技术领域
[0001] 本
发明涉及使用串联飞行时间质谱仪测量碎片离子的质谱。
背景技术
[0002] 注：本文使用“道尔顿”(Da)单位，而非法定的“统一的
原子质量单位”(u)，Da单位在2006年添加到了“国际计量局”的上一版(第八版)的“国际单位制(SI)”文件，与原子质量单位处于同等地位。如该文件所述，这样做主要是为了允许使用千道尔顿和毫道尔顿等类似单位。
[0003] 质谱仪通常只能确定离子质量与离子电荷的比率。在下文中，术语“离子的质量”或“离子质量”也指离子的质量m与离子多余正或负元电荷数量z的比率，即质量-元电荷比(或简称质荷比)m/z。
[0004] 在将要通过引用包括在本文中的
专利文献DE 102013011462.4(C. )中，描述了具有一个或多个Cassini
反射器而非普通Mamyrin反射器的飞行时间质谱仪。在本公开中还对
现有技术进行了详细描述。
[0005] 术语“碎片离子质谱”或“子离子质谱”通常指所选离子种类的碎片离子的质谱，而被选择用来
破碎的离子种类通常称为“母离子”。
[0006] 在基质辅助激光
解吸电离(MALDI)的飞行时间质谱仪中，用于产生子离子的两种破碎类型(ISD破碎(“源内衰减”)和PSD破碎(“源后分解”))之间存在区别。为了通过PSD方式获得子离子质谱，可在MALDI过程中，将用于MALDI的激光脉冲的
能量增加到这样的程度，即产生很多亚稳态分析物离子并且这些离子仅在第一
加速区之后和反射器之前衰减为碎片离子(子离子)。还可通过在位于第一加速区和反射器之间的充气碰撞室中碰撞的方式产生不稳定母离子。在这两种情况下均必须选择用于获得子离子质谱的母离子。通常使用母离子选择器选择母离子，该选择器位于第一加速区之后和反射器之前，如果有碰撞室，也位于碰撞室之前。如果亚稳态母离子已经在第一加速区和母离子选择器之间分解，则在此处已经形成的碎片离子还可以穿过母离子选择器，这是因为它们与未分解的母离子具有基本相同的速度，因此与未分解的母离子同时到达母离子选择器。未分解的母离子和由所选母离子形成的子离子通常先穿过第二加速区，然后在反射器中被分离，并被测量作为子离子质谱。例如，在专利文献DE 198 56 014C2(C. 等人，对应于GB 2 344 454B和US 6,300,627B1)中描述了飞行时间质谱仪和获得PSD子离子质谱的相应方法。
[0007] 通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)获得子离子质谱要消耗相对较大的样本材料量。对于PSD破碎而言，激光脉冲的能量大幅增加(因而同时也增加了样本消耗)，以产生将在反射器之前的第一直线飞行路径中分解的大量亚稳态离子。此外，还可针对每个所选母离子种类获得单独的子离子质谱。显而易见，这存在一种缺点，那就是每次仅限于处理一种母离子种类，这就意味着很多其他离子种类被过滤掉并且未被使用，因此，如果要测量多个子离子质谱，则会消耗相对较大的样本量。另一个缺点是，必须顺序获得多个子离子质谱，这就需要更长的测量时间。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供在少量消耗样本的情况下快速获得碎片离子的飞行时间质谱的方法，尤其借助基质辅助激光解吸电离(MALDI)实现。
[0009] 本发明提供使用飞行时间质谱仪测量碎片离子质谱的方法，该飞行时间质谱仪包含离子源、飞行路径、反射器和离子检测器。
[0010] 根据本发明的第一方法的特征在于：(a)每次使用不同仪器参数获得至少两个混合飞行时间谱，其中混合飞行时间谱包含一个以上母离子种类的碎片离子的
信号，并且碎片离子在反射器之前的飞行路径中产生；和(b1)相互比较混合飞行时间谱，并识别源于一个母离子种类的碎片离子的信号；和/或(b2)在混合飞行时间谱中确定一个碎片离子种类的飞行时间，并由此计算碎片离子和相关母离子的质荷比。如果碎片离子和母离子的电荷已知，则可以确定“真正的”质量。被更改的仪器参数可以是，例如，飞行路径之前加速区的加速
电压，或者反射器处的减速电压，或者二者。
[0011] 如果一个或多个混合飞行时间谱还包含母离子的信号，则可通过比较混合飞行时间谱来将源自一个母离子种类的碎片离子的信号
指定给相应的母离子种类。可将已经确定源自一个母离子种类的碎片离子的信号与该母离子种类的信号或不与该母离子种类的信号一同转变为“分开的”纯碎片离子质谱。
[0012] 可通过在两个混合飞行时间谱中的每一个谱中选择一个源自相同碎片离子种类的信号，并确定作为下列等式的解的质荷比，以此来计算碎片离子和相关母离子的质荷比：
[0013] T1＝Sys(m/qm,M/qM,P1) (1)
[0014] T2＝Sys(m/qm,M/qM,P2) (2)
[0015] 其中，M和qM分别是母离子的质量和电荷；m和qm分别是碎片离子的质量和电荷；T1和T2是根据混合飞行时间谱确定的碎片离子种类的两个信号的飞行时间；P1和P2是被更改的用于获得飞行时间谱的仪器参数的值；以及Sys是飞行时间质谱仪的系统函数，其中碎片离子的飞行时间是仪器参数和碎片离子与相关母离子的质荷比的函数。
[0016] 计算碎片离子与相关母离子质荷比还可以包括在几个混合飞行时间谱中的每一个谱中选择一个源自相同碎片离子种类的信号，并确定作为回归方程Ti＝Sys(m/qm,M/qM,Pi)的参数的质荷比：其中，M和qM分别是母离子的质量和电荷；m和qm分别是碎片离子的质量和电荷；Ti是根据混合飞行时间谱确定的碎片离子种类的信号的飞行时间；以及Pi是用于获得飞行时间谱的仪器参数的值。飞行时间质谱仪的系统函数Sys给出了碎片离子的飞行时间是仪器参数和碎片离子与相关母离子的质荷比的函数。
[0017] 根据本发明的第二方法的特征在于：(a)获得一个混合飞行时间谱，该谱包含一个以上母离子种类的碎片离子的信号，其中碎片离子在反射器之前的飞行路径中产生；(b)选择一个碎片离子的同位素模式中的两个信号S1和S2，由混合飞行谱确定它们的飞行时间T1和T2；以及(c)作为下列等式的解来确定碎片离子与相关母离子的质荷比：
[0018] T1＝Sys(m/qm,M/qM) (3)
[0019] T2＝Sys((m+n·Da)/qm,(M+n·Da)/qM) (4)
[0020] 其中，M和qM分别是母离子的质量和电荷；m和qm分别是碎片离子的质量和电荷；所选同位素具有n道尔顿的质量差；以及Sys是飞行时间质谱仪的系统函数，其中碎片离子的飞行时间是碎片离子与相关母离子的质荷比的函数。如果碎片离子与相关母离子的电荷已知，则可以确定“真正的”质量m和M。在根据本发明的方法中，尽管在碎片离子生成时(尤其在亚稳态母离子分解时)要接收的分解能处于统计分布的方向上，但仍需要相对较长的飞行时间才能解析同位素模式。
[0021] 可从例如离子源和飞行路径之间或碎片离子形成或产生之前的无场飞行路径内的较大数量的离子种类中选择几种母离子种类。不需要选择单个母离子种类。
[0022] 在进入飞行路径前加速母离子，例如在离子源自身中加速，或在位于离子源和飞行路径之间的加速区中加速。离子的飞行时间通常从脉冲开启加速场开始。可通过分解亚稳态母离子在飞行路径中形成碎片离子，和/或在破碎池中由母离子产生碎片离子。母离子及其碎片离子飞到反射器的飞行时间最好相同，但是穿过反射器的飞行时间最好不同。反射器最好具有以二次方增加的减速电势，尤其是Cassini
离子阱的电势分布更要如此，以便于解耦离子在纵向和横向的振荡。在反射器之后，离子可以穿过第二加速区或第二飞行路径，第二加速区或第二飞行路径最好比反射器之前的飞行路径短，然后在离子检测器中检测离子。
[0023] 获得混合飞行时间谱可能意味着离子信号的质量不再沿着飞行时间轴单调增加，即，与其他母离子或第二重的母离子种类的碎片离子相比，第一母离子种类的碎片离子可能具有更长的飞行时间，因此飞行时间轴不能直接转换为质量轴。通过碎片离子的单个信号，不能确定其与电荷相关的质量或相关母离子与电荷相关的质量。
[0024] 如果飞行时间质谱仪的总飞行路径基本由反射器前的无场飞行路径组成，并且如果反射器具有以二次方增加的减速电势，则系统函数为：
[0025]
[0026] 其中，mp,d和qm分别是碎片离子的质量和电荷；Mp和qM分别是相关母离子的质量和电荷；UB是无场飞行路径之前加速区的加速电压；以及UC是反射器处的减速电压。可通过使用一种或多种已知物质进行标定来确定两个常数c1和c2。
[0027] 如果使用不同的加速电压UB1和UB2获得两个混合飞行时间谱，则可得到碎片离子飞行时间的下列等式：
[0028]
[0029]
[0030] 二次方减速电势与无场飞行路径结合非常有利，这是因为可轻松从两个测得的混合飞行时间谱中识别源自一种母离子种类的碎片离子。从这两个等式中可以看到，质量为Mp的母离子种类的所有质量为mp,d(其中d＝1、2、3…)的碎片离子(以及母离子本身)具有相同的飞行时间延迟ΔT＝T2-T1，这仅取决于母离子的质荷比Mp/qM和两个加速电压：
[0031]
[0032] 与第一混合飞行时间谱具有相同飞行时间延迟ΔT的第二混合飞行时间谱的所有信号被识别为均源自一个母离子种类。此处母离子种类的质量Mp可直接由飞行时间延迟和加速电压UB1和UB2确定。源自不同母离子种类的碎片离子的飞行时间延迟(ΔT(M1),ΔT(M2),…)也可通过第一和第二混合飞行时间谱之间的互相关来确定。源自一个母离子种类的子离子的信号可被识别为两个混合
频谱中在确定的飞行时间延迟之一处重叠的信号。此外，由于在两个混合飞行时间谱中保留了母离子种类的子离子顺序，因此可在均源自相同子离子种类的混合飞行时间谱中轻松找到两个信号S1和S2。
[0033] 还可以使用不同的加速电压UB1和UB2获得两个混合飞行时间谱，该谱中也包含母离子的信号。在第二混合飞行时间谱中，则可以识别与第一混合飞行时间谱具有相同飞行时间延迟ΔT的信号。将具有最长飞行时间的信号指定为母离子种类，将其他信号指定为源自该母离子种类的碎片离子。
[0034] 除了一个或多个混合飞行时间谱，最好还获得至少一个不含碎片离子的飞行时间谱，以便在混合飞行时间谱中直接识别还未分解或破碎的母离子，从而将其与子离子区别。还可在加速电压为UB1和UB2时额外获得两个飞行时间谱，该谱中仅包含母离子的信号。然后可将第二混合飞行时间谱中与第一混合飞行时间谱具有相同飞行时间延迟ΔT的信号指定为在额外获得的飞行时间谱中具有相同飞行时间延迟ΔT的母离子种类。
[0035] 最好使用通过基质辅助激光解吸电离(MALDI)产生离子的离子源。在这种情况下，MALDI离子源最好直接临接无场飞行路径。然后通常轴向加速来自MALDI离子源的离子，让其进入无场飞行路径。在MALDI离子源中，通过激光脉冲以高脉冲能量轰击样本，因此样本通常吸收很多内部能量，从而使产生的至少一部分离子为亚稳态，并在反射器之前的飞行路径中分解为碎片离子。此外，还可在低脉冲能量时获得飞行时间质谱以产生少量或不产生亚稳态母离子，该质谱仅包含质量为M1、M2、M3等可能是母离子的所有离子。
附图说明
[0036] 图1示出了具有MALDI离子源和Cassini反射器(20、21、22、23)的飞行时间质谱仪的简化示意图，通过该质谱仪获得具有几个母离子种类和多个碎片离子的混合飞行时间谱。
[0037] 图2示出了不同设计的Cassini反射器，利用其可产生Cassini反射器(20)的
电场。
[0038] 图3和图4示出了两个人工混合飞行时间谱(1、2)，这两个谱包含来自三个母离子种类(质量为800、900和1000道尔顿)及其碎片离子的信号。
[0039] 图5、图6和图7示出了来自图3和图4的混合飞行时间谱(1、2)的
叠加，其中每次将混合飞行时间谱(2)移动一定程度，使得在两个混合飞行时间谱中，三个母离子种类之一的信号彼此相对。
[0040] 图8示出了飞行时间质谱仪的简化示意图，该质谱仪
正交加速来自离子源(30)的离子束(31)。
具体实施方式
[0041] 本发明提供了在少量消耗样本的情况下快速获得子离子质谱的方法，其中，以每次可以使用数学几何关系来确定哪个碎片离子来自哪个母离子种类的方式，使用飞行时间质谱仪从大量母离子和碎片离子获得混合飞行时间谱。此飞行时间质谱仪包含离子源、飞行路径、反射器和离子检测器。飞行路径最好无场，且反射器最好具有以二次方增加的反射电势。
[0042] 图1示出了飞行时间质谱仪的简化示意图，该质谱仪包含MALDI离子源(10、11、12)，无场飞行路径(14)、Cassini反射器(20、21、22、23)和离子检测器(26)。
[0043] 样本盘(10)上有多种样本，每种都含有物质的混合物，使用紫外线脉冲(12)借助基质辅助激光解吸/电离(MALDI)来电离物质。使用紫外线脉冲(12)轰击样本盘可产生内部能量非常高的母离子(称为“亚稳态离子”)，至少部分母离子在加速
电极(11)后的无场飞行路径上分解为碎片离子。可在时间延迟下在MALDI离子源中加速离子，从而每次都使相同质量的离子时间聚集在入口(15)处(通过“延迟提取”聚集)。不同物质的部分亚稳态母离子沿无场飞行路径(14)分解；碎片离子与母离子的速度大约相同，因此同时进入Cassini反射器(20、21、22、23)。然而，母离子和碎片离子以不同的飞行时间沿不同的轨迹(16、17、18、19)穿过Cassini反射器(20、21、22、23)。碎片离子(16、17、18)的较低
动能意味着它们不能像母离子(19)一样深入穿透Cassini反射器，而较低的质量意味着它们能够以相应更快的速度穿过反射器(20、21、22、23)。但是，碎片离子和母离子在空间上均聚集到出口孔(24)上。母离子和碎片离子在加速区(25)(膜片堆叠)中在很短的时间内加速到高能(通常介于10和30keV之间)，并在离子检测器(26)中作为母离子和碎片离子的混合质谱被测量。
[0044] 母离子和碎片离子飞到Cassini反射器(20、21、22、23)的飞行时间相同，但以不同的飞行时间暂时聚集在Cassini反射器(20、21、22、23)中，这样离子检测器(26)就可测量包含几个种类的母离子及其碎片离子的“混合飞行时间谱”。
[0045] 所示出的是Cassini反射器(20、21、22、23)的横截面。离子轨迹位于两个内部电极(23)之间，因为电极位于绘图平面之外，因此用虚线表示。此处的Cassini反射器包含
外壳电极(20)、两个内部电极(23)和两个端接等势片(21、22)，如公开DE 102013011462A1所述。Cassini反射器(20、21、22、23)具有半个Cassini离子阱的电势分布，电势在轴向上精确地以二次方增加。等势片(21、22)具有曲线形状的电极，其形状与位于等势片处的Cassini离子阱的电势分布等势面相同。等势片(22)有两个用于注入和抛射离子的孔(15、24)，而Cassini反射器(20、21、22、23)的形状以及注入与抛射孔(15、24)
位置的设计最好能够让质量相同的离子在Cassini反射器(20、21、22、23)中经过奇数个横向半振荡。在图1中，离子在Cassini反射器(20、21、22、23)中经过了3/2个横向振荡。还可以制作更细长的Cassini反射器，该反射器在纵向上穿透抛物线电势更深。然后每半个纵向振荡，离子必须执行5/2、7/2或9/2个横向振荡，这增加了对质量m非常不同的碎片离子的接受度。
[0046] Cassini离子阱的电势分布Ψ(x，y，z)可以是，例如，下列形式的超对数场：
[0047]
[0048] 场的形状可通过常数ai、b和B改变。Uln、Uquad和Uoff是电势电压，Cln和Cquad是常数。外部腔室(20)的内表面和内部电极(23)的外表面是等势面Ψ(x，y，z)＝这一电势分布的常数。在横截面中，等势线形成围绕此处内部电极的近似Cassini椭圆；两个内部电极(23)产生二阶Cassini椭圆；n个内部电极产生n阶Cassini椭圆。对于偶数个内部电极，存在离子可以在至少一对内部电极之间的中心面附近横向振荡的
实施例。形状参数可用于设置纵向振荡周期和横向振荡周期之间的任何所选比率。
[0049] 此处最好使用Cassini反射器，这是因为它具有以二次方增加的减速电势(反射电势)，并且还能在两个横向上在空间上聚集离子。此外，在反射器中通过分解形成的碎片离子几乎已经完全被过滤掉。但原则上，可使用电势以二次方增加的任何反射器获得符合等式(5)的最优简单系统函数。但在这里还应当注意到的是，也可使用具有Mamyrin反射器的飞行时间质谱仪来获得根据本发明的混合飞行时间谱，但在使用不具有二次方减速电势的反射器时，系统函数与等式(5)不同，因此解相应的方程组可能更加复杂。
[0050] 图1中Cassini反射器的外部腔室(20)很难制造。而且，大体上闭合的Cassini反射器的内部也不容易抽成
真空。图2示出了设计不同但具有相同电场的Cassini反射器：此处图1中的外部腔室(20)由具有相同的带孔膜片(122)的堆叠取代。此处所示出的Cassini反射器为三维；在反射方向上切开，且仅示出了半个检测器。带孔膜片具有Cassini椭圆形式的内部开口。为了维持Cassini离子阱的电场，为带孔膜片(122)和等势片(120)的电极供应产生以二次方增加的场的合适电势。等势片(120)和(121)对应于图1中的等势片。不同质量m的碎片离子沿着轨迹(124)移动，这些轨迹延伸到反射器的不同深度。母离子沿更深地延伸到反射器中的轨迹(125)移动。本实施例具有几个优点：反射器更易于抽成真空、整体尺寸更小、制造更简单、成本更低。
[0051] 图3和图4示出了两个混合飞行时间谱(1、2)，它们是使用图1中的飞行时间质谱仪通过在MALDI离子源(10、11、12)中施加两个不同的加速电压U1和U2而获得。在两个混合飞行时间谱(1、2)中，用箭头标记母离子，它们的质量是800、900和1000道尔顿。对于每个母离子种类，都存在质量为100、200和300道尔顿的三种碎片离子，使用相关母离子种类的强度绘制每种碎片离子。横坐标表示飞行时间。
[0052] 母离子及其相关碎片离子在直线无场飞行路径(14)上的飞行时间相同，但是在Cassini反射器(20、21、22、23)中的飞行时间不同。如果在两个不同的加速电压U1和U2下获得两个混合飞行时间谱，则对于碎片离子来说，总飞行时间t1产生混合飞行时间谱1，总飞行时间t2产生混合飞行时间谱2：
[0053]
[0054]
[0055] 其中，Mp是母离子的质量(其中p＝1、2、…)，md是相关碎片离子的质量(其中d＝1、2、…)，qM和qm是其电荷，U1是MALDI离子源(10、11、12)中母离子的加速电压，以及UC是Cassini反射器(20、21、22、23)处的减速电压。可通过使用已知物质进行标定来确定两个常数c1和c2。对于MALDI离子，电荷qM和qm通常是各个质子的电荷。
[0056] 如果两个混合飞行时间谱(1、2)中的一个碎片离子种类的飞行时间t1和t2已知，则可确定相关母离子的质量Mp：
[0057]
[0058] 由此可确定碎片离子的质量md：
[0059]
[0060] 如果离子以相对较低的能量(例如以仅300
电子伏的能量)穿过图1中的Cassini反射器，则飞行时间较长，因而可产生相对较高的
分辨率，这就意味着，尽管碎片离子在分解时接收的分解能处于统计分布的方向上，但仍可为碎片离子解析同位素线。例如，使用图1中的飞行时间质谱仪获得单独的混合飞行时间谱，如果在该单独的混合飞行时间谱中解析碎片离子种类的13C信号和12C信号，则可得到母离子和碎片离子质量未知的下列两个等式：
[0061]
[0062]
[0063] 其中，mp,d和qm分别是子离子的质量和电荷；Mp和qM分别是相关母离子的质量和电荷；UB是MALDI离子源中母离子的加速电压；以及UC是反射器处的减速电压。可通过使用已知物质进行标定来确定两个常数c1和c2。可通过求方程组的解获得两个未知质量。根据本发明的该方法需要良好的飞行
时间分辨率，但不必使用不同的加速电压获得第二混合飞行时间谱。
[0064] 也可相互比较两个混合飞行时间谱(1)和(2)，以识别源自一个母离子种类的碎片离子的信号。例如，比较可以是几何形状的比较，或者借助互相关来实现。在两个混合飞行时间谱(1、2)中，母离子以及所有相关碎片离子延迟相同的飞行时间值t1-t2，这是因为在两个加速电压下，母离子及其碎片离子在Cassini反射器(20、21、22、23)中的飞行时间仍相同，只有在直线飞行路径(14)中的飞行时间不同。现在，能够轻松辨别哪个碎片离子源自哪个母离子，在图5、图6和图7中示出了图3中混合飞行时间谱(1)与图4中各自延迟的混合飞行时间谱(2)的三次叠加。将图4的混合飞行时间谱沿着飞行时间轴移动，直到具有800道尔顿质量的母离子或具有900道尔顿质量的母离子或具有1000道尔顿质量的母离子的位置彼此相对。
[0065] 在图5中，混合飞行时间谱(1)和(2a)中质量为800道尔顿的母离子重合；同时，这里还可轻松辨识出，这些母离子的所有碎片离子也相互重合(虚线箭头)，因此可轻松辨别相关碎片离子。以相同方式在图6和图7中比较混合飞行时间谱(1)和(2b)或(1)和(2c)时，还可识别质量为900和1000道尔顿的母离子的碎片离子。
[0066] 还可借助混合飞行时间谱(1)和(2)之间的互相关来确定用来移动图5到图7中混合飞行时间谱(2a、2b、2c)的三个延迟时间，此互相关在三个延迟时间的每一个时间处均具有局部最大值。可从混合飞行时间谱中选择均延迟了相应确定时间的那些信号来获得纯碎片离子谱。
[0067] 最好先使用低激光能量在没有碎片离子的情况下获得母离子的传统飞行时间谱。该谱包含质量为M1、M2、M3等可能是母离子的所有离子。如果在用于两个混合飞行时间谱(1)和(2)的两个加速电压下获得母离子的两个飞行时间谱，则可识别两个混合飞行时间谱(1)和(2)中的母离子。表示各自母离子及其碎片离子特性的时间延迟还可通过母离子的两个飞行时间谱的互相关来确定。如果母离子的飞行时间谱包含每个都可分解为碎片离子的太多母离子(例如超过50多个可能的母离子)，则可使用传统母离子分离器来选择母离子的质量范围(例如，质量范围介于1000和1500道尔顿之间)，以将母离子的数量限制为例如每个混合飞行时间谱中仅有15个母离子。可使用大约四到五个混合飞行时间谱，以这种方式确定所有50个左右子离子的质谱。因此，与之前使用的方法相比，样本消耗降低10倍。
[0068] 图8是示出飞行时间质谱仪的简化示意图，该质谱仪使用脉冲发生器(32)正交加速来自离子源(30)的离子束(31)。为清楚起见，此处在投影平面上绘制了离子源(30)和离子束(31)；但它们应该位于与投影平面成直
角的位置，以便产生能够通过与投影平面垂直的狭缝(15)进入Cassini反射器(20、21、22、23)的带状离子束(14)。脉冲束的母离子穿过破碎池(33)并在此处直接分解或在无场飞行路径(14)上分解为混合飞行时间谱的碎片离子。例如，破碎池(33)中的破碎可通过具有足够能量的
光子实现或通过在充气破碎池(33)中碰撞实现。
[0069] 本领域技术人员会发现基于根据本发明的离子反射装置非常容易开发更多相关实施例。本专利保护
申请也将涵盖此类从本发明衍生而出的应用。
