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神经干细胞的标记物

阅读:36发布:2020-08-20

专利汇可以提供神经干细胞的标记物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 申请 涉及用于基于标记物整联蛋白α10β1的表达检测并分离神经干细胞(NSC)或神经祖细胞(NPC)群体的方法;以及所述NSC或NPC群体用于CNS的 疾病 和损害的疗法、诊断和 预后 的用途。,下面是神经干细胞的标记物专利的具体信息内容。

1.包括由神经干细胞和/或神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的标记物作为针对哺乳动物神经干细胞和哺乳动物神经祖细胞的标记物的用途。
2.一种用于鉴定哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供包含神经组织的样品,
b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
d)根据c)中的评分鉴定该哺乳动物神经干细胞和/或该神经祖细胞。
3.一种用于分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供包含神经组织的样品,
b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
d)根据c)中的评分选择该哺乳动物神经干细胞和/或该哺乳动物神经祖细胞。
4.根据前述权利要求中任一项的方法或用途,其中该整联蛋白α10亚基在该哺乳动物神经干细胞和/或该神经祖细胞的细胞表面上表达。
5.根据前述权利要求中任一项的方法或用途,其中该整联蛋白α10亚基在哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞中在细胞内表达。
6.根据前述权利要求中任一项的方法或用途,其中该整联蛋白α10作为与整联蛋白β1亚基组合的异源二聚体表达。
7.根据前述权利要求中任一项的方法或用途,其还包括在b)的检测之前将该样品与特异性地结合整联蛋白α10亚基的抗体接触的步骤。
8.根据前述权利要求中任一项的方法或用途,其还包括检测选自以下的第二标记物的表达:巢蛋白、PSA-NCAM、GFAP、PDFGRα、SOX-2、CD133(凸素-1)、CD15、CD24、Musashi、EGFR、双皮质素(DCX)、Pax6、FABP7、LeX、波形蛋白和GLAST。
9.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该方法在体外进行。
10.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织包含神经干细胞和/或神经祖细胞。
11.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织获得自或衍生自脑组织。
12.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织是成体脑组织。
13.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织是胎儿脑组织。
14.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织衍生自室下区(SVZ)或颗粒细胞下层(SGZ)或脑膜。
15.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该神经组织选自人类、犬科动物、科动物、科动物、猫科动物、鼠、绵羊或猪神经组织。
16.根据前述权利要求中任一项的方法,其中对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过流式细胞术确定的。
17.根据前述权利要求中任一项的方法,其中对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过测量整联蛋白α10蛋白表达确定的。
18.根据前述权利要求中任一项的方法,其中对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过测量整联蛋白α10mRNA表达确定的。
19.根据前述权利要求中任一项的方法,其中对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过选自免疫测定、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光、和蛋白质印迹的方法确定的。
20.根据前述权利要求中任一项的方法,其中用于检测细胞对整联蛋白α10亚基的表达的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或其片段
21.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体是单克隆抗体。
22.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体是非人类抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或人类抗体。
23.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体共价结合到可检测部分,诸如选自荧光团、酶或放射性示踪剂或放射性同位素的可检测部分。
24.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体具有选自IgA、IgD、IgG和IgM的同种型。
25.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体是:a)单克隆抗体,其通过以登录号DSM ACC2583在德国生物和细胞培养物保藏中心处保藏的杂交瘤细胞系产生;或b)竞争结合到与通过以登录号DSM ACC2583在德国微生物和细胞培养物保藏中心处保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合的表位相同的表位的抗体;或
c)a)或b)的片段,其中所述片段能够特异性地结合到该整联蛋白α10亚基链的细胞外I结构域。
26.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体附接到固体支持物。
27.根据前述权利要求中任一项的方法,其中将该抗体用一种或多种荧光团标记。
28.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该荧光团是藻红蛋白、别藻蓝蛋白、荧光素、德克萨斯红、或Alexa Fluor 647、亮色染料。
29.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该抗体还包含适用于检测的部分。
30.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该适用于检测的部分选自纳米颗粒、和放射性同位素。
31.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该纳米颗粒选自胶团、非弹性壳、纳米管状颗粒、脂质体、金纳米颗粒以及聚合物
32.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该放射性同位素选自β-发射体、俄歇-发射体、转换电子发射体、α-发射体、以及低光子能量发射体。
33.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该可检测部分包括顺磁性同位素或由其组成。
157 55 162 52
34.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该顺磁性同位素选自 Gd、Mn、 Dy、Cr和56Fe。
35.根据前述权利要求中任一项的方法,其中该可检测部分是通过成像技术诸如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像可检测的。
36.一种用于确定测试化合物是否调节体外哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞分化的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供表达整联蛋白α10亚基或具有表达整联蛋白α10亚基的能的神经干细胞和/或神经祖细胞,
b)将该神经干细胞和/或该神经祖细胞与测试化合物接触,并且
c)检测该神经干细胞和/或该神经祖细胞的分化速率或分化模式的变化作为该测试化合物调节神经干细胞和/或神经祖细胞分化的指示,
其中该分化速率或分化模式是通过根据权利要求2至35中任一项的方法检测该细胞对整联蛋白α10的表达来确定的。
37.一种用于制造相对于参考群体富集神经干细胞和/或神经祖细胞的体外哺乳动物细胞的分离群体的方法,该方法包括以下步骤:
a)至少提供包含神经干细胞和/或神经祖细胞的细胞群体的一部分或参考群体的一部分,
b)将鉴定由该神经干细胞和/或该神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的化合物引入到以上a)中的细胞群体中,
c)从以上步骤b)中的细胞群体选择并分离、或分离并选择、或分离、或选择该神经干细胞和/或该神经祖细胞,
从而产生富集神经干细胞和/或神经祖细胞的细胞群体。
38.根据权利要求37的方法,其中该神经干细胞和/或该神经祖细胞是通过根据权利要求2至35中任一项定义的方法鉴定和/或分离的。
39.根据权利要求37和38中任一项的方法,其中步骤c)中的选择是通过荧光细胞分选或磁珠分选进行的。
40.一种表达整联蛋白α10亚基的未分化哺乳动物细胞的体外细胞培养物,
其中该细胞衍生自神经组织并且其中
a)该培养物中的细胞当在基本上不含如在(b)中定义的血清和增殖诱导生长因子两者的培养基中分化时,具有分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞的能力,以产生至少10%神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞的细胞培养物;
b)该细胞培养物在含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基中分裂;
c)在撤出该血清替代物和该增殖诱导生长因子两者后,该培养物中的细胞分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞。
41.一种体外细胞培养物,其包含:
a)含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基;以及
b)衍生自哺乳动物的中枢神经系统的未分化哺乳动物细胞,其中至少10%、优选地至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少
70%、优选地至少80%、优选地至少90%的该细胞表达整联蛋白α10亚基。
42.一种表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物未分化细胞的悬浮培养物,其中所述细胞基本上形成为细胞聚集体,并且其中该细胞聚集体被维持在含有增殖诱导生长因子的培养基中。
43.一种通过根据权利要求3至28中任一项的方法可获得的细胞培养物。
44.根据权利要求40至42中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该整联蛋白α10作为与整联蛋白β1链组合的异源二聚体表达。
45.根据权利要求40至44中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该整联蛋白α10亚基在该未分化哺乳动物细胞的细胞表面上表达。
46.根据权利要求40至45中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该整联蛋白α10亚基在该未分化哺乳动物细胞中在细胞内表达。
47.根据权利要求40至46中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中至少10%、优选地至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少70%、优选地至少80%、优选地至少90%的该未分化哺乳动物细胞是表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞。
48.根据权利要求40至47中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该未分化哺乳动物细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
49.根据权利要求40至48中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞的一部分还表达选自以下的至少一种标记物:巢蛋白、PSA-NCAM、GFAP、SOX2、PDGFRα、CD133、CD15、CD24、Musashi、EGFR、双皮质素(DCX)、Pax6、FABP7和GLAST。
50.根据权利要求40至49中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该至少一种增殖诱导生长因子选自表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子α(TGF-α)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、PDGFα或其组合。
51.根据权利要求40至50中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞获得自或衍生自哺乳动物脑的室下区(SVZ)或颗粒细胞下层(SGZ)或脑膜。
52.根据权利要求40至51中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞是鼠细胞。
53.根据权利要求40至52中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞是人类细胞。
54.根据权利要求40至53中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞衍生自人类胎儿或人类成体神经干细胞和/或神经祖细胞。
55.根据权利要求40至54中任一项的细胞培养物或悬浮培养物,其中该培养物中的细胞不衍生自人类胚胎细胞或人类胚胎。
56.一种在有需要的受试者中治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害的方法,该方法包括:
a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
57.一种在有需要的受试者中治疗精神和行为障碍的方法,该方法包括:
a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,从而治疗具有精神症状的神经障碍。
58.一种在有需要的受试者中治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害的方法,该方法包括:
a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α
10亚基;
b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
59.一种在有需要的受试者中治疗精神或行为障碍的方法,该方法包括:
a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α
10亚基;
b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗具有精神症状的神经障碍。
60.根据权利要求58和59中任一项的方法,其中该哺乳动物间充质干细胞从以下分离:
骨髓或脂肪组织或脐带血或华顿氏胶或牙髓或脊髓组织或血液或或羊膜或子宫内膜或肢芽或唾腺或皮肤或包皮或滑膜。
61.一种用于确定有需要的患者中CNS的受损或患病区域的特征的体外方法,该方法包括以下步骤:
a)向受试者给予抗整联蛋白α10亚基,
b)检测该受试者的CNS的受损或患病区域中整联蛋白α10亚基的表达,
c)确定该CNS的受损或患病区域的特征诸如位置和大小。
62.根据权利要求61的方法,其中该神经组织包含神经干细胞和/或神经祖细胞。
63.根据权利要求61的方法,其中该特征用于预测中之后CNS组织的再生程度。
64.根据权利要求61至63中任一项的方法,其中整联蛋白α10亚基的高表达值对应于低的改良Rankin量表(mRS)值。
65.根据权利要求61至64中任一项的方法,其中该整联蛋白α10亚基用于生物标记物组中。
66.一种针对哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的标记物,其包括由该神经干细胞和/或该神经祖细胞表达的整联蛋白α10链亚基,该标记物用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害和/或治疗精神和行为障碍、或诊断和/或表征该疾病或损害的方法中使用。
67.一种包含表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的分离群体的组合物,其用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或精神和行为障碍的方法中使用。
68.根据权利要求56至67中任一项的方法、标记物或组合物,其中该整联蛋白α10作为与整联蛋白β1链组合的异源二聚体表达。
69.根据权利要求56至68中任一项的方法、标记物或组合物,其中该整联蛋白α10亚基在该哺乳动物神经干细胞和/或该神经祖细胞的细胞表面上表达。
70.根据权利要求56至69中任一项的方法、标记物或组合物,其中该整联蛋白α10亚基在哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞中在细胞内表达。
71.根据权利要求56至70中任一项的方法、标记物或组合物,其中该细胞群体富集表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞。
72.根据权利要求56至71中任一项的方法、标记物或组合物,其中神经系统的疾病或损害是中枢或外周神经系统损伤或神经变性疾病。
73.根据权利要求56至72中任一项的方法、标记物或组合物,其中该神经系统损伤选自脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)、外周神经损伤、中风和脑癌。
74.根据权利要求56至73中任一项的方法、标记物或组合物,其中该神经系统损伤是中风。
75.根据权利要求56至73中任一项的方法、标记物或组合物,其中该神经变性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病(HD)、多发性硬化症(MS)以及多系统萎缩症。
76.根据权利要求56至73中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该精神或行为障碍选自雷特综合征、精神分裂症抑郁症、孤独症谱系障碍(ASD)以及双相型障碍(BPD)。
77.根据权利要求56至73中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中所述神经干细胞是使用如权利要求2至55中任一项定义的方法分离的,或者其中所述神经干细胞是如权利要求2至55中任一项定义的。
78.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该神经干细胞是同种异体神经干细胞。
79.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该神经干细胞是自体神经干细胞。
80.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该神经祖细胞是同种异体神经祖细胞。
81.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该神经祖细胞是自体神经祖细胞。
82.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该间充质干细胞是同种异体间充质干细胞。
83.根据前述权利要求中任一项的方法、用于使用的标记物、或组合物,其中该间充质干细胞是自体间充质干细胞。

说明书全文

神经干细胞的标记物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于鉴定和分离哺乳动物神经干细胞和神经祖细胞的标记物以及其用于制备神经干细胞和神经祖细胞的富集细胞群体的用途。本发明还涉及神经干细胞、神经祖细胞和间充质干细胞用于治疗神经系统的疾病和损害以及预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害的用途。此外,本发明涉及使用该标记物检测并诊断损害并且作为预后标记物。
[0002] 发明背景
[0003] 构成神经系统(脑、脊髓和外周神经)的复杂易损结构易于受各种类型的损伤的影响,该损伤的范围是导致进行性退化的创伤到神经变性疾病。不幸的是,在损伤之后发生非常少的自发再生、修复或愈合。因此,脑损害、由于脊髓损伤导致的瘫痪和外周神经损害往往是永久性的且导致丧失能的。患有严重神经系统损伤或中的患者往往需要持续终身的辅助。中风是死亡和成人残疾的最常见诱因,尤其是在高度发达国家。然而,治疗选项目前为止非常受限。因此,需要创新性的新策略来改进神经性损伤和中风的治疗。
[0004] 神经干细胞(NSC)是中枢神经系统(CNS)中的细胞,其具有增殖、自我更新和生成神经元和神经胶质两者的大量祖细胞的能力。在成体神经发生的过程中,NSC经历多个阶段,包括NSC自我更新,瞬时扩增祖细胞、成神经细胞、和终末成熟神经元、星形胶质细胞、以及少突胶质细胞(Gage F.H.和Temple S.,2013)。NSC已经在胚胎小鼠、大鼠和人类CNS的几乎所有区域中被鉴定到。在成体CNS中,已经显示神经干细胞和神经祖细胞有助于特化干细胞环境中的神经发生。因此,NSC可用于在疾病和损害之后神经组织的再生。
[0005] 神经干细胞(NSC)和祖细胞(NPC)能够形成中枢神经系统的所有主要细胞类型,从而使得它们成为用于脑损伤和神经变性障碍的基于细胞的疗法的候选物。然而,两个原因阻碍了细胞疗法用于临床应用的开发。一个是难以从人类组织分离NSC并以足够的量扩增细胞以用于疗法。另一个是不能从更多分化细胞类型和其他污染细胞纯化NSC。因此,神经干细胞/神经祖细胞(NSC)的特异性细胞标记物对于针对治疗性应用鉴定、分离和选择人类NSC是至关重要的。
[0006] 多年来已经使用若干标记物来鉴定不同的细胞类型和分化阶段:
[0007] Sox2(SRY box 2)(转录因子的Sox家族的成员)和巢蛋白(细胞内丝状蛋白)被频繁地用作胚胎和成体脑两者中的NSC的标记物。然而,因为两种标记物存在于细胞内,所以它们不能容易地用于分离和选择功能性NSC。
[0008] PSA-NCAM(聚唾液酸化神经细胞粘附分子)在脑发育过程中在神经祖细胞中高度表达。然而,它也存在于分化神经细胞中(Kim HS等人2014; J等人2016)。
[0009] GFAP,神经胶质原纤维酸性蛋白(一种中间体丝状蛋白),存在于神经祖细胞上,但是在成熟星形胶质细胞中也主要被视为主要的中间体丝状蛋白(Zhang QB等人2006)。
[0010] CD133(凸素-1)存在于不同类型的干细胞(包括NSC)中,但是也在分化细胞上表达(Kania G,Corbeil D,Fuchs J等人2005;Zhang QB等人2006)。
[0011] PDGFR-α遍布成体CNS存在,并且沿心室壁均匀分布(Chojnacki等人2011)。在成体室下区(SVZ)内,发现PDGFR-α标记特定细胞群体,该细胞群体是B型神经干细胞(Jackson等人2006)并且主要生成少突胶质细胞(Chojnacki等人2011)。研究表明,PDGFR-α调节神经元产生与少突胶质细胞产生之间的平衡(Farahani和Xaymardan 2015)。因此,PDGFR-α由一些分化神经细胞表达,但是主要存在于少突胶质细胞祖细胞上。
[0012] 推定Musashi-1(Msi-1)(一种RNA结合蛋白)在CNS干细胞和祖细胞中表达,在这些细胞中,它调节增殖和维持(对于综述,参见MacNicol等人2008)。然而,它定位在细胞的胞质和核中,即在细胞内,并且因此可以容易地用于分离和选择功能性NSC。
[0013] CD24是存在于免疫细胞和CNS细胞上的细胞粘附分子。在脑中,CD24存在于年轻成体小鼠中的神经区域内并且与PSA-NCAM共定位,因此被识别为成神经细胞(A型NSC)标记物(Calaora等人1996)。它已经用于通过流式细胞术从小鼠脑分离NSC(Rietze等人2001;Panchision等人2009),并且与其他细胞表面标记物(诸如CD15和CD29)组合用于富集神经元培养物(Pruszak等人2009)。然而,因为CD24的平在神经元细胞成熟时增加,所以它也被认为是早期神经元分化的标记物(Pruszak等人2009)。
[0014] LeX(还被称为SSEA-1或CD15)是在成体CNS中的心室衬里分布的不成熟神经上皮细胞和分化有丝分裂后神经元的标记物(Calaora等人1996;Capela和Temple,2002)。虽然其表达与GFAP重叠,但是来自SVZ的仅很少(4%)的分离细胞是LeX阳性的。在细胞外环境中LeX被SVZ细胞脱落的事实可以解释如此低水平的游离LeX。此外,LeX被成体小鼠SVZ的B型和C型细胞表达,但是不被A型(成神经细胞)细胞表达(Capela和Temple,2006)。
[0015] 波形蛋白是在早期脑发育过程中主要由放射状胶质细胞和不成熟星形胶质细胞表达的主要中间体丝状蛋白中的一种。
[0016] β-III微管蛋白或Tuj1是不成熟神经元的细胞内丝状物标记物。它在轴突引导和维护中有所涉及。
[0017] 最后,已经提出整联蛋白家族的一些成员作为人类神经干细胞的标记物,包括由12种不同的整联蛋白组成的β1亚家族的一些整联蛋白,其中不同的α亚基与整联蛋白β1组合以形成具有不同功能的独特受体。整联蛋白β1已经用于从胎儿脑组织选择NSC,然而,基于β1亚基进行的选择不是特异性的,因为β1亚家族中的整联蛋白存在于包括分化细胞的大部分细胞上。还不清楚NSC上的哪种α整联蛋白与β1配偶。已经在NSC上检测到全部α2、α3、α
5、α6和α7的表达(Flanagan等人,2006),但是这些整联蛋白也存在于各种细胞类型上。Hall PE等人(2006)提出使用二聚体整联蛋白α6β1作为人类NSC的可能标记物。此整联蛋白是血管层粘连蛋白的受体,并且已知在血小板粘附、活化和动脉血栓形成中发挥作用。
[0018] 总之,存在对于适用于鉴定和分离神经干细胞和神经祖细胞的特异性标记物的未满足的需要。
[0019] 发明概述
[0020] 整联蛋白α10β1是存在于软骨细胞上的II型胶原蛋白结合受体(Camper等人,1998)。整联蛋白α10β1是软骨细胞上的在软骨中高度表达的主要胶原蛋白结合整联蛋白,在发育过程中和在成体组织中均是如此(Camper等人,2001)。整联蛋白α10β1也由间充质干细胞(MSC)表达(Varas等人,2007)。此外,还示出,成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)上调整联蛋白α10β1的表达并且改善MSC的软骨形成潜力(Varas等人,2007)。Bengtsson等人(2005)证明,缺乏整联蛋白α10β1的小鼠具有软骨生长板的缺陷,并且因此造成长骨的生长迟缓。
最近的研究揭示,犬科动物α10整联蛋白基因中的天然存在的突变在猎犬品种中是软骨发育异常的原因( 等人,2013),从而在骨骼发育中对于α10β1发挥重要作用。
[0021] 诸位发明人出人意料地在衍生自神经组织的神经干细胞和神经祖细胞上检测到整联蛋白异源二聚体α10β1的表达,并且在此公开其作为用于鉴定和分离哺乳动物神经干细胞和神经祖细胞的选择性标记物的用途。相比于以上提及的NSC表面标记物,整联蛋白α10β1存在于成体小鼠SVZ干细胞环境的全部三种NSC/NPC细胞类型上(参见以下表1),如共定位研究所示(图3、6、7、8、9、10、11和12),从而表明与其他已知的标记物相比,整联蛋白α
10β1是更广泛的干细胞和祖细胞标记物,覆盖脑干细胞环境的不同亚型。
[0022] 表1.通过NSC表面标记物鉴定的成体小鼠SVZ的细胞类型。A型:成神经细胞,其产生成熟神经元;B型:干细胞,星形胶质细胞-与一层室管膜细胞(E细胞)相邻;C型:短暂扩增细胞。
[0023]
[0024] 本公开文本的一个方面涉及包括由神经干细胞和/或神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的标记物作为针对哺乳动物神经干细胞和哺乳动物神经祖细胞的标记物的用途。
[0025] 本公开文本的另一个方面涉及一种用于鉴定哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法,该方法包括以下步骤:
[0026] a)提供包含神经组织例如神经细胞的样品,
[0027] b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
[0028] c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
[0029] d)根据c)中的评分鉴定该哺乳动物神经干细胞和/或该神经祖细胞。
[0030] 本公开文本的另一个方面涉及一种用于分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法,该方法包括以下步骤:
[0031] a)提供包含神经组织的样品,
[0032] b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
[0033] c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
[0034] d)根据c)中的评分选择该哺乳动物神经干细胞和/或该哺乳动物神经祖细胞。
[0035] 本公开文本的另一个方面涉及一种用于确定测试化合物是否调节体外哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞分化的方法,该方法包括以下步骤:
[0036] a)提供表达整联蛋白α10亚基的神经干细胞和/或神经祖细胞,
[0037] b)将该神经干细胞和/或该神经祖细胞与测试化合物接触,并且
[0038] c)检测该神经干细胞和/或该神经祖细胞的分化速率或分化模式的变化作为该测试化合物调节神经干细胞和/或神经祖细胞分化的指示,
[0039] 其中分化速率或分化模式是通过根据在此所述的方法检测细胞对整联蛋白α10的表达来确定的。
[0040] 本公开文本的另一个方面涉及一种用于制造相对于参考群体富集神经干细胞和/或神经祖细胞的体外哺乳动物细胞的分离群体的方法,该方法包括以下步骤:
[0041] a)至少提供包含神经干细胞和/或神经祖细胞的来自CNS的细胞群体的一部分或参考群体的一部分,
[0042] b)将鉴定由该神经干细胞和/或该神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的化合物引入到以上a)中的细胞群体中,
[0043] c)从以上b)中的细胞群体选择和分离神经干细胞和/或神经祖细胞,
[0044] 从而产生富集神经干细胞和/或神经祖细胞的细胞群体。
[0045] 本公开文本的另一个方面涉及一种表达整联蛋白α10亚基的未分化哺乳动物细胞的体外细胞培养物,其中该细胞衍生自神经组织并且其中
[0046] a)培养物中的细胞当在基本上不含血清和增殖诱导生长因子两者的培养基中分化时,具有分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞的能力;
[0047] b)培养物中的细胞在含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基中增殖;
[0048] c)在撤出血清替代物B27和增殖诱导生长因子两者后,培养物中的细胞分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞。
[0049] 本公开文本的另一个方面涉及一种体外细胞培养物,其包含
[0050] a)含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基;以及[0051] b)衍生自哺乳动物的中枢神经系统的未分化哺乳动物细胞,其中至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%、例如至少95%的细胞表达整联蛋白α10亚基。
[0052] 本公开文本的另一个方面涉及一种表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物未分化细胞的悬浮培养物,其中所述细胞基本上形成为细胞聚集体,并且其中该细胞聚集体被维持在含有增殖诱导生长因子的培养基中。
[0053] 本公开文本的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗神经系统的疾病或损害和/或预防CNS损害并保护CNS免受损害的方法,该方法包括:
[0054] a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0055] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,
[0056] 从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
[0057] 本公开文本的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗精神和行为障碍的方法,该方法包括:
[0058] a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0059] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,
[0060] 从而治疗具有精神症状的神经障碍。
[0061] 本公开文本的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害的方法,该方法包括:
[0062] a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0063] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
[0064] 本公开文本的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中治疗精神和行为障碍的方法,该方法包括:
[0065] a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0066] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗具有精神症状的神经障碍。
[0067] 本公开文本的另一个方面涉及一种针对哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的标记物,其包括由神经干细胞和/或神经祖细胞表达的整联蛋白α10链亚基,该标记物用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害和/或治疗精神和行为障碍的方法中使用。
[0068] 本公开文本的另一个方面涉及一种包含表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的分离群体的组合物,其用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或精神和行为障碍的方法中使用。附图说明
[0069] 图1.整联蛋白α10β1由从成体小鼠脑的室下区分离的细胞的亚群表达。
[0070] 该图示出了在从成体小鼠脑的室下区分离的细胞上整联蛋白α10β1的表达,如通过流式细胞术所评估的。未染色细胞的分析(A)。随后分析了用针对整联蛋白α10亚基的单克隆抗体(B)和对照小鼠IgG2a抗体(C)染色的细胞和阳性细胞的百分比。结果显示分离细胞的亚群表达整联蛋白α10β1。
[0071] 图2.整联蛋白α10β1由从室下区分离并且作为神经球或作为单层培养的细胞的亚群表达。
[0072] 该图示出了由作为单层(A-D)和神经球(E-H)培养的细胞进行的整联蛋白α10β1、PDFGRα、Lex和CD24的表达,如通过流式细胞术所评估的。通过流式细胞术分析用针对整联蛋白α10亚基的单克隆抗体(A,E)、针对PDFGRα的单克隆抗体(B,F)、针对CD24的抗体(C,G)和针对Lex的抗体(D,H)染色的细胞和阳性细胞的百分比。结果显示以单层或作为神经球培养的细胞的亚群表达整联蛋白α10β1、PDGFRα、Lex和CD24。
[0073] 图3.神经球表达整联蛋白α10β1和其他神经干细胞/祖细胞干细胞标记物。
[0074] 该图示出了从小鼠的SVZ分离并且针对整联蛋白α10β1和其他神经干细胞/祖细胞标记物免疫染色的神经球中的细胞的双重免疫标记。对染色进行可视化并且通过共聚焦显微镜法获取图像。完整神经球显示α10和神经干细胞/祖细胞标记物巢蛋白(A)、PDGFRα(B)、GFAP(C)、PSA-NCAM(D)、波形蛋白(E)两者的表达。与体内SVZ的细胞组成一致(Doetsch等人1997),体外神经球也显示低丰度的C型细胞,如通过Olig2染色(F)所证明的。
[0075] 图4.从SVZ分离并在干细胞条件下培养的神经干细胞/祖细胞保留其分化为神经元细胞和神经胶质细胞的潜力。神经干细胞/祖细胞进行分化并且测量神经元基因(Map2,β-III Tub)和神经胶质基因(Gfap,O4)的表达。Gapdh用作进行归一化的管家基因。基因表达表示为一式三份样品的平均值±平均值标准偏差(SEM)。
[0076] 图5.整联蛋白α10β1由成体小鼠脑的室下区(SVZ)的细胞表达。
[0077] 该图示出了成体小鼠组织的SVZ中整联蛋白α10β1的表达,如通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜法所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(A)和使细胞核DNA可视化的DAPI(B)对脑组织进行染色。A和B的复合图像在C中示出。
[0078] 图6.整联蛋白α10β1和神经干细胞/祖细胞标记物巢蛋白部分共定位在成体小鼠脑的室下区(SVZ)中。
[0079] 该图示出了成体小鼠组织的SVZ中整联蛋白α10β1和巢蛋白的表达,如通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜法所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(A)、针对巢蛋白的小鼠单克隆抗体(B)和使细胞核DNA可视化的DAPI(C)对脑组织进行染色。
[0080] 图7.整联蛋白α10β1和成神经细胞标记物PSA-NCAM部分共定位在成体小鼠脑的室下区(SVZ)中的细胞上。
[0081] 该图示出了成体小鼠脑组织的SVZ中整联蛋白α10β1和PSA-NCAM的表达,如通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜法所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(C)、针对PSA-NCAM的小鼠单克隆抗体(B)和使细胞核DNA可视化的DAPI(A)对脑组织进行染色。A、B和C的复合图像在D中示出。
[0082] 图8.整联蛋白α10β1和神经胶质细胞标记物GFAP部分共定位在成体小鼠脑中的室下区(SVZ)中的细胞上。
[0083] 该图示出了成体小鼠脑组织的SVZ中整联蛋白α10β1和GFAP的表达,如通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜法所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(A)、针对GFAP的山羊多克隆抗体(B)对脑组织进行染色。A和B的复合图像在C中示出。
[0084] 图9.整联蛋白α10β1和神经干细胞标记物SOX2部分共定位在新生小鼠脑中的室下区(SVZ)中的细胞上。
[0085] 该图示出了新生小鼠脑组织的SVZ中整联蛋白α10β1和神经干细胞标记物SOX2的表达,如通过免疫荧光染色和落射荧光显微镜法所评估的。用使细胞核DNA可视化的DAPI(A)、针对SOX2的小鼠单克隆抗体(B)和针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(C)对脑组织进行染色。A、B和C的复合图像在D中示出。
[0086] 图10.整联蛋白α10β1和PDFGRα共定位在从成体小鼠脑中的室下区分离的细胞的亚群上。
[0087] 该图示出了由从成体小鼠脑的室下区分离的细胞上进行的整联蛋白α10β1和PDFGRα的表达,如通过流式细胞术所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的单克隆抗体(A)和用针对PDFGRα的单克隆抗体(B)对细胞进行染色,并且分析阳性细胞的百分比。流式细胞术分析证明分离细胞的亚群表达整联蛋白α10β1和PDFGRα两者(C)。
[0088] 图11.整联蛋白α10β1在新生小鼠脑中的海体的颗粒细胞下层(SGZ)中表达,并且与神经干细胞标记物SOX2部分共定位。
[0089] 该图示出了新生小鼠脑组织中的SGZ中整联蛋白α10β1和神经干细胞标记物SOX2的表达,如通过免疫荧光染色和落射荧光显微镜法所评估的。用使细胞核DNA可视化的DAPI(A)、针对SOX2的小鼠单克隆抗体(B)和针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(C)对脑组织进行染色。A、B和C的复合图像在D中示出。
[0090] 图12.整联蛋白α10β1在新生小鼠脑的脑膜中表达并且与PDGFRα(神经胶质细胞/少突胶质细胞祖细胞的标记物)共定位。
[0091] 该图示出了新生小鼠脑组织的脑膜中整联蛋白α10β1和PDGFRα的表达,如通过免疫荧光染色和落射荧光显微镜法所评估的。用使细胞核DNA可视化的DAPI(A)、针对PDGFRα的山羊多克隆抗体(B)和针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体(C)对脑组织进行染色。A、B和C的复合图像在D中示出。
[0092] 图13.在中风之后的小鼠脑中整联蛋白α10β1上调。
[0093] 该图示出了在小鼠脑中的中风区域中相对于在完整区域中而言整联蛋白α10β1的更高表达,如通过免疫荧光染色和落射荧光显微镜法所评估的。中风区域是虚线右边的区域。
[0094] 图14.整联蛋白α10β1、神经元标记物NeuN、和星形胶质细胞标记物GFAP的表达。
[0095] 该图示出了小鼠脑中整联蛋白α10β1、NeuN、GFAP和Iba1的表达,如通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜法所评估的。用针对整联蛋白α10亚基的兔多克隆抗体、针对NeuN的豚鼠多克隆抗体和针对GFAP和Iba1(小神经胶质细胞标记物)的山羊多克隆抗体对脑组织进行染色。对照小鼠脑的复合图像在A、D中示出,并且示出了中风脑关于整联蛋白α10β1和NeuN的表达(B和C)、整联蛋白α10β1和GFAP的表达(E和F)和整联蛋白α10β1和Iba1的表达(H和I)的复合图像,共定位通过箭头示出。结果显示整联蛋白α10β1与分别在神经元和星形胶质细胞上表达增加的NeuN和GFAP(再生反应)共定位,但是不与小神经胶质细胞标记物Iba1共定位。
[0096] 定义
[0097] 如在此使用的,术语“啮齿动物(rodent)”和“啮齿动物(rodents)”是指系统发育目啮齿目(Rodentia)的所有成员。
[0098] 如在此使用的,“整联蛋白α10”或“整联蛋白α10亚基”是指异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的α10亚基。此指示不排除结合到α10亚基、从而形成整联蛋白α10β1异源二聚体的四级结构的β1亚基的存在。
[0099] 如在此使用的,“抗整联蛋白α10抗体”或“抗整联蛋白α10亚基抗体”是指能够识别并结合到异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的至少α10亚基的抗体。这些抗体可以是识别异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的表位的抗体,其中该表位包含α10和β1亚基两者的基酸残基。
[0100] 如在此使用的,术语“鉴定”是指将细胞识别为某种细胞类型(例如,神经干细胞或神经祖细胞)的行为。鉴定的替代性术语是“检测”,其在此以相同含义使用。例如通过检测特定标记物被细胞表达来将该细胞鉴定为神经干细胞或神经祖细胞。
[0101] 如在此使用的,术语“分离”、“分选”和“选择”是指将细胞鉴定为某种细胞类型并且将其与不属于同一细胞类型或分化状态的细胞分开的行为。
[0102] 如在此使用的,术语“评分”是指对整联蛋白α10亚基表达的评分。评分可以是经由在样品群中进行例如免疫测定、流式细胞术、免疫荧光、蛋白质印迹或免疫沉淀测量整联蛋白α10亚基表达,并且将该测量与在表达整联蛋白α10亚基的参考细胞群体中进行的测量以及与不表达整联蛋白α10亚基的细胞群体中进行的测量进行比较。表达整联蛋白α10的参考细胞的例子是用整联蛋白序列转染的C2C12细胞、HEK293细胞。不表达α10的参考细胞的例子是未转染的C2C12细胞和HEK293细胞。
[0103] 术语“鼠”是指鼠科(family Muridae)的任何和所有成员,包括大鼠和小鼠。
[0104] 在此的术语“基本上不含”旨在意指低于所用测定的检测限值,从而表现为阴性,即,不含。
[0105] 在此的术语“定型(committed)”旨在意指专向于或集中于。因此,定型细胞是专向于或集中于特定分化途径的细胞。据此,将遵循非定型细胞不专向于或集中于任何特定分化途径并且具有若干选择。
[0106] 在此使用的术语“受试者”用于意指根据在此公开的方法鉴定和/或分离的神经干细胞和/或神经祖细胞和/或间充质干细胞可被给予的任何哺乳动物,该方法基于在细胞的表面上或在细胞中的细胞内检测整联蛋白α10表达。具体预期用本公开文本的方法进行治疗的受试者包括人类以及非人类灵长类动物、绵羊、马、、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠,以及衍生自或源自这些宿主的器官、肿瘤、和细胞。

具体实施方式

[0107] 作为针对神经干细胞和神经祖细胞的标记物的整联蛋白α10
[0108] 诸位发明人意外地发现,整联蛋白α10β1存在于人类神经干细胞(NSC)和/或神经祖细胞(NPC)上。因此,此整联蛋白可以用于从混合细胞群体鉴定、选择并特异性地分离神经干细胞和神经祖细胞,并且将是用于修复例如由于神经系统损伤导致的受损组织或用于治疗神经变性疾病的细胞疗法中的有用工具。与以上提及的NSC表面标记物相比,整联蛋白α10β1鉴定成体小鼠SVZ的全部三种细胞类型(参见以上表1),从而表明与其他已知的标记物相比,整联蛋白α10β1是更广泛的干细胞和祖细胞标记物,覆盖脑干细胞环境的不同细胞亚型。
[0109] 人类整联蛋白α10链序列是已知的,并且在GenBankTM/EBI Data Bank登录号AF074015处可公开获得。因此,整联蛋白α10链的新用途和方法在本发明中公开。
[0110] 如以上揭示的,本公开文本的一个方面涉及包括由神经干细胞和/或神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的标记物作为针对哺乳动物神经干细胞和哺乳动物祖细胞的标记物的用途。
[0111] 在一个实施方案中,整联蛋白α10亚基作为与整联蛋白β1链组合的异源二聚体表达。
[0112] 在一个实施方案中,整联蛋白α10亚基在哺乳动物NSC和/或NPC的细胞表面上表达。
[0113] 在一个实施方案中,整联蛋白α10亚基在哺乳动物NSC和/或NPC中在细胞内表达。
[0114] 用于鉴定神经干细胞(NSC)和神经祖细胞(NPC)的方法
[0115] 本公开文本的一个方面涉及一种用于鉴定哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法。该方法包括以下步骤:
[0116] a)提供包含神经组织的样品,
[0117] b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
[0118] c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
[0119] d)根据c)中的评分鉴定该哺乳动物神经干细胞和/或该神经祖细胞。
[0120] 本公开文本的另外的方面涉及一种用于分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法。该方法包括以下步骤:
[0121] a)提供包含神经组织的样品,
[0122] b)检测由a)的该样品中包含的细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达,
[0123] c)对b)的整联蛋白α10亚基表达进行评分,并且
[0124] d)根据c)中的评分选择该哺乳动物神经干细胞和/或该哺乳动物神经祖细胞。
[0125] 在一些实施方案中,鉴定哺乳动物NSC和/或NPC的方法和分离哺乳动物NSC和/或NPC的方法还包括在b)的检测整联蛋白α10亚基表达之前将该样品与特异性地结合整联蛋白α10亚基的抗体接触的步骤。
[0126] 更具体地,用于根据本公开鉴定和/或分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法还可以包括以下步骤:
[0127] e)提供包含NSC和/或NPC的细胞悬浮液,
[0128] f)在结合到整联蛋白α10β1的单克隆抗体或其片段与整联蛋白α10β1的细胞外结构域形成抗体-抗原复合物的条件下将e)中的该细胞悬浮液与所述单克隆抗体或其片段接触,
[0129] g)分离f)中的结合到所述单克隆抗体或其片段的细胞,
[0130] 从而产生哺乳动物NSC和/或NPC的纯群体。
[0131] 在本公开文本的一些实施方案中,用于根据本公开鉴定和/或分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法还可以包括从单克隆抗体或其片段回收结合到所述抗体或其片段的细胞。
[0132] 以上e)中提供的包含哺乳动物NSC和/或NPC的细胞悬浮液可以从神经组织分离,如在以下“神经组织”的部分中详细描述的。
[0133] 在本公开文本的一些实施方案中,用于根据本公开文本鉴定和/或分离哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的方法在体外进行。
[0134] 神经组织
[0135] 哺乳动物NSC和NPC的主要来源是神经组织。事实上,NSC和NPC存在于胎儿或成体哺乳动物中枢神经系统(CNS)中的环境中,并且来自神经形成发生的胎儿或成体哺乳动物脑或脊髓。
[0136] 脑中的神经干细胞环境是能够使神经祖细胞寄宿和维持神经祖细胞的组织微环境。直至最近,在哺乳动物中识别到仅两个脑环境,前外侧脑室的室下区(SVZ)和海马齿状回的颗粒细胞下层(SGZ)。越来越多的证据显示成体脑的其他部分(尤其是在损伤之后)中也存在神经形成和胶质形成,从而表明另外的干细胞环境存在于成体脑中(Lin和Iacovitti,2015)。最近显示,软脑膜寄宿有表达呈递巢蛋白和SOX2的未分化的、增殖的和分化的神经前体的标记物的细胞亚组,并且这组细胞在成年期中持续存在。因此,脑膜可以表示胚胎发育过程中和在成年期中祖细胞的另一个功能性环境。
[0137] 因此,在本公开文本的一些实施方案中,该神经组织包含NSC和NPC。
[0138] 在一些实施方案中,该神经组织获得自或衍生自脑组织。
[0139] 在一些实施方案中,该神经组织是成体脑组织。
[0140] 在一些实施方案中,该神经组织是胎脑组织。
[0141] 在一些实施方案中,该神经组织衍生自或获得自哺乳动物的室下区(SVZ)、颗粒细胞下层(SGZ)或脑膜。
[0142] 所有的哺乳动物均适于获得神经组织。在一些实施方案中,该神经组织选自人类、犬科动物、马科动物、牛科动物、猫科动物、鼠、绵羊或猪神经组织。如果需要的话,可以获得其他哺乳动物神经组织。
[0143] 在一些实施方案中,哺乳动物NSC和NPC是人类NSC和NPC。
[0144] 在一个另外的实施方案中,哺乳动物NSC和NPC是鼠NSC和NPC。
[0145] 在一些实施方案中,该神经组织不衍生自人类胚胎。
[0146] 整联蛋白α10表达的检测
[0147] 用于鉴定哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞以及其分离的方法中的关键步骤是检测整联蛋白α10蛋白表达。
[0148] 在一个实施方案中,对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过流式细胞术确定的。例如,α10的表达可以通过流式细胞术或具有高特异性的任何其他方法来分析。多色分析可以与流式细胞术一起采用,这是特别便利的。因此,NSC和/或NPC可以基于特定抗原的染色水平与其他细胞分开。
[0149] 在一个实施方案中,对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过测量整联蛋白α10蛋白表达确定的。例如,可以使用流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀和/或蛋白质印迹。
[0150] 在一个实施方案中,对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过测量整联蛋白α10mRNA表达确定的。特定蛋白质的mRNA表达的检测是本领域技术人员熟知的,并且通常通过以下进行:在探针不与其他mRNA分子杂交的杂交条件下用对于感兴趣的mRNA有特异性的DNA或RNA探针探测mRNA。还可以使用不同的聚合酶链反应(PCR),其对于本领域技术人员是明显的。
[0151] 以下给出合适的PCR方法。简而言之,可以使用聚合酶链反应(PCR)。
[0152] 可以通过标准方法,例如通过使用RNeasy微型试剂盒(德国凯杰公司(Qiagen Germany))从人类神经干细胞或神经祖细胞制备RNA。
[0153] 可以根据制造商的建议用寡d(T)-引物或基因特异性引物通过逆转录酶反应Superscript II(美国英杰公司(Invitrogen,USA))产生cDNA。
[0154] 之后进行PCR来扩增cDNA。将α10的特异性引物,正向引物5’GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3’和反向引物5’GTG TTT TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3’添加到cDNA,并且在65℃下根据制造商的建议通过Platinum Taq DNA聚合酶(美国英杰公司)扩增特异性产物,进行40个周期。
[0155] 用于检测标记物的表达的若干种方法是本领域技术人员已知的。因此,在本公开文本的一个实施方案中,对由细胞对整联蛋白α10亚基的表达的检测是通过选自免疫测定、流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀和蛋白质印迹的方法确定的。
[0156] 在再另外的实施方案中,根据本发明的方法检测在NSC和/或NPC的细胞表面上或在NSC和/或NPC中的细胞内的整联蛋白链α10表达。可以使用以上给出的方法,例如流式细胞术和免疫沉淀。优选使用流式细胞术。
[0157] 在再另外的实施方案中,通过任何免疫测定,诸如免疫化学方案中描述的方法(Methods in molecular biology,Humana Press Inc)检测整联蛋白α10亚基的表达。可以通过各种方法进行检测,例如本领域技术人员已知的任何免疫方法,诸如免疫沉淀、蛋白质印迹、磁性激活细胞分选(MACS)或流式细胞术方法,例如荧光激活细胞分选(FACS)。
[0158] 因此,在一些实施方案中,由细胞进行的整联蛋白α10亚基的表达经由抗体检测,其中该抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或其片段。
[0159] 抗体,诸如单克隆抗体或其片段,具体可用于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关联的标记物、细胞表面蛋白以及细胞内标记物。因此,它适于鉴定整联蛋白α10。
[0160] 在一个实施方案中,该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0161] 在另外的实施方案中,该抗体是非人类抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或人类抗体。
[0162] 另外,鉴定也可以通过特异性地结合到整联蛋白α10分子的任何特异性分子(诸如蛋白质或肽)进行。这类蛋白质或肽的例子是结合到整联蛋白α10分子的天然配体。这类天然配体可重组制备、化学合成、或从天然来源纯化。
[0163] 当特异性地结合到整联蛋白α10分子的抗体、蛋白质或肽结合到可检测部分时,有利于检测。
[0164] 在一些实施方案中,抗体用于检测整联蛋白α10亚基的表达,并且该抗体共价结合到可检测部分,诸如选自荧光团、酶或放射性示踪剂或放射性同位素的可检测部分。
[0165] 在一些实施方案中,该抗体结合到荧光团,并且该荧光团选自异硫氰酸荧光素、藻红蛋白与藻红蛋白缀合物、别藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白缀合物、德克萨斯红与德克萨斯红缀合物、Alexa系列荧光染料、亮紫和亮蓝系列荧光染料。
[0166] 可以使用许多其他荧光团,并且技术人员根据特定检测方法并且还根据所用抗体的特征选择最合适的一种。
[0167] 在另外的实施方案中,该抗体具有选自IgA、IgD、IgG和IgM的同种型。
[0168] 在甚至另外的实施方案中,该抗体是:
[0169] a)单克隆抗体,其通过以登录号DSM ACC2583在德国生物和细胞培养物保藏中心处保藏的杂交瘤细胞系产生;或
[0170] b)竞争结合到与通过以登录号DSM ACC2583在德国微生物和细胞培养物保藏中心处保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合的表位相同的表位的抗体;或
[0171] c)a)或b)的片段,其中所述片段能够特异性地结合到该整联蛋白α10亚基链的细胞外I结构域。
[0172] 当特异性地结合到整联蛋白α10分子的抗体、蛋白质或肽结合到固体支持物时,也可以有利于检测。因此,在一个实施方案中,抗体用于检测整联蛋白α10亚基的表达,并且该抗体附接到固体支持物。
[0173] NSC和NPC的分离和培养
[0174] 根据本公开文本的方法分离哺乳动物神经干细胞(NSC)和/或哺乳动物神经祖细胞(NPC)可以是基于细胞粘附到塑料培养皿并且在特定培养条件下形成集落的能力。用于在不包括根据本发明的标记物的情况下分离哺乳动物神经干细胞和神经祖细胞的合适方案进一步在Giachino等人2009,Guo W等人,(2012)和Oliver-De la Cruz和Ayuso-Sacido(2012)中详细给出。因此,可以使用已知的方法,但不引入根据本发明的标记物。
[0175] 用于分离的程序可以包括使用例如抗体涂覆磁珠的磁分离,亲和色谱法,连接到单克隆抗体或与单克隆抗体结合使用的试剂(例如互补序列和细胞毒素),以及用附接到固体基质(例如板)的抗体进行的“淘选”,
[0176] 或其他便利的技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选器,其可以具有不同的复杂程度,例如本领域技术人员已知的多个颜色通道、光散射检测通道、阻抗通道等。
[0177] 适于在根据本发明的方法中使用的分离方法的另外方案由以下描述:Orfao,A和Ruiz-Arguelles,A((1996)General Concepts about Cell Sorting Techniques.Clin Biochem.29(1):5-9),和Herzenberg,LA,De Rose,SC和Herzenberg,LA((2000)Monoclonal Antibodies  and FACS:complementary  tools for immunobiology and medicine.Immunol.Today.21(8):383-390)。
[0178] 首先从由神经组织采集的细胞混合物纯化哺乳动物NSC和NPC。通常,使用阴性标记物将NSC和NPC与分化细胞分开。
[0179] 从存在于神经组织中的其他细胞(例如,定型神经细胞)分离NSC和NPC包括选择和分选步骤,其中首先鉴定NSC和NPC并且然后与其他细胞分开。可以采用技术人员已知的各种技术来通过初始去除专向于除NSC和NPC以外的其他谱系来分离细胞
[0180] 在第一分离中,可以使用一种或多种荧光染料标记针对其他标记物的抗体。
[0181] 可以通过采用与死亡细胞相关联的染料(碘化丙锭,LDS)来针对死亡细胞选择NSC和NPC。细胞可以在其培养基中或在任何生理盐水溶液中采集,该任何生理盐水溶液优选缓冲溶液,诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS),任选地具有胎牛血清(1%FCS)或牛血清白蛋白(1%BSA)
[0182] 未在NSC和NPC上表达的标记物是例如CD326、CD34和CD45,并且在一些实施方案中,其表达或表达缺乏可以用于作为进行非NSC或NPC的细胞的阴性选择的标记物。
[0183] 如果有待在一个步骤中去除非NSC或NPC的另外谱系或细胞群体,可以包括针对这类谱系特异性标记物的各种抗体。
[0184] 在本公开文本的一些实施方案中,其他特异性较低且非独特的哺乳动物NSC和/或NPC标记物可以与根据本发明的标记物平行分析。事实上,在不同的CNS发育阶段检测的NSC和NPC子集已经显示表达标记物,诸如巢蛋白、GFAP、CD15、CD24、Sox2、Musashi、CD133、EGFR、PDGFRα、双皮质素(DCX)、Pax6、FABP7和GLAST。这些标记物由表达整联蛋白α10亚基的细胞中的一些共表达,如在实施例中所示。然而,这些标记物均不独特地由NSC和/或NPC表达,实际上许多由神经分化细胞和其他非神经细胞类型表达。
[0185] 相比之下,在分离和扩增方案中使用根据本发明的整联蛋白α10标记物将产生神经干细胞和/或神经祖细胞的同质群体,其具有分化为脑和脊髓的不同细胞的能力,因此可用于再生脑或脊髓组织。
[0186] 因此,在已知的分离和扩增方案中包括根据本发明的标记物(包括整联蛋白α10亚基)以及单独使用该一种或多种标记物对于进一步评估和富集神经干细胞和神经祖细胞群体是高度有价值的。具体地,没有如同哺乳动物神经干细胞和神经祖细胞的根据本发明的标记物一样的其他特异性独特标记物是已知的。
[0187] NSC和NPC也可以基于光散射特性以及其对各种细胞表面抗原的表达,结合使用根据本发明的方法进行的鉴定来选择。
[0188] 通常,在荧光染料的帮助下检测存在于细胞表面上或细胞内的标记物。可以用于多色分析的荧光染料包括藻胆蛋白(例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、荧光素、德克萨斯红、以及本领域技术人员熟知且可商购获得的许多其他荧光染料。
[0189] 用于基于存在其细胞表面上的标记物的使用检测和选择细胞的常用技术是流式细胞术和免疫沉淀。
[0190] 在一些实施方案中,可以通过流式细胞术或免疫沉淀分析NSC和NPC,从而检测和鉴定整联蛋白α10亚基表达。本领域技术人员对于用于检测和/或选择细胞的流式细胞术和免疫沉淀的合适方案是熟悉的。
[0191] 如果从完整小鼠脑采集细胞群体,则仅少部分,例如总细胞数的少于2%是NSC或NPC。
[0192] 如果使用抗体或其片段,则它可以附接到固体支持物以允许进行高度特异性分离。所采用的分离的具体程序,例如离心、机械分离诸如柱、膜或磁分离,应当使采集部分的活力最大化。可以采用本领域技术人员已知的不同功效的各种技术。所采用的具体技术取决于分离的效率、方法的细胞毒性、进行的容易性和速度、以及对于复杂设备和/或技术技能的需要。
[0193] 用于通过根据本发明的方法帮助从细胞悬浮液分离NSC和/或NPC的程序可以包括使用例如抗体涂覆磁珠的磁分离,基于根据本发明的抗体或其片段的亲和色谱法,以及用附接到固体基质(例如,板)的抗体或其片段进行的“淘选”,或其他便利的技术。
[0194] 用于提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选器、磁珠分选和本领域技术人员已知的任何合适的方法。
[0195] 在另外的实施方案中,本公开文本的方法的第一富集步骤是对NSC或对NPC的阳性选择,其可以重复,直至实现NSC或NPC的所需纯度。
[0196] 用于产生富集哺乳动物NSC和/或NPC的细胞的分离群体的方法
[0197] 本公开文本的一个方面涉及一种用于制造相对于参考群体富集神经干细胞和/或神经祖细胞的体外哺乳动物细胞的分离群体的方法,该方法包括以下步骤:
[0198] a)至少提供包含神经干细胞和/或神经祖细胞的细胞群体的一部分或参考群体的一部分,
[0199] b)将鉴定由该神经干细胞和/或该神经祖细胞表达的整联蛋白α10亚基的化合物引入到以上a)中的细胞群体中,
[0200] c)从以上b)中的细胞群体选择和分离神经干细胞和/或神经祖细胞,
[0201] 从而产生富集神经干细胞和/或神经祖细胞的细胞群体。
[0202] 提供群体可以与以上详细描述的用于鉴定NSC和NPC的方法相似的方式进行。该细胞群体可以包含至少一种NSC和/或至少一种NPC,或者可以仅包含既不是NSC也不是NPC的细胞。例如,可以提供获得自或衍生自神经组织的细胞群体,或者可以提供参考细胞群体,诸如用整联蛋白α10转染的HEK细胞或C2C12细胞。
[0203] 引入以鉴定NSC和/或NPC的化合物可以是鉴定NSC和/或NPC的蛋白质、肽、单克隆抗体、或其部分、或多克隆抗体。
[0204] 引入以鉴定NSC和/或NPC的化合物可以是能够检测整联蛋白α10的蛋白质、肽、单克隆抗体、或其部分、或多克隆抗体。
[0205] 在一个实施方案中,通过根据以上所述的用于鉴定NSC和/或NPC的方法在所述NSC和/或所述NPC的细胞表面上检测整联蛋白链α10的表达来将NSC和/或NPC鉴定为NSC和/或鉴定为NPC。
[0206] 单克隆或多克隆抗体或其部分特别可用于鉴定标记物,例如在完整活细胞的细胞表面上表达的标记物。用于鉴定NSC和/或NPC的化合物还可以用于分离步骤。因此,所述一种或多种化合物诸如抗体或其部分可以附接到固体支持物以允许第一粗分离。固体支持物的例子是珠例如磁珠、琼脂糖或本领域技术人员已知的其他相似类型的珠。在分离对于细胞的活力没有过度损害的情况下可以采用适用于分离细胞的任何手段。
[0207] 所采用的分离技术应当使采集部分的活力维持最大化。以下描述活力的评估。
[0208] 简而言之,活力的评估可以使用例如流式细胞术来进行。在适当细胞的染色之后,可以添加活力染料来在活细胞与非活细胞之间进行区分。存在多种这类染料,描述了这类染料的例子和使用它们的典型方法。原理对于这些染料中的大部分是相同的:如果细胞膜受损,这些染料就进入细胞;这样,被这些染料染色的细胞是非活细胞,并且未染色的细胞被认为是活细胞。
[0209] 染料的例子是碘化丙锭(PI)、7-氨基放射菌素D(7AAD)、To-Pro3、以及单叠氮化乙锭(EMA)。由A.Radbruch(斯普林格出版社,第2版,2000年1月)在Flow Cytometry and Cell Sorting(Springer Lab Manual)中描述其他方法。
[0210] 采集部分的细胞活力典型地是>90%,优选地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、或甚至100%。
[0211] 用于根据本发明的方法分离细胞所采用的具体技术取决于分离的效率、方法的细胞毒性、进行的容易性和速度、以及对于复杂设备和/或技术技能的需要。
[0212] 在根据本发明的方法的一个实施方案中,包括至少一个对哺乳动物NSC和/或NPC的富集步骤。
[0213] 在根据本发明的方法的一个实施方案中,包括至少一个对哺乳动物NSC的富集步骤。
[0214] 在根据本发明的方法的一个实施方案中,包括至少一个对哺乳动物NPC的富集步骤。
[0215] 在再另外的实施方案中,NSC和/或NPC的第一富集步骤是对NSC和/或NPC的阴性选择,即从初始细胞群体耗尽或去除其他谱系定型细胞。例如,阴性选择表达标记物(诸如CD34、CD45和CD326)的细胞。
[0216] 在再另外的实施方案中,本公开文本的方法包括另一个步骤,基于检测整联蛋白α11亚基的表达进行阴性选择,例如从细胞群体耗尽或去除表达标记物整联蛋白α11的细胞。
[0217] 在再另外的实施方案中,第一富集是对NSC和/或NPC的阳性选择,
[0218] 其可以重复,直至实现NSC和/或NPC的所需纯度。对于阳性或阴性选择,蛋白质、肽、单克隆或多克隆抗体可以用作用以鉴定如上所述的整联蛋白α10的化合物。该化合物可以与用于分离的手段缀合,该手段诸如磁珠,其允许直接分离;生物素,其可以用抗生物素蛋白去除;或结合到支持物的链霉抗生物素蛋白;荧光染料,其可以与荧光激活细胞分选器一起使用;或类似手段,以允许容易地分离特定细胞类型,如以上段落中例示的。可以采用对于感兴趣的细胞(即,NSC和NPC)的活力没有过度损害的任何技术。
[0219] 在一个实施方案中,通过使用例如基于流式细胞术的细胞分选器(诸如 )或具有高特异性的任何其他相似的方法,通过荧光细胞分选进行选择。多色分析可以与特别便利的流式细胞术和对于流式细胞术领域的技术人员熟知的技术一起采用。细胞可以基于特定抗原的染色水平来分离。在第一分离中,可以用一种荧光染料标记其他标记物的抗体,而专向谱系(即,整联蛋白α10)的抗体可以缀合到一种或多种不同的荧光染料。在另外的实施方案中,其他标记物可以是NSC和/或NPC可以表达的巢蛋白、GFAP、CD15、CD24、Sox2、Musashi、CD133、EGFR、PDGFRα、双皮质素(DCX)、Pax6、FABP7和GLAST。不在NSC和NPC上表达的标记物的例子是CD326、CD34、CD45和整联蛋白α11,并且在另外的实施方案中,其表达或缺乏表达也可以与根据本发明的标记物(例如,整联蛋白α10表达)一起评估。
[0220] 如果有待在此步骤中去除另外谱系或细胞群体,可以包括针对这类谱系特异性标记物的各种抗体。可以用于多色分析的荧光染料包括藻胆蛋白(例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、荧光素、德克萨斯红、以及本领域技术人员已知的任何合适的荧光染料。
[0221] 可以通过采用与死亡细胞相关联的染料诸如碘化丙锭或LDS-75 1(激光染料苯乙烯基-75 1(6-二甲基氨基-2-14-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,3-丁二烯基-1-乙基喹啉高氯酸盐))来针对死亡细胞选择细胞。细胞可以在任何合适的细胞培养基(诸如Iscove改良的Dulbecco培养基)中或在任何生理盐水溶液中采集,该任何生理盐水溶液优选缓冲溶液,诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS),任选地具有胎牛血清(FCS)或牛血清白蛋白(BSA)。可以采用用于阳性或阴性选择的其他技术,其允许准确分离,诸如亲和柱和类似技术,进一步由以下描述:Silvestri F,Wunder E,Sovalat H,Henon P,Serke S,在Positiveselection of CD34+cells:a short review of the immunoadsorption methods currently available for experimental and clinical use中(在"2nd European Workshop on stem Cell Methodology",Mulhouse,France,1993年5月3-7日.J Hematother.1993Winter;2(4):473-81上报告)以及Basch RS,Berman JW,Lakow E.在Cell separation using positive immunoselective techniques(J Immunol Methods.1983年2月11日;56(3):269-80)。
[0222] 可以基于光散射特性以及细胞对各种细胞表面抗原的表达来选择细胞。
[0223] 虽然认为特定的分离顺序对于本发明不是关键的,但是所指示的顺序是已知有效的进行本发明的一种方式。因此,建议通过粗分离优选阴性选择来初始地分离细胞,从而使用阴性细胞标记物诸如CD326、CD34和CD45去除不定型为NSC和NPC的细胞。阴性选择之后典型地接着进行阳性选择,其中阳性选择针对与NSC和/或NPC相关联的标记物,并且阴性选择针对与谱系定型细胞和非NSC和/或NPC的其他干细胞群体相关联的标记物。然后,此分离之后接着进行对于具有作为NSC和/或NPC的多谱系潜力和增强的自我再生能力的细胞群体或包含所述群体的细胞组合物的选择。以下进一步描述该组合物。
[0224] 在另外的实施方案中,这种群体的富集是约70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%、或甚至100%。以上详细讨论这类细胞的活力。
[0225] 富集群体可以进一步扩增并且用定义的因子诸如表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)诱导以分化为特定神经细胞。例如,FGF-2通常与介导生长因子与其受体的结合的肝素组合使用。已经报告支持细胞培养的其他生长因子是转化生长因子α(TGF-α)、白血病抑制因子(LIF)及其等同的睫状神经营养因子(CNTF)、或脑衍生神经营养因子(BDNF)。PDGFα是经常在用于少突胶质细胞祖细胞的维持培养基中使用。作为使用特定生长因子的替代性方案或除此之外,NPC和NSC可以在其他支持性细胞的存在下共培养,所述其他支持性细胞像星形胶质细胞,其似乎通过物理接触有利于NPC和NSC生长;或内皮细胞,其可以经由血管内皮生长因子(VEGF)产生增强的细胞增殖
[0226] NSC和/或NPC的调节
[0227] 本公开文本的另外的方面涉及一种用于确定测试化合物是否调节体外哺乳动物NSC和/或NPC分化的方法。这种方法包括以下步骤:
[0228] a)提供表达整联蛋白α10亚基的神经干细胞和/或神经祖细胞,
[0229] b)将该神经干细胞和/或该神经祖细胞与测试化合物接触,并且
[0230] c)检测该神经干细胞和/或该神经祖细胞的分化速率或分化模式的变化作为该测试化合物调节神经干细胞和/或神经祖细胞分化的指示,
[0231] 其中分化速率或分化模式是通过根据在此公开的方法检测细胞对整联蛋白α10的表达来确定的,还参见以上部分“整联蛋白α10表达的检测”。
[0232] 所提供的NSC和NPC可以是根据在此公开的方法中的任一种实现的富集细胞群体、根据本发明的分离NSC和/或NPC、或根据本发明的细胞组合物。
[0233] 测试化合物可以是已知影响或疑似影响NSC和/或NPC的任何化合物,例如药物组合物、药物、多克隆或单克隆抗体、或其部分(诸如结合到NSC和/或NPC上的整联蛋白α10或任何其他分子的抗体),用于促进NSC和/或NPC的生长的因子(例如PDGFRα、EGF和FGF-2)。
[0234] 检测例如NSC和/或NPC的分化速率或分化模式的变化作为测试化合物调节NSC和/或NPC分化的指示可以通过根据在此公开的方法在所述神经干细胞和/或神经祖细胞上或在神经干细胞和/或神经祖细胞中的细胞内检测整联蛋白α10表达来进行。
[0235] 检测例如NSC和/或NPC的分化速率或分化模式的变化作为测试化合物调节NSC和/或NPC分化的指示可以经由流式细胞术或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法诸如任何免疫方法来进行。分化速率或分化模式的变化可以经由用测试化合物调节的NSC和/或NPC相对于未处理或模拟物处理的NSC和/或NPC群体的动力学、功能或表型研究来检测。
[0236] 细胞组合物
[0237] 本公开文本的一个方面涉及一种表达整联蛋白α10亚基的未分化哺乳动物细胞的体外细胞培养物,其中该细胞衍生自神经组织并且其中
[0238] a)该培养物中的细胞当在基本上不含如在(b)中定义的血清和增殖诱导生长因子两者的培养基中分化时,具有分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞的能力,以产生至少10%神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞的细胞培养物;
[0239] b)该细胞培养物在含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基中分裂;
[0240] c)在撤出血清替代物和该增殖诱导生长因子两者后,该培养物中的细胞分化为神经元和/或少突胶质细胞和/或星形胶质细胞。
[0241] 在一个实施方案中,步骤c)包括添加胎牛血清。
[0242] 本公开文本的另外的方面涉及一种体外细胞培养物,其包含
[0243] a)含有血清替代物诸如B27和至少一种增殖诱导生长因子的培养基;以及[0244] b)衍生自哺乳动物的中枢神经系统的未分化哺乳动物细胞,其中至少10%、优选地至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少70%、优选地至少80%、优选地至少90%的细胞表达整联蛋白α10亚基。
[0245] 本公开文本的甚至另外的方面涉及一种表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物未分化细胞的悬浮培养物,其中所述细胞基本上形成为细胞聚集体,并且其中该细胞聚集体被维持在含有增殖诱导生长因子的培养基中。
[0246] 在一些实施方案中,整联蛋白α10表达如在以上部分“作为针对神经干细胞和神经祖细胞的标记物的整联蛋白α10”中所述。
[0247] 在一些实施方案中,至少10%、优选地至少20%、优选地至少30%、优选地至少40%、优选地至少50%、优选地至少60%、优选地至少70%、优选地至少80%、优选地至少
90%的未分化哺乳动物细胞是表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞。
[0248] 在一些实施方案中,未分化哺乳动物细胞是神经干细胞或神经祖细胞。
[0249] 在一些实施方案中,未分化哺乳动物细胞获得自或衍生自成体或胎儿哺乳动物神经组织,例如人类或鼠神经组织,其在以上部分“神经组织”中详细描述。
[0250] 在一些实施方案中,未分化哺乳动物细胞不获得自或衍生自人类胚胎细胞或人类胚胎。
[0251] 在一些实施方案中,未分化哺乳动物细胞中的一些还表达选自巢蛋白、PSA-NCAM、GFAP、SOX2和PDGFRα的至少一种标记物。
[0252] 具有大于50%、诸如大于60%、例如大约70%、诸如大于80%、例如大于90%诸如大于95%、诸如96%、97%、98%或99.9%的人类NSC或NPC细胞的组合物可以根据用于富集NSC或NPC的公开方法实现。这种NSC和/或NPC能够提供NSC的全部各种谱系的成员(诸如神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞以及其他细胞)的细胞再生和发育。
[0253] 最后,单一细胞类型可以获得自NSC或NPC组合物,并且用于哺乳动物神经组织的重构或再生。NSC或NPC组合物应当优选地以治疗有效剂量给予,其中该剂量是使所述哺乳动物诸如人类进行再产生的特定细胞数量。细胞数量在供体与供体之间可以不同,并且可以由本领域技术人员根据情况凭经验确定。
[0254] 细胞增殖诱导因子对于每种细胞类型是特异性的,并且是本领域技术人员已知的。在本公开文本的一些实施方案中,该至少一种增殖诱导生长因子选自表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、转化生长因子α(TGF-α)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、PDGFα、以及其组合。
[0255] 神经系统损伤和神经变性疾病的治疗
[0256] 根据在此公开的方法鉴定和分离的哺乳动物NSC和/或NPC诸如人类或小鼠NSC和/或NPC可以用于在有需要的受试者中治疗神经系统的损害和损伤和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害和/或治疗神经变性疾病。对于神经变性障碍,这尤其适用于与神经元组织的丧失或损害相关联的神经变性疾病。本发明通过使丧失或受损组织再生来治疗这类神经变性疾病。
[0257] 此外,根据例如在WO 03/106492中公开的方法鉴定和分离的间充质干细胞(MSC)也可以用于使中枢神经系统的丧失或受损组织再生,如Steinberg G.K.等人(2016)Stroke 47:1817-1824所证明的。因此,在本公开文本的一个方面中涉及一种使中枢神经系统的丧失或受损组织再生的方法以及在有需要的受试者中治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害的方法,该方法包括:
[0258] a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0259] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,
[0260] 从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
[0261] 本公开文本的另外的方面涉及一种在有需要的受试者中治疗精神和行为障碍的方法,该方法包括:
[0262] a)提供包含哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0263] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞的分离群体,
[0264] 从而治疗具有精神症状的神经障碍。
[0265] 本公开文本的另外的方面涉及一种在有需要的受试者中治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害的方法,该方法包括:
[0266] a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0267] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗中枢神经系统的疾病或损害和/或预防中枢神经系统的损害并保护中枢神经系统免受损害。
[0268] 本公开文本的另外的方面涉及一种在有需要的受试者中治疗精神和行为障碍的方法,该方法包括:
[0269] a)提供包含哺乳动物间充质干细胞的富集群体的组合物,其中该细胞表达整联蛋白α10亚基;
[0270] b)向该受试者给予治疗有效量的哺乳动物间充质干细胞的分离群体,从而治疗具有精神症状的神经障碍。
[0271] 所述间充质干细胞可以例如从以下分离:骨髓、脂肪组织、脐带血、华顿氏胶(Wharton’s jelly)、牙髓羊水、羊膜、牙组织、子宫内膜、肢芽、血液、胎盘和胎膜、唾腺、皮肤和包皮、亚羊膜脐带衬膜或滑膜。
[0272] 本公开文本的另外的方面涉及一种针对哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的标记物,其包括由神经干细胞和/或神经祖细胞表达的整联蛋白α10链亚基,该标记物用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或预防神经系统的损害并保护神经系统免受损害和/或治疗精神和行为障碍的方法中使用。
[0273] 本公开文本的另外的方面涉及一种包含表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞的分离群体的组合物,其用于在治疗神经系统的疾病或损害和/或精神和行为障碍的方法中使用。
[0274] 在一些实施方案中,整联蛋白α10表达如在以上部分“作为针对神经干细胞和神经祖细胞的标记物的整联蛋白α10”中所述。
[0275] 在一些实施方案中,该细胞群体富集表达整联蛋白α10亚基的哺乳动物神经干细胞和/或哺乳动物神经祖细胞,例如,如在以上部分“用于产生富集哺乳动物NSC和/或NPC的细胞的分离群体的方法”中所述。
[0276] 神经干细胞(诸如神经祖细胞,诸如间充质干细胞:其是根据在此公开的方法通过在所述细胞的细胞表面上检测到整联蛋白α10亚基表达而分离的)可以被植入在受试者的神经系统的受损区域中,并且因此可以促进神经组织的生长并修复神经系统和神经变性疾病的损伤。
[0277] 神经干细胞(诸如神经祖细胞,诸如间充质干细胞:其是根据在此公开的方法通过在所述细胞的细胞表面上检测到整联蛋白α10亚基表达而分离并植入或移植到有需要的受试者中)可以促进神经干细胞迁移和分化以及为受损细胞提供营养支持的细胞外基质因子的产生。
[0278] 在一些实施方案中,将神经干细胞(诸如神经祖细胞,诸如间充质干细胞:其是根据在此公开的方法通过在所述细胞的细胞表面上检测到整联蛋白α10亚基表达而分离的)经由脑内、动脉内、静脉内、或脑室内途径给予至有需要的受试者。
[0279] 可以将该细胞在一个或多个时机中给予至所述受试者。
[0280] 一旦它们被给予或移植到受试者中,该细胞就将根据它们所转移到的环境而产生不同的行为并且可以分化为所有类型的神经细胞。
[0281] 有待表征和治疗的疾病、损害和障碍
[0282] 若干疾病和障碍可以使用本公开文本的标记物和/或细胞和方法表征和治疗。
[0283] 在本公开文本的一个实施方案中,神经系统的疾病或损害是中枢或外周神经系统损伤或神经变性疾病。所述疾病、损害或损伤可能涉及丧失或受损的神经细胞。
[0284] 在本公开文本的一些实施方案中,神经系统损伤涉及对脑、脑干、脊髓、和/或外周神经的损伤,从而导致病症诸如中风、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤(SCI)、弥散性轴突损伤(DAI)、癫痫、神经病、外周神经病、以及这些综合征可能导致的相关疼痛和其他症状。
[0285] 中风是到脑的较差血液流动导致细胞死亡的医学病症。存在两种主要类型的中风:缺血性和出血性。脑缺血(即,脑部缺血,脑血管缺血)是到脑的血液流动不足以满足代谢需要的病症。这导致较差的供或脑组织缺氧,并且因此导致脑组织死亡或脑梗塞/缺血性中风。病灶性脑缺血减少到特定脑区域的血液流动,从而增加此特定区域的细胞死亡的风险,而全脑缺血整体影响脑。病灶性脑部缺血的啮齿动物模型常常在实验性中风研究中采用。
[0286] 如在(Fairbairn等人,2015)中所述,可以将NSC植入到由于急性外周神经损伤导致的外周神经损伤部位中。还可以将NSC植入到慢性去神经化神经中以改善形态和电生理恢复。
[0287] 诸位发明人已经证明(例如,图13-图14),表达整联蛋白α10β1的神经干细胞募集在受中风困扰的区域中。在一个实施方案中,本发明因此可用于表征受缺血性损害诸如中风困扰的区域的大小和位置。因此本发明对于医学专家是有用的,可作为CNS的疾病或损害之后的诊断性和预后性工具。参见例如Panagiotou等人(2015)Frontiers  in Neuroscience第9卷,文章182,其证明纳米颗粒缀合的抗体用于评估中风表征的用途。此外,神经干细胞(例如,自体神经干细胞或祖细胞)可以获得自供体,诸如患者本身,并且表征为扩增并移植到CNS的受损或患病区域中的神经干细胞或祖细胞。因此,本发明可用于治疗多种CNS疾病和障碍以及涉及神经组织的丧失或损害的损伤和创伤。
[0288] 在其他实施方案中,神经系统的疾病或损害是涉及神经元的变性及其在脑、脑干、脊髓、和/或外周神经中的病变的神经变性疾病,诸如神经变性障碍,包括但不限于帕金森病、阿尔茨海默病、老年痴呆、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、与多发性硬化症(MS)相关联的神经元/轴突损伤、以及相关联的症状。
[0289] 在其他实施方案中,神经系统损伤和/或神经变性疾病涉及脑、脑干、脊髓、和/或外周神经中神经元的功能障碍和/或丧失,诸如由以下导致的功能障碍和/或丧失:代谢疾病、营养缺陷、中毒性损伤、恶性肿瘤、和/或遗传性或自发性病症,包括但不限于糖尿病、肾功能障碍、酒精中毒、化疗、化学药剂、药物滥用、维生素缺陷、感染、以及相关联的症状。
[0290] 在一个实施方案中,神经系统损伤和/或神经变性疾病涉及脑、脑干、脊髓、和外周神经系统中神经胶质细胞诸如少突胶质细胞、星形胶质细胞、和施旺细胞的变性或硬化,包括但不限于多发性硬化症(MS)、视神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎、和癫痫、以及相关联的症状。
[0291] 在其他实施方案中,神经系统损伤和/或神经变性疾病涉及视网膜、光感受器、和相关联的神经,包括但不限于视网膜色素变性、黄斑变性、青光眼、以及相关联的症状。
[0292] 在其他实施方案中,神经系统损伤和/或神经变性疾病涉及感觉上皮和相关联的前庭听神经神经节病变,包括但不限于噪声性听力丧失、聋、耳鸣、外耳炎、迷路炎、遗传性耳蜗前庭萎缩、美尼尔症、以及相关联的症状。
[0293] 在一些实施方案中,神经系统损伤选自脊髓损伤(SCI)、创伤性损伤(TBI)、中风和脑癌。在一个优选的实施方案中,神经系统损伤是中风。
[0294] 在一些实施方案中,涉及神经组织的损害的精神和行为障碍可以通过本发明的NCS或NPC治疗。参见例如
[0295] Ladran等人(2013)Interdiscip Rev Syst Biol Med.5(6):701–715以及Kálmán等人(2016)Stem Cells Int.7909176。
[0296] 在某些实施方案中,精神和行为障碍选自雷特综合征(Rett syndrome)、精神分裂症抑郁症、孤独症谱系障碍(ASD)以及双相型障碍(BPD)。事实上,一些精神和行为障碍与具有改变的形态和/或功能的神经系统相关联。因此,健康NSC和/或NPC的移植可以引起形态上和功能上健康的定型神经细胞的生成以及精神和行为障碍的消退。
[0297] 根据本发明的细胞组合物还可以用于治疗遗传性疾病。与NSC和/或NPC相关联的遗传性疾病可以通过自体或同种异体NSC的遗传修饰以改正遗传缺陷来治疗。例如,亨廷顿氏病(HD)是一种遗传病,并且具有患病父母的儿童具有50%的几率遗传导致该疾病的遗传错误。此错误发生在具有称为亨廷顿的蛋白质的遗传密码的基因中。此缺陷性基因致使身体产生错误毒性版本的亨廷顿蛋白,并且这最终导致中型多棘神经元(MSN)和其他神经元的丧失。向其细胞包含缺陷性基因的受试者给予包含健康NSC和/或NPC的细胞组合物可以使得受试者能够产生健康亨廷顿蛋白。
[0298] 在同种异体NSC和/或NPC的情况下,正常细胞形成没有基因缺陷的相同物种的哺乳动物,可以用作疗法。
[0299] 可以设想用于转移和固定NSC和/或NPC和/或MSC以及包含NSC和/或NPC和/或MSC的组合物的各种程序,包括将分离细胞注射到缺陷(例如,脑或脊髓的损害)位点中,在合适的凝胶中孵育分离细胞并植入,与生物可吸收性支架一起孵育,或通过全身输注等。不同的程序是本领域技术人员已知的。
[0300] 任选地,NSC和/或NPC和/或MSC可以与针对整联蛋白α10的抗体一起孵育,以便将细胞保持在适当位置。因此,抗体可以缀合到生物可吸收性支架,从而允许在植入到受损或缺陷位点中(例如植入到神经缺陷的位点中)之前固定细胞。该支架允许NSC和/或NPC和/或MSC的3D固定。以下例示合适的生物材料支架。给出的例子并不限制选择使用对于本领域技术人员明显的其他合适的支架(如果对于特定应用更合适的话)。
[0301] 支架的类型包括生物可吸收性聚(α-羟基酯)支架,诸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和共聚物(PLGA)。
[0302] 另外的实施方案包括衍生自聚合物凝胶诸如透明质酸、胶原蛋白、藻酸盐和壳聚糖的支架。
[0303] 实施例
[0304] 实施例1:从小鼠室下区(SVZ)分离细胞和流式细胞术分析
[0305] SVZ分离
[0306] 从小鼠幼崽和成体的SVZ分离神经干细胞/祖细胞。对小鼠进行去头处理,将脑取出,放置在具有抗生素的冷PBS中,并且采集含有SVZ的切片(1mm厚)。将SVZ从侧脑室前侧壁解剖。将组织在37℃下在StemPro Accutase(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))溶液中消化20分钟。在用P200和P20头研磨之后,将细胞悬浮液过滤(50μm过滤器,BD生物科学公司(BD Biosciences))并且在37℃下在5%CO2下铺板在NSP培养基中:DMEM/F12w/Glutamax和神经基础培养基(1:1)(吉布科公司(Gibco)),补充有1x B27(吉布科公司)、1x N2(吉布科公司)、100U/mL抗生素-抗真菌剂(吉布科公司)、bFGF(20ng/ml)(吉布科公司)和EGF(20ng/ml)(吉布科公司)。在大约5天之后球体开始出现。使用Accutase每
5-7天进行细胞传代。
[0307] 流式细胞术程序
[0308] 1.抗体:使用针对整联蛋白α10亚基的单克隆抗体。将细胞离心并且每个Eppendorf管添加100μL的等分试样。使用来自0.2mg/mL原液的1μg/mL对照小鼠IgG2a抗体作为对照。
[0309] 2.将细胞与初级抗体在冰上一起孵育60min。
[0310] 3.将细胞在500μl染色缓冲液(PBS+/+具有2%FBS)中洗涤两次。
[0311] 4.添加二级抗体并且将细胞在冰上孵育45分钟。
[0312] 5.将细胞在500μL染色缓冲液中洗涤2-3次。
[0313] 6.将500μL染色缓冲液添加到小球并且将细胞重悬浮。
[0314] 7.通过流式细胞术分析细胞。
[0315] 结论:此实施例示出了从成体小鼠脑的室下区分离的细胞表达整联蛋白α10β1,参见图1B。
[0316] 实施例2:通过免疫荧光对小鼠脑组织中整联蛋白α10β1和其他标记物的共表达的分析
[0317] 将新鲜冷冻的小鼠脑组织包埋入TissueTek(樱花公司,日本(Sakura,Japan))中。在SuperFrost Plus载玻片(Menzel- 有限公司)上采集10μm切片(在MICROM HM 
500OM低温保持器中制备)。在用丙后固定(100%,在-20℃下,进行10min)之后,将切片用于免疫标记。
[0318] 将冷冻切片在37℃下进行空气干燥,持续约20min。当切片达到室温时,将它们在PBS(磷酸盐缓冲盐水,0.1M,pH 7.4)中冲洗两次,持续5min。将氧烷阻隔物(“PAP笔”)施加在切片周围。将切片在室温下在含有0.05%(0.1-0.001)Triton X-100和1%BSA的PBS中孵育30min,并且然后在PBS1x2min中冲洗。将切片与在针对不同抗原的不同物种中制备的初级抗体的混合物一起孵育(首先单独评估特异性和最佳工作稀释度)。在4℃-8℃下,与α10pAb1.2μg/ml(0.6-1.2μg/ml)(在含有0.05%Triton X-100和1%BSA的PBS中稀释)一起进行孵育16-18小时。对于两个表位的同时荧光可视化,作为混合物(“混合物(cocktail)”)分别施加初级抗体和二级抗体。将切片在PBS中冲洗1min,接着冲洗2x 5min,并且在室温下在1:150稀释的混合物中与荧光团缀合的一种或多种二级Ab一起孵育30-45min。
[0319] 在驴中或在山羊中制备针对兔、小鼠、或山羊IgG或针对鸡IgY的用于多次标记的二级抗体(高度亲和纯化的,主要是Fab2片段)(美国杰克逊实验室(Jackson,USA)或美国英杰公司(Invitrogen,USA)),并且在含有1%BSA的PBS中稀释。对于两个表位的同时荧光可视化,作为混合物(“混合物(cocktail)”)施加初级抗体和二级抗体。首先将切片在PBS-Triton X100中冲洗2min,并且然后在PBS1x 5min中冲洗。将切片在PBS中稀释的0.1μM细胞器(细胞核)染色DAPI中孵育15min,并且在PBS中冲洗2x 5min。在“抗褪色溶液(anti-fade solution)”ProLong Gold(美国英杰公司)中安装切片并且盖上盖玻片。用于本发明的研究的抗体在表2中给出。
[0320] 表2.用于本发明的研究的抗体。
[0321]
[0322] 分析:
[0323] 通过共聚焦激光扫描显微镜法和落射荧光进行分析。
[0324] 利用用于在305-633nm之间激发且用于检测在420-650nm之间发射的激光器,在Zeiss LSM 510META共聚焦显微镜中检查样本。使用20x/0,8平场复消色差透镜和40x/1,3油浸没平场复消色差透镜物镜获取图像,具有三个免疫荧光通道、一个DAPI通道和一个明视场DIC通道。
[0325] 使用40x/1,3物镜获得连续共聚焦平面的Z堆叠(没有DIC),使用1024x1024px大小(像素宽度0,22μm),或使用“缩放”(扫描较小区域)和奈奎斯特最佳采样频率(像素宽度0,115μm)以用于最大分辨率。连续共聚焦平面之间的步长大小是根据奈奎斯特最佳采样频率(0.48μm)。
[0326] 结果:来自免疫荧光染色和共聚焦显微镜法的图像指示,整联蛋白α10β1在成体小鼠组织的SVZ中表达(图5),整联蛋白α10β1和巢蛋白在成体小鼠脑组织的SVZ中表达且共定位(图6),整联蛋白α10β1和PSA-NCAM在成体小鼠脑组织的SVZ中表达且部分共定位(图7);整联蛋白α10β1和GFAP在成体小鼠脑组织的SVZ中表达且部分共定位(图8),以及整联蛋白α
10β1和SOX2在新生小鼠脑组织的SVZ中表达且部分共定位(图9)。使用流式细胞术还看到整联蛋白α10β1和PDFGRα在成体小鼠脑组织的SVZ中共定位,如图10所示。
[0327] 来自免疫荧光染色、共聚焦显微镜法和落射荧光的图像指示,整联蛋白α10β1和SOX2在新生小鼠脑组织的颗粒细胞下层中表达且部分共定位(图11),以及整联蛋白α10β1和PDFGRα在新生小鼠脑组织的脑膜中表达其部分共定位(图12)。
[0328] 结论:在此实施例中,显示各种标记物在成体小鼠脑组织的SVZ中表达并与整联蛋白α10β1部分共定位。
[0329] 实施例3:分离小鼠NSP/NSP细胞的分化和基因表达分析
[0330] 为了确认特定神经细胞谱系,使用定量PCR测定来测量基因表达。
[0331] RNA提取和定量PCR
[0332] 使用RNeasy Plus微试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从细胞或组织提取总RNA,并且然后使用SuperScript cDNA合成试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))反转变为cDNA。对于定量PCR,使用TaqMan基因表达主要混合物(生命技术公司)和TaqMan探针(赛默飞世尔科技公司)。将靶基因的循环阈值针对管家基因Gapdh的几何平均值归一化以得到ΔCt。针对最终分析来计算2的-ΔCt次方(2-ΔCt),参见图4。用于qPCR分析的Taqman探针在表3中给出。
[0333] 表3.用于qPCR分析的Taqman探针。
[0334]
[0335] 结论:结果显示Map2、β-微管蛋白III、Gfap和O4的基因表达的上调(图4)。这指示分离NSC/NSP有效分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
[0336] 实施例4:作为神经球培养整联蛋白α亚基阳性神经干细胞
[0337] 从出生后的成体小鼠(C57Bl/6)的SVZ分离神经干细胞/祖细胞。分离脑,并且在37℃下将侧脑室壁解剖并在StemPro Accutase(赛默飞世尔科技公司)中消化20min。将组织用P200和p20头研磨,并且将细胞悬浮液过滤(50μm过滤器,BD生物科学公司)并铺板在补充有B27(吉布科公司)、N2(吉布科公司)、100U/mL抗生素-抗真菌剂(吉布科公司)、bFGF(20ng/ml)(吉布科公司)和EGF(20ng/ml)(吉布科公司)的NSP培养基(DMEM/F12w/Glutamax和神经基础培养基(1:1)(吉布科公司)中。使用Accutase每5天进行细胞传代。
[0338] 结果:来自免疫荧光染色、接着共聚焦显微镜法的流式细胞术和图像显示,作为神经球培养的细胞亚群表达整联蛋白α10β1和其他干细胞标记物(图2和图3)。
[0339] 实施例5:通过给予通过检测整联蛋白α10亚基表达鉴定和分离的NSC富集群体来治疗小鼠的中风
[0340] 小鼠NSC的分离和培养
[0341] 根据实施例1中所述的程序从完整小鼠脑分离表达整联蛋白α10亚基的神经干细胞。
[0342] 在分离之后,以神经球形式培养神经干细胞,如实施例4中所述。
[0343] 在1:3的分流比下每4-6天进行传代。通常,第3代的细胞可易于用于实验。第3代的NSC也用于表征。通过流式细胞术检查神经干细胞标记物CD133和PDFGRα以及整联蛋白α10β1。
[0344] 永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)
[0345] 例如遵循Engel等人(2011)中描述的程序以手术方式生成小鼠中的pMCAO。
[0346] 将不同数量的稳定表达α10β1的NSC细胞移植到受中风困扰的小鼠脑中小鼠接受单一剂量的2.5×106、5×106或10×106个NSC-α10细胞。通过使用磁共振成像立体定向技术限定残余中风体积周围的靶位点来植入整联蛋白α10β1阳性NSC。
[0347] 总之,此研究证明,具有用于治疗中风的NSC-α10表达细胞的脑内干细胞移植物通常是安全的并为小鼠良好耐受,并且导致改善的神经功能。
[0348] 小鼠BM-MSC的分离和培养
[0349] 通过颈椎脱位法处死4周或8周大的小鼠并且放置在100mm细胞培养皿(贝克顿迪金森公司,富兰克林湖,新泽西州,美国(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA))中,其中将全身浸泡在70%(v/v)乙醇中2分钟,并且然后将小鼠转移到的新培养皿。将在脚踝和腕关节处的四个爪解剖,并且在后肢与躯干、前肢、躯干之间的连接部周围制作切口。随后通过朝向爪的切割位点牵拉将整个皮肤从后肢和前肢去除。使用微解剖剪刀和外科手术刀将肌肉、韧带、和肌小心从胫骨、股骨、和肱骨脱离。通过在关节处切割解剖胫骨、股骨、和肱骨,并且将骨转移到无菌纱布上。小心刮擦骨以去除残余的软组织,并且转移到在冰上的具有10mL完全α-MEM培养基的100-mm无菌培养皿上。在动物死亡后30分钟内处理所有样品以确保高细胞活力。将软组织从骨完全脱离以避免污染。
[0350] 在生物安全通风橱中,使用含有1%PSN的PBS洗涤骨两次以冲洗掉血细胞和残余软组织,然后将骨转移到具有10mL完全α-MEM培养基的新的100-mm无菌培养皿上。将骨用夹钳固定,并且使用微解剖剪刀在稍微低于骨髓腔的端部处切除两端。使用附接到5mL注射器的23号针将5mL完全α-MEM培养基从培养皿抽出;然后将针插入到骨腔中。缓慢冲洗出骨髓,并且再次洗涤骨腔两次,直至骨变淡白为止。使用夹钳从培养皿取出所有骨片,从而将固体物质留在培养基中,并且将培养皿在5%CO2培养箱中在37℃下孵育5天。为了获得足够的骨髓细胞,重复冲洗骨腔,直至骨显现为淡白色为止。
[0351] 在相差显微镜法中初始纺锤形细胞在第3天出现,并且然后培养物的汇合度变得更高,并且在仅2天内达到70%-90%汇合度。将细胞用PBS洗涤两次,并且在37℃下用2.5mL的0.25%胰蛋白酶消化2分钟,然后用7.5mL的完全α-MEM培养基中和胰蛋白酶。使用移液管辅助器冲洗板的底部,并且将细胞转移到15mL Falcon管(贝克顿迪金森公司),将其在800g下离心5分钟,并且将细胞在1:3的分流比下重悬浮在75cm2细胞培养烧瓶(康宁公司,康宁,纽约州,美国(Corning Inc,Corning,NY,USA))中。
[0352] 在1:3的分流比下每4-6天进行传代。通常,第3代的细胞比第1代和第2代的细胞含有更少的巨噬细胞和血细胞以及更少的脂肪,并且因此可易于用于实验。
[0353] 第3代的BM-MSC用于表征。通过流式细胞术检查间充质干细胞标记物CD44和CD90、内皮细胞标记物CD31和造血细胞标记物CD45。
[0354] 将整联蛋白α10β1经慢病毒转导到BM-MSC中
[0355] 第1天:将新鲜培养基中的1.6x 104个BM-MSC细胞添加到96孔板中每个构建体所需数量的孔。应当使用每个慢病毒构建体和对照的一式两份或一式三份的孔。在5%-7%CO2的环境中在潮湿培养箱中在37℃下孵育18-20小时。
[0356] 第2天:从孔去除培养基。将110μl培养基和海地美溴铵(最终浓度8μg/ml)添加到每个孔。轻微旋动板以进行混合。将2-15μl的α10β1或对照慢病毒颗粒添加到适当的孔。轻微旋动板以进行混合。在5%-7%CO2的环境中在潮湿培养箱中在37℃下孵育18-20小时。
[0357] 第3天:从孔去除含有慢病毒颗粒的培养基。向每个孔添加新鲜培养基至120μl的体积。
[0358] 第4天:从孔去除培养基。添加含有嘌呤霉素的新鲜培养基。
[0359] 第5天及之后:每3-4天用新鲜的含有嘌呤霉素的培养基替换培养基,直至可以鉴定抗性集落为止。
[0360] 永久性大脑中动脉阻塞(pMCAO)
[0361] 例如遵循Engel等人(2011)中描述的程序以手术方式生成小鼠中的pMCAO。
[0362] 将不同数量的稳定过表达α10β1的BM-MSC细胞移植到小鼠脑的中风区域中[0363] 小鼠接受单一剂量的2.5×106、5×106或10×106个BM-MSC-α10细胞。通过使用磁共振成像立体定向技术限定残余中风体积周围的靶位点来植入NSCs-α10β1。
[0364] 结论:总之,此研究证明,具有用于治疗中风的BM-MSC-α10表达细胞的脑内干细胞移植物通常是安全的并为小鼠良好耐受,并且导致改善的神经功能。
[0365] 实施例6:中风小鼠模型中整联蛋白α10β1的表达
[0366] 中风模型
[0367] 在C57BL/6小鼠(25-30g,查尔斯河,德国(Charles River,Germany))上进行程序。简而言之,使用通过光栓疗法(PT)产生的永久性病灶性缺血模型。在手术过程中将体温保持在37℃下。将小鼠用异氟烷(在自然通风下在O2中2%)麻醉。在尾静脉中静脉内注射玫瑰红感光染料(10mg/ml,西格玛公司(Sigma))。切开颅骨上的皮肤。在立体定向限定的位置(前卤侧边1mm以及前侧/后侧+2/-2mm)处用冷光(Kl 1500LCD,肖特公司(Schott))和绿色滤光器(510nm)通过暴露的颅骨照射脑20分钟。作为对照,取出并冷冻小鼠脑。
[0368] 响应于中风,截至第七天整联蛋白α10β1的表达明显增加(图13)。共聚焦分析显示,神经元上的NeuN表达在中风区域中也增加,并且存在整联蛋白α10β1和NeuN的部分共定位(图14B和图14C)。此外,成熟星形胶质细胞上GFAP的表达在中风区域中增加(图14E和图14F),并且发现与整联蛋白α10β1共定位。小神经胶质细胞标记物Iba1也在中风区域内发现(图14H和图14I),但是未在对照脑组织中发现(图14G)。然而,它不与整联蛋白α10β1共定位。这表明,整联蛋白α10β1鉴定可能参与在中风之后使脑组织再生的细胞类型。
[0369] 结论:作为对于中风的响应,整联蛋白α10β1单独的或与其他标记物(NeuN、GFAP和Iba1)一起的表达增加可以在中风患者中用作确定中风区域和预测损伤的严重性和结果的生物标记物。
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[0404] Zhang et al(2006)Cell Research 16:909–15.
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