快速进行生物化学和其他测定的能力在许多领域均是至关重要的。例如， 快速和准确诊断感染性疾病对于有效控制个体的疾病和减少多重耐药病原体 和社区获得性感染等公共卫生问题均至关重要。
目前的基于PCR的DNA扩增方法有很多缺点，包括试剂费用高、耗费 人力且易于发生交叉污染。此外，相对于培养而言，PCR测定难以同时测定 多个物种、毒力因子和抗药性标记物。它们对通常不够敏感，且不能划算地 对病原体进行定量。因此，本领域需要用于核酸检测的改进装置，这些装置 能够克服上述局限性，且还能使该技术小型化和自动化，以便能够在样品收 集现场实施这些测定并将培训工作最小化。
核酸测序在多领域中变得越来越普遍，例如全基因组测序、诊断学、药 物基因组学和法医学。不过，昂贵的测序装置已经阻碍了测序领域。开发廉 价的高通量测试系统对于遗传学测试的推广及其相关的许多优势而言是至关 重要。因此，需要新的技术平台，以便能够以合理的价格快速可靠地进行核 酸测序。本发明在此提供廉价的基于小滴的测序系统。
免疫测定广泛用于临床诊断，其仅在美国便构成超过30亿美元的市场。 免疫测定属于临床实验室中常规使用的最具有敏感性和特异性的方法。免疫 测定利用抗原与其相应的抗体之间的高亲和力和特异性的结合来检测并定量 样品基质中的所述抗原。异质性免疫测定例如ELISA(酶联免疫吸附测定)属 于最为敏感和特异的临床测定方法，且已经广泛用于鉴定一大类的抗原和抗 体。例如，可进行免疫测定等来鉴定心脏标记物、肿瘤标记物、药物、激素 和感染性疾病。
消耗的样品少、测定更快速、且完全自动化是任何临床分析仪都需要不 断改进的三个特征。尽管现有技术的实验室的免疫测定分析仪可提供良好的 自动化和通量，但它们每次测试均需要明显多的样品量(包括死腔)和很长的测 定时间。测定时间长以及分析仪体型庞大使其难以在样品收集现场应用。
此外，免疫测定的表现具有很大的可变性，这大部分是由于该技术依赖 于操作者，导致不同研究之间甚至同一研究如果使用了一个以上的实验室时， 其结果难以进行比较。全自动的一体化分析仪能够消除操作者的影响并可对 免疫监测测定结果进行标准化，因此能够极大改善对测定结果的分析。
尽管自动化免疫测定已经取得明显的进步，但这些分析仪极为昂贵，对 于低通量研究而言难以负担。那些具有自动化板洗涤装置、温育装置和整合 的光学装置的低端系统仍需技术人员进行一些免疫测定的关键性步骤，例如 准备含有抗体的微滴定板和给板加样。这导致因反复手工干扰而引起的人为 误差，这是不同测定间以及测定内变异的主要来源。
很多领域还需要进行样品收集现场测试，例如在医疗、环境和生物恐怖 主义相关监测领域。例如，床旁血液分析的样品收集现场(POC)测试已经有 所改善，但其仍然是现代医疗的关键挑战。理想地，POC测试应该能够使得 临床医生能够实时诊断并实施急救技术，而无需大型实验室设施。本领域仍 需要能够在POC以小体积样品同步监测血气、代谢物、电解质、酶、DNA、 蛋白质和细胞的芯片实验室。
液体的微流体控制是成功的芯片实验室的关键条件。微流体系统可宽泛 地分为基于连续流和基于离散流的结构。如其名称所提示的那样，连续流系 统依赖于液体在通路中的连续流动，而离散流系统利用通路内部的或者无通 路结构中的液体小滴。连续流系统共同的局限性是液体的转移受到永久固定 的通路的物理性限制。所使用的转移机构通常由外部的泵进行压力驱动或由 高低压进行动电驱动。这些方法涉及复杂的通路，并需要大量辅助系统如外 部的阀或电源。这些局限性使得难以在常规的连续流系统中实现高度的功能 性整合和控制，特别是难以实现样品收集现场的手持式装置。本领域还需要 利用小滴操控的样品收集现场测试系统，特别是能够在单个芯片上实现多测 试或多类型测试的系统。
发明概述
本发明的一个方面涉及基于小滴的洗涤。根据该方面的一个实施方式， 提供了提供与表面相接触的具有降低的浓度的物质的小滴的方法，其中所述 方法包括：(a)提供与包含起始浓度和起始量的物质并具有起始体积的小滴相 接触的表面；(b)进行一或多次小滴操作以便使洗涤小滴与步骤(a)中提供的小 滴汇合，以产生合并的小滴；和(c)进行一或多次小滴操作以便将所述合并的 小滴拆分为一组小滴，所述一组小滴包含：(i)与所述表面相接触的小滴，所 述小滴具有的物质浓度相对于所述起始浓度是降低的；和(ii)与所述表面分离 的小滴。
本发明的另一个方面涉及基于小滴的表面的修饰和洗涤。根据该方面的 一个实施方式，提供了提供与表面相接触的具有降低的浓度的物质的小滴的 方法，其中所述方法包括：(a)提供小滴微驱动器，其包含表面，所述表面与 包含起始浓度和起始量的物质并具有起始体积的小滴相接触；(b)进行一或多 次小滴操作以便使洗涤小滴与步骤(a)中提供的小滴汇合，以产生合并的小滴； 和(c)进行一或多次小滴操作以便将所述合并的小滴拆分为一组小滴，所述一 组小滴包含：(i)与所述表面相接触的小滴，所述小滴具有的物质浓度相对于 所述起始浓度是降低的；和(ii)与所述表面分离的小滴。根据另一个实施方式， 提供了修饰小滴微驱动器上的表面的方法，其中所述方法包括实施一或多次 小滴操作，以便使包含表面修饰剂的小滴与所述表面相接触。根据另一个实 施方式，提供了小滴微驱动器，其包含固定化于其表面上的样品或试剂，其 被设置为使得所述小滴微驱动器上的小滴可与所述表面相接触。根据另一个 实施方式，提供了将物质从该物质所结合的表面上移除的方法，其中所述方 法包括进行一或多次小滴操作以便使小滴与所述表面相接触，所述小滴包含 用于从所述表面洗脱所述物质的溶液。
本发明的又一个方面涉及基于小滴的核酸扩增装置、系统和方法。根据 该方面的一个实施方式，提供了小滴微驱动器，其包含：(a)包含用于进行小 滴操作的电极的基材；和(b)一或多个温度控制装置，其被设置在一或多个所 述的电极附近用于加热和/或冷却小滴微驱动器的区域，并被设置为使得小滴 能够在所述电极上转移至所述区域内以便加热。
本发明的另一个方面涉及基于小滴的核酸扩增方法和设备。根据该方面 的一个实施方式，提供了用于扩增生物学样品中的核酸的方法，其中所述方 法包括：(a)提供包含小滴微驱动器的系统，所述小滴微驱动器电子连接于并 受控于能够执行指令的处理器，所述小滴微驱动器包含：(i)可能包含靶核酸 的样品；(ii)包含用于进行小滴操作的电极的基材；和(iii)一或多个温度控制 装置，其被设置在一或多个所述的电极附近用于加热小滴微驱动器的区域， 以便使得小滴被转移到所述区域内用于加热；(b)利用小滴操作在所述小滴微 驱动器上将一或多个扩增试剂小滴与一或多个样品小滴合并，以产生扩增即 用型小滴(amplification-ready droplet)；和(c)热循环所述扩增即用型小滴，当 所述扩增即用型小滴中存在靶核酸时，这足以使得所述靶核酸被扩增。根据 另一个实施方式，提供了在小滴微驱动器上扩增核酸的方法，其中所述方法 包括反复转移体积不超过50nL的扩增即用型小滴通过基材上的一或多个加 热区。根据另一个实施方式，提供了在升高的温度条件下进行小滴操作的反 复，其中所述方法包括：(a)提供小滴微驱动器；(b)加热其上的小滴使温度 超过约25℃以产生加热的小滴；和(c)在所述加热的小滴上进行小滴操作。 根据另一个实施方式，提供使用荧光材料制得的小滴微驱动器，其包含用于 检测来自小滴的荧光信号的检测区域，所述检测区域涂覆有光吸收性、低荧 光或非荧光材料涂层。
本发明的另一个方面涉及基于小滴的诊断学。根据该方面的一个实施方 式，提供了小滴微驱动器系统，其包含：(a)被构造为用于进行小滴操作的小 滴微驱动器；和(b)传感器，其被构造为与所述小滴微驱动器具有感测关系， 以便所述传感器能够感测所述小滴微驱动器上的一或多个小滴的信号和/或性 质。
本发明的又一个方面涉及基于小滴的亲和力测定。根据该方面的一个实 施方式，提供了检测样品中的靶分析物的方法，其中所述方法包括：(a)实施 小滴操作将小滴微驱动器上的基于亲和力的测定试剂与可能包含所述靶分析 物的样品合并，以产生代表分析物的存在、不存在和/或量的信号；和(b)检 测所述信号，其中所述信号与样品中所述分析物的存在、不存在和/或量相对 应。
本发明的另一个方面涉及基于小滴的亲和力测定装置和系统。根据该方 面的一个实施方式，提供了小滴微驱动器，其包含固定化于表面的抗体。根 据另一个实施方式，提供了小滴微驱动器，其包含所述小滴微驱动器上的小 滴，所述小滴包含抗体。本发明的另一个方面涉及用于小滴操作的填充流体。 根据该方面的一个实施方式，提供了小滴微驱动器，其包含：(a)第一基材， 其包含被构造为用于在所述基材的表面上进行小滴操作的电极；(b)距所述基 材的所述表面一段距离的第二基材，该距离足以在所述第一基材和第二基材 之间限定出内部体积，其中所述距离足以容纳被置于第一基材上所述空间内 的小滴；和(c)设置在所述内部体积内并相对于所述电极设置的小滴其设置方 式允许使用所述电极在所述小滴上实现小滴操作。根据另一个实施方式，提 供了小滴微驱动器，其包含基材，所述基材包含：(a)用于进行喷射或分配小 滴操作的电极；和(b)电磁体，其与小滴充分接近以促使基本上所有的珠在所 述分裂或分配操作过程中保留在一个小滴中。根据另一个实施方式，提供小 滴微驱动器，其包含基材，所述基材包含用于进行小滴操作的电极，其中至 少一部分所述基材包含用于进行小滴操作的电极并缺少第二基材，这样可在 缺少基本上平行的基材的所述基材上进行小滴操作。根据另一个实施方式， 提供了小滴微驱动器，其包含一或多个用于进行小滴操作的电极，其中一或 多个所述的电极中包括开口，用于将光传输至放置于所述电极上的小滴或传 输来自所述小滴的光。根据另一个实施方式，提供了小滴微驱动器，其包含 一或多个基本上透明的用于进行小滴操作的电极，其中一或多个所述的电极 部分被遮盖物覆盖，所述遮盖物留有窗口，用于将光传输至放置于所述电极 上的小滴或传输来自所述小滴的光。根据另一个实施方式，提供了小滴微驱 动器，其上包含不透明填充流体和透明小滴。
本发明的又一个方面涉及基于小滴的颗粒分选。根据该方面的一个实施 方式，提供了小滴微驱动器，其包含：(a)颗粒悬液；和(b)电极，其被设置 为用于使用包含颗粒的小滴进行小滴操作。根据另一个实施方式，提供了小 滴微驱动器，其包含小滴，所述小滴中包含单个颗粒。根据另一个实施方式， 提供了转移颗粒的方法，其中所述方法包括提供包含所述颗粒的小滴并将所 述小滴转移到小滴微驱动器上。根据另一个实施方式，提供了提供包含单个 颗粒的小滴的方法，其中所述方法包括：(a)提供包含颗粒悬液的小滴；(b)从 (a)的小滴分配小滴以提供分配的小滴；和(c)确定所述分配的小滴是否包含单 个颗粒和/或所需颗粒类型。
定义
在本文中，以下术语具有所给出的含义。
＂启动＂当涉及一或多个电极时，指的是实现所述一或多个电极的电状态的 改变，以产生小滴操作。
＂亲和力＂指的是一种分子对另一种分子或对底物的特异性或非特异性分 子内吸引力，例如抗体对其相应的抗原或半抗原的吸引力。
＂分析物＂指的是所检测的靶物质，其可以存在于样品中。示例性的实例包 括抗原性物质、半抗原、抗体、蛋白质、肽、氨基酸、核苷酸、核酸、药物、 离子、盐、小分子、细胞。
＂抗体＂指的是对表位或半抗原具有亲和力的多肽。抗体可以是多克隆抗 体、单克隆抗体、抗体片段、和/或能够与特定结合对的相应成员相结合的工 程化分子。抗体可以标记或缀合于有助于对所述抗体进行直接或间接检测和/ 或定量的分子。
对于小滴微驱动器上的珠，＂珠＂指的是能够与小滴微驱动器上或附近的小 滴相互作用的任何珠或颗粒。珠可以具有多种多样的形状，例如球状、大致 球状、卵状、盘状、立方体或其他三维形状。所述珠可以，例如，能够被转 移至小滴微驱动器上的小滴中；相对于小滴微驱动器被构造为使得能够允许 将所述小滴微驱动器上的小滴与所述珠相互作用、带到所述小滴微驱动器上 和/或使之离开所述小滴微驱动器。可以采用多种多样的材料制造珠，包括例 如树脂和聚合物。珠可以具有任何合适的大小，包括例如，微珠、微粒纳米 珠和纳米颗粒。在一些情况中，珠具有磁响应性；在其他情况中，珠基本上 没有磁响应性。对于磁响应性珠，磁响应性材料可构成基本上珠的全部或仅 珠的一种组分。所述珠的其余部分可包括例如聚合物材料、涂层、以及允许 附着分选试剂的部分。合适的磁响应性珠的实例可参见美国专利出版物No. 2005-0260686，＂Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase＂，其公开于2005年11月24日，在此通过引用将其有关磁响应性材料 和珠的教导的全部内容并入本文。
＂dNTP＂指的是脱氧核糖核苷酸三磷酸酯，其中核苷酸是任何核苷酸，例 如A、T、C、G或U。＂ddNTP＂指的是双脱氧核糖核苷酸三磷酸酯，其中所述 核苷酸是任何核苷酸，例如A、T、C、G或U。可以理解，除非另有说明， 可以用ddNTP替代dNTP，且反之亦然。
＂小滴＂指的是小滴微驱动器上的一定体积的液体，其至少部分受到填充流 体的限制。例如，小滴可以完全被填充流体包围或可以被填充流体和所述小 滴微驱动器的一或多个表面所限制。小滴可具有多种多样的形状；非限制性 的实例包括大致盘状、弹丸状(slug shaped)、截球状、椭圆体、球状、部分压 缩球形、半球形、卵形、圆柱状以及在小滴操作过程中形成的各种形状，例 如汇合或分裂或通过上述形状与小滴微驱动器的一或多个表面相接触而形成 的形状。
＂小滴操作＂指的是对小滴微驱动器上的小滴作出的任何操作。小滴操作可 包括，例如：将小滴加载至小滴微驱动器中；从源小滴分配一或多个小滴； 将小滴分裂、分离或拆分为两个或更多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转 移至另一处；将两个或更多个小滴汇合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合 小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸 发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小滴转移出微驱动器；在此所述的其他小 滴操作；和/或上述的任何组合。术语＂汇合＂、＂合并＂等用于描述从两个或更 多个小滴产生一个小滴。应该理解，当该术语涉及两个或多个小滴时，可以 使用足以使所述两个或多个小滴合并为一个小滴的任何小滴操作组合。例如， 可通过转移小滴A使之与静态的小滴B相接触、转移小滴B使之与静态的小 滴A相接触、或转移小滴A和B使它们彼此接触而实现＂使小滴A与小滴B 汇合＂。术语＂分裂＂、＂分离＂和＂拆分＂并不意欲暗示所得小滴的大小有任何特殊 (即，所得小滴的大小可以是相同的或不同的)或所得小滴的数量有任何特殊 (所得小滴的数量可以是2、3、4、5或更多)。术语＂混合＂指的是一种小滴操 作，其导致小滴内的一或多种组分的分布更加均匀。＂加载＂小滴操作包括微透 析加载、压力辅助加载、机器人加载、被动加载、和移液器加载。
＂电子连接＂在此指的是两种或更多种组分或元件之间的电的或数据的关 系。因此，所谓第一组分电子连接于第二组分的情况并无意排除额外的组分 可出现于所述第一和第二组分之间、和/或与所述第一和第二组分可操作地相 关联或设置的可能性。此外，电连接的组分在某些情况下可包括无线的中间 组分。
当涉及用户界面或类似情况如本文所述的小滴微驱动器图时，“突出显 示”指的是所述用户界面或图的组分可以是视觉上可区分的，例如通过改变 颜色、亮度、阴影、形状、或符号、图标或其他视觉标识符的隐现。例如， 用鼠标拖住或选定用户界面或图上的电极的标识可改变该电极标识的颜色。 声音也可伴随所突出显示的项目以进一步帮助用户与系统的互动。
＂输入装置＂在此广泛地包括所有可能用于将信息输入计算机系统或网络 上的装置和途径。实例包括针式装置、笔式装置、键盘装置、键区装置、触 摸板装置、触摸屏装置、操纵杆装置、转球装置、鼠标装置、条形码读取装 置、磁条读取装置、红外线装置、语音识别技术。
＂磁响应性＂指的是对磁场的响应性。磁响应性材料的实例包括顺磁性材 料、铁磁材料、亚铁磁材料、和变磁性材料。合适的顺磁性材料的实例包括 铁、镍和钴，以及金属氧化物例如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、 Cr2O3、和CoMnP。
＂输出装置＂在此广泛地包括所有可能用于将来自计算机系统的信息或数 据输出给用户或另一系统的装置和途径。实例包括可视显示器、LED、打印 机、扬声器、调制解调器和无线收发机。
＂方案＂指的是一系列的步骤，包括但不限于，一或多个小滴微驱动器上的 小滴操作。
当涉及用户界面上显示的用户互动元件例如图标、场或虚拟按键时，＂选 择＂指的是给出输入，其导致执行与目标相关的指令。因此，例如，通过指向 并点击电极标识而选定小滴微驱动器图上显示的电极的标识，可导致执行启 动真实电极所需的指令和/或执行给一组指示启动真实电极的指令添加一行代 码所需的指令以。可使用多种多样的输入装置或输入装置的组合来实现选择， 例如鼠标、操纵杆、和/或键盘。
当涉及将分子例如抗体或分析物固定化于表面时，＂表面＂指的是该分子能 够被固定化于其上同时仍保留与小滴微驱动器上的小滴相互作用的能力的任 何表面。例如，所述表面可以是所述小滴微驱动器上的表面，例如所述小滴 微驱动器的顶板或底板上的表面；自所述小滴微驱动器的顶板或底板延伸出 的表面；放置于所述小滴微驱动器上的物理物体的表面，该物理物体的放置 方式允许其与所述小滴微驱动器上的小滴相互作用；和/或放置于所述小滴微 驱动器上的珠，如放置于小滴中和/或放置于小滴微驱动器中但在所述小滴外 部。
就洗涤表面而言，＂洗涤＂指的是降低来自与所述表面相接触的小滴的与所 述表面相接触或暴露于所述表面的一或多种物质的量。所述物质的量的降低 可以是部分性的、或者是完全性的。所述物质可以是各种各样的物质；实例 包括用于进一步分析的靶物质，以及多余的物质，例如样品组分、污染物和/ 或过量的试剂。表面可以是，例如，小滴微驱动器的表面或小滴微驱动器上 的珠的表面。在一些实施方式中，洗涤操作始自与表面相接触的起始小滴， 其中所述小滴包括初始总量的物质。洗涤操作可采用多种小滴操作进行。洗 涤操作可产生与所述表面相接触的小滴，其中所述小滴具有的所述物质的总 量低于所述物质的初始量。在另一个实施方式中，小滴操作可产生无小滴的 表面，其中与所述表面相接触的所述物质的总量或暴露于所述表面的所述物 质的总量低于所述起始小滴中与所述表面相接触的所述物质的初始量或暴露 于所述表面的所述物质的初始量。其他的实施方式在本文中另述，更其他的 实施方式在本说明书公开的基础上将是显而易见的。
当给定组分例如层、区域或基材在此被称为是被置于或形成于另一组分 “上”时，该给定组分可直接在所述另一组分上，或者，也可存在中间组分(例 如，一或多个涂层、层、夹层、电极或接触物)。应该进一步理解，术语＂置于... 上的＂和＂在...上形成的＂可互换使用，用于描述给定组分是如何相对于另一组 分放置或安放的。因此，术语＂置于...上的＂和＂在...上形成的＂无意于对材料转 移、存放或制造的特定方法引入任何限制。
当任何形式的液体(例如小滴或连续体，无论是移动的还是静态的)被描 述为位于电极、阵列、基质或表面＂上＂、＂处＂、或＂上方＂时，该液体可以是直 接接触所述电极/阵列/基质/表面，或者是与位于所述液体和所述电极/阵列/基 质/表面之间的一或多个层或膜相接触。
当小滴被描述为位于小滴微驱动器＂上＂或＂加载于小滴微驱动器上＂时，应 该理解，该小滴被设置在所述小滴微驱动器上的方式有助于利用所述小滴微 驱动器在所述小滴上进行小滴操作，该小滴被设置在所述小滴微驱动器上的 方式有助于感测来自所述小滴的性质或信号，和/或所述小滴已经在所述小滴 微驱动器上经历了小滴操作。
附图说明
图1是用于根据本发明的一个实施方式的扩增方案的小滴微驱动器的俯 视平面图；
图2A和2B分别是根据本发明的不同实施方式的具有单个整合式加热器 和多个整合式加热器的小滴微驱动器的俯视平面图；
图3是用于根据本发明的一个实施方式的核酸序列分析的小滴微驱动器 的俯视平面图；
图4和5是显示本发明的一个示例性实施方式的反应步骤和小滴操作的 图示；
图6是用于进行根据本发明的一个实施方式的免疫测定的小滴微驱动器 的透视图；
图7是显示根据本发明的一个实施方式在小滴微驱动器上进行基于小滴 的基于亲和力的三明治测定的步骤的图示；
图8是显示根据本发明的一个实施方式在小滴微驱动器上进行竞争性基 于亲和力的测定的步骤的图示；
图9是根据本发明的一个实施方式的生物学液体分析仪的透视图；
图10是根据本发明的一个实施方式的小滴微驱动器加载结构的侧向剖面 图；
图11-13是显示根据本发明的不同实施方式利用磁场来固定化和释放磁 响应性珠的步骤的图示；
图14是显示根据本发明的一个实施方式利用物理性障碍物固定化和释放 珠的步骤的图示；
图15是显示根据本发明的一个实施方式对小滴微驱动器表面进行洗涤的 步骤的图示；
图16A和图16B分别是根据本发明的一个实施方式的用于转移小滴的小 滴微驱动器的侧向剖面图和俯视平面图；
图17是根据本发明的一个实施方式的生物学液体分析仪的透视图；
图18是根据本发明的一个实施方式的小滴微驱动器系统的图示；
图19A和19B是根据本发明的一个实施方式的便携式手持分析仪的图示；
图20是根据本发明的一个实施方式的小滴控制系统的用户界面的图示； 和
图21A-21D是显示根据本发明的不同实施方式的不同小滴微驱动器传 感器元件的构造的侧向剖面图。
发明详述
本发明提供用于实施一或多种基于小滴的生化测定的方法、装置和系统。 例如，本发明提供用于扩增核酸、分析核酸序列、进行基于亲和力的测定、 和/或分析体液组分的方法、装置和系统。
在某些实施方式中，所述系统的方案可包括以任何能够实现本发明的检 测目的顺序进行的如下一或多个步骤：自对象提取样品；处理用于加载到小 滴微驱动器上的样品；将样品加载到所述小滴微驱动器上；分配所述样品的 一或多个样品小滴用于转移到所述小滴微驱动器上；将一或多种试剂加载到 所述小滴微驱动器上；分配一或多个试剂小滴用于转移到所述小滴微驱动器 上；转移一或多个试剂小滴和/或一或多个样品小滴，以便使一或多个试剂小 滴与一或多个样品小滴相接触，从而实现试剂与样品的相互作用；检测试剂 与样品的相互作用的影响；提供输出，将检测步骤的结果通知用户。下文讨 论使用本发明的小滴微驱动器的生化方案的实例。
8.1 核酸扩增
本发明提供用于在小滴微驱动器上扩增小滴内的核酸的方法、装置和系 统。可以在单个小滴中从该小滴中存在的少量或者甚至是单一拷贝的核酸分 子制备大量拷贝的一或多种核酸分子。本发明的方法总体上包括合并必要的 反应物以形成扩增即用型小滴，并在足以导致靶核酸扩增的温度对小滴实施 热循环，例如通过聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方式中，可将包括扩增 的靶核酸的小滴随后转移至后续的方法中，例如检测方法、进一步扩增靶核 酸的方法、和/或测序方法(例如参见8.2节)。扩增装置可包括小滴微驱动器和 足以进行小滴操作的组分，以便当所述小滴微驱动器加载了合适的试剂时实 施本发明的方法。本发明的系统可包括所述小滴微驱动器以及系统组分，其 被设计为有助于以软件控制所述小滴微驱动器的操作以实施本发明的方案。
图1给出了用于本发明的扩增方案的示例性小滴微驱动器100。在该实施 方式中，可提供多个液体端口和/或池，例如样品池102、PCR试剂池104、 和引物组池106。还可提供加热区域，例如低温加热区域108和高温加热区域 110。还可提供使用例如显微镜或光电倍增管(PMT)的样品观察区域112。
在一个实施方式中，本发明提供小滴微驱动器和/或系统被构造并程序化 为在扩增即用型小滴中实施样品的扩增，随后捕获扩增的核酸。在与磁响应 性珠接触之前或之后，可处理扩增的核酸使之变性为单链核酸，以便所述单 链核酸结合于所述磁响应性珠。例如可使用生物素-链霉抗生物素系统实现结 合，例如，其中单链核酸被生物素化，而所述表面(例如珠或小滴微驱动器表 面)包被了共价结合于其上的链霉抗生物素。可采用洗涤方案洗去扩增试剂。 本发明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易 见的。
可以理解，本发明的一个重要方面涉及能够使用各种核酸扩增试剂和/或 小滴微驱动器上的样品进行小滴操作。例如，本发明包括：
(1)小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包含在此所述的用于进行核 酸扩增的任何一或多种试剂和/或样品；
(2)本发明的装置或系统，其包含所述小滴微驱动器；
(3)在所述小滴微驱动器或系统上进行小滴操作的方法或利用所述小滴 微驱动器或系统操作小滴的方法；和/或
(4)利用所述小滴微驱动器或系统进行基于小滴的序列分析方案的方法。
例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱 动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更 多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇 合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小 滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小 滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。本发 明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易见的。
8.1.1 样品和样品制备
本发明的扩增方法使用的样品包括用于扩增的核酸模板。所述核酸模板 可以是任何类型，如基因组DNA、RNA、质粒、噬菌体、和/或人工序列。所 述核酸模板可以是任何来源的，如完整的生物体、器官、组织、细胞、细胞 器(例如叶绿体、线粒体)、合成的核酸来源等。此外，模板可以是多种来历的， 如病理样品、法医样品、古生物样品等。生物学标本可包括，例如，全血、 淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、羊水、精液、 阴道分泌物、浆液、滑膜液、心包液、腹腔液、胸水、漏出液、渗出液、囊 液(cystic fluid)、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、和拭子或洗液(例如 口腔、鼻咽、眼、直肠、肠道、阴道、表皮等)和/或其他生物学标本。
可进行各种样品处理步骤来制备所述核酸模板。在一些情况中，例如自 质粒或噬菌体扩增，粗制样品即可使用。在其他情况中，例如扩增基因组DNA 的大片段，优选高度纯化的模板。样品制备步骤可在所述小滴微驱动器之上 或之外进行。
本发明的系统可以被构造并程序化为能够处理生物学样品以制备包括用 于扩增的核酸模板的小滴。该处理过程的某些部分或全部可在所述小滴微驱 动器之上或之外实施，例如使用含有结合于其上的对靶生物体具有亲和力的 试剂的珠将所述靶生物体从生物学样品中分离出来。所述小滴微驱动器可处 理样品，将其拆分为一或多个离散小滴，用于在所述小滴微驱动器上进行后 续操作。
在一些情况中，可处理标本以降低后续小滴操作过程中的粘度。例如， 可在所述小滴微驱动器之上或在所述小滴微驱动器之外制备样品，将其与碱 性溶液(例如，10％ KOH)混合或与还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇 (DTE)混合以溶解样品并使之充分流动以便在小滴微驱动器上进行小滴操作。 其他合适的样品制备技术的实例可参见美国专利申请No.60/745,950，发明名 称为＂Apparatus and Methods of Sample Preparation for a Droplet Microactuator＂， 申请日为2006年4月28日。
包括所述核酸模板的小滴可与扩增试剂合并以提供扩增即用型小滴，如 与PCR试剂合并产生PCR即用型小滴。根据所选定的试剂，扩增即用型小滴 可用于等温扩增或热循环以扩增靶核酸。扩增产物可在小滴微驱动器上进行 实时检测和/或定量。以这种方式，本发明提供了芯片上的实时定量扩增来检 测并定量样品中的靶核酸。
由于几乎100％的样品可用于分析(不需要填充管路或泵)，因此可分析极 少量的样品体积(例如少于约100μL或少于约50μL或少于约25μL)。多数测 试可使用单个小样品进行，并可最大程度节省试剂费用。
8.1.2 试剂
在本发明的扩增方案中，各种试剂可与核酸模板合并以产生扩增即用型 小滴，例如PCR即用型小滴。PCR试剂典型地包括引物、核苷酸、聚合酶和 缓冲液。这些输入试剂可以分别加载到小滴微驱动器上的单独试剂的形式提 供并在所述小滴微驱动器上利用小滴操作合并。此外，部分或所有这些试剂 可以作为试剂混合物提供，将其以预先混合的形式加载到所述小滴微驱动器 上。在一个实施方式中，将所有扩增试剂合并为单个小滴，该小滴仅需与样 品小滴合并便产生扩增即用型小滴，如PCR即用型小滴。
8.1.2.1 缓冲液
试剂典型地包括缓冲液。选定的缓冲液有助于扩增反应。符合此功能的 任何缓冲液均是合适的。当待扩增的核酸是DNA时，缓冲液通常包括镁离子。
在一个实施方式中，缓冲液包括KCl、Tris和MgCl2。其他合适的缓冲液 可参见Chamberlain等，Nucleic Acid Rerearch 16：1 1141-11156(1988)。例如， 缓冲液可包括约500mM KCl，约100mM Tris-HCl(pH 8.3)，和约15mM MgCl2。在另一个实例中，缓冲液可包括约83mM(NH4)2SO4，约335mM Tris-HCl(pH8.8)，约33.5mM MgCl2，约50mM β-巯基乙醇，和约34mM EDTA。 缓冲液还可包括引物和/或聚合酶。
在一个实施方式中，可在若干小滴中先后或平行进行PCR，在这些小滴 中，一或多种缓冲液组分的浓度被系统性地改变(例如在一系列小滴中)以便改 善或优化特定反应所用的缓冲液。因此，例如，可以改变以下任何一或多种 缓冲液组分：KCl；Tris；MgCl2；(NH4)2SO4；β-巯基乙醇；EDTA。一旦鉴定 到最佳的测试缓冲液条件，即可使用该最佳缓冲液系统进行PCR或可以在所 述最佳测试缓冲液系统附近进行进一步优化。
本发明包括小滴微驱动器，其上包括小滴，所述小滴是缓冲液或包含缓 冲液组分，本发明还包括包括所述小滴微驱动器的系统和/或装置以及在小滴 微驱动器上进行小滴操作或对小滴微驱动器上的小滴进行操作的方法。因此， 例如，本发明包括小滴微驱动器，其上包括小滴，所述小滴包括一或多种以 下组分：KCl，Tris，MgCl2；((NH4)2SO4；β-巯基乙醇；EDTA。
此外，本发明包括小滴微驱动器，其上包括小滴，所述小滴包含一或多 种上述组分，所述组分的浓度足以有助于扩增靶核酸。此外，本发明包括所 述小滴以及聚合酶、核苷酸和/或一或多种引物，它们的浓度足以有助于扩增 靶核酸。本发明还包括在所述小滴微驱动器、装置、和/或系统上进行小滴操 作的方法或使用所述小滴微驱动器、装置、和/或系统来操作本节所述的任何 小滴。例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微 驱动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或 更多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴 汇合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使 小滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将 小滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述各项的任意组合。
8.1.2.2 引物
本发明的扩增方法所用的试剂可包括一或多种引物。在典型的方法中， 使用两种引物来确定待扩增的所述核酸模板的区域。典型地，选定的引物序 列和长度可保证有效复制且几乎没有错误。此类引物的长度通常为约18-24 个碱基。选择有效引物的其他条件是已知的。合适的引物性质的实例包括没 有内部二级结构、40-60％G/C含量、富G/C和A/T区域平衡分布、以及3′ 末端不具有互补性以免形成引物二聚体。尽管没有特殊要求，但具有一或多 种这些性质的引物和适合用于实施本发明。此外，引物的解链温度(Tm)通常 选择为使得退火温度为约55至约65℃、或约62至约65℃。有多种公共的计 算机程序可用于鉴定具有适合用于扩增的性质的引物。如果使用两种引物， 它们通常使用相等的浓度。如果待扩增的核酸是RNA，则不一定需要引物。
在一些实施方式中，使用引物的简并混合物。例如，因特定的氨基酸序 列可由多种可能的密码子编码，因此混合物可包括覆盖靶多肽所用的所有密 码子组合的所有可能的序列。可通过鉴定感兴趣生物体的密码子偏向性并仅 纳入该生物体通常使用的引物而简化简并引物混合物。
所提供的引物可具有任何有助于扩增靶核酸的浓度。浓度应该足够低， 以免过多的引物错配、非特异性产物堆积、和/或形成引物二聚体。引物浓度 还应该足够高，以免在扩增反应完成前引物耗竭。在一些实施方式中，引物 浓度为约0.1μM至约1μM或约0.1μM至约0.6μM。
引物还可以被标记。例如，可以选择标记物以便检测、定位、定量、和/ 或分离PCR产物。例如，可使用生物素化以便利用链霉抗生物素捕获表面上 的生物素化的PCR产物进行检测和/或纯化。此外，链霉抗生物素可与磁响应 性珠相联合用于捕获生物素化的PCR产物。也可使用地高辛配基检测PCR产 物。引物可以，例如，在其5′端和/或内部进行标记，此外，可将标记的核苷 酸掺入PCR产物以便检测、定位、定量、和/或分离。
本发明包括小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包括用于扩增靶核 酸的标记的和/或未标记的引物(例如浓度为约0.1μM至约1μM或约0.1μM 至约0.6μM)，其浓度足以有助于扩增反应，本发明还包括包括所述小滴微驱 动器的系统和/或装置以及在小滴微驱动器上进行小滴操作或对小滴微驱动器 上的小滴进行操作的方法。作为另一个实例，本发明包括小滴微驱动器，其 上包含小滴，所述小滴包括标记的和/或未标记的引物，引物浓度应该足够低， 以减少或消除引物错配和非特异性产物堆积，且引物浓度还应该足够高，以 免在扩增反应完成前引物耗竭。在另一个实例中，本发明包括小滴微驱动器， 其上包括小滴，所述小滴包括标记的和/或未标记的引物，引物浓度为约0.1μM 至约1μM或约0.1μM至约0.6μM。此外，本发明包括所述小滴以及聚合酶、 核苷酸和/或缓冲液组分，它们的浓度被选定为有助于扩增靶核酸。此外，本 发明包括在所述小滴微驱动器、装置、和/或系统上进行小滴操作的方法或使 用所述小滴微驱动器、装置、和/或系统来操作本节所述的任何小滴。例如， 所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱动器中；从 源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更多个小滴； 将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇合或合并为 一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小滴保持原位； 温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小滴转移出微驱 动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述各项的任意组合。
8.1.2.3 核苷酸
本发明的扩增方法所用的试剂包括核苷酸。dNTP的储存液可从多种来源 商品化获得。储存液通常的浓度为100-300mM。在将储存液引入所述小滴微 驱动器和/或所述小滴微驱动器上之前可采用小滴操作将所述储存液与一或多 种缓冲液合并以稀释所述储存液。PCR即用型小滴中的终浓度典型地为约50 μmol至约200μmol。四种dNTP典型地以等摩尔浓度提供。
本发明可以使用各种修饰的核苷酸。实例包括被设计为用于减少二级结 构转变、防止污染的核苷酸、以及放射性标记的核苷酸、非放射性标记的核 苷酸、以及被设计为促进随机诱变的核苷酸。实例参见McPherson等，PCR， Taylor and Francis Group，2006(通过引用将其全部内容并入本文)。
本发明包括小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包括用于扩增靶核 酸的核苷酸，其浓度足以有助于扩增反应，本发明还包括包括所述小滴微驱 动器的系统和/或装置以及在小滴微驱动器上进行小滴操作或对小滴微驱动器 上的小滴进行操作的方法。因此，例如，本发明包括小滴微驱动器，其上包 括小滴，所述小滴包括一或多种核苷酸，其浓度为约100mM至约300mM(储 存浓度)或约50μmol至约200μmol(工作浓度)。在另一个实例中，本发明包 括小滴微驱动器，其上包括小滴，所述小滴包括1、2、3或4种核苷酸，每 一种的浓度为约100mM至约300mM或约50μM至约200μM。本发明的系 统可以被构造并程序化为实施稀释储存核苷酸浓度的方案以提供包括工作核 苷酸浓度的小滴。例如，本发明的系统可以被构造并程序化为将约100mM至 约300mM的储存核苷酸浓度稀释为约50μmol至约200μmol的工作溶液的 方案。此外，本发明包括含有核苷酸的小滴以及聚合酶、引物和/或缓冲液组 分，它们的浓度被选定为用于提供有助于扩增靶核酸。此外，本发明包括在 所述小滴微驱动器、装置、和/或系统上进行小滴操作的方法或使用所述小滴 微驱动器、装置、和/或系统来操作本节所述的任何小滴。例如，所述小滴操 作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱动器中；从源小滴分配 一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更多个小滴；将小滴自一 处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇合或合并为一个小滴； 稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小滴保持原位；温育小滴； 加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小滴转移出微驱动器；在此 所述的其他小滴操作；和/或上述各项的任意组合。
8.1.2.4 PCR聚合酶
本发明的基于小滴的PCR方案可使用多种PCR聚合酶。合适的聚合酶通 常在约75℃具有最佳活性，并能够在例如高于95℃的温度长时间温育后仍 保留该活性。有用的聚合酶可包括，例如，DNA依赖性DNA聚合酶和/或RNA 依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)。可使用各种热稳定型聚合酶，例如Taq DNA 聚合酶。合适的实例包括AmpliTaq  的Stoffel 片段等等。具有校读能力的热稳定型聚合酶的实例包括Tli、 Pfu、Pwo、 和KOD Hifi、DNA聚合酶、 以及前述各项的各种exo-形式。在一些情况中，聚合酶制备物可包括用于确 定或确认PCR试剂浓度的染料。在一些情况中，系统被构造并程序化为检测 此类染料并基于比色测定值计算试剂浓度。在一些情况中，本发明使用的小 滴包括热稳定型聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)和校读聚合酶(例如Pwo DNA 聚合酶)的组合。
本发明包括小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包括一或多种聚合 酶，其浓度足以有助于扩增反应，本发明还包括包括所述小滴微驱动器的系 统和/或装置以及在小滴微驱动器上进行小滴操作或对小滴微驱动器上的小滴 进行操作的方法。此外，本发明包括在所述小滴微驱动器、装置、和/或系统 上进行小滴操作的方法或使用所述小滴微驱动器、装置、和/或系统来操作本 节所述的任何小滴。例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴 加载至小滴微驱动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或 拆分为两个或更多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个 或更多个小滴汇合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使 小滴变形；使小滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴； 布置小滴；将小滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的 任何组合。此外，本发明包括本发明的小滴微驱动器上的含有聚合酶的小滴 以及核苷酸、引物和/或缓冲液，它们的浓度被选择为可提供足以有助于扩增 靶核酸的条件。
8.1.2.5 检测扩增的产物
在一些实施方式中，在若干轮扩增循环后检测扩增的核酸。例如，可在 每一循环过程中或之后、或在预定轮循环后，例如在每2、3、4、5、6、7、8、 9、或10个循环后，定量扩增的核酸。检测通常包括利用小滴操作来转移小 滴至检测区内，在该处，传感器测量小滴的某些方面，例如物理、化学或电 方面，这些方面与扩增相关联。系统可被程序化以便持续进行扩增循环直至 检测发现已经达到所期望的信号水平。在一个实施方式中，扩增检测方法是 荧光技术。
此外，在一些实施方式中，包含扩增的核酸的小滴可被转移用于进一步 处理/检测。例如，在诊断实施方式中，包括扩增的核酸的小滴可被转移用于 检测是否存在诊断用靶核酸。靶核酸例如可包括来自致病性生物体的核酸， 例如与寄生虫、细菌、真菌或病毒相关联的DNA或RNA。所述小滴微驱动 器可以是一体化便携式诊断平台的一个组分。所述系统可通过实时PCR对感 染性疾病组进行全自动快速检测。所述系统可以在床旁、Stat实验室、医生办 公室或者野外使用。
荧光检测适合于检测扩增的核酸。发光二极管(LED)和激光二极管适合用 作激发光源，因为它们的体积小、省电且耐用。LED很有吸引力，因为它们 便宜，而激光二极管则具有较窄的光谱宽度，并且它们可被聚焦于很小的光 点直径而不会发出大量的光。
除了已经讨论的试剂，可用于本发明的核酸扩增方案的试剂包括各种检 测试剂，例如荧光和非荧光染料和探针。例如，方案可使用适合用于TaqMan 反应的试剂，例如TaqMan探针；适合用于 Green反应的试剂，例如  Green；适合用于分子信标反应的试剂，例如分子信标探针；适合用 于蝎型反应(scorpion reaction)的试剂，例如蝎型探针(scorpion probe)；适合用 于荧光DNA-结合染料类型反应的试剂，例如荧光探针；和/或适合用于 LightUp方案的试剂，例如LightUp探针。
本发明包括小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包括一或多种检测 试剂，例如任何一或多种上述的探针，其浓度足以有助于扩增反应，本发明 还包括包括所述小滴微驱动器的系统和/或装置以及在小滴微驱动器上进行小 滴操作或对小滴微驱动器上的小滴进行操作的方法。此外，本发明包括在所 述小滴微驱动器、装置、和/或系统上进行小滴操作的方法或使用所述小滴微 驱动器、装置、和/或系统来操作本节所述的任何小滴。例如，所述小滴操作 可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱动器中；从源小滴分配一 或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更多个小滴；将小滴自一处 沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇合或合并为一个小滴；稀 释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小滴保持原位；温育小滴； 加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小滴转移出微驱动器；在此 所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。此外，本发明包括本发明的小 滴微驱动器上的含有核苷酸的小滴以及核苷酸、引物、检测探针和/或缓冲液， 它们的浓度被选择为可提供足以有助于扩增靶核酸的条件。
此外，本发明包括对扩增进行检测和/或定量的方法，该方法包括测量来 自小滴微驱动器上的小滴的信号(例如荧光信号)。因此，例如，该方法可将可 能包括荧光染料(例如 Green)的小滴暴露于具有一选定波长的光源， 该选定波长导致所述化合物发出荧光，以及测量所产生的荧光。可在扩增反 应过程中跟踪自小滴发出的荧光以便监测反应，例如使用 Green类化 合物。本发明的系统可以，例如，被程序化为检测该荧光并显示出相应的图 或者其他输出形式，以便用户实时跟踪PCR反应的进程。
在另一个实例中，本发明包括通过以下步骤检测和/或定量靶核酸的存在 的方法，加入对可能包括靶核酸的扩增即用型小滴中的靶核酸具有特异性的 探针(例如TaqMan类探针)，热循环所述扩增即用型小滴，并检测由所述探针 降解所引起的任何荧光信号，其中荧光信号代表所述小滴中存在所述靶核酸。 本发明包括使用其他靶特异性探针例如蝎型探针和分子信标的相应的方法。
8.1.3 热循环
在本发明的实践中，PCR即用型小滴被热循环以便实施靶核酸的扩增。 为了有效扩增某些核酸，可能需要严密控制热循环。下文的8.8.6节讨论了为 在小滴微驱动器上进行可控热循环而设计的结构的实例。典型地，每一热循 环包括至少两个步骤：
(1)将小滴加热至足以使小滴中的双链核酸变性为单链DNA的温度(典 型地为约90-100℃)；和
(2)降低所述小滴的温度以便允许引物与其在所述核酸模板链中的互补 序列退火(典型地为约50-75℃)。
在一些情况中，热循环还可包括第三个步骤：
(3)调节小滴温度以便促进所述核酸的双链节段通过掺入额外的核苷酸 而延伸(典型地为约70-75℃)。
根据所选定的试剂，可以在允许引物与所述核酸模板链退火的温度相同 的温度进行额外的核苷酸的掺入，这样一来便不需要第三步的温度调节。在 本发明的不同方案中，还可加入额外的热循环步骤。
本发明允许对多个小滴平行地进行热循环。因此，在不同的实施方式中， 在单个小滴微驱动器上平行地对超过2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、 或1000个扩增即用型小滴进行热循环。在一些实施方式中，平行地实时测定 这些小滴中的扩增。
在一个实施方式中，将正经历热循环的每个小滴置于传感器附近，或者 是转移至传感器的附近，以便可以实时监测与扩增相关的来自所述小滴的信 号。系统可将代表扩增进程的实时信息输出给用户。此外，系统可被设置为 允许在对多个小滴平行进行热循环时进行输出，如在单个小滴微驱动器上对 超过2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、或1000个扩增即用型小滴平 行进行热循环，且系统输出代表扩增进程的实时信息。
本发明的方法还包括温度优化步骤或方案，用于优化变性、退火和/或延 伸的温度和/或时间。在该步骤中，可使用一或多个加热区来改变一或多个加 热步骤的温度。例如，所述方法可包括用于优化退火温度的优化步骤或方案。 可使用不同的退火温度对一系列小滴进行热循环，随后对扩增进行检测定量， 由此确定哪一个测试退火温度可产生最佳的结果。随后的热循环可以该测试 温度进行。类似地，可对一系列小滴的退火温度使用不同的时间进行热循环， 随后对扩增进行检测定量，由此确定哪一个测试时间在给的退火温度可产生 最佳的结果。随后的热循环可以选定的时间进行。此外，可以依次或同时实 施此类优化方案以便确定优化温度和优化时间。可以实施类似的方案优化变 性和/或延伸步骤的温度和时间。
在一个实施方式中，通过加热和冷却整个小滴微驱动器实现热循环。该 实施方式大体上包括以下步骤：
(1)将所述小滴微驱动器加热到足以使双链DNA(存在于所述小滴微驱 动器上的小滴中)变性为单链DNA的温度；
(2)将所述小滴微驱动器的温度降低到足以允许引物(存在于所述小滴 微驱动器上的小滴中)与其在所述核酸模板链上的互补序列退火的温度；
(3)任选地，调整所述小滴微驱动器的温度以便通过掺入额外的核苷酸而 延伸所述核酸的双链节段(存在于所述小滴微驱动器上的小滴中)。
本发明的热循环方案不会造成PCR即用型小滴中的水分或其他组分明显 丢失。此外，所述热循环方案不会造成小滴之间明显的交叉污染。此外，所 述热循环不会明显破坏所述小滴微驱动器继续进行小滴操作的能力。例如， 在一些情况中，可在不同的变性、退火、和/或延伸温度持续进行小滴操作。
在相关的实施方式中，通过加热和冷却所述小滴微驱动器的区段或区域 实现热循环。这种方法大体上包括以下步骤：
(1)将所述小滴微驱动器的区段或区域加热到足以使双链DNA(存在于 所述小滴微驱动器上的小滴中)变性为单链DNA的温度；
(2)将所述小滴微驱动器的区段或区域的温度降低到足以允许引物(存在 于所述小滴微驱动器上的小滴中)与其在所述核酸模板链上的互补序列退火的 温度；
(3)任选地，调整所述小滴微驱动器的区段或区域的温度以便通过掺入额 外的核苷酸而延伸核酸的双链节段(存在于所述小滴微驱动器上的小滴中)。
在一个实施方式中，使用图2A所示的具有单个整合式加热器202的小滴 微驱动器进行该方法。
在另一个实施方式中，所述小滴微驱动器的区域可保持在所需的温度， 并将小滴转移通过合适的温度区域以实施热循环.这种方法大体上包括以下 步骤：
(1)将扩增即用型小滴转移至小滴微驱动器的区域，该区域保持合适的温 度以便将小滴中的双链DNA变性为单链DNA；
(2)将扩增即用型小滴转移至小滴微驱动器的区域，该区域保持在足以允 许小滴中的引物与其在所述核酸模板链上的互补序列退火的温度；和
(3)任选地，将扩增即用型小滴转移至小滴微驱动器的区域，该区域保持 在足以通过掺入额外的核苷酸以促进或优化小滴中的双链核酸节段的延伸的 温度。
在该实施方式中，通过重复将小滴从一个区移至另一个区的转移步骤而 实施热循环。在一个实施方式中，所述小滴微驱动器仅为每个所需温度提供 一个温度区，并通过使各个小滴旋转通过合适的温度区而实施热循环。在另 一个实施方式中，所述小滴微驱动器包括两个或更多个每种温度区。在又一 个实施方式中，所述小滴微驱动器包括两个或更多个的一或多个所述温度区。 此外，所述小滴微驱动器可包括2个、3个或更多个温度区，每一个可加热至 不同的特定温度。在一个实施方式中，使用如图2B所示的具有多个整合式加 热器204的小滴微驱动器进行该方法。
此外，可使用一或多个加热器来建立跨小滴微驱动器的区域的连续温度 梯度。在该实施方式中，可使用电极矩阵(electrode matrix)、电极路径(electrode path)或系列电极路径将小滴定位在合适的温度区以实施所需的热循环步骤。 可通过将小滴转移至所述温度梯度内合适位置的电极处以达到靶温度来实施 热循环。可通过简单地改变小滴在所述温度区内的位置而实现温度的变化， 例如，用于优化各种变性、退火和/或延伸步骤。
热循环可包括使用各种加热和/或冷却模块以建立变性、退火和/或延伸的 靶温度区。这些加热和冷却模块可被设置为有助于在靶温度区之间形成适当 的温度斜坡(temperature ramp)。可通过改变特定加热和/或冷却模块的温度和/ 或通过选择加热和冷却模块的距离以实现具有适当的温度斜坡的靶温度区， 因此控制所述斜坡。所述小滴微驱动器可具有加热和/或冷却模块，所述模块 的温度范围和间隙被选定为用于产生预定组的潜在靶温度区和温度斜坡。靶 温度区之间可具有各种加热和/或冷却模块以调整各区之间的斜坡。
在一个实施方式中，所述小滴微驱动器包括一系列独立调节式加热元件。 可调节各加热元件的温度，以便在小滴通过一个靶温度区到下一个靶温度区 时提供合适的加热斜坡。此外，可选择靶温度时加热元件之间的距离，以便 有助于形成合适的温度斜坡和/或以便预防因接近放置的加热元件之间的相互 作用而造成过热。此类方法为实行各自要求不同的靶温度区和斜坡特征的多 种方案提供了灵活性。例如，在一系列或矩阵的加热元件中，靶温度区可在 接近的加热元件处和/或可被一或多个加热元件分开以使得它们相隔更大的距 离。这样一来，可改变距离以满足各种方案需求的温度需求。本发明的系统 可选择最佳的加热元件以建立加热区之间具有合适的或最佳的温度斜坡的靶 温度区。
本发明的方法可包括用于优化热循环的变性、退火、和/或延伸阶段的温 度和/或时间的温度优化步骤或方案。例如，所述方法可包括用于优化退火温 度的优化步骤或方案。可建立一系列加热区，其中，通过不同的退火温度对 扩增即用型小滴进行循环以确定哪一个退火温度产生最佳结果。可在所述最 佳温度进行后续的热循环。类似地，可采用如下方案对一系列扩增即用型小 滴进行循环，所述方案中，退火阶段的时间被系统性改变以确定哪一段时间 可在给定温度下产生最佳结果。可使用所述最佳时间段进行后续的热循环。 此外，可依次或同时实施此类方案以便确定最佳温度和最佳时间段。可实施 类似的方案以优化变性和/或延伸步骤。优化方案可依次或平行进行。
类似地，本发明的方法可包括温度优化步骤或方案，其使用多个独立加 热的温度区以优化变性、退火、和/或延伸的温度和/或时间。例如，可建立一 系列加热区，将扩增即用型小滴从其中转移通过。所述区可包括以启动变性、 退火、和/或延伸为目的的温度。在特定一组小滴中，可系统性地改变一组PCR 即用型小滴的所述变性、退火和/或延伸区之一的温度，而其他两个温度保持 恒定。可测试多个小滴组，以便可按需改变每个温度参数。可依次地和/或平 行地测试一或多个所述的多个小滴组。加热区温度的变化，例如，可由处理 器控制(例如控制加热元件的温度和/或控制小滴在加热梯度内的位置)，使用 被预程序化为实施优化方案的软件和/或使用由用户通过用户界面控制的软 件。可以类似方式优化所述热循环各阶段的时间。优化方案可依次地或平行 地进行。
此外，本发明包括在升高的温度条件下使用PCR即用型小滴在小滴微驱 动器上进行一或多次小滴操作的方法，例如温度高于约70、75、80、85、90、 95、或100℃。例如，所述小滴操作可包括：将小滴加载至小滴微驱动器中； 从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更多个小滴； 将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇合或合并为 一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小滴保持原位； 温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小滴转移出微驱 动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。再者，本发明包括 通过在小滴微驱动器的两个或更多个温度区之间转移小滴而加热和/或冷却小 滴的方法。此外，本发明包括加热和/或冷却小滴的方法，其中当所述温度区 的范围在约40℃至约120℃时，在小滴微驱动器的两个或更多个温度区之间 转移小滴。本发明还包括加热和/或冷却小滴的方法，其中当所述温度区的范 围在约40℃至约120℃时，在小滴微驱动器的两个或更多个温度区之间转移 小滴，以便达到靶温度，其中至少一部分所述靶温度是高于约70、75、80、 85、90、95、或100℃的温度。
本发明包括小滴微驱动器或小滴微驱动器系统，其具有一或多个输入池， 所述输入池加载了用于进行生物化学反应的试剂，例如用于核酸扩增方案、 基于亲和力的测定方案、测序方案、以及用于分析生物学液体的方案的试剂。 例如，一或多个池可包括用于提供缓冲液、引物、核苷酸、聚合酶以及进行 PCR反应的其他试剂的试剂。在一个实施方式中，一或多个池包括缓冲液， 其包括用于进行PCR反应的两种或更多种试剂，其中所述试剂选自引物、核 苷酸、聚合酶、和其他PCR试剂。在另一个实施方式中，一或多个所述的池 包括小滴，所述小滴包括进行PCR反应所需的所有试剂，这样当与包括核酸 模板的样品小滴合并后，得到的是用于PCR热循环的现成的小滴。本发明还 包括小滴微驱动器或小滴微驱动器系统，其具有一或多个加载了用于进行 PCR反应的样品的输入池。
8.1.4 扩增方案
本领域人员可以理解，根据这里公开的内容，许多变化仍然属于本发明 的范围。总体上，所述方案包括合并两个或更多个包含PCR试剂和模板的小 滴以产生PCR即用型小滴，并在选定的有助于扩增靶核酸的温度对所述PCR 即用型小滴进行热循环。
在上游，所述方案可包括各种样品处理步骤，以便提供用于PCR扩增的 现成的核酸模板。例如，可在PCR之前进行RNA的逆转录以提供稳定的用 于扩增的DNA核酸模板。因此，在一个实施方式中，本发明提供制备包含 DNA核酸模板的小滴的方法，其中所述方法包括进行基于小滴的RNA的逆 转录以产生所述核酸模板。
可采用＂热启动＂方法将反应准备过程中引物二聚体的形成最小化。通过在 PCR循环之前限制聚合酶活性，可减少非特异性扩增并增加靶产量。普通的 热启动PCR方法包括化学修饰、腊屏障方法、以及用针对Taq的抗体进行抑 制。
在下游，所述方案可包括各种后续步骤，例如测序所扩增的核酸，如采 用焦磷酸测序(pyrosequencing)方法或采用毛细管电泳分离扩增的片段。
也可在PCR过程中使用各种专门的技术。例如，可使用具有与所述核酸 模板不完全互补的序列的引物进行基于小滴的体外诱变。因此，例如，本发 明可包括在小滴微驱动器上的小滴中实施体外诱变的方法，其中所述方法包 括合并两个或更多个小滴，所述小滴包括PCR试剂和选定用于诱变的引物， 其量足以有助于扩增所述靶核酸的突变形式。此外，突变形式的靶核酸可被 转移用于下游处理，如对所述突变形式的靶核酸进行测序以确认所需的突变。
在本发明的医学诊断方面，可使用分子标签例如地高辛配基(DIG)或生物 素标记的dUTP以检测特定的序列。标记的PCR产物可以，例如，用作杂交 探针，或使用捕获探针进行检测。
在许多方案中，需要同时处理一或多个对照小滴以确定反应的质量或真 实性。因此，例如，为了保证没有发生污染，可对一或多个不含样品模板的 PCR即用型小滴进行热循环，而其他方面的处理方式与包括样品模板的小滴 相同。在对照小滴中检测到扩增的核酸代表存在污染。其他的对照小滴可包 括已知量或浓度的模板材料、或已知量或浓度的荧光染料。对照小滴可与所 述样品小滴在同一小滴微驱动器上与真实的样品小滴同时处理、在其之前和/ 或之后处理。
所述系统能够对每个样品或测定的反应方案和条件进行独立的基于软件 的定制。这一点与该平台的可升级性相结合，确保可将所述系统的能力延伸 至大范围的靶核酸。
本发明包括在扩增试剂上进行小滴操作的方法。例如，本发明包括在包 括缓冲液、引物、核苷酸、聚合酶、和/或其他PCR试剂的小滴上进行一或多 次小滴操作的方法。本发明还包括使用小滴微驱动器上的包括一或多种引物 的缓冲液小滴进行一或多次小滴操作的方法。本发明还包括使用小滴微驱动 器上的包括一或多种核苷酸的缓冲液小滴进行一或多次小滴操作的方法。本 发明还包括使用小滴微驱动器上的包括一或多种聚合酶如DNA聚合酶的缓 冲液小滴进行一或多次小滴操作的方法。本发明还包括使用小滴微驱动器上 的包括一或多种逆转录酶的缓冲液小滴进行一或多次小滴操作的方法。在另 一个实施方式中，本发明包括使用小滴微驱动器上的缓冲液小滴进行一或多 次小滴操作的方法，所述缓冲液小滴包括2、3、4或更多种PCR试剂，所述 试剂选自包括引物、核苷酸、聚合酶、和其他PCR试剂的范畴。此外，本发 明包括使用PCR即用型小滴进行一或多次小滴操作的方法，所述PCR即用型 小滴包括一或多种缓冲物、引物、核苷酸、聚合酶、和包括靶核酸序列的核 酸模板。
基于小滴的扩增方案还可用于分析RNA的含量。在一些实施方式中， RNA是初始靶核酸。可使用双缓冲系统，其中为自病毒RNA产生cDNA的 逆转录(RT)步骤提供一种缓冲物，并选定不同的缓冲物用于DNA扩增步骤。 在相关的实施方式中，使用单一缓冲物方法，其中提供的缓冲物可适合于这 两种反应，不需要对其中之一是优化的。
在一个实施方式中，可在小滴微驱动器上实施基于小滴的PCR以定量相 关的癌症生物学标记物的基因表达水平的改变，如血管内皮生长因子(VEGF) 和周期素依赖性激酶抑制剂p21(Cip1)和p27(Kip1)。例如，可裂解小滴内的细 胞，无论其是悬浮的还是结合于表面。可使用珠，例如寡(dT)磁响应性珠在小 滴中捕获释放的poly(A)mRNA。试剂可获自Dynal Biotech的mRNA DIRECT Micro Kit。可混合或搅动小滴以增强细胞裂解，并增加被捕获到珠上的poly(A) mRNA。可通过加热使RNA-DNA双链体解链以洗脱来自寡(dT)磁响应性珠的 mRNA。合适的温度取决于链的长度。可使用本文其他部分所述的基于小滴的 洗涤方案来洗涤珠。可采用基于小滴的方案，以针对靶基因(例如VEGF、 p21(Cip1)和p27(Kip1))的合适引物在所述小滴微驱动器上进行PCR(例如 qRT-PCR)。也可使用Van Gelder和Eberwine的技术实施基于小滴的RNA扩 增。
本发明提供基于小滴的DNA滚环扩增。在滚环方法中，在小滴微驱动器 上加热含有dsDNA的缓冲液小滴达到足以导致dsDNA变性的温度(典型地为 约95℃)。在一些情况中温育时间可以为约1至约10分钟。将包括可环化探 针的小滴与包括变性DNA的小滴合并，以便使可环化探针与靶dsDNA在有 效的温度(例如约60℃)以及含有聚合酶(例如黄色蠕形霉(T.flavus)DNA聚合 酶)和合适的连接酶(例如Ampligase DNA连接酶)的缓冲液中退火并连接。在 一些情况中，可温育少于约45分钟。将所得小滴与滚环引物、缓冲液、29 DNA 聚合酶在降低的温度(例如约31℃)下合并。在一些情况中，温育时间可为约2 至约30分钟。可用29 DNA聚合酶掺入生物素以捕获链霉抗生物素珠或表 面上的扩增子，并以荧光探针来观察。
本发明提供基于小滴的DNA链置换扩增(SDA)。在该实施方式中，将包 括具有靶特异性扩增引物的dsDNA片段的缓冲液小滴在小滴微驱动器上加 热，达到足以使dsDNA变性的温度(典型地为约95℃)。在一些情况中，温育 时间可少于约4分钟。然后将小滴冷却至退火温度(例如约37℃)以便退火。 在一些情况中，退火时间可少于约4分钟。通过小滴操作使所述小滴与包括 限制性内切酶和exo(-)KJenow聚合酶的小滴合并。在所述小滴微驱动器上对 所得小滴进行等温温育，温度足以导致DNA扩增(例如约37℃)。在一些情况 中，温育时间可以是约1至约5小时。可使用，例如，荧光探针或链特异性 分子信标检测扩增。
本发明提供基于小滴的RNA的转录介导的扩增或NASBA。在该实施方 式中，在所述小滴微驱动器上将包括靶核酸的小滴加热至足以使靶变性的温 度(例如约95℃)。在一些情况中，变性时间可以少于约4、3、或2分钟。然 后将小滴冷却至合适的温度(例如约41℃)，并利用小滴操作与包括T7 RNA 聚合酶启动子靶引物1和靶引物2的小滴合并。所得小滴通过小滴操作与包 括逆转录酶、RNAse H和T7 RNA聚合酶的小滴合并。然后将所述小滴的温 度调整至足以导致RNA扩增子被扩增的温度。在一些情况中，扩增时间可持 续约60分钟。
本发明的一个方面是具有用于固定化核酸的基材的小滴微驱动器。在一 个方面，所述基材是金基材。另一个方面是小滴微驱动器，其包括用于固定 化核酸的基材和用于将所述核酸固定化于所述基材的试剂。再另一个方面是 小滴微驱动器，其包括用于固定化核酸的基材、用于将所述核酸固定化于所 述基材的试剂、和核酸样品。这些试剂和样品可，例如，储存于所述小滴微 驱动器上的池中和/或所述小滴微驱动器外的池或其他容器(例如筒)中。在另 一个方面，本发明涉及将核酸样品固定化于基材的方法，其包括实施小滴操 作以便将包含核酸样品的小滴与所述基材相接触，并由此将所述核酸样品沉 积于所述基材上。
8.1.5 下游分析
在一些实施方式中，可将包含扩增的靶核酸转移至下游进一步分析。例 如，可将小滴转移至下游通过微凝胶电泳进行分析。微凝胶电泳可在所述小 滴微驱动器之上或之外进行。
在一个实施方式中，使用二维微凝胶电泳装置，例如Mohanty等和美国 电泳协会年会(the American Electrophoresis Society Annual Meeting)所述的装 置(见http://aiche.confex.com/aiche/2005/techprogram/P30621.HTM)。
在一些实施方式中，将包括扩增的核酸的小滴与包括试剂的小滴相接触， 所述试剂足以见所述扩增的核酸克隆入合适的载体中。可选择载体用于，例 如，基因文库、和/或在细胞中表达。
8.2 核酸序列分析
本发明提供用于在小滴微驱动器系统上进行基于小滴的核酸序列分析的 方法、装置和系统，所述小滴微驱动器系统避免了与现有技术的方法所需要 的越来越复杂的混合物有关的问题。
图3所示为示例性的小滴微驱动器300，其适合用于核酸序列分析。在该 实施方式中，可提供多个液体端口或池，例如DNA输入池302、DNA试剂池 304、引物组池306、核苷酸(例如dA、dC、dG和dT)池308、和焦磷酸测序 引物池310。还可提供洗涤缓冲液池312以及废液区314、热循环区316、和 成像区318。各种热循环区实施方式可利用多种构造的加热器，例如本文在其 他部分所述的加热器。成像区318可使用，例如，光电倍增管(PMT)。
图4和5显示了本发明的示例性实施方式的反应步骤和小滴操作。可按 需(在所述小滴微驱动器之上或之外)扩增核酸样品，以得到足够浓度的核酸用 于分析。可将核酸样品引入小滴微驱动器并固定化于固相支持物。可使用小 滴微驱动技术将用于使核酸变性为单链、引发和逐步延伸核酸的试剂转移给 固定化的核酸。重要的是，可将包括反应产物的小滴从固定化的核酸处转移 开，例如用于进一步处理、分析、和/或废液处置。重要的是，在一些实施方 式中，检测可与延伸合成反应在时间和空间上分开进行。仅这种能力即可减 少或消除现有技术方法所导致的某些降解副产品堆积的问题。本发明的另一 个优势是可在传感器附近进行检测，以提高光收集的效率并因此提高分析的 敏感性。
本发明可包括小滴微驱动器或小滴微驱动器系统，其具有一或多个输入 池，其中加载了用于进行测序方案的试剂。例如，一或多个池可包括用于进 行焦磷酸测序方案的试剂。本发明还可包括小滴微驱动器或小滴微驱动器系 统，其具有一或多个输入池，其中加载了用于进行焦磷酸测序方案的样品。
可以理解，本发明的一个重要方面包括能够在小滴微驱动器上使用各个 序列分析试剂和/或样品进行小滴操作。例如，本发明可包括：
(1)小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包含在此所述的用于进行序 列分析的任何一或多种试剂和/或样品；
(2)本发明的装置或系统，其包含所述小滴微驱动器；
(3)在所述小滴微驱动器或系统上进行小滴操作的方法或利用所述小滴 微驱动器或系统操作小滴的方法；和/或
(4)利用所述小滴微驱动器或系统进行基于小滴的序列分析方案的方法。
例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱 动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更 多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇 合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小 滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小 滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。本发 明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易见的。
8.2.1 样品扩增
核酸序列分析典型地以包括扩增的核酸分析物的样品或以包括用于扩增 的核酸分析物的样品开始。对于后者，可使用标准技术进行扩增和/或如8.1 节所述在小滴微驱动器上使用基于小滴的扩增。可在用于进行序列分析方案 的同一个小滴微驱动器上进行扩增和/或在分开的小滴微驱动器上进行扩增。 在一些实施方式中，使用与序列分析小滴微驱动器以流体连通方式连接的第 二小滴微驱动器。
8.2.2 核酸固定化
如图4所示，所述扩增的核酸样品可固定化于所述小滴微驱动器内，以 便使试剂小滴与固定化的核酸相接触。可以在所述小滴微驱动器的表面或所 述微驱动器内的其他表面进行固定化，例如由聚合物、聚合物树脂制得的以 及任选地包括磁响应性材料的珠。
可用于进行此类附着的基材包括玻璃、金、聚丙烯酰胺凝胶、聚吡咯、 聚四氟乙烯(Teflon)、以及光学纤维。材料的形式可以是，例如，膜、颗粒、 基质或珠。在一个实施方式中，所述基材包括磁响应性珠。所述小滴微驱动 器可包括磁体或电磁体，用于产生磁场以操控(例如固定化、释放、或移动) 所述磁响应性珠。例如，可使用磁场搅动磁响应性珠和将磁响应性珠固定化 于微驱动器以强化洗涤步骤(见8.6节)。
可使用多种技术将分子如DNA固定化于表面。实例包括那些用于将寡核 苷酸附着于微阵列表面的化学方法和用于固相合成技术的化学方法。
可将核酸样品硫醇化并吸附于金质基材。例如，可通过用硫取代磷酸二 酯部分非成桥性核苷酸间氧可将核酸硫醇化，如参见美国专利5,472,881， Beebe等，发明名称为＂Thiol Labeling of DNA for Attachment to Gold Surfaces＂， 通过引用将其全部内容并入本文。可将一或多个包括硫醇化的核酸的小滴在 所述小滴微驱动器上转移至金表面，在该处，硫醇化的核酸样品将沉积在所 述金表面。使包括硫醇化的DNA的小滴与所述金表面相接触，接触的时间足 以使硫与金之间形成共价键。可利用电驱动(Electroactuation)技术增加具有金 的小滴的表面积。
可使用水溶性生物素酯或使用生物素基亚磷酰胺试剂将DNA样品的5′- 端生物素化。生物素化的DNA可被包被链霉抗生物素的基材捕获。因此，可 转移包括生物素化的DNA样品的小滴使之接触链霉抗生物素表面，可由此捕 获并固定化所述DNA。
将单链DNA固定化于基材的化学方法已经被公开(S.Taira等， ＂Immobilization of single-stranded DNA by self-assembled polymer on gold substrate for a DNA chip，＂Biotechnol Bioeng.2005 Mar 30；89(7)：835-8)。在该 方法中，将硫辛酸(TA)共价附着于聚(盐酸烯丙胺)(PAH)的侧链，以便通过 自组装将聚合物固定化于金表面。N-羟基琥珀酰亚胺酯为末端的探针单链(ss) DNA可容易地固定化于TA-PAH-包被的金表面上。该表面可覆盖聚丙烯酸， 后者与TA-PAH形成离子复合物，以减少阳离子电荷。
如图4步骤3所示，以变性剂如NaOH溶液处理双链核酸以产生单链样 品。图中显示该步骤发生在固定化步骤之后；不过，可以理解，可在固定化 之前、过程中或之后，通过转移变性剂使之接触双链核酸样而实现变性。还 可通过加热样品将双链复合体热解链而进行变性。
本发明的一个方面是小滴微驱动器，其具有用于固定化核酸的基材。另 一个方面是小滴微驱动器，其包括用于固定化核酸的基材和用于将所述核酸 固定化于所述基材的试剂。再另一个方面是小滴微驱动器，其包括用于固定 化核酸的基材、和用于将所述核酸固定化于所述基材的试剂、和核酸样品。 这些试剂和样品例如可储存于所述小滴微驱动器上的池中和/或所述小滴微驱 动器外的池或容器中(例如筒中)。在池加载组件的一个实施方式中，试剂和/ 或样品池(例如，在小管或注射器中)可与小滴微驱动器池以流体连通方式连 接，以便来自小管的液体可流至或被直接推入所述小滴微驱动器池。本发明 的这一方面是可升级的，这样，池和池加载组件的数量可根据需要而增加， 根据需要为许多试剂提供槽口，以便进行所需的方案。试剂/样品池和试剂/ 样品的加载在8.8.4节和8.8.5.1节进一步讨论。
8.2.3 聚合酶促成的核苷酸掺入
如图4的步骤4和5所示，固定化的单链核苷酸样品被引发，产生双链 节段。可通过例如转移包含引物的小滴使之接触固定化的样品而实现引发。
在存在聚合酶的情况下，引发的样品与脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)反应。 该反应可通过转移一或多个包括脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)和聚合酶的小滴 使之与固定化的样品相接触而实现。如果dNTP与所述核酸样品单链部分中的 第一个碱基互补，聚合酶可催化将其掺入DNA链中。每一掺入事件均伴随焦 磷酸(PPi)释放，释放的量与掺入的核苷酸的量相符合。因此可通过测量释放 的PPi来确定掺入事件。dNTP的添加典型地为每次一个，各自在分开的缓冲 液中。随着按照预先选定或程序化的顺序获得各种核苷酸，核苷酸掺入沿着 每个固定化的模板依次进行。
可使用多种天然的和改良的聚合酶。改良的聚合酶包括，例如，具有添 加、插入或取代的天然序列，得到的聚合酶保持了促进核苷酸掺入到引发的 样品中的能力。聚合酶可以是外切酶缺陷型聚合酶。也可使用DNA聚合酶的 大片段或Klenow片段。
可选择dATP或ddATP类似物，所述类似物不干扰酶促PPi检测反应， 但却可以被聚合酶掺入到正在延长的DNA链中而不会干扰正常的碱基配对。 合适的类似物的实例包括脱氧或双脱氧ATP的[1-硫代]三磷酸酯(或α-硫代三 磷酸酯)类似物，如脱氧腺苷[1-硫代]三磷酸酯、或也称为脱氧腺苷α-硫代三 磷酸酯(dATPαS)。这些以及其他类似物可参见美国专利6,210,891，Nyren，等， 发明名称为＂Method of sequencing DNA＂，通过引用将其关于此类类似物的全 部内容并入本文。
可纳入单链结合蛋白，通过降低单链样品的折叠而延长可被测序的序列 长度。因此，例如，本发明包括小滴微驱动器，其包括包含单链结合蛋白的 小滴。所述小滴可以是包含单链结合蛋白的扩增即用型小滴。本发明包括在 包含单链结合蛋白的小滴上进行小滴操作的方法。
8.2.4 检测核苷酸掺入
确定特定碱基是否已经掺入靶位点包括定量掺入反应过程中释放的PPi。 聚合酶反应过程中每个dNTP添加到正在延长的核酸链中时，都会释放PPi。 这种情况下释放的PPi可用酶学方法检测，例如通过在萤光素酶-萤光素反应 中产生光(下文进一步讨论)。随着反应的持续，互补链得以组装，可通过信号 峰值确定核苷酸序列。该系统可产生程序，如图5所示。
8.2.4.1 将PPi转化为ATP
在一些情况中，可间接检测掺入事件中释放的PPi。例如，可在存在酶性 催化剂的条件下定量APS产生的ATP而实现PPi定量。存在腺苷5′磷硫酸酯 (APS)时，ATP硫酸化酶定量地将PPi转化为ATP。因此，在一个实施方式中， PPi可被转化为ATP，并可测定ATP的量以便确定反应过程中所掺入的dNTP 的量。
8.2.4.2 定量ATP
一旦PPi转化为ATP，即可定量ATP以测定dNTP的掺入。如图5所示， ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧合萤光素转化，后者产生可见光，产生 的量与ATP的量成比例。萤光素酶催化的反应产生的光可通过例如电荷偶联 装置(CCD)相机、光电二极管和/或光电倍增管(PMT)来检测。光信号与掺入的 核苷酸的数量成比例。检测到的信号可转换为与结果相对应的用户可视的系 统输出。
用萤光素-萤光素酶反应检测PPi的释放是已知的。例如，Nyren和Lundin (Anal.Biochem.，151，504-509，1985，通过引用将其全部内容并入本文)公开了 基于ATP硫酸化酶和萤光素酶的连续监测PPi释放的方法，该方法称为酶促 发光无机焦磷酸检测测定法(Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay，＂ELIDA＂)。使用ELIDA方法检测小滴微驱动器上的小滴中 的PPi是本发明的一个方面。可对该方法进行改良，例如使用更具热稳定性的 萤光素酶(Kaliyama等，1994，Biosci.Biotech.Biochem.，58，1170-1171，通过 引用将其全部内容并入本文)。用于PPi检测反应的合适的检测酶的实例是ATP 硫酸化酶和萤光素酶。
某些现有技术方法使用核苷酸降解酶，例如腺苷三磷酸双磷酸酶，来降 解未掺入的dNTP和过量的ATP。待降解完全后，再添加另一种dNTP。由于 反应在单一溶液中进行，因此随着测序的进行无用产物持续堆积。本发明的 一个重要方面在于其不需要核苷酸降解步骤。因此，尽管本发明的某些方面 可包括核苷酸降解步骤，但在其他方面，本发明的系统和方法特别省略了核 苷酸降解步骤。因此，例如，可在没有明显量的核苷酸降解酶的情况下实现 分析，如没有明显量的腺苷三磷酸双磷酸酶。
此外，本发明人认为，在没有明显的副产品堆积的情况下，进行掺入/转 化/检测反应使得结果更具有可预测性。因此，例如，如果样品中存在一段单 一核苷酸，随着该段单一核苷酸长度的增加，通常难以辨别掺入的具体数量。 本发明人认为，本发明的反应具有的清晰特性可使得更长的单一核苷酸段具 有更高的精确性和可重复性。因此，例如，本发明人认为，本发明的方法可 精确地检测具有6、7、8、910、11、12、13、14、15或更多核酸的单一核苷 酸段，准确度可达90、95、99或99.9％。
8.2.5 小滴操作方案
可以理解，除了上述方案以外，还可使用多种小滴操作方案进行本发明 的序列分析。因此，例如，可在一个反应中与dNTP掺入反应一起转化为ATP， 或所述反应可以逐步进行：(1)掺入dNTP以释放PPi，随后(2)将PPi转化为 ATP。如果掺入和转化步骤一起进行，系统可转移包括所需试剂(dNTP、聚合 酶、ATP硫酸化酶和APS)的单个小滴。因此，可将掺入dNTP至固定化的样 品、释放PPi、以及使PPi与APS反应产生ATP所需的所有试剂置于所述小 滴微驱动器上的池中，作为每种核苷酸的单一源试剂。各种核苷酸的源试剂 可连续地与固定化的样品相接触，使反应得以发生，在存在互补dNTP的情况 下产生ATP。
如果掺入和转化步骤分开进行。引物、聚合酶、dNTP、硫酸化酶、和APS 可自分开的来源作为分开的试剂小滴来提供，所述试剂小滴合并在一起来进 行本发明的反应。或者，可自单一来源以焦磷酸测序试剂小滴的形式提供部 分或所有这些试剂，焦磷酸测序试剂小滴与固定化的样品相接触，以进行本 发明的反应。例如，可使包括dNTP和聚合酶的小滴与固定化的样品相接触， 如果互补则碱基可掺入，由此释放PPi。然后将可能包括PPi的小滴自固定化 的样品处移开，并与包括ATP硫酸化酶和APS的小滴合并，以产生ATP。或 者，包括ATP硫酸化酶和APS的小滴可在存在固定化样品的情况下与可能包 括PPi的小滴合并，以产生ATP。
此外，虽然图4显示的是引发步骤4和掺入/转化步骤5是依次发生的， 但可以理解，它们可被分开的更远或者它们可被并入单一一个步骤。换言之， 各种特定的试剂可在适当的时间被添加到一或多个小滴内的反应中，或者可 以在单个小滴中或一系列小滴中提供多种试剂的任何组合。因此，在一个实 施方式中，所述小滴微驱动器转移一或多个小滴使之与单链样品相接触，其 中，一或多个小滴一起包括一起或在分开的小滴中以任何组合和任何次序提 供的如下试剂(或它们的功能等价物)：引物、聚合酶和dNTP，其结果是引物 与样品杂交形成双链部分，聚合酶催化任何互补的dNTP掺入到与所述双链部 分邻近的第一单链碱基位置的靶位点，从而释放PPi。
在另一个实施方式中，所述小滴微驱动器转移一或多个小滴使之接触单 链样品，且所述一或多个小滴一起包括以任何组合和任何次序提供的如下试 剂(或它们的功能等价物)：引物、聚合酶、dNTP、硫酸化酶和APS，其结果 是引物与样品杂交形成双链部分，聚合酶催化任何互补的dNTP掺入到与所述 双链部分邻近的第一单链碱基位置的靶位点，从而释放PPi，且ATP硫酸化 酶在存在APS的情况下将任何PPi转化为ATP。通过定量所释放的PPi而确 定碱基的掺入。
可通过小滴微驱动技术将可能包含ATP的小滴与包含试剂例如萤光素酶 和萤光素的小滴汇合，以便检测任何ATP。类似地，可通过小滴微驱动技术 将包括萤光素并可能包含ATP的小滴与包括萤光素酶的小滴汇合用于检测任 何ATP。此外，可通过小滴微驱动技术将包括萤光素酶并可能包含ATP的小 滴与包括萤光素的小滴回合用于检测任何ATP。
可在存在或没有固定化样品的情况下汇合用于检测反应的小滴。例如， 萤光素酶/萤光素小滴可与可能包括ATP的小滴在存在固定化样品的情况下汇 合。或者，可能包括ATP的小滴可与待与萤光素酶/萤光素小滴汇合的固定化 样品分开。在任何一种情况中，可在传感器附近汇合包括产生光信号的试剂 的小滴，以便使检测到的光量最大化。
如果将可能包括ATP的小滴从待与萤光素酶小滴汇合的固定化样品移 开，该转移步骤可包括温育步骤，以最大化地产生ATP用于在荧光反应中进 行检测。换言之，该温育可在转移过程中进行，或者小滴可暂时储存，以备 荧光反应之前进行温育。所述小滴微驱动器可包括用于此目的的温育区。该 温育区可包括或不包括用于控制区内温度的加热元件。该温育区可包括或不 包括分隔该区与所述小滴微驱动器的其余部分的壁。该温育区可包括电极阵 列以有助于将小滴转移至该区内外。该区是可升级的，并可包括电极，用于 在该温育区内转移和储存数十、数百或者更多的小滴。
在实施本发明时，可将一或多种检测试剂排除在聚合酶反应步骤之外， 这样在聚合酶反应过程中将不发出任何信号。例如，在一个实施方式中，聚 合酶步骤的反应混合物中不添加检测酶。相反，将用于进行聚合酶步骤的小 滴从固定化样品处移开，然后在传感器的范围内与包括检测酶的小滴汇合， 用于检测来自任何所发生的反应的信号。
用于聚合酶反应的反应混合物因此可包括至少一种dNTP、聚合酶、APS、 和ATP硫酸化酶，并任选地包括萤光素，同时缺少任何明显量的萤光素酶。 这样一来，dNTP掺入反应可与检测反应分开。因此可在存在传感器的情况下 进行检测反应，如图5所示，以便使检测信号最大化。例如，如果检测信号 包括光，可在用于检测由任何所得光产生反应发出的光的传感器范围内进行 检测反应。
此外，检测反应和随后的掺入反应可平行进行，由此加快测序速度。类 似地，可在分开的小滴中平行地进行掺入反应、温育先前掺入反应的输出物、 以及对先前温育的输出物进行检测，由此加快测序速度。
与现有技术的某些方法不同的是，本发明的所述小滴微驱动器方法避免 了物质转移效应。试剂可直接与各样品相接触，不需要多样品之间的试剂流。 如果使用磁响应性珠，可用磁场将它们保持在原位和/或将它们在小滴中从一 处转移至另一处。试剂可从试剂源直接转移至样品而无需接触其他样品，且 不会潜在引起交叉污染。因小滴被填充流体隔离，可避免副产物的弥散。也 可避免使用可能干扰光检测的装填珠(例如稳定珠)的孔。可在各次施加核苷酸 之间使用含有腺苷三磷酸双磷酸酶的洗液，但在本发明的实践中这并不是必 须的，而且在一些实施方式中，要特别避免这样做。
在施加各组新试剂到固定化样品之间，可以对其进行洗涤，例如用缓冲 液洗涤。各种洗涤方案可参见8.6节。
8.2.6 应用
本发明的核酸扩增和测序方法、装置和系统具有广泛的用途，例如用于 科研、医学和兽医学诊断、药物基因组学、基因组测序、基因表达谱、检测 序列变异、法医学、以及环境测试。由于本发明的所述小滴微驱动器所带来 的便携性，在此提到的各种用途中如需要测序，测序工作可以在样品收集现 场进行。
在一个实施方式中，本发明提供流感测试分析。在该实施方式中，系统 可接收作为输入物的生物学样品，处理样品以制备用于扩增的靶流感病毒核 酸，使用本发明的方案进行扩增，并检测是否存在流感核酸。生物学样品可 以，例如，收集自鼻咽拭子。
在另一个实施方式中，本发明提供呼吸道感染分析。在该实施方式中， 系统可接收作为输入物的生物学样品，处理样品以制备用于扩增的来自常见 呼吸道病原体例如细菌、病毒和/或真菌的核酸，使用本发明的方案进行扩增， 并检测是否存在靶呼吸道病原体核酸。在所述呼吸道感染分析的一个延伸形 式中，所述分析可包括测试非典型感染，例如那些累及免疫功能低下患者的 感染。生物学样品可以，例如，来自鼻咽拭子。适合使用本发明的呼吸道感 染分析进行检测的呼吸道病原体的实例包括：肺炎链球菌(S.pneumoniae)、流 感杆菌(H.influenzae)、军团菌、衣原体、支原体；病毒例如流感病毒、RSV、 冠状病毒、副流感病毒、腺病毒、变性肺病毒、博卡病毒(bocavirus)、汉坦病 毒；和真菌例如肺囊虫、曲霉菌、隐球菌。
对于长核酸的测序，如全基因组，可将样品断裂为相互重叠的较小的片 段(例如100-1000bp、200-900bp或300-800bp)，例如通过限制性酶的消化。 这些较小的片段可使用本发明的系统和方法来分析。结果经组合并编辑可重 建较长的序列，这例如通过鉴定并匹配被测序片段的重叠部分而实现。这以 平行的方式分析这些片段，以便加快测序。每一模板可测序多次以最佳准确 性。这样一来，整个染色体甚至整个基因组可被精确测序。
可通过提取自细胞或组织的mRNA确定在特定组织中转录的基因。使用 逆转录酶可将mRNA拷贝为DNA(cDNA)。得到的cDNAs可被克隆，来自 cDNA文库的克隆末端经本发明的方法测序可产生EST，后者提供了自其提取 mRNA的组织的表达谱。RNA谱在一些情况中可与疾病状态相关，并可被测 序用作诊断工具。也可测序RNA病毒。
一旦获得感兴趣的区域的参比序列(例如被认为参与疾病的基因)，即可通 过对已知序列的一小部分进行选择性重新测序来鉴定不同个体或密切相关的 物种之间存在的序列变异。变异可以是，例如，SNP；大小的差异(插入/缺失)； 拷贝数差异(重复)和重组(倒位、易位)。
可以测序例如来自水、土壤和/或大气样品的生物体的群体。例如，目前 微生物学的绝大部分知识仍来自导致疾病的个别物种，或容易作为单纯培养 物生长在实验室条件下且因此易于研究的个别物种。可以通过测序来研究此 类生物体的群体、成员、功能和关系。因此可自不能通过常规技术培养的生 物体获得序列和基因多样性的定量分析。
本发明的系统和方法可用于提供基因组特异性的诊断和治疗。例如，系 统可用于鉴定与或多或少有利的治疗结果有关联的基因型特征。结果可用于 指导治疗决策。类似地，本发明的系统和方法可用于鉴定感染性生物体或具 有遗传学损伤或改变的细胞内的突变，例如癌症和其他肿瘤性疾病，而这种 信息可用于指导或确认治疗决策。感染性生物体可以包括，例如，病毒、细 菌、寄生虫或真菌。本发明提供，例如，用于快速廉价检测抗药性细菌或病 毒(例如新的抗药性HIV毒株)的系统和方法，这是对付这些致病生物体的至 关重要的组分。
本发明的系统和方法可用于遗传学测试，例如鉴定对象体内的在特定疾 病中起作用的DNA节段或可用于预测特定疾病的DNA节段。例如，如果家 族中一种形式的标记物在具有某疾病的人中远多于那些没有该疾病的血亲， 即可证明存在连锁。此类方法在Huntington病、囊性纤维化、乳腺癌以及其 他疾病中被证实是成功的。因此，例如，本发明的系统和方法可用于鉴定基 因中那些仅存在于(基因剂量足以引起疾病)患病者或倾向于发生该疾病者中 的突变。在另一个实施方式中，本发明的系统和方法用于在以下情况中鉴定 遗传学变异：(1)统计学表明很可能某序列存在于患病个体中，且(2)统计学表 明很可能该序列不存在于不患该病的个体中。类似地，本发明的系统和方法 用于鉴定遗传学变异的情况是：统计学表明具有阳性测试结果的人很可能得 某病，而具有阴性测试结果的人不会得该病。此外，本发明的系统和方法可 用于测序DNA节段以鉴定一或多种SNP。
本发明的系统和方法可用于临床试验。例如，可测序来自参与试验者的 核酸，病可将不良事件与试验组内的遗传学变异进行比较，以鉴定对发生一 或多种不良事件具有高易感性的参与者亚组。根据所研究的具体不良事件的 严重程度，具有相关遗传学变异的对象，例如，可以得到更密切的观察、接 受进一步的保护性治疗、和/或完全退出试验。类似地，可以比较治疗效果和 试验组中的遗传学变异，以鉴定更可能得到阳性治疗结果的参与者亚组。可 基于阳性结果和/或缺乏不当的不良事件而界定靶群体。可相应地对产品进行 标注。医生可测试其患者是否具有相关的遗传学变异，并仅给对其而言治疗 是药物学可接受的群体亚组开具产品处方。
本发明也可用于法医学鉴定，例如：鉴定可能的嫌疑人，其DNA可与留 在犯罪现场的证据相匹配；使被误认有罪者证明无罪；鉴定犯罪受害者与灾 难受害者；确立亲子关系和其他家庭关系；辅助野生动物官员鉴定濒危物种 和受保护物种；检测可污染空气、水、土壤和食品的细菌和其他生物体；在 移植计划中进行供者器官与受者的配型；确定家畜品种或家系；和辨别消费 品例如鱼子酱和葡萄酒的真伪；鉴定基因工程改造的食品。
其他应用实例包括：在药物研发过程中测定遗传学变异与对象结果之间 的关联，例如疗效、不良反应谱、药代动力学、和/或药效动力学；分析对象 的基因特征谱以根据基因型变异区分有效的药物治疗；筛查疾病易感性，使 得对象可采用措施以监测、治疗、避免或减轻遗传性疾病的严重程度；筛查 如何降低患者群体中的不良药物反应数量；对于在遗传性可鉴定的群体亚组 中是不安全的药物，筛查如何能够使用该药；和监测基因治疗。
8.3 基于亲和力的测定
本发明提供方法、装置和系统，其用于进行基于小滴的、基于亲和力的 测定，例如基于亲和力的测定。这些测定法包括其中利用小滴操作将对分析 物具有结合亲和力的化合物与所述分析物或可能包括所述分析物的样品相接 触任何测定法。例如，可在小滴中提供所述对分析物具有结合亲和力的化合 物，并转移之使之接触分析物，所述分析物存在于小滴微驱动器上的另一个 小滴中或被固定化于小滴微驱动器的表面上。作为另一个实例，对所述分析 物具有结合亲和力的化合物本身可固定化于小滴微驱动器的表面上和/或固定 化于包括在小滴微驱动器上的珠的表面上，并可将包括分析物或可能包括所 述分析物的小滴与所述固定化的抗体相接触。
可以理解，本发明涵盖多种可能的基于亲和力的测定方案。基于亲和力 的测定形式的实例包括基于亲和力的直接测定、基于亲和力的间接测定、以 及基于亲和力的竞争性测定。这些测定法可用于检测是否存在靶分析物，且 在一些情况中，还可用于定量存在于样品中的所述靶分析物。在竞争性测定 中，将包括样品抗体和标记的抗体的小滴与表面相接触。所述样品抗体与标 记的抗体竞争结合吸附于所述表面上的抗原。该方法的一种变化包括通过中 间连接物将抗原连接于所述表面。例如，所述连接物可以是抗体。捕获桥连 测定使用包括样品抗体的小滴将吸附于所述表面上的抗原与溶液中的抗原相 连接。另一种方法涉及使用生物素化的抗原和包被了链霉抗生物素的固相。 另一种方法涉及使所述样品抗体与固定化于所述固相上的抗原相结合。可以 使用同种型特异性标记的第二抗体检测发生结合的抗体。可采用本发明的小 滴方案洗去过量的抗体。
可以理解，本发明的一个重要方面涉及能够使用每种所需的基于亲和力 的测定试剂和/或样品在小滴微驱动器上进行小滴操作。例如，本发明包括：
(1)小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包含在此所述的用于进行基 于亲和力的测定的任何一或多种试剂和/或样品；
(2)本发明的装置或系统，其包含所述小滴微驱动器；
(3)在所述小滴微驱动器或系统上进行小滴操作的方法或利用所述小滴 微驱动器或系统操作小滴的方法；和/或
(4)利用所述小滴微驱动器或系统进行基于小滴的基于亲和力的测定的 方法。
例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱 动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更 多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇 合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小 滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小 滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。本发 明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易见的。
8.3.1 样品和样品制备
本发明提供基于小滴的基于亲和力的测定，其可用于检测多种分析物。 例如，任何可以特异性结合于亲和力分子(例如抗体)的分析物均适合使用本发 明的系统的进行检测。可分析单个样品中的一或多种靶分析物。分析物可以 是，例如，生物学分析物或合成分析物。实例包括如下类别的分析物：人类 来源的分析物、动物来源的分析物、植物来源的分析物、细菌来源的分析物、 病毒来源的分析物、和孢子来源的分析物。分析物可以包括，例如，蛋白质、 肽、小分子、以及各种生物学分子、例如碳水化合物、脂质等等。在一个实 施方式中，样品先接触固定化的抗体(例如固定化于珠上的抗体)，然后将所述 固定化的抗体引入到所述小滴微驱动器上。
图6显示的是一种适合用于进行免疫测定的示例性小滴微驱动器600。该 实施方式可包括两种基材，第一基材601a和第二基材601b，它们以基本上平 行的方式相隔，提供了一个居间空间。可在所述居间空间内提供多个液体端 口或池，例如洗涤缓冲液池602、样品池604、初级抗体池606、次级抗体池 608、和固定化的抗体(例如固定化于珠上的抗体)池610。还可提供废液区612， 以及磁体614，其放置方式允许磁体的磁场与位于所述居间空间内的磁响应性 组分之间相互作用。在这种具体的实施方式中，转移电极616在所述第一基 材上提供。
8.3.2 基于亲和力的三明治测定
在一个实施方式中，本发明提供在小滴微驱动器上进行的、基于小滴的 基于亲和力的三明治测定。可以理解，本发明涵盖多种用于进行基于亲和力 的三明治测定的方案。以下的基于小滴的方案以图7的图示为基础，其仅仅 是一个实例，其无意于限制本发明的范围：
(1)将对靶分析物具有特异性的抗体(初级抗体)固定化于表面；
(2)洗涤所述固定化的抗体，如使用基于小滴的洗涤方案，以移除过量的 抗体；
(3)用小滴操作将所述固定化的抗体暴露于可能包括所述靶分析物的样 品小滴，所述靶分析物对所述固定化的抗体具有结合亲和力；
(4)洗涤所述固定化的抗体-靶分析物复合物，如使用基于小滴的洗涤方 案，以移除所述样品小滴的未结合组分；
(5)将所述固定化的抗体(现在可能包括与之结合的所述靶分析物)暴露于 包括报告(次级)抗体的小滴；
(6)洗去过量的报告抗体，如使用基于小滴的洗涤方案；
(7)任选地，进行额外的步骤以产提供可测量的参数或信号；
(8)测定所述可测量的参数或信号；和
(9)提供代表所述信号的输出。
可采用小滴操作在本申请所描述的小滴微驱动器上进行任何一或多个前 述的步骤。
8.3.2.1 固定化抗体
将初级抗体固定化于表面。该表面可以是，例如，所述小滴微驱动器的 表面、或珠的表面，例如磁响应性珠、非磁响应性珠、或颗粒，例如纳米颗 粒。
可在所述小滴微驱动器上使用基于小滴的方案将抗体固定化于表面。例 如，可将用于将抗体固定化于表面的试剂引入所述小滴微驱动器，将其分散 为离散小滴并转移使之接触所述表面以便沉积。如果所述表面是一或多个珠 的表面，可将所述珠引入所述小滴微驱动器，分散为缓冲液小滴，转移至所 述小滴微驱动器上，并与一或多个包括试剂的小滴汇合，所述试剂用于将所 述小滴固定化于所述珠的表面上。
或者，抗体可在所述小滴微驱动器之外固定化。例如，抗体可先固定化 于珠上，然后引入到所述小滴微驱动器。有多种商品化的蛋白质(例如链霉抗 生物素)包被的和抗体包被的珠。在另一个实施方式中，抗体可固定化于所述 小滴微驱动器的表面上，如在生产所述小滴微驱动器的过程中进行。
此外，可处理表面以便固定化抗体。例如，所提供的表面可包括对抗体 具有亲和力的部分或与抗体连接的结合部分。抗体，其任选地包括结合部分， 可与表面相接触，由此将抗体固定化于表面。例如，可将预先包被了链霉抗 生物素的珠引入所述小滴微驱动器。以包括所述包被了链霉抗生物素的珠的 小滴进行小滴操作，并用小滴操作使此类含有珠的小滴接触一或多个包括生 物素化抗体的小滴，由此将抗体连接于珠。作为另一个实例，所述小滴微驱 动器可在小滴微驱动路径上包括包被了链霉抗生物素的表面，这样便可用小 滴操作使包括生物素化的抗体的小滴接触包被了链霉抗生物素的表面，并由 此将抗体固定化于所述表面。在另一个实例中，可选择性地将捕获抗体固定 化于所述小滴微驱动器的表面，如通过将表面图案画以便能够固定化抗体， 或通过将光活性物质直接连接于抗体或链霉抗生物素，然后通过使用直写式 光刻系统(direct-write light system)或使用光遮蔽物或其他选择性暴露光的装 置选择性固定化所述抗体。
已知多种技术可将抗体结合于表面。例如，可用G蛋白活化表面，使得 抗体分子能够通过其Fc结构域与之结合，而留下可变区用来捕获靶。通过活 化的抗体与1，3-二氨基丙烷偶联的聚苯乙烯醛基/硫酸酯乳胶 (1，3-diaminopropane coupled，polystyrene aldehyde/sulfate latex)的反应可将抗体 共价结合于乳胶表面。通过温育抗体和缀合缓冲液(30mM Na2CO3，70mM NaHCO3，pH 9.5)，可用抗体包被无表面活性物质的硫酸酯白聚苯乙烯乳胶珠 (Surfactant-free sulfate white polystyrene latex bead)。生物素酰化的抗体可被捕 获到包被了链霉抗生物素的基材上。抗体可共价结合于所述小滴微驱动器的 修饰的表面，如硅烷或硫醇化层。抗体可共价结合于所述小滴微驱动器的修 饰的表面(例如在组装过程中或利用小滴操作将抗体沉积于表面上)，例如以硅 烷修饰的表面或硫醇化表面。
8.3.2.2 靶分析物结合于固定化的抗体
将样品小滴与所述固定化的抗体相接触以允许样品中存在的任何靶分析 物结合于所述固定化的抗体。可利用小滴操作转移样品小滴使之与其上附着 所述抗体的表面相接触而实现该步骤，所述表面例如为包括包被了抗体的珠 的小滴或其上固定化了所述抗体的所述小滴微驱动器的表面。在一个可供选 择的实施方式中，表面是珠的表面，而珠先与样品接触，然后被引入所述小 滴微驱动器。可以先洗涤珠，然后将其引入所述小滴微驱动器。抗体结合来 自所述样品小滴的分析物。通过提高物质转移速度可加快结合过程。加快物 质转移的几个实例包括高速转移小滴以便能够充分混合具有抗体的珠和靶分 析物或给固定化抗体的表面补充靶分析物。其他手段包括通过电操控小滴原 位搅动温育的小滴或通过多种外部装置例如压电启动方法。如果没有任何物 质转移，手段，结合事件靠扩散而发生，这将需要更长的时间，因此会延长测 定时间。在某些实施方式中，可在所述小滴微驱动器上对所述固定化的抗体(例 如所述珠或表面)实施洗涤方案，如参见8.6节，以移除过量的样品或其他物 质。
8.3.2.3 报告抗体结合于靶分析物
洗涤(例如所述珠或表面)后，包含对分析物上的不同表位具有亲和力的报 告抗体的小滴可接触洗涤过的可能含有被捕获的分析物的固定化抗体。标记 的抗体缀合物包括连接于报告分子(例如放射性分子)的抗体、能够催化可检测 反应的酶(例如颜色改变、化学发光、荧光、化学发光、或电化学)、化学发光 分子、或荧光分子。根据所使用的报告分子，可随后对包括分析物和报告抗 体的所述固定化的抗体(例如珠或其他表面)实施洗涤方案，如参见8.6节，以 移除过量的报告抗体。
8.3.2.4 产生并检测可测量的参数
通过检测由所述报告抗体促成的信号可对结合的报告抗体定量。例如， 信号可以是放射性、颜色改变、化学发光、荧光、化学发光、拉曼光谱、光 散射方法、颗粒/珠聚集、表面等离子体共振、拉曼光谱效应等等。检测可以 是直接或间接的，可通过检测结合于分析物的抗体的量或通过检测未结合的 抗体的量进行。
对需要进一步反应以产生信号的方法，如将非荧光产物转化为荧光产物， 可使包括所需额外反应物的小滴接触抗体-抗原-抗体复合物，以促进所述进一 步的反应。
已经允许报告抗体结合分析物之后，可采用洗涤方案洗去过量的报告抗 体，并利用小滴操作使包括所需报告反应物的小滴接触所述固定化的抗体。 在一个实施方式中，所述报告抗体标记了能够催化产生可测量的参数的反应 的酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP))。例如，HRP可催化过 氧化氢产生电化学信号，其可通过测量电流或电压而检测。可通过由HRP催 化的以Amplex Red和过氧化氢为底物的荧光反应来检测结合的抗体。另一个 实例使用碱性磷酸酶介导的NBT向紫色甲(formazan)的转化，其可在小滴 中通过比色方法检测。在另一个方法中，化学发光底物例如鲁米诺或来自 Lumigen的Ps-atto可被HRP催化产生化学发光信号。其他合适的检测方法的 实例在其他部分讨论(例如见8.3.5节)。
在一个实施方式中，在存在传感器的情况下在所述小滴微驱动器上的小 滴中进行检测步骤，以便增强或最大化捕获来自反应的信号。在另一个实施 方式中，离开传感器进行反应，并用小滴操作将小滴转移至传感器处来检测。
8.3.2.5 可供选择的三明治测定方法
可以理解，多种可供选择的方法是可行的。例如，不一定需要按照上述 次序进行所述的步骤，如可在将分析物暴露于所述固定化的抗体之前或者同 时将报告抗体结合于分析物。在另一个方法中，捕获抗体、分析物、和报告 抗体的结合均可同时进行，然后将它们提供到捕获位点并随后洗涤。在一些 方法中，例如表面增强型共振拉曼散射，可不需要洗涤。
8.3.3 基于亲和力的竞争性测定
在一个实施方式中，本发明提供在小滴微驱动器上进行的基于亲和力的 竞争性测定。用于基于亲和力的竞争性测定的分析物典型地是那些因太小而 不能按照三明治测定的需要结合两种抗体的分析物。可以理解，本发明涵盖 多种可进行基于亲和力的竞争性测定的方案。下面给出的基于小滴的方案以 图8的图示为基础，其仅仅用于说明的目的，而无意于限制本发明的范围：
(1)将对靶分析物具有特异性的抗体固定化于表面；
(2)洗涤所述固定化的抗体，如使用基于小滴的洗涤方案，以移除过量的 抗体；
(3)提供可能包括靶分析物并包括报告分析物的样品小滴；
(4)将所述固定化的抗体暴露于合并的靶分析物/报告分析物小滴，以便 所述报告分析物与任何靶分析物竞争结合位点；
(5)洗涤基材以移除未结合的分析物和报告分析物；
(6)任选地，进行额外的步骤以产生可测量的参数或信号；和
(7)定量结合的报告分析物，其中所述报告分析物的量与所述靶分析物的 量成反比。
可在本申请所描述的小滴微驱动器上使用小滴操控技术进行任何一或多 个前述的步骤。各步骤在后续章节进一步详细讨论。
8.3.3.1 固定化抗体
可按照8.4.1.1节所述固定化抗体。
8.3.3.2 竞争性结合
将包括可能包括靶分析物的样品的小滴与包括所述报告分析物的小滴合 并，使合并的小滴接触所述固定化的抗体。或者，可在加载所述小滴微驱动 器的过程中进行靶与报告分子的混合。
所述报告分析物可通过多种缀合方法的任一种将报告核酸结合于分析物 而制备。在一个实施方式中，分析物部分被分子修饰，例如生物素，这样产 生了次级捕获位点，用于固定化链霉抗生物素传感器DNA复合物。生物素与 分析物的结合不得不当干扰其与捕获抗体的结合。在一些情况中，生物素化 的材料可与来自测试样品的分析物同等地竞争。生物素化的分析物与报告分 子的结合可在生物素化的分析物被所述固定化的抗体捕获之前或之后发生。
例如，在一个实施方式中，通过将具有已知量的生物素化的分析物的小 滴与可能含有未知量的未修饰分析物的样品小滴混合而进行测定。将包括生 物素化的分析物的小滴与可能包括靶分析物的小滴合并。合并的小滴与所述 固定化的抗体接触，以便生物素化的分析物与靶分析物(如果存在的话)竞争结 合所述固定化的抗体。所结合的生物素化的分析物的量与测试小滴内的分析 物的量成反比。所述固定化的抗体(如所述珠或表面)随后可进行洗涤方案，如 参见8.6节，以移除过量的报告分析物。
8.3.3.3 检测所述报告分析物
洗涤后，具有链霉抗生物素-生物素-报告分子复合物的小滴被添加到包括 洗涤的珠的小滴，或者与包括所述固定化的抗体的表面相接触。链霉抗生物 素-生物素-报告分子复合物结合任何被所述珠上的所述抗体捕获的生物素化 的分析物。
8.3.3.4 可供选择的竞争性测定方法
在此所述的基于亲和力的竞争性测定仅仅是适合在本发明的所述小滴微 驱动器上实施的小滴微驱动器方案的一个实例。本发明涵盖多种可能的可供 选择的形式。例如，所述步骤不限于所给出的次序。可通过将包括游离抗体 的小滴与一或多个包括靶分析物/报告分析物的小滴合并，从而在抗体固定化 之前先将抗体结合于靶分析物/报告分析物，随后将抗体与所述表面接触用于 固定化。所述报告分析物与报告核酸可通过将包括这两种试剂的小滴在所述 小滴微驱动器上合并而得以缀合。包括所述报告分析物的小滴可与包括报告 核酸的小滴合并，以便在所述报告分析物暴露于捕获抗体之前或之后实现缀 合。
在另一个实施方式中，通过将含有已知量的酶标记的分析物的小滴与含 有靶分析物的样品小滴混合，然后进一步与含有抗体的小滴混合，进行竞争 性测定。竞争的是标记的分析物和靶分析物之间的结合位点。酶标记的分析 物与抗体结合后酶的活性降低，可通过多种不同类型的转换事件(例如吸附) 对此进行监测，以便定量样品中靶分析物的浓度。例如，含有标记有葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶(G6P-DH)万古霉素的小滴可与含有未标记的万古霉素的样品小滴 混合，然后进一步与含有与万古霉素具有反应性的抗体、葡萄糖-6-磷酸和烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的小滴混合。结合抗体后G6P-DH的活性降低。 G6P-DH将NAD+转化为NADH，导致以分光光度法在340nm处测定的吸光 度值发生改变。在所述小滴微驱动器内进行校准之后，即可通过储存的校准 曲线和样品测定中得到的吸光度值确定各未知样品中万古霉素的浓度。可采 用相同的方法检测的其他分析物包括丙戊酸、妥布霉素、庆大霉素和咖啡因。
8.3.4 其他基于亲和力的测定方案
在此所述的基于亲和力的竞争性测定仅仅是适合在本发明的所述小滴微 驱动器上实施的小滴微驱动器方案的一个实例。本发明涵盖多种可能的可供 选择的形式。例如，本发明的所述小滴微驱动器系统能够使得对单个样品同 时进行多个基于亲和力的测定或对多个样品进行单一的基于亲和力的测定或 其组合。此外，基于亲和力的测定可与其他测试一起进行，例如PCR和/或免 疫-PCR。
根据本说明书的教导，可使用基于小滴的方案实施多种类型的测定。实 例包括免疫沉淀测定；免疫放射测定；异质性酶标记的基于亲和力的测定， 其中定量抗体的结合和未结合成分需要物理分离这两种成分；均质性(非分离) 酶标记的基于亲和力的测定，其不需要物理分离这两种成分，因为可功能性 地区分未结合的和结合的抗体。对于免疫沉淀测定，包括用于进行免疫沉淀 测定的试剂的小滴在小滴微驱动器上合并以进行免疫沉淀测定。可使用光散 射检测器检测免疫沉淀。
尽管到现在为止所讨论的绝大多数方法均涉及抗体或分析物的固定化， 但固定化并非是所有本发明的基于小滴的免疫测定所必需的。例如，本发明 包括均质性基于小滴的酶多重免疫测定，其中标记的抗体包括与初级抗体结 合后被灭活的酶。酶活性大致与分析物浓度成比例。该方法大体上包括在小 滴微驱动器上合并用于进行基于小滴的酶多重免疫测定的小滴并测定所得酶 活性。
在另一个方法中，抗原/抗体复合物的光散射特性在结合事件后发生改变， 且可通过检测所述小滴微驱动器上的反应小滴中的光散射改变(例如通过浊度 测定)来监测这种改变，以鉴定和/或定量捕获事件。例如，可利用小滴操作将 所述小滴微驱动器上的含有免疫球蛋白(例如IgA、IgG、和IgM(经样品制备 包括稀释和加入聚合物之后))或脂蛋白(例如ApoAl、ApoB(经样品制备包括 稀释和加入聚合物或表面活性物质之后))的生理学样品小滴与含有相应抗体 的小滴合并，发生结合事件后，引起合并的小滴的浊度发生改变，这种改变 可通过分光光度法来监测。可通过这种技术进行测定的其他分析物的几个实 例包括：α1-抗胰蛋白酶(AAT)、转铁蛋白、前白蛋白、触珠蛋白、补体C3 和补体C4。
适合用于本发明的另一类免疫测定包括凝集测定，其可以小滴形式进行。 含有分析物的小滴与含有结合了捕获抗体或抗原的颗粒(例如乳胶颗粒)的小 滴混合。如果样品中存在靶分析物，乳胶颗粒即开始凝集在一起，并可通过 测定吸光度而定量。
本系统提供多通路的基于亲和力的测定。在一个实施方式中，系统能够 使用免疫测定来检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50或更多种分析物。在一些高通量分析中，系统提供96、384、1536、或更 多数量分析物的多通路检测，其可以系列方式进行或平行方式进行。分析物 可以包括，例如，天然或非天然来源的分析物。在另一个实施方式中，本发 明能够实施基于亲和力的测定方案来检测来自于以下类别的任何2、3、4、或 5种类别的一或多种分析物：细菌来源的分析物、病毒来源的分析物、真菌来 源的分析物、蛋白质毒素分析物、和小分子毒素分析物。
系统可以被程序化为按需重复测定以增加单个靶结果的可信度。重要的 是，所述小滴微驱动器系统可以被程序化为对阳性结果进行确认性再测定以 降低假阳性的可能性。系统还可以被程序化并构造为允许在所述小滴微驱动 器上储存测试的样品用于后续的额外实验室测试。
本发明的异构重要的优势在于所述小滴微驱动器能够快速准确地生成校 准曲线。所述小滴微驱动器可准确且可重复地分配具有已知浓度的对照分析 物的溶液小滴，并能够通过将此类小滴与缓冲液小滴合并而加以稀释，以提 供一系列具有不同浓度对照分析物的对照小滴。这些对照小滴可进行与样品 小滴同样的方案以产生校准曲线。校准曲线可用于确定样品小滴中分析物的 量。
8.3.5 用于基于亲和力的测定的其他测定方法
多种检测方法可用于本发明的基于小滴的基于亲和力的测定。选定的方 法能够在基于小滴的基于亲和力的测定中直接或间接地产生信号。可通过放 置在与小滴相接触或与其非常接近的传感器检测到所述信号。适合用于基于 亲和力的测定的信号的实例包括以下物质产生的信号：放射性同位素标记物、 荧光标记物、发光标记物、电致发光标记物、微粒、纳米颗粒、酶反应、凝 集化合物、拉曼活性染料、电活性标记物、以及影响传导性的标记物。合适 的放射性同位素标记物的实例包括：57Co、3H、35P、35S和125I。在一个实施 方式中，放射性同位素标记物用于小滴微驱动器上的闪烁迫近分析法 (scintillation proximity assay，SPA)。SPA能够检测结合事件而无需洗涤步骤。 放射性标记物可以，例如，被掺入到竞争性测定的竞争性分析物中，或掺入 到三明治测定的次级抗体中。释放α或弱β粒子的放射性标记物是优选的。 SPA在荧光团附近进行，所述荧光团在暴露于放射性标记物后发射光。例如， 荧光团可提供在珠中、所述小滴微驱动器的结合了抗原或初级抗体表面、或 连接了抗原或初级抗体的纳米颗粒中。合适的发光标记物的实例包括吖啶酯、 罗丹明、二恶二酮、吖啶、phenanthridiniums和各种异氨基苯二酰肼衍生物。 合适的荧光标记物的实例包括荧光素和Eu3+。合适的酶标记物的实例包括那 些自合适的底物产生可见的、有颜色的、荧光的和/或发光的产物的酶标记物。 例如，合适的酶可包括青霉素酶、辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶、尿素酶、 脱氨酶和碱性磷酸酶。合适的纳米颗粒的实例包括金属纳米颗粒。有关适合 用于本发明的基于亲和力的测定的检测方法的进一步信息见8.11节。
8.3.6 样品大小和测定速度
使用数字微流体平台可极大程度减小设备的体积和费用，主要是在于使 所有液体处理功能最小化。在一些实施方式中，测定使用的样品和试剂少于 目前方法所用的百分之几或千分之几，但却具有相同的敏感性和特异性。在 一个实施方式中，所述系统典型地使用小滴体积为1μL或更少、或100纳升 或更少的样品进行基于亲和力的测定。
其他优势包括，由于测定所用的微型格式具有更快的动力学以及多通路 具有更高的通量，可减少获得结果所用的时间。例如，在一个实施方式中， 所述系统实施基于亲和力的测定方案可在少于约60、50、40、30、20、15、 10、5或2分钟的时间内检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50或更多种的分析物。
8.3.7 基于小滴的基于亲和力的测定的应用
如上所述，本发明的基于亲和力的测定可用于检测多种分子。任何以亲 和力结合于亲和力分子(例如抗体)的分子均是合适的分析物。分析物可以包 括，例如，生物分子或合成的分子。生物可包括，例如，来自植物、动物、 微生物和病毒的分子。合成的分子可包括，例如，工业副产品、污染物、和 药物。分析物可包括毒素或代表存在生物体的分析物，如感染性疾病，或用 于生物恐怖主义或生物战的毒素。此类生物体的实例包括炭疽、禽流感、肉 毒中毒、汉坦病毒、军团菌病、肺鼠疫、天花、土拉菌病和出血热病毒(VHF)。 其他实例包括与抗癌症疫苗的免疫原性监测相关的分析物、慢性感染性疾病 (例如HIV、疟疾、丙型肝炎、念珠菌病)、免疫学(例如过敏、自身免疫)、内 分泌学(甲状腺、非甲状腺)、药物测试(例如药物滥用、治疗性药物)和检测生 物恐怖主义因子(例如炭疽、天花)。
在一个实施方式中，免疫测定技术用于测试样品是否存在生物体，例如 细菌或病毒。在一些实施方式中，系统可实现极为敏感的检测，甚至可检测 到单个细胞。此外，一些实施方式可包括PCR细菌分型或变异。
本发明的基于亲和力的测定还可用于检测化学性、生物性或爆炸性危险 品。例如，针对爆炸物的抗体可用于检测样品中存在的痕量爆炸物。因此， 本发明还提供用于筛查一个地区中的代表存在生物性、化学性或爆炸性武器 的化学分析物或生物性分析物的方法。
在一个实施方式中，本发明能够检测单个小滴中的多种分析物。根据本 发明，实现这一目的的一种方式涉及对所述小滴微驱动器上在空间上分隔开 的位置处的不同分析物使用不同的抗体。例如，所述小滴微驱动器可包括多 个表面，每一表面包含一特定的抗体。可操控单个样品小滴使之同时接触这 些抗体，或者当所述小滴被转移通过抗体区域时依次接触这些抗体。本发明 的基于亲和力的测定方案可用于检测是否存在结合于任何一种所述各种区域 内的抗体的分析物。类似地，可以使用不同的标记物同时检测同一空间区域 内的不同分析物，由此在单个小滴内检测多种分析物。在另一个实施方式中， 所述小滴微驱动器包括空间上被分隔开的珠，每一种珠或每一组珠具有一种 或一组独特的抗体。可利用小滴操作来操控样品小滴和/或含有珠的小滴以便 样品小滴与每一所述的珠或每组所述的珠相接触。
8.4 免疫PCR
本发明提供基于小滴的免疫PCR(pick)，其用于选择性检测仅以痕量水平 存在的分析物。这一发明组合了使用基于小滴的平台上的检测抗体的各种基 于亲和力的测定手段并使用核酸链作为标记物。采用扩增技术扩增这种核酸 链(例如见8.1节)。
可以理解，本发明的一个重要方面涉及能够使用各种所需的iPCR试剂和 /或小滴微驱动器上的样品进行小滴操作。例如，本发明包括：
(1)小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包含在此所述的用于进行 iPCR方案的任何一或多种试剂和/或样品；
(2)本发明的装置或系统，其包含所述小滴微驱动器；
(3)在所述小滴微驱动器或系统上进行小滴操作的方法或利用所述小滴 微驱动器或系统操作小滴的方法；和/或
(4)利用所述小滴微驱动器或系统进行基于小滴的基于亲和力的测定的 方法。
例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱 动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更 多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇 合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小 滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小 滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。本发 明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易见的。
8.4.1 三明治iPCR
在一个实施方式中，本发明提供在小滴微驱动器上进行的基于小滴的三 明治iPCR。总体上，所述三明治iPCR包括：
(1)将对靶分析物具有特异性的抗体固定化于表面；
(2)洗涤所述固定化的抗体，如使用基于小滴的洗涤方案；
(3)将所述固定化的抗体暴露于可能包括所述靶分析物的样品小滴；
(4)洗涤所述固定化的抗体，如使用基于小滴的洗涤方案；
(5)将所述固定化的抗体(现在可能包括与之结合的所述靶分析物)暴露 于包括缀合于核酸分子的第二抗体的洗涤；
(6)洗涤所述固定化的抗体，如使用基于小滴的洗涤方案；
(7)扩增所述核酸并检测所述扩增(例如果有的话)以便确定捕获靶分析物 的存在并对其进行定量。
可在本申请所描述的小滴微驱动器上使用小滴操控技术进行任何一或多 个前述的步骤。各步骤在后续章节进一步详细讨论。
8.4.1.1 固定化抗体
将初级抗体固定化于表面。所述表面可以是，例如，所述小滴微驱动器 的表面、或珠的表面，例如磁响应性珠。可在所述小滴微驱动器上使用基于 小滴的方案实现将抗体固定化于表面。例如，可将用于将抗体固定化于表面 的试剂引入所述小滴微驱动器，将其分散为离散小滴并转移使之接触所述表 面以便沉积。如果所述表面是一或多个珠的表面，可将所述珠引入所述小滴 微驱动器，作为小滴分配于缓冲液中，转移，并与一或多个包括试剂的小滴 汇合，所述试剂用于将所述小滴固定化于所述珠的表面上。
已知多种技术可将抗体结合于表面。例如，可用G蛋白活化表面，使得 抗体分子能够通过其Fc结构域与之结合，而留下可变区用来捕获靶。通过活 化的抗体与1，3-二氨基丙烷偶联的聚苯乙烯醛基/硫酸酯乳胶的反应可将抗体 共价结合于乳胶表面。通过温育抗体和缀合缓冲液(30mM Na2CO3，70mM NaHCO3，pH 9.5)，可用抗体包被无表面活性物质的硫酸酯白聚苯乙烯乳胶珠。 生物素酰化的抗体可被捕获到包被了链霉抗生物素的基材上。也可进行光指 导的固定化，例如参见本说明书在其他部分的描述。
8.4.1.2 靶分析物结合于固定化的抗体
将样品小滴与所述固定化的抗体相接触以允许样品中存在的任何靶分析 物结合于所述固定化的抗体。可通过转移样品小滴使之与其上固定化了所述 抗体的所述小滴微驱动器的表面相接触而实现该步骤。在另一个实施方式中， 可通过将样品小滴与包括其上固定化了所述抗体的珠的小滴相接触而实现该 步骤。所述抗体结合于来自所述样品小滴的分析物。可对所述固定化的抗体(例 如所述珠或表面)实施洗涤方案，如参见8.6节。
8.4.1.3 抗体-NA结合于靶分析物
洗涤(例如所述珠或表面)后，可使包括对分析物上的不同表位具有亲和力 的抗体-NA缀合物的小滴接触洗涤过的可能含有被捕获的分析物的固定化抗 体。抗体-NA缀合物包括连接于所述抗体的核酸分子。所述核酸分子用作用 于扩增的核酸模板。可对所述固定化的抗体(例如所述珠或表面)实施洗涤方 案，如参见8.6节。
8.4.1.4 扩增核酸
扩增核酸，例如参见8.1节。测定产生的扩增产物的量，如采用实时荧光 检测，电化学和/或电化学发光检测。产生的PCR产物的量与结合的抗体-DNA 的量相关，后者反过来取决于所述样品小滴中存在的分析物的量。
8.4.1.5 可供选择的方法
在一个可供选择的实施方式中，通常将这些步骤的次序颠倒过来以进行 核酸扩增，随后是基于亲和力的测定，后者产生光学信号或电信号。在这种 顺序中，可进行免疫测定来监测核酸扩增。
8.4.2 竞争性iPCR
在一个实施方式中，本发明提供在小滴微驱动器上进行的竞争性iPCR。 竞争性iPCR所检测的分析物典型地是那些因太小而不能按照三明治测定的 需要结合两种抗体的分析物。总体上，竞争性iPCR包括：
(1)将对靶分析物具有特异性的抗体固定化于表面；
(2)将可能包括靶分析物的样品小滴与包括报告分析物的小滴合并；
(3)将所述固定化的抗体暴露于合并的靶分析物/报告分析物小滴，以便 所述报告分析物与任何靶分析物竞争结合位点；
(4)洗涤基材以移除未结合的分析物；
(5)将结合的报告分析物连接于报告核酸；和
(6)扩增报告核酸并监测扩增的进程以确定未结合的报告分析物的量，而 结合的报告分析物的量与样品中的靶分析物的量成反比。
可在本申请所描述的小滴微驱动器上使用小滴操控技术进行任何一或多 个前述的步骤。各步骤在后续章节进一步详细讨论。
8.4.2.1 固定化抗体
可按照8.4.1.1节所述固定化抗体。
8.4.2.2 竞争性结合
将包括可能包括靶分析物的样品的小滴与包括所述报告分析物的小滴合 并，并使合并的小滴接触所述固定化的抗体。
所述报告分析物可通过多种缀合方法的任一种将报告核酸结合于分析物 而制备。在一个实施方式中，分析物部分被分子修饰，例如生物素，这样产 生了次级捕获位点，用于固定化链霉抗生物素-DNA复合物。生物素与分析物 的结合不得不当干扰其与初级捕获抗体的结合。在一些情况中，生物素化的 材料可与来自样品的分析物同等地竞争。生物素化的分析物与报告核酸的结 合可在生物素化的分析物被所述固定化的抗体捕获之前或之后发生。
例如，在一个实施方式中，通过将具有已知量的生物素化的分析物的小 滴与可能含有未知量的未修饰分析物的样品小滴混合而进行测定。将包括生 物素化的分析物的小滴与可能包括靶分析物的小滴合并。合并的小滴与所述 固定化的抗体接触，以便生物素化的分析物与靶分析物(如果存在的话)竞争结 合所述固定化的抗体。所结合的生物素化的分析物的量与所述样品小滴内的 分析物的量成反比。
8.4.2.3 结合核酸报告分子
洗涤后，具有链霉抗生物素-生物素-报告核酸复合物的小滴被添加到包括 洗涤的珠的小滴或表面。链霉抗生物素-生物素-报告核酸复合物结合任何被所 述珠上的所述抗体捕获的生物素化的分析物。
8.4.2.4 扩增核酸
洗涤后，通过扩增所述报告核酸来确定固定化的链霉抗生物素-生物素- 报告核酸复合物的量。扩增信号与最初样品中分析物的量成反比。可如8.1节 所述进行扩增。测量所产生的扩增产物的存在和量，如采用实时荧光检测法 进行。被置换的报告分析物的量与样品中的靶分析物的量成比例。
8.4.2.5 可供选择的方法
所述步骤不限于所给出的次序。例如，可通过将包括游离抗体的小滴与 一或多个包括靶分析物/报告分析物的小滴合并，从而在抗体固定化之前先将 抗体结合于靶分析物/报告分析物，随后将抗体与所述表面接触用于固定化。 所述报告分析物与报告核酸可通过将包括这两种试剂的小滴在所述小滴微驱 动器上合并而得以缀合。包括所述报告分析物的小滴可与包括报告核酸的小 滴合并，以便在所述报告分析物暴露于捕获抗体之前或之后实现缀合。本发 明涵盖多种可能的可供选择的形式。
8.4.3 样品和样品制备
可使用本发明的基于小滴的iPCR的方案检测多种分析物。可分析单个样 品中的一或多种靶分析物。分析物可以是，例如，生物学分析物或合成分析 物。例如，在一个实施方式中，分析物选自以下类别：细菌来源的分析物、 病毒来源的分析物、孢子来源的分析物、蛋白质毒素分析物、和小分子毒素 分析物。在一个实施方式中，靶分析物包括毒素或代表存在特殊生物体的分 析物，如感染性疾病，或用于生物恐怖主义或生物战的毒素。此类生物体的 实例包括炭疽、禽流感、肉毒中毒、汉坦病毒、军团菌病、肺鼠疫、天花、 土拉菌病和出血热病毒(VHF)。
8.4.4 免疫PCR方案
本发明的系统能够使得在单个样品上同时进行多种免疫PCR测定。此外， 免疫PCR测定可与其他测试一起进行，例如PCR和/或基于亲和力的测定。
系统提供多通路检测。在一个实施方式中，系统能够检测2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多种分析物。分析物可以包括， 例如，天然或非天然来源的分析物。在另一个实施方式中，本发明能够检测 来自于以下类别的任何1、3、4、或5种类别的一或多种分析物：细菌来源的 分析物、病毒来源的分析物、孢子来源的分析物、蛋白质毒素分析物、和小 分子毒素分析物。
系统可以被程序化为按需实施额外的测定以增加单个靶结果的可信度。 重要的是，所述小滴微驱动器系统可以被程序化为对阳性结果进行确认性再 测定以降低假阳性的可能性。系统还可以被程序化并构造为允许在所述小滴 微驱动器上储存测试的样品用于后续的额外实验室测试。
在操作中，本发明以极快的速度进行分析并提供结果。例如，在一个实 施方式中，系统能够在少于约60、50、40、30、20、15或10分钟的时间内 检测2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多种分析 物。在另一个实施方式中，系统能够检测来自于以下类别的任何2、3、4、或 5种类别的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更 多种分析物：细菌来源的分析物、病毒来源的分析物、孢子来源的分析物、 蛋白质毒素分析物、和小分子毒素分析物，且全部测试在少于约60、50、40、 30、20、15或10分钟的时间内完成。
8.4.5 应用
本发明提供的iPCR测定可用于检测以极少量存在的多种多样分子。例 如，该系统可用于监视化学性、生物性或爆炸性危险品。例如，针对爆炸物 的抗体可用于检测样品中存在的痕量爆炸物。因此，本发明还提供用于筛查 一个地区中的代表存在生物性、化学性或爆炸性武器的化学分析物或生物性 分析物的方法。
在一个实施方式中，iPCR技术用于测试样品是否存在生物体，例如细菌 或病毒。在一些实施方式中，系统甚至可实现单个生物体检测。此外，一些 实施方式可包括PCR细菌分型或变异。
8.5 分析生物学液体
本发明提供方法、装置和系统，其用于分析血液、各种血液成分以及其 他生物学液体。图9和17所示为生物学液体分析仪的示例性设计。
图9显示了生物学液体分析仪900的一个实施方式。在该实施方式中， 可提供各种用于进行生物学液体分析的模块，例如，检测代谢物(例如葡萄糖、 乳酸、血尿素氮、和肌酐)、电解质(例如K+、Cl-、和Na+)、蛋白质、和酶。 这些不同的模块可包括电流模块902、电位模块904、光学模块906、和电导 模块908。
图17所示为生物学液体分析仪1700的另一个实施方式。在该实施方式 中，可提供多个液体端口或池，例如抗体池1701(例如为细菌抗体、孢子抗体、 细菌AB-DNA、孢子AB-DNA、蛋白质毒素抗体、小分子抗体、蛋白质 AB-DNA、和小分子SB-A DNA)、PCR引物池1702、和PCR试剂池1703。 还可提供样品端口1704，以及样品池1705、洗涤溶液区1706、和废液池1707。 可提供的其他区域包括热温度区1708、冷温度区1709、和检测仪区1710。
可以理解，本发明的一个重要方面包括能够在小滴微驱动器上使用各种 所需的生物学液体分析样品和试剂进行小滴操作。例如，本发明包括：
(1)小滴微驱动器，其上包含小滴，所述小滴包含在此所述的用于进行此 类生物学液体分析的任何一或多种试剂和/或样品；
(2)本发明的装置或系统，其包含所述小滴微驱动器；
(3)在所述小滴微驱动器或系统上进行小滴操作的方法或利用所述小滴 微驱动器或系统操作小滴的方法；和/或
(4)利用所述小滴微驱动器或系统进行基于小滴的基于亲和力的测定的 方法。
例如，所述小滴操作可包括以下一或多种操作：将小滴加载至小滴微驱 动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分为两个或更 多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更多个小滴汇 合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴变形；使小 滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置小滴；将小 滴转移出微驱动器；在此所述的其他小滴操作；和/或上述的任何组合。本发 明的各种其他方法、装置、系统和其他方面通过下文的描述将是显而易见的。
8.5.1 样品和样品制备
可用于本发明的所述小滴微驱动器的合适的样品实例包括全血、血清、 和血浆、及其各种组分。可使用静脉、动脉、或毛细血管血液。可使用本发 明进行分析的其他样品实例包括脑脊液(CSF)、尿液、唾液、汗液、泪液、羊 水、胸水、乳汁、囊液、滑膜液、粪便、和精液。
可在所述小滴微驱动器上和/或在引入所述小滴微驱动器之前，从全血提 取血清和/或血浆。图10给出了用于此目的的加载结构1000的实例。在该实 施方式中，液体自池1002流经密闭装置1004进入加样室1006，在该处其与 膜1008相接触。渗透物进入渗透物流动通道1010，通过该处，在压力源1014 通过通道1016施加的压力的辅助下流入小滴微驱动器池1012。
该装置体积小，与常规测试方法所需的体积相比，这显著降低了样品体 积，而样品体积在许多情况中均是一个重要因素。例如，在一个实施方式中， 典型的样品体积为约1nL至约100mL、或约10nL至约10mL、或约1μL至 约10μL。
8.5.2 分析物
本发明提供多用途小滴微驱动器系统，其能够在单个亚微升小滴的血液 或约～0.5μL的任何生理学样品上进行阵列测试。合适的测试物的实例包括代 谢物(例如葡萄糖、肌酐、乳酸、血尿素氮)、电解质/元素(例如K+、Na+、Cl-、 P、Mg、Li、Ca、Fe)、气体(例如pH、pCO2、NH3)、酶(碱性磷酸酶(ALP)、 天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、脂 肪酶、肌酸激酶、肌酸激酶MB)、蛋白质(白蛋白、C-反应蛋白(CRP)、尿微 量白蛋白、尿白蛋白、脑脊液蛋白、血清总蛋白)、和红细胞压积。其他分析 物包括糖化血红蛋白(AIc)、血红蛋白、尿酸、甘油三酯、胆固醇、高密度脂 蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。
8.5.2.1 代谢物
本发明可用于进行基于电化学或光检测的多种酶偶联测定法，例如用于 测定葡萄糖、血尿素氮、肌酐、和乳酸。在一些实施方式中，在所述小滴微 驱动器上进行的酶偶联测定中，通过对H2O2进行电流检测而测量葡萄糖、乳 酸、和肌酐。
在一些实施方式中，本发明包括电化学模块，其具有用于对代谢物(例如 葡萄糖、乳酸、血尿素氮、肌酐)进行电流和/或电位检测的电极。
8.5.2.2 电解质
为了定量样品中的各种离子(例如氨、溴、镉、钙、氯、铜、氰化物、氟、 氟硼酸根、碘、铅、硝酸根、高氯酸根、钾、银/硫化物、镁、铁、锂、磷、 钠、表面活性物质、硫氰酸根)，例如处理的生物学样品，可改进所述小滴微 驱动器使之包括离子选择性电极(ISE)。可转移样品小滴使之接触用于检测所 需离子的ISE。此外，检测之前，可使标准物小滴接触ISE，用于进行校准。 在一些实施方式中，本发明包括电化学模块，其具有用于对电解质(例如K+； Cl-；Na+)进行电流、电位、和/或电导检测的电极。
ISE可被纳入用于检测电解质的所述小滴微驱动器。例如，ISE可作为顶 部和/或底部基材的组分和/或暴露于顶部和/或底部基材之间的空间的组分或 与单个基材小滴微驱动器相关联。它们可与转移电极整合。ISE通常被设置为 能够利用小滴操作来使得所述小滴微驱动器上的小滴与ISE相接触。可使用 多种技术制备所述小滴微驱动器上的离子选择性电极。实例包括丝网印刷术、 以及照相平版印刷术、蚀刻、和剥离技术。
作为具体的非限制性实例，可丝网印刷Ag/AgCl以提供具有KCl盐桥的 工作电极和参比电极。用于制造离子选择性膜的PVC中的合适的离子载体包 括用于Na+的甲基莫能星(methyl monensin)、用于K+的缬氨霉素、用于Cl- 的季铵氯化物、和、用于pH的三月桂胺。可通过微量分配和/或喷涂 (spray-coating)(例如，热/超声波印刷)制备离子选择性膜。
可检测生物学样品中的电解质。具体的非限制性实例包括全血、血浆和 血清、以及本说明书其他部分提到的实例。
8.5.2.3 气体
为了定量存在的气体(例如pCO2，pO2)或pH，可使用各种专门的电极。作 为非限制性实例，可将二氧化碳微探针整合入本发明的小滴微驱动器用于检 测和/或定量二氧化碳。所述微探针可设置为使得能够进行小滴操作以便使得 所述小滴微驱动器上的小滴接触所述微探针。此外，为了校准的目的，检测 前，可利用小滴操作使得标准小滴接触二氧化碳微探针。相应的方法适合用 于检测氧和/或确定pH。在一些实施方式中，所述小滴微驱动器可包括用于对 血气(例如pCO2、pO2、pH)进行电流、电位、和/或电导检测的电极。
作为具体的非限制性实例，可将由金-氢醌电极制得的pH电极浸入由 NaHCO3、NaCl、和蔗糖结合物制得的内部固体电解质而制备Severinghaus型 CO2传感器。其上可沉积气体可通透性聚二甲基硅氧烷膜。可将数字式调整电 子设备(例如高输入阻抗放大器)连接于电位电极。
可在所述小滴微驱动器上的任何小滴内检测气体。具体的非限制性实例 包括那些包括全血、血浆、和/或血清、以及本说明书其他部分提到的生物学 样品的小滴。
8.5.2.4 酶
在一些实施方式中，本发明包括化学发光测定，其用于检测酶，例如肝 脏的酶。使用一系列基于小滴的多个酶促步骤，ALT和AST的测定可简化为 产生过氧化氢的最终步骤，后者可通过吸光度、发光、荧光、或电化学方法 定量测定。
8.5.2.5 血清蛋白
可使用比色测定来检测样品中的总蛋白。合适的比色方法的实例包括： 缩二脲方法、Lowry方法、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)测定法、和 Bradford测定法。缩二脲法通常包括使样品小滴接触包含二价铜离子的小滴。 二价铜离子与蛋白质形成有颜色的复合物。Lowry反应方法基于通过与Folin 试剂小滴合并而放大缩二脲反应。Lowry测定法的一种变化形式使用二辛可 宁酸(BCA)小滴以便检测由二价铜离子在碱性条件下与小滴中的蛋白质反应 而产生的一价铜离子。Bradford测定法包括将样品与包含考马斯兰染料的小滴 合并以形成有颜色的复合物。在各种情况中，可使用例如图21A所示的LED/ 光电二极管装置来监测吸光度。可使用在此所述的技术在任何样品小滴中检 测总蛋白，包括使用基于荧光和/或化学发光的光学感测方法以及使用在此所 述的基于亲和力的测定技术。可用于确定总蛋白的样品的具体的非限制性实 例包括生物学样品，例如全血、血浆和血清，以及本说明书其他部分提到的 样品。
8.5.2.6 红细胞压积
可使用多种技术定量样品小滴中的红细胞。例如，可通过测量805nm处 的吸光度而计算出血红蛋白含量。可通过测量650nm处的吸光度而计算出氧 合血红蛋白。通过比较样品的吸光度测定值与一系列已知标准物的吸光度测 定值而得出结果。
在一些实施方式中，本发明包括电化学模块，其具有用于对红细胞压积 进行电流、电位、和/或电导检测的电极。所述小滴微驱动器可包括电导元件， 其具有用于对红细胞压积进行AC电导测量的一对电极。对于双基材小滴微驱 动器，电极可置于一个或两个基材上。电极可被设置为使得能够进行小滴操 作以便使所述小滴微驱动器上的小滴接触所述电极。
8.5.3 多分析物分析仪
合适的分析物的实例是葡萄糖、肌酐、乳酸、BUN、K+、Na+、Cl-、pH、 pCO2、ALP、总蛋白、和红细胞压积。在一个实施方式中，在单个小滴微驱 动器上分析2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多种分析物。优选地， 这些分析物选自葡萄糖、肌酐、乳酸、BUN、K+、Na+、Cl-、pH、pCO2、ALP、 总蛋白、和红细胞压积。在一个实施方式中，在单个小滴微驱动器上分析葡 萄糖、肌酐、乳酸、BUN、K+、Na+、CI-、pH、pCO2、ALP、总蛋白、和红 细胞压积。气体合适的分析物的实例包括钙、胆红素、白蛋白、凝血时间、 ALT、和AST。
在一些实施方式中，在本发明的小滴微驱动器系统上平行处理2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12或更多种分析物的测定，即对该分析物的一或多 个处理和/或检测步骤与对另一种分析物的一或多个处理和/或检测步骤同时 在单个小滴微驱动器上实现。小滴微驱动器系统可实施2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12或更多项比色测定，以平行检测相同的或不同的分析物类型。 所述小滴微驱动器系统可实施2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多 项化学发光测定，以平行检测相同的或不同的分析物类型。所述小滴微驱动 器可实施2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多项电流测定，以平行 检测相同的或不同的分析物类型。所述小滴微驱动器可实施2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12或更多项电位测定，以平行检测相同的或不同的分析物 类型。所述小滴微驱动器可实施2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更 多项荧光测定，以平行检测相同的或不同的分析物类型。所述小滴微驱动器 可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多项电导测定，以平行检 测相同的或不同的分析物类型。所述小滴微驱动器将包括小滴或池，所述小 滴或池包括用于实施每种所述方案的试剂。所述小滴微驱动器装置和/或系统 将包括用于实施所述方案的检测步骤所需的检测组分。
此外，所述小滴微驱动器可包括平行处理的2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12或更多种分析物，且所述系统可对这些分析物实施1、2、3、4、 5、6或更多种测定方案。所述小滴微驱动器可包括平行处理的2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12或更多种分析物，且可对这些分析物实施1、2、3、 4、5、6或更多种测定方案，其中所述测定选自比色测定、化学发光测定、荧 光测定、电流测定、电位测定和电导测定。所述小滴微驱动器将包括小滴或 池，所述小滴或池包括用于实施每种所述方案的试剂。所述小滴微驱动器装 置和/或系统将包括用于实施所述方案的检测步骤所需的检测组分。
此外，用于核酸扩增、核酸测序、基于亲和力的测定、细胞处理、珠处 理和洗涤、以及分析物检测方案的各种方案也可整合到单个小滴微驱动器系 统中。在一个实施方式中，单个小滴微驱动器包括用于进行核酸扩增和核酸 测序的试剂和检测组分。在另一个实施方式中，单个小滴微驱动器包括用于 进行核酸扩增以检测血液传播的病原体的试剂和检测组分，以及用于进行一 或多种其他测定的试剂和检测组分，所述其他测定来自在此所述的那些测定 类型和/或分析物类型。在另一个实施方式中，小滴微驱动器包括用于操控细 胞的组分以及用于进行基于亲和力的测定的组分和试剂。
简言之，本发明使得小滴微驱动器系统不仅能够以更高的通量和显著更 低的样品体积进行中心实验室化学分析仪的常规操作，而且通过在同一平台 整合血液学、病理学、分子诊断学、细胞学、微生物学和血清学还提供了更 好的功能性。
在一个实施方式中，本发明提供小滴操控模块，其整合了用于分析血气、 电解质、酶、蛋白质、和代谢物的光学检测模块和电化学检测模块。
本发明的一个实施方式使用模块设计以分隔独立优化的制造过程。例如， 可在一个基材上制造所有的电化学组分，在另一个基材上制造所有的微流体 电极，而在再另一个基材上制造所有电子装置。可在电化学模块和小滴操控 模块之间形成一次性三明治小滴微驱动器，其可以偶联于用于数据获取和分 析的可重复使用的电子模块。可在分析仪中构建光学检测模块。
8.5.4 生物学液体分析检测
在此所述的生物学液体分析可使用多种检测方法，如参见8.1、8.2、8.3、 8.4、8.5、和8.11节。
8.6 表面和表面洗涤方案
本发明的各种方案需要固定化试剂的表面。例如，可使用表面来捕获或 固定化小滴的靶组分，例如细胞、其他珠、微粒、纳米颗粒、抗体、蛋白质、 肽、核酸、小分子和/或其他化学组分。用于此类目的的表面可包括，例如， 珠、微粒、纳米颗粒、膜、物理物体、和/或小滴微驱动器表面的表面。各种 方案需要洗涤步骤，其中自一或多个表面移除未结合的物质。
通过小滴操作使包括一或多种用于捕获的靶组分的样品小滴接触对此类 靶具有亲和力的表面。可使用本发明的洗涤方案自所述表面移除所述样品小 滴的未结合组分。例如，可通过小滴方案使一或多个包括一或多种靶组分的 小滴接触一或多个表面，使得一或多种靶组分固定化于或捕获于所述一或多 个表面。实施洗涤方案自所述一或多个表面移除未结合物质。类似地，可通 过小滴方案使一或多个包括一或多种靶组分的小滴接触一或多个珠，使得一 或多种靶组分固定化于或捕获于所述一或多个珠。实施洗涤方案自所述一或 多个珠移除未结合物质。
洗涤通常包括使一或多个洗涤小滴接触固定化的表面。洗涤可包括在接 触表面时搅动小滴。洗涤小滴可包括，例如，水、去离子水、盐溶液、酸性 溶液、碱性溶液、去垢剂溶液和/或缓冲液。
本发明的洗涤方案导致未结合物质自所述表面被高效移除。在一个实施 方式中，本发明提供一种方法，其提供与表面相接触的小滴，所述小滴具有 降低的物质浓度。该方法通常包括提供与小滴接触的表面，小滴包含起始浓 度的所述物质并具有起始体积；进行一或多次小滴操作以便将洗涤小滴与所 述小滴汇合以产生合并的小滴；和进行一或多次小滴操作以便将所述合并的 小滴拆分为一组小滴，所述一组小滴包括：(i)与所述表面相接触的小滴，相 对于所述起始浓度，其具有降低的物质浓度和降低的物质的量；和(ii)与所述 表面分离的小滴。
本发明的方法可产生与所述表面相接触的小滴，相对于起始浓度，其具 有降低的物质的量或明显降低的物质的量。在一些实施方式中，所得小滴的 体积与所述起始体积大致相同。在一些实施方式中，可重复洗涤步骤直至所 得小滴达到或超过一或多种组分的预定最大量。所述预定量可代表相对于所 述起始浓度的充分降低。在一些情况中，所得小滴可基本上没有所述组分。 例如，在一些实施方式中，所述量的降低以摩尔计超过99％、99.9％、99.99％、 99.999％、99.9999％、99.99999％、99.999999％。
本发明的方法可产生与所述表面相接触的小滴，相对于起始浓度，其具 有降低的物质的浓度或明显降低的物质的浓度。在一些实施方式中，所得小 滴的体积与所述起始体积大致相同。在一些实施方式中，可重复洗涤步骤直 至所得小滴达到或超过一或多种组分的预定最大浓度。所述预定浓度界限可 代表相对于所述起始浓度的充分降低。在一些情况中，所得小滴可基本上没 有所述组分。例如，在一些实施方式中，所述浓度的降低以摩尔计超过99％、 99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％、99.99999％、99.999999％。
8.6.1 洗涤珠
对于使用珠的方案，可利用小滴操作使具有珠的小滴与一或多个洗涤小 滴合并。然后，在(例如通过物理方法或磁方法)保留珠的同时，可利用小滴操 作将所述汇合的小滴拆分为两个或更多个小滴：一或多个具有珠的小滴和一 或多个没有明显量的珠的小滴。在一个实施方式中，利用小滴操作将所述汇 合的小滴拆分为一个具有珠的小滴和一个没有明显量的珠的小滴。
通常，每次执行洗涤方案导致足够的珠被保留用于进行所需的测定而不 会对测定结果造成不当的损害作用。在某些实施方式中，每次拆分所述汇合 的小滴导致保留90％、95％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、99.9999％、 99.99999％、或99.999999％以上的珠。在其他实施方式中，为了使所移除物 质的浓度和/或量达到预定的降低而执行的每次洗涤方案导致保留99％、 99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99％、99.9％、 99.99％、99.999％、99.9999％、99.99999％、或99.999999％以上的珠。在其他 实施方式中，计算出保留的珠的量并相应地调整结果。
在一些实施方式中，可在池中洗涤珠，其中将含有珠的小滴与洗涤小滴 合并，保留珠(例如通过磁体、物理结构、静电力)，并利用小滴操作将缺乏珠 的小滴自所述池中分配出。例如，可通过稀释和分配策略来洗涤珠，其中将 洗涤缓冲液加入到池中来稀释内容，使用磁体将磁响应性珠定位于所述池中， 而将绝大部分溶液自所述池中分配出，且重复该循环直至达到可接受的洗涤 水平。
8.6.1.1 洗涤磁响应性珠
图11所示的非限制性实例涉及利用磁场固定化磁响应性珠。可通过降低 或消除磁场而释放固定化的磁响应性珠。洗涤磁响应性珠通常可包括以下步 骤：
(1)利用小滴操作将包含磁响应性珠1102和未结合物质1103的小滴1101 置于磁体1104附近；
(2)利用小滴操作将洗涤小滴1106与包含所述磁响应性珠1102的小滴 1101合并；
(3)通过施加磁场将珠1102固定化；
(4)利用小滴操作移除包围所述珠的部分或全部所述小滴以产生包含所 述珠的具有降低浓度的未结合靶物质的小滴1108和包含未结合靶物质的小滴 1110；
(5)通过移除磁场释放所述珠1102；
(6)重复步骤(2)至(3)或(2)至(4)直至达到预定程度的纯化。
以这种方式，未结合物质，例如污染物、副产品或过量试剂，可与珠分 离。每个循环产生包括珠且具有水平降低的无用物质的小滴。步骤(5)并非每 个循环均需要；不过，其可用于通过释放可被捕捉到固定化的珠中的污染物 而增强洗涤。可按照不同次序进行所述步骤，如步骤(2)和(3)可以颠倒。可以 利用在此所述的小滴操作在小滴微驱动器上进行洗涤方案的步骤。
图12所示为另一个实施方式，其可包含顶板1201、底板1202、电极1203、 和磁体1204。该实施方式通常可包括：
(1)利用小滴操作将弹丸1205与包含磁响应性珠1207和未结合物质1208 的小滴1206在磁体1204附近合并；
(2、3)珠1207固定化后，利用小滴操作转移所得的合并的弹丸1210穿 过所述珠1207以便将未结合物质1208自所述珠1207分离；
(4)利用小滴操作分出所述合并的弹丸1210的一部分以产生包含具有浓 度降低的未结合靶物质的珠的部分1212以及包含未结合靶物质的部分1214；
(5)按需重复步骤(1)-(4)以便未结合物质达到所需的降低。
在一个相关的方法中，可通过在所述弹丸被转移穿过所述固定化的珠时 添加额外的洗涤小滴和/或弹丸而持续补充所述弹丸。该方法可持续进行直至 未结合物质达到所需的降低。
图13所示为一个可供选择的实施方式，其还可包括顶板1301、底板1302、 电极1303、和磁体1304。在该实施方式中，移动磁体1304，例如沿着A1方 向，以便将珠1305与合并弹丸1307的中的未结合物质1306分开，而不是移 动弹丸1307。类似的方法涉及既移动磁体也移动弹丸以实现分离(未显示)。 再另一个方法涉及使用多个磁体来移动珠(未显示)。
在使用磁响应性珠的实施方式中，本发明人发现，施加磁场虽然可以暂 时固定化珠、移动珠和/或定位珠，但有时导致所述珠发生有害的聚集。在一 个实施方式中，纳入表面活性物质来预防或减少珠聚集。适合用于此目的的 表面活性物质的实例包括： Triton X-100。所选的表 面活性物质及其用量应该可减少或消除珠聚集并使非特异性吸附最小化，而 同时不导致靶分析物或试剂自小滴中明显丢失。
另一个消除或减少珠的团聚的方法涉及使用较少数量的较大的珠。可使 用任何数量的在一或多次小滴操作中可被置入小滴中的珠。在一些实施方式 中，磁响应性珠的数量可在1至几十万的范围。例如，在一个实施方式中， 本发明使用1至100个磁响应性珠/小滴。例如，本发明使用1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10...100个磁响应性珠/小滴。在一个实施方式中，磁响应性珠 的数量为1至10个。使用较少数量的磁响应性珠允许使用更大的珠。例如， 在一个实施方式中，本发明使用1至100个磁响应性珠/小滴，其中所述珠的 平均直径为约25至约100微米。在另一个实施方式至，本发明使用1至10 个磁响应性珠/小滴，其中所述珠的平均直径为约50至约100微米。
8.6.1.2 洗涤非磁响应性珠
一个类似的方法可使用不具有磁响应性或不具有明显磁响应性的珠。如 图14所示，不同于使用磁场来固定化珠1401，可使用物理障碍物1402来移 除包围珠1401的部分或全部所述小滴1403。物理障碍物1402可包括，例如， 膜、筛、和/或来自所述小滴微驱动器(例如来自顶板1404和/或底板1405)的 突出部分。如果使用附着于顶板1404和/或底板1405的物理障碍物1402(突 出物或物体)，其应该被设置为可允许使用一或多个电极1406进行转移，但可 防止珠1401跟着转移，例如使用给小滴转移留出足够空间的来自顶板的突出 物和/或具有一或多个开口的突出物，所述开口允许小滴转移通过该开口同时 防止珠跟着转移。
8.6.2 洗涤小滴微驱动器表面
图15所示为洗涤小滴微驱动器表面的方法的实例。在这一非限制性实例 中，表面1501位于顶板1502的内侧。在该方法中，(1)使包括对表面组分 1505具有亲和力的靶物质1504的样品小滴1503接触表面1501(利用小滴操 作)，导致(2)所述靶物质的部分或全部被固定化。(3)利用小滴操作将洗涤小 滴1506和所述样品小滴1503合并以产生合并的洗涤-样品小滴1507。(4)然 后利用小滴操作将所述合并的洗涤-样品小滴拆分为与所述表面相接触并包含 降低浓度的未结合靶物质的部分1508以及自所述表面分离并包含未结合靶物 质的部分1509。可按需重复步骤(3)和(4)以便未结合物质达到所需的降低。
8.7 细胞处理
本发明的各种方案可使用包括细胞的小滴。小滴可包括用于维持细胞活 力的培养基和/或生长细胞培养物。
在一些情况中，本发明使用具有预定数量的细胞的小滴。例如，在一些 实施方式中，本发明使用包括单个细胞的小滴。例如，单细胞小滴可用于产 生克隆纯的细胞群体和/或用于进行研究单细胞对特定刺激的反应的实验。通 过将来自细胞悬液的小滴分配至来自细胞悬液的小滴转移通路或网络和/或通 过将具有多细胞的小滴拆分为一或多个亚小滴，可提供具有预定数量的细胞 的小滴。悬液可由外部来源提供或储存在小滴微驱动器池内。可分析小滴以 确定各小滴内的细胞数量，并可将具有预先选定的细胞数量的小滴发送给下 游用于进一步处理。具有多个细胞的分配的小滴本身可与一或多个缓冲液小 滴合并，并拆分为两个或更多个亚小滴，并分析其释放存在单个细胞。
将基于小滴分析做出分选决定。例如，可使用光传播来鉴定具有预定数 量细胞的小滴。可基于传播的光的测定值做出分选决定。其他实施方式可利 用自动化图像分析和/或多色荧光和/或散射分析。不符合规定的小滴可送回样 品池做另一次尝试或转移至废液池。
符合细胞数规定的小滴可转移至小滴微驱动器池和/或转移用于分选和/ 或富集。图16A和16B给出了用于提供具有富集细胞含量的池的一种方法。 在该实施方式中，自细胞悬液1604分配小滴1602并根据其性质转移至小滴 微驱动器1600上的池1606。
在其他实施方式中，可进一步操控小滴，如作为离散小滴用于分选其内 部所含的细胞。包括预定数量的细胞的小滴可用作在此所述的各种测定方案 的输入。在一些实施方式中，重力不用作转移小滴的原动力。
在一个具体的实施方式中，可在所述小滴微驱动器上分离肿瘤细胞。例 如，可以自微升水平的细针穿刺物(FNA)分离细胞。在另一个实施方式中，可 分析样品例如血液干细胞、骨髓细胞、GI洗液、和冻融样品中的癌细胞。
可使用抗体来实现相关细胞的免疫捕获，例如抗-细胞角蛋白珠可用于捕 获来自样品的相关细胞然后将其引入所述小滴微驱动器和/或捕获来自小滴微 驱动器上的小滴的相关细胞。通过主动使小滴来回运动或在池内漩涡振动所 述小滴，可在所述小滴微驱动器上增强结合或降低温育时间。可按照本文其 他部分所述来分离并洗涤珠。可将靶细胞释放入所述小滴微驱动器上的小滴 内的悬液中。
可使用在此所述的细胞分配方法自芯片上的池(on-chip reservoir)给每个 小滴分配相同数量的细胞。可将具有细胞的小滴等分至多个芯片上的池内。 可在芯片上的池内温育细胞。可评价细胞活力，例如可使用刃天青作为荧光 氧化还原指示剂。活细胞将非荧光性的刃天青染料转化为发出红色荧光的试 卤灵。非活性细胞不发出荧光。可将细胞分配至芯片上的池中并使用在此所 述的方法扩增来自所述细胞的核酸。
8.8 小滴微驱动器结构和操作
本发明的系统突出包括由处理器控制的小滴微驱动器。例如，处理器例 如可以被程序化为控制小滴微驱动器上是小滴操控。小滴微驱动器的构造具 有多种可能性。图1、2、6、9、和17给出了多种示例。可构造到本发明的小 滴微驱动器内的组分的实例包括：各种填充流体，其可加载至所述小滴微驱 动器上；液体加载机构，用于将填充流体、样品和/或试剂引入到所述小滴微 驱动器上；各种池，例如输入池和/或处理池；小滴分配机构；温度控制装置， 用于控制所述小滴微驱动器、填充流体、和/或小滴微驱动器上的小滴的温度； 和磁场产生组分，用于操控小滴微驱动器上的磁响应性珠。本节讨论所述小 滴微驱动器的这些以及其他方面以及它们在本发明的系统中的用途。
8.8.1 小滴微驱动器
所述系统利用小滴微驱动器。所述小滴微驱动器包括具有一或多个电极 的基材，所述电极被设置为用于进行一或多次小滴操作。在一些实施方式中， 所述小滴微驱动器可包括此类电极的一或多个阵列、路径或网络。可利用多 种电特性来实现小滴操作。实例包括电润湿(electrowetting)和电泳。
在一个实施方式中，所述小滴微驱动器包括与基材连接的两个或更多个 电极，并包括用于使得所述电极启动/停止的装置。例如，电极可电子连接于 并受控于一组手控开关和/或控制器。所述小滴微驱动器因此能够实施小滴操 作，例如分配、分裂、转移、汇合、混合、搅动，等等。在一个实施方式中， 采用电场介导的驱动来实现小滴操控。电极可电子连接于用于控制与所述小 滴微驱动器电联系的装置。
基本小滴微驱动器包括电极路径或阵列。在一些实施方式中，所述小滴 微驱动器包括两个平行的分开一定间隙的基材以及位于所述基材之一或两者 上的电极阵列。所述基材之一或两者可以是板。所述基材之一或两者可以 PCB、玻璃、和/或半导体材料作为基材而制造。如果基材是PCB以下材料是 合适的材料的实例：Mitsui BN-300；Arlon 11N；Nelco N4000-6和N5000-30/32； Isola FR406，特别是IS620；含氟聚合物系列(因其背景荧光低，因此适合用于 荧光检测)；聚酰亚胺系列。多种材料也适合用作基材的介电组分。实例包括： 蒸汽沉积电介质，例如聚对二甲苯基C(特别是在玻璃上)、和聚对二甲苯基N； 聚四氟乙烯AF；Cytop；和可焊性表面阻焊层(soldermasks)，例如流体光可成 像型可焊性表面阻焊层(liquid photoimageable soldermasks)(例如在PCB上)， 如Taiyo PSR4000系列、Taiyo PSR AUS系列(具有适合于温控用途的良好的热 特性)、和Probimer 8165(具有适合于温控用途的良好的热特性)；干膜可焊性 表面阻焊层，例如Dupont Vacrel系列中的那些；和膜电介质，例如聚酰亚胺 膜(Kapton)、聚乙烯、和含氟聚合物如FEP、PTFE。基材的部分或全部还可 包括疏水涂层。合适的实例包括聚四氟乙烯AF；Cytop；Fluoropel系列的涂 层；硅烷涂层；氟甲硅烷(fluorosilane)涂层；和3M Novec电子涂层。
如果所述小滴微驱动器包括两个板，则可将小滴放入两个板之间的空间 内。包围小滴的空间典型地包括填充流体。所述小滴微驱动器可使用多种多 样的流体小滴进行小滴操作，不过传导性流体是优选的。
所述小滴微驱动器的表面典型地涂覆有疏水涂层。如果用在热循环，选 定的疏水涂层应该能够抵抗长时间热循环操作过程中的热应力。合适的耐热 材料的实例包括：可焊性表面阻焊层例如 8165，其用于汽车业并 具有优秀的热激抗性；以及PCB板材，例如Mitsui BN-300，其抗高温和热变 形。
小滴转移沿控制电极的路径或网络进行。阵列或路径包括电联系，用于 将电极电连接于外部电路。阵列或路径可包括电联系，用于将特定电极电连 接在一起。电极由处理器通过外部电路进行控制。可通过给电极施加电压而 实现小滴操作。尽管优选的电压依电介质的厚度的变化，对于介电常数为 2-100且厚度在1nm至10mm的情况，单位面积能量的优选范围是约300微 焦耳/平方米至约300000微焦耳/平方米。优选的启动电压的范围为约1mV至 约50kV、或约IV至约10kV、或约5V至约1000V、或约10V至约300V。
典型地，电极由电压继电器启动。所述小滴微驱动器通过直接操控离散 小滴而运行，如使用电场操控。例如，邻近具有接地包围电极的加压电极的 小滴将转移以便将其自身与加压电极对齐，即小滴将被转移至该电极的位置。 一系列连续转移将小滴沿着控制电极的路径或网络转移。除了转移，其他的 操作包括小滴的汇合、分裂、混合和分配，这些可通过该病电压启动的模式 以相同的方式进行。
需要注意，电极可通过多种途径启动。例如，可通过施加DC电位启动电 极。类似地，可通过施加AC电位启动电极，这样所述启动的电极具有AC电 位而未启动的电极具有地线或其他参比电位。在另一方面，可通过反复启动 电极然后使之变为反相而施加电位。通过使用软件快速改变输出的极性而实 现AC模式。
在一些实施方式中，本发明使用的小滴操作结构和技术可参见美国专利 6,911,132，发明名称为＂Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting- Based Techniques＂，公告日为2005年6月28日，授予Pamula等；美国专利 申请No.11/343,284，发明名称为＂Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board＂，申请日为2006年1月30日；美国专利 6,773,566，发明名称为＂Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same＂，公告日为2004年8月10日和6,565,727，发明名称为＂Actuators for Microfluidics Without Moving Parts＂，公告日为2000年1月24日，均授予 Shenderov等；美国专利出版物No.20060254933，发明名称为＂Device for transporting liquid and system for analyzing＂，公开日为2006年11月16日， Adachi等，因其教导涉及了用于进行小滴操作的结构个技术而通过引用将上 述文献的内容并入本申请。
小滴操作可以快速进行，典型地，其涉及的平均线性速率为约0.01cm/s 至约100cm/s、或约0.1cm/s至约10cm/s、更优选地约0.5cm/s至约1.5cm/s。 此外，典型地，小滴被操控的操控频率为约1Hz至约100KHz、优选地约10 Hz至约10KHz、更优选地约25Hz至约100Hz。除了快速以外，使用所述小 滴微驱动器的小滴操控还高度准确，且可在单个小滴微驱动器上独立地和同 时地操控多个小滴。
离散小滴操作无需使用连续流结构，并避免了与连续流结构相关的所有 各种缺点。例如，由于没有液体被浪费在填充管路和充满池，因此可以几乎 100％利用样品和试剂。此外，如上所述，小滴运动可以极快。在一些情况中， 所述小滴微驱动器可由连续流组分进行补充，因此包括离散小滴操作和连续 流元件的这些组合方法属于本发明的范畴。连续流组分可由控制器控制。不 过，在某些其他实施方式中，本发明的小滴微驱动器和/或本发明的方法特别 要避免使用各种连续流元件。例如，在某些实施方式中，一或多种以下组分 被排除于本发明的小滴微驱动器和/或方法：微通道；固定微通道；微通道网 络；泵；外部泵；阀；高压电源；离心力元件；移动部分。
电场介导的驱动也无需使用其他小滴操作，并避免了与此类技术相关的 所有各种缺点。可以理解，所述小滴微驱动器可由其他小滴操控技术互补或 补充，例如电(例如静电驱动、双向电泳)、磁、热(例如热Marangoni效应、热 毛细管)、机械(例如表面声波、微泵、蠕动)、光(例如光电润湿、光学镊子(optical tweezers))、和化学(例如化学梯度)装置。如果使用这些技术，相关的硬件也可 电子连接于并受控于所述控制器。不过，在其他实施方式中，本发明的小滴 微驱动器要特别排除一或多种这些小滴操作技术。
所述小滴微驱动器可以高度集成的形式制造并使用极小的设备驱动。例 如，小滴微驱动器和设备加在一起了小至数立方英寸大小。所述小滴微驱动 器仅需要小量的电能，而且能够，例如，容易地使用电池操作。所述小滴微 驱动器可使用极小的小滴进行小滴操作。小滴典型地为约1fL至约1mL、更 优选地约100pL至约1μL、进一步更优选地约10nL至约1μL。
使用离散小滴再芯片上处理而非使用连续流提供了一些重要的优势。由 于不需要扩充样品液体用于填充管路或泵，实际上所有样品液体均可用于分 析，且可以分析极小体积的样品(例如少于约100μL或少于约50μL或少于约 25μL)。在使用试剂方面也具有同样的优势，其中减少试剂消耗量可降低分析 的成本。使用离散的小体积小滴还允许在很小的基底(footprint)上进行大量的 反应(例如大于10/cm2或大于100/cm2或大于1,000/cm2或大于10,000/cm2)。
本发明的各种组分可作为所述小滴微驱动器的组分而被纳入。实际上， 本发明的整个系统可以是集成的小滴微驱动器。在一些实施方式中，所述小 滴微驱动器包括各种传感器和用于将传感器电子连接于外部电路的装置。在 其他实施方式中，所述小滴微驱动器包括加热器和/或磁场产生元件以及用于 将所述元件连接于外部电路的装置。此外，以池或小滴的形式包括任何一或 多种在此所述的试剂的小滴微驱动器也是本发明的一个方面。
可在电极中布置光学窗口以增强在芯片上进行光学检测的能力。如果在 透明基材上的不透明材料中形成电极，可在电极上设置窗以允许光穿过基材。 或者，如果电极材料是透明的，可设置遮盖物以便消除杂散光。此外，可将 所述开口布置为衍射光栅。还可使用第二电润湿层设置自适应光学窗口。例 如，对透明小滴可使用不透明油(例如染黑的油)以设置临时性和可移动的光学 窗口。
8.8.2 筒
在一些实施方式中，本发明包括用于连接于小滴微驱动器的筒。可以理 解，尽管筒对于实施本发明而言不是必需的，但在一些情况中其十分便利。 如果有的话，筒可以包括用于将所述小滴微驱动器的路径或网络电连接于处 理器(例如本发明的小滴微驱动器系统的处理器)的装置。在该实施方式中，电 联系：电极-筒-处理器，其中在这三者之间可以有额外的元件。在另一个实施 方式中，筒可包括用于物理地连接于所述小滴微驱动器的装置。在该实施方 式中，电联系可以是：电极-处理器-筒。或者，筒可完全没有电组分。
如果有的话，筒可包括用于一或多种试剂(例如预先加载的试剂)的池。所 述小滴微驱动器可被构造为使得能够在所述筒池和所述小滴微驱动器的内部 之间建立流体通路，用于使来自所述筒的试剂、样品和/或填充流体流到所述 小滴微驱动器上。例如，可在筒连接于分析仪之前、之后、或过程中将预先 加载的筒池分配到所述小滴微驱动器内。筒可以是密封的、独立的和/或一次 性的。其可与或不与小滴微驱动器一起提供。此类筒可用于保证测定条件的 可重复性，允许安全地处理或处置感染性或危险性材料，和/或降低各轮之间 的交叉污染。筒可以包括，例如，机械加工的塑料部分。其可以附着于所述 小滴微驱动器并与之组合提供。
选定的筒材料可用于储存试剂而不会发生试剂的降解或污染。此外，它 们还应该被选择为能够在高温条件下稳定操作并保证与实时化学方法相适 应。它们可包括，例如，模制塑料组分。在一些实施方式中，密封的一次性 测试筒可增加操作者的安全性并有助于安全地处置。
所述小滴微驱动器系统的各种组分可置于所述筒上。例如，有的话，包 括所述小滴微驱动器的内部可见的顶板可作为所述筒的组分而提供。各种传 感器也可作为组分被置于所述筒上。
8.8.3 填充流体
本发明的所述小滴微驱动器包括一或多个自由(即，流体-流体)界面。实 例包括液体-液体或液体-气体界面。典型地，在初级(小滴)相进行化学方法， 而次级相作为将小滴彼此分隔开的填充流体。次级相可以是，例如，液体、 凝胶和/或气体。如果次级相包括液体，该液体与所述初级液相是充分不混溶 的，以使得所述小滴微驱动器能够进行一或多种小滴操作。
要注意，所述小滴微驱动器可包括两种以上的相。例如，在一个实施方 式中，所述小滴微驱动器可在水-油-气三相系统的基础上运行。在一个有关的 实施方式中，所述小滴微驱动器可在水-第一油-第二油三相系统的基础上运 行，例如系统包括水性小滴，其被硅油包围，后者又被氟硅油包围。通常， 三相系统会包括相互不混溶的或基本不混溶的三种组分。
在另一个实施方式中，油或另一种不混溶的液体可用作用于电润湿的小 滴密封剂。例如，通过使小滴移动通过气/油界面，可将小滴包囊化于油壳内。 各个小滴将具有其自己的局部油浴，而包囊化小滴之间的空间则充满气体或 第三种不混溶的液体。本发明的优势之一是该方法可通过油相内分隔而将系 统中小滴之间的物质转移最小化，同时保留油在蒸发和表面污垢方面的优越 特性。该方法还可用于促进与电可湿性液体不混溶的非电可湿性液体的电润 湿。在该构思下的一个具体实施方式中，可选择可交联的(通过UV、热、湿 或化学方法)不混溶的液体以产生具有固体壳的液体胶囊，用于药物输送合成 用途。
此外，在一些应用中可能需要或必需在不混溶的液体例如油中进行某些 操作而在气体中进行其他的操作。本发明包括混合系统，其中既在气体又在 不混溶的液体填充流体例如油中进行小滴操控。例如，样品可在油中处理而 后转移至空气介质部分中进行蒸发以便随后通过MS进行分析。反过来，可 在空气中收集样品而后以油中的小滴进行处理。因此，所述小滴微驱动器可 包括转移通路用于将小滴从充满填充流体的小滴微驱动器表面移至开放于大 气或包括气态填充流体的小滴微驱动器。
填充流体可以是任何形式的流体，其中在正确的情况下所述小滴微驱动 器可以进行一或多次小滴操作。应该注意的是，某些填充流体在特定条件下 可以是固体或高度粘稠的流体，例如在注意过程中，不过在操作时，它们被 转变为流体，如通过加热。在所述小滴微驱动器的操作过程中，填充流体可 以是液体或气体。合适的液体填充流体的实例包括，但不限于，硅油；氟硅 油；碳氢化合物，包括例如烷烃，例如癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十 四烷、十五烷、十六烷；脂肪族烃和芳烷烃，例如十二烷、十六烷、和环己 烷、碳氢化合物油、矿物油、石蜡油；卤化油，例如氟碳化合物和过氟化碳(例 如3M Fluorinert液体)；任何同一类别的前述的油混合物；任何不同类别的前 述的油混合物。合适的气体填充流体的实例包括，但不限于，空气、氩气、 氮气、二氧化碳、氧气、湿化空气、任何惰性气体。在一个实施方式中，初 级相是水溶液，而次级相是与水相对不混溶的空气或油。在另一个实施方式 中，填充流体包括填充位于板之间的包围所述小滴的空间的气体。优选的填 充流体是低粘度的油，例如硅油。其他合适的流体的实例可参见美国专利申 请No.60/736,399，发明名称为＂Filler-Fluids for Droplet-Based Microfluidics＂， 申请日为2005年11月14日，通过引用将其全部内容并入本文。可选择流体 以防止小滴出现明显的蒸发。
可选择本发明的方案中所使用的流体的相以顺利实施本发明的方案而不 会形成不当的气泡、试剂漏入填充流体、和/或试剂粘附于所述小滴微驱动器 表面。
在本发明的某些实施方式中，可选择填充流体以减少或防止本发明的方 案所使用的样品、试剂或其他小滴的蒸发。可选择填充流体以防止本发明的 方案所使用的样品、试剂或其他小滴的蒸发并变得过少以至难以进行进一步 的有效操作。类似地，可选择填充流体以防止本发明的方案所使用的样品、 试剂或其他小滴的蒸发造成小滴内的物质发生有害性浓缩以至对所述小滴的 使用造成不当的不良影响。此外，可选择填充流体以减少或防止物质自本发 明的方案所使用的样品、试剂或其他小滴转移穿过相的边界，以维持小滴的 体积和/或保证可靠的微流体操作和/或测定结果。相之间的可混和性有时导致 小滴相发生皱缩(或膨胀)。为了防止或减少这一问题，系统的一或多种相可经 平衡浓度的另一种相进行饱和以减少皱缩或膨胀。因此，例如，可使用平衡 浓度的用于本发明的方案所使用的样品、试剂或其他小滴的溶剂饱和填充流 体，和/或一或多种本发明的方案所使用的样品、试剂或其他小滴可使用平衡 浓度的填充流体进行饱和。
在一些实施方式中，选择液体填充流体以使得小滴与小滴微驱动器表面 之间的接触最小化。也就是说，小滴与表面之间可存在液体膜，其防止小滴 内的物质接触并粘附于被涂覆的表面。该方法有助于防止表面的污垢以及对 小滴转移造成的有关干扰。例如，已经发现水性小滴内的高浓度的某些蛋白 质容易粘在疏水表面而损害这些表面的疏水特性；而如果浸泡在能够使得两 个表面之间的接触最小化的油中，则同样的小滴可移动穿过相同的表面而不 会出现可察觉的蛋白质粘附。该方法还可有助于避免因来自一种小滴的沉积 物质被第二种小滴吸纳而导致的小滴之间的交叉污染。在类似的实施方式中， 可使用小滴与小滴微驱动器表面之间的膜通过防止小滴操作过程中小滴与表 面之间的摩擦力样物理性相互作用来润滑小滴。
在一个实施方式中，本发明提供其他部分被气体填充的系统中的液体填 充流体层薄层涂层。例如，本发明提供微流体系统，其包括开放的或封闭的 系统，该系统包括形成在小滴微驱动器表面上的薄层填充流体，例如油，其 中所述系统的其他部分由气体填充。油具有足够的厚度以便提供小滴微驱动 器表面的润滑和沾染以及通过小滴微驱动器表面对小滴的沾染。优选地，选 择油以便使小滴与油相之间的物质转移最小化。该方法的一个优势在于减少 所述小滴微驱动器内的遗留物。在一些实施方式中，可通过在空气中操作时 用填充流体涂覆表面而处理所述表面。该方法也可用于加载操作，作为保留 油的润滑作用同时避免油气泡陷入大量填充流体中的手段。
用硅油处理聚四氟乙烯AF表面可提供硅油填充流体的润滑益处，即便当 在空气中操作时也是如此。该方法可用于使用油润滑层填充所述小滴微驱动 器，随后再以空气置换以便加载样品而不会引入气泡，随后再引入油以防止 样品蒸发。因此，根据待进行的微流体处理的类型，每一类型的系统均有益 处。
在另一个实施方式中，可在方案内的不同步骤完全交换填充流体。例如， 可在加样过程中引入气体填充流体以防止带入空气泡，然后可泵入液体填充 流体以防止流体蒸发。可根据待进行的具体测定步骤，将不同类型的填充流 体泵入或泵出系统。
在又一个实施方式中，可在单个系统内使用多种填充流体。例如，可选 择具有分离的气体填充区和流体填充区的小滴微驱动器。可在不同填充流体 区之间分开特定类型的小滴操作。
可基于填充流体的折射率对其加以选择使之与小滴相匹配以防止经过所 述小滴或所述小滴附近的光的折射。或者，可选择折射率不同于小滴的填充 流体以便为特定类型的光学测量或光学操控提供对比剂。可选择折射率低于 初级流体的填充流体以便光能够通过全内反射而通过初级流体传播。初级相 可包括高度伸长的小滴，其可作为＂光管＂将光在两个位置间传输，例如用于促 进光学分析。
可基于填充流体的颜色对其加以选择，以有助于直接或间接显现小滴， 例如通过本发明的方案中所使用的样品、试剂、和/或其他小滴与所述填充流 体之间提供对比。该方法可增强不同相的显现，例如用于将小滴与填充流体 或空气泡区分开。在光学应用中，两种相的差别吸光度可用于调整经过所述 系统的光的颜色。作为另一个实例，对于在小滴内进行荧光测量的应用，可 能希望油包括吸收发射波长的光的分子，例如染料，以便将邻近小滴内发生 的反应之间的相互干扰最小化。
可选择具有特别的热特性的填充流体，其能够使小滴绝热或将热自小滴 传导出去。例如，在本发明的扩增方案中，可能需要导热性或低热容填充流 体以便快速改变温度。对于需要稳定的温度的应用，可使用绝热或高热容填 充流体以保持温度稳定。
可选择填充流体以便当提供合适的刺激时可发生相变。例如，可使用腊 样填充流体(例如石蜡或十八烷)，其中通过加热将所述填充流体由固体变为液 体形式。降低温度可使得填充流体恢复为固体，这样小滴便可以包含于固体 基质内。将液相包囊化于固体内可有助于本发明的方案所使用的样品、试剂 或其他小滴的储存和操作和/或允许在使用所述小滴微驱动器之后能够安全而 方便地处置材料。填充流体可作为固体储存于所述小滴微驱动器上、基于筒 的池内、或其他地方，并可加热以允许所述流体流进并填充所述小滴微驱动 器。或者选定的不混溶的填充流体可以是可交联的(通过UV、热、湿或化学 方法)，以产生位于固体壳内的液体胶囊。
选定的填充流体可具有特定的气体通透性或饱和特性。在某些应用中， 小滴内发生的反应可消耗氧或其他气体，需要由填充流体内所含的气体或通 过其转移的气体进行补充。例如，某些氟化的油具有可用于此类目的的气体 通透性。或者，可选择填充流体以便自小滴排除某些气体，例如，用于维持 小滴内的厌氧条件。选定的填充流体可以具有一定程度的可混和性或小滴相 内的分隔。通常，希望小滴和填充流体之间完全缺乏或基本上完全缺乏可混 和性，但某些应用可能得益于相之间的某种有限程度的可混和性或相之间的 特殊分子的分隔，如液体-液体提取应用。在溶解于填充流体内的气体可能是 有问题的某些实施方式中，在使用前或过程中可能需要提供对填充流体进行 脱气的装置。例如，可通过在真空条件下温育、加热、喷雾或通过离心将填 充流体脱气。
选定的填充流体可以与小滴相或与所述小滴微驱动器表面具有特殊的表 面或界面张力。表面活性物质可加入到填充流体中以便稳定小滴相和固相之 间可能存在的液膜。合适的表面活性物质的实例包括非离子性低HLB(亲水- 亲油平衡性)表面活性物质。HLB优选地少于约10或少于约5。合适的实例包 括：Triton X-15(HLB＝4.9)；Span 85(HLB 1.8)；Span 65(2.1)；Span 83(3.7)； Span 80(4.3)；Span 60(4.7)；和氟化的表面活性物质。
所选定的表面活性物质及其被提供的量优选地(1)与无所述表面活性物质 的相应的小滴微驱动器相比，能够在所述小滴微驱动器上进行更多的小滴操 作；或(2)与无所述表面活性物质的相应的小滴微驱动器相比，能够在所述小 滴微驱动器上进行一或多次小滴操作；或(3)与无所述表面活性物质的相应的 小滴微驱动器相比，能够使得所述小滴微驱动器上的一或多次小滴操作更加 可靠。在相关的实例中，所选定的表面活性物质及其被提供的量优选地使得， 与在无所述表面活性物质的相应的小滴微驱动器上对包括一或多种特定试剂 或混合物的同样小滴的小滴操作相比，能够在所述小滴微驱动器上对包括一 或多种特定试剂或混合物的小滴进行一或多次小滴操作或使得所述小滴操作 更加可靠。在另一个相关的实例中，所选定的表面活性物质及其被提供的量 优选地使得，与在无所述表面活性物质的相应的小滴微驱动器上对包括两亲 性分子的同样小滴的小滴操作相比，能够在所述小滴微驱动器上对包括两亲 性分子的一或多个小滴进行一或多次小滴操作或使得所述小滴操作更加可 靠。
在一个优选的实施方式中，所述表面活性物质添加到填充流体中的量在 约0.001至约10％w/w、或约0.001至约1％w/w、或约0.001至约0.1％w/w 的范围内。例如，在一个实施方式中，填充流体是2cSt硅油，而所述表面活 性物质是Triton X-15，所述Triton X-15的量在约0.001至约10％w/w、或约 0.001至约1％w/w、或约0.001至约0.1％w/w的范围内。固体-液体界面张 力可被调整为用于控制所述小滴微驱动器表面上的填充流体的湿润，例如， 用于控制小滴与小滴微驱动器表面之间的填充流体薄层的形成、厚度或表现， 或用于控制给所述小滴微驱动器填充所述流体或从所述小滴微驱动器清空所 述流体时所述流体的湿润表现。
通过给填充流体涂上表面活性物质，本发明人发现，相容性蛋白质溶液 的浓度可以被提高3个数量级以上，从mg/L到mg/mL。本发明人能够使用新 的填充流体可靠地分配并转移25nL小滴的75mg/mL的溶菌酶溶液。例如， 填充流体可以是涂有表面活性物质的硅油，例如Triton X-15。优选地，表面 活性物质是亲脂性表面活性物质。在一个实施方式中，我们将0.1％(w/w) Triton X-15，即一种亲脂性表面活性物质，添加给油，这样可形成高浓度蛋白 质小滴或者从芯片上的池分配这样的小滴。对于所有相容性流体，小滴转移 迅速(典型地为约3-10cm/sec)而可靠(>25,000操作)。在一个实施方式中，填 充流体包括表面活性物质搀杂物，其量导致可被可靠地分配至所述小滴微驱 动器上的蛋白质浓度增加。
选定的填充流体可具有特殊的粘度或挥发性。例如，低粘度流体(例如0.65 cSt.硅油)有助于转移小滴，而低挥发性填充流体(例如2、5或10cSt.硅油) 适合于防止蒸发导致的填充流体损失，特别是在高温进行核酸扩增的情况中。 在一些应用中，可能希望填充流体蒸发，因此可选择挥发性过滤流体。选定 的填充流体可以具有特殊的温度粘度依赖关系，因为填充流体的粘度影响流 体动力学而所述小滴微驱动器上的温度可以改变。在本发明的核酸扩增方案 中，选择填充流体以便热循环导致的任何粘度改变均不会对实施扩增方案所 需的小滴操作造成不当的损害。
选定的填充流体可具有特殊的电特性。例如，某些应用包括电润湿以利 于使用非传导性填充流体(例如硅油)。或者可选择电介质介电常数以控制将来 自外部电极的电能偶联进系统。某些应用中，可使用非传导性填充流体作为 电绝缘体或电介质，其中小滴仅漂浮在电极上方而与电极没有物理接触。例 如，在电润湿系统中，可使用小滴与电极之间的填充流体(例如硅油)层对小滴 进行静电控制。填充流体可被去离子化以降低传导性。
选定的填充流体相对于小滴相可具有特殊的密度。两相之间的密度差异 可用来控制或开发作用于小滴上的浮力。可用于本发明的这一方面的两相系 统的实例包括水/硅油、水/Flourinert、和水/氟硅油。如果一相是有浮力的，那 么可在垂直构型中使用该效应作为转移一相通过另一相的手段。例如，废液 或收集孔可位于所述小滴微驱动器的顶部或底部，在该处可通过简单地将小 滴释放在合适的点并允许它们漂浮或下沉到靶目的地而将小滴输送至该池。 该方法可适用于自小滴微驱动器移除试剂，例如移除含有扩增的核酸的流体 用于其他处理。密度差异还可用作控制或操纵小滴与小滴微驱动器表面之间 的接触的手段。例如，可释放通常不接触顶板的小滴使之下沉或漂浮至该表 面以与其相接触。还可将密度差异和浮力效应用于感测应用，其中检测小滴 的运动并使之与位置、方向或加速度的变化相关联。
选定的填充流体应该与所述小滴微驱动器表面具有材料相容性。例如， 某些填充流体可浸蚀、溶解、污染、吸附至或以其他方式与某些小滴微驱动 器材料不相容。例如，氟化的碳氢化合物，例如Fluorinert，可能与聚四氟乙 烯AF或Cytop表面不相容，因为它们会溶解这些材料，而硅油可能与PDMS 表面不相容，因为这些材料趋向于相互溶解。
选定的填充流体要与用于本发明的方案的样品和试剂具有生物化学相容 性。
本发明可包括用于控制所述小滴微驱动器、筒和/或系统内的填充流体的 引入或循环的装置。在一种操作方式中，在起始小滴微驱动器操作的过程中 注入一次填充流体。可使用注射器、滴管、吸移器、毛细管、管或其他装置 从外部来源提供填充流体。或者，可从位于所述小滴微驱动器组件或筒内部 的池提供填充流体。例如，流体可置于密封囊中，经穿刺或挤压而将所述流 体转移至所述小滴微驱动器中。
在另一种操作模式中，可提供用于将一或多种填充流体多次引入所述小 滴微驱动器或使之在所述小滴微驱动器在循环的装置。可提供次级流体处理 系统以便注入流体或将其自所述小滴微驱动器中移除。可使用压力、重力或 其他装置例如使用温度梯度将填充流体转移至所述小滴微驱动器内或自其转 移出去。该系统可用于以下目的：
(1)补充填充流体随时间蒸发或泄漏的损失。可使用填充流体的缓慢稳定 流动或周期性注射而补足填充流体体积的任何损失。
(2)持续地或周期性地提供＂清洁的＂填充流体以减少小滴之间的污染。可 通过全部替换或者循环通过可移除污染物的吸附材料的滤器或床而清洁填充 流体。
(3)提供将小滴转移至废液处的装置。例如，在测定结束后，可释放小滴 并使之与填充流体一起流到出口，提供了＂冲洗＂所述小滴微驱动器的手段。可 冲洗所述小滴微驱动器以便重设所述小滴微驱动器的状态，以备进行额外的 测定。
(4)当不同步骤需要不同流体时，交换填充流体，例如以空气替换油以便 干燥小滴、或以一种油替换另一种油。
(5)提供通过加热或冷却在所述小滴微驱动器中循环的流体而控制小滴 温度的装置。例如，可通过使温度受控的填充流体在所述小滴微驱动器中循 环以进行热循环而在含有合适的PCR试剂(例如引物、核苷酸、和聚合酶)的 小滴中进行PCR。可直接测量进入和离开所述小滴微驱动器的填充流体的温 度，并调整填充流体的温度和流速以给所述小滴微驱动器内部提供最佳的温 度控制。
可给每个小滴使用填充流体的局部区域甚至是单独单元的填充流体。例 如水性小滴可包囊化于流体的单独的壳内，例如油，其与该小滴一起移动。 各个此类小滴由此将具有其自己的局部流体浴，包囊化的小滴之间的空间填 充第三种不混溶的流体，例如空气或氟硅油。可使用该方法通过油相内分隔 将系统内小滴之间的物质转移最小化，同时保留油在蒸发和表面污垢方面的 优越特性。通过简单地将小滴移动通过油界面，当小滴沿着所述界面造成膨 胀时挤掉一单位的油，即可产生油壳。
可使用混合系统，其中所述小滴微驱动器的不同区域填充不同的流体。 例如，样品可在油中处理而后转移至空气部分中进行蒸发以便随后通过MS 进行分析。反过来，可在空气中收集样品而后在油中进行处理。
可使用磁响应性珠移动小滴微驱动器上的油相和水相之间的物质。通常， 水溶解性化合物或物质趋向于留在小滴内，不能大量穿过油-水分界面，而油 溶解性化合物或物质留在亲脂性填充流体内。当所述物质附着于磁响应性珠 时，可使用磁场移动珠以及所附着的物质穿过油-水边界。需要选择对油和水 具有足够的亲和力的珠以使得它们能够容易地穿过分界面。这一操作可用于 干燥或浓缩物质，还可用于促进洗涤和/或稀释。例如，可借助于填充流体将 结合于磁响应性珠的物质从一个小滴中移除并转移至另一个小滴。
填充流体可循环通过所述小滴微驱动器以减少各轮过程中和/或之间的污 染。填充流体可持续或周期性地流过所述小滴微驱动器，以便将新鲜的填充 流体不断补充给所述小滴微驱动器。除了用于去除被污染物污染的油，还可 在运行结束时使用该技术以便从阵列中清除小滴，可撤除电压，使得小滴被 释放，并随着油流动到所述小滴微驱动器的外部和/或进入废液池。
8.8.4 小滴微驱动器加载
所述小滴微驱动器通常包括一或多个输入端口，用于将一或多种填充流 体、试剂和/或样品(例如用于进行本文其他部分所述的方案和/或测定的试剂和 /或样品，如参见8.1、8.2、8.3、8.4和/或8.5节)引入所述小滴微驱动器。在 一些实施方式中，使用常规的机器人技术通过输入端口加载样品或试剂。在 一个可供选择的实施方式中，通过预填式长玻璃毛细管中的油塞分离样品或 试剂小滴，该装置当连接于所述小滴微驱动器时能够捕获样品或试剂小滴， 随着小滴被泵出毛细管进入输入端口而将其发送至所述小滴微驱动器上。另 一个加载技术涉及将试剂预先模压到所述小滴微驱动器上并使其干燥，如使 用高速试剂模压或印制方法。另一种方法涉及使用直接的板-至-小滴微驱动器 界面，其中通过使用压力促使内容物通过与孔对齐的输入端口而将板(如1536 或384或96孔板)的内容物平行地转移至所述小滴微驱动器上。在一些实施方 式中可将加载硬件电子连接于并受控于所述控制器。
8.8.5 池
所述小滴微驱动器包括多种池，例如输入池和/或处理池。
8.8.5.1 输入池
在一些实施方式中，所述小滴微驱动器包括与一或多个输入端口流体连 通的一或多个输入池，典型地与输入端口直接流体连通。输入池作为储存大 量源物质(例如试剂或样品)的池，用于分配小滴(例如试剂小滴或样品小滴)。 因此，输入池可作为，例如，样品孔或试剂孔。
输入池通常包括一或多个限定出内部空间和开口的孔壁。孔壁所限定的 内部空间通过孔壁与所述小滴微驱动器内部的其余部分至少部分地分开。所 述孔与适合将来自所述小滴微驱动器的外部的流体引入输入池的端口邻近(以 任何方向，如垂直或侧向)。可在孔壁中提供一或多个开口以便与所述小滴微 驱动器的所述内部体积流体连通，用于分配小滴进入该内部体积。开口可允 许流体流入或转移至所述小滴微驱动器的所述内部体积内，到达电极的路径 或网络上。输入池也可包括一或多个出口(vent)，以便当流体通过所述端口或 开口引入所述孔或自孔中移除时，来自输入池的填充流体能够替换。
输入池可进一步包括顶板或底板中的一或多个平面控制电极，所述电极 与孔壁所限定的空间邻近或位于其中。平面电极电子连接于并受控于控制器。 在一个优选的实施方式中，平面电极具有两个或更多个分支或辐射状线，这 样，在存在流体的情况下，在小滴分配过程中启动控制电极会对流体施加＂拉 力＂，拉力的方向通常与小滴分配的方向相反。在一些情况中，电极的形状产 生多向量拉力，其具有的平均向量的方向通常与小滴被分配的方向相反。
孔壁例如可以由来自顶板或底板的突出物形成，和/或可以由壁形成材料 沉积在顶板或底板的表面而形成。例如，孔壁可以由沉积并模式化于所述表 面的可焊性表面阻焊层材料或聚合物衬垫材料形成。在一些实施方式中，连 续或半连续样品或试剂流的源以流体连通的方式与一或多个所述输入端口连 接。
应该注意的是，尽管可以从所限定的池进行小滴分配，但在一些实施方 式中，进行小滴分配可以不使用物理上限定的池。可以从小滴分配过程中(例 如通过电润湿力或通过亲水性表面)所限定的源小滴进行分配。
8.8.5.2 处理池
所述小滴微驱动器还可以包括一或多个处理区域或池。这些区域或池用 作用于实施各种小滴处理步骤的位置，例如混合、加热、温育、冷却、稀释、 滴定、和等等。所述小滴微驱动器包括一或多个控制电极路径或网络，其足 以将小滴从一或多个输入端口转移至一或多个处理区域或池。在一些情况中， 处理区域仅仅是这些路径或网络的组分或区。在其他实施方式中，处理区域 是限定的处理池。此类池的结构，例如，大体上与上述的输入池相同。不过， 处理池典型地不直接与输入端口流体连通，即，沿着一或多个控制电极路径 或网络进行小滴转移需要向处理池添加试剂或样品。在一些情况中，处理池 包括池的路径或网络以便在处理池内进行小滴操作。
8.8.5.3 小滴操作
所述小滴微驱动器可对小滴进行多种小滴操作。实例包括：将小滴加载 至小滴微驱动器中；从源小滴分配一或多个小滴；将小滴分裂、分离或拆分 为两个或更多个小滴；将小滴自一处沿任何方向转移至另一处；将两个或更 多个小滴汇合或合并为一个小滴；稀释小滴；混合小滴；搅动小滴；使小滴 变形；使小滴保持原位；温育小滴；加热小滴；蒸发小滴；冷却小滴；布置 小滴；将小滴转移出微驱动器；本文所述的其他小滴操作；和/或上述各项的 任意组合。
小滴分配指的是将较大体积的流体等分为较小的小滴的过程。可在流体 界面、输入池、和处理池使用分配。通过给流体池附近的电极提供电压引起 从所述池伸出流体＂指状物＂而形成小滴。当流体前端到达末端电极时，中间电 极的电压撤出，这引起流体缩回池内，同时在末端电极处留下新形成的小滴。 如前所说，池内的一或多个电极也可以被提供电压以有助于分开从大流体分 配出的小滴。由于小滴与电极的形状相符合，而电极是固定的，因此可达到 出色的精度和准确性。小滴分配由控制器控制。在一些实施方式中，本发明 使用以下文献所述的小滴分配结构和/或技术：美国专利6,911,132，发明名称 为＂Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques＂，公 告日为2005年6月28日；美国专利申请No.11/343,284，发明名称为 ＂Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board＂， 申请日为2006年1月30日；美国专利6,773,566，发明名称为＂Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same＂，公告日为2004年8 月10日和6,565,727，发明名称为＂Actuators for Microfluidics Without Moving Parts＂，公告日为2000年1月24日，均授予Shenderov等，通过引用将上述 文献的内容并入本申请。
在一些实施方式中，小滴操作由电润湿技术介导。在其他实施方式中， 小滴操作由电泳技术介导。在其他实施方式中，小滴操作由电润湿技术和电 泳技术介导。
在一个实施方式中，可以组合使用电润湿和电泳进行分离。可使用电润 湿微驱动产生通道以便进行电泳；以便输送样品至通道或在电泳分离之后捕 获来自所述通道的样品成分。例如，为了形成通道，可使用电润湿使分离介 质小滴变形(伸长)成为随后的细长形状。在一些情况中，通道可以聚合，如使 用UV聚合作用。在其他情况中，可通过利用小滴操作将小滴添加至具有物 理边界的微通道内而形成通道。在相关的实施方式中，可通过以循环的方式 在出口处捕获小滴内的感兴趣的成分并随后将其送回输入口而增加电泳通道 的有效长度。采用相同的原则，可进行一系列逐步细化的分离。还可以同时 使用多种不同的分离介质而实现分离。
小滴分裂或小滴拆分通常涉及将小滴分为两个或更多个亚小滴。在一些 情况中，得到的小滴具有相对一样的大小。
转移涉及将小滴从一个位置沿任何方向移至另一个位置。小滴可以在平 面上转移或者做三维转移。可以理解，各种小滴操作，例如分配和/或分裂， 可包括转移元件，小滴在该元件上可转移离开另一个小滴。
汇合涉及将两个或更多个小滴合并成单个小滴。在一些情况中，使相对 一样大小的小滴相互汇合。在其他情况中，一个小滴可以汇合进一个更大的 小滴中，例如将小滴与池中存在的更大体积合并。
混合小滴涉及各种小滴操控，例如转移或搅动，导致组分在小滴中的分 布更加具有均质性。在一个混合实施方式中，通过启动和停止电极，使得放 置在电润湿电极上的小滴在原位快速且周期性地变形，在小滴内诱导流体流， 从而促进混合。可利用频率依赖性效应例如机械共振来调整混合的质量和速 度。与需要在表面上转移小滴用于混合的技术相比，这种方法将混合所需的 面积降至最小。这种混合计划可在不存在顶板的情况下使用。由于具有节省 空间的优势，该计划使得能够在反应孔处进行简化的混合，而这仅需要一个 电极。
可将来自池的试剂或样品分配为离散小滴，用于转移至所述小滴微驱动 器上的其他位置。
本发明包括使用包含珠的小滴的小滴操作。本文在其他部分描述了各种 此类操作。在一个实施方式中，使用珠在易于干扰小滴操作的试剂上进行小 滴操作。例如，某些蛋白质易于结合于小滴微驱动器的表面和/或分隔填充流 体。可将此类化合物固定化于亲水性珠上以促进使用所述化合物的小滴操作。 所述化合物可结合于珠，而所述珠可含在小滴内，对小滴进行小滴操作。
在一种特殊的分配操作中，利用血液凝结从全血中分离血清。将全血加 载于芯片上并与包含凝血剂的小滴合并。凝结后，从样品中分配小滴。由于 细胞和血小板被限制在原位，从样品中分配来的流体将仅含有血清。
8.8.6 热控制
本发明的所述小滴微驱动器可包括用于控制所述小滴微驱动器或小滴微 驱动器的区域的温度的装置。其中，热控制可用于各种需要加热或冷却步骤 的方案。实例包括需要热循环的扩增方案和需要温育步骤的各种测定方案。
8.8.6.1 热控制设计
总体上，可以三种途径提供热控制：(1)对整个小滴微驱动器的热控制； (2)对小滴微驱动器的区域的热控制，其中使用与被控区相接触或与之邻近的 加热器；和(3)对小滴微驱动器的区域的热控制，其中使用整合到所述小滴微 驱动器内的加热器(例如位于包含电极路径或阵列的基材内和/或位于所述小 滴微驱动器的顶板内，如果存在的话)。前述方法的组合也是可行的。图2所 示为前面讨论过的两种方法。
在整合式加热器方法中，使用直接整合到所述小滴微驱动器内的热控制 系统产生并控制温度区。可使用通过直接在所述小滴微驱动器上制造的薄膜 加热元件来整合热控制以便最大程度提高所述小滴微驱动器上的扩增反应的 速度、通量和质量。由于热量(thermal mass)很小，因此小滴可以极快的速度 进行热循环。通过将加热元件放置于接近小滴的位置并减少加热器与小滴之 间的寄生热损失而增强热控制。加热元件可整合到所述小滴微驱动器的顶板 和/或底板内。
将加热元件整合到所述小滴微驱动器上也使得能够在所述小滴微驱动器 内使用多个不同的温度区。这使得分析中的需要不同温度的多个步骤，例如 样品制备和热循环，可在所述小滴微驱动器的不同部分上同时进行。小滴可 被物理性转移或＂穿梭＂于具有不同的固定温度的区域之间，以进行扩增反应的 热循环部分。该方法可提供更快的反应，因为整个温度区的加热和冷却不再 是限速因素。反之，加热和冷却速度取决于在各区之间转移小滴所需的时间 和一旦小滴到达所述区后小滴温度与所述区的温度达到平衡所需的时间，而 预期两者均非常快。另一个优势在于反应步骤可以是＂列队的＂而非＂成批的＂， 这允许更高的操作灵活性。例如，离散样品可以连续补入到所述小滴微驱动 器内，而非在单个时间点输送。
可使用单个加热器以成批模式对小滴进行热循环或者通过使小滴循环通 过加热元件产生的不同温度区以流通模式(flow-through mode)对小滴进行热 循环。成批模式与流通模式之间的关键区别在于，在成批模式中，热控制是 通过改变所述加热器的温度而实现的，而在流通模式中，热循环是通过在不 同的恒定温度区之间转移小滴而实现的。在＂成批＂方法中，使用所述小滴微驱 动器上的单个整合的薄膜加热器对位于加热器区内的静态小滴进行热循环。 在＂流通＂方法中，在所述小滴微驱动器上产生了两种不同的固定温度区，并通 过使小滴穿梭于这两个区之间而进行热循环。
在＂成批＂情况下，可通过使用直接位于小滴附近的薄膜加热器使得加热器 本身的热量和热损失最小化。由于所述热量，包括小滴本身，均如此之小， 因此可实现快速的温度改变。被动冷却(在填充流体中)同样快速，因为与总热 量相比，输入到系统内的总能量极小。
对于＂流通＂加热，需要更大的热量，因为这有助于稳定温度，而由于加热 器温度一旦到达其设定点后不再改变，因此较慢的斜坡速度是可接受的。例 如，可以使用所述小滴微驱动器外部的模块加热器来运行流通系统，模块加 热器比薄膜加热器更加精确且更容易控制，不过，原则上，任一类型加热器 均可用于实施任一方法。
在另一个实施方式中，通过使加热的填充流体流过或循环在芯片和小滴 周围而控制温度。
所述小滴微驱动器布局是可升级的，因此小滴微驱动器可包括少数例如1 个加热区至数十个、数百个、乃至更多的加热区。
8.8.6.2 加热器类型
加热器可由薄层传导性膜形成。合适的薄膜的实例包括Pt加热器金属线 和透明的铟-锡-氧化物(ITO)。ITO能更好地显示小滴，利于实时观察。也可使 用远程放置的用于温度调节的常规热电偶(TC)。在一个实施方式中，可使用 PCB基材中的细金属(例如铜)通路在流体和远程TC之间建立紧密的热电偶接 合(thermal junction)。此外，通过使用表面放置的热敏电阻或红外传感器监测 铜通路来确定样品温度。使用热敏电阻的一个优势在于它们足够小(2 x 2 mm)，可直接焊接在所述小滴微驱动器上，而使用IR的一个优势在于其是非 接触式的方法，能够简化界面连接。由于铜的导热性比FR-4基材至少高700 倍(350-390W/m-K比0.3-0.5W/m-K)，Cu通路的温度可精确代表流体内部温 度。加热器可整合在所述小滴微驱动器底板和/或顶板(如果存在的话)上并在 任一板的底面和/或顶面上，或整合到任一板的结构内部。
在一个流通实施方式中，通过使用加热器可提供降低的温度梯度，以产 生跨所述小滴微驱动器的连续温度梯度(例如从100至50℃)。使用连续梯度 消除了出现在加热器模块边缘的陡直温度梯度。受控的温度梯度允许实施具 有任意数量温度点的方案，因此还可明显增强装置的功能性。此外，各个反 应可按照定制的热方案进行，而仅需热调节两个或更多个模块的温度。小滴 将被转移至并保持在加热器之间的合适位置，以便达到靶温度。当小滴被转 移至检测点时，可使用荧光传感器来成像小滴的荧光。可通过改变小滴的位 置而改变靶温度的上下限温度。
在一些实施方式中，置于小滴上方的加热器可遮掩小滴，因此干扰实时 光学测量。在此类情况中，可将小滴从加热器下方转移至优选的光学检测位 置(即，检测点)。为小滴微驱动器检测的目的，例如通过荧光定量来检测，小 滴可周期性地从加热器下方转移至检测点。在小滴从一个温度区循环至另一 个时，小滴可被发送至传感器附近。
8.8.7 小滴微驱动器制造
可使用常规用于在微滴微驱动器上产生传导性相互连接结构的标准微制 造技术和/或使用印刷电路板(printed-circuit board，PCB)制造技术来制备小滴 微驱动器。合适的PCB技术包括以下文献所公开的那些技术：美国专利申请 No.11/343,284，发明名称为＂Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board＂，申请日为2006年1月30日，通过引用将其全部 内容并入本文。使用这些技术能够以极低的成本大量生产所述小滴微驱动器。 低成本制造使得能够经济地生产小滴微驱动器，甚至是一次性抛弃型。因此， 本发明提供一种方法，其中将小滴微驱动器作为用于本发明的系统的一次性 筒的组分提供给用户。
也可采用常规的缩微平版印刷术(microlithography)技术在玻璃或硅上实 施设计方案，该技术能够产生比PCB工艺中的典型部件小得多的部件。甚至， 例如，对于一个具有1,572,864个池、池距为70μm、池容积为3fL的小滴微 驱动器，所需的平版印刷部件大小最小为～0.5μm，完全在目前半导体工业中 的常规缩微平版印刷技术的能力范围之内。
8.9 系统
可使用例如图18所示的小滴微驱动器系统实现流体加载。可使用小滴控 制系统1801进行流体加载方案的步骤。写出一组计算机可执行的指令，加载 至用于执行加载方案的控制器内。也可使用包括小滴控制系统1801和方案执 行系统1802的整合系统。小滴控制系统1801允许用户控制小滴微驱动器系 统功能，例如流体加载方案的小滴操作和传感器操作。方案执行系统1802允 许用户执行控制小滴微驱动器系统功能的软件程序，例如小滴操作和流体加 载操作。本发明还提供用于进行流体加载方法或方案的方法或计算机可用指 令。该平台具有程序化灵活性，允许快速优化测定法并允许实施有条件的执 行步骤。例如，如果受到特定测试结果的触发，可执行校准、确认测试、或 额外的控制。在一些实施方式中，系统可整合样品制备步骤。系统的自动化 和小滴微驱动器上操作增加了便携性，并使得能够更快地且由接受最低训练 的人员进行测定，由此减少了人为误差。
进一步参展图18，在高水平，本发明的系统的各个系统典型地包括处理 器或控制器1803、小滴微驱动器1804、传感器或检测器1805、输入装置1806、 输出装置1807、和软件。美国专利申请No.60/806,412，发明名称为＂Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations＂，申请日为2006年6月30 日，通过引用将其全部内容并入本文，该文献公开了小滴微驱动器系统，其 可与本发明的小滴微驱动器方面协同使用。小滴控制系统包括小滴控制软件， 其在计算机1808上运行并被程序化为显示用于控制小滴微驱动器系统功能的 小滴控制界面。方案执行系统包括方案执行软件，其被程序化为有助于执行 一组计算机可执行指令或计算机可用指令，用于控制小滴微驱动器系统功能 以进行流体加载。
8.9.1 控制器
本发明的系统可包括控制器1803。控制器用于提供处理能力，例如存储、 分析、和或执行软件指令。控制器例如可以由具有内存的数字信号处理器 (DSP)、微控制器或特殊用途整合电路(ASIC)组成。合适的DSP处理器的实例 是Analog Devices Blackfin DSP处理器。
控制器电子连接于本发明的各种硬件组分，例如所述小滴微驱动器、任 何传感器、和任何输入和/或输出装置。控制器可以被构造并程序化为控制这 些装置的数据和/或电源方面。例如，对于所述小滴微驱动器，控制器通过启 动/停止电极来控制小滴操控。本发明的这些方面在8.8节进一步讨论。
控制器可进一步电子连接于独立的计算机系统，所述计算机系统包括处 理器、输入和输出装置、数据存储介质、和其他组分。这种设置特别适用于 以下小滴控制系统，其中的计算机系统被程序化为操纵小滴控制用户界面。 在这种设置中，计算机系统的处理器可通过用户界面接收输入并将指令转送 给控制器，以便例如启动/停止电极、读取电极、内存、和/或传感器、和等等。
在方案执行系统中，用于控制系统的软件可直接加载于控制器内并由控 制器执行以便控制器控制所述小滴微驱动器系统功能。在该实施方式中，系 统可自动运行，如作为便携式或手持式系统。
8.9.2 小滴微驱动器
系统可包括小滴微驱动器1804，如8.8节所述。所述小滴微驱动器电子 连接于处理器，使得处理器可控制所述小滴微驱动器的各种操作，例如小滴 操控操作。
8.9.3 传感器
本发明的各种实施方式使用了传感器或检测器1805。传感器可包括连接 于所述小滴微驱动器的传感器，用于测量所述小滴微驱动器上的感兴趣的参 数，例如所述小滴微驱动器上反应产物可能处于的位置处的荧光或发光强度。 传感器还可包括监测系统状态的传感器，例如小滴微驱动器插入式传感器、 盖锁传感器、环境温度传感器等等。来自各传感器的输出可被定位于特定的 内存位置，且处理器必须仅查询被定位的位置以获得来自传感器的读数。传 感器相对于所述小滴微驱动器放置和/或电子连接于所述小滴微驱动器，使得 传感器可检测来自所述小滴微驱动器的信号，例如电或光信号。传感器在本 说明书的其他部分详细讨论，如见8.11节。
8.9.4 输入和输出装置(s)
本发明的系统还包括各种输入装置1806和输出装置1807。在某些实施方 式中，例如方案执行系统，可使用人机界面(HMI)控制器控制某些输入和输出 装置。
8.9.5 软件
本发明的各种系统包括软件。提供在存储介质上的软件是本发明的一个 方面。合适的存储介质实例包括磁存储器、光学存储器、相变内存、全息照 相存储器、分子记忆存储器、电池或电容器-后背SRAM和闪存存储器。软件 可安装于内存和/或处理器中。内存和/或处理器和/或存储介质中有本发明的软 件的系统也是本发明的一个方面。
本发明的软件可以使用各种编程语言写就，例如Visual C、Java和/或 Python。系统可包括解释程序，用于将来自高级语言的小滴操控和其他指令翻 译成中间语言供处理器执行。或者，可使用编译器将根据本发明写就的软件 编译成机器语言。用于本发明的语言的软件解释程序和编译器本身是本发明 的一个新方面。因此，含有所述解释程序和/或编译器的所有形式的数据存储 器、内存、和处理器均为本发明的方面。
系统可以被程序化为执行多种多样的涉及任何数量的小滴操控的方案。 多个小滴可在单个小滴微驱动器上被独立地和同时地操控。能够以平行方式 独立操控多个小滴使得能够将复杂方案作为一系列基本微流体指令而执行。 系统是可升级的，并可以平行的方式控制每个小滴微驱动器的数十、数百、 数千或更多的小滴操控。例如，在任何时候均可以在小滴操作中设置小滴微 驱动器上的每个控制电极的最大值。
系统可以被程序化为使得用户能够输入指令以执行方案。可以根据用户 需要监测并调整已有方案。可以实施复杂方案，其中一或多个步骤的结果决 定如何选择一或多个后续步骤。例如，其中某个测量结果为阳性的小滴可以 被转移用于进一步处理，而结果为阴性的小滴则被丢弃，或反之亦然。
8.9.6 便携性
参照图19A和19B，在一些实施方式中，提供的分析仪是便携式装置， 例如手持式装置1900。图19A所示为手持式装置1900的外部，而图19B所 示为用于插入小滴微驱动器(未显示)的槽1902、用于感测来自所述小滴微驱 动器的光学信号的光学传感器1904和盖锁1906，后者可连接于系统以指示盖 是打开的还是关闭的。可以预见，便携式分析仪也可以是桌面装置。本发明 的小滴微驱动器系统的便携性有助于在门诊、手术室、急诊室、小实验室以 及户外(紧急反应小组、意外事件、灾难、战场、生物恐怖主义地点等等)等各 种各样的条件下实现治疗现场或样品收集现场用途，用于快速诊断，以便为 危急情况争取快速回旋的机会。
8.10 用户界面
小滴控制系统包括小滴控制软件，其被程序化为显示用于在小滴微驱动 器上控制小滴操作，控制传感器，如果有的话，和控制与小滴控制系统相关 的其他硬件的小滴控制界面。系统还可包括软件，用于产生一组软件或计算 机可用指令以便控制小滴微驱动器系统功能，例如小滴操作和/或传感器操作。
如图20所示，系统可包括用户界面2000。关于用户界面的描述可结合美 国专利申请No.60/806,412，发明名称为＂Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations＂，申请日为2006年6月30日，通过引用将其全部内 容并入本文。用户界面可显示小滴微驱动器的图2001，优选地为互动图。图 可与小滴微驱动器直接相互作用，以便操控所述小滴微驱动器上的小滴来进 行本发明的流体加载方案。可以虚拟模式使用该图，以程序化模式操控虚拟 小滴2011以产生并记录用于控制小滴微驱动器功能和相关硬件的子程序。
8.10.1 小滴控制系统和用户界面
小滴控制系统包括小滴控制软件。小滴控制软件被程序化为显示用于在 小滴微驱动器上控制小滴操作，控制传感器，如果有的话，和控制与小滴控 制系统相关的其他硬件的小滴控制界面。小滴控制软件允许用户通过软件驱 动的用户界面操控小滴微驱动器上的小滴。如上所述，这种界面的实例显示 在图20中。其中，用户界面可允许用户浏览小滴微驱动器的信息。用户界面 还便于用户输入指令来控制所述小滴微驱动器及其相关装置例如相关的传感 器等的功能。
对于在小滴微驱动器上控制小滴操作，软件被程序化且系统被构造为用 于，例如，小滴微驱动器上的驱动控制和参比电极以进行小滴操作。小滴操 作，其在以上8.8节进一步讨论过，可通过给选定的电极施加电压而进行。软 件和系统可被构造为允许软件安装在处理器上，以便通过控制与电极相关联 的继电器的运行而控制选定电极的启动。
如图20所示，用户界面2000，其显示在输出装置上，可被程序化为显示 小滴微驱动器设计的图形说明或图2001。图2001可基于限定出各个控制电极 和/或池的位置的矩阵或其他布置图。图的组分可通过外观来区分，例如通过 形状、颜色、亮度、图标等等。例如，在图20给出的图中，停止的小滴操控 电极2002可显示为第一种颜色(例如灰色)，启动的小滴操控电极和池2003可 显示为第二种颜色(例如红色)，而停止的池2004可显示为第三种颜色(例如蓝 色)。
在一个简单的实施方式中，矩阵在控制文件中限定，其标示了每个电极 和/或池的行和列。安装控制文件时，系统读取矩阵定义并在用户界面上显示 相应的矩阵图。
该界面可显示图中组分的信息，这些也可以存储于控制文件中。在一个 实施方式中，系统显示鼠标所指的、选定的、或用户以其他方式电子标出的 组分的信息。显示的信息可以包括，例如，以下信息的部分或全部：
- 组分类型，如小滴操控电极、试剂池、样品池等等；
- 电连接信息，如电极编号、接地线、引出线数量等等；
- 邻近关系，如多边形电极布置；
- 代表性几何学，用于将图呈现至用户界面；
- 设计标注和/或其他意见；
- 零件数；
- 列和/或行的位置。
系统还可记录各个电极的启动历史，这样用户可以跟踪电极已经被启动 过的次数。可以通过，例如，鼠标指向或选定电极而显示历史信息。系统可 以被程序化为接受来自用户的指示同时显示所有电极历史信息的输入。
为便于用户互动，鼠标指向的或选定的电极2002或其他组分也可造成所 述电极或其他组分被突出显示在所述小滴微驱动器图上。这种能力使得正在 直接控制小滴微驱动器操作的用户可以在实际选定并启动所述小滴微驱动器 组分之前，通过用鼠标指向所述小滴微驱动器组分来回顾各个可能的步骤的 信息。系统可以被程序化为以不同方式突出显示鼠标指向的组分以及选定的 组分，这样用户可以对两者加以区分。
系统可包括供用户用于选择操作模式的装置2007，例如选择虚拟或程序 化模式，其中可写下用于控制小滴微驱动器的程序；以及操作模式，其中在 小滴微驱动器上直接控制小滴。
系统可包括供用户选择用来显示小滴微驱动器设计的装置2012。或者， 标示所述小滴微驱动器设计的数据可作为当所述小滴微驱动器组件或筒与系 统偶联后，可供系统存取的所述小滴微驱动器组件或筒的组分而纳入。
应该注意的是，在一些设计中，多于一个的电极可连接于同一个电输出 端。此类设计可简化所述小滴微驱动器的设计。在此类设计中，选择或鼠标 指向来自一总组中的一个电极将导致选定、突出显示并启动该组中的所有电 极。
因此，在一个实施方式中，系统被程序化使得当用户在微驱动器图2001 上选定停止的电极2002时，系统启动该电极。例如，系统被程序化并构造为 使得，在图上点击电极的标识会引起向小滴微驱动器上相应的真实电极施加 电压，由此启动所选定的电极。这样一来，用户可使用该界面直接在小滴微 驱动器上操控小滴。
小滴控制系统可允许用户通过依次点击一系列邻近的电极而转移小滴。 类似地，系统可允许用户通过选定虚拟的显示器上的小滴2011并将小滴拖至 小滴微驱动器图上所需位置的虚拟电极处而转移小滴。此外，系统可允许用 户通过选定虚拟的显示器上的小滴2011，然后点击小滴微驱动器图上所需位 置的虚拟电极处而转移小滴。可通过用户界面类似地控制其他小滴微驱动器 组分。
系统可以被程序化为显示电子连接于小滴微驱动器组分的电控制线2005 的标识，这样，当用户用鼠标指向和/或选择一组分时，系统突出显示其作为 被定位于该组分的结果而被启动的电信号。
可虚拟监测小滴微驱动器，如可使用显微镜和视频捕获装置。用户界面 可被程序化为显示来自视频捕获装置的所述小滴微驱动器的实时图象。此外， 所述小滴微驱动器图可叠加在所述实时小滴微驱动器图象上，使得当用户通 过用户界面与小滴微驱动器互动时，能够观察小滴微驱动器上的小滴操作。
类似地，系统可以被程序化为显示小滴微驱动器图上的虚拟小滴2011， 其显示的是受控于系统的小滴微驱动器上的小滴的真实行为，和/或系统可以 被程序化为显示小滴微驱动器图上的虚拟小滴2011，其显示的是小滴微驱动 器上的小滴的预期行为，即使小滴微驱动器此时并没有直接受控于系统。
系统还可以被程序化为实现＂反向输出＂2006操作。在典型的操作中，小 滴固定地与对地电压/地线相连接。在＂反向输出＂操作中，信号是反向的，使 得小滴处于高电压，而通过将电极设为地电位而启动。换言之，＂反向输出＂ 操作改变了信号的极性。
系统还可促进产生一组软件或计算机可用指令，用于控制所述小滴微驱 动器上的小滴操作以及用于控制小滴微驱动器和有关硬件的其他功能。软件 指令可包括，例如，实施处理和分析样品并输出分析结果的方案的指令。系 统可促进编写程序，用于控制小滴微驱动器和有关组分的功能，例如传感器 组分，而无需与实际的小滴微驱动器相互作用。
系统可以包括，例如，允许用户产生具有一组供小滴微驱动器执行的指 令的程序的装置。合适的指令的实例包括：
-＂on＂，用于鉴别待启动的电极；
-＂frequency＂，设定所述步骤被执行的速度，如电极启动/停止的时间过程；
-＂wait＂，允许指令暂停一段预定的时间；
-＂loop＂，循环程序中的步骤；
-＂voltage＂，设定施加于输出端的电压。
指令可以是字节代码语言，其包括进行小滴操控和控制系统其他方面的 指令。系统准备的指令可以汇编语言记录并汇编为字节代码。字节代码可安 装在本发明的系统中，例如方案执行系统中，用于执行。系统可包括软件解 释程序，用于翻译用于例如在方案执行系统中执行的语言。
在一个优选的实施方式中，系统显示一系列的的按钮或图标2008，其可 用于添加、插入、更新、改变或删除来自子程序的指令。适当的话，按钮或 图标可伴有字段2009，用于输入与指令相关联的参数。例如，通过点击＂add＂ 按钮，可在子程序末尾添加命令。通过点击＂insert＂按钮，可在子程序内部插 入命令。通过点击＂modify＂按钮，子程序中的命令可被改变。通过点击＂delete＂ 按钮，命令可被删除。此外，显示字段2010是可编辑的，其可被纳入用于阅 读、输入和/或编辑代码。
系统可显示小滴微驱动器图上的子程序的激发式执行，其给用户输出视 觉显示的选定命令序列的效果。换言之，在激发式执行模式中，软件执行子 程序的步骤，但不发送电信号至小滴微驱动器。在优选的激发模式中，被激 发的小滴显示在屏幕上以便向用户说明该程序的实际效果。这样一来，用户 可以容易地查明子程序的问题而无需与小滴微驱动器相互作用。
8.10.2 方案执行系统和用户界面
本发明提供方案执行系统。所述方案执行系统包括方案执行软件，其被 程序化为有助于执行一组软件指令，用于加载流体、控制小滴微驱动器上的 小滴操作和/或小滴微驱动器和相关硬件的其他功能。方案执行系统能够在自 立系统上执行方案，典型地是便携式或手持式系统。
方案执行系统被构造为控制小滴微驱动器和任何相关的组分。预程序化 指令可加载至控制器中来控制系统和任何相关的组分。方案执行系统可包括 各种组分，以便允许用户给处理器提供输入和从处理器获得输出。可使用HMI 板促进人机界面。HMI板典型地包括控制器和各种电子组分，例如用于将输 入和输出装置与处理器电子连接的总线和端口。
8.11 传感器
小滴微驱动器和统包括用于测量小滴性质的传感器，例如物理性质、化 学性质和电性质。在一些实施方式中，传感器将包括感测元件，其被设置为 与小滴和/或来自小滴的信号相互作用；换能元件，其将来自传感器的输出转 换为可测量的信号；用于将信号传送至处理器的装置。处理器可将信号转换 为用户可识别的输出。
传感器元件可以是小滴微驱动器的组分，如放置在顶板或底板上、放置 在小滴微驱动器的顶板和底板之间的内部空间内、或制造为小滴微驱动器的 一个整合组分，如顶板或底板的整合组分。在其他实施方式中，传感器元件 可位于小滴微驱动器的外部，但设置在系统内，使得传感器能够接收来自小 滴微驱动器上的信号，如信号来自小滴微驱动器上的小滴。例如，感测光子 的传感器元件可设置为接收来自小滴微驱动器上的小滴的光子。如果系统具 有能够传送来自小滴的光子的顶板，传感器可设置为与顶板邻近用于感测光 子。如果系统的顶板不能传送来自小滴的光子，则可给该顶板提供能够传送 光子的窗口，而传感器可设置为与窗口邻近用于感测光子。
图21A-21D给出了传感器构造的示例，其中传感器可与底板2102、顶 板2104和电极2106相关联。图21A示意了光学传感器，其可包括使用一种 包括LED 2108和光电二极管2110的装置，用于监测吸光度。图21B示意了 发光传感器，其可包括使用光电倍增管(PMT)2112。图21C示意了电位传感 器2114，其典型地基于测定无电流情况下的电位而起作用。图21D示意了电 流传感器2116，其典型地通过当在两个电极之间施加电压时产生电流而起作 用。
重要的是，如本说明书其他部分所述，小滴微驱动器可以是单独的组分， 其可以由用户将其与系统相连接。如果传感器位于小滴微驱动器的外部，在 一些实施方式中，可对齐这些传感器，使得当其连接于小滴微驱动器系统时， 感测元件被适当对齐以便检测来自小滴微驱动器的信号，如光子传感器与小 滴微驱动器上合适的窗口和/或与小滴微驱动器上合适的位置对齐，这些窗口 或位置是小滴方案过程中将进行感测步骤的地方。
在不同的实施方式中，小滴微驱动器和/或系统与传感器组分被构造为使 得能够实施一或多种类型的感测。合适的感测类型的实例包括物理感测、电 化学感测、和光学感测。
8.11.1 物理方法
本发明的小滴微驱动器和/或系统可包括一或多个物理传感器，它们被设 置为用于感测小滴微驱动器上的小滴的性质。物理感测的实例包括温度和小 滴的大小(例如通过对小滴的基底进行热测量)。
8.11.2 电化学方法
本发明的小滴微驱动器系统使用多种光学检测方法。本发明的小滴微驱 动器和/或系统可包括一或多个电化学传感器，它们被设置为用于感测小滴微 驱动器上的小滴的性质。合适的实例电化学感测类型包括电位传感器、电流 传感器、伏安传感器、和电导传感器。传感器的各种组分(例如电极、反电极、 参比电极等等)可提供在同一个或分开的基材上，并设置为允许接触小滴微驱 动器上的小滴。例如，在其中小滴微驱动器包括两个基本上平行的基材的实 施方式中，传感器组件的各种组分可布置在基材之一或两者上。在一些实施 方式中，可使用电路将信号扩增为可测量的电压。这些方法的各个方面在下 文讨论。
8.11.2.1 电流测定传感器
小滴微驱动器装置或系统可包括电流测定传感器和电源，它们被设置为 允许小滴微驱动器上的小滴被转移至与电源和传感器相接触，以便检测流经 小滴的电流。
8.11.2.2 电位测定传感器
小滴微驱动器装置或系统可包括电位测定电极和参比电极，它们被设置 为允许小滴微驱动器上的小滴被转移至与测定电极和参比电极相接触，以便 测量小滴的平衡电极电位。
8.11.3 光学方法
本发明的小滴微驱动器系统使用各种光学检测方法。
本发明的小滴微驱动器和/或系统可包括一或多个光学传感器，它们被设 置为用于感测小滴微驱动器上的小滴的性质。光学感测的实例包括吸光度、 化学发光、和荧光。在一些情况中，光学传感器可伴有合适的光源，如用于 激发荧光或进行吸光度测定。提供的这些传感器可作为放置在小滴微驱动器 上的组分和/或作为小滴微驱动器的整合部分，如可使用半导体制造技术。
光学传感器可包括各种用于检测光学信号的光学器件，并可与各种用于 分析光学图象的图象处理器相连接。例如，通过处理小滴的图象可检测小滴 的大小。类似地，通过测量小滴的热基底可得到小滴大小。还可使用电传感 器来测量小滴大小，如通过测量小滴基底的阻抗。
在一些情况中，可以改进小滴微驱动器的表面以增强光学感测。例如， 可使用具有反射性表面涂层的电极促进小滴的光学测定。使用反射电极增加 吸光度测定的路径长度而且也与反射光谱法相适应。对于自身荧光基材，例 如PCB，可使用涂覆有非荧光涂层的小滴微驱动器表面来提供非荧光检测区。
这些方法的各个方面在下几节讨论。
8.11.3.1 光传感器
小滴微驱动器装置或系统可包括吸光度检测组分，其包括光源和光传感 器，它们被设置为允许将小滴微驱动器上的小滴转移至与所述光源和光传感 器邻近，以便通过光传感器检测经过小滴的光或能量。
小滴微驱动器装置或系统可包括化学发光检测组分，其包括光传感器(例 如光电二极管雪崩光电二极管光电倍增管)或光子传感器(例如光子计数光电 倍增管)，它们被设置为允许将小滴微驱动器上的小滴转移至与所述光传感器 或光子传感器邻近，以便通过光传感器或光子传感器检测由小滴内的化学物 质释放出的光子。
8.11.3.2 荧光传感器
小滴微驱动器装置或系统可包括荧光检测组分，其包括具有合适滤光片 (如果需要的话)的激发光源和光传感器(例如光电二极管、雪崩光电二极管、 光电倍增管)或光子传感器(例如光子计数光电倍增管)，传感器具有合适的滤 光片和分色镜(如果需要的话)，所述组分被设置为允许将小滴微驱动器上的小 滴转移至与所述激发光源和光传感器或光子传感器邻近，以便通过光传感器 或光子传感器检测由小滴内的荧光物质释放出的光子。
8.11.3.3 表面等离子体共振
在另一个实施方式中，使用表面等离子体共振(SPR)感测来检测抗体和任 何靶分析物之间的相互作用。SPR感测可用于检测和定量此类相互作用。典 型地，相互作用物对中的一种相互作用物(即，抗体或分析物)被固定化于玻璃 基材上的SPR-活性金表面。可使用基于小滴的方法固定化该相互作用物，其 中转移小滴使之接触金表面以便将相互作用物沉积在上面。可转移包括另一 种相互作用物的小滴使之接触所述固定化的相互作用物，由此使得所述另一 种相互作用物结合于所述固定化的相互作用物。当光(例如可见光或近红外光) 照过玻璃基材并以接近表面等离子体共振条件的角度和波长照到金表面时， 金的光学反射率根据金表面上存在的生物分子或金上面的薄层涂层中存在的 生物分子而发生极为敏感的变化。由于其涉及靠近金表面的传导电子被高效、 共同地激发，因此光学响应可以高度敏感。通过监测这种反射率的改变，可 以观察并定量溶液相相互作用物与固定化的相互作用物之间的结合程度。本 发明还包括小滴微驱动器，其上包括金表面、和电极路径或网络，电极被设 置为允许执行小滴操控，所述小滴操作足以使小滴接触金表面。此外，本发 明包括系统，其包括此类小滴微驱动器且还包括能够将光照射到所述金表面 的光源，所述光的角度和波长接近表面等离子体共振条件。类似地，本发明 包括系统，其包括这种小滴微驱动器且进一步包括用于检测金表面的反射率 变化的装置。此外，本发明包括小滴微驱动器装置和/或系统，其具有加载于 其上的足以进行SPR方案的一些或全部步骤的试剂。
8.11.3.4 拉曼光谱
在一个实施方式中，小滴微驱动器和/或系统包括拉曼光谱检测能力。总 体上，这种能力包括产生拉曼信号的光源、拉曼信号检测表面、和拉曼分光 光度计。
产生拉曼信号的光源可以是，例如，单色光，如具有可见光波长范围内 的激发波长的激光源。光源被设置为照射小滴微驱动器上的拉曼信号检测表 面。表面可以是，例如，小滴微驱动器的表面和/或小滴微驱动器上的颗粒的 表面。例如，表面可以是小滴微驱动器上的小滴中的颗粒的表面。小滴微驱 动器可具有使用包括此类颗粒的小滴进行小滴操作以便实现各种使用拉曼信 号检测方法方案的能力。
拉曼信号检测表面可包括任何适合于拉曼散射的表面。实例包括金或银 表面。表面可以是粗糙的。在一些情况中，小滴微驱动器可包括多个金属性 表面(例如小滴微驱动器、珠、颗粒、纳米颗粒等等的表面)，包括标记了不同 拉曼报告分子的表面。可通过拉曼报告分子的特征性拉曼光谱鉴定结合于表 面的抗体或分析物。拉曼检测表面可以是，例如，电极、电极上的涂层、或 任何芯片表面上层。在操作中，利用小滴操作使小滴位于拉曼检测表面上， 并以激光束照射。用分光计收集来自被照射表面的散射光。在另一个实施方 式中，拉曼检测表面是小滴微驱动器上的小滴中的颗粒。所述颗粒可以是， 例如，纳米颗粒，例如银或金纳米颗粒。例如，银纳米颗粒可制备为单分散 胶体悬液的形式，其可以在小滴微驱动器上利用小滴操作进行操控。在一些 实施方式中，颗粒可以聚集成簇，可使用聚集添加剂，例如无机盐如氯化钠 或硝酸钠、酸例如硝酸或盐酸或有机胺例如聚-L-赖氨酸。可利用小滴操作将 这些聚集添加剂与包括样品和颗粒的小滴合并，如利用小滴操作合并包括聚 集添加剂的小滴与包括颗粒和样品的小滴。选择与拉曼光谱区相关联的小滴 微驱动器表面以使得背景荧光信号最小化。
拉曼分光光度计被设置为用于检测自样品小滴发射的拉曼散射光。拉曼 分光光度计可与小滴微驱动器整合，设置在小滴微驱动器的外部，其设置方 式使得其能够检测从小滴微驱动器上的样品小滴发射的拉曼散射光。
在操作中，提供小滴微驱动器，其上具有拉曼检测表面。利用小滴操作 使分析物与拉曼检测表面相关联。以产生拉曼信号的光源照射表面。检测与 预期信号有关联的拉曼散射光信号，以便确定分析物的性质和/或量。
在另一个实施方式中，采用表面增强型拉曼散射(SERS)来检测抗体和任 何靶分析物之间的相互作用。总体上，该方法涉及监测样品小滴中由分析物 介导的结合事件，所述小滴包括所述分析物、特异性结合成员、拉曼-活性标 记物，且与表面相接触，例如珠或小滴微驱动器的表面，而且其能够诱导表 面增强型拉曼光散射。样品小滴被辐射照亮，所述辐射足以引起测试混合物 中的拉曼-活性标记物发射可检测的拉曼光谱。所检测到的表面增强型拉曼散 射光谱中的差异依赖于测试混合物中存在的分析物的量。可通过监测拉曼散 射光谱来确定样品小滴中分析物的存在和/或量。本发明包括小滴微驱动器装 置和/或系统，其具有加载于其上的试剂，所述试剂足以进行SERS方案的一 些或全部步骤。
在相关的实施方式中，本发明提供通过监测小滴微驱动器上的分析物-介 导的配体结合事件而确定样品小滴中分析物的存在或量的方法。该方法大体 上包括分析物与连接于拉曼活性标记物的抗体反应。该反应使用小滴微驱动 器上的小滴进行，并在允许抗体与分析物(如果存在的话)特异性结合的条件下 进行，以产生样品小滴中的第一复合物。依次或同时，第一复合物接触能够 诱导表面增强型拉曼光散射并具有连接于其上的特异于所述分析物的抗体的 表面，以形成第二复合物。所述第二复合物被辐射照亮，所述辐射足以引起 复合物中的拉曼-活性标记物产生可检测的拉曼光谱。表面增强型拉曼散射光 谱中的差异代表测试混合物中分析物的存在和/或量。
多种表面可适合于本发明的基于小滴的SERS方案。实例包括粗糙金属电 极、聚集物、膜、不同形态学的金属岛(metal islands)、接近渗透阈值的半连 续膜、和真空脱水的纳米结构金属膜。因此，本发明包括小滴微驱动器，其 包括SERS基材。小滴微驱动器被适当设置，使得小滴可沿电极路径或网络转 移至与SERS基材相接触。
在本发明的DNA检测方法中，可使用拉曼标记物。标记物可以是非序列 特异性嵌入物或共价连接于独特探针序列的特异性标记物。带负电荷的标记 物可能需要使用电荷中和剂，例如精胺，以促进标记物与带负电荷的表面的 结合，后者例如是具有柠檬酸盐表面层的银纳米珠。也可使用聚集剂以改善 信号。精胺也可用作聚集剂。
8.11.3.5 多传感器能力
优选的传感器是用于检测吸光度、荧光、化学发光的传感器以及电位、 电流、和电导传感器。本发明的小滴微驱动器装置和/或系统包括一或多种这 些检测能力。在一个实施方式中，小滴微驱动器包括有助于在单个小滴微驱 动器上进行2或多种这些检测方法的组分。在另一个实施方式中，小滴微驱 动器包括一种检测模块，但系统被程序化为可使用该模块进行多于一种的测 试。在该实施方式中，需要测试的处理好的样品小滴被依次移至测试位置。 因此，如果使用单个传感器，多个样品可在检测点上形成多路。
8.11.4 传感器电子学
检测能力可以传感器板的一或多个组分的形式提供。传感器板可包括一 或多个传感器。传感器板可包括额外的用于调整或放大来自小滴的信号的电 子电路例如放大器、A/D转换器、读出电路等等。传感器板可包括控制元件 或检测方案的其他小滴微驱动器外组分，例如控制用于移动系统组分的电机。
在一个实施方式中，传感器板包括伺服电机控制器，用于控制将磁场源 移至小滴操作表面附近和从小滴操作表面附近移开的伺服电机，由此给小滴 微驱动器施加/移除磁场。这种实施方式可用于操控磁响应性材料。传感器板 还可包括电源元件和通信元件，包括但不限于，用于将所述板的传感器组分 或控制组分电子连接于处理器的元件。
光学检测位置可包括专门的涂层、电极设计、或其他有助于光学检测的 部件。例如，检测点可包括专门的垫和/或便于作为光学测定的背景表面的涂 层。
在某些实施方式中，例如核酸扩增应用，优选的光学检测方法是荧光定 量。在该实施方式中，可选择检测点以便遮蔽微驱动器基材或沉积在微驱动 器基材上的涂层中存在的背景荧光。例如，在一个实施方式中，微驱动器由 印刷电路板基材组成，而检测点由金垫组成，所述垫为传感器遮蔽了基材的 背景荧光，这有助于对置于垫上的小滴进行荧光测定。垫可以在直接布置于 基材上的金属层内形成，或者在布置于在基材上布置的中间层上的金属层内 形成。
优选地，金属层(垫形成于其中)应该被布置在任何呈现明显背景荧光的层 的上方。在一个实施方式中，垫直接布置在印刷电路板基材上，该基材在与 控制小滴的电极形成于同一金属层内。在该实施方式中，介电材料(其也可呈 现背景荧光)可布置在金属层上方，但其被选择性地从检测垫处(而非控制电极 处)移除。
因此，通过选择性移除检测垫上方的荧光材料和光学遮蔽位于垫下方的 荧光材料这种组合而实现低背景荧光检测点。优选地，垫被设计为最小程度 干扰其他的小滴微驱动器功能。在上述实施方式中，垫可与控制电极形成于 同一金属层内，但与控制电极分开，且在电方面与之不同。因此垫
8.11.5 检测方法
本发明提供多种用于感测/检测小滴的信号或特征的方法。本说明书在其 他部分描述了很多这些方法。本节描述可用于各种情况下的额外的方法。
本发明的小滴微驱动器方法的优势包括能够使特定测定法中的反应步骤 去偶联。许多生化测定使用共同的终反应以产生颜色、光、或其他可检测的 量。可使用本发明的基于小滴的方案将测定小滴与含有终反应试剂的小滴在 检测现场相组合。测定步骤的去偶联允许各步骤被分开进行优化，而当反应 步骤之一是限速步骤时，步骤在时间上的分开提供了更大的灵活性。例如， 化学发光测定通常在碱性pH具有更好的结果。对于最佳条件在酸性pH的测 定而言，测定反应可先在酸性pH完成，而反应的发光方面则可以在碱性pH 进行。
本发明的小滴微驱动器可用于研究速度动力学反应。可周期性地从反应 正在进行的池中分配样品小滴。随后小滴可被个别地进行分析以确定反应的 时间过程。可对小滴进行实时分析，或与另一种试剂混合用于以后分析。还 可使用电润湿来快速混合小滴以便研究快速反应动力学。
可测量小滴粘度的改变用作评价小滴内部化学反应状态的手段。例如， 可向血液小滴内加入凝血剂，随后转移小滴并监测小滴转移的容易度。凝结 程度越高则小滴转移越发困难，可对此加以检测并用作凝结程度的测量法。
优选的传感器包括用于感测光学信号例如吸光度、荧光、和化学发光的 光学传感器、和用于感测电化学性质例如电位性质、电流性质、电导性质的 电化学传感器。因此，本发明的小滴微驱动器系统包括被设置为有助于检测 一或多种这些性质的组分。在一个实施方式中，在单个小滴微驱动器上的一 或多个小滴上检测2或更多种这些性质，或者可使用单个小滴微驱动器系统 来实现这些目的。在另一个实施方式中，小滴微驱动器包括一种特定类型的 传感器，且系统被程序化为使用所述传感器进行一或多种测试。在该实施方 式中，需要测试的处理好的样品小滴被依次移至测试位置，即移至足够接近 必要的传感器的地方以便能够进行检测。因此，多个样品可在检测点上形成 多路，用于使用单个传感器的检测。使用这种方法，可将多个传感器类型提 供于单个小滴微驱动器上。
在一些实施方式中，小滴微驱动器系统可被构造为将小滴或样品沉积到 小滴微驱动器外部的位置处用于检测。例如，可将包括(或可能包括)分析物的 小滴沉积到基材上用于MALDI-TOF分析。
小滴可被周期性转移通过合适的传感器附近的共同检测点以便同时监测 多个反应。例如，小滴微驱动器可包括两个或更多个连接流通PCR反应室内 的高和低温度区的＂道＂。单个检测器位于这些道的交叉点。安排好小滴通行的 时间，使得小滴依次通过所述检测点。
适合在本发明的小滴微驱动器上的本发明的基于小滴的方案中实施的测 定法实例包括光学测定，例如吸光度测定、荧光测定、生物发光测定和化学 发光测定；和电化学测定，例如电位测定、电流测定、和电导测定。例如， 可使用一或多种前述测定类型的各种组合来鉴定和/或定量一或多种分析物， 例如蛋白质、酶、核酸、代谢物、电解质、气体(例如血气)和红细胞压积。本 发明的系统可被程序化为在在单个小滴微驱动器上进行这些测定类型的各种 组合。
在一个实施方式中，单个小滴微驱动器或系统包括进行2、3、4、5、6 或更多种不同类型测定的检测能力。例如，小滴微驱动器装置、系统和/或小 滴微驱动器系统的其他组分可分开地或一起包括一或多种检测组分，例如用 于电流测定、电位测定、电导测定、吸光度、化学发光、荧光、和/或温度的 组分。此外，小滴微驱动器系统可被程序化为实施用于在同一或多个样品或 样品类型上进行2、3、4、5、6或更多种不同类型测定的测定方案。
在小滴微驱动器内，小滴操控组分和检测组分在一些实施方式中可以通 过被提供于分开的基材上而去偶联。类似地，各种检测组分可作为小滴微驱 动器装置或系统的部分而提供，但在不同的小滴微驱动器上。因此，例如， 传感器可以在筒上，而小滴微驱动器与筒连接。偶联被设置为使得当小滴微 驱动器连接于筒时，合适的组分被对齐以便进行检测。因此，例如，光子传 感器可对齐窗口或其他透明基材，使得当小滴微驱动器被适当放置于筒上时， 从小滴微驱动器上的小滴发射出的光子可通过窗口或基材被子传感器检测 到。类似地，如果光源对于小滴微驱动器上的小滴中的分子发出荧光是必需 的，则光源可以放置在筒或小滴微驱动器装置或系统的其他组分上并对齐， 使得光源可到达小滴以产生所需的荧光。
在一个实施方式中，小滴微驱动器包括用于进行电化学的电极。电极可 被排布在电润湿基材上，以便对与电极相接触的小滴进行电化学测量。在双 基材小滴微驱动器中，可在任一或两种基材上形成用于进行电化学的电极。 在一些实施方式中，转移电极和电化学测量电极被提供在不同基材上。电极 可包括用于构建离子选择性分析的膜。
8.12 其他方法
本发明包括方法，其中出于交易原因向顾客提出或提供台式系统 (bench-top system)的组分。在一个实施方式中，被提出或被提供给顾客的组分 不包括PC。本发明的软件可在存储介质上提供给用户或可自网络下载，例如 互联网。用户可获得系统的其他组分，将这些组分连接于PC，在PC上安装 软件，并因此组装本发明的系统。
本发明包括方法，其中使用台式系统产生用于执行方案的代码。代码上 传至分开的系统，例如便携式或手持式系统，其出于交易原因而被提出或被 提供给顾客。用户可使用系统来执行方案。
本发明还包括方法，其中通过网络远程实现程序化和/或系统控制，例如 通过电话系统或互联网。因此，例如，系统可以被出售给用户，程序员可借 助于通过互联网显示的用户界面连接到系统以便控制系统，使用系统产生程 序，将程序安装到系统上、和/或在系统上修复程序。作为另一个实例，本发 明包括一种方法，其中远程用户通过网络使用小滴微驱动器，并在系统上进 行一或多种小滴操控。
8.13 试剂盒
本发明的另一个方面是试剂盒，其包括试剂、样品收集装置、和/或用于 进行本发明的方法的小滴微驱动器或筒。
8.14 总结
前面参照附图详细描述了一些实施方式，这些附图举例说明了本发明的 一些具体实施方式。具有不同结构和操作的其他实施方式并未脱离本发明的 范围。
本领域人员可以理解，本发明可以作为方法、系统、或计算机程序产品 而实施。因此，本发明的形式可以是全硬件实施方式、全软件实施方式(包括 固件、常驻软件、微代码等等)或组合软件和硬件方面的实施方式，它们在此 总体上均可以被称为＂电路＂、＂模块＂或＂系统＂。此外，本发明的形式可以是具 有包含在介质中的计算机可用的程序代码的计算机可用的存储介质上的计算 机程序产品。
可以使用任何合适的计算机可用的介质。计算机可用的或计算机可读的 介质可以是，例如但不限于，电子、磁、光学、电磁、红外、或半导体系统、 设备、装置、或传播介质。更具体的计算机可读的介质的实例(非穷举列表) 可包括以下的一些或全部：具有一或多种线的电联系、便携式计算机磁盘、 硬盘、随机存取内存(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦可编程只读存储器 (EPROM或闪存)、光学纤维、便携式致密盘只读存储器(CD-ROM)、光学存 储装置、传送介质例如支持互联网或局域网的传送介质、或磁存储装置。注 意，计算机可用的或计算机可读的介质可以甚至是纸张或另一种合适的介质， 其上印有程序，由于程序可被电子地捕获，例如通过光学扫描纸张或其他介 质，然后编译、翻译、或以其他合适的方式处理，如果必要的话，然后存储 于计算机存储器内。就本文件而言，计算机可用的或计算机可读的介质可以 是任何可含有、存储、传送、传播、或转移程序用于通过指令执行系统、设 备、或装置而使用或与指令执行系统、设备、或装置相关联而使用的介质。
用于实施本发明的操作的计算机程序代码可以面向对象的编程语言例如 Java、Smalltalk、C++或类似语言写就。不过，用于实施本发明的操作的计算 机程序代码也可以常规的程序编程语言例如＂C＂编程语言或类似编程语言写 就。程序代码全部在用户计算机上运行、部分在用户计算机上运行、作为孤 立的软件包、部分在用户计算机上运行且部分在远程计算机上运行或全部在 远程计算机或服务器上运行。对于后一种情况，远程计算机可通过局域网(LAN) 或宽区域网络(WAN)连接于用户计算机，或可以连接到外部计算机(例如，通 过互联网可使用互联网服务提供商)。
已经根据本发明的实施方式的方法、设备(系统)和计算机程序产品参照流 程图说明和/或方块图描述了本发明。应该理解，流程图说明和/或方块图中的 各个方块、和流程图说明和/或方块图中的方块的组合，可通过计算机程序指 令实施。计算机程序指令可被提供给通用计算机的处理器、特殊用途计算机、 或其他可编程的数据处理设备，以产生机器，使得通过计算机或其他可编程 的数据处理设备的处理器而执行的指令产生装置，用于实施流程图和/或方块 图的一或多个方块所指出的功能/行动。
这些计算机程序指令还可存储在计算机可读的存储器内，其指导计算机 或其他可编程的数据处理设备按照特定方式行使功能，使得存储于计算机可 读的存储器内的指令产生制造物品，其包括实施流程图和/或方块图的一或多 个方块所指出的功能/行动的指令装置。
计算机程序指令还可安装到计算机或其他可编程的数据处理设备上以使 得一系列操作步骤得以在计算机或其他可编程的设备上进行，以便产生计算 机实施的方法，使得在计算机或其他可编程的设备上执行的指令提供用于实 施流程图和/或方块图的一或多个方块所指出的功能/行动的步骤。
为了方便读者，本说明书被拆分为多个章节。小标题不应该被理解为是 对本发明的范围的限制。
应该理解，本发明的各种细节可以改变而并未脱离本发明的范围。此外， 前面的说明仅仅是用于阐述本发明，而无意于限制本发明，本发明由所附权 利要求书限定。
基金信息
本发明的工作至少部分得到XXX基金第YYY号的资助。美国政府在本 发明中享有一定权益。
相关申请
本申请涉及如下美国临时申请并通过引用将它们并入本文：60/744,780， 发明名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based Protein Crystallization＂， 申请日为2006年4月13日；60/745,058，发明名称为＂Filler Fluids for Droplet-Based Microfluidics＂，申请日为2006年4月18日；60/745,049，发明 名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based Protein Crystallization＂，申请 日为2006年4月18日；60/745,039，发明名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based Blood Chemistry＂，申请日为2006年4月18日；60/745,073，发 明名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based PCR＂，申请日为2006年4 月18日；60/745,059，发明名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based Immunoassay＂，申请日为2006年4月18日；60/745,914，发明名称为＂Apparatus and method for Manipulating Droplets with a Predetermined Number of Cells＂，申 请日为2006年4月28日；60/745,950，发明名称为＂Apparatus and Methods of Sample Preparation for a Droplet Microactuator＂，申请日为2006年4月28日； 60/746,797，发明名称为＂Portable Analyzer Using Droplet-Based Microfluidics＂， 申请日为2006年5月9日；60/746,801，发明名称为＂Apparatus and Methods for Droplet-Based Immuno-PCR＂，申请日为2006年5月9日；60/745,054，发明 名称为＂Droplet-Based Multi-Well Plate＂，申请日为2006年4月18日； 60/806,400，发明名称为＂Droplet Microactuator Stamping Platform＂，申请日为 2006年6月30日；60/806,412，发明名称为＂Systems and Methods for Droplet Microactuator Operations＂，申请日为2006年6月30日；60/807,104，发明名 称为＂Method and Apparatus for Droplet-Based Nucleic Acid Amplification＂，申请 日为2006年7月12日。