治疗剂及其用途
阅读：116发布：2020-07-06
专利汇可以提供治疗剂及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了在 治疗 前列腺癌 中使用的包含对激肽释放酶蛋白(例如PsA或hK2)具有特异性的结合模 块 或由该结合模块组成的药剂，及用于治疗患者中的前列腺癌的方法，该方法包括对患者施用 治疗有效量 的包含对激肽释放酶蛋白具有特异性的结合模块或由该结合模块组成的药剂的步骤。，下面是治疗剂及其用途专利的具体信息内容。
1.包含(a)对人腺激肽释放酶(hK2)具有特异性的抗体或其抗原结合片段和(b)细胞毒性放射性同位素或由(a)和(b)组成的试剂，其在治疗患者中的前列腺癌中使用，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段直接或间接连接至所述细胞毒性放射性同位素。
2.权利要求1的试剂，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段包含抗体
11B6的一个或多个互补决定区(CDR)。
3.权利要求2的试剂，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段包含抗体
11B6及其抗原结合片段或由抗体11B6及其抗原结合片段组成。
4.权利要求1的试剂，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段通过螯合模块连接至所述细胞毒性放射性同位素。
5.权利要求1的试剂，其中所述细胞毒性放射性同位素选自下组：β发射体、俄歇(Auger)发射体、转换电子发射体、α发射体、和低光子能发射体。
6.权利要求1的试剂，其中所述细胞毒性放射性同位素具有在所述试剂附近产生高剂量吸收率(absorbance)的局部吸收能量的发射样式。
7.权利要求1的试剂，其中所述细胞毒性放射性同位素能够同时以多模式方式充当可检测模块及还充当细胞毒性模块。
8.权利要求1的试剂，其中所述试剂进一步包含延长所述试剂的体内半衰期的模块。
9.权利要求8的试剂，其中所述延长体内半衰期的模块选自下组：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖苷。
10.权利要求1的试剂，其中要治疗的前列腺癌是非局限性(即弥漫性)前列腺癌。
11.权利要求1的试剂，其中要治疗的前列腺癌是转移性前列腺癌。
12.权利要求11的试剂，其中要治疗的转移性前列腺癌是淋巴系统转移；骨的转移；骨盆、直肠、膀胱、尿道内的转移。
13.权利要求1的试剂，其中所述患者具有前列腺癌，并且在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于70岁龄。
14.权利要求1的试剂，其中所述患者的特征在于家族成员先前已经诊断为前列腺癌。
15.权利要求1的试剂，其中要治疗的前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)。
16.试剂在制备用于治疗患者中的前列腺癌的药物中的用途，所述试剂包含(a)对人腺激肽释放酶(hK2)具有特异性的抗体或其抗原结合片段和(b)细胞毒性放射性同位素或由(a)和(b)组成，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段直接或间接连接至所述细胞毒性放射性同位素。
17.权利要求16的用途，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段包含抗体
11B6的一个或多个互补决定区(CDR)。
18.权利要求17的用途，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段包含抗体
11B6及其抗原结合片段或由抗体11B6及其抗原结合片段组成。
19.权利要求16的用途，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段通过螯合模块连接至所述细胞毒性放射性同位素。
20.权利要求16的用途，其中所述细胞毒性放射性同位素选自下组：β发射体、俄歇(Auger)发射体、转换电子发射体、α发射体、和低光子能发射体。
21.权利要求16的用途，其中所述细胞毒性放射性同位素具有在所述试剂附近产生高剂量吸收率(absorbance)的局部吸收能量的发射样式。
22.权利要求16的用途，其中所述细胞毒性放射性同位素能够同时以多模式方式充当可检测模块及还充当细胞毒性模块。
23.权利要求16的用途，其中所述试剂进一步包含延长所述试剂的体内半衰期的模块。
24.权利要求23的用途，其中所述延长体内半衰期的模块选自下组：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖苷。
25.权利要求16的用途，其中要治疗的前列腺癌是非局限性(即弥漫性)前列腺癌。
26.权利要求16的用途，其中要治疗的前列腺癌是转移性前列腺癌。
27.权利要求26的用途，其中要治疗的转移性前列腺癌是淋巴系统转移；骨的转移；骨盆、直肠、膀胱、尿道内的转移。
28.权利要求16的用途，其中所述患者具有前列腺癌，并且在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于70岁龄。
29.权利要求16的用途，其中所述患者的特征在于家族成员先前已经诊断为前列腺癌。
30.权利要求16的用途，其中要治疗的前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)。
31.治疗剂，其包含对人腺激肽释放酶(hK2)具有特异性的抗体或其抗原结合片段和如前述权利要求中任一项限定的细胞毒性放射性同位素，其中所述对hK2具有特异性的抗体或其抗原结合片段直接或间接连接至所述细胞毒性放射性同位素，其中所述治疗剂适合治疗前列腺癌。
32.药物组合物，其包含治疗有效量的如前述权利要求中任一项限定的试剂和药学可接受稀释剂、载体或赋形剂。
33.依照权利要求32的药物组合物，其适合于胃肠外投递。
34.依照权利要求32的药物组合物，其适合于静脉内、皮下或肌肉内投递。
35.依照权利要求32的药物组合物，其适合于通过注射投递。
36.试剂盒，其包含如权利要求1至15中任一项限定的试剂或如权利要求32-35中任一项限定的药物组合物。
治疗剂及其用途
发明领域
[0001] 一般而言，本发明属于治疗剂和方法领域，特别是在前列腺癌领域。
[0002] 发明背景
[0004] 目前，前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。前列腺是男性中胡桃大小的腺体，其产生作为精液组分的流体。前列腺具有两个或更多个由组织的外层围绕的叶或部分。前列腺位于直肠前面且刚好在尿液膀胱下，并且围绕着尿道。
[0005] 前列腺癌的发病率在欧洲西北部和美国最高。肿瘤的生长通常是在较长的时间段期间发生的过程。前列腺癌通常是温和形式的癌症。实际上，大多数诊断为前列腺癌的男性确能存活，并且仅少数男性遭遇更具攻击性的前列腺癌形式，其在早期阶段中转移。这种前列腺癌形式仅在其在早期阶段中诊断时，在癌症扩增到囊外组织前可治愈。
[0006] 目前，前列腺癌的诊断和监测可以通过测量患者血液中的前列腺特异性抗原(PSA)的浓度实施。若PSA的浓度在不同时间点时实施的几次连续测量中明显较高，则估计
存在有前列腺癌的可能性。在此时间点，可以实施活组织检查来确认前列腺癌。
存在有前列腺癌的可能性。在此时间点，可以实施活组织检查来确认前列腺癌。
[0007] PSA(又称为激肽释放酶(kallikrein)III)是一种由237个氨基酸的单链构成的蛋白质，其在前列腺的分泌细胞中生成。这些分泌细胞可见于整个前列腺中。就前列腺癌而言PSA是公认并且经彻底研究的标志物。与健康细胞比较，PSA的生成在恶性细胞中较低，而在增生细胞中较高。因此，矛盾的是，实际上，PSA的浓度在来自患有前列腺癌的男性的血液中较高。然而，一种解释可以是恶性细胞具有损坏的细胞结构，并且因此对PSA更通透。
[0008] 另一种重要的丝氨酸蛋白酶(其可以适合于前列腺癌的未来治疗)是人腺激肽释放酶2(hK2)。编码hK2的基因与编码PSA的基因一起位于染色体19上。hK2主要在前列腺组织中表达，就像PSA一样。在前列腺中，PSA以无活性的原形式(pro-form)存在，并且通过hK2的肽酶作用而被活化。针对hK2的免疫组织化学研究已经显示了hK2的表达与分化水平相关。
这意味着hK2在低分化的组织(诸如经受前列腺癌的组织)中以较高的产率，而在高分化的
组织(诸如经受良性前列腺增生(BPH)的组织，所述良性前列腺增生(BPH)是另一种常见的
前列腺问题)的组织中以较低的产率表达。
这意味着hK2在低分化的组织(诸如经受前列腺癌的组织)中以较高的产率，而在高分化的
组织(诸如经受良性前列腺增生(BPH)的组织，所述良性前列腺增生(BPH)是另一种常见的
前列腺问题)的组织中以较低的产率表达。
[0009] 目前的前列腺癌疗法是手术(例如根治性前列腺切除术)、放射疗法(包括近程治疗(brachytherapy)和外束放射疗法、高强度聚焦超声(HIFU)、化学疗法、口服化疗性药物、冷冻手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述疗法的组合。
[0010] 然而，大多数这些疗法(手术和外部放射疗法)仅仅(或主要)可用于治疗原发性肿瘤和较大的转移。化学疗法用于弥散性癌症，对于大多数这些患者，它是姑息作用和/或延长存活。因此，其它或互补治疗形式对于实现弥散性恶性疾病的较大的改善是必需的，特别是在微转移的情况中。
[0012] 如此，需要用于治疗前列腺癌的新的治疗剂和方法，特别是在弥散性疾病、转移和微转移的情况中。
[0013] 发明概述
[0016] 换言之，本发明的第一个方面涉及包含对激肽释放酶蛋白具有特异性的结合模块或由该结合模块组成的试剂在制造用于治疗前列腺癌的药物中的用途。
[0018] “结合模块”包括能够特异性结合激肽释放酶蛋白的所有类型的化学实体(例如，寡核苷酸、多核苷酸、多肽、肽模拟物和小化合物)。有利地，结合模块能够在生理学条件下选择性(即优先)结合激肽释放酶蛋白。
[0019] 如上文指示的，本发明的试剂可以包含构成对激肽释放酶蛋白具有特异性的结合模块的任何合适的化学实体或由该化学实体组成。
[0020] 适合于检测测试化学实体和激肽释放酶蛋白之间的相互作用的方法是本领域中公知的。例如，可以使用超滤伴离子喷射质谱/HPLC方法或其它物理和分析方法。另外，可以使用荧光能量共振转移(FRET)方法，其中两种荧光标记实体的结合可以通过测量彼此极其
接近时荧光标记物的相互作用测量。
接近时荧光标记物的相互作用测量。
[0021] 检测激肽释放酶蛋白与大分子(例如DNA、RNA、蛋白质和磷脂)的结合的备选方法包括表面等离振子共振测定法，例如如记载于Plant等,1995,Analyt Biochem 226(2),
342-348。此类方法可以利用例如用放射性或荧光标记物标记的多肽。
342-348。此类方法可以利用例如用放射性或荧光标记物标记的多肽。
[0022] 鉴定能够结合激肽释放酶蛋白的化学实体的别的方法是如下的方法，其中将激肽释放酶蛋白暴露于化合物，并且检测和/或测量化合物对所述激肽释放酶蛋白的任何结合。
可以测定化合物对激肽释放酶蛋白的结合的结合常数。适合于检测和/或测量(量化)化合
物对激肽释放酶蛋白的结合的方法是本领域技术人员公知的，并且可以例如使用能够高通
量操作的方法，例如基于芯片的方法实施。称作VLSIPSTM的新技术已经实现含有几十万或更多种不同分子探针的极小芯片的生产。这些生物学芯片具有阵列上排列的探针，对每个探
针分配特定的位置。已经生产生物学芯片，其中每个位置具有例如10微米的等级。可以使用芯片确定靶分子是否与芯片上的任何探针相互作用。在选择的测试条件下将阵列暴露于靶
分子后，扫描装置可以检查阵列中的每个位置，并且确定靶分子是否已经与所述位置处的
探针相互作用。
可以测定化合物对激肽释放酶蛋白的结合的结合常数。适合于检测和/或测量(量化)化合
物对激肽释放酶蛋白的结合的方法是本领域技术人员公知的，并且可以例如使用能够高通
量操作的方法，例如基于芯片的方法实施。称作VLSIPSTM的新技术已经实现含有几十万或更多种不同分子探针的极小芯片的生产。这些生物学芯片具有阵列上排列的探针，对每个探
针分配特定的位置。已经生产生物学芯片，其中每个位置具有例如10微米的等级。可以使用芯片确定靶分子是否与芯片上的任何探针相互作用。在选择的测试条件下将阵列暴露于靶
分子后，扫描装置可以检查阵列中的每个位置，并且确定靶分子是否已经与所述位置处的
探针相互作用。
[0023] 鉴定对激肽释放酶蛋白具有结合亲和力的化合物的另一种方法是酵母双杂交系统，其中本发明的多肽可以用于“捕捉”结合激肽释放酶蛋白的蛋白质。酵母双杂交系统记载于Fields&Song,Nature 340:245-246(1989)。
[0024] 在一个实施方案中，结合模块可以包含多肽或由多肽组成。
[0025] 例如，结合模块可以包含对激肽释放酶蛋白具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段、或保留对激肽释放酶蛋白的结合特异性的所述抗原或抗原结合片段的变体、融合物
或衍生物、或所述其变体或衍生物的融合物，或由上述组成。
或衍生物、或所述其变体或衍生物的融合物，或由上述组成。
[0026] 如此，在本发明的第一个方面的一个实施方案中，结合模块可以是抗体或其抗原结合片段。
[0027] “抗体”包括基本上完整的抗体分子，及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中至少一个氨基酸相对于天然存在的人抗体发生突变)、单链抗体、双抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。
[0028] “抗原结合片段”意指能够结合激肽释放酶蛋白的抗体的功能性片段。上文提及的不同抗体衍生物的结合亲和力可以使用固定浓度的固定化抗体片段和不同浓度的Eu-PSA示踪剂用Scatchard法确定。或者，可以在Biacore仪上使用表面等离振子共振(SPR)技术确定结合亲和力。实施例8中进一步描述分析方法。
[0029] 特别地，抗原结合片段选自下组：Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)、单一可变域(例如VH和VL域)和域抗体(dAb，包含单一和双重形式[即dAb-接头-dAb])。
[0030] 使用抗体片段而不是全抗体的优点有几层。片段的较小尺寸可以导致改善的药理学特性，诸如更好的对实体组织的穿透和/或更快的血清清除，这可以容许更高的治疗比
率。此外，抗原结合片段诸如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可以在微生物诸如大肠杆菌
(E.coli)中表达并且从该微生物中分泌，如此容许大量所述片段的容易生成。
率。此外，抗原结合片段诸如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可以在微生物诸如大肠杆菌
(E.coli)中表达并且从该微生物中分泌，如此容许大量所述片段的容易生成。
[0031] 本发明范围内还包括抗体及其抗原结合片段的修饰型式，例如其通过聚乙二醇或其它合适聚合物的共价附接修饰(参见下文)。
[0032] 生成抗体和抗体片段的方法是本领域中公知的。例如，抗体可以经由几种方法中的任一种生成，所述方法采用抗体分子的体内生成的诱导，筛选免疫球蛋白文库(Orlandi.等,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837；Winter等,1991,Nature 349:293-
299)或通过培养的细胞系生成单克隆抗体。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和埃巴病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler等,1975.Nature 256:4950497；Kozbor等,
1985.J.Immunol.Methods 81:31-42；Cote等,1983.Proc,Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-
2030；Cole等,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120)。
299)或通过培养的细胞系生成单克隆抗体。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和埃巴病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler等,1975.Nature 256:4950497；Kozbor等,
1985.J.Immunol.Methods 81:31-42；Cote等,1983.Proc,Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-
2030；Cole等,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120)。
[0033] 针对选定抗原的合适单克隆抗体可以通过已知的技术制备，例如那些披露于“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)及
“rMonoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell
(CRC Press,1982)中的技术。
“rMonoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell
(CRC Press,1982)中的技术。
[0034] 同样地，可以使用本领域中公知的方法(参见例如Harlow和Lane,1988,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)获得
抗体片段。例如，依照本发明的抗体片段可以通过对抗体的蛋白水解性水解或者通过在大
肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达编
码片段的DNA制备。或者，可以通过常规方法通过对全抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化获得抗体片段。
抗体片段。例如，依照本发明的抗体片段可以通过对抗体的蛋白水解性水解或者通过在大
肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达编
码片段的DNA制备。或者，可以通过常规方法通过对全抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化获得抗体片段。
[0035] 本领域技术人员应当领会，对于人疗法或诊断学，可以使用人的或人源化的抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是具有源自非人抗体的最小部分的经遗传工程化改造的
嵌合抗体或抗体片段。人源化抗体包括其中的人抗体(接受抗体)的互补决定区用来自具有
期望功能性的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的互补决定区的残基替换的抗
体。在一些情况中，人抗体的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含既不存在于接受抗体中也不存在于引入的互补决定区或框架序列中的残基。一般地，人源化
抗体会包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中整个或基本上整个互补决定区
对应于非人抗体，且整个或基本上整个框架区对应于相关人共有序列。任选地，人源化抗体还包含通常源自人抗体的抗体恒定区(诸如Fc区)的至少一部分(参见例如Jones等,
1986.Nature 321:522-525；Riechmann等,1988,Nature 332:323-329；Presta,1992,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596)。
嵌合抗体或抗体片段。人源化抗体包括其中的人抗体(接受抗体)的互补决定区用来自具有
期望功能性的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的互补决定区的残基替换的抗
体。在一些情况中，人抗体的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含既不存在于接受抗体中也不存在于引入的互补决定区或框架序列中的残基。一般地，人源化
抗体会包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中整个或基本上整个互补决定区
对应于非人抗体，且整个或基本上整个框架区对应于相关人共有序列。任选地，人源化抗体还包含通常源自人抗体的抗体恒定区(诸如Fc区)的至少一部分(参见例如Jones等,
1986.Nature 321:522-525；Riechmann等,1988,Nature 332:323-329；Presta,1992,
Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596)。
[0036] 用于人源化非人抗体的方法是本领域中公知的。一般地，人源化抗体具有从非人来源导入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基(经常称为输入残基)通常从
引入可变域中取得。人源化可以基本上如描述的那样实施(参见例如Jones等,1986,Nature
321:522-525；Reichmann等,1988.Nature 332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science 239:
1534-15361；US 4,816,567)，即用相应的啮齿类互补决定区替换人互补决定区。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于整个的人可变域已经用来自非人物种的相应序列
替换。实际上，人源化抗体通常可以是其中的一个互补决定区残基及可能一些框架残基用
来自啮齿类抗体中类似位置的残基替换的人抗体。
引入可变域中取得。人源化可以基本上如描述的那样实施(参见例如Jones等,1986,Nature
321:522-525；Reichmann等,1988.Nature 332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science 239:
1534-15361；US 4,816,567)，即用相应的啮齿类互补决定区替换人互补决定区。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上小于整个的人可变域已经用来自非人物种的相应序列
替换。实际上，人源化抗体通常可以是其中的一个互补决定区残基及可能一些框架残基用
来自啮齿类抗体中类似位置的残基替换的人抗体。
[0037] 人抗体也可以使用本领域中已知的多种技术鉴定，包括噬菌体展示文库(参见例如Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.222:581；
Cole等,1985,于：Monoclonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77；
Boerner等,1991.J.Immunol.147186-95)。
Cole等,1985,于：Monoclonal antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77；
Boerner等,1991.J.Immunol.147186-95)。
[0038] 一旦获得合适的抗体，可以对它们测试活性，例如通过ELISA。
[0039] 在本发明的第一个方面的备选实施方案中，结合模块包含非免疫球蛋白结合模块或由非免疫球蛋白结合模块组成，例如如记载于Skerra,Curr Opin Biotechnol.2007Aug；
18(4):295-304。
18(4):295-304。
[0040] 在别的备选实施方案中，结合模块包含适体或由适体组成。例如，试剂可以包含肽适体或核酸适体或由肽适体或核酸适体组成(参见Hoppe-Seyler和Butz,2000,J Mol Med.78(8):426-30；Bunka DH和Stockley PG,2006,Nat Rev Microbiol.4(8):588-96及
Drabovich等,2006,Anal Chem.78(9):31 71-8)。
Drabovich等,2006,Anal Chem.78(9):31 71-8)。
[0041] 在又一个备选实施方案中，结合模块包含小化学实体或由小化学实体组成。具有激肽释放酶结合特性的此类实体可以通过筛选小化合物的商业文库(例如如可购自
ChemBridge Corporation,San Diego,USA)鉴定。
ChemBridge Corporation,San Diego,USA)鉴定。
[0042] 因而，依照本发明的第一个方面的试剂中存在的结合模块特异地结合激肽释放酶蛋白。在此上下文中，短语“特异地结合”意指优先于其它蛋白质，任选包括其它激肽释放酶蛋白质，结合模块选择性结合靶激肽释放酶蛋白。技术人员知道用于评估结合分子对靶物
的结合特异性的许多方法。例如，在结合分子是抗体或基于抗体的情况中，其特异性结合激肽释放酶蛋白的能力可以通过免疫测定法，诸如ELISA，放射性免疫测定法等评估。
的结合特异性的许多方法。例如，在结合分子是抗体或基于抗体的情况中，其特异性结合激肽释放酶蛋白的能力可以通过免疫测定法，诸如ELISA，放射性免疫测定法等评估。
[0043] 在一个实施方案中，若结合模块在免疫测定法中和/或在生理学条件(诸如存在于前列腺或如本文中讨论的其它治疗部分中的条件)下以大于1x105、1x106、1x107、2x107、
1x108、2x108、1x109、2x109、1x1010、2x1010、3x1010、1x1011或更多，诸如在1x105至3x1010或更多的范围内的结合亲和力结合激肽释放酶蛋白，则它可以被说成特异地结合激肽释放酶蛋
白。
1x108、2x108、1x109、2x109、1x1010、2x1010、3x1010、1x1011或更多，诸如在1x105至3x1010或更多的范围内的结合亲和力结合激肽释放酶蛋白，则它可以被说成特异地结合激肽释放酶蛋
白。
[0044] 如本发明的第一个方面中使用的结合模块可以对人激肽释放酶蛋白具有特异性。人激肽释放酶蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，其属于发现由至少15个成员组成的人组织激肽释
放酶基因家族(Hsieh ML,Cancer Res 1997；57；2651-6)。激肽释放酶是具有单一多肽链的热稳定性糖蛋白，Mw在27-40kDa之间变化。
放酶基因家族(Hsieh ML,Cancer Res 1997；57；2651-6)。激肽释放酶是具有单一多肽链的热稳定性糖蛋白，Mw在27-40kDa之间变化。
[0045] 如本发明的第一个方面中使用的结合模块可以对选自下组的激肽释放酶蛋白具有特异性：前列腺特异性抗原(PSA；hk3，人激肽释放酶3)和人腺激肽释放酶(hK2)。
[0046] 在一个实施方案中，结合模块对PSA具有特异性。术语PSA意图包括每种已知的PSA形式，诸如游离的PSA、PSA的前体形式、PSA的内部切口形式、低分子量游离PSA、标准重量游离PSA、无活性成熟PSA、PSA的截短形式、PSA的糖基化变体、BPSA、无活性PSA原、和每种PSA复合物，诸如与α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α1-蛋白酶抑制剂(API)、和α2-巨球蛋白(AMG)结合的PSA。图14中提供了PSA的例示性一级氨基酸(参见SEQ ID NO:16)。
[0047] 与从BPH组织分泌的PSA相比，从癌细胞中分泌的PSA为更具活性的状态。在胞外流体中，PSA可以经受蛋白水解降解，如此导致活性的丧失和复合物的形成。如此，标记与PSA结合或复合的化合物或实体，诸如ACT、API、和AMG也在本发明的范围内。
[0048] 在一个优选的实施方案中，与PSA的复合同等型相比，结合模块对PSA的游离(即非复合)同等型具有特异性。对PSA的游离同等型具有特异性的结合模块可以对PSA的游离同
等型上暴露，但是PSA的复合同等型上未暴露的表位，诸如构象性(即非线性)表位具有结合特异性。此类构象性表位的例子由作为PSA催化裂隙周围的激肽释放酶环的一部分的氨基
酸残基形成，并且可以包括His41、Asn96、和Ser189的活性位点三联体。关于PSA上的许多合适表位的进一步讨论和公开内容，参见Leinonen等,Clinical Chemistry 48:12,2208-221
6(2002)，其通过提述并入本文。
等型上暴露，但是PSA的复合同等型上未暴露的表位，诸如构象性(即非线性)表位具有结合特异性。此类构象性表位的例子由作为PSA催化裂隙周围的激肽释放酶环的一部分的氨基
酸残基形成，并且可以包括His41、Asn96、和Ser189的活性位点三联体。关于PSA上的许多合适表位的进一步讨论和公开内容，参见Leinonen等,Clinical Chemistry 48:12,2208-221
6(2002)，其通过提述并入本文。
[0049] 在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对PSA具有特异性的情况中，则结合模块可以与选自下组的抗体及其抗原结合片段竞争对PSA(诸如PSA的游离同等型)，或包含
如由结合模块结合的PSA的反应性表位的肽的结合：PSA30、4D4、5C3、和5A10。此类抗体的进一步讨论可以参见Pettersson等,Clin.Chem,41:10,1480-1488(1995)；Nilsson等,
Brit.J.Cancer,75:6,789-797(1997)；Leinonen等,Clinical Chemistry 48:12,2208-
2216(2002)；Vaisanen等,Anal.Chem.,78:7809-7815(2006)；Evans-Axelsson等,Cancer
Biother.Radiopharm.27:4,243-51,EP 1 320 756B1；及US 20041101914，每篇的内容通过提述并入本文。
如由结合模块结合的PSA的反应性表位的肽的结合：PSA30、4D4、5C3、和5A10。此类抗体的进一步讨论可以参见Pettersson等,Clin.Chem,41:10,1480-1488(1995)；Nilsson等,
Brit.J.Cancer,75:6,789-797(1997)；Leinonen等,Clinical Chemistry 48:12,2208-
2216(2002)；Vaisanen等,Anal.Chem.,78:7809-7815(2006)；Evans-Axelsson等,Cancer
Biother.Radiopharm.27:4,243-51,EP 1 320 756B1；及US 20041101914，每篇的内容通过提述并入本文。
[0050] 下文显示了例示性抗PSA抗体5A10的组分重链和轻链的氨基酸序列(其中CDR序列加下划线)。
[0051] 5A10重链
[0052]EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDEDKRYNPSLKSRLTISEDSSR
NQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS[SEQ ID NO：1]
NQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS[SEQ ID NO：1]
[0053] 5A10轻链
[0054]DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITN
VQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN[SEQ ID NO：2]
VQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN[SEQ ID NO：2]
[0055] 在此背景中，术语“竞争”包括如下的意义，即与选自PSA30、4D4、5C3、和5A10的参照抗体一起存在于竞争测定法的包含结合模块的试剂可以将参照抗体对PSA(诸如游离PSA)的可检测结合水平降低1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％、99％或100％(例如在试剂和参照抗体以等摩尔量存在于测试中，且任选其中在生理学条件下实施测试)。此类分析可以通过免疫放射测量测定法(IRMA)完成，如实施例9中描述的。
70％、80％、90％、95％、99％或100％(例如在试剂和参照抗体以等摩尔量存在于测试中，且任选其中在生理学条件下实施测试)。此类分析可以通过免疫放射测量测定法(IRMA)完成，如实施例9中描述的。
[0056] 在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对PSA具有特异性的情况中，则结合模块可以包含选自下组的抗体的一个或多个互补决定区(CDR)：PSA30、4D4、5C3、和5A10(如上述SEQ ID NO：1至8中加下划线序列显示)。
[0057] 如本领域中公认的，完整的抗体包含6个CDR，其中3个存在于可变轻(VL)变化，而其中其它3个存在于可变重(VH)链。
[0058] 结合分子不一定含有这些抗体中任一个的所有6个CDR以保留抗原结合活性，尽管在一些实施方案中，结合分子可以包含来自选自下组的抗体的所有6个CDR：PSA30、4D4、
5C3、和5A10。
5C3、和5A10。
[0059] 或者，结合模块可以包含来自选自由PSA30、4D4、5C3、和5A10组成的组的抗体的小于6个CDR，诸如：
[0060] ●5个CDR(即3个来自VH或VL区的CDR，2个来自其它可变区的CDR)；
[0061] ●4个CDR(即3个来自VH或VL区的CDR，1个来自其它可变区的CDR；或各2个来自VH和VL区的CDR)；
[0062] ●3个CDR(即所有3个来自VH或VL区之一的CDR，且无一来自另一个；或2个来自VH或VL区的CDR，1个来自另一个可变区的CDR)；
[0063] ●2个CDR(即2个来自VH或VL区之一的CDR，且无一来自另一个；或各1个来自VH和VL区的CDR)；或
[0064] ●1个来自VH或VL区之任一的CDR。
[0065] 本领域中公知的是，3个或更少的CDR区(在一些情况中，甚至仅单一CDR或其部分)能够保留衍生CDR的抗体的抗原结合活性：
[0066] Laune等(1997),JBC,272:30937-44证明了一批源自CDR的六肽展现出抗原结合活性(参见摘要)，并且注意到完整的、单一CDR的合成肽展现出强的结合活性(参见第30942
页，右手栏)。
页，右手栏)。
[0067] Monnet等(1999),JBC,274:3789-96显示了一批12聚体肽，并且有关的框架区具有抗原结合活性(参见摘要)，并且评述单独的CDR3样肽能够结合抗原(参见第3785页，左手
栏)。
栏)。
[0068] Qiu等(2007),Nature Biotechnology,25:921-9显示了由两个连接的CDR组成的分子能够结合抗原(参见摘要和第926页，右手栏)。
[0069] Ladner等(2007),Nature Biotechnology,25:875-7是一篇综述文章，其报告了Qiu等(上文)并且评述了含有两个CDR的分子能够保留抗原结合活性(参见第875页，右手
栏)。
栏)。
[0070] Heap等(2005),J.Gen.Virol.,86:1791-1800报告了“微抗体(micro-antibody)”(含有单一CDR的分子)能够结合抗原(参见摘要和第1791页，左手栏)，并且显示了来自抗
HIV抗体的环肽具有抗原结合活性和功能。
HIV抗体的环肽具有抗原结合活性和功能。
[0071] Nicaise等(2004)Protein Science,13:1882-91显示了单一CDR可以赋予对其溶菌酶抗原的抗原结合活性和亲和力。
[0072] Vaughan和Sollazzo(2001),Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening,4:417-430是一篇综述文章，其描述了含有小于3个CDR区的微型抗体
(minibody)。例如，在第418页(右栏-3我们的设计策略)，描述了微型抗体，其仅包含框架区内散布的H1和H2CDR高变区。微型抗体描述为能够结合靶物。
(minibody)。例如，在第418页(右栏-3我们的设计策略)，描述了微型抗体，其仅包含框架区内散布的H1和H2CDR高变区。微型抗体描述为能够结合靶物。
[0073] Quiocho(1993),Nature,362:293-4是又一篇综述类型的文章，其提供了微型抗体技术的汇总(即微型化的抗体，在此情况中具有小于3个CDR)。
[0074] Pessi等(1993)，Nature，362：367-9及Bianchi等(1994)，J.Mol.Biol.，236：649-59是Vaughan和Sollauo综述中提及的文章，并且更加详细描述了H1和H2微型抗体及其特
性。
性。
[0075] Gao等(1994)，J.Biol.Chem.，269：32389-93，其描述了对其底物血管活性肠肽具有高亲和力的全VL链(包括所有3个CDR)，作为没有必要具有VH和VL链两者的证据。
[0077] 在一个优选的实施方案中，在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对PSA具有特异性的情况中，则结合模块是抗体或其抗原结合片段或衍生物，其包含例示性抗PSA抗体5A10的6个CDR。
[0078] 在一个备选的实施方案中，在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对PSA具有特异性的情况中，则结合模块可以包含选自下组的抗体及其抗原结合片段或由该抗体及
其抗原结合片段组成：PSA30、4D4、5C3、和5A10。
其抗原结合片段组成：PSA30、4D4、5C3、和5A10。
[0079] 在本发明的第一个方面的另一个实施方案中，结合模块对人腺激肽释放酶(hK2)具有特异性。
[0080] 术语hK2意图包括hK2的所有异构形式，和与hK2复合的任何分子或蛋白质。例示性的hK2序列描述为转录物：KLK2-201(ENST00000325321)，即基因ENSG00000167751的产物，如在可以参见以下万维网地址的Ensemble数据库中给出：
[0081] ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein？g＝ENSG00000167751；r＝19：51376689-51383822；t＝ENST00000325321
[0082] 并且具有以下序列：
[0083] MWDLVLSIAL SVGCTGAVPL IQSRIVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC GGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL YNMSLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA
KITDVVKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSI EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS NDMCARAYSE KVTEFMLCAG
LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKVVHYR KWIKDTIAAN P[SEQ ID
NO：3]
KITDVVKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSI EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS NDMCARAYSE KVTEFMLCAG
LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKVVHYR KWIKDTIAAN P[SEQ ID
NO：3]
[0084] 存在于精液浆中大部分hK2是无活性的，并且与蛋白C抑制剂(PCI)复合。也有可能的是，hK2与其它胞外蛋白酶抑制剂形成复合物。体外研究显示了hK2可以结合α2-抗血纤维蛋白酶(α2-AP)、ACT、AMG、抗凝血酶III(ATIII)、C1-灭活剂和血纤蛋白溶解酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)。
[0085] 如此，标记与hK2结合或复合的化合物、分子、蛋白质或任何其它实体，诸如PCI、α2-抗血纤维蛋白酶(α2-AP)、ACT、AMG、抗凝血酶III(ATIII)、C1-灭活剂和血纤蛋白溶解酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)也在本发明的范围内。
[0086] 在一个实施方案中，与hK2的复合同等型相比，结合模块对hK2的游离(即未复合)同等型可以具有特异性。对hK2的游离同等型具有特异性的结合模块可以对在hK2的游离同
等型上暴露，但是在hK2的复合同等型上未暴露的表位具有结合特异性，并且这可以是线性或构象性(即非线性)表位。例如，结合模块可以对在游离hK2中暴露并且在复合同等型(诸
如在hK2与PCI复合时存在于精液中的形式)中未暴露的表位具有特异性，所述表位包含作
为hK2的催化裂隙的一部分的一个或多个氨基酸残基。hK2的表位定位记载于Vaisanen等，
Clinical Chemistry 50：9，1607-1617(2004)(其公开内容通过提述并入本文)。
等型上暴露，但是在hK2的复合同等型上未暴露的表位具有结合特异性，并且这可以是线性或构象性(即非线性)表位。例如，结合模块可以对在游离hK2中暴露并且在复合同等型(诸
如在hK2与PCI复合时存在于精液中的形式)中未暴露的表位具有特异性，所述表位包含作
为hK2的催化裂隙的一部分的一个或多个氨基酸残基。hK2的表位定位记载于Vaisanen等，
Clinical Chemistry 50：9，1607-1617(2004)(其公开内容通过提述并入本文)。
[0087] 在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对hK2具有特异性的情况中，则结合模块可以与选自下组的抗体竞争对hK2或包含如由结合模块结合的h2K的反应性表位的肽
的结合：11B6和7G1。此类抗体的进一步讨论可以参见Vaisanen等，Clinical Chemistry，
50：9，1607-1617(2004)；及Vaisanen等，Anal.Chem.，78：7809-7815(2006)，每篇的内容通过提述并入本文。
的结合：11B6和7G1。此类抗体的进一步讨论可以参见Vaisanen等，Clinical Chemistry，
50：9，1607-1617(2004)；及Vaisanen等，Anal.Chem.，78：7809-7815(2006)，每篇的内容通过提述并入本文。
[0088] 下文显示了例示性抗hK2抗体11B6的组分重链和轻链的氨基酸序列(其中CDR序列加下划线)。
[0089] 11B6重链
[0090]DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSITRDTSKN
QFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO：4]
QFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO：4]
[0091] 11B6轻链
[0092]DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSL
NIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK[SEQ ID NO：5]
NIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK[SEQ ID NO：5]
[0093] 在此上下文中，术语“竞争”包括如下的意义，即与选自11B6和7G1的参照抗体一起存在于竞争测定法的包含结合模块的试剂可以将参照抗体对hK2的可检测结合水平降低1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或
100％(例如在试剂和参照抗体以等摩尔量存在于测试中，且任选其中在生理学条件下实施
测试)。此类分析可以通过免疫放射测量测定法(IRMA)完成，如实施例9中描述的。
100％(例如在试剂和参照抗体以等摩尔量存在于测试中，且任选其中在生理学条件下实施
测试)。此类分析可以通过免疫放射测量测定法(IRMA)完成，如实施例9中描述的。
[0094] 在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对hK2具有特异性的情况中，则结合模块可以包含选自下组的抗体的一个或多个互补决定区(CDR)：11B6和7G1(如上述SEQ ID
NO:10至13中以下划线序列显示的)。
NO:10至13中以下划线序列显示的)。
[0095] 结合分子不一定含有这些抗体中任一个的所有6个CDR以保留抗原结合活性，尽管在一些实施方案中，结合分子可以包含来自选自下组的抗体的所有6个CDR：11B6和7G1。
[0096] 或者，结合模块可以包含来自选自由11B6和7G1组成的组的抗体的小于6个CDR，诸如：
[0097] ●5个CDR(即3个来自VH或VL区的CDR，2个来自其它可变区的CDR)；
[0098] ●4个CDR(即3个来自VH或VL区的CDR，1个来自其它可变区的CDR；或各2个来自VH和VL区的CDR)；
[0099] ●3个CDR(即所有3个来自VH或VL区之一的CDR，且无一来自另一个；或2个来自VH或VL区的CDR，1个来自另一个可变区的CDR)；
[0100] ●2个CDR(即2个来自VH或VL区之一的CDR，且无一来自另一个；或各1个来自VH和VL区的CDR)；或
[0101] ●1个来自VH或VL区之任一的CDR。
[0102] 在一个优选的实施方案中，在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对hK2具有特异性的情况中，则结合模块是抗体，或其抗原结合片段或衍生物，其包含例示性抗hK2抗体11B6的6个CDR(参见SEQ ID NO:4和5的加下划线序列)。
[0103] 在一个备选实施方案中，在如本发明的第一个方面中使用的结合模块对hK2具有特异性的情况中，则结合模块可以包含选自下组的抗体及其抗原结合片段或由该抗体及其
抗原结合片段组成：11B6和7G1。
抗原结合片段组成：11B6和7G1。
[0104] 任选地，本发明的第一个方面中使用的试剂可以进一步包含治疗性模块。因而，试剂可以包含如上文描述的结合模块和治疗性模块或由如上文描述的结合模块和治疗性模块组成。结合模块可以与治疗性模块直接或间接连接。
[0105] 在试剂可以包含如上文描述的结合模块和治疗性模块或由如上文描述的结合模块和治疗性模块组成的情况中，则例如如下文实施例中使用的条件下测试时，试剂可以展
现出与由单独的结合模块组成的试剂的肿瘤摄取特征基本上等同的肿瘤摄取特征。在此上
下文中，基本上等同的包括大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％或基本上100％的意义。
现出与由单独的结合模块组成的试剂的肿瘤摄取特征基本上等同的肿瘤摄取特征。在此上
下文中，基本上等同的包括大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％或基本上100％的意义。
[0106] 可以使用任何合适的治疗性模块。合适的治疗性模块是能够降低或抑制前列腺癌细胞生长，或特别是杀死前列腺癌细胞的治疗性模块。例如，治疗剂可以是细胞毒性模块。
细胞毒性模块可以包含一种或多种放射性同位素或由一种或多种放射性同位素组成。例
如，一种或多种放射性同位素可以各自独立选自下组：β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体、和低光子能发射体。可以期望的是，一种或多种放射性同位素各自独立具有在所述试剂附近产生高吸收剂量的局部吸收能量的发射样式。例示性的放射性同位素可以包
括长程β发射体(long-range beta-emitter)，诸如90Y、32P、186Re/188Re、166Ho、76As/77As、
89 153 131 177 67 161 105
Sr、 Sm；中程β发射体(medium range beta-emitter)，诸如 I、 Lu、Cu、 Tb、 Rh；
低能β发射体，诸如45Ca或35S；转换或俄歇发射体，诸如51Cr、87Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、
125I、201TI；和α发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。图9中可以看到治疗性放射性核素的其它例子。其它放射性核素是可用的，并且会可能用于治疗。在其它实施方案中，可以期望治疗性模块或细胞毒性模块不是如WO 20061087374 A1，特别是其第11页，第7-15行中以“示踪剂”公开的模块。
细胞毒性模块可以包含一种或多种放射性同位素或由一种或多种放射性同位素组成。例
如，一种或多种放射性同位素可以各自独立选自下组：β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体、和低光子能发射体。可以期望的是，一种或多种放射性同位素各自独立具有在所述试剂附近产生高吸收剂量的局部吸收能量的发射样式。例示性的放射性同位素可以包
括长程β发射体(long-range beta-emitter)，诸如90Y、32P、186Re/188Re、166Ho、76As/77As、
89 153 131 177 67 161 105
Sr、 Sm；中程β发射体(medium range beta-emitter)，诸如 I、 Lu、Cu、 Tb、 Rh；
低能β发射体，诸如45Ca或35S；转换或俄歇发射体，诸如51Cr、87Ga、99Tcm、111In、114mIn、123I、
125I、201TI；和α发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac、225Ac、212Pb、255Fm、223Ra、149Tb和221At。图9中可以看到治疗性放射性核素的其它例子。其它放射性核素是可用的，并且会可能用于治疗。在其它实施方案中，可以期望治疗性模块或细胞毒性模块不是如WO 20061087374 A1，特别是其第11页，第7-15行中以“示踪剂”公开的模块。
[0107] 在一个优选的实施方案中，治疗性模块是177Lu。例如，试剂可以是抗hK2抗体11B6或其抗原结合片段或衍生物的经177Lu标记形式。
[0108] 或者，治疗性模块包含一种或多种治疗(诸如细胞毒性)试剂或由一种或多种治疗性(诸如细胞毒性)试剂组成，所述试剂例如细胞抑制性药物；抗雄激素药物；可的松
(cortisone)及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜素(thapsigargin)及其代谢物；毒素(诸如皂草毒蛋白(saporin)或加利车霉素
(calicheamicin))；化疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗前列腺癌的任何其它治疗性或
细胞毒性药物。
(cortisone)及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜素(thapsigargin)及其代谢物；毒素(诸如皂草毒蛋白(saporin)或加利车霉素
(calicheamicin))；化疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗前列腺癌的任何其它治疗性或
细胞毒性药物。
[0109] 例如，例示性的治疗性/细胞毒性药物可以包括：
[0110] ●细胞抑制剂(Cytostatics)，特别是那些具有剂量限制副作用的，包括但不限于环磷酰胺(cyclophosamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，异环磷酰胺(ifosfamide)，
busulphane、洛莫司汀(lomustine)、紫杉烷类(taxanes)、雌莫司汀(estramustine
phosphate)和其它氮芥、抗生素(包括多柔比星(doxorubicine)、加利车霉素和埃斯培拉霉素(esperamicine))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、氮丙啶(azaridines)、含有铂的化合物、内皮他丁(endostatin)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonates)、亚硝脲(nitrosoureas)、三氮烯(triazenes)、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、酶、取代的尿素、甲肼衍生物、柔红霉素(daunorubicin)、两亲胺(amphipathic amines)，
busulphane、洛莫司汀(lomustine)、紫杉烷类(taxanes)、雌莫司汀(estramustine
phosphate)和其它氮芥、抗生素(包括多柔比星(doxorubicine)、加利车霉素和埃斯培拉霉素(esperamicine))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、氮丙啶(azaridines)、含有铂的化合物、内皮他丁(endostatin)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonates)、亚硝脲(nitrosoureas)、三氮烯(triazenes)、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、酶、取代的尿素、甲肼衍生物、柔红霉素(daunorubicin)、两亲胺(amphipathic amines)，
[0111] ●抗雄激素(Anti-androgens)诸如氟他胺(flutamide)和比卡鲁胺(bikalutamide)及其代谢物；
[0112] ●可的松及其衍生物；
[0113] ●膦酸盐(Phosphonates)诸如二膦酸盐(diphophonate)和双膦酸盐(buphosphonate)；
[0114] ●睾酮-5-α-还原酶抑制剂；
[0115] ●硼附加物；
[0116] ●细胞因子；
[0117] ●毒胡萝卜素(thapsigargin)及其代谢物；
[0118] ●用于治疗前列腺癌的其它试剂。
[0119] 或者，细胞毒性模块包含一种或多种模块或由一种或多种模块组成，所述模块适合于用于活化疗法，诸如光子活化疗法，中子活化疗法，中子诱导的俄歇电子疗法，同步辐射疗法、或低能X-射线光子活化疗法。
[0120] 例如，凭借依照本发明的肿瘤靶向剂，会有使用同步辐射(或低能X-射线)推进放射疗法的潜力，主要聚焦于所谓的光活化放射疗法(PAT)，其中通过与预先施用的高Z肿瘤
靶向剂相互作用在癌症组织中增强来自外部X-射线照射的局部能量沉积，参见图10。
靶向剂相互作用在癌症组织中增强来自外部X-射线照射的局部能量沉积，参见图10。
[0121] PAT治疗形式利用来自同步加速器源的单色X-射线，诸如由Grenoble的欧洲同步加速器放射设施(European Synchrotron Radiation Facility,ESRF)的ID17生物医学束
线(beamline)提供的，且如预期在未来的其它设施，诸如新的瑞典同步加速器设施Max-IV
可得到的。
线(beamline)提供的，且如预期在未来的其它设施，诸如新的瑞典同步加速器设施Max-IV
可得到的。
[0122] 作为又一个潜在的治疗形式，关于“诱导的俄歇电子肿瘤疗法”的研究是在兰德(Lund)的即将到来的欧洲散裂源(European Spallation Source,ESS)，并且有希望是医学
实验站。反应器产生的热和半热中子已经长期用于硼-中子-捕捉-疗法，BNCT，其既用于临床前实验又用于用诱导的α颗粒和给出高局部吸收能的反冲核(7L)治疗脑肿瘤。类似的方
法是使用中子和用对中子具有高截面的稳定核标记的合适的肿瘤靶向分子。例如，可以用
稳定的钆(157Gd)标记抗体或肽，并且其充当由Gd核捕捉的中子的靶分子，即所谓钆中子捕捉疗法(Gadolinium Neutron Capture Therapy,GdNCT)。通过Monte Carlo技术，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布，因为它源自γ-光子、中子、核反冲，及特征性x-射线、内转换和来自钆或其它潜在元素的俄歇-电子。
实验站。反应器产生的热和半热中子已经长期用于硼-中子-捕捉-疗法，BNCT，其既用于临床前实验又用于用诱导的α颗粒和给出高局部吸收能的反冲核(7L)治疗脑肿瘤。类似的方
法是使用中子和用对中子具有高截面的稳定核标记的合适的肿瘤靶向分子。例如，可以用
稳定的钆(157Gd)标记抗体或肽，并且其充当由Gd核捕捉的中子的靶分子，即所谓钆中子捕捉疗法(Gadolinium Neutron Capture Therapy,GdNCT)。通过Monte Carlo技术，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布，因为它源自γ-光子、中子、核反冲，及特征性x-射线、内转换和来自钆或其它潜在元素的俄歇-电子。
[0123] 如上文讨论的，治疗性模块(诸如放射性同位素、细胞毒性模块等)可以与结合模块(诸如抗体或其片段)直接或间接连接。合适的接头是本领域中已知的，并且包括例如辅
基、非酚接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯衍生物；十二硼酸盐(dodecaborate))、大环和无环螯合剂两者的螯合模块，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷(tetraazacyclododecane)-1,
4,7,10四乙酸(DOTA)的衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄
基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-l,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十四烷
(tetraazacyclodocedan)-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物及其它螯合模块。此类接头的
使用可以特别适合于如下的情况，其中试剂包含抗体或其片段或由抗体或其片段组成，作
为经由接头与作为治疗性模块的放射性同位素连接的结合模块。
基、非酚接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯衍生物；十二硼酸盐(dodecaborate))、大环和无环螯合剂两者的螯合模块，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷(tetraazacyclododecane)-1,
4,7,10四乙酸(DOTA)的衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰基苄
基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-l,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十四烷
(tetraazacyclodocedan)-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物及其它螯合模块。此类接头的
使用可以特别适合于如下的情况，其中试剂包含抗体或其片段或由抗体或其片段组成，作
为经由接头与作为治疗性模块的放射性同位素连接的结合模块。
[0124] 一种优选的接头是DTPA，例如如177Lu-DTPA-11B6中使用的。
[0125] 任选地，本发明的第一个方面中使用的试剂可以(或不可)进一步包含可检测模块。例如，可检测模块可以包含放射性同位素或由放射性同位素组成，诸如选自下组的放射性同位素：锝-99m；铟-111；镓-67；镓-68；砷-72；锆-89；碘-123，碘-124，碘-125；铊-201。任选地，试剂可以包含可检测和细胞毒性放射性核素对，诸如86Y/90Y或124I/211At。或者，试剂可以包含放射性同位素，所述放射性同位素能够同时以多模式方式充当可检测模块及还充
当细胞毒性模块以提供所谓的“多形式治疗诊断剂(Multimodality theragnostics)”。如此，结合模块可以与纳米颗粒偶联，所述纳米颗粒具有多成像(例如，SPECT、PET、MRI、光学、或超声)的能力及使用细胞毒性试剂，诸如放射性核素或化疗剂的治疗能力。使用高频交变磁场和伴随的超声成像通过过热治疗的可能性也包括在本发明内。例如参见图11。
当细胞毒性模块以提供所谓的“多形式治疗诊断剂(Multimodality theragnostics)”。如此，结合模块可以与纳米颗粒偶联，所述纳米颗粒具有多成像(例如，SPECT、PET、MRI、光学、或超声)的能力及使用细胞毒性试剂，诸如放射性核素或化疗剂的治疗能力。使用高频交变磁场和伴随的超声成像通过过热治疗的可能性也包括在本发明内。例如参见图11。
[0127] 在本发明的第一个方面中使用的试剂包含可检测模块的情况中，则可检测模块可以通过成像技术，诸如SPECT、PET、MRI、光学、或超声成像可检测。
[0128] 可以使用本领域公知的方法将治疗性和可检测性模块与结合模块缀合或以其它方式组合(例如，现有的免疫缀合物疗法gemtuzumab ozogamicin[商品名称：Mylotar@]包
含与细胞毒素加利车霉素连接的单克隆抗体)。
含与细胞毒素加利车霉素连接的单克隆抗体)。
[0129] 在又一个实施方案中，依照本发明的第一个方面使用的试剂试剂用于以包含试剂分子群体的配制剂形式治疗前列腺癌。在一个选项中，用于治疗的群体中的所有(或基本上所有，诸如大于90％、95％、99％、99.9％或更多，按重量计)试剂分子包含相同治疗性模块。
在另一个选项中，群体包含具有不同治疗性模块的其它试剂的混合物。此选项会给出增强
靶向性放射性核素疗法的效果的可能性，其使用多种试剂，诸如化疗剂、激素治疗剂或其它疗法组合，其中靶向剂不仅投递治疗活性放射性核素至肿瘤关联抗原，而且还通过触发胞
内信号传导级联同时放射性敏化靶定的肿瘤细胞。此选项还可用于用细胞毒剂的混合物治
疗前列腺癌，例如使用α-发射体和不同射程的β-发射体的混合物，或具有不同射程、LET(线性能量转移)和RBE(相对生物学效果)的放射性核素的混合物，用于大肿瘤、微转移、和单肿瘤细胞的组合治疗。在一个实施方案中，长程发射体可以用于治疗大肿瘤，并且短程发射体可以用于治疗较小的肿瘤，诸如微转移，和单肿瘤细胞。
在另一个选项中，群体包含具有不同治疗性模块的其它试剂的混合物。此选项会给出增强
靶向性放射性核素疗法的效果的可能性，其使用多种试剂，诸如化疗剂、激素治疗剂或其它疗法组合，其中靶向剂不仅投递治疗活性放射性核素至肿瘤关联抗原，而且还通过触发胞
内信号传导级联同时放射性敏化靶定的肿瘤细胞。此选项还可用于用细胞毒剂的混合物治
疗前列腺癌，例如使用α-发射体和不同射程的β-发射体的混合物，或具有不同射程、LET(线性能量转移)和RBE(相对生物学效果)的放射性核素的混合物，用于大肿瘤、微转移、和单肿瘤细胞的组合治疗。在一个实施方案中，长程发射体可以用于治疗大肿瘤，并且短程发射体可以用于治疗较小的肿瘤，诸如微转移，和单肿瘤细胞。
[0130] 任选地，本发明的第一个方面中使用的试剂可以(或不可)进一步包含用于延长试剂的体内半衰期的模块。用于延长试剂的体内半衰期的例示性模块可以包括聚乙二醇
(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖苷。具体地，可以涵盖PEG。
(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖苷。具体地，可以涵盖PEG。
[0131] 在本发明的一个实施方案中，然后，将包含对激肽释放酶蛋白(诸如PSA或hK2)特异性的结合剂(例如抗体或其片段)和治疗剂的试剂注射/输注到身体中。然后，试剂结合生成相应抗原，诸如PSA或hK2的组织。随后可以用合适的试剂治疗与试剂结合的生物结构和/或可以使用剂量确定和/或疗法评估成像方法，包括PET/SPECT/CT/MR/光学/超声。
[0132] 在一些情况中，通过试剂减少前列腺癌细胞的程度的变化可以直接对应于患者的前列腺癌细胞中靶激肽释放酶(诸如PSA和hK2)的生成和浓度关系。这些变化可以例如通过
WO 2006108734的方法(其方法通过提述并入本文)确定，并且用于获得治疗信息。
WO 2006108734的方法(其方法通过提述并入本文)确定，并且用于获得治疗信息。
[0133] 例如，从上文提及的成像方法获得的PSA和hK2抗体结合的疗法前显现可以与本发明的方法和用途组合。通过测量减少，有可能直接确定调查组织是PSA生成性的，hK2生成性的，或者两者皆是。鉴于此确定，会有可能定制疗法以使其最有效。如此，个体化患者疗法可以用疗法前剂量计划实现。关于个体化患者疗法的指导可以从本领域已知的疗法取得，诸
如那些论述于(1)Garkavij等(2010)Cancer,116:1084-1092；(2)Linden等(1 999)
Clin.Cancer Res.,53287s-3291s；(3)Ljungberg等(2003)Cancer Biother.Radiopharm.,
18:99-107；(4)Minarik等(201 0)J.Nucl.Med.,51:1974-1978；(5)Sjogreen-Gleisner等
(2011)Q.J.Nucl.Med.Mol.Imaging,55:126-154；及(6)Sjogreen等(2005)Cancer
Biother.Radiopharm.,20:92-97的；每篇的内容通过提述并入本文。
如那些论述于(1)Garkavij等(2010)Cancer,116:1084-1092；(2)Linden等(1 999)
Clin.Cancer Res.,53287s-3291s；(3)Ljungberg等(2003)Cancer Biother.Radiopharm.,
18:99-107；(4)Minarik等(201 0)J.Nucl.Med.,51:1974-1978；(5)Sjogreen-Gleisner等
(2011)Q.J.Nucl.Med.Mol.Imaging,55:126-154；及(6)Sjogreen等(2005)Cancer
Biother.Radiopharm.,20:92-97的；每篇的内容通过提述并入本文。
[0134] 因而，在一个实施方案中，本发明的第一个方面牵涉用对PSA具有特异性的依照本发明的第一个方面的试剂治疗确定为拥有PSA生成性前列腺癌细胞的患者。
[0135] 在另一个实施方案中，本发明的第一个方面牵涉用对人腺激肽释放酶(hK2)具有特异性的依照本发明的第一个方面的试剂治疗确定为拥有hK2生成性前列腺癌细胞的患
者。
者。
[0136] 在另一个实施方案中，本发明的第一个方面牵涉用对PSA和人腺激肽释放酶(hK2)两者具有特异性的本发明的第一个方面的试剂，或其中之一拥有对PSA的特异性而另一个
拥有对hK2的特异性的试剂组合治疗确定为拥有既是PSA生成性又是hK2生成性的前列腺癌
细胞的患者。
拥有对hK2的特异性的试剂组合治疗确定为拥有既是PSA生成性又是hK2生成性的前列腺癌
细胞的患者。
[0137] 在联合疗法的情况中，试剂可以对患者分开、序贯、同时施用、或在同一药物组合物中配制为混合物。
[0138] 如此，对前列腺癌患者施用依照本发明的第一个方面的试剂可以导致前列腺癌细胞之上或之中的激肽释放酶蛋白、此类前列腺特异性抗原(PSA；hk3，人激肽释放酶基因3)和/或人腺激肽释放酶(hK2)的结合，并且导致患者中前列腺癌细胞的生长抑制和/或死亡。
例如，与治疗前患者中前列腺癌细胞的观察到的生长速率和/或存在相比，试剂可以将患者中前列腺癌细胞的生长速率和/或存在降低至少10％，特别是至少20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％或90％，且最特别是100％。测量受试者中前列腺癌细胞的生长速率和/或存在的方法是本领域中已知的。
例如，与治疗前患者中前列腺癌细胞的观察到的生长速率和/或存在相比，试剂可以将患者中前列腺癌细胞的生长速率和/或存在降低至少10％，特别是至少20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％或90％，且最特别是100％。测量受试者中前列腺癌细胞的生长速率和/或存在的方法是本领域中已知的。
[0139] 如此，本发明提供了用于治疗前列腺癌的方法。
[0140] “治疗”包括患者的治疗性和预防性处理两者。术语“预防性”用于涵盖如本文中描述的试剂或其配制剂在患者或受试者中预防或降低前列腺癌的可能性，局限性前列腺癌的扩散、散布或转移的用途。术语“预防性”还涵盖如本文中描述的试剂或其配制剂预防先前已经治疗前列腺癌的患者中的前列腺癌复发的用途。
[0141] 要通过本发明的第一个方面治疗的前列腺癌可以局限于前列腺，或者可以是非局限性(即弥散性)前列腺。例如，局限于前列腺的前列腺癌可以依照TNM系统(自肿瘤/节/转
移缩写)分类为临床T1或T2癌症，而非局限性/弥散性前列腺癌可以例如分类为临床T3或T4
癌症。
移缩写)分类为临床T1或T2癌症，而非局限性/弥散性前列腺癌可以例如分类为临床T3或T4
癌症。
[0142] 要通过本发明的第一个方面治疗的前列腺癌可以是转移性前列腺癌。转移指癌症从其初始位置扩散到体内其它位置。例如，要治疗的转移性前列腺癌可以是淋巴系统中；骨(包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)中存在的转移；骨盆、直肠、膀胱、或尿道内的转移。其它不太常见的位置处存在的转移也可以用本发明治疗。转移可以是微转移。微转移是一种转移形
式，其中新形成的肿瘤一般太小以致于不能检出，或难以检测。例如，本发明为技术人员提供了治疗单癌细胞或细胞簇的手段，即使此类细胞或簇的存在不可能诊断，但是其例如作
为隐性弥散性疾病存在。
式，其中新形成的肿瘤一般太小以致于不能检出，或难以检测。例如，本发明为技术人员提供了治疗单癌细胞或细胞簇的手段，即使此类细胞或簇的存在不可能诊断，但是其例如作
为隐性弥散性疾病存在。
[0144] 如此，在一个实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗原发性前列腺肿瘤转移的试剂和方法。
[0145] 前列腺癌趋向于在年龄超过50岁的男性中，更通常在超过60、65或70岁的男性中形成，并且虽然它是男性中最普遍的癌症类型之一，许多人从来没有症状，没有经历治疗，且最终死于其它原因。这是因为前列腺癌在大多数病例中是缓慢生长的，无症状的，且由于具有状况的男性是老人，他们经常死于与前列腺癌无关的原因，诸如心脏/循环疾病，肺炎，其它不相关癌症，或老年。约三分之二的前列腺癌病例是缓慢生长的，而另外的三分之一是更具攻击性且快速形成的。
[0146] 因而，前列腺癌的有效治疗的开发对于控制癌症的更具攻击性且快速形成形式是特别重要的，特别是在较年轻的患者中。因而，在一个实施方案中，本发明的第一个方面涉及在诊断前列腺癌时和/或在治疗时小于70、65、60、55、50、45、40岁龄或更小的患者中的前列腺癌的治疗。
[0147] 与没有家族史的男性相比，认为具有患有前列腺癌的一级亲属(父亲或兄弟)的男性具有两倍的形成前列腺癌的风险，并且认为受累的两个一级亲属的男性具有大至5倍的
风险。因而，本发明的第一个方面可以涉及治疗患者中的前列腺癌，所述患者特征在于1、2、或更多个家族成员，特别是一级家庭成员(诸如父亲或兄弟)先前已经诊断为前列腺癌。
风险。因而，本发明的第一个方面可以涉及治疗患者中的前列腺癌，所述患者特征在于1、2、或更多个家族成员，特别是一级家庭成员(诸如父亲或兄弟)先前已经诊断为前列腺癌。
[0148] 本发明的第一个方面还涉及治疗患者中的前列腺癌，其中要治疗的前列腺癌是去势抗性前列腺癌(CRPC)。CRPC可以以通常在1至3年后对激素治疗变得难治，并且即使进行
激素疗法也继续生长为特征。
激素疗法也继续生长为特征。
[0149] 本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的涉及本发明的第一个方面的如上文限定的试剂和药学可接受稀释剂、载体或赋形剂。
[0150] 其它化合物也可以包括在药物组合物中，包括螯合剂，诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。
[0151] 药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，所述方式为足够贮存稳定的，并且适合于对人和动物施用。例如，药物组合物可以是冻干的，例如经由冷冻干燥，喷雾干燥，喷雾冷却，或经由使用来自超临界颗粒形成的颗粒形成。
[0152] “药学可接受”意指不降低本发明的试剂的激肽释放酶蛋白结合活性的有效性的无毒性材料。此类药学可接受缓冲液、载体或赋形剂是本领域中公知的(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R Gennaro编,Mack Publishing Company(1990)及
handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press
(2000)，其公开内容通过提述并入本文)。
handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press
(2000)，其公开内容通过提述并入本文)。
[0153] 术语“缓冲液”意图指以稳定pH为目的的含有酸-碱混合物的水性溶液。缓冲液的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐(glycolate)、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
[0155] 术语“佐剂”意图指对配制剂添加以提高本发明试剂的生物学效果的任何化合物。佐剂可以是下列一种或多种：具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、乙醇酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂还可以是阳离子聚合物，诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰基化(deacetylated)透明质酸、壳聚糖(chitosan)、阳离子树枝状聚合物(dendrimer)、阳离子合成聚合物，诸如聚(乙烯基咪
唑)，和阳离子多肽，诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、和含有这些氨基酸的肽。
唑)，和阳离子多肽，诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、和含有这些氨基酸的肽。
[0156] 赋形剂可以是下列一种或多种：糖、聚合物、脂质和矿物质。糖的例子包括对组合物添加例如以促进冻干的乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和环状糊精。聚合物的例子是淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐(alginate)、鹿角菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物，聚丙烯酸、聚磺酸酯(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同程度水解的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、和聚乙烯吡咯酮(均具有不同分子量)，将其对组合物添加，例如用于粘度控制，实现生物粘附，或用于保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油一、二、和三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(均具有不同酰基链长度和饱和)，蛋卵磷酯(egg lecithin)，大豆卵磷脂，氢化蛋和大豆卵磷脂，其出于与聚合物的原因相似的原因对组合物添加。矿物质的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和钛氧化物，其对组合物添加以获得益处，诸如液体积累降低或有利的色素性质。
[0157] 本发明的试剂可以配制成本领域中已知适合于其投递的任何类型的药物组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以为脂质体形式，其中在其它药学可接受载体
外，试剂与两亲性试剂，诸如脂质(其以聚集形式以胶束、不溶性单层和液晶存在)组合。适合于脂质体配制剂的脂质包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸，等等。合适的脂质还包括在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰以延长血流循环时间的上述脂质。此类脂质体配制剂的制备可以参见例如US 4,235,871，其公开内容通过提
述并入本文。
外，试剂与两亲性试剂，诸如脂质(其以聚集形式以胶束、不溶性单层和液晶存在)组合。适合于脂质体配制剂的脂质包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸，等等。合适的脂质还包括在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰以延长血流循环时间的上述脂质。此类脂质体配制剂的制备可以参见例如US 4,235,871，其公开内容通过提
述并入本文。
[0158] 本发明的药物组合物还可以为生物可降解微球形式。脂肪族聚酯，诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(已酸内酯)(PCL)、和聚酸酐已经广泛用作微球生成中的生物可降解聚合物。此类微球的制备可以参见US 5,851,451及EP 0
213 303，其公开内容通过提述并入本文。
213 303，其公开内容通过提述并入本文。
[0159] 在又一个实施方案中，本发明的药物组合物以聚合物凝胶形式提供，其中聚合物诸如淀粉、纤维素醚、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐(alginate)、鹿角菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物，聚丙烯酸、聚乙烯咪唑、聚磺酸酯(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、不同程度水解的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、和聚乙烯吡咯酮用于增稠含有试剂的溶液。聚合物还可以包含明胶或胶原。
[0160] 或者，试剂可以仅溶解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。
[0161] 应当领会，本发明的药物组合物可以包含离子和限定的pH以加强活性剂的作用。另外，组合物可以经受常规的药物操作，诸如灭菌和/或可以含有常规的佐剂诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂，等等。
[0162] 可以经由本领域技术人员已知的任何合适的路径施用依照本发明的药物组合物。如此，可能的施用路径包括胃肠外(静脉内、皮下、和肌肉内)、表面、眼、鼻、肺、含服、口腔、胃肠外、和直肠。还有可能从植入物中施用。由于施用试剂的潜在高度细胞毒性，输注可为期望的路径。
[0163] 在一个实施方案中，胃肠外，例如静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下施用药物组合物，或者它们可以通过输注技术施用。它们以可含有其它物质(例如足够的盐或葡萄糖以生成与血液等张的溶液)的无菌水性溶液形式方便使用。在必要时，水性溶液应当适当缓冲(例如至3至9的pH)。无菌条件下合适的胃肠外配制剂的制备通过本领域技术人员公知的标准药学技术容易实现。
[0164] 适合于胃肠外施用的配制剂包括水性和非水性无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使配制剂与意图接收者的血液等张)；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含助悬剂和增稠剂。配制剂可以在单位剂量或多剂容器(例如密封安瓿和小瓶)中呈现，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件中贮存，所述冷冻干燥条件仅需要刚好在使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。可以从先前描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备即时注射溶液和悬浮液。
[0165] 如此，本发明的药物组合物特别适合于胃肠外(例如静脉内)施用。
[0166] 或者，可以鼻内或通过吸入(例如，通过使用合适的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其它合适的气体，在从加压容器、泵、喷雾或喷雾器中呈现的气雾剂喷雾形式中)施用药物组合物。在加压气雾剂的情况中，剂量单位可以通过提供阀确定以投递计量的量。加压容器、泵、喷射或喷雾器可以含有活性多肽的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其另外可以含有滑润剂，例如三油酸山梨坦(sorbitan trioleate)。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以配
制成含有本发明的化合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。
制成含有本发明的化合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。
[0167] 会对患者以药学有效剂量施用药物组合物。如本文中使用的，“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”指对给定的条件和施用方案提供治疗效果的量。这是计算为与需要的添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)结合产生期望的治疗效果的预先确定量的活性材料。此外，其意图指足以降低和/或预防宿主的活动、功能和应答的临床显著缺陷的量。或者，治疗有效量足以引起宿主中临床显著状况的改善。如本领域技术人员领会的，化合物的量会随其比活而变化。合适的剂量量可以含有计算为与需要的稀释剂结合产生期望治疗效
果的预先确定的量的活性组合物。在用于制造本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗
有效量的活性组分。基于患者特征，诸如年龄、重量、性别、状况、并发症、其它疾病等，普通医学技术人员可以确定治疗有效量，如本领域中公知的。可以通过以单个剂量单位，或也可以几个较小的剂量单位形式单次施用和还有通过在特定时间间隔多次施用细分的剂量二
者来实施药学有效剂量的施用。或者，可以在延长的时段里以连续输注提供剂量。
果的预先确定的量的活性组合物。在用于制造本发明组合物的方法和用途中，提供了治疗
有效量的活性组分。基于患者特征，诸如年龄、重量、性别、状况、并发症、其它疾病等，普通医学技术人员可以确定治疗有效量，如本领域中公知的。可以通过以单个剂量单位，或也可以几个较小的剂量单位形式单次施用和还有通过在特定时间间隔多次施用细分的剂量二
者来实施药学有效剂量的施用。或者，可以在延长的时段里以连续输注提供剂量。
[0168] 上文关于本发明的第一个方面限定的试剂可以以各种浓度配制，这取决于使用的化合物的效力/毒性。配制剂可以包含0.1μM-1mM，1μM-500μM，500μM-1mM，300μM-700μM，1μM-100μM，100μM-200μM，200μM-300μM，300μM-400μM，400μM-500μM和约500μM的浓度的活性剂。
[0169] 本领域技术人员应当领会，本发明的药物组合物可以单独或与其它治疗剂组合在治疗前列腺癌中，或在用治疗前列腺癌的其它治疗形式，诸如手术(例如根治性前列腺切除术)、放射疗法、近程治疗、外部束放射疗法、高强度聚焦超声(HIFU)、化学疗法、口服化疗性药物、冷冻手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述疗法的组合治疗患者之前、之后或同时施用。
[0170] 本发明还提供了试剂盒，其包含如上文关于本发明的第一个方面限定的试剂或如上文限定的药物组合物。
[0171] 本发明还提供了基本上如本文中描述的药物中使用的试剂。
[0172] 本发明还提供了基本上如本文中描述的药物组合物。
[0173] 本发明还提供了基本上如本文中描述的试剂的用途。
[0174] 本发明还提供了基本上如本文中描述的治疗方法。
[0175] 本发明还提供了基本上如本文中描述的试剂盒。
[0176] 依照本发明的一个方面，提供了治疗方法，该方法用如上文限定的试剂治疗原发性和弥漫性前列腺癌。
[0177] 依照本发明的另一个方面，提供了治疗方法，该方法可以用于治疗转移，诸如淋巴腺转移和/或骨转移，包括微转移。
[0178] 依照本发明的又一个方面，提供了治疗方法，该方法可以与外部放射疗法、细胞抑制剂、和雄激素治疗，或与肿瘤靶向治疗性抗体/片段不偶联的其它治疗一起或在其之后使用。
[0179] 依照本发明的具体方面，提供了对PSA和/或hK2特异性的疗法标记抗体，该标记抗体用于治疗前列腺癌，即PSA和/或hK2生成性组织。
[0180] 依照本发明的另一个方面，提供了所述方法的用途。
[0181] 依照本发明的治疗方法比现有技术有优点，因为它容许治疗前列腺癌，且所述治疗方法也可以用于治疗转移，包括微转移，诸如淋巴腺转移，或如上文描述的其它转移形式中的任一种，并且与术后规程一起或之后，并且在放射、细胞抑制剂、和雄激素治疗期间或之后使用。
[0182] 前述描述聚焦于适用于前列腺癌的治疗方法的本发明的实施方案。然而，应当领会，本发明不限于此应用，而是可以适用于许多其它疗法组合，包括例如转移、术后检查、和放射、细胞抑制剂、和雄激素治疗期间或之后的检查。就转移的疗法而言，会在淋巴腺中治疗转移。
[0183] 在另一个实施方案中，可以使用放射引导手术(RGS)或图像引导手术(IGS)在手术期间和/或之前如上文描述鉴定示踪剂标记的抗激肽释放酶特异性结合模块(诸如PSA和/
或hK2抗体)。
或hK2抗体)。
[0184] 如此，可以在手术期间和/或之前施用如上文讨论的包含结合模块和可检测模块的试剂。在此实施方案中，首先可以输注试剂，诸如示踪剂标记的抗PSA和/或抗hK2抗体。此后，可以使用RGS/IGS在手术期间或之前用对可检测模块灵敏的检测仪鉴定PSA/hK2生成性
组织。例如，可检测模块可以是放射发射或磁性灵敏性可检测模块；例如，它可以是切伦科夫(Cerenkov)放射和/或轫致辐射的发射体；它可以是荧光标记物和/或磁性或可磁化标记
物。因而，依照本发明的RGS/IGS可以例如是如下的方法，该方法基于光学、切伦科夫、轫致辐射、或β-放射的检测；放射性核素标记物的检测，和/或可以牵涉磁力测定。本领域技术人员公知RGS为一种使外科医生能够鉴定被可检测模块“标记”的组织的手术技术。
组织。例如，可检测模块可以是放射发射或磁性灵敏性可检测模块；例如，它可以是切伦科夫(Cerenkov)放射和/或轫致辐射的发射体；它可以是荧光标记物和/或磁性或可磁化标记
物。因而，依照本发明的RGS/IGS可以例如是如下的方法，该方法基于光学、切伦科夫、轫致辐射、或β-放射的检测；放射性核素标记物的检测，和/或可以牵涉磁力测定。本领域技术人员公知RGS为一种使外科医生能够鉴定被可检测模块“标记”的组织的手术技术。
[0186] 因而，在第二个方面，本发明还提供了通过在手术(诸如放射引导或图像引导手术)之前或期间对前列腺癌患者施用在药物中使用的试剂，其包含对激肽释放酶蛋白具有
特异性的结合模块(诸如上文关于本发明的第一个方面描述)和如上文关于本发明的第一
个方面讨论的可检测模块或由所述结合模块和所述可检测模块组成。
特异性的结合模块(诸如上文关于本发明的第一个方面描述)和如上文关于本发明的第一
个方面讨论的可检测模块或由所述结合模块和所述可检测模块组成。
[0187] 如此，第二个方面还提供了包含对激肽释放酶蛋白具有特异性的结合模块和可检测模块或由所述结合模块和所述可检测模块组成的试剂在制造药物中的用途，所述药物用
于在手术(诸如放射引导或图像引导手术)之前或期间对前列腺癌患者施用。
于在手术(诸如放射引导或图像引导手术)之前或期间对前列腺癌患者施用。
[0188] 本发明的第二个方面还提供了对前列腺癌患者实施的手术(诸如放射引导或图像引导手术)的方法，该方法包括在手术之前或期间对患者施用有效量的试剂的步骤，所述试剂包含对激肽释放酶蛋白具有特异性的结合模块和可检测模块或由所述结合模块和所述
可检测模块组成。
可检测模块组成。
[0189] 涵盖的是，就本文中描述的任何其它方法、试剂或组合物而言，可以执行本文中描述的任何方法、试剂或组合物。
[0190] 词语“一个”或“一种”的使用在与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”结合使用时可以意指“一个/种”，但是它还与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或超过一个/种”的意义一致。
[0191] 在与上文的描述和附图结合考虑时会更好地领会和理解本发明的这些和其它实施方案。然而，应当理解，上述描述虽然指示本发明的多个实施方案及其许多具体详情，但是其作为例示而非限制给出。许多替代、修改、添加和/或重排可以在本发明的范围内在不偏离其精神的前提下做出，并且本发明包括所有此类替代、修改、添加和/或重排。
[0192] 下列各图形成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步表明本发明的某些方面。通过与本文中呈现的具体实施方案的详细描述结合参考这些中的一幅或多幅图可以更
好理解本发明。
好理解本发明。
[0193] 图1显示了正常小鼠中静脉内施用后多种组织中经125I标记的PSA30抗体的动力学。
[0195] 图3显示了注射后多个时间时在携带基于LNCaP的皮下肿瘤的裸鼠(n＝34)中静脉125
内注射后 I-PSA30的肿瘤与器官比率。较高的比率数值指示摄取特异性在肿瘤中比在鉴
定的组织中更大。
内注射后 I-PSA30的肿瘤与器官比率。较高的比率数值指示摄取特异性在肿瘤中比在鉴
定的组织中更大。
[0196] 图4A-H显示了数码放射自显影的结果：以同位素分开的相同肿瘤切片中，注射125I-PSA30后48小时加上注射经标记的胆碱后1小时，125I-PSA30(图4A)和18F-胆碱(图4B)的各自标准化摄取。使用相邻的切片证实经由H&E的组织学分析(图4C，图4E-F)和使用2E9总
PSA抗体得到的PSA表达(图4D，图4G-H)。在高PSA30单抗摄取和高胆碱摄取的面积之间没有直接关联。备注：注射18F-胆碱后容许此小鼠自由运动。209x297mm(300x 300DPI)。
PSA抗体得到的PSA表达(图4D，图4G-H)。在高PSA30单抗摄取和高胆碱摄取的面积之间没有直接关联。备注：注射18F-胆碱后容许此小鼠自由运动。209x297mm(300x 300DPI)。
[0197] 图5显示了正常小鼠中静脉内施用后多种组织中经125I标记的5A10抗体的动力学。
[0198] 图6显示了正常小鼠中静脉内施用后多种组织中经125I标记的11B6抗体的动力学。
[0199] 图7显示了移植有转移性前列腺肿瘤细胞异种移植物的小鼠中静脉内施用后多种组织中经125I标记的11B6抗体的动力学。器官摄取以随时间的％IA/g表示。
[0200] 图8显示了LnCAP异种移植物中111In-11B6的生物分布。放射性积累在48hpi后达到峰值，16.4±1.92％IA/g(每克百分比注射放射性)。正常器官(肝、脾、肾、骨、前列腺、睾丸)中的摄取处于较低的水平。在唾液腺中观察到稍微升高的摄取，可能是由于hK2表达的某种正常表达所致。
[0201] 图9显示了一些治疗性放射性核素的例子。
[0202] 图10显示了PAT原则的例示。在存在低剂量外部放射的情况中，高Z肿瘤靶向剂在靶定肿瘤细胞中产生较大的局部吸收剂量增强。
[0203] 图11显示了可以如何使用纳米颗粒通过附接于作为抗体的肿瘤靶向剂进行多形式成像和治疗的例子。
[0204] 图12显示了肿瘤/血液比率。该比率随时间增加，指示LnCAP肿瘤中用111In-11B6对hK2的活跃靶向。
[0205] 图13显示了48hpi时hK2表达异种移植物(LnCAP)和hK2阴性异种移植物(DU145)中111In-11B6的比较生物分布。结果显示了肿瘤积累中两种异种移植物之间的统计学显著
差异(p<0.005)，而大多数正常器官中的放射性积累仍然在相同的水平。LnCAP比DU145具有高超过3倍的肿瘤摄取。这指示111In-11B6是hK2特异性的。
差异(p<0.005)，而大多数正常器官中的放射性积累仍然在相同的水平。LnCAP比DU145具有高超过3倍的肿瘤摄取。这指示111In-11B6是hK2特异性的。
[0206] 图14显示了依照Leinonen,J.等Clin Chem 2002；48:2208-2216的PSA的氨基酸序列和表位结构。
[0207] 图15显示了例示性5A10-Fab的Scatchard图。
[0208] 图16显示了177Lu-11B6的标记动力学。
[0209] 图17显示了177Lu-11B6在PBS和EDTA中的体外稳定性。
[0210] 图18显示了177Lu-11B6in LnCAP异种移植物中177Lu-11B6的代表性SPECT图像。
[0211] 图19显示了LnCAP异种移植物中177Lu-11B6的生物分布。
[0212] 图20显示了LnCAP异种移植物中72h pi时177Lu-11B6的详细生物分布。
[0213] 图21显示了LnCAP异种移植物中177Lu-11B6的体内生物动力学。
[0214] 图22显示了用177Lu-11B6处理之前(左侧图像)和之后(右侧图像)肿瘤大小的代表性照片。
[0215] 图23显示了(a)单剂177Lu-11B6(b)双剂177Lu-11B6和(c)对照处理对LnCAP异种移植物中肿瘤大小的影响的汇总。
[0216] 图24显示了用单剂177Lu-11B6处理的一只LnCAP异种移植物小鼠的(a)肿瘤生长数据和(b)SPECT图像。
[0217] 包括以下实施例以表明本发明的具体实施方案。本领域技术人员应当领会，以下实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实施中运行良好的技术，并且如此可以认
为构成其实施的具体模式。然而，根据公开内容，本领域技术人员应当领会可以对公开的具体实施方案进行许多改变，且在不偏离本发明精神和范围的前提下仍然获得同样或相似的
结果。
为构成其实施的具体模式。然而，根据公开内容，本领域技术人员应当领会可以对公开的具体实施方案进行许多改变，且在不偏离本发明精神和范围的前提下仍然获得同样或相似的
结果。
[0218] 实施例1：125I-PSA30和125I-11B6的生物分布
[0219] 材料和方法：使用lodogen法，用125I(PerkinElmer,USA)标记PSA30和11B6抗体。简言之，使用具有150μg 1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(glycoluril)的包被试管标记200μg PSA30。在将混合物于室温温育15分钟后，通过凝胶过滤(PD-10柱,GE Healthcare,UK)除去低分子量组分。在凝胶过滤后，放射化学纯度是95％。
[0220] 结果和讨论：参见图2和3。在大多数时间点，与其它研究器官相比，LNCaP肿瘤具有更高的摄取，并且在静脉内注射125I-PSA30配制剂后24小时时达到峰值(4.32％IA/g)。与显示放射性降低的所有其它器官形成对比，LNCaP肿瘤在注射后前24小时期间显示明显的放射性升高(达32％)。与不携带肿瘤的小鼠相比，甲状腺积累大大提升。LNCaP肿瘤中的125I-PSA30单抗摄取在注射后24小时时达到峰值，随后到注射后72小时注意到肿瘤摄取的急剧
下降。重要地，在此相同时间点，甲状腺摄取有急剧升高。这种反相关可能是已经发生脱卤作用的指标。总之，125I-PSA30可以有效靶向基于LNCaP的异种移植物小鼠中的fPSA。
下降。重要地，在此相同时间点，甲状腺摄取有急剧升高。这种反相关可能是已经发生脱卤作用的指标。总之，125I-PSA30可以有效靶向基于LNCaP的异种移植物小鼠中的fPSA。
[0221] 实施例2：111In-DTP1A-11B6的生物分布
[0222] 材料和方法：依照国家关于实验室动物保护的立法实施动物实验。动物研究已经得到地方动物研究伦理委员会批准。使用购自Taconic Europe(Bomholt,Denmark)的雄性
免疫缺陷裸鼠(6-8周龄)进行此研究。随后，将hK2表达性LnCAP前列腺癌细胞的异种移植物在右体侧中植入。对于异种移植，LNCaP细胞，100μL细胞培养基和100μL基质胶(BD
Sciences,Bedford,USA)中的5.2x 106个细胞/小鼠。将DU145细胞(hK2阴性细胞系)，1-2x
106在右体侧中sc植入以充当阴性对照。注射LNCaP细胞后3-6周，给5组携带LNCaP异种移植物的小鼠(4-5只动物/组)和1组(3只动物/组)携带DU145异种移植物的小鼠各自iv.注射
100μL 111In-DTPA-11B6(100μ1中约200kBq和22.5μg蛋白质)。在不同时间点，即4h、24h、
48h、72h或168h p.i.将动物处死(sack)，并且在48h p.i时将对照组处死。将目标器官(参见表)在20ml小瓶中放置，以进行闪烁计数(Zinsser Analytic,Frankfurt,Germany)，称
重，并且在具有3-英寸Nal(TI)检测仪(1480Wizard OY,Wallac,Turku,Finland)的自动化
γ-计数器中测量。在解剖后和在最后一个时间点时两次测量所有器官。以下述标准方案实施放射性测量。
免疫缺陷裸鼠(6-8周龄)进行此研究。随后，将hK2表达性LnCAP前列腺癌细胞的异种移植物在右体侧中植入。对于异种移植，LNCaP细胞，100μL细胞培养基和100μL基质胶(BD
Sciences,Bedford,USA)中的5.2x 106个细胞/小鼠。将DU145细胞(hK2阴性细胞系)，1-2x
106在右体侧中sc植入以充当阴性对照。注射LNCaP细胞后3-6周，给5组携带LNCaP异种移植物的小鼠(4-5只动物/组)和1组(3只动物/组)携带DU145异种移植物的小鼠各自iv.注射
100μL 111In-DTPA-11B6(100μ1中约200kBq和22.5μg蛋白质)。在不同时间点，即4h、24h、
48h、72h或168h p.i.将动物处死(sack)，并且在48h p.i时将对照组处死。将目标器官(参见表)在20ml小瓶中放置，以进行闪烁计数(Zinsser Analytic,Frankfurt,Germany)，称
重，并且在具有3-英寸Nal(TI)检测仪(1480Wizard OY,Wallac,Turku,Finland)的自动化
γ-计数器中测量。在解剖后和在最后一个时间点时两次测量所有器官。以下述标准方案实施放射性测量。
[0223] 放射性测量：使用用于测量放射性核素的标准方案。经背景水平校正的每分钟计数用于评估。以每克组织的百分比注射剂量(％ID/g)表示的组织摄取数值如下计算：
[0224] ％ID/g＝(组织放射性/注射放射性)/器官重量x 100
[0225] 其中对于iv注射：
[0226] 注射反应性＝对照注射器中的平均放射性-使用注射器中的放射性-尾部中的放射性
[0227] 结果和讨论：参见图8，12和13。初步结果显示了111In-11B6随时间在肿瘤中有效积累，在48hpi时达到峰值16.4±1.92％IA/g(每克的百分比注射放射性)。正常器官(肝、脾、肾、骨、前列腺、睾丸)中的放射性摄取处于较低的水平。在唾液腺中观察到稍微升高的摄取，可能是由于hK2表达的某种正常表达所致(图8)。这会在未来的研究中进一步调查。此外，111In-DTPA-11B6是hK2特异性的，因为它在阴性对照异种移植物DU145中的摄取显著更低(图13)。肿瘤/血液比率随时间增加，指示肿瘤中越来越多地摄取111In-DTPA-11B6(图
12)。总之，111In-DTPA-11B6的生物分布数据显示了有希望的在前列腺癌中的肿瘤靶向特
性，指示使用其它放射性核素治疗前列腺癌的潜力。
12)。总之，111In-DTPA-11B6的生物分布数据显示了有希望的在前列腺癌中的肿瘤靶向特
性，指示使用其它放射性核素治疗前列腺癌的潜力。
[0228] 实施例3：数码放射自显影术成像
[0229] 材料和方法：对用125I-PSA和18F-胆碱注射的动物实施DAR。在注射代谢性探针后1小时对动物实施安乐死，并且立即取出肿瘤，在Cryomount(HistoLab products AB,Sweden)中固定(secure)，在液氮中快速冷冻，并切成100μm切片以进行DAR或20μm切片以进行组织病理学和免疫组织化学(IHC)分析。使用基于硅条检测仪的系统(Biomolex 700成像
仪；Bimolex AS,Oslo)对较厚切片内的放射性分布成像。使用发射光谱和衰变速率两者的
差异产生用超过一种放射性核素(在此情况中125I和18F)注射的动物中每种放射性核素的不同图像。
仪；Bimolex AS,Oslo)对较厚切片内的放射性分布成像。使用发射光谱和衰变速率两者的
差异产生用超过一种放射性核素(在此情况中125I和18F)注射的动物中每种放射性核素的不同图像。
[0230] 结果和讨论：参见图4A-H中的结果。基于这些数据，我们显示了切出肿瘤中PSA30单抗摄取在静脉内注射后24小时时达到峰值，并且与正常组织相比在肿瘤中保留。相对较
低的T/O比率(参见图3中的表)可以归因于各种因素；诸如：结合位点屏障，其见于在低抗体剂量在血管周围空间中被fPSA抗原饱和，如此阻止对实体瘤的更深穿透时；肿瘤内部不足
的血管通透性；或者抗体的脱碘(如甲状腺中高碘积累提示)。两种改善T/O比率的方式会是
125
提高抗体剂量和测试不同放射性标记物。尽管有此缺点，我们发现了 I-PSA30放射性在肿
瘤组织中的积累。
低的T/O比率(参见图3中的表)可以归因于各种因素；诸如：结合位点屏障，其见于在低抗体剂量在血管周围空间中被fPSA抗原饱和，如此阻止对实体瘤的更深穿透时；肿瘤内部不足
的血管通透性；或者抗体的脱碘(如甲状腺中高碘积累提示)。两种改善T/O比率的方式会是
125
提高抗体剂量和测试不同放射性标记物。尽管有此缺点，我们发现了 I-PSA30放射性在肿
瘤组织中的积累。
[0231] 免疫组织化学和组织病理学(参见图4A-H中的结果)。为了研究PSA，使用IHC检查20μm肿瘤冷冻切片(如上文描述的那样冷冻和固定)。通过使用DAKO Envision Flex/HRP系统试剂盒(Dako Corporation)显现针对PSA或hK2的免疫反应性。还用苏木精(核染色)和伊
红(胞质染色)(H&E)对相邻的肿瘤切片染色，并在标准的透照显微镜下分析一般形态学。凭借H&E染色，对肿瘤切割的可见区和坏死区染色。作为阳性对照，将LNCaP肿瘤切片与1:1000稀释的PSA单抗2E9一起温育，并如上文描述显现。作为阴性对照，在不温育二抗，但是包括所有其它IHC步骤的情况下显现接受PSA30的静脉内注射的小鼠的肿瘤切片。使用Carl
Zeiss MIRAX扫描显微镜扫描仪扫描染色的切片，并用MIRAX Viewer软件(Carl Zeiss
Imaging Solutions GmbH,Germany)观察。
红(胞质染色)(H&E)对相邻的肿瘤切片染色，并在标准的透照显微镜下分析一般形态学。凭借H&E染色，对肿瘤切割的可见区和坏死区染色。作为阳性对照，将LNCaP肿瘤切片与1:1000稀释的PSA单抗2E9一起温育，并如上文描述显现。作为阴性对照，在不温育二抗，但是包括所有其它IHC步骤的情况下显现接受PSA30的静脉内注射的小鼠的肿瘤切片。使用Carl
Zeiss MIRAX扫描显微镜扫描仪扫描染色的切片，并用MIRAX Viewer软件(Carl Zeiss
Imaging Solutions GmbH,Germany)观察。
[0232] 实施例4：放射性标记
[0233] 直接碘化(125I/124I/131I)：使用氯胺-T(CAT,Sigma St.Louis,MO,USA)法将蛋白质(10μl,PBS中的1mg/ml)与作为NaI溶液的125I(4MBq)混合。通过添加PBS中的CAT(10μl,2mg/ml)，并在剧烈摇动下温育1分钟启动反应，然后通过添加偏二亚硫酸钠(sodium metabisulfite)(20μl,2mg/ml)终止。通过在用PBS预平衡的NAP-5柱(Sephadex G-25,GE
Healthcare)上的大小排阻层析将经标记的蛋白质与未反应的125I和低分子量反应组分分
开。
Healthcare)上的大小排阻层析将经标记的蛋白质与未反应的125I和低分子量反应组分分
开。
[0234] 间接碘化(125I/124I/131I/211At)：标记前体N-琥珀酰亚胺基对(三甲基甲锡烷基)苯甲酸酯(SPMB)依照Orlova等于Nucl Med Biol 27:827-835(2000)制备，并将5μg SPMB添加至5％乙酸溶液中的5MBq 125I或211At。为了开始反应，添加水溶液中的40μg氯胺-T(Sigma,St.Louis,Mo.)。将反应混合物搅动5分钟，并添加水溶液中的80μg sodium-meta-bisulphate(Aldrich,Steinheim,Germany)以停止反应。将放射性标记的前体添加至0.07M
硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中的40μg蛋白质溶液。将偶联反应于室温在不断振荡的情况中实施
45分钟。使用用PBS平衡的NAPTM-5大小排阻柱(GE,Healthcare)将标记的蛋白质变体与低分子量产物分开。然后，在IRMA测试(依照Evans等，提交于CBR)中分析放射性标记的蛋白质以确认标记规程未影响针对其靶物的结合亲和力。
硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中的40μg蛋白质溶液。将偶联反应于室温在不断振荡的情况中实施
45分钟。使用用PBS平衡的NAPTM-5大小排阻柱(GE,Healthcare)将标记的蛋白质变体与低分子量产物分开。然后，在IRMA测试(依照Evans等，提交于CBR)中分析放射性标记的蛋白质以确认标记规程未影响针对其靶物的结合亲和力。
[0235] 用177Lu的放射性标记：异氰酸-苯甲基-CHX-A”-DTPA(130nM)与蛋白质(60nM)的缀合在220uL 0.7M硼酸盐缓冲液pH 9.2中在37℃水浴中实施过夜。使用0.2M乙酸钠缓冲液pH 5.5作为洗脱剂在NAP-5大小排阻柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上纯化缀合的CHX-
蛋白质，然后分成10批，之后用于螯合。通过取样正在进行的螯合过程，并且用0.2M柠檬酸盐运行缓冲液在快速薄层层析(ITLC)SG板(Biodex)上检查螯合物的纯度来优化螯合时间。
在Cyclone Phosphorimager(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)上分析板。发现螯合于室
温在30分钟后完成。放射性镥的量随单独实验需要而变化。
蛋白质，然后分成10批，之后用于螯合。通过取样正在进行的螯合过程，并且用0.2M柠檬酸盐运行缓冲液在快速薄层层析(ITLC)SG板(Biodex)上检查螯合物的纯度来优化螯合时间。
在Cyclone Phosphorimager(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)上分析板。发现螯合于室
温在30分钟后完成。放射性镥的量随单独实验需要而变化。
[0236] 为了测试弱螯合的177Lu的存在，实施EDTA考验(challenge)。在37℃过夜温育中用200:1或1,000:1摩尔过量的EDTA对螯合剂考验螯合产物的一式三份样品。假设缀合物是定
量的，如此产生每种抗体的两个CHX-A-DTPA分子的平均值，来计算EDTA浓度。然后，通过如上述的ITLC分析溶液的样品。作为对照，[177Lu]-蛋白质的一式三份样品也在PBS中于37℃或4℃保持过夜。
量的，如此产生每种抗体的两个CHX-A-DTPA分子的平均值，来计算EDTA浓度。然后，通过如上述的ITLC分析溶液的样品。作为对照，[177Lu]-蛋白质的一式三份样品也在PBS中于37℃或4℃保持过夜。
[0237] 实施例5：体内稳定性
[0238] 为了分析放射性标记的缀合物的体内稳定性，给正常小鼠i.v.注射放射性标记物，并且在不同时间点时实施安乐死。然后，将血液收集，以5,000g离心。然后，将血液样品在用PBS平衡的NAP-5柱(截留5kDa)上分开，并且确定高分子级分中存在的放射性的相对
量。
量。
[0239] 实施例6：用于监测疗法效果的细胞存活
[0240] 在培养皿(直径6cm，约2x 105个细胞/皿)中接种细胞。在48小时后，将放射性标记的蛋白质(57ng/皿，或287ng/皿，对应于每抗原约1:1和5:1抗体)添加至细胞。为了确定培养基中125/131I/177Lu的效果，将一些皿与过量的未标记的蛋白质(29μg/皿)预温育。使用额外的皿以评估每个细胞的衰变数目(DPC)。在这些皿中，在24小时温育期间的6个时间点测量放射性标记的蛋白质的细胞摄取。然后，将细胞用冷的无血清培养基清洗6次，并在新鲜的培养基中继续温育。大约一周一次对细胞计数，并且每2周再接种。通过对两个抗体浓度及对封闭皿计算摄取曲线下面积评估DPC。对于最低的放射性标记的蛋白质浓度，细胞接受约56DPC，及对于最高浓度，接受150DPC，而封闭的细胞接受约2DPC。使用1/Y2作为加权因子，通过非线性回归(指数生长)分析获得的结果。
[0241] 实施例7：体内研究
[0242] 使用以下异种移植物模型：LnCAP、DU145、PC-3肿瘤模型。PSA由所有三种细胞系表达，而hK2由LnCAP表达而不在DU145或PC-3中表达。
[0243] 对于异种移植，将0.02％胰蛋白酶/PBS中收获的LNCaP、DU145或PC-3细胞(200-1000万个细胞)在培养基中重悬，并且用200μL含有等量基质胶(BD Biosciences,Bedford,MA)的细胞悬浮液sc注射到右体侧中。通过视觉或通过触诊监测肿瘤形成。
[0244] 封闭实验：实施生物分布实验I中的封闭实验以建立肿瘤中放射性标记的蛋白质的摄取是否hK2特异性。在主要iv注射放射性标记的蛋白质前，在封闭小鼠组中iv注射0.8-
3.0mg未标记的蛋白质。比较未封闭组和封闭组之间的注射后24-72h的放射性摄取。
3.0mg未标记的蛋白质。比较未封闭组和封闭组之间的注射后24-72h的放射性摄取。
[0245] 比活的优化：进行此实验以确定比活(即放射性标记的缀合物的注射蛋白质剂量)对肿瘤摄取的影响。制备具有多个预先确定的比活的一系列177Lu标记的蛋白质。用未标记蛋白质的储备溶液稀释177Lu标记的蛋白质的等分试样以提供每只携带LnCAP的小鼠从10μg变化至500μg的注射剂量。注射后2-3天，对动物实施安乐死。将器官和肿瘤切出，并且测量放射性摄取。进一步考虑对提供最佳的肿瘤摄取的比活进行剂量测定法。
[0246] 剂量测定法确定的实例：给携带LnCAP的小鼠(4只小鼠/组)注射177Lu标记的蛋白质。从4hpi至注射后2周对动物实施安乐死。使用MIRD方案计算不同器官的吸收剂量。对身体(动物)中所有目标器官组织获得时间-放射性曲线。研究基于来自SPECT和/或PET的定量
成像。曲线的积分会给出累积的放射性。使用基于自身计算(基于吸收分数的蒙特卡罗
(Monte Carlo)技术和特定几何学)的MIRD形式，将S值用于将累积放射性转化成吸收剂量。
在许多情况中，交叉剂量(cross dose)必须小心计算，这意味着进行基于蒙特卡罗的剂量
测定法计算(Hindorf等(2004)J.Nuc.Med.,45:1960-1965；Larsson等(2007)Cancer
Biotherapy&Radiopharmaceuticals,22:438-442；Larsson等(2011)Acta Oncol.,50:973-
980)。
成像。曲线的积分会给出累积的放射性。使用基于自身计算(基于吸收分数的蒙特卡罗
(Monte Carlo)技术和特定几何学)的MIRD形式，将S值用于将累积放射性转化成吸收剂量。
在许多情况中，交叉剂量(cross dose)必须小心计算，这意味着进行基于蒙特卡罗的剂量
测定法计算(Hindorf等(2004)J.Nuc.Med.,45:1960-1965；Larsson等(2007)Cancer
Biotherapy&Radiopharmaceuticals,22:438-442；Larsson等(2011)Acta Oncol.,50:973-
980)。
[0247] SPECT和PET成像的实例：PET-CT和SPECT-CT成像是放射性核素疗法的组成部分。它大致给出放射性材料在组织中积累的程度，并且帮助提供需要的治疗剂量及其效果的估
值。对于良好的治疗结果，必须对肿瘤投递足够剂量的放射。这通过成像确认，如上文关于剂量计划提及的参考文献(其内容通过提述并入本文)中讨论的。
值。对于良好的治疗结果，必须对肿瘤投递足够剂量的放射。这通过成像确认，如上文关于剂量计划提及的参考文献(其内容通过提述并入本文)中讨论的。
[0248] 放射生物学：将基于个别患者/实验室动物几何学的特定剂量测定法用于正确的剂量测定法，并且可将其与生物学效果相关，并且给出与放射性生物学效果关联的可能性
及实现个别患者的优化疗法。
及实现个别患者的优化疗法。
[0249] 实施例8：结合亲和力的确定
[0250] Scatchard法
[0251] 通过使用依照Scatchard,Ann N Y Acad Sci 51:660-72(1949)的Scatchard法确定生成的抗体变体的结合亲和力(Kd)。
[0252] 简言之，使用固定浓度的抗体(或在此情况中Fab抗体片段)和不同浓度的经EU3+标记的PSA示踪剂。
[0253] 表面等离振子共振
[0254] 还可以通过Biacore仪上的实时生物特异性相互作用分析确定抗体变体的结合动力学和亲和力。简言之，通过胺偶联将PSA或hK2固定化于CM5传感器芯片上，并且固定化水平达到1000-2000个响应单位。将不同抗PSA或抗hK2抗体衍生物(单抗和Fab两者)在HBS-EP
缓冲液中稀释成范围为0.1-10nM的浓度。在5m结合相和30min解离相中以流速50μL/min研
究结合动力学，接着再生。通过校正质量转移，使用1:1朗缪尔结合模型计算动力学常数。
缓冲液中稀释成范围为0.1-10nM的浓度。在5m结合相和30min解离相中以流速50μL/min研
究结合动力学，接着再生。通过校正质量转移，使用1:1朗缪尔结合模型计算动力学常数。
[0255] 实施例9：免疫放射性测量测定法(IRMA)
[0256] 一式三份进行用于放射性标记的mAb或Fab的结合质量的基于单克隆抗体的免疫放射性测量测定法(IRMA)，其为四步夹心测定法，温育之间有清洗步骤(清洗缓冲液：10mM Tris-HCL pH 8.0,0.15M NaCl,0.05％Tween 20)。依照公认的推荐，进行并优化测定法。将分离(breakapart)微量滴定板用H117(0.2μg/孔)(一种以相同的亲和力识别游离的或总的
PSA和人激肽释放酶2(hK2)的单克隆抗体)包被，在包被缓冲液(75mM碳酸钠pH 9.6)中稀
释，并于4℃温育过夜。然后，将孔于室温与0.2μg/孔淬灭缓冲液(清洗缓冲液中的3％鱼明胶)一起温育2小时。接着，将孔用含有3ng/μL fPSA的200μl血浆(女性)包被，并且于室温温育2小时。然后，将放射性标记的和未标记的PSA30在测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5,
0.1M NaCl,5mM EDTA,0.25％BSA和0.05％Tween 20)中以下降的浓度混合在一起，并添加
至孔(总体积：50μL/孔)。每孔的标记抗体的百分比如下：100、92、84、68、50、30和0％。将板于室温温育2小时，清洗，并在Nal(TI)孔计数器(1282Compugamma CS；LKB Wallac,Turku,Finland)中测量。接受相对于理论偏差<25％的检测能力差异，用于进一步应用。标记后检测质量的评估显示了放射性标记的抗体维持未标记0抗体的亲和力/结合能力的70-90％。
PSA和人激肽释放酶2(hK2)的单克隆抗体)包被，在包被缓冲液(75mM碳酸钠pH 9.6)中稀
释，并于4℃温育过夜。然后，将孔于室温与0.2μg/孔淬灭缓冲液(清洗缓冲液中的3％鱼明胶)一起温育2小时。接着，将孔用含有3ng/μL fPSA的200μl血浆(女性)包被，并且于室温温育2小时。然后，将放射性标记的和未标记的PSA30在测定缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5,
0.1M NaCl,5mM EDTA,0.25％BSA和0.05％Tween 20)中以下降的浓度混合在一起，并添加
至孔(总体积：50μL/孔)。每孔的标记抗体的百分比如下：100、92、84、68、50、30和0％。将板于室温温育2小时，清洗，并在Nal(TI)孔计数器(1282Compugamma CS；LKB Wallac,Turku,Finland)中测量。接受相对于理论偏差<25％的检测能力差异，用于进一步应用。标记后检测质量的评估显示了放射性标记的抗体维持未标记0抗体的亲和力/结合能力的70-90％。
[0257] 实施例10：在前列腺癌小鼠模型中用177Lu-m11B6的放射性免疫疗法
[0258] 前列腺癌是西方世界在男性中最常诊断出的癌症，占所有新癌症病例的25％且占癌症死亡的14％(22700443)。目前的治愈治疗策略(手术和辐照)仅当恶性局限于前列腺时
获得成功。在弥漫性疾病病例中的治疗策略限于去势，其经常仅在变得难治前抑制生长12-
18个月，尽管是激素剥夺的环境(Scher HI等,Cancer of the prostate.于:DeVita VT
Jr,Hellman S,Rosenberg SA编第7版Philadelphia,PA:Lippincott Williams&Wilkins；
2005)。由于缺乏已经证明具有超出短暂响应的效果的疗法，迫切需要新颖的分子靶向性疗法。由于前列腺癌是放射敏感的，其表现为放射性免疫疗法的理想靶物。此外，放射性免疫疗法通常将高水平的循环抗体投递至骨髓和淋巴结(癌症通常扩散到的位置)。另外，放射
性免疫疗法采用“交叉射击效应(cross-fire effect)”，根据选择放射性同位素的发射颗粒范围，其可以在不直接结合抗体的情况中杀死周围的抗原阴性旁观细胞(16029058)。
获得成功。在弥漫性疾病病例中的治疗策略限于去势，其经常仅在变得难治前抑制生长12-
18个月，尽管是激素剥夺的环境(Scher HI等,Cancer of the prostate.于:DeVita VT
Jr,Hellman S,Rosenberg SA编第7版Philadelphia,PA:Lippincott Williams&Wilkins；
2005)。由于缺乏已经证明具有超出短暂响应的效果的疗法，迫切需要新颖的分子靶向性疗法。由于前列腺癌是放射敏感的，其表现为放射性免疫疗法的理想靶物。此外，放射性免疫疗法通常将高水平的循环抗体投递至骨髓和淋巴结(癌症通常扩散到的位置)。另外，放射
性免疫疗法采用“交叉射击效应(cross-fire effect)”，根据选择放射性同位素的发射颗粒范围，其可以在不直接结合抗体的情况中杀死周围的抗原阴性旁观细胞(16029058)。
[0259] 人激肽释放酶2(hK2)是一种仅在健康和恶性前列腺组织中以非常高的浓度表达的雄激素驱动的酶。由于已经显示了hK2切割前列腺特异性抗原(PSA)的酶原形式，认为其
生理学功能之一是充当所述酶的调节物。总之，这些生物学特征使hK2变为治疗诊断系统
(治疗和诊断)中的最佳靶物。
生理学功能之一是充当所述酶的调节物。总之，这些生物学特征使hK2变为治疗诊断系统
(治疗和诊断)中的最佳靶物。
[0260] 本研究的目的是确认11B6(一种特异性靶向hK2的催化裂隙内部的表位的单抗)作为媒介物将高度毒性放射性核素特异性投递至前列腺癌生长位置的可用性(utility)。在
此概念证明研究中，我们选择用177Lu(一种低能β颗粒，其还发生γ发射，使得能够实施
SPECT成像)标记单抗。
此概念证明研究中，我们选择用177Lu(一种低能β颗粒，其还发生γ发射，使得能够实施
SPECT成像)标记单抗。
[0261] 材料和方法
[0262] 材料
[0263] 177Lu购自Mallinkrodt Medical BV,Petten,Holland。使用CycloneTM Storage Phosphor System和OptiQuantTM图像分析软件(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)测量
ITLC(快速薄层层析)条(Biodex,US)上的放射性，用于确定标记动力学和放射性化学纯度。
如果没有另外指出，那么所有化学品购自Sigma Alchrich，并且缓冲液是使用分析级水内
部制备的。单抗11B6是一种对人激肽释放酶2特异性且具有约1.2nM的对此抗原的亲和力的
抗体；参见上述SEQ ID NO:4和5(获自University of Turku,Finland)。对于体内研究，使用表达hK2的前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC,Manassas,VA,USA)。在补充有10％胎牛血清和
PEST(青霉素100IU/ml和100μg/ml链霉素)的RPMI 1640培养基中培养细胞。将细胞于37℃
在具有5％CO2的湿润培养箱中维持，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，缓冲液
中的0.02％EDTA,Thermo Scientific)解附(detach)。
ITLC(快速薄层层析)条(Biodex,US)上的放射性，用于确定标记动力学和放射性化学纯度。
如果没有另外指出，那么所有化学品购自Sigma Alchrich，并且缓冲液是使用分析级水内
部制备的。单抗11B6是一种对人激肽释放酶2特异性且具有约1.2nM的对此抗原的亲和力的
抗体；参见上述SEQ ID NO:4和5(获自University of Turku,Finland)。对于体内研究，使用表达hK2的前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC,Manassas,VA,USA)。在补充有10％胎牛血清和
PEST(青霉素100IU/ml和100μg/ml链霉素)的RPMI 1640培养基中培养细胞。将细胞于37℃
在具有5％CO2的湿润培养箱中维持，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，缓冲液
中的0.02％EDTA,Thermo Scientific)解附(detach)。
[0264] 缀合和放射性标记
[0265] CHX-A”-DTPA与11B6的缀合：使用0.07M硼酸钠缓冲液将PBS中的单抗11B6溶液调节至pH 9.2。在Amicon Ultra-2离心滤器(2ml,100K)上将样品浓缩。将蛋白质溶液与螯合
物CHX-A”-DTPA(Macrocyclics,USA)以螯合物与抗体摩尔比率3:1于40℃缀合。在4小时后
终止反应，并且通过在用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液，pH 5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析将CHX-A”-DTPA-11B6(此后称作DTPA-11B6)与游离的螯合物分开。用1ml乙酸铵缓冲液洗脱缀合的11B6和5A10。
物CHX-A”-DTPA(Macrocyclics,USA)以螯合物与抗体摩尔比率3:1于40℃缀合。在4小时后
终止反应，并且通过在用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液，pH 5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析将CHX-A”-DTPA-11B6(此后称作DTPA-11B6)与游离的螯合物分开。用1ml乙酸铵缓冲液洗脱缀合的11B6和5A10。
[0266] DTPA-11B6的放射性标记：将乙酸铵缓冲液pH 5.5中的DTPA-11B6与预先确定量的177LuCl3混合。于室温温育2小时后，将标记终止，并且在用PBS平衡的NAP-5柱上纯化。将标记效率和标记动力学用ITLC条监测，用0.2M柠檬酸洗脱。在此系统中，放射性标记的缀合物保留在起点线，而游离的Lu-177与溶剂前沿一起迁移。使用Optiquant作为量化软件
(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)用PhosphorImager系统(Perkin Elmer,Wellesley,
MA,USA)确定放射性分布。
(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)用PhosphorImager系统(Perkin Elmer,Wellesley,
MA,USA)确定放射性分布。
[0267] 表面等离振子共振
[0268] 通过在Biacore 2000系统中使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1M乙醇胺盐酸盐-NaOH pH 8.5的胺偶联在购自Biacore
的CM4研究级芯片上固定化10mM NaAc-缓冲液，pH4.0中的蛋白hk2(Department of
Biotechnology,Turku,Finland)。单抗11B6、其缀合物DTPA-11B6和Herceptin作为非特异
性参照单抗(均在Biacore缓冲液中)以5个不同浓度(0.5nM，5nm，10nM，50nM和100nM)流过2个流动池，以检测最终结合。两个流动池之一含有固定化的hK2，而另一个是空白参照。使用
25mM甘氨酸缓冲液，pH 2.7再生芯片。
的CM4研究级芯片上固定化10mM NaAc-缓冲液，pH4.0中的蛋白hk2(Department of
Biotechnology,Turku,Finland)。单抗11B6、其缀合物DTPA-11B6和Herceptin作为非特异
性参照单抗(均在Biacore缓冲液中)以5个不同浓度(0.5nM，5nm，10nM，50nM和100nM)流过2个流动池，以检测最终结合。两个流动池之一含有固定化的hK2，而另一个是空白参照。使用
25mM甘氨酸缓冲液，pH 2.7再生芯片。
[0269] 体外稳定性研究
[0270] 在PBS中且以过量的EDTA(比DTPA多至500倍的EDTA在m11B6上缀合)测试标记缀合物的稳定性，于4°温育1周和2周，并且使用ITLC条分析，见上文。
[0271] 动物研究
[0272] 依照国家关于实验室动物保护的立法实施所有动物实验。动物研究已经得到地方动物研究伦理委员会批准。使用购自Taconic Europe(Bomholt,Denmark)的雄性免疫缺陷
裸鼠(6-8周龄)进行此研究。
裸鼠(6-8周龄)进行此研究。
[0273] 将hK2表达性LnCAP前列腺癌细胞的异种移植物每次注射以约10*106个细胞在右体侧和/或左体侧中皮下植入。
[0274] 将形成LNCaP肿瘤的动物分成组，并注射治疗剂177Lu-DTP-11B6或对照，参见下文表1：
[0275] 表1
[0276]
[0277] 在3-4天的时间间隔内对包括的所有动物连续测量并称重。
[0278] 最初，对一些动物施以较低放射性(8MBq)的177Lu-DTPA-11B6，以使用SPECT调查治疗剂的局限化。还用SPECT研究来自组8的一只小鼠。对这些动物取出其器官，并且使用具有3-英寸Nal(TI)检测仪(1480WIZARD,Wallac Oy,Turku,Finland)的自动化Nal(TI)孔计数
器量化这些组织样品中的放射性。
器量化这些组织样品中的放射性。
[0279] 为了研究对骨髓的影响，定期采集血液样品(10μL)。注射后一周两次收集血液样品达8周，并且在Medonic Cell Analyzer-Vet CA530Vet(Boule Medical,Stockholm,
Sweden)中分析WBC计数、RBC计数、和血小板计数。在血液取样时，监测动物的重量和身体状况。通过对动物监测体重减轻、一般状况的下降、和血液学毒性来评估毒性。
Sweden)中分析WBC计数、RBC计数、和血小板计数。在血液取样时，监测动物的重量和身体状况。通过对动物监测体重减轻、一般状况的下降、和血液学毒性来评估毒性。
[0280] 用测径器测量肿瘤体积。测量长度I、宽度w和厚度t，并且计算体积。
[0281] 药动学
[0282] 对于111In-m11B6的生物动力学研究，在尾静脉中给小鼠注射对25μg m11B6抗体标记的放射性核素。在定期的时间间隔处死动物。
[0283] 简言之，将小鼠单抗11B6与CHX-A”-DTPA缀合们并且用111In标记，形成111In-CHX-A”-DTPA-11B6(111In-DTPA-11B6)。在hK2和AR阳性(LNCaP)PCa异种移植物模型中实施生物分布研究。使用DU-145异种移植物(hK2和AR阴性)作为对照。将动物NMRI裸鼠在指定的时间间隔实施安乐死，解剖，并且对其取出器官以进行放射性测量。实施微-SPECT成像。将肿瘤切片，染色，并实施放射自显影术。给一些动物注射无放射性的(cold)小鼠单抗11B6，之后注射111In-DTPA-11B6以阻断放射性标记的11B6的摄取。
[0284] 以与用于111In-m11B6研究相同的方式获得177Lu-m11B6的生物动力学。
[0285] 数据采集和剂量测定法
[0286] 为了确定不同靶器官的吸收剂量，与小鼠特异性S-因子一起应用MIRD-方案(I)。分解数目(累积放射性)源自用111In-m11B6得到的动力学数据。通过最小二乘方算法将双指数函数(bi-exponential function)拟合至数据点，并且分解数目以这些表述的积分乘以
衰减因子计算。骨髓的累积放射性基于血液方法(2)，其中假设红骨髓中的放射性浓度与血液中的放射性浓度成比例。已经提示了此红骨髓与血液比率(RMBLR)是0.36(2)，其也在本
研究中使用。
衰减因子计算。骨髓的累积放射性基于血液方法(2)，其中假设红骨髓中的放射性浓度与血液中的放射性浓度成比例。已经提示了此红骨髓与血液比率(RMBLR)是0.36(2)，其也在本
研究中使用。
[0287] 为了确定小鼠特异性S因子，使用MOBY(3)模型型式，其中可以规定器官大小。规定来自动力学研究的解剖器官的平均重量连同平均总重量。然后灵活的NURBS表面的绘制产生品系特异性模型。该模型以160*160*400体元进行体元化。在左体侧上添加皮下肿瘤，其呈现为在正常皮肤轮廓(skin-contour)外部的球形，但是为具有短轴(为与皮肤轮廓垂直
的球形半径的一半)和长轴(为球形半径)的椭圆体。将唾液腺和前列腺手动添加至模型，并且以具有与器官的平均重量关联的半径的球形呈现。
的球形半径的一半)和长轴(为球形半径)的椭圆体。将唾液腺和前列腺手动添加至模型，并且以具有与器官的平均重量关联的半径的球形呈现。
[0288] 然后，将模型用作用MCNPX 2.6代码得到的177Lu和111In的S-因子的蒙特卡洛模拟的输入，如先前工作中描述的(4)。
[0289] 治疗计划
[0290] 基于经历用90Y和177Lu的放射性免疫疗法的大鼠中骨髓上的吸收剂量和生物学效应之间的关系(Larsson等,2012,Med.Phys.39(7):4434-43)，可以评估骨髓的LD50会是
大约(in the order of)12Gy。在文献中，大鼠和小鼠的急性辐照的LD50是相同的，约9Gy
(例如参见Radiobiology for the radiologist,Hall&Giacca(编),2006,第6版)。
大约(in the order of)12Gy。在文献中，大鼠和小鼠的急性辐照的LD50是相同的，约9Gy
(例如参见Radiobiology for the radiologist,Hall&Giacca(编),2006,第6版)。
[0291] 然后，通过假设对骨髓的可耐受吸收剂量为12Gy设计疗法。然后，通过剂量测定法计算，计算与此吸收剂量对应的放射性。然后，治疗组设计为给予其以A/4、A/2、A、2xA和3xA。相应的放射性用于对照。
[0292] 结果
[0293] 177Lu-DTPA-m11B6的放射性标记
[0294] 图16中的标记动力学结果显示了标记效率是非常高的，在2小时温育后达到90％。这确保可能的卓越治疗功效，伴有未缀合177Lu的次要效果。
[0295] PBS和EDTA中的体外稳定性结果随时间显示了良好的稳定性，在2周内随时间几乎没有变化(参见图17)。还有，在PBS和EDTA温育之间没能看到差异，指示非常良好的缀合化学，其确保具有长保留和循环时间的体内稳定性。
[0296] 成像
[0297] 图18中的SPECT图像显示了异种移植的裸鼠中177Lu-DTPA-m11B6的分布(注射8MBq)。
[0298] 图18的不同图像如表2中解释。
[0299] 表2
[0300]栏1 栏2 栏3 栏4
S1:48h
S1:72h S2:72h S3:72h S11:72h DU 145
S1:168h S2:168h S8:168h封闭 S9:168h封闭
S1:48h
S1:72h S2:72h S3:72h S11:72h DU 145
S1:168h S2:168h S8:168h封闭 S9:168h封闭
[0301] 小鼠S1的第一栏显示了小鼠S1中肿瘤中的卓越摄取，摄取在时间48、72和168h pi增加。第二栏显示72和168h时具有相同高肿瘤摄取的小鼠S2。栏3，行2显示了72h pi时具有相似高肿瘤摄取的小鼠。行3，栏3显示了在168h pi时在用无放射性(cold)抗体封闭后没有肿瘤摄取的小鼠S8，这显示了m11B6用于肿瘤靶向的特异性。栏4，行3中为小鼠S9的类似结果。最终，栏4，行2中的小鼠S11在对m11B6抗体非特异性的细胞系DU 145的肿瘤中没有显示摄取。
[0302] 这些结果显示了导致高肿瘤积累的m11B6的高特异性。
[0303] 生物分布
[0304] 上述实施例2中讨论了111In-m11B6的生物动力学研究的结果。在肿瘤组织中看到积累，在48小时，最大值为16％IA/g；除了唾液腺外，所有其它器官显示了放射性的下降(参见图8)。如此，获得较高的肿瘤与正常器官比率，其是高治疗功效的前提。
[0305] 图19中显示了177Lu-m11B6的生物分布数据(在72h和168h)。这里，与111In-m11B6相比可以看到高得多的放射性积累，在168h时几乎为30％IA/g。这进一步强调用放射性标
记的11B6抗体的高治疗功效的可行性。
记的11B6抗体的高治疗功效的可行性。
[0306] 图20中显示了封闭以及使用肿瘤细胞系DU-145的72h pi时的详细结果。这里，给出来自上文显示的SPECT研究的177Lu-m11B6在具有LnCaP或DU-145和用预先注射的未缀合
11B6封闭hK2Ag的小鼠中的分布。如详细看到的，封闭和肿瘤细胞系DU-145导致无肿瘤摄
取，显示了m11B6的高特异性。
11B6封闭hK2Ag的小鼠中的分布。如详细看到的，封闭和肿瘤细胞系DU-145导致无肿瘤摄
取，显示了m11B6的高特异性。
[0307] 剂量测定法
[0308] 图21显示了用于剂量测定法计算的111In-m11B6的生物动力学研究的结果。在复合图内的每幅图中，上部点线代表具有1个标准差的动力学研究结果，连续曲线是改编的双指数函数，并且下部虚线曲线是考虑111In衰变的情况。下部虚线曲线下面积是用于剂量测定法计算的累积放射性。
[0309] 基于如图21中显示的生物动力学，计算积累放射性。使用111In S值，然后计算每个放射性单位的吸收剂量(Gy/MBq)。在下文表3中给出111In的结果。
[0310] 基于假设相同生物动力学可以用于177Lu-m11B6，相应的累积放射性用其物理半衰期计算。在使用177Lu的S值时，计算每个放射性单位的吸收剂量。类似生物动力学的假设通过177Lu-m11B6的摄取结果得到验证，其显示了与111In-m11B6相似的摄取数值(参见图8
和19)。
和19)。
[0311] 表3
[0312] 来自用111In-和177Lu-11B6的疗法的吸收剂量(Gy/MBq)
[0313]
[0314] 基于骨髓的LD50值12Gy，可以注射26.7MBq的剂量。这意味着肿瘤的吸收剂量60Gy。
[0315] 再计算肿瘤吸收剂量(假设111-In-m11B6动力学与177Lu-m11B6的动力学相同)并且在72h pi(16％IA/g到20％IA/g)和168h pi(15％IA/g至28％IA/g)时改变摄取数值导致
如下文表4中给出的吸收剂量。然后，可以看到肿瘤的吸收剂量会从60Gy增加至120Gy。
如下文表4中给出的吸收剂量。然后，可以看到肿瘤的吸收剂量会从60Gy增加至120Gy。
[0316] 表4
[0317]
[0318] 上述剂量测定法计算基于合适的剂量测定法模型；生物动力学揭示了可以在骨髓毒性的安全限内对肿瘤投递治疗吸收剂量。
[0319] 动物肿瘤收缩
[0320] 图22显示了一只小鼠中的肿瘤(动物体侧上可见，在皮肤下)在处理后在体积方面如何缩小。
[0321] 放射性免疫疗法结果
[0322] 图23显示了施用放射性(a)D，(b)2x D的研究组和(c)对照组的结果(其中D＝26.7MBq).
[0323] 这两个处理组中有肿瘤体积缩小的明显趋势。在注射177Lu-m11B6后几天已经看到肿瘤收缩的开始。在对照组中，在注射NaI溶液后有肿瘤体积增加。
[0324] 图24(a)显示了注射放射性A的组中的一只小鼠的结果。这里，在施用放射性A的177Lu-m11B6时，肿瘤从第1天到第6天稳定生长。在处理后，观察到肿瘤体积的快速下降。
[0325] 在SPECT研究(8d pi)中，用仍存在的放射性显示肿瘤体积；参见图24(b)。
[0326] 结论
[0327] 用例示性抗体177Lu-m11B6的本研究清楚证明针对前列腺癌肿瘤的体内治疗功效。
[0328] 基于特殊剂量测定法模型和体内测量生物动力学的两种理论计算都显示给出高治疗比率的有利剂量测定法。然后，这在具有良好治疗结果的动物研究中得到验证，该结果显示快速的肿瘤体积收缩。
[0329] 参考文献
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hematopoietic system response and red marrow absorbed dose in Brown Norway
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Rats：Establishment of a SyngeneicTumorModel to EvaluateMeans to Improve
Radioimmunotherapy Clin Cancer Res 2005；11：7104s-7108s.2005.
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