用瞬时照相用胶片对用化学发光信号传递部 分标记的各个细胞进行不放大的大面积检测。在本实施方案中，白色 念珠菌细胞的表面用荧光素偶联抗体类目-偶联分子涂覆，与碱性磷酸 酶：抗体偶联物结合，并与CDP Star底物反应，产生光。
材料和方法：白色念珠菌90028(美国典型培养物保藏中心)是按照 实施例14所述生长并标记的。在Polaroid胶片上成像时，将一片 Hybond-N薄膜(Amersham-Pharmacia RPN1782B)放在一张吸收滤纸 上，用0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl预湿润。将细胞的稀释物点 在薄膜上，然后加入CDP Star试剂(NEN NEL-601)。按制造商说明， 将薄膜装到SpotLight照相机(Boston Probes DT10000)中，与ASA 2000 胶片(Boston Probes DT20000)接触30分钟。
结果：用化学发光信号传递部分标记的各个白色念珠菌细胞可按照图 19所示，直接在瞬时胶片上检测。该图表示标记细胞3个不同稀释物 的像。图19所示样品稀释物与实施例14(图18)中成像的那些相同， 代表约200，60，和20个细胞(分别是图中从左到右)。大的亮点， 特别是在左面所见的，与含有若干细胞的聚簇相对应。图右面的点代 表各个的细胞或若干细胞的聚簇。
实施例16.利用不放大的大面积成像对涉及下呼吸道感染的生物进行 检测           
目的：利用不放大的大面积成像鉴定涉及下呼吸道感染的生物：肺炎 衣原体，肺炎支原体和侵肺军团菌。
概述：肺炎是全世界死亡的主要原因，是美国死亡的第6大原因。该 数字的上升趋势是由于＞65岁个体比例的增加和其它因素造成的。现 有的诊断常常是凭经验，然而确切的诊断可通过使用适宜的抗生素而 提高患者的结果。通过将痰液直接荧光染色，然后联合不放大的大面 积成像而对特定生物(有些生物很难培养)进行的检测可帮助诊断， 由此降低肺炎所造成死亡的发生率以及健康护理的费用。
实验方法：制得肺炎衣原体和肺炎支原体的对照载玻片(Bion，Park Ridge，IL；目录号分别为CP-4212和MP-1212)。将载玻片温热至室 温，然后在封闭溶液(PBS/1％BSA，15分钟，25℃)中培养。吸去 封闭溶液，将初级抗体(抗-肺炎衣原体；DAKO Corporation， Carpinteria，CA，Code NM660，Clone RR402，1/5稀释，和抗-肺炎 支原体；Fitzgerald International Industries，Inc.，Concord，MA，Cat.No. 10-M40，1/1000稀释)在封闭溶液中的稀释物加入到肺炎衣原体对照 载玻片和肺炎支原体对照载玻片的各个孔中。培养载玻片(30分钟， 25℃)，然后清洗(PBS-BT，每次4×5分钟)，并与次级Cy3偶联抗 体培养(15分钟，25℃，山羊抗-小鼠IgG-Cy3，Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，目录号111-165-144)。通过用PBS-BT 和1型无菌水浸没孔而清洗载玻片(分别为每次4×5分钟，和每次2×5 分钟)。为了对侵肺军团菌进行大面积检测，获得侵肺军团菌血清分 类群1(目录号92-103-FL)以及热固定的侵肺军团菌血清分类群1 (Philadelphia 1，目录号92-103-H)和6(Chicago 2，目录号92-110- H)的FITC-偶联抗体(mTECHTM Monoclonal Technologies，Alpharetta， GA)。在聚-赖氨酸涂覆的载玻片(Sigma，目录号P0425)上制备两 种通过热杀死的侵肺军团菌血清分类群(1和6)的细胞污迹。用封 闭溶液浸没载玻片，培养(15分钟，25℃)，然后吸出。用侵肺军团 菌血清分类群1的FITC-偶联初级抗体浸没载玻片(30分钟，25℃)， 然后吸出，并用PBS和1型水(分别为每次2×5分钟，和每次2×5分 钟)清洗。将所有载玻片风干，并利用不放大的大面积成像捕获像 (TRITC滤器装置，Chroma Id.No.41002b，对于Cy3偶联物及FITC 滤器而言，激发545/30nm，发射610/75nm，Chroma Id.No.SP101， 对于FITC偶联物而言，激发470/40nm，发射522/40nm)。安装载玻 片(Pro Long Antifade Reagent，Molecular Probes，Eugene，OR，目 录号P-4781)，使用荧光显微镜(Axioplan II荧光显微镜，Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY；Cy3.5滤器装置，Chroma Id.No.41002，对于 Cy3偶联物或FITC滤器装置而言，激发545/30nm，发射610/75nm， Chroma Id.No.SP101激发470/40nm，发射522/40nm)观察(400x)。
结果：本实施例证实了利用不放大的大面积成像，联合直接荧光抗体 染色技术，可检测涉及下呼吸道感染的生物。阳性对照和阴性对照的 大面积成像表明，这种检测是特异性的(图20)。利用大面积成像见 到的信号对于通过标记细菌细胞产生的是特异性的，这一点可由显微 镜分析证实。
变化：不放大的大面积成像可用于检测其它细菌，酵母和霉菌，以及 其它种类的疾病，包括泌尿道感染，败血症，和性传播疾病。
实施例17.利用不放大的大面积成像同时扫描含有3种不同微生物的 样品的多路直接荧光免疫测定法                                  
概述.在本实施例中，不放大的大面积成像被用于检测并鉴定3种类型 微生物的多路试验中。将细胞与3种类目特异性(在这种情况下，是 种类-特异性的)抗体的混合物一起培养，其中每个是用不同的荧光染 料标记的。使用CCD成像器检测各个细胞。
实验过程.大肠埃希氏菌和白色念珠菌分别是按照实施例2和实施例11 所述生长和固定的。酿脓链球菌在Brain Heart Infusion(Difco目录号 237500)中过夜生长，并按照实施例2所述固定和清洗。将所有这3 种类型的细胞单独在水中稀释，直到通过相差显微镜观察到20-50个 细胞/高倍视野(40X)。将这些稀释物的等分试样(3μl)放在聚-L-赖 氨酸涂覆的盖玻片上，扩散成大约5mm直径的面积，然后干燥。
按照制造商的说明(Molecular Probes，Eugene，OR)，抗大肠埃 希氏菌抗体(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65001R)，抗白色念珠菌 抗体(1mg；Biodesign，Saco，ME.B65411R)，和抗链球菌Grp A抗 体(1mg；Biodesign，Saco，ME.B10601R)分别用Alexa FlourTM 488 (目录号A10235)，Alexa FlourTM 350(目录号A10170)，和Alexa FlourTM 546(目录号A10237)，蛋白标记试剂盒标记。
标记抗体的混合物是以20μg/ml在标准兔血清(Cat#88-NR50； Fitzgerald，Concord，MA)中制备的。用抗体混合物涂覆点在盖玻片 上的细胞，并于室温时，在含有水饱和纸巾的湿润塑料吸量盒盖中培 养1小时，用Saran Wrap涂覆。然后将盖玻片在含有1％标准兔血清 的PBS中清洗1次，在PBS中清洗2次(每次10分钟)。清洗除去 盖玻片，并使用压缩空气吹干所有残留的液体。每个盖玻片的相关区 域是1秒内在CCD成像器中成像的(如详述部分的步骤6所述，和 图3所示)，该CCD成像器带有FITC(激发480nm/40nm和发射 535nm/50nm)(Alexa488特异性)，Texas Red(激发560nm/55nm和 发射645nm/75nm)(Alexa 546特异性)及DAPI(激发360nm/40nm 和发射460nm/50nm)(Alexa 350特异性的)通道。
结果.多路细菌测定法的结果在图21中给出。对于各种不同的细菌样 品而言，物体的数目和强度在预期的荧光通道中最高。因此，对于大 肠埃希氏菌样品而言，在FITC(Alexa 488)通道所见的物体数目和 强度最高。同样，白色念珠菌样品，和酿脓链球菌样品分别在DAPI 和Texas Red通道中具有最强的强度和最多的物体数。因此，利用不 放大的大面积成像的测定法可将具有抗体类目结合分子混合物的细胞 的3个类目区别开来。
实施例18.腺病毒的固相捕获测定法                             
目的：本实施例表示在固体支持物上捕获的少数病毒可用荧光粒子标 记，并通过不放大的大面积成像观察。96孔平板的孔首先用抗腺病毒 抗体涂覆。接着将腺病毒和用抗腺病毒抗体涂覆的粒子加入到孔中， 通过抗体涂覆的表面捕获病毒和粒子。除去未偶联的粒子，通过大面 积荧光像分析检测代表捕获病毒的捕获粒子。
材料和方法：通过加入50μl 0.2mg/ml的100mM碳酸氢钠pH10的溶 液，并室温培养而用生物素化的BSA(Sigma目录号A-8549)涂覆96 孔Greiner平板(Greiner Labortechnik目录号655097)的孔。用100μl PBS 清洗孔1次。然后室温用50μl 0.1mg/ml链霉抗生物素(Jackson Immunoresearch Laboratories目录号016-000-113)的PBS溶液涂覆生 物素化的BSA层2小时，接着用PBS清洗，然后室温用50μl 0.1mg/ml 生物素化-抗-腺病毒抗体(用Molecular Probes试剂盒目录号F-6347 生物素化的Chemicon目录号MAB8052抗体)的PBS溶液涂覆。在100μl PBS-TB中将孔清洗3次，4℃贮存。
通过室温在4％甲醛/PBS(终浓度)中重构30分钟而将2型腺病 毒(ATCC VR-846)及呼吸道合胞病毒(RSV)(ATCC VR-1302)固 定。加入甘油至16％的终浓度，-80℃冷冻等分试样。病毒粒子滴定 度是基于由制造商提供的滴定度评估的，并以TCID50表示，然后按照 制造商(ATCC)的建议，通过乘以0.7的因数，转化成pfu(噬斑形 成单位)。假定pfu约等于制品中的病毒粒子数。使用前，将等分试样 在冰上溶解。溶解后，将没有使用的部分在4℃贮存，用于进一步的 实验。
按照实施例8所述，用抗腺病毒抗体(Chemicon目录号MAB8052) 涂覆粒子，区别在于以1％固体使用0.2μm直径的荧光粒子(Molecular Probes目录号F-8848)。
为了完成测定，除去孔中的贮存缓冲液。将大约10,000个病毒粒 子和3×108个粒子加入到含有100μl终体积的Block Aid缓冲液 (Molecular Probes目录号10701)的孔中。室温在摇动平台上培养微 量滴定盘1小时。在PBS-TB中清洗该孔3次，然后在水中清洗1次。 除去水后，利用CCD成像器使孔成像(如详述部分的步骤6所述和 图3所示)，其中CCD成像器装配有FITC激发(470nm/40nm)和发 射滤器(522nm/40nm)装置。像是用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)处理并分析的。物体计数功能用于评估孔中的粒子数。 结果：本实施例表明，在固相上捕获的病毒粒子可用荧光粒子信号传 递部分标记，且如图22所示，可在不放大的情况下检测。使用Image-Pro Plus软件对像进行的分析(下面)表明，物体(粒子)数约为13,000， 基本与所加入的腺病毒粒子数(-10,000)匹配。然而，应注意的是， 并不能精确测定制品中的病毒数。而且不知道制品中存在多少感染组 织的培养物细胞或这种细胞的片段。RSV阴性对照(上面)中的物体 数约为800，并代表非-特异性的背景。
实施例19.血液中病毒的固相捕获                             
目标：该实施例表示血液样品中的少数病毒可在固体支持物上被捕 获，用荧光粒子标记，并通过不放大的大面积成像观察。将含有腺病 毒的血液加入到96孔平板中的抗-腺病毒抗体涂覆的孔中。捕获病毒 后，加入抗-腺病毒抗体涂覆的荧光粒子。除去未结合的粒子，并通过 CCD荧光成像检测代表捕获病毒的捕获粒子。
材料和方法：96孔平板(Greiner Labortechnik目录号655097)的孔 是用生物素化的抗腺病毒抗体涂覆的。重构2型腺病毒(ATCC VR- 846)和RSV(ATCC VR-1302)，并按照实施例18固定。按照实施例 8所述，用抗腺病毒抗体(Chemicon目录号MAB8052)涂覆粒子， 区别在于以1％固体使用0.2μm直径的荧光粒子(Molecular Probes目 录号F-8848)。为了进行测定，除去孔中的贮存缓冲液。向孔中加入 约10,000个病毒粒子，孔中50％是Block Aid缓冲液(Molecular Probes 目录号10701)，50％是小鼠血液，终体积为100μl。室温在摇动平台 上培养微量滴定盘1小时。在PBS-TB中清洗孔2此，加入3×108个 粒子的100μl Block Aid缓冲液。摇动培养1小时后，用PBS-TB清洗 孔3次，用水清洗1次，并用CCD成像器(如详述部分的步骤6所 述和图3所示)观察，该CCD成像器装配有FITC激发(470nm/40nm) 和发射滤器装置(522nm/40nm)。
结果：该实施例表示特定的病毒粒子(在这种情况下，是腺病毒)可 在有50％血液存在的固相上被捕获，用荧光粒子信号传递部分标记， 在不放大的情况下检测，如图23所示。使用Image-Pro Plus软件进行 的像分析(下面)表明物体(粒子)数为13,489，大概与所加入的腺 病毒粒子数(10,000)相匹配。RSV阴性对照(上面)中的物体数为 2,173，代表非-特异性背景。该测定法的结果与实施例18的结果相似， 表明血液的存在不会干扰在固相上捕获病毒粒子，用荧光粒子标记它 们，以及在不放大的情况下对它们进行检测。
实施例20.腺病毒的液相测定法                                  
目的：本实施例表示本发明可利用液相夹层-形成法扫描少数病毒。将 含有腺病毒的样品与涂覆了抗病毒抗体的荧光和磁性粒子组合培养。 在有腺病毒(但没有对照病毒)存在的条件下，诱导形成磁性和荧光 粒子的复合物。这些荧光复合物是通过磁性选择的，沉积在光学透明 的表面上，并进行不放大的大面积成像。
材料和方法：将腺病毒和RSV重构，并按照实施例18所述固定。抗 体涂覆的荧光和磁性粒子是按照实施例8所述，使用抗腺病毒抗体 (Chemicon目录号MAB8052)涂覆1μm直径的红色荧光粒子 (Molecular Probes目录号F-8851)，和2.8μm直径的磁性粒子 (Dynal；目录号142.03)制备的。在本实施例中，将5×105个红色 荧光粒子和5×106个磁性粒子在Block Aid缓冲液(Molecular Probes 目录号B-10710)中混合，终体积为250μl。以大约1000个病毒/样品 的滴定度加入腺病毒或RSV。室温混合4小时后，使用微量离心机试 管的Polysciences BioMag磁性分离器分离磁性粒子和所有结合粒子， 并在PBS-TB中清洗3次。将清洗过的磁性粒子转移到微量滴定孔 (Greiner Labortechnik目录号655097)中，在装配有Texas Red激发 (560nm/55nm)/发射(645nm/75nm)滤器装置的CCD成像器(如详 述部分的步骤6所述和图3所示)中观察。按照实施例18所述用 Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)捕获并分析像。
结果：本实施例表示特定的病毒粒子可由使用磁性和荧光粒子的液相 夹层-形成法捕获，并在不放大的情况下检测，如图24所示。在测定 中大约加入了1000个病毒粒子。在图下面，利用Image-Pro Plus物体 计数分析检测到2324个腺病毒粒子，而在阴性RSV对照(上面)中， 只检测到代表非-特异性背景结合的46个粒子。
实施例21.血液中的腺病毒均相测定法                            
实施例概述.有效且低成本的病毒加样试验—测定人样品中的病毒浓度 —代表了医疗诊断中的一种很大的需求。本实施例可证实本发明如何 快速计算样品中的病毒。本实施例测试腺病毒，一种重要的人类病原 体。在技术上，该实施例与实施例8相似。
用抗体涂覆粒子.按照实施例8所述，用抗体涂覆粒子，并以2％固体 浓度重悬浮。在本实施例中，抗腺病毒单克隆抗体(抗-六邻体；目录 号MAB8052；Chemicon)用于涂覆黄绿色荧光粒子(TransFluoSpheres； 目录号T-8871；Molecular Probes)和磁性纳米粒子(羧基聚合物-涂 覆的铁流；Immunicon；目录号F3000)。混合相等体积的荧光和磁性 粒子，使混合物中每种类型粒子的终浓度为1％固体。按照实施例8 所述，利用超声波处理分散粒子混合物。
检测并量化血液中的腺病毒.本实施例所述的试验可检测血液中的腺病 毒。向全血和粒子混合物中加入含有各种量(0，103，104，105pfu) 纯化腺病毒(CsCl梯度纯化；Frank Graham，McMaster University) 的样品(在PBS-B中，10μl)，并按照实施例8所述进行反应。实验 样品中的荧光粒子簇数减去阴性对照样品中的平均簇数表示样品中的 腺病毒粒子数。
实施例22.同时扫描细菌和病毒的多路大面积成像免疫测定法       
目标：本实施例证实本发明可用于构造同时扫描含有多种不同分析物 —这里指细菌和病毒的样品的试验。成对的抗体-涂覆微粒—一个荧光 微粒和一个顺磁微粒—可用于结合靶，如先前若干实施例(例如，实 施例8)所述。然而这里使用了两对这样的粒子-一组用抗大肠埃希氏 菌抗体涂覆，一组用抗腺病毒抗体涂覆。为了将两种类型粒子：分析物 的复合物彼此区别开来，每个分析物使用不同的荧光粒子。大肠埃希 氏菌-特异性粒子具有绿色荧光特征，而腺病毒-特异性粒子具有红色 荧光特征。将样品与分析物-特异性粒子混合后，利用磁性选择所得的 粒子：分析物的复合物到检测区，并进行不放大的大面积成像。通过对 两个CCD像进行分析可鉴定并量化病毒和细菌靶，这些像是用调谐 为红色或绿色粒子的滤光器装置获得的。
材料和方法：大肠埃希氏菌细胞是按照实施例8所述生长并固定的， 腺病毒是按照实施例18所述重构并固定的。抗体涂覆的荧光和磁性 粒子是按照实施例8所述制备的。抗腺病毒抗体(Chemicon目录号 MAB8052)用于涂覆红色荧光粒子(Molecular Probes目录号F-8851)， 抗大肠埃希氏菌抗体(KPL目录号01-95-90)与绿色荧光粒子 (Molecular Probes目录号8852)一起使用，而磁性粒子(Dynal目录 号142.03)是用各种抗体制备的。测定时，以下列量将粒子混合在250μl 终体积的Block Aid缓冲液(Molecular Probes目录号B-10710)中： 每种荧光粒子为2.5×107个，每种磁性粒子为5×106个。以大约1000 个病毒粒子/细胞的量加入腺病毒和/或大肠埃希氏菌。室温混合1小 时后，在磁场中分离磁性粒子和所有结合粒子，并在PBS-TB中清洗 3次。使用装配有FITC和Texas Red激发/发射滤器装置(见实施例18 和实施例20的滤器说明)的CCD成像器(如详述部分的步骤6所述 和图3所示)在Greiner微量滴定孔(Greiner Labortechnik目录号 655097)中观察清洗过的磁性粒子。
结果：本实施例可证实细菌和病毒可在同一样品中扫描，并利用不放 大的大面积成像检测。如图25所示，当把约1000个腺病毒加入到混 合物中时，所检测到的大部分粒子是抗腺病毒红色荧光粒子(Texas Red 滤器装置)(上排)。当加入约1000个大肠埃希氏菌时，抗大肠埃希 氏菌绿色荧光粒子是用FITC滤器装置(第二排)检测的，而当同时 加入腺病毒和大肠埃希氏菌时，粒子是在两个通道(第三排)中检测 的。当不加入病原体时，可检测到较少数量级的粒子，它们代表非-特 异性背景(下排)。
实施例23.利用不放大的大面积成像检测各个细菌的滤器流通测定法  
概述.在本实施例中，快速流通测定法与不放大的大面积成像联合检测 用高度荧光粒子标记的少数细菌。将细菌和珠子一起培养后，使所得 含有细菌：珠子复合物的溶液通过滤器，其已经被抗细菌抗体涂覆。然 后按照实施例1所述，利用不放大的大面积成像检测由滤器捕获的复 合物。
实验设计.将硝基纤维素薄膜(Pall Biodyne A；5μm孔；目录号 BNCF810S)切成1cm×1cm的正方形。将正方形浸泡在含抗大肠埃 希氏菌O157的溶液(在PBS中，200μg/ml)中。室温干燥后，封闭 薄膜(200ml；30分钟；室温，1％酪蛋白(Hammerston级；EM sciences； 目录号CX0525-1)和0.1％Tween 20(Sigma；目录号P1379))。然后 在吸水纸上将薄膜吸干。将薄膜转移到石蜡膜上，并用PBS(300μl) 使薄膜饱和。将大肠埃希氏菌O157(105个细胞)的溶液和用抗大肠 埃希氏菌O157抗体(Kirkegaurd and Perry Laboritories；目录号01- 95-90；抗体按照实施例8所述被动吸附)涂覆的红色荧光珠(106个 珠子/Molecular Probes；lμm；硫酸盐；580/605nm，目录号F-8851) 共同混合在试管中，培养15分钟，然后加入到其中一块硝基纤维素 正方形上。在另外一个正方形上，只加入抗体涂覆的荧光珠(该滤器 是“没有细菌”的阴性对照)。再培养15分钟后，将薄膜放在一片滤 纸(Whatman 50μm孔)上，吸收多余的液体。然后清洗薄膜(PBS-T； 50ml；20分钟)。通过用CCD成像器成像来检测荧光，该成像器装配 有红色荧光珠的FITC滤光器装置(激发560/55nm，发射645/75nm)。 4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics)用于捕获并处理 CCD成像器的像。经证实，在成像器上检测到的正信号是结合大肠埃 希氏菌的珠子，这是通过装有相同滤器装置的Axioplan II荧光显微镜 (Carl，Zeiss Inc.，Thornwood，NY)检查获知的。
结果.图26表示利用流通测定法检测细菌的结果，所述细菌使用特异 性结合的高度荧光珠修饰。使含细菌样品通过的实验滤器的CCD像 包括很多白点，而使没有细菌的样品通过的对照滤器包括很少的珠 子。高倍显微镜检查证实了实验滤器含有由珠子围绕的细菌组成的若 干复合物，而对照滤器不含复合物，只含分散的各个珠子。
实施例24.利用荧光酯酶底物染色的细胞的大面积成像量化细菌    
目的：在很多应用中，它具有较大的动态范围，用于量化活的细菌细 胞。理想的系统能够准确计算从0或1个细菌细胞到几百万或几亿个 细菌细胞，从而取消连续稀释和固有的缺少准确性，而这又是传统微 生物平板接种法所需的。在该实施例中，我们说明如何用荧光底物将 活细胞染色，与基于CCD的不放大的大面积成像联合用于量化至少5 个数量级的细胞。
实验方法：大肠埃希氏菌ATCC 8739细胞是按照实施例Y(Cell Direct 实施例)所述生长并处理的。在PBS中制备细胞的连续10-倍稀释物， 样品一式两份通过黑色聚酯薄膜(Chemunex目录号200-C2010-02) 过滤，该薄膜固定在Millipore 1225多功能过滤装置中的吸收垫 (Chemunex目录号200-C3012-02)上，按照实施例Y(Cell Direct实 施例)所述染色。此外，一式三份将10μl 10-5稀释物平板接种在TSA (BD目录号236950)上，37℃过夜生长，达到细胞滴定度。聚酯薄 膜上的荧光信号是用装配有FITC滤光器装置(Chroma/激发 470/40nm，发射522/40nm)的CCD成像器捕获的(如上面步骤6所 述；图3所示)。4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics) 用于捕获并处理CCD成像器的像。将从每个滤器产生的信号定义为 所有物体像素强度的总和(在本具体实施例中定义的物体具有350- 65301的像素强度)。这种限定信号的方法可消除不含任何染色细胞的 滤器区背景，但不能掩饰或不完全计算重叠物体的强度。(因为细胞 很小而且十分透明，信号是累积的，只要细胞层较薄。)
结果：如图28所示，这种方法产生的信号在至少5个数量级上是线 性的，本试验具有较大的动态范围。
变化：物体数较低时，准确的量化可通过计算各个物体数而获得，而 不是利用它们像素强度的总和，这是因为物体不太可能重叠。这可发 展到准确计算少至0或1个细胞，特别是如果使用多种染料和多个激 发和/或发射波长确定哪个物体代表活细胞。此外，更复杂的物体查找 算法可用于考虑局部背景强度和照射的改变。
实施例25.利用不放大的大面积成像检测滤器上的各个染色细菌    
概述.在该实施例中，大面积成像用于检测各个大肠埃希氏菌细胞的 靶，它是用结合核酸的荧光染料染色的。染色细胞通过黑色聚碳酸酯 滤器过滤，用白光照射，并用CCD照相机成像。
实验设计.大肠埃希氏菌MG1655的培养物是按照实施例2所述用Syber Green I染色的。将培养物稀释，并用真空泵和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)使大约105个细胞通过 黑色聚碳酸酯滤器过滤。然后用水清洗滤器(50ml；1型质量)。荧 光是用大面积CCD成像器(图3)和适于检测Syber Green I的FITC 滤光器装置(激发470/40nm，发射522/40nm)检测的。4.1版本的 Image-Pro Plus软件(Media cybernetics)用于捕获并处理CCD成像器 的像。经证实，在成像器上检测到的正信号是细胞，这是通过用装有 相同滤器装置的Axioplan II荧光显微镜(Carl，Zeiss Inc.，Thornwood， NY)获知的。
结果.图27表示在滤器上捕获并检测细菌。滤器表面上的Syber Green I 染色的细胞显示为白点。当在高倍放大率下观察时，所见的斑点是染 色的细胞。
实施例26.在不放大的情况下，少数细菌细胞的非仪器检测          
概述.在本实施例中，用碱性磷酸酶和抗大肠埃希氏菌抗体涂覆的粒子 用于在液体捕获测定法中检测大肠埃希氏菌O157。细菌在液体中与 双层涂覆的粒子和抗体-涂覆的磁性粒子结合，利用磁力分离并清洗粒 子：分析物复合物，从而将粒子复合物与未结合的粒子分开。复合物过 滤沉积在0.2μm孔的硝基纤维素薄膜上，然后利用化学发光和比色底 物观察。
实验过程.双层涂覆的粒子是通过向链霉抗生物素涂覆的粒子(108个 粒子；Bangs；0.95μm，非-荧光；目录号CP01N)中加入生物素化的 碱性磷酸酶(5μl 2.9mg/ml的原液；Pierce；目录号29339)和生物素 化的驴抗-山羊IgG抗体(5μl 1.6mg/ml原液；Jackson；目录号705- 065-147)而制备的。用PBS将反应水平增加至100μl。培养30分钟 后，清洗粒子2次。每次清洗是以3000g在微量离心机中旋转粒子5 分钟，然后弃去上清液，并将粒子重悬浮在PBS(100μl)中。清洗后， 向粒子中加入山羊抗-大肠埃希氏菌O157抗体(5μl 1mg/ml原液； Kirkegaurd and Perry Laboratories；目录号01-95-90)。室温培养粒子30 分钟，然后按照上面所述清洗2次。制备双层涂覆粒子后，将大肠埃 希氏菌O157培养物固定在2.5％甲醛(见实施例1，用DNA-结合荧 光染料染色的各个细菌的大面积成像)中，并以10倍增量连续稀释 获得107-103个细胞/ml。在独立的1.5ml试管中，使10μl各稀释物与 山羊抗-大肠埃希氏菌O157抗体涂覆的磁性粒子(106个粒子；Dynal； 2.8μm；甲苯磺酰化；目录号M-280；按照实施例8制备)和双层涂 覆粒子(106个粒子)结合(一式两份)。用PBS-TB将粒子：细菌混悬 液加至100μl，室温混合培养1小时。培养后，在PBS-TB中清洗试 管4次。每次清洗是利用磁性分离将磁性粒子：细菌：粒子夹层结构牵 引至试管的一侧，然后吸去上清液，在PBS-TB(100μl)中重悬浮。 单独过滤清洗粒子：细菌夹层的各稀释物复制品。将各复制品加入到 PBS(50ml)中，使用真空泵和塑料漏斗杯(Millipore Microfil V User Guide，PF07114，Rev A 3/00)通过0.2μm孔的硝基纤维素薄膜过滤。 将BM Purple AP底物(500μl；Roche；目录号1442074)加入到其中 一组滤器装置中。其它滤器中加入CDP-Star(500μl；NEN；目录号 NEL-601)。培养1小时后，在水中清洗BM紫薄膜，除去剩下的BM Purple，将薄膜风干。按照制造商的说明，将CDP-Star薄膜安装在 SpotLight照相机(Boston Probes；目录号DT10000)上，并与ASA 2000 胶片(Boston Probes；目录号DT20000)接触2秒。然后接触相同的 滤器，进行不放大的大面积成像。4.1版本的Image-Pro Plus软件(Media cybernetics)用于捕获并处理CCD成像器的像。
结果.图29表示双-功能粒子，它与类目特异性结合分子及酶信号传递 部分偶联，可利用产色或化学发光信号传递部分检测。这里使用双标 记粒子的测定法较为灵敏，可检测少数细菌(大约100个细胞)。大 肠埃希氏菌：珠子复合物通常只能在高倍显微镜下观察，使用肉眼观察 的能力是由于含有大量酶分子的这些粒子的巨大信号能量。事实上， 当按照本实施例所述制备、在滤器上沉积，并用产色底物处理时，各 个分散的显微珠可用肉眼检测。本实施例所用的方法证实了与目前的 快速试验相比，本发明可提供简单，便宜，而且是非仪器的关注点试 验。
实施例27.快速、均相、灵敏、且定量地对临床样品中的结核分枝杆 菌进行免疫测定                                                 
概述.诊断测试结核分枝杆菌的医疗重要性在实施例9的概述中讨论。 在本实施例中，本发明使用类目特异性抗-结核分枝杆菌抗体构造均相 免疫测定法(见实施例8和图11)。这种类型的试验快速、灵敏、便 宜、且易于使用。这里所述的测定法可补充实施例9中证实的抗酸杆 菌法，将结核分枝杆菌与其它微生物种类区别开来。
结核分枝杆菌-特异性抗体.本实施例中的类目结合分子是与结核分枝 杆菌特异性结合的抗体。本实施例利用对结核分枝杆菌复合物中的种 类特异的单克隆抗体(MPB64-1CA)(Abe等，J.Clin.Microbiol.37： 3693-2881，1999)。可选择性地，可使用单克隆抗体。例如，本发明 可使用与结核分枝杆菌反应的兔多克隆抗体(BioDesign目录号B65601 R)。
类目特异性多克隆抗体优选使用本领域那些技术人员已知的方 法，通过免疫亲和色谱法纯化。在本实施例中，结核分枝杆菌-特异性 抗体是用含有固定在活化粒子上的靶病原体的柱子纯化的(例如， Affigel 10；BioRad)(Harlo等，Using Antibodies：A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY， 1999))。以这种方式对预定抗体进行积极选择后，检查抗体与其它下 呼吸道病原体及呼吸道共生菌丛交叉反应的抗体(例如，见第3章， 表1，Murray等编辑(1999)，Manual of Clinical Microbiology，7th ed. Washington，D.C.：American Society for Microbiology)，包括不会引 起肺结核的分枝杆菌种类(例如，鸟分枝杆菌病原体被固定(Amann 等，Appl Environ Microbiol 56：1919-25，1990)，点在聚-赖氨酸涂覆 的载玻片(Sigma；目录号P-0425)上，用抗-结核分枝杆菌抗体(在 PBS-B中1∶500稀释；20分钟；RT)处理，并用PBS-TB(50ml)清 洗4次，然后用荧光素标记的山羊-抗-兔IgG处理。与抗体交叉反应 的生物用于除去特异性反应抗体中的交叉反应抗体。交叉反应抗体与 粒子粘着，并按照上面结核分枝杆菌-特异性抗体的积极选择所述，用 于通过免疫亲和色谱吸收交叉反应抗体。然而，为了除去交叉反应抗 体，收集未结合的抗体，弃去结合抗体。所得抗体对结核分枝杆菌特 异。
可选择性地，非-生产用抗体(多克隆或单克隆)或重组抗体可使 用本领域那些技术人员已知的、在各种著作和参考文献中描述的标准 方法生产(例如，Coligan，J.等编辑，(1994)Current Protocols in Immunology.New York：John Wiley & Sons；Knott，C等(1997) Development of Antibodies for Diagnostic Assays.In Principles and Practice of Immunoassay，C.Price和D.Newman编辑：Stockton Press； George，A.(1997)Antibody Engineering：Potential Applications for Immunoassays.In Principles and Practice of Immunoassay，C.Price和 D.Newman编辑：Stockton Press)。
用类目特异性抗体涂覆磁性和荧光微粒.类目特异性抗体用于按照实施 例8所述涂覆磁性粒子和荧光染色的聚苯乙烯粒子。
使结核分枝杆菌-特异性粒子与下呼吸道样品结合.在下一步中，使荧 光和磁性结核分枝杆菌粒子与下呼吸道样品中的结核分枝杆菌结合。 将液化的下呼吸道样品(200μl)与结核分枝杆菌-特异性粒子混合物 (每种类型1×106个粒子)在具有光学透明底部的96孔微量滴定皿的 孔中(Greiner Labs目录号665097)混合。BAL下呼吸道样品在不进 行处理的情况下使用。痰液样品是用NALC-NaOH法(Isenberg编辑， (1992)Clinical microbiology procedures handbook.Washington，D. C：American Society of Microbiology).Section 3.4)制备的。
检测并量化样品中的结核分枝杆菌.按照实施例8所述将样品处理，成 像并分析。
对照.阳性和阴性对照实验优选与临床样品同时进行。阳性对照样品， 它是按照与临床样品相同处理的，优选在PBS中含有已知量(大约1000 个细胞)的结核分枝杆菌。对阳性对照中正确细胞量的检测表明了生 物化学和像分析过程在正常工作。阴性对照样品含有PBS，但没有细 胞。如果所有过程都正常工作，那么在阴性对照实验中不应见到正信 号。
变化.靶染色可替代荧光粒子或在使用荧光粒子之外(见实施例8的变 化，结核分枝杆菌的特异性染色过程，如还可利用金胺O或金胺-若 丹明染色(见实施例9))用于检测。
实施例28.利用荧光染色对临床样品中的结核分枝杆菌进行快速均相 的抗微生物敏感试验                                            
概述.结核分枝杆菌的快速鉴定(见实施例9)和快速敏感性试验有很 高的医疗重要性。本实施例既可利用简单而灵敏的抗酸涂抹技术使结 核分枝杆菌直接在临床样品中生长(实施例9，图13)，又可减少目 前为肺结核患者提供敏感性数据所需的几周时间。
对于结核分枝杆菌而言，敏感性试验的周转时间为几周到几个月， 在这段时间内，用次优抗微生物疗法治疗的患者可在很多其它人群中 传播这种疾病。现有的敏感性试验从培养样品开始。因此，鉴于绝大 多数生物的敏感性试验通常在样品收集后的24-48小时开始，对于结 核分枝杆菌而言，试验的开始常常延迟几周。现有的快速试验通常在 进行抗生素敏感性试验之前，需要在没有药物的条件下生长7-12天。 因此迫切需要更快速的结核分枝杆菌敏感性试验，这是因为多种药物 抗性的结核分枝杆菌在全世界的流行性发展。
这里描述的抗微生物敏感性测定法可提供临床上有价值的特征， 包括：最少的生长需要(多代)，简单，成本低，若干抗微生物疗法 的平行分析，直接测试细菌滴定度较低的生物复合物临床样品的能 力。该试验的独特特征是本发明在不使用显微镜的情况下，鉴定并计 算样品中少数微生物的能力。本发明通过省略其它形式必须的、在没 有药物的条件下进行培养的步骤，并将用抗生素培养的时间缩短至4 天而将典型敏感性试验的周转时间缩短几周。本发明试验的周转时间 比最快速的新兴快速试验(例如，Norden等，J.Clin.Micro.33： 1231-1237，1995)少了一半。与其它快速敏感性试验方法(例如， BACTEC-460，和流式细胞术)相比，本发明需要更少的昂贵仪器。
本实施例所用的方法还可用于监测正在进行抗微生物疗法的患者- 其它重要的、未满足的临床需要。监测接受抗生素患者的活细胞数对 于测定治疗功效较为重要。目前以核酸扩增为基础的结核分枝杆菌快 速试验不能用于患者的监测。这是因为含有可扩增核酸的非活性结核 分枝杆菌长时间存在于患者体内，即使在治疗有效的条件下也是如 此。活生物数可通过在若干代生长(在这种情况下，没有抗生素存在) 的培养前后，评估样品中的细胞数而测定。
鉴定结核分枝杆菌.制备痰液样品，并用金胺-若丹明抗酸法(Isenberg 编辑，1992，supra)染色，按照实施例9所述测试结核分枝杆菌。如 果存在结核分枝杆菌，痰液的等分试样用于分析病原体的抗微生物敏 感性。
使用各种抗生素时，结核分枝杆菌在临床样品中的直接生长.抗生素敏 感性试验是利用肉汤微量稀释法在含有结核分枝杆菌的样品上进行 的。向含有浓缩7H9肉汤(100μl；标准浓度的3倍；DIFCO#211417) 的试管(2ml聚丙烯螺旋帽试管；Sarstedt)中加入液化痰液的等分试 样(100μl；按照实施例27制备)，并用先前所述(Moore等，J.Clin Microbiol 37：479-83，1999)各种浓度的乙胺丁醇，异烟肼，和利福平 (每个试管中加100μl抗生素；Sigma)接种。除抗生素外，还用PBS (100μl)接种两个试管。使这些试管中的一个与测量细菌在没有药物 条件下生长的敏感性试验样品(阳性对照)同时培养。其它试管在4 ℃培养，防止生长(阴性对照)。所有试管培养4天，然后按照先前 所述(Moore等，1999，supra)，通过用1％低聚甲醛处理而杀死它们。 利用荧光抗酸杆菌试验测定抗微生物敏感性。利用实施例9所述的荧光 抗酸杆菌计算在有或没有抗生素存在时生长的样品。将样品的等分试 样(100μl)涂抹在载玻片上，进行不放大的大面积成像，并按照前面 所述分析(实施例9)。对于所测试的抗生素而言，利用样品计数数据 绘制2条曲线。一条曲线是以像的总积分强度为基础的，另一条是以 利用成像软件找到的物体总数为基础的。各种抗生素的最小抑制浓度 (MIC)是通过检测这些曲线而测定的(见实施例10)。
使用均相免疫测定形式的变化.本发明的其它实施方案也可使用，如实 施例27(还可见图11)所用的均相免疫测定形式。当使用液相形式 时，将在各种抗生素浓度生长的样品等分试样(100μl)加入到结核分 枝杆菌-特异性荧光和磁性粒子的混合物中，并按照实施例27所述处 理。
实施例29.快速、均相、定量检测血液中的人免疫缺损病毒      
概述.检测和测量血液中的HIV水平在HIV感染的所有阶段都非常重 要。HIV感染的早期诊断取决于检测血浆中低水平病毒的能力。量化 血浆中的病毒水平是监测AIDS患者健康的重要策略，且对于随后抗 病毒治疗的有效性较为重要。HIV检测法所需的灵敏度少于100个病 毒/ml。目前超灵敏的方法是以核酸检测为基础的(例如，PCR，TMA， 和bDNA)。然而，这些方法较为昂贵，而且相对于免疫测定法而言较 慢。然而，目前的免疫测定法不足以灵敏测量血浆中的低水平病毒。
本实施例证实了本发明以简单、快速、且经济的均相免疫测定形 式提供核酸扩增试验的超灵敏度的能力。本发明的重要特征，即检测 并鉴定非-显微样品中的各个靶，对于同时获得灵敏度和简单性而言很 重要。
用抗体涂覆粒子.为了制备HIV-特异性粒子，按照实施例8所述，用 抗体涂覆黄绿色荧光粒子(FluoSpheres；目录号T-8803；Molecular Probes)和磁性粒子(羧基聚合物涂覆的铁流；Immunicon；目录号 F3000)，区别在于使用的是抗-HIV gp 160/120(Chemicon；目录号 MAB8836)。
对照粒子.本实施例可同时掺入阳性和阴性内部对照。如果所有过程和 试剂都正确发挥作用，那么阳性对照粒子显而易见，但检测到的阴性 对照粒子数较少。阳性对照粒子由橙色荧光粒子(TransFluoSpheres； 100nm目录号T-8872)和磁性纳米粒子(铁流)组成。阳性对照粒子 用抗-噬菌体Fd抗体(Accurate；目录号BYA-3163-1)涂覆。将已知 数目(～1000)的噬菌体Fd病毒加入到各实验样品中。如果所述过 程能够正确发挥作用，那么所有Fd病毒同时与Fd-特异性橙色荧光纳 米粒子和Fd-特异性磁性纳米粒子结合。
阴性对照粒子是用抗-洋地黄毒苷抗体(Roche；目录号1 333 062) 涂覆的深红色荧光粒子(TransFluoSpheres；100nm目录号T-8876)。 测定中检测到的深红色荧光粒子表示背景水平(即，所检测到的粒子 数与磁性标记的靶无关)。
制备粒子整体.将HIV-特异性粒子和对照粒子混合，使得总粒子浓度 为2％固体。粒子是按照实施例8所述通过超声波处理分散的。
制备血浆.使用EDTA作为抗凝剂将血液收集在无菌试管中(例如， Bection-Dickinson；目录号6454)。室温时以900RPM在螺旋帽微量 离心机试管(例如，Sarstedt；目录号782.694.006)中离心10分钟而 把血浆从全血(1.5ml)中分离出来。将血浆在-20℃冷冻贮存几周或 如果不冷冻，在1天内使用。向每份血浆样品(200μl)中加入约1000Fd 噬菌体(10μl PBS中的100pfu/μl原液；ATCC目录号15669-B2)。 免疫测定和HIV检测。将粒子混合物(100μl)和样品在微量滴定皿的 孔中混合，培养，进行磁性选择，并按照实施例22所述成像，只是3 个像是用适于3种类型粒子的滤器装置收集的，包括一个各个激发滤 器(Chroma HQ480/40x)和3个不同的发射滤器，即黄绿色粒子的 Chroma HQ522/40m，橙色粒子的Chroma HQ567/15m，和深红色粒子 的Chroma HQ667/30m。黄绿色粒子(HIV-特异性)数减去深红色粒 子(阴性对照)数表示样品中的病毒数。深红色粒子数与所加入Fd 噬菌体粒子数的比值表示试验效率。
实施例30.通过免疫分型分析人的细胞：量化AIDS患者中的CD4+细 胞           
人类疾病，包括癌症和免疫缺损的诊断，取决于人类细胞的鉴定， 这是以它们不同的分子组分为基础的。免疫分型，一种鉴定特异性细 胞类型的重要工具，使用抗体将靶细胞标记并染色。免疫分型的普通 技术形式包括流式细胞术和高倍显微镜检查(免疫组织化学)。然而， 流式细胞术需要昂贵的仪器，而高倍显微镜检查不灵敏。相反，利用 本发明的免疫分型测定法既灵敏又相对便宜。利用本发明的本实施例 的试验对于确定免疫状况，以及AIDS患者健康很重要。该测定法可 测定血液中CD4+T细胞的浓度。本实施例在技术上与实施例8相似， 只是本实施例中的靶细胞是人的细胞，样品是血液。
制备磁性和荧光粒子.CD4+-特异性荧光和磁性粒子是按照实施例8所 述制备的，只是这里使用的是CD4-特异性抗体(Biodesign；目录号 P54400M)。按照实施例8混合涂覆粒子，并加入到含有PBS-TB (175μl)、具有光学透明底部的96孔微量滴定皿(例如，Greiner； 目录号655896)的6个孔中。
量化全血中的CD4+细胞.将AIDS患者的全血(5μl)加入到6个微量 滴定皿孔的2个中的粒子混合物中(构成一式两份的实验样品孔)。 将健康供体(具有已知的CD4+细胞浓度)的全血(5μl)加入到两个 孔中(构成一式两份的阳性对照孔)。将人血清(缺失细胞；Biochemed； 目录号758AB)加入到第3对含粒子混合物的孔中(构成一式两份的 阴性对照孔)。室温培养细胞和粒子20分钟。按照实施例8所述，利 用磁铁将与CD4+-特异性磁性粒子缔合的CD4+细胞牵引至孔的底 面。在维持磁场的同时，通过清洗(3次；每次200μl PBS-TB)除去 未结合的物质。按照实施例8使CD4+细胞成像并量化。试验效率是 通过将阳性对照中的CD4+细胞数与已知浓度进行比较而测定的。测 定的背景水平是根据阴性对照孔测定的。
实施例31.砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌的快速均相免疫测定法    
概述.本实施例中研究的诊断测定法测试了两种性传播病原体，砂眼衣 原体和淋病奈瑟氏球菌，它们通常会引起尿道炎。感染会导致严重的 后遗症，包括骨盆炎性疾病，不孕症，和HIV感染敏感性的增加。1995 年，据估计，有大约1.5亿人新感染了这两种病原体中的一种(1998 年，在美国，几乎有1百万人感染)。每年要花费大约十亿美元检测 砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌。目前的检测使用从革兰氏染色(对于 淋病奈瑟氏球菌)到DNA扩增的方法。不幸地是，这些检测或者便 宜但不灵敏(例如，革兰氏染色，直接荧光测定)或者灵敏而昂贵(例 如核酸扩增试验)。
本实施例利用本发明构造一种可便宜并灵敏地检测，鉴定，并计 算尿液样品中砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌的试验。
制备病原体-特异性和对照粒子.病原体-特异性粒子是利用实施例8所 述的过程制备的。用抗-衣原体抗体(BioDesign；目录号C65641M) 涂覆绿色荧光粒子(FluoSpheres；目录号T-8803；Molecular Probes) 和磁性粒子。用抗-淋病奈瑟氏球菌抗体(BioDesign；目录号C65618M) 涂覆红色荧光粒子(Molecular Probes TransFluoSpheres，目录号T- 8861)和磁性粒子。阳性和阴性对照粒子是按照实施例29制备的。
检测并量化尿液中的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体.使用市售试剂盒 (B-D Urine Collection Kit(Becton-Dickinson，BD VacutainerTM Brand 尿液收集杯))收集尿液样品(10ml)。以4000xg将尿液旋转10分 钟，弃去上清液。将颗粒状物重悬浮在400μl PBS-B中。按照实施例 20所述将样品与粒子混合，培养，进行磁性选择，成像并分析。然而， 在本实施例中，取得了4个样品的像，3个使用实施例29所述的滤器 装置，1个是适于使红色荧光粒子(Chroma HQ617/40m)成像的滤器。 黄绿色荧光粒子数表示样品中的砂眼衣原体数。红色荧光粒子数表示 样品中的淋病奈瑟氏球菌数。
变化.本实施例的试验可扩展至包括扫描可引起尿道炎的其它病原体 (例如，阴道毛滴虫，解脲尿支原体和生殖道支原体)。利用其它不 同的信号传递部分(即，具有可区别荧光特征的粒子)或组合标记策 略可检测并鉴定其它靶。定量检测多形核白细胞的存在可帮助诊断尿 道炎，并可掺入到通过使用对这些细胞特异的抗体涂覆粒子的试验 中。
实施例32.检测下呼吸道病原体的快速，多路，均相的细胞计量术   肺炎.肺炎在美国是由于感染性疾病死亡的最普遍原因。疾病的病因学 取决于年龄和免疫状况。病毒引起绝大多数儿童肺炎，而细菌病原体 是引起成人肺炎的最普遍病原体。在无免疫应答宿主中引起肺炎的病 原体根据影响免疫系统或保护表面(粘膜或皮肤)的癌症患者，移植 受体，和HIV-感染患者的不同而变化。
为了成功治疗肺炎，主要是快速鉴定病原体。然而，目前的诊断 不能有效鉴定病原体。为确定肺炎原因所作的诊断超过一半都不能鉴 定病原剂。(这还不包括其中没打算鉴定病原体的一大部分情况)。常 规的微生物培养方法不能鉴定引起下呼吸道感染的很多细菌病原体和 所有病毒和真菌病原体。例如，需要特定的方法来鉴定引起肺结核， 百日咳，legionnaire’s疾病，和由支原体引起的肺炎的病原体。下呼 吸道的诊断较为复杂，这是因为难以获得未被正常上呼吸道菌丛污染 的下呼吸道样品。此外，对上呼吸道无害的正常菌丛当被患者吸入时， 也可引起肺炎。辨别由诊断鉴定的菌株是上呼吸道污染物还是病原剂 需要认真进行样品质量对照的测量和微生物的量化。
肺炎通常分为两类：公共获得性肺炎和医院获得性肺炎。在美国， 公共获得性肺炎引起大约20,000人死亡，而且每年要担负$8百万的 治疗费用。医院获得性肺炎是最严重和第二普遍的医院获得性感染类 型。而在医院的加强护理单位中，超过10％的患者患上肺炎。死亡率 很高：大约1/3医院肺炎患者死于这种疾病。快速且准确的诊断至关 重要，这是因为最佳的挽救生命的抗生素疗法取决于究竟是哪种潜在 的病原体引起疾病。潜在病原体的较宽范围，它们中的一些在表2中 列出，对下呼吸道诊断提出了挑战。
在美国，下呼吸道感染患者大约有75％口服抗生素。每年大约要 花费近$1百万在无效的抗生素上，这是由于目前的诊断不能鉴定绝大 多数下呼吸道感染中的病原体。对于病毒感染不正确地使用抗生素在 很大部分上要对抗生素的过量使用和目前抗生素-抗性病原体的广泛流 行负责。因此，非常需要一种各个诊断测定法，它可检测下呼吸道病 原体的复杂组合。
试验的优点.在本实施例中，本发明用于使均相免疫测定法成为超灵 敏，定量，且高度多路的。通过同时检测共有的细菌，病毒，和真菌 病原体，这里所述的方法可大大改善目前的实践。无需培养，扩增， 或酶步骤的灵敏的免疫测定法是用户容易掌握使用的，成本低，快速， 且能够商业化(见实施例8，均相免疫测定法的优点)。该试验可在诊 断有效性方面提供较大改善，产生适宜且及时的抗微生物疗法，最终 挽救很多人的生命。
实施例的技术概述.图32表示本实施例所用的方案。将具有下呼吸道 感染症状患者的下呼吸道样品(例如，BAL或液化痰液)与粒子整体 混合，其中每个粒子用结合特定靶病原体的抗体涂覆。每个病原体-特 异性粒子是通过放射性标记单独编码的。在这个更高度多路的试验中 使用与实施例31所用类似的方法。
表2.共有的下呼吸道病原体     肺炎链球菌   流感嗜血杆菌   肺炎支原体     粘膜炎莫拉氏菌   砂眼衣原体   不动杆菌     军团菌   金黄色葡萄球菌   大肠埃希氏菌     克雷伯氏杆菌   粘质沙雷氏菌   绿脓假单胞菌     变形杆菌   肠杆菌   呼吸道合胞病毒     腺病毒   甲型流感病毒   乙型流感病毒     副流感病毒   巨细胞病毒   白色念珠菌     曲霉   新型隐球菌   卡氏肺囊虫
病原体-特异性抗体.本实施例中的类目结合分子是特异性结合表2所 列下呼吸道病原体的抗体。在可能的情况下，从商业来源(例如， BioDesign，Biotrend Gmbh，Cologne，Germany，Fitzgerald Industries International，Inc.，Concord，MA，和Accurate Chemical and Scientific Corporation，Westbury，NY))获得每个病原体的抗体。可选择性地， 获得抗体，亲和纯化，并按实施例27所述检测。
测试抗体的结合特异性和标记靶病原体的能力。为了获得最佳标 记，优选将对特定病原体特异的若干抗体彼此进行比较。将靶病原体 (在10μl PBS-T中有大约105个病原体细胞或病毒感染细胞)与类目 特异性抗体(大约10μg，10μl PBS-T)和过量(例如，20μg)荧光 标记的(例如，荧光素)次级抗体(例如，山羊抗-小鼠或山羊抗-兔， 这取决于类目特异性初级抗体的来源)混合，室温培养20分钟。在 PBS-T(1ml)中清洗2次，除去未结合的抗体。清洗是通过在微量离 心机(12,000xg；1分钟)中将稀释生物旋转而进行的。然后使荧光 标记的靶生物在荧光显微镜(Zeiss Axioplan 2)中成像，并用成像软 件(Im-age-Pro Plus，Media Cybemetics，Silver Spring，MD)记录。
使用类似的测定法，测试可提供靶病原体最佳标记的抗体的特异 性，这是通过使抗体与一组呼吸道病原体和在下呼吸道中找到的共生 菌丛结合而实现的。同样，为了确保抗体不与呼吸道的内源性组分反 应，还测试了每种抗体与来源于正常患者和下呼吸道疾病患者(已知 并不是由靶病原体所引起)的上下呼吸道样品的结合。
使用这些试验，选择有效结合靶病原体，而不结合在呼吸道样品 中找到的任何其它微生物或组份的抗体。
构造类目结合分子-涂覆的粒子整体.将表2所列各下呼吸道病原体的 类目特异性抗体用于按照实施例8所述涂覆两种粒子：聚苯乙烯-涂覆 的磁性粒子和荧光染色的聚苯乙烯粒子。然而在本实施例中，每个家 族的病原体-特异性抗体与单独放射性标记的荧光粒子偶联。因此，对 于每个病原体类目而言，要制备包含磁性粒子和荧光粒子的一对类目 特异性粒子。本实施例所用的荧光粒子是定制的、放射性标记的硫酸 盐-衍生的珠子(Bangs Laboratories；5种不同浓度荧光素(505/515) 和Texas Red(595/615)的组合)。珠子被标记。将粒子整体结合，终 粒子浓度达到2％固体(在PBS-TB中)。按照实施例29所述制备阳 性和阴性对照粒子，并包括在粒子整体中，区别在于本实施例中的对 照粒子是用放射性标记的粒子构造的，具有与病原体-特异性粒子不同 的颜色编码。
样品中病原体的检测，鉴定和量化.将液化的下呼吸道样品(200μl BAL 样品，其中按照实施例29所述加入了1000个对照噬菌体)与粒子整 体(100μl)在微量滴定皿中混合。按照实施例8培养样品，并进行磁 性选择。使用适于进行放射性标记的两种染料的两个滤器装置收集两 个像(荧光素：激发Chroma HQ480/40x和发射Chroma HQ535/50m； Texas Red：激发Chroma HQ560/55x和发射Chroma HQ645/75m)。使 用Image-Pro Plus软件排列像。记录通过软件找到的每个物体的荧光 标志(即，放射性标记所用两种染料的比例)，并与查表(凭经验， 使用不同种类的放射性标记荧光粒子创造的)进行比较，该查表可将 荧光标志和病原体-特异性联系起来。使用Image-Pro Plus软件包的定 制软件模块将物体的数目和分类制表。试验效率是通过计算与阳性和 阴性对照粒子相对应的物体数而监测的。试验背景是通过分析平行运 行的试验评估的，其中用BAL样品替换PBS(200μl)。
Chroma HQ560/55和发射(Chroma HQ645/75m)Chroma激发 560/55，发射645/75
实施例33.利用不放大的大面积成像平行扫描若干下呼吸道病原体的 免疫测定法概述.本实施例的医疗目的和重要性与实施例32的那些相 同。这里，正如该实施例中，类目特异性抗体用于同时扫描含有若干 引起肺炎的不同病原体(包括病毒，细菌和真菌)的下呼吸道样品。 然而，在本实施例中，将样品固定在载玻片上。下呼吸道病原体的同 一性是通过进行平行免疫组织化学分析，然后通过不放大的大面积成 像使各个靶成像而测定。图33表示本实施例所用的方案。
下呼吸道样品的间接荧光测定法.将下呼吸道样品涂抹在载玻片上，并 按照先前所述固定(例如，Isenberg，编辑，1992，supra；部分9.5)。 为了使不同抗体与载玻片的不同部分结合，将粘着孔(例如，粘着硅 氧烷flexiPerm细胞培养室，常制成具有30个孔；IVSS；Sartorius) 固定于载玻片上。本实施例所用的类目特异性抗体在实施例32描述。 向不同的孔中加入各种类型的类目特异性抗体(200μl；在PBS中为 10μg/ml)。作为阴性对照，将从兔免疫前血清纯化的IgG(200μl；在 PBS中为10μg/ml；Rabbit IgG Reagent Grade，Sigma，Cat.No.，I5006) 和从小鼠免疫前血清纯化的IgG(Mouse IgG Reagent Grade Sigma，Cat. No.，5381)加入到单独的孔中。室温培养载玻片30分钟。用PBS清 洗孔(200μl；4次)。然后除去粘着孔，这样就可将整个载玻片作为 一个各个单位有效处理。将载玻片浸入PBS中后(在玻片染色缸中)， 再放在蒸馏水中，然后将载玻片风干。用山羊-抗兔和山羊抗-小鼠生 物素化的多克隆次级抗体的混合物(每种多克隆抗体在PBS中为 5μg/μl)完全覆盖样品，然后在湿润的载玻片室(Boekel)中室温培 养30分钟。清洗后(2次用PBS；1次用蒸馏水；在玻片染色缸中)， 用链霉抗生物素-涂覆的荧光粒子(Molecular Probes；目录号F-8780； 0.5％固体)完全覆盖样品，培养，并按照前面的步骤清洗。
成像和分析.按照前面所述，使用基于CCD的成像器使样品成像(如 详述部分的步骤6所述和图3所示)。成像器可获得载玻片每个部分 的像，它们与含病原体-特异性抗体或对照抗体的孔相对应。像分析软 件(Image-Pro Plus)可计算每个像中的总荧光和荧光染色物体数。比 阴性对照具有明显更多荧光物体和更高荧光强度的孔表示相应病原体 引起感染的可能性。
变化和相关实施方案.在本化合物测定法中它可能是有效的捆绑试验 (在其它孔中)，它可测试通常在口腔/咽喉区中找到的、污染下呼吸 道样品的共生物种。它还可用于包括对鳞状上皮细胞(它可表示下呼 吸道样品的质量)和/或免疫系统细胞(它可告知有关感染的可能性) 特异的抗体。
可能获得高信号复杂度的其它类型信号传递部分可代替放射性标 记的粒子使用。例如，可类似地使用荧光团标记的抗体。用两个或多 个荧光团标记各病原体-特异性抗体的两个混合物可产生高信号复杂 度。测定所用的终抗体家族是通过混合独特比例的差异标记的病原体- 特异性抗体而创造的。例如，对病原体X特异的抗体家族可能具有一 个部分的红色荧光抗体，一个部分的黄色抗体，和一个部分的蓝色抗 体。对病原体Y特异的抗体家族可能具有两个部分的黄色抗体，和一 个部分的蓝色抗体等。应注意的是，与实施例所用的高度荧光粒子相 比，用荧光抗体标记的靶信号强度通常明显降低。信号强度还取决于 靶上的抗原数。因此，对于较小的靶，和具有相对较少类目特异性结 合位点的其它靶而言，本发明可能需要更灵敏的信号检测仪器。
与本实施例其中一个类似的方法还可用于原位核酸杂交试验。在 这种情况下，应按照实施例1所述制备、固定、和杂交细胞，区别在 于每个家族的类目特异性探针应使用生物素标记(使用标准方法；例 如，在PCR过程中掺入)。杂交和清洗后，应按照本实施例对载玻片 进行处理和成像(即，在除去未结合的生物素化次级抗体后发生的步 骤)。
实施例34.在不进行培养的情况下，多路鉴定泌尿道感染          
泌尿道感染(UTI)很常见—每年大约有1.5亿人发病—而且要花 费上百万美元在保健上。UTI的诊断通常需要进行尿液培养，对于某 些病原体而言它很耗费时间，而且不能使用标准微生物方法和培养基 (例如砂眼衣原体)。本实施例描述了本发明用于构造简单且灵敏的 UTI试验的用途，这个试验是高度多路的，而且无需细菌培养。试验 方法的方案在图34中表示。
结合共有UTI病原体的抗体.表3给出普遍引起UTI的细胞病原体。 特异性结合每种病原体的抗体是按照实施例27和实施例32所述那些 类似获得并选择的。除了物种-特异性抗体外，本实施例使用了与多种 细菌反应的抗体。结合绝大多数革兰氏阴性菌(例如，目录号15306， QED Bioscience，Inc.，San Diego，CA)和绝大多数革兰氏阳性菌(例 如，目录号15711，QED Bioscience，Inc.，San Diego，CA)的抗体 也包括在内，用于检测其中不包括物种-特异性抗体的不太普遍的生 物。
表3.引起泌尿道感染(UTI)的细菌病原体 大肠埃希氏菌 腐生葡萄球菌 克雷伯氏菌 肠杆菌 变形杆菌 砂眼衣原体 淋病奈瑟氏球菌 解脲棒杆菌 摩根氏菌 柠檬酸杆菌 B族链球菌 D族链球菌 肠球菌 绿脓假单胞菌 不动杆菌 沙雷氏菌
将捕获抗体粘着于载玻片上。抗体与含有乙醛的载玻片(TeleChem International；SuperAldehyde Substrates)共价结合。为了使不同抗体 与载玻片的不同部分结合，将粘着孔(例如，粘着硅氧烷flexiPerm 细胞培养室，常制成具有24个孔；IVSS；Sartorius)固定于载玻片上。 向不同的孔中加入各种类型的类目特异性抗体(在PBS中为10μg/ml； -2.5mm深度)，然后按照先前所述处理(MacBeath，G等，Science 289：1760-3，2000；包括在互联网上提供的补充材料，http：//www. sciencemag.org/feature/data/1053284.shl)。在通过清洗除去孔中游离抗 体后，和在进行随后的处理步骤之前，除去硅氧烷孔。
尿液样品中的UTI病原体与固定捕获抗体的直接结合.尿液样品是按 照标准过程(Isenberg编辑，1992，supra)收集的。通过加入1M EPPS pH8.0(4ml；钠盐)，100mM NaEDTA pH8.0(4ml；钠盐)，和10XPBS-TB (4ml；见定义)中和样品(28ml，在50ml一次性聚丙烯试管中； Falcon)。将具有结合捕获抗体的显微镜载玻片浸没在尿液样品中，轻 轻搅拌室温培养2小时(Bambino旋转器；Boekel)。在培养过程中， 细菌与含有相应捕获抗体的载玻片部分接触并粘着。本测定法的可行 性通过细菌UTI感染通常以较高的病原体滴定度(例如，103-105个细 胞/ml)出现的事实来证实的。
将捕获的细胞染色并成像.从尿液样品中除去载玻片，清洗(3X；50ml PBS-TB；5分钟；轻轻搅拌；接着用50ml EE清洗；轻轻搅拌15秒)， 风干，热固定(在热传导阻滞区的表面上加热至100℃，5分钟)。然 后用含有Syber Green I的溶液(10,000X原液的1∶1000稀释物； Molecular Probes；#S7563)涂覆载玻片，培养(室温10分钟)，清洗 (在50ml EE中2次；每次1分钟；轻轻搅拌)。
使用图3A所示的成像器和上面详述部分的步骤6，通过不放大的 大面积荧光成像分析载玻片的每个部分。
可选择性的试验，方法，和形式.本实施例所述的试验具有很多用途， 包括，例如，鉴定呼吸道，感染的手术伤口，食物，或环境样品中的 病原体。还可使用可选择性的标记技术(例如，荧光粒子，碱性磷酸 酶/抗体-涂覆的粒子，辣根过氧化物酶：抗体偶联物，荧光抗体，RLS 粒子，磁性粒子)，形式(例如，微流或侧流和流通形式，其中捕获 抗体与吸水薄膜结合)，及成像方法(例如，产色测定法的目测或反 射计检测和化学发光及生物发光测定法的胶片发光绘图法)构造类似 的测定法，它们中的很多已经别处描述。
实施例35.血源性病毒：HIV，HCV，HBV，和CMV的快速、多路 鉴定      
血源性病毒的检测对于测试单个患者样品和血库中的样品很重 要。常常使用的是血清学试验(检测对靶病毒特异的抗体)。然而， 与血清学方法相比，直接检测靶病毒的方法具有在感染过程早期检测 感染样品的优点。这是因为对病原体特异的抗体在3-4周的时间内， 通常不会出现在感染个体的血液中(血清转化)。不幸地是，病毒的 直接检测或不灵敏(多数抗原试验)或昂贵(多数核酸试验)。
本实施例描述了本发明构造一种快速、多路试验的用途，该试验 无需使用显微镜即可检测血液样品中的各个游离病毒粒子。试验的方 案在图35给出。
用抗-病毒抗体涂覆荧光粒子和孔.对靶病毒特异的抗体可从很多商业 来源购买。例如，下列抗体是从指定批发商购买的：抗-HIV(抗-gp120； 单克隆；Biodesign；目录号C65199M)；抗-HCV(Biodesign；目录号 C8A024M)；抗-HBV(抗-乙型肝炎表面抗原；单克隆；Biodesign； 目录号C86132M)；和抗-CMV((抗-糖蛋白B；单克隆；Biodesign； 目录号C8A024M)。
抗体是通过被动吸附，以每个孔4个相邻的不同点，与微量滴定 皿的孔结合的(1个点/抗体)。将每种抗-病毒抗体点在96孔微量滴定 平板(Greiner America；目录号55896)的孔中(1μl；1μg/μl)，在湿 润的室(Boekel Slide Moat；model 240000)中，室温培养2小时。然 后按照前面所述清洗并封闭该孔。
彩色-编码的病毒特异性荧光粒子是按照实施例8所述的方法，用 抗病毒抗体涂覆具有不同发射谱的荧光染色聚苯乙烯粒子而制造的。 荧光粒子(Molecular Probes)编码如下：HIV-特异性粒子(黄绿色； 目录号F8823)；HCV-特异性粒子(橙色；目录号F8820)；HBV-特 异性粒子(深红色；目录号F8816)；和CMV-特异性粒子(红外；目 录号F8818)。以相等浓度(在PBS-T中，107个粒子/ml)混合这4种 类型的抗体-涂覆粒子。使用前，抗体经过超声波处理并清洗(实施例 8)。值得注意的是，各抗体在孔中被分开，还可相对于各种病毒使用 相同类型的荧光粒子。然而，不同信号传递部分的使用可增加试验的 稳定性。
检测血液样品中的病毒.血液样品是从各种来源收集的，包括，例如患 者[使用标准方法，包括按照上面所述用抗凝剂EDTA处理，例如， (Isenberg，ed.，1992，supra)]；供血单位；或血液成分(例如，血 浆)。将全血(200μl)加入到含有各捕获抗体点的微量滴定皿孔中。37 ℃培养样品2小时，确保病毒与捕获抗体在孔表面粘着。彻底清洗 (4X；每次使用200μl PBS-TB)除去孔中的血液样品。将病毒特异 性粒子的混合物(200μl)加入到孔中，轻轻旋转(Beckman Allegra 6； GH-3.8转子；1200g)，使粒子覆盖孔的底部。简单培养(室温10分 钟)后，通过搅拌(涡旋4X 200μl PBS-TB；每次1分钟)清洗除去 未结合的粒子。最后，用EE(200μl)清洗孔，并干燥。然后按照实 施例8所述，使用CCD成像器使孔成像并分析，只是多个像是用适 宜的滤器装置获得的(黄绿色：激发Chroma HQ480/40x和发射Chroma HQ535/50m；橙色：激发Chroma HQ535/50X和发射Chroma HG610/75m；深红色：激发Chroma HQ560/55x和发射Chroma HQ645/75m；和红外：激发Chroma HQ710/75x和发射Chroma HQ810/90m)。病毒是由粘着了结合粒子的斑点鉴定的。如果测定成 功，诊断稳定性是根据只有预期颜色的粒子与特定斑点结合的事实提 供的。
实施例36.利用不放大的大面积成像对甲型流感病毒进行超灵敏的侧 流试验        
目的：本实施例可证实本发明利用用户容易掌握使用的侧流测定形式 和不放大的大面积成像快速检测低水平病毒的用途。在下述实验中， 将甲型流感粒子的稀释物涂在多孔膜带上，与偶联物垫中的标记粒子 接触，并通过毛细作用移动，越过捕获抗体，用于选择病毒：标记粒子 复合物。然后利用大面积不放大成像观察这些捕获的复合物。
实验方法：按照所述汇集侧流试验带。抗体线是通过将甲型流感特异 性捕获线(QED，目录号1302)和对照线(Jackson Immuno Research Laboratories，Inc.；生物素抗-小鼠IgG，目录号115-165-146)粘在薄 膜(距垫5-10mm)上的而制备的。使用前，将线干燥(至少15分钟)。 链霉抗生物素标记的荧光珠(Bangs Laboratories Inc.；目录号CP01F- 5121)是通过将珠子(10μl 1.23×1011原液)，抗体(10μl 1.0μg/ml原 液)和PBS(80μl)结合并混合(1.5小时/室温)而用生物素抗-甲型 流感抗体(Virostat；目录号1307)标记的。然后将珠子旋转(5000， 10分钟)并重悬浮在PBS-B(100μl)中。将抗-甲型流感涂覆的荧光 珠(2μl)加入到每个带的偶联物垫上。使用PBS-B连续稀释纯化甲 型流感的原液(Advanced Biotechnologies Inc：甲型流感/PR/8/34 (H1N1)，目录号10-210-000)。将试验样品(100μl IL-2稀释物)与 PBS-TB(50μl)结合，加入到试验带的样品垫中。测定(-15分钟) 后，利用不放大的大面积成像使带成像。
结果：图36表示用荧光标记粒子标记，不放大的大面积成像分析的 甲型流感病毒的侧流试验结果。该图表示上面涂覆样品的试验带的捕 获和对照线的像，所述样品含有(从左到右)0，105，106，107和108 个病毒/ml。荧光信号随着甲型流感病毒浓度的增加而增加。数据表明， 本试验可检测低至105个病毒/ml的浓度。因此本实验证实了基于本发 明的侧流试验的灵敏度。
实施例37.目测结核分枝杆菌的快速侧流试验                    
概述.快速侧流，或“带状”试验形式对于提供关注点(例如，在医生 办公室，急救室，和家庭中测试)诊断变得越来越重要。然而，侧流 试验常常因为不灵敏以致不能用于检测以较低水平存在于临床样品中 的病原体所引起的感染。例如，检测痰液中的结核分枝杆菌感染时， 需要检测几千个细胞/ml的痰液-低于目前带状试验的灵敏度阈值。因 此，在发展中国家，仍然需要通过简单的、非仪器检测结核分枝杆菌 来满足公共卫生方面尚未满足的需要。虽然核酸扩增试验可检测较低 滴定度的结核分枝杆菌，但是这些试验太昂贵，而且复杂，不能用于 绝大多数临床情况中。
本实施例描述了一种针对结核分枝杆菌的便宜、简单、快速、且 高度灵敏的侧流试验。用户可在不使用仪器的情况下目测。
使抗-结核分枝杆菌抗体和碱性磷酸酶与纳米粒子结合.单克隆抗-结核 分枝杆菌抗体(MPB64-1CA；Abe等，1999，supra)和碱性磷酸酶 (Pierce；31391)按照制造商的建议，通过被动吸附，以等摩尔浓度 与金偶联粒子(30nm；Nanoprobes；CG3054)结合，并以1011个粒 子/ml重悬浮。
通过侧流试验领域那些技术人员了解的详细内容、材料，和过程 设计并构造侧流单位。设计和构造的结果在由侧流试验制造商提供的 技术注意事项(例如，Millipore’s Short Guide for Developing Immunochromatographic Test Strips，2nd ed.，Millipore，技术注意事项 #TB500，1999；Lateral Flow Tests，1st ed.，Bangs Laboratories，技术 注意事项#303，1999)和其它文献(例如，Chandler，J.等，IVD Technology 6：37-49，2000；Weiss，Alan，IVD Technology 5：48-57，1999；Wild， D.，ed.(2001).The Immunoassay Handbood.2nd.ed.New York，NY：Nature Publishing Groop，2001)中描述。
侧流组分是按照制造商的说明从试剂盒(Millipore；目录号 HFMI-DAK015；Hi-Flow Plus Membrane Assortment Assembly Kit)汇 集的。按照制造商的建议，使用试剂调配装置(基质1600；Kinematics) 将检测区中的抗体和对照区中的试剂涂成带状。
将液化痰液或BAL样品(200μl；实施例27)点在样品垫上。样 品通过毛细作用移动，穿过薄膜。将PBS-T(200μl))涂在样品垫上(3 分钟)后，使样品利用毛细作用通过薄膜。一段较短的时间(3分钟) 后，重复该PBS-T清洗步骤。3分钟后，将金偶联物(10μl；用抗-结 核分枝杆菌/碱性磷酸酶涂覆的109个粒子)涂在样品垫上，进行两次 PBS-T清洗(如前所述)。将碱性磷酸酶底物(1ml；BM紫；Boehringer Mannheim)直接涂在薄膜上，显色，直到在阳性对照区看到斑点(30 分钟-1小时)，之后，倾出剩余的比色检测试剂，将水(1ml)直接涂 在薄膜上。3分钟后，倾去水。如果试验正常进行，那么在阳性对照 区可看到约1000个斑点。试验区中的斑点数表示样品中的结核分枝 杆菌数。
各种选择性的免疫色谱构型也是可能的，包括“流通”排列(见 实施例23)。
实施例38.利用不放大的大面积成像检测若干不同生物竞争剂的快速 侧流试验  
由于生物竞争剂造成的诊断感染在常规感染性疾病诊断中遇到的 那些之外，又提出了若干挑战。很可能用于生物胁迫或生物竞争的试 剂与在平常医疗实践中见到的那些不同，并因此难于利用标准诊断方 法识别。非常规试剂在本领域的诊断用途需要利用便携式、用户容易 掌握使用的系统扫描不同的物质(包括毒素，病毒和细菌)，其中该 系统可检测滴定度非常低时的早期感染。
 本实施例描述了一种侧流免疫测定法，它快速、便于携带、而且 用户容易掌握使用，可扫描各种物质含量较低的临床或环境样品。技 术上，该实施例类似实施例36，区别在于若干病原体是在一个测定法 中检测的，且化学发光信号是电检测的。
表4.可能用于生物竞争或生物胁迫中的非常规试剂 炭疽杆菌 志贺氏菌 天花病毒 鼠疫耶尔森氏菌 沙门氏菌 马尔堡病毒 土拉热弗朗西丝氏 菌 霍乱弧菌 埃博拉病毒 猪布鲁氏菌 蓖麻毒素 伯氏考克斯氏体 肉毒素
对很可能用于生物竞争或生物胁迫中的试剂特异的纳米金-抗体偶联物。 本实施例扫描含有表4所列物质的样品(例如，血液)，这些样品中 的一些是细菌，病毒，和蛋白毒素。获得对表4所列各种物质特异的 抗体，亲和纯化，并按照实施例32和实施例27所述测试特异性。值 得注意的是，对于蛋白毒素而言，具有不同和非重叠抗原决定部位的 单克隆抗体与纳米金粒子和侧流薄膜上的检测区(或捕获区)偶联(见 下面)。
对表4中物质特异的纳米金偶联物是按照实施例26所述，通过各 种类型的亲和纯化抗体及等摩尔碱性磷酸酶的被动吸附而制备的。将 PBS-TB中的物质-特异性偶联物以等摩尔浓度混合，这样最终总的偶 联物浓缩物在PBS-TB中是固体。
侧流装置.按照实施例36的测定法构造并运行本实施例中的侧流试 验，区别在于所检测分析物的数目较大，信号特征不同(本实施例是 化学发光，实施例36是比色)，及偶联垫在本实施例中的使用。图38 表示侧流试验的构造。该图已经简化(例如，该试验只描述了表4中 的3种物质和偶联物垫上所示的3种偶联物，上面的图代表物质-特异 性偶联物的总体)。如实施例36中所述，便携式侧流装置具有一个检 测区和一个对照区，但在这种情况中，检测区包括固定的物质-特异性 抗体的平行带-每种物质-特异性抗体为一个带。对照区包括固定的非 常规物质的平行带-每种靶物质为一个带。如各种参考文献(例如， Millipore，技术注意事项#TB500，1999，supra；Bangs Laboratories， 技术注意事项#303，1999，supra；Chandler，J.等，2000，supra；Weiss， A.，1999，supra；Wild，2001，supra)中所述，物质-特异性偶联物 的混合物嵌入在偶联物垫中。
侧流测定法.将液化样品(200μl，例如，唾液，液化痰液，血清)涂 在样品垫上，然后3次将200μl PBS-TB涂在样品垫上(每次涂在样 品垫上之间，等待60秒)。液化样品可使偶联物流动，这是因为它可 通过毛细作用从样品垫移动到偶联物垫(图38)。可能存在于样品中 的任何靶物质都可与相应的纳米金：抗体：AP偶联物结合。物质：纳米 金复合物继续利用毛细作用移动，直到它们遇到与特定物质相应的测 试区带中的相应物质-特异性抗体，物质：纳米金复合物即在那里固定。 没有与物质结合的纳米金偶联物前进至对照区，并结合对照抗原的相 应带。
用CDP-Star(PE Biosystems)涂覆检测带，培养5分钟。然后按 照图38所述用CCD成像器(Orca II；Hamamatsu)使带成像。各个 物质(生物，病毒，或蛋白)是利用与物质结合的碱性磷酸酶涂覆粒 子所发射的化学发光而检测的。如果测定正常进行，所有对照带都被 化学发光粒子涂覆。如果样品中存在一种(或多种)物质，相应带应 含有固定的化学发光粒子。物质的同一性是通过阳性检测带到对照带 的距离(每种物质的试验带到对照带的距离是已知的)测定的。成像 软件(Image-Pro Plus)处理由CCD照相机收集的像，其中使用可量 化试验带中斑点数的宏，并通过测量距对照带的远近而赋予物质同一 性。
实施例39.使用核酸探针全面检测呼吸道病原体                 
目的和优点.在本实施例中，各个测定法可全面检测患有下呼吸道疾病 患者的样品中是否存在共有呼吸道病原体的不同排列。本实施例的医 疗目的和重要性与实施例32的那些相同。然而，本实施例使用基因 组DNA探针和原位杂交形式，而不是抗体类目结合分子和免疫测定 形式。
实施例的技术概述.类目特异性序列是利用基因组扣除(细菌和真菌)， 或计算机分析(病毒)从各种下呼吸道病原体中分离出来的。寡核苷 酸探针家族是相应于对各致病种类特异的类目特异性序列合成的。每 个家族的类目特异性探针是用不同组合的荧光量子点标记的。整个探 针整体(即，所有探针家族)与样品杂交，固定于载玻片上，然后洗 去未结合的探针。使用CCD照相机，通过确定病原体-特异性探针的 哪个家族-即量子点标记的哪种组合-与样品中的微生物杂交而测定临 床样品中病原体的同一性。
从引起下呼吸道疾病的病原体中分离类目特异性序列.表2列出了引起 下呼吸道感染的共有病原体。基因组扣除法(Straus，1995，supra) 用于从细菌和真菌(即，非病毒)病原体中分离类目特异性序列。下 列部分通过描述纯化和鉴定对肺炎链球菌特异的诊断标记而举例说明 扣除方法。肺炎链球菌是肺炎最普遍的原因；它导致所有公共获得性 肺炎病例中约30-50％(在美国，每年500,000)。
利用基因组扣除分离一组含有肺炎链球菌类目特异性序列的DNA片 段。图39A表示肺炎链球菌与其最紧密亲缘之间的种系发生关系 (Kawamura等，International Journal Of Systematic Bacteriology 45：406-8，1995)。分离类目特异性序列的方法可分为两步：基因组扣 除(图39B)和筛选(图39C)。首先，基因组扣除(Straus，1995，supra) 是利用作为“+”基因组差异样品的致病株(在这里是肺炎链球菌) DNA进行的(图39B)。“-”基因组差异样品是通过将若干最紧密相 关株混合而构造的-这些株通常不会引起肺炎。所得扣除产物是与病原 体基因组杂交，但不与最紧密相关种类的基因组杂交的片段。然后利 用部分补平法(Corrette-Bennett等，Nucleic Acids Res 26：1812-8，1998) 将这些片段克隆到pBluescript I载体的XhoI位点中。
鉴定属于类目特异性序列的扣除产物.下一步是分离肺炎链球菌-特异 性扣除产物的亚组，它是类目特异性的，即与所有肺炎链球菌杂交， 但不与其它种类的任何菌株杂交。应注意的是，并不是所有扣除产物 都是类目特异性序列。扣除产物组不包括所有预期的类目特异性序列 片段，但包括某些非类目特异性片段。这是因为基因组扣除实验(见 上一段)可选择与各个肺炎链球菌(基因组扣除中的“+”菌株)杂 交，而不与若干相关种类的各个菌株杂交的片段。因此，例如，某些 扣除产物不与某些其它肺炎链球菌杂交，某些与扣除中所用的缓症链 球菌的不同菌株杂交。
为了鉴定属于类目特异性序列的扣除产物亚组，通过与很多不同 链球菌分离物的基因组DNA杂交而筛选克隆片段。因为它不能检测 与所有肺炎链球菌杂交的探针，最近似的方法是检测与上百种肺炎链 球菌杂交的探针，所述上百种肺炎链球菌是从全世界分离的，而且在 几个世纪以前就已经分离出来了(肺炎链球菌是从American Type Culture Center，和疾病控制中心获得的)。同样检测与很多链球菌中 的非-肺炎链球菌杂交的探针。图39C表示检测探针是否是类目特异 性序列的适当方法。基因组DNA是从肺炎链球菌和相关链球菌种类 的不同分离物制备的(使用Graves and Swaminathan Graves等的方法， (1993)Universal B acterial DNA分离过程.In Diagnostic molecular microbiology：principles and applications，D.Persing，T.Smith，F.Tenover 和T.White，eds.(Washington，D.C.：American Society for Microbiology)，pp.617-621，使之变性，并以斑点印迹阵列的形式 (Ausubel 1987，supra)点在带正电的尼龙滤器上(例如，GeneScreen Plus，NEN)。(对于可进行集落杂交的种类而言，除了“斑点印迹” 外，菌株可在尼龙滤器上原位生长并溶解，从而避免从大量菌株纯化 DNA)。
为了检测克隆扣除产物是否是类目特异性序列，它与排列的基因 组DNA杂交。如果克隆与所有肺炎链球菌的基因组DNA杂交，但不 与相关链球菌种类的基因组DNA杂交，那么它被分为类目特异性序 列(图39C)。克隆扣除产物是通过在克隆重组质粒的PCR扩增过程 中掺入洋地黄毒苷而标记的。所用的标准PCR条件(见定义)是用XhoL 和XhoR引物(它与克隆扣除产物在Bluescript载体中直接侧面连接)， 区别在于用洋地黄毒苷-dUTP(100μM；Boehringer Mannheim)补充 反应。然后使用高度严格杂交的标准方法(Ausubel 1987，supra)使 各个标记的探针与基因组DNA的斑点印迹阵列杂交，接着按照制造 商建议的方案(Boehringer Mannheim)，使用碱性磷酸酶：抗-洋地黄毒 苷抗体偶联物(Genius；Boehringer Mannheim)和CDP-Star(NEN) 检测。化学发光项是利用装在light-tight盒(Alpha Innotech Corp.， Multilmage II cabinet，目录号DE-500-110)中的CCD照相机(ORCA II； Hamamatsu)获得的，并使用Image-Pro Plus像软件包(Media Cybernetics，Silverspring，MD)分析。
合成类目特异性寡核苷酸家族.接下来，合成寡核苷酸探针，它与通过 上述斑点印迹鉴定的30个类目特异性克隆相对应。首先，对所选择 的30个肺炎链球菌类目特异性序列进行测序。所有DNA测序是使用 Pekin Elmer的ABI 377自动测序仪并按照制造商的建议进行的。合成 寡核苷酸探针时，使用程序“Primer3”(S.Rozen，H.Skaletsky(1998) Code availabe at  http：//www-genome.wi.mit.edu/- genome_software/other/primer3.htm)选择来源于30个类目特异性序列 的、大约20个碱基长的2个亚序列，其中对于内部杂交寡核苷酸挑 取而言使用缺省参数设置，只是将最小解链温度定为59℃，将最大解 链温度定为61℃。
 每个寡核苷酸是在5’末端进行氨基修饰而合成的(Midland Certified Scientific Reagent Co.)。氨基修饰的寡核苷酸能够与高度荧 光量子点共价连接(见下面)。
表5.使用量子点组合标记.将5种不同类型着色的量子点组合，可产生 31(25-1)种不同的颜色组合。对于表2上面所列的24种病原体而言， 病原体-特异性寡核苷酸亚组与表中用菱形标记的量子点结合。因此， 相对于每种病原体构造具有不同信号标志的探针家族。应注意，表中 没有标出5种标记颜色的31种可能组合中的7种(即，与没有颜色， 1种颜色，和5种颜色相对应的组合)。 红色 黄色   绿色  蓝色   紫色     +     +     肺炎链球菌     +     +     流感嗜血杆菌     +     +     肺炎支原体     +     +     粘膜炎莫拉氏菌     +     +     肺炎衣原体     +     +     不动杆菌     +     +     军团菌     +     +     金黄色葡萄球菌     +     +     大肠杆菌     +     +     克雷伯氏菌     +     +     +     粘质沙雷氏菌     +     +     +     绿脓假单孢菌     +     +     +     变形杆菌     +     +     +     肠杆菌     +     +     +     呼吸道合胞病毒     +     +     +     腺病毒     +     +     +     甲型流感病毒     +     +     +     乙型流感病毒     +     +     +     副流感病毒     +     +     +     巨细胞病毒     +     +     +     +     白色念珠菌     +     +     +     +     曲霉     +     +     +     +     新型隐球菌     +     +     +     +     卡氏肺囊虫
用量子点组合标记类目特异性寡核苷酸探针.为了达到全面检测下呼吸 道感染的目的，肺炎链球菌探针家族必须以这种方式标记，即把它与 对应于表2中其它病原体的探针家族区别开来。在本实施例中，每个 探针家族是用不同组合的量子点标记的。组合标记的原理在图5中给 出。量子点是纳米大小的半导体晶体，它发出的荧光很亮，足以作为 各个粒子使用简单且便宜的仪器(Bruchez等，Science 281：2013-6， 1998；Chan等，Science 281：2016-8，1998；Service，Science 281：1930-1， 1998)检测。总之，量子点对于本发明非常有用的性质包括发射谱非 常狭窄；发射谱是通过纳米晶体的大小确定的—通过改变大小，可产 生具有若干不同发射谱的量子点标记试剂(对于这种多色应用很重 要)；发光非常强，这样各个粒子就可成像；与小蛋白相比，粒子非 常小(在原位分析过程中，提高探针进入固定细胞中靶的可能性)； 量子点可用生物上非常重要的分子(例如，核酸，蛋白，生物素)共 价修饰；以及各个波长的光可引起从具有不同发射谱的量子点发射。
为了区别标记24个类目特异性寡核苷酸探针家族(与表2所列的 呼吸道病原体相对应)，可使用不同组合的量子点。将5种不同类型 着色的量子点组合，可产生31(25-1)种不同的色彩组合(表2)。从 每组病原体-特异性寡核苷酸中，使100个寡核苷酸与使用表2病原体 栏中的菱形标记的量子点偶联。因此，对于肺炎链球菌而言，100个 不同的肺炎链球菌类目特异性寡核苷酸是用紫色量子点标记的。同 样，100个其它肺炎链球菌类目特异性寡核苷酸是用蓝色量子点标记 的。200个量子点标记的肺炎链球菌类国特异性寡核苷酸构成肺炎链 球菌类目特异性探针家族。探针家族与各个肺炎链球菌细胞的原位杂 交被检测为蓝色和紫色量子点的聚簇。同样，金黄色葡萄球菌细胞被 检测为紫色和绿色量子点的局部聚簇(如表2的第2栏所示)。寡核 苷酸是用制造商建议的过程与量子点(Quantum Dot Corp)共价结合 的。
有时，寡核苷酸探针可起类目特异性序列的作用，尽管它是类目 特异性序列的亚序列。这是由于较大类目特异性序列内的不完全序列 分散而出现的。寡核苷酸是类目特异性序列的确认是按照上面所述， 使用适于寡核苷酸的杂交条件(Ausubel 1987，supra)，通过使量子点 标记的寡核苷酸与斑点印迹杂交而获得的。斑点印迹是用benchchtop 盒(Alpha Innotech Corp.，MultiImage II cabinet；目录号DE-500-110) 中，具有UV表面照射的ORCAII CCD照相机(Hamamatsu)和成像 软件(MetaMorph Universal Imaging Corporation，Downingtown，PA) 分析的。不能起类目特异性序列作用的探针组中的寡核苷酸(与所有 肺炎链球菌杂交，但不与其它链球菌杂交)不包括在类目特异性寡核 苷酸探针家族中。
值得注意的是，在本实施例中可使用其它可信号产生的部分替换 量子点。例如，利用EDAC化学(按照制造商的说明)，可使羧化-修 饰的荧光标记粒子(40纳米直径，TransFluoSpheres，Molecular Probes) 与5’末端的氨基修饰的寡核苷酸连接。然后使用具有不同发射谱 (560，605，645，685，720nm)和相同吸光度最大值(488nm)的5 种类型的TransFluoSpheres标记病原体-特异性寡核苷酸，其组合与使 用表5中5种不同类型量子点的组合相似。
可选择性地，较大的克隆类目特异性序列可使用核酸聚合酶(例 如，DNA聚合酶I，逆转录酶，或Taq聚合酶的Klenow片段)，在有 修饰核苷酸存在下标记。有效核苷酸修饰的例子包括直接与荧光团偶 联的核苷酸(例如，来源于Molecular Probes的Alexa系列，或含有 伯胺(它可在掺入到多聚核苷酸中后，与荧光团偶联)的荧光素-12- dUTP(NEN Life Sciences；目录号NEL413)核苷酸)，和半抗原修饰 的核苷酸(例如，洋地黄毒苷-dUTP；Boehringer Mannheim)。对于半 抗原-修饰的多核苷酸而言，信号传递部分(例如，荧光素-标记的抗- 洋地黄毒苷抗体)常常在探针与样品杂交后，与探针偶联。就寡核苷 酸而言，使用聚合酶-标记的类目特异性序列组合标记时，标记方案必 须使用一组可区别的信号传递部分。
分离其它下呼吸道病原体的类目特异性探针.表2中其它细菌和真菌病 原体的类目特异性探针家族是按照上面肺炎链球菌所述制备的。然 而，如上面和表5中所述，每个类目特异性探针家族是用不同组合的 量子点标记的。用于研究本试验的病原体是从American Culture Collection(ATCC；Manassas VA)获得的。
同样制备病毒类目特异性探针家族，区别在于病毒类目特异性序 列是通过与公众可获得的基因组序列进行比较而分离的。首先，在公 共数据库(例如，GenBank；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中扫描病 毒病原体，例如甲型流感病毒的序列。然后输入这些序列，并在程序 MegAlign(DNAStar)中进行序列对比。从基因组不变区选择类目特 异性序列，该不变区已经根据病毒的一个以上分离物测序。设计、合 成寡核苷酸，并使其与量子点连接，然后上面肺炎链球菌所述进行检 测。病毒分离物是从培养物保藏单位，如美国典型培养物保藏中心 (ATCC)获得的，用于制备基因组核酸(斑点印迹)。例如，ATCC 保藏了甲型流感病毒和乙型流感病毒的大量标本。来源于病毒各种分 离物的核酸是通过标准方法制备的，用于基因组斑点印迹(见，例如， Stephenson等编辑，(1998)，Diagnostic virology-Laboratory manuals. (Totaowa，NJ：Humana Press).307 pp)。
将病原体-特异性探针家族结合产生下呼吸道病原体探针整体。探 针整体是在EE缓冲液(见定义)中汇集的，每个探针的浓度为10nM。 鉴定临床样品中存在的病原体。病原体-特异性探针的整体可用于同时 扫描含24种病原体的呼吸道样品(图40)。样品和对照品的优选布置 在图40中表示。用样品和对照区域中的登记标记蚀刻显微镜载玻片， 从而帮助像的排列(见下面)。
将呼吸道样品(例如，痰液，支气管肺泡的灌洗液，或受保护的 支气管刷标本)和对照靶一起涂在显微镜载玻片上，风干。在每个载 玻片上构造内部对照部分，其上面是排列的、含有纯化呼吸道病原体 的斑点。载玻片对照部分是为了证实杂交正常进行，且提供内部荧光 标记的标准品，从而与样品中的信号进行比较。将探针整体中的24 种呼吸道病原体(表2所列)点(0.1μl PBS中含250个微生物)于载 玻片上，风干。然后使用Braun-Howland等的方法固定样品和对照品 (Braun-Howland等，Biotechniques 13：928-34，1992)。杂交前，通过 75℃时，用70％甲酰胺涂覆样品10分钟而使固定样品中的核酸变性。 倾去过量的液体，在EE中清洗载玻片，并风干。
接下来，使探针整体与载玻片上的样品杂交。杂交是在含5μl探针 整体(每个探针的终浓度为lnM)的HYB缓冲液(50μl；见定义) 中进行的。用盖玻片覆盖杂交溶液，并于50℃时，在湿润的载玻片槽 (Boekel)中培养30分钟。50℃时，在HYB缓冲液中清洗载玻片5 次(每次30秒)。将载玻片冷却至室温后，用EE清洗它们，并风干。
与图3A所示相似的CCD成像设备(但没有自动平台)用于获得 样品和内部标准品的像。加样盘有3个位置：开口，第1个成像位置， 和第2个成像位置。将具有结合量子点-标记探针的载玻片插入到成像 设备的加样盘(在开口位置)中，该成像设备具有接近成像器定位的 内部标准品部分。将加样盘移动到第一个成像位置以观察载玻片的内 部标准品部分。标准品成像后，将载玻片移动到第二个成像位置以分 析实验样品。
像的获得优选通过计算机软件(Image-Pro Plus)控制。5个像都 是自动获得的，每个荧光团信号传递部分1个像。当每个荧光团成像 时，软件自动选择合适的激发和发射滤器，并按照用户定义的参数(例 如，曝光时间，标准品强度值等)收集像。软件通过将5个像的信息 结合而构造一个复合像。像是借助于登记标记(标记在样品和对照区 域中蚀刻，这样就可在每个像中看到它们)自动排列的。排列是必需 的，这是因为滤器更换过程中，较小的机械干扰会使连续的像轻微偏 移。然后，软件给复合像中的每个像素赋予相应于这5个像强度的基 础值。
基于软件的标准品分析具有两个主要功能。首先，它证实了实验 过程在正常工作。标准品阵列中的24个“斑点”含有靶病原体的各 个细胞或病毒，而它们是按照与实验样品中的病原体同样处理的。类 目结合分子的每个病原体-特异性家族的信号传递部分的组合是已知 的。因此，该软件可检查每个斑点中的细胞/病毒是否与信号传递部分 的预期组合相对应。此外，将在每个斑点中观察到的病原体数与已知 数目(约250个生物)进行实验比较。如果，按照预期通过结合探针 标记正确数目的病原体，那么实验过程被认为是正常工作的。软件分 析包括将结果与废止标准进行比较，其可由用户设置。实验被废止的 原因优选包括正确或有效标记一个或多个病原体的失败，过多的背景 (由没有病原体的像部分的分析确定)，和较差的信噪比。优选从标 准品和样品的像中扣除在此阶段，相对于5个像评估的背景荧光值。
标准品分析的第二个功能是产生用于将信号标志与已知病原体联 系起来的准确关键。对于每个病原体，构造这5个像(即，对于用荧 光团-优化的激发/发射滤器收集的每个像)的预期基础值。为了在其 中一个像中建立病原体的预期范围，将斑点中250个微生物的强度值 列表。在本发明的优选实施方案中，以在标准品中检测的强度值范围 为基础选择阈值。因此，对于每种病原体而言，构造每个像的一组预 期范围。构造查找表，它可将假色与落在特定病原体预期范围内的一 组值联系起来。赋予假色的过程与染色质组型所用的相似(Schrck 等，1996，supra；Speicher等，1996，supra.)。
优选将用于样品鉴定的条形码(通过涂覆各种厚度的黑条而构造) 放在载玻片上，使它与标准品同时成像。条形码的使用和分析方法对 于本领域那些技术人员是可以理解的。
分析标准品后，将载玻片加样器移动到第二个位置，将载玻片的 样品部分放在成像区。软件驱动收集样品的5个像(在标准品之前自 动成像)。使用在标准品分析过程中构造的查表，将假色赋予各个物 体，其与颜色比值落在特定病原体预期范围内的那组相对应。计算每 种类型假色物体强度的总和，并除以对照样品中靶的平均强度值，得 到存在于每个样品中的靶数。第一遍像分析可鉴定并计算代表靶各个 类目的物体中的病原体。在第二遍分析时，软件可测试像素登记比值， 如果它们具有的比值与不止一种类型的病原体比值相一致，那么与任 何各个靶病原体的多种都不一致。最后，该软件可为用户展示诊断 (即，感染或未感染)，样品中病原体的强度和数目，样品ID号(从 载玻片上的条形码信息提取的)，和标准品及样品的复合像(具有假 色像素)。
实施例40.使用核酸探针同时测试含有很多病原体的血液样品       血流感染.心血管系统的致病性侵害是一种最严重的感染性疾病。在美 国，每年发生大约200,000例血流感染，其中20-50％是致死的。尤其 危险的是非常年轻和非常老的无免疫应答患者，那些具有皮肤或软组 织感染和创伤的患者，和侵入性医疗过程的受者。所有主要类型的病 原体都可感染血流，包括细菌，病毒，真菌，和寄生虫。快速鉴定血 流感染中的病原体对于创立适宜的，可挽救生命的疗法而言很重要。
疗法的选择取决于病原体的同一性。很多较为昂贵的试验都需要 确定感染源。然而，迅速开始最佳疗法常常是生存和死亡的原因。因 此，需要一种能够快速测定各种共有血流病原体同一性的各个测定 法。
实施例概述.本实施例描述的试验通过使用间接标记的病原体-特异性 探针进行原位杂交而扫描血液样品中各种血流病原体的存在。通过同 时检测共有细菌，病毒，和原生动物病原体，该方法可大大改善目前 的实践。试验的快速(无需微生物培养)尤其适用于快速诊断血流病 原体，开始适宜且即时的治疗。
表6.引起血流感染的病原体     细菌     真核生物     葡萄球菌     金黄色葡萄球菌     Viridans streptococci     肠球菌     链球菌     肺炎链球菌     埃希氏菌     克雷伯氏菌     假单孢菌     肠杆菌     变形杆菌     拟杆菌     梭状芽孢杆菌     绿脓假单孢菌     Cornybacterium     疟原虫     杜氏利什曼虫     弓形体     微丝蚴     荚膜组织胞浆菌     Coccidoides immitis     新型隐球菌     念珠菌     病毒     HIV     单纯疱疹病毒     丙型肝炎病毒     乙型肝炎病毒     巨细胞病毒     EB病毒
汇集来源于引起血流感染病原体的组合标记的类目特异性探针整体.表 6列出可引起血流感染的一些共有病原体。使用由Tinsley等(1996， supra)改进的代表性差异分析法，从非病毒(即，细菌，真菌，和寄 生虫)病原体中分离类目特异性序列。这种方法在技术上不同于实施 例39所用的方法，但它仍然可分离具有相同性质的扣除产物。基因 组差异样品是按照实施例39所述构造的，并使用标准方法(Ausubel 1987，supra)克隆到Bluescript II载体中。类目特异性序列的病原体- 特异性家族是按照实施例39所述鉴定并测序的。
寡核苷酸探针是按照实施例39合成并测试的。按照先前实施例所 述，使用5种光谱不同的量子点的组合标记，和与表5类似的方案。 然而在本实施例中，每个寡核苷酸是用两个部分设计的：类目特异性 序列和标记序列(图6和图41)。标记部分可提供间接标记寡核苷酸 探针的工具。为了间接标记探针分子，用信号传递部分标记抗-标记(或 标记互补)序列，然后与双功能寡核苷酸探针杂交(图41)。使用5 个不同的标记，每个标记一种颜色。假设，例如，金黄色葡萄球菌的 “色彩编码”是绿色，紫色，和蓝色。大约100个金黄色葡萄球菌-特 异性探针是用“绿色标记”合成的，另外100个用“蓝色标记”，还 有100个用“紫色标记”。设计标记序列和类目特异性序列，这样一 来，每个部分及其互补序列的解链温度(Tm；使用Suggs(Suggs，S.V 等，Proc Natl Acad Sci U S A 78：6613-7，1981)算法计算，1M NaCl) 为60℃(±1℃)。而且在设计标记时，还要使它们彼此、彼此的互补 序列，类目特异性寡核苷酸，或类目特异性寡核苷酸的互补序列不会 交叉杂交(即，寡核苷酸的所有这种组合优选具有40℃的解链温度 (Tm(不匹配))(即，Tm(理想匹配)-20℃))。这种方法的优点是只需合成5 个标记的抗-标记序列(它们可用于若干用途)，且标记和抗-标记可在 与样品杂交的过程中彼此杂交。(在可选择的实施方案中，各个通用 标记序列可在所有寡核苷酸上使用，或可使用家族-特异性标记)。
如实施例39所述，检查寡核苷酸以确定它们通过与基因组DNA 的斑点印迹杂交而起严格类目特异性序列的作用。然而在本实施例 中，探针是用与碱性磷酸酶(Synthetic Genetics)偶联的抗-标记间接 标记的。52℃(与寡核苷酸/基因组DNA杂交(60℃)减8℃的解链 温度(Tm)相等)时，探针与斑点印迹在HYB缓冲液中杂交。在相 同温度下，在相同的缓冲液中清洗印迹(3次，每次10分钟)，在150mM NaCl和100mM tris-HCl pH9.5的溶液中清洗，然后用CDPStar(NEN) 覆盖。印迹的数字图像是按照先前实施例所述获得的。
因此，与病原体-特异性探针家族相对应的每组寡核苷酸(每个探 针家族与表6所列30种病原体中的一种特异性杂交)是利用组合标 记方案，通过独特组合的荧光染料标记的。按照实施例39组合标记 探针家族，从而形成血流病原体-特异性探针整体。
血液病原体探针整体与血液样品的原位杂交.使用标准方法(Isenberg 编辑，(1992)Clinical microbiology procedures handbook.Washington， D.C.：American Society of Microbiology)收集血液样品。使用Lischewski 等(Lischewski等，J Clin Microbiol 35：2943-8，1997)的方法制备进 行原位杂交的血液样品(0.5ml)。按照先前实施例所述，将血液样品 点在与对照斑点相邻的阵列上，区别在于在本实施例中，斑点含有来 源于表6所列血流病原体的生物。载玻片也是按照先前实施所述进行 条形编码的。杂交和清洗按照先前实施例所述进行，区别在于本实施 例中，包括探针整体(每个探针的终浓度为1nM)和抗-标记(与探 针整体中相应标记序列的相应浓度是等摩尔的)。
按照实施例39所述使载玻片成像并进行分析。
实施例41.使用核酸探针快速共同检测很多中枢神经系统病毒     
实施例概述.中枢神经系统(CNS)感染属于医疗急症。感染剂的快速 诊断对于最佳医疗效果很重要。病毒感染的诊断还是特别值得怀疑且 常常较为昂贵。本实施例描述的方法可用于同时检测含有各种类型病 毒的脑脊髓液(CSF)样品。
本实施例详细描述了一种快速高度多路的试验，它可将样品、所 需仪器、和实验复杂度减到最低。将CSF样品点在滤器上并固定，使 之变性，用侧流色谱法与病毒探针的整体杂交(用量子点组合标记)。 通过不放大的大面积CCD成像使结合探针成像并鉴定。
汇集病毒-特异性序列的整体.选择对表7所列各病毒特异的类目特异 性序列。在某些情况下，病毒-特异性类目特异性序列已经在文献中描 述过。在其它情况下，在将序列与数据库中的其它病毒进行比较后， 从公共数据库中的病毒基因组序列中选择序列。序列对比是用标准方 法进行的(Ausubel等，1987，supra)。选择类目特异性寡核苷酸，合 成，并按照实施例39所述用量子点标记。组合标记方案与表5所示 相似，区别在于来源于表7病毒的类目特异性寡核苷酸与量子点偶联。 中枢神经系统病原体-特异性探针整体是通过以(每种寡核苷酸)10nM 浓度在EE中结合各种类目特异性寡核苷酸而构造的。
表7.引起CNS感染的病毒 柯萨奇病毒A 单纯性疱疹病毒 圣路易脑炎病毒 EB病毒 粘液病毒 JC病毒 艾可病毒 Bunyavirus 巨细胞病毒 水痘-带状疱疹病毒 HIV 柯萨奇病毒B 披膜病毒 麻疹病毒 肝炎 副粘病毒 腮腺炎病毒 马脑炎病毒 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 狂犬病病毒 BK病毒
样品制备.CSF是利用标准方法(Isenberg，1992，supra)收集的。将 样品(1ml)在离心机(12,000Xg；1分钟)中简单旋转，除去细胞和 颗粒状物质。通过在Biomax-5级Ultrafree-4离心部件(目录号UFV4 510XB；Millipore，Bedford，MA)中，以7,500g旋转而将上清液(1ml) 中的病毒浓缩。将剩余物(10μl)在95℃加热5分钟，从而使核酸变 性，并点在支持的硝基纤维素带(0.5×2cm；5μm孔；Osmonics)上。 在与样品不同的带区中，按照先前所述(Gravitt等，Journal Of Clinical Microbiology 36：3020-7，1988)，将来源于表7各病毒的变性基因组核 酸的对照样品(1×105基因组)点在相邻带上(条形码)。类似涂抹墨 水的参考带。
毛细作用-介导的杂交.通过使用Reinhartz等(Reinhartz，1993，supra) 描述的纸色谱杂交测定法使量子点标记的探针整体与样品和对照组的 变性样品DNA接触。图42表示本实施例所用的过程。将探针的杂交 溶液涂在带的一端，通过毛细作用流过固定的变性样品核酸。杂交溶 液是Reinhartz等所用的，补充了1％聚乙烯吡咯烷酮，区别在于溶液 所含的DNA是血源性病原体探针整体(每个量子点寡核苷酸探针的 终浓度是1nM)。将带浸泡在杂交溶液(100μl)中，50℃进行杂交色 谱25分钟。37℃将样品在0.3％Tween/PBS中清洗5分钟，然后风干。 利用过滤带的CCD成像鉴定病原体。按照实施例39通过成像鉴定病原 体。样品中的病毒核酸分子与具有特征组合量子点标记的探针杂交。 每个量子点聚簇被赋予一种假色。CSF样品中病毒的鉴定是通过将样 品中点的假色与对照带(含有已知的病毒基因组)的假色进行比较而 获得的。
实施例42.用基因组DNA探针快速鉴定结核分枝杆菌的抗微生物敏感 性试验         
概述.快速灵敏检测结核分枝杆菌的医疗重要性在实施例28的概述中 讨论。本实施例与先前实施例(实施例9，实施例27，和实施例28) 的不同之处在于使用结核分枝杆菌-特异性基因组DNA序列作为类目 结合分子，而不是用结核分枝杆菌-特异性染料，非-特异性染料，或 抗体。
通过基因组扣除获得的结核分枝杆菌-特异性基因组DNA序列是 用半抗原洋地黄毒苷修饰的。患者痰液样品的等分试样是在含有各种 浓度的各种抗生素的生长培养基中培养的。将样品排列在滤器上后， 使用半抗原标记的结核分枝杆菌特异性序列作为探针杂交，利用化学 发光和不放大的大面积CCD检测计算细胞数。
制备半抗原-标记的结核分枝杆菌-特异性类目特异性序列.结核分枝杆 菌-特异性序列是按照实施例39所述和图40所示，通过基因组扣除和 量子点筛选分离的。进行基因组扣除时，正基因组差异样品是结核分 枝杆菌，负基因组差异样品是鸟分枝杆菌。为了确定哪个克隆扣除产 物是结核分枝杆菌-特异性序列，按照实施例39所述，用克隆产物作 为探针，与50个结核分枝杆菌分离物(来源于不同的地理位置)和50 个相关分枝杆菌种类的分离物在斑点印迹中杂交。探针用洋地黄毒苷 标记，并按照实施例39所述使斑点印迹成像。收集洋地黄毒苷-标记 的类目特异性序列(n＝96)(每个探针的终浓度为250pg/μl)。
检测下呼吸道样品中的结核分枝杆菌.用NALC-NaOH法(Isenberg， ed.(1992))制备痰液样品。然后将预处理过的痰液(10μl)涂在尼龙 滤器(GeneScreen；NEN)上，并通过放在一系列滤器上而制备。37 ℃时，将滤器连续放在(室温，每次5分钟)用预溶解溶液(见溶液 部分)饱和的一系列滤器上(包裹在塑料套中，防止蒸发)；干燥滤 器(Whatman 3MM)；37℃时用1％SDS/100μg/ml蛋白激酶K(Life Technologies)溶液饱和的滤器(包裹在塑料套中)；干燥滤器；用0.5N NaOH饱和的滤器；干燥滤器；用1M tris pH7.5饱和的滤器；和干燥 滤器。作为阳性对照，将结核分枝杆菌(10μl中-1000个微生物)在 与痰液样品邻近处点样。作为阴性对照，将大肠埃希氏菌(-1000个 细胞)在与阳性对照邻近处点样。与半抗原-标记探针的原位杂交是按 照实施例39所述进行的。然后，使与碱性磷酸酶(Genius试剂盒； Boehringer Mannheim)偶联的抗-洋地黄毒苷抗体与杂交探针结合， 将滤器放于载玻片上，并按照制造商的建议用CDP-Star(NEN)培养。 利用非显微CCD成像器(图3)使载玻片成像并进行分析。
用各种抗生素培养临床样品.按照实施例28所述，在含有结核分枝杆 菌的样品上进行抗生素敏感性试验。
将样品排列在滤器上并准备杂交.使用安装在真空烧瓶上的一次性过滤 装置(Millipore；Microfil Funnel(100ml)，目录号MHAWG072)，将 培养物样品的等分试样(100μl)排列在栅式尼龙滤器上。将样品 (100μl)吸量到同时应用真空(例如，以1/3的最大真空水平使用Gast (Model；DOA-P104-AA)真空泵)的交替栅式方形物上。拆去滤器 并风干。然后按照本实施例前面所述，放置一系列滤器准备进行杂交。
杂交，化学发光成像和分析.按照制造商建议的方案(Boehringer Mannheim)，进行高度严格的杂交和清洗(Ausubel 1987，supra)，接 着与碱性磷酸酶：抗-洋地黄毒苷抗体偶联物(Genius；Boehringer Mannheim)结合，并与化学发光的碱性磷酸酶底物，CDP-Star(NEN) 培养，从而使结核分枝杆菌-特异性探针(洋地黄毒苷-标记的)与排 列的结核分枝杆菌结合。化学发光像是按照上面所述，利用基于不放 大的CCD照相机成像而获得的。按照前面本发明详述部分步骤6所 述，计算每个样品斑点中的不同物体数和积分强度。
将实验斑点中的靶数与阴性和阳性对照斑点进行比较，从而确定 在各种抗生素稀释物中出现的生长量。含有乙胺丁醇，异烟肼，和利 福平样品的细胞数分别降低了45，50，或25％，表明对已知抗生素 疗法的敏感性(Moore等，1999，supra)。
上述方法可以相同方式用于其它细菌。
通过非显微镜监测小菌落的原位生长而进行的快速敏感性试验.在含有 各种抗生素的培养基上生长的小菌落(例如，由2-1000个克隆相关细 胞组成的菌落)可用于评估菌株的抗生素敏感性分布。概念上，本方 法类似经典的平板扩散或琼脂稀释技术或最新的固定梯度法(例如， E-试验)。在所有这些方法中，都将细胞放在含有不同浓度的若干抗 生素的固体生长培养基中。为了确定菌株的抗生素敏感性分布，给在 各种抗生素上生长的细菌分离物评分。
本发明使用这种方法，可大大加速获得重要抗生素敏感性试验的 数据。例如，平板扩散敏感性试验可按照NCCLS(NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests；Approved Standard Seventh Edition M2-A7 Vol.20 No.1 Jan.2000)建议的进行。 然而，除了直接在琼脂平板上接种细菌外，还可将细菌平板接种在放 置于琼脂培养基平板上的尼龙滤器上。将含有各种抗生素的小滤器平 板(2.5mm直径)放在尼龙滤器上，使细菌生长大约5次双倍时间(速 生细菌通常为几小时)。然后将滤器连续放在(在每个Whatman 3MM 滤器上，室温5分钟)干燥滤器；用100％甲醇饱和的滤器；干燥滤 器；用碘化丙锭(在水中为10μg/μl)饱和的滤器；和干燥滤器中。使 用本实施例所用的不放大荧光成像器直接观察围绕在平板周围的各个 细胞。利用成像软件(Image-Pro Plus，4.1版本；Media cybernetics) 自动测量生长抑制区的直径，其过程与经典平板扩散抗生素敏感性试 验中，通过肉眼测量平板周围区域或晕轮的过程相似。可选择性地， 细胞可按照本实施例和其它实施例所述，使用病原体-特异性染色或具 有散射光，或荧光，或化学发光信号传递部分的类目结合分子成像。 快速的抗病毒敏感性试验。目前研制了很多新的抗病毒化合物。由于抗 性在HIV中的快速发展，抗病毒抗性的问题越来越突出。因此，敏感 性试验变得越来越重要。虽然越来越多地使用遗传型方法测定抗性， 但是通过检测核酸序列中的突变组合而评估药物抗性还是十分复杂， 常常不能正确地预测抗性。不幸的是，对病毒传代培养物进行的表型 敏感性试验很耗费时间。然而，使用与上面相对于结核分枝杆菌描述 的那些类似的，监测细胞培养物中病毒复制的方法，本发明可大大提 高病毒敏感性试验的周转时间。
实施例43.使用核酸探针检测性传播疾病的病原体                
实施例概述.本实施例利用本发明同时检测含有两种主要的性传播病原 体的尿液：砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌。有关本试验的更多重要性 可参考实施例31的概述。这些株的类目特异性序列是利用基因组扣 除(淋病奈瑟氏球菌)和基于计算机的虚拟扣除方法(砂眼衣原体) 分离的。类目特异性序列是用半抗原洋地黄毒苷(砂眼衣原体)或荧 光素(淋病奈瑟氏球菌)标记的，并与已经在滤器上浓缩并固定的固 定细胞杂交。密集信号传递部分，也称作共振光散射粒子(RLS粒子)， 用于检测并鉴定病原体。与抗-洋地黄毒苷抗体(红色-散射RLS粒子) 或抗-荧光素抗体(绿色-散射RLS粒子)偶联的RLS粒子与样品中的 病原体结合。由于信号传递部分的强度，病原体可通过对发光样品进 行简单目测而鉴定。红点表示砂眼衣原体感染，绿点信号表示淋病奈 瑟氏球菌感染。
利用虚拟扣除分离砂眼衣原体类目特异性序列.砂眼衣原体(Stephens 等，Science 282：754-9，1998)，肺炎衣原体(Kalman等，Nat Genet 21：385-9，1999)株中完全基因组序列的存在可使计算机能够测定不 同于其它基因组的一个基因组区。该过程也被称作虚拟扣除，与基因 组扣除实验相似。可在公共数据库中(NCBI； http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/-Genomes/bacbt/html)获得的基因 组序列是用软件处理的，该软件可排列并比较整个基因组(MUMmer； Delcher等，Nucleic Acids Res 27：2369-2376，1999)。MUMmer(使用 20bp的最小MUM长度参数)产生一个描述序列对比中所有缺口的详 细文件。这些缺口包括插入/缺失和高度多形区。使用程序Primer3 (S.Rozen等，1998，supra)，选择在砂眼衣原体，而不是在肺炎衣原 体中进行的用于扩增(-200-500bp)区的PCR引物。PCR引物是用图 43所示的二分结构设计的。其中一个引物具有与一个20bp引物连接 的XhoL引物序列，所述20bp的引物与砂眼衣原体中插入/缺失区的 “左”端(5’-XhoL-砂眼衣原体左引物-3’)相对应。另外一个引物 具有5’XhoR-砂眼衣原体右引物-3’结构，其中砂眼衣原体右引物是 一个20bp的引物，与相同插入/缺失区的“右”端相对应。使用这些 引物，虚拟扣除序列是在将细胞在EE缓冲液中沸腾5分钟后，从砂 眼衣原体细胞扩增的(在10μl EE中有105个细胞；是从ATCC获得 的)。扩增，按照实施例39所述，用洋地黄毒苷-dUTP标记产物，并 利用斑点印迹分析筛选类目特异性。
利用基因组扣除分离淋病奈瑟氏球菌类目特异性序列.在本实施例中， 潜在的淋病奈瑟氏球菌是按照实施例39所述，利用基因组扣除分离 的(Straus，1995，supra)。正基因组差异样品是由淋病奈瑟氏球菌基 因组DNA的Sau3a消化液组成的，负基因组差异序列是由剪切的脑 膜炎奈瑟氏球菌DNA组成的。淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌 (从ATCC获得)在适宜的培养基(ATCC；814GC培养基)中生长， 并用CTAB法制备(Ausubel 1987，supra)。按照实施例39所述克隆 扣除产物，标记，并筛选斑点印迹(含有各种奈瑟氏球菌的DNA)。 荧光素-标记的类目特异性序列是按照制造商建议的过程，使用荧光素 -12-dUTP(NEN Life Sciences；目录号NEL413)和引物XhoL和XhoR (见节略部分的序列)，通过扩增重组质粒而合成的。
汇集砂眼衣原体/淋病奈瑟氏球菌探针的混合物.洋地黄毒苷-标记的砂 眼衣原体类目特异性序列(n＝96)与荧光素标记的淋病奈瑟氏球菌类 目特异性序列(n＝96)结合(将等体积的扩增反应物混合在一起，每 个探针的终浓度约为250pg/μl)。
制备探针-特异性RLS信号传递部分.通过使由于密集的光散射而很容 易观察的RLS粒子与结合探针结合，可检测并鉴定各个病原体细胞。 两个不同类型的RLS粒子(按照US 6214560所述制备)用于差异标 记结合的砂眼衣原体探针和结合的淋病奈瑟氏球菌探针。红色散射 RLS粒子(160nm直径的金粒子)用于结合砂眼衣原体探针，而绿色 散射RLS粒子(60nm直径的金粒子)用于结合淋病奈瑟氏球菌探针。 对砂眼衣原体探针特异的红色散射粒子是按照先前所述(Hermanson， 1998，supra，和这里的参考文献)通过使抗-洋地黄毒苷抗体(Roche， 目录号1333 062)与粒子偶联而制备的。同样，对淋病奈瑟氏球菌 探针特异的绿色散射RLS粒子是通过使抗-荧光素抗体(Roche，目录 号1 426 320)与粒子偶联而制备的。以相等浓度(3.8×10-11M)混合 红色和绿色散射RLS:抗体偶联物。
制备进行原位杂交的尿液样品.使用市售试剂盒(B-D Urine Collection Kit(Becton-Dickinson))收集尿液样品(10ml)，通过黑色聚碳酸酯 薄膜(0.22μm；Osmonics)过滤，从而使可能存在的细菌浓缩。使细 菌DNA变性，并通过处理滤器使菌落转移(Ausubel 1987，supra)。 将含有样品的滤器连续放在用0.5M NaOH饱和的滤器(Whatman 3MM)(5分钟)；干燥滤器(5分钟)；用1M tris pH7.5饱和的滤器(5 分钟)；和干燥滤器(5分钟)上。
同样制备对照滤器。使10ml PBS中的砂眼衣原体(-1000个原体； ATCC)通过滤器过滤，并按照实验样品制备。同样收集GC培养基 (10ml)中的淋病奈瑟氏球菌(-1000个细胞)并在独立的滤器上制 备。最后，以相同方式制备在LB(10ml)中含有大肠埃希氏菌的阴 性对照滤器。
应注意，在可选择性的实施方案中，可使用其它底物替换尼龙滤 器(例如，载玻片，聚-赖氨酸处理过的载玻片，硅烷化载玻片，硝基 纤维素滤器等)。且，还可通过离心(例如，12,000Xg，1分钟)而 不是过滤浓缩尿液样品。可选择性地，可将体积较小的尿液样品(例 如，100μl)直接涂在底物上，然后固定并处理，从而产生基因组DNA。 使半抗原-标记的砂眼衣原体/淋病奈瑟氏球菌探针整体与过滤的尿液 样品和对照品结合。滤器是在1ml含有上述1：2稀释的探针整体混合物 的HYB溶液(见定义)中杂交的(每个探针的终浓度约为125ng/μl)。 反应在培养箱(Hybaid)中65℃进行4小时。在玻璃杂交瓶(Hybaid) 中的0.2XSSC(100ml；见定义)中清洗2次(每次20分钟)而除去 未结合的探针。
使探针-特异性RLS信号传递部分与探针-标记的病原体细胞结合.滤器 是室温(22℃)时，在轻微摇动(-60rpm)的旋转平台上的塑料盘 (RubberMaid)中的BB(封闭缓冲液；100ml；见定义)中培养而“封 闭的”。将1XBB(1ml)中的RLS粒子(200μl混合物)加入到密封 袋(Seal-A-Meal)中的滤器上，室温轻轻摇动培养1小时。室温轻轻 摇动在BB(100ml)中清洗2次，除去滤器中未结合的RLS：抗体偶 联物。观察前，将滤器在载玻片上风干。
目测鉴定样品中的病原体.将来源于CCD成像器(详述部分的步骤6 所述)中Xenon-弧光灯的光以倾斜于滤器平面的角度对准滤器。使用 对应于两类RLS粒子的激发和发射滤器处理两个像。通过评估对照滤 器而评估实验过程。砂眼衣原体对照滤器应有-1000个红点，淋病奈 瑟氏球菌滤器应有相似数目的绿点，阴性对照滤器(含大肠埃希氏菌) 不应有绿点或红点。最后，评估含有临床尿液样品中的细胞的滤器是 否存在砂眼衣原体(红点)，淋病奈瑟氏球菌(绿点)，混合感染(红 点和绿点)，或没有砂眼衣原体/淋病奈瑟氏球菌感染(与阴性对照相 比，缺少统计学上显著数目的斑点)。
其它相关应用.沿着与本实施例所述相同的路线，很容易发展很多相关 的、临床上很重要的诊断试验。可构造测试其它泌尿道病原体(例如， 大肠埃希氏菌)的试验。如果使用组合标记，那么这种试验可包括大 量病原体。使用利用棉签收集的样品对砂眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌 (以及生殖泌尿道的其它感染剂)进行检测，代表了重要的相关应用 (Isenberg，1992，supra)。例如，使用尿道(男性或女性)，子宫颈， 和阴道棉签收集的样品对于生殖泌尿道病原体的诊断很重要。在这些 实施例中，可将棉签上的样品直接涂在滤器或载玻片上。这种试验对 于诊断生殖泌尿道的重要病毒病原体也是很有价值的(例如，人乳头 瘤病毒，1型单纯疱疹病毒，和2型单纯疱疹病毒)，真菌(例如，念 珠菌)，和寄生虫(如，阴道毛滴虫)。本实施例中所用的方法(与适 当改进的样品收集技术联合)可用于很多不同类型的临床样品(例如， 外科手术伤口，血液，和呼吸道样品)。此外，与各种类型的类目结 合分子(例如，抗体，mRNA的探针)联合，类似方法可用于非病原 体分析物，包括疾病组织，血清蛋白，和毒素。
技术变化.除了上述样品收集和底物的改变之外，本发明还可插入其它 有效的技术变化。例如，可使用荧光团或荧光粒子标记的荧光类目特 异性抗体构造操作更简单的试验。这种试验可省略多个步骤(例如， 杂交)。可插入很多类型的信号传递部分(例如，荧光纳米粒，量子 点，和传统荧光团)，并用CCD照相机自动成像。如一些实施例所述， 除了限制-片段大小的类目特异性序列之外，还可使用标记的寡核苷 酸。本实施例的高生产率应用可插入微量滴定平板(例如，384-孔平 板)，其中每个孔含有不同的样品。结合步骤之后，可使用能够检测 光散射的CCD成像器或微量滴定平板阅读器使每个孔滤器上的标记 细胞成像。
其它实施方案                                           
本申请引用的所有专利，专利申请，和出版物都引入此处作为参 考。根据这里公开的本发明说明书和实施例，本发明的其它实施方案 对于本领域那些技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅仅用于举 例说明，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求来表示。适于这 里所述方法的其它实施方案的例子可在2002年9月6日提交的，名 称为“复制细胞的快速灵敏检测”的美国申请号＿＿＿＿，和2002 年9月6日提交的，名称为“分子的快速灵敏检测”的美国申请号＿ 中找到，这两篇文献也引入此处作为参考。
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