一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法
阅读：1014发布：2020-11-22
专利汇可以提供一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 生物 领域，具体地说是一种骨组织工程用多孔复合 支架 及其制备方法。本发明提供的骨组织工程用多孔复合支架为羟基 磷灰石 /纳米微晶 纤维 素/丝素蛋白多孔支架，是由羟基磷灰石、纳米微晶 纤维素 、丝素蛋白组成的三维多孔复合支架，孔隙率为90～95％，孔径为180～220μm。本发明羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架，羟基磷灰石和纳米微晶纤维素均匀分布于支架中， 力 学性能优良，而且该支架具有良好的 生物相容性 ，能够支持和促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。本发明制备工艺简单、材料来源广泛，生产效率高，成本低，可应用于工业化大生产。，下面是一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种用于骨组织工程用多孔复合支架的方法，其特征在于：所述骨组织工程用多孔复合支架为羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架，是由羟基磷灰石、纳米微晶纤维素、丝素蛋白组成的三维多孔复合支架，孔隙率为90～95％，孔径为180～220μm；
所述羟基磷灰石为针状，粒径为10～100nm；
所述纳米微晶纤维素为呈规整的短棒状结构，其长度为150-350nm，宽度为20-40nm；
所述方法包括以下步骤：
(1)将蚕茧剪碎，然后加入80-100℃、浓度为0.2wt％NaCO3水溶液中煮2-4h进行脱胶形成丝素，蚕茧与NaCO3水溶液的比例为：2-5g蚕茧加入100ml、0.2wt％NaCO3水溶液，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性；
(2)重复步骤(1)；
(3)将步骤(2)洗至中性的丝素于40-60℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，40～60℃水浴加热4～6h后用去离子水透析3～4天，离心两次，得到2～10wt％丝素蛋白溶液；
(4)将羟基磷灰石、纳米微晶纤维素加入2～10wt％丝素蛋白溶液中，混合的比例为：每毫升丝素蛋白溶液加入30mg羟基磷灰石、30mg纳米微晶纤维素搅拌均匀，然后冷冻干燥，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。
2.根据权利要求1所述的一种骨组织工程用多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述的蚕茧为去蛹的蚕茧；
3.根据权利要求1所述的一种骨组织工程用多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述的透析过程采用截留分子量为10000～12000的透析袋进行透析。
4.根据权利要求1所述的一种骨组织工程用多孔复合支架的制备方法，其特征在于：所述的离心的条件为于25℃、10000r/min条件下离心5-15min。
5.根据权利要求1所述的一种骨组织工程用多孔复合支架的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻干燥的条件为-50--70℃冷冻干燥18-24h。
一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 骨是人体的支架，对人体起着保护和支持作用，而在运动中起杠杆作用。骨膜、骨质和骨髓是构成骨的三大部分。但是，骨缺损是临床上的常见病，据统计，我国每年因疾病、创伤、肿瘤等造成的骨缺损病人超过100万，大范围骨缺损的修复目前仍是骨科治疗的难题之一。虽然骨具有再生和自修复的能力，但是单纯靠自我修复，缺损部位往往很难自我愈合。在这种情况下，则需要进行治疗。目前，治疗骨缺损的方法有骨移植、人工骨移植替代材料和组织工程技术等。其中，组织工程学组织具有来源不受限、可预先设计形状、低抗原性和具有生命力等优点。另外，应用骨组织工程技术治疗骨缺损可以克服自体骨移植供体不足和异体骨移植免疫排斥等缺点。因此，利用骨组织工程学来进行骨修复是治疗骨缺损的热点。
[0003] 丝素蛋白(Silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的一种疏水性的天然高分子纤维蛋白质，由18种氨基酸组成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占其总组成的80％以上。丝素蛋白来源丰富，成本低廉，具有力学性能优异，结构稳定，良好的生物相容性和可加工性的优点，是一种优良的天然的高分子材料。基于丝素蛋白这些优点，越来越多地用作骨组织工程支架材料。但是由于丝素蛋白本身没有骨诱导和骨传导的作用，对骨缺损的修复有所限制，因此，制备一种具有骨诱导和骨传导能力的丝素蛋白多孔支架，作为骨修复组织工程材料，是本专利的目的。
[0004] 羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)属于钙磷陶瓷，由于它与骨里面的无机成分非常相似，在骨组织工程中是一种重要的生物陶瓷。羟基磷灰石具有良好的生物相容性，生物活性，、骨传导性和骨诱导性，经常用于牙修复，骨修复和矫形修复。但是，羟基磷灰石不易被吸收且脆性大，限制了其在骨组织工程中的应用。因此，必需研发一种新的载药体系，使得羟基磷灰石能够顺利地应用在骨组织工程中。
[0005] 纳米微晶纤维素(Nanocrystal Cellulose,CNC)，是由天然纤维素或微晶纤维素通过化学，物理或者生化的方法制备而得，纳米微晶纤维素不但具有纳米微粒的相关性质例如：较大的比表面、高强度和高结晶度；还具备了纤维素的基本结构与特性，例如：无毒性、生物相容性和可降解性等特点；另外，纳米纤维素一般在复合物当中充当的角色是补强填料，以提高复合物的热稳定性及机械性能。而且，纳米微晶纤维素中含有丰富的羟基，加入复合物中，能够改善复合物的亲水性能。
[0006] 近年来，利用丝素蛋白作为三维支架，在骨组织工程应用和研究成为了热点。有研究表明，用丝素蛋白作为骨修复材料，用于裸鼠颅骨缺损获得了比较好的修复效果；而纳米纤维素一般在复合物当中充当的角色是补强填料，以提高复合物的热稳定性，亲水性及机械性能。另一方面，如何改善羟基磷灰石不易被吸收且脆性大的缺点，也是研究人员所关注的问题。
发明内容
[0007] 本发明针对上述存在的问题，提供一种力学性能优良、具有良好的生物相容性的骨组织工程用多孔复合支架。
[0008] 本发明是这样实现的：
[0009] 一种骨组织工程用的多孔复合支架，其特征在于：所述骨组织工程用多孔复合支架为羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架，是由羟基磷灰石、纳米微晶纤维素、丝素蛋白组成的三维多孔复合支架，孔隙率为90～95％，孔径为180～220μm。
[0010] 优选的，所述的羟基磷灰石为针状，粒径为10～100nm。
[0011] 优选的，纳米微晶纤维素为呈规整的短棒状结构，其长度为150-350nm，宽度为20-40nm。
[0012] 本发明的另一目的是提供上述骨组织工程用的多孔复合支架的方法：
[0013] 所述方法包括以下步骤：
[0014] (1)将蚕茧剪碎，然后加入80-100℃、浓度为0.2wt％NaCO3水溶液中煮2-4h进行脱胶形成丝素，蚕茧与NaCO3水溶液的比例为：2-5g蚕茧加入100ml、0.2wt％NaCO3水溶液，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性；
[0015] (2)重复步骤(1)；
[0016] (3)将步骤(2)洗至中性的丝素于40-60℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，40～60℃水浴加热4～6h后用去离子水透析3～4天，离心两次，得到2～10wt％丝素蛋白溶液；
[0017] (4)将羟基磷灰石、纳米微晶纤维素加入2～10wt％丝素蛋白溶液中，混合的比例为：每毫升丝素蛋白溶液加入0质量，然后冷冻干燥，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。
[0018] 优选的，步骤(2)所述的每毫升丝素蛋白溶液加入羟基磷灰石和纳米微晶纤维素的量均为30mg。
[0019] 进一步，所述的蚕茧为去蛹的蚕茧；
[0020] 优选的，所述的透析过程采用截留分子量为10000～12000的透析袋进行透析。
[0021] 优选的，所述的离心的条件为于25℃、10000r/min条件下离心5-15min。
[0022] 优选的，步骤(2)中所述的冷冻干燥的条件为-50～-70℃冷冻干燥18-24h。
[0023] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0024] (1)本发明羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架，羟基磷灰石和纳米微晶纤维素均匀分布于支架中，力学性能优良，而且该支架具有良好的生物相容性，能够支持和促进骨髓间充质干细胞的成骨分化；
[0025] (2)该复合多孔支架具有孔隙率高(90-95％)、孔径均匀(180-220um)的优点；
[0026] (3)本发明将羟基磷灰石、纳米微晶纤维素和丝素蛋白溶液混合，通过冷冻干燥的方法，形成羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架，制备工艺简单、材料来源广泛，生产效率高，成本低，可应用于工业化大生产。附图说明
[0027] 图1是实施例1的羟基磷灰石的形貌图，其中图1a为羟基磷灰石的扫描电镜图，图1b羟基磷灰石的透射电镜图；
[0028] 图2是实施例1的纳米微晶纤维素的透射电镜图；
[0029] 图3是对比实施例1的丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图；
[0030] 图4是对比实施例2的纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图；
[0031] 图5是对比实施例3的羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图；
[0032] 图6是实施例1的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图；
[0033] 图7是对比实施例1的丝素蛋白多孔支架、对比实施例2的纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架、对比实施例3的羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架和实施例1的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的细胞毒性图，其中：SF为对比实施例1的丝素蛋白多孔支架细胞毒性图；CNC/SF为比实施例2的纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架细胞毒性图；HA/SF为对比实施例3的羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架细胞毒性图；HA/CNC/SF为实施例1的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的细胞毒性图；
[0034] 图8是对比实施例1的丝素蛋白多孔支架、比实施例2的纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架、对比实施例3的羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架和实施例1的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的骨髓间充质干细胞增殖分化图；其中：SF为对比实施例1的丝素蛋白多孔支架的骨髓间充质干细胞增殖分化图；CNC/SF为比实施例2的纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架骨髓间充质干细胞增殖分化图；HA/SF为对比实施例3的羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架骨髓间充质干细胞增殖分化图；HA/CNC/SF为实施例1的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的骨髓间充质干细胞增殖分化图。
[0035] 具体实施案例
[0036] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0037] 实施例1
[0038] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将2.5g的蚕茧加入100ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液中进行脱胶形成丝素，在100℃条件下煮2h。脱胶后用去离子水清洗丝素至中性；
[0039] (2)再重复上述步骤一次；
[0040] (3)将洗至中性的丝素于50℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，50℃水浴加热6h后用去离子水透析4天(透析袋的截留分子量为
8000，每天换水一次)，然后于25℃、10000r/min离心10min，离心两次，得到浓度为4wt％的丝素蛋白溶液；
8000，每天换水一次)，然后于25℃、10000r/min离心10min，离心两次，得到浓度为4wt％的丝素蛋白溶液；
[0041] (4)将加入30mg羟基磷灰石，30mg纳米微晶纤维素加入1ml步骤(3)的4wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。从图1和图2可知，羟基磷灰石为针状，粒径为10～100nm；纳米微晶纤维素为呈规整的短棒状结构，其长度约为150-350nm，宽度约为20-40nm。羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图如图6所示。从图6可以知道，该复合支架具有孔隙率高(90-95％)，孔径均匀(180-220um)，羟基磷灰石和纳米微晶纤维素均匀分布于支架中。
[0042] (5)将步骤(4)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化、离心条件为：5min、1500rpm，去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0043] 在96孔板中，每孔加入100μL MTT溶液，置于37℃培养箱中继续孵育4h。用镊子取出上面所得到复合支架放入到2mL离心管中，加入1mL DMSO，吹打至结晶物完全溶解。吸取200μL加入酶标板中，在酶标仪(Bio-Rad 550)上测定570nm的吸光度。如图7所示，羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架中的细胞数量随着时间的延长而增加，而且增加的量是四种支架中最多的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架具有良好的生物相容性。
[0044] (6)将步骤(4)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化、离心条件为：5min、1500rpm，去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，24h后换为含地塞米松培养基(含10％FCS、50mM的抗坏血酸，10mMβ-磷酸甘油二钠和100nM地塞米松的高糖DMEM)，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0045] 将样品从培养板中取出，PBS清洗3次后，加入100μL细胞裂解液，4℃裂解过夜，超声破碎。加入500μL碱性磷酸酶底物反应液，37℃水浴反应30min后，加入0.1M的NaOH溶液500μL终止反应，立即在紫外-可见光分光光度计测定405nm处的吸收值。如图8所示，羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性随时间延长不断增加，且增加的量是四种支架中最多的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架能够支持骨髓间充质干细胞的增殖和分化。
[0046] 实施例2
[0047] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将5g的蚕茧加入100ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液中进行脱胶形成丝素，在80℃条件下煮4h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性；
[0048] (2)再重复上述步骤一次；
[0049] (3)将洗至中性的丝素于40℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，40℃水浴加热6h后用去离子水透析3天(透析袋的截留分子量为
8000，每天换水2次)，然后于25℃、10000r/min离心5min，离心两次，得到浓度为10wt％的丝素蛋白溶液；
8000，每天换水2次)，然后于25℃、10000r/min离心5min，离心两次，得到浓度为10wt％的丝素蛋白溶液；
[0050] (4)将加入60mg羟基磷灰石，60mg纳米微晶纤维素加入1ml步骤(3)的10wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃冷冻干燥18h，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。
[0051] 实施例3
[0052] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将2g的蚕茧加入100ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液中进行脱胶形成丝素，在90℃条件下煮3h。脱胶后用去离子水清洗丝素至中性；
[0053] (2)再重复上述步骤一次；
[0054] (3)将洗至中性的丝素于60℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，60℃水浴加热4h后用去离子水透析4天(透析袋的截留分子量为
8000，每天换水一次)，然后于25℃、10000r/min离心15min，离心两次，得到浓度为2wt％丝素蛋白溶液；
8000，每天换水一次)，然后于25℃、10000r/min离心15min，离心两次，得到浓度为2wt％丝素蛋白溶液；
[0055] (4)将加入5mg羟基磷灰石，5mg纳米微晶纤维素加入1ml步骤(3)的2wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-70℃冷冻干燥24h，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。
[0056] 对比实施例1
[0057] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将5g的蚕茧加入200ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液脱胶形成丝素，100℃中煮3h，脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，然后再重复上述步骤一次，最后就洗至中性的丝素于50℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，50℃水浴加热6h后用去离子水透析4天(透析袋的截留分子量为8000)，其中每天换水两次，然后于25℃、10000r/min离心10min，离心两次，得到浓度为4wt％的丝素蛋白溶液；
[0058] (2)将步骤(1)所得的4wt％丝素蛋白溶液，于-60℃冷冻干燥24h，得到丝素蛋白多孔支架。丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图如图3所示。从图3可以知道，该复合支架具有孔隙率为80-90％，孔径为200-300um。
[0059] (3)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化、离心条件为：5min，1500rpm、去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，在37℃培养箱中培养至所需时间，隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0060] 在96孔板中，每孔加入100μL MTT溶液，置于37℃培养箱中继续孵育4h。用镊子取出上面所得到复合支架放入到2mL离心管中，加入1mL DMSO，吹打至结晶物完全溶解。吸取200μL加入酶标板中，在酶标仪(Bio-Rad 550)上测定570nm的吸光度。如图7所示，丝素蛋白多孔支架中的细胞数量随着时间的延长而增加，但是对比实施例1制备的丝素蛋白多孔支架是最低的，本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架具有最好的生物相容性。
[0061] (4)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化，离心条件为：5min、1500rpm，去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，24h后换为含地塞米松培养基(含10％FCS、50mM的抗坏血酸，10mMβ-磷酸甘油二钠和100nM地塞米松的高糖DMEM)，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0062] 将样品从培养板中取出，PBS清洗3次后，加入100μL细胞裂解液，4℃裂解过夜，超声破碎。加入500μL碱性磷酸酶底物反应液，37℃水浴反应30min后，加入0.1M的NaOH溶液500μL终止反应，立即在紫外-可见光分光光度计测定405nm处的吸收值。如图8所示，丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性随时间延长不断增加，且增加的量是四种支架中最低的，但是本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性是最高的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架能够支持骨髓间充质干细胞的增殖和分化，且效果是最好的。
[0063] 对比实施例2
[0064] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将5g的蚕茧加入200ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液，在100℃下煮3h进行脱胶形成丝素。脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，然后再重复上述步骤一次，最后就洗至中性的丝素于50℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，50℃水浴加热6h后用去离子水透析4天(透析袋的截留分子量为8000)，其中每天换水两次，然后于25℃、10000r/min离心10min，离心两次，得到浓度为4wt％的丝素蛋白溶液；
[0065] (2)将加入60mg纳米微晶纤维素加入1ml步骤(1)的4wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图如图4所示。从图4可以知道，该复合支架的孔隙率为80-90％，孔径为200-250um，纳米微晶纤维素均匀分布于支架中。
[0066] (3)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化、离心条件为：5min，1500rpm、去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0067] 在96孔板中，每孔加入100μL MTT溶液，置于37℃培养箱中继续孵育4h。用镊子取出上面所得到复合支架放入到2mL离心管中，加入1mL二甲基亚砜(DMSO)，吹打至结晶物完全溶解。吸取200μL加入酶标板中，在酶标仪(Bio-Rad 550)上测定570nm的吸光度。如图7所示，纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架中的细胞数量随着时间的延长而增加，但是本专利实施例1制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的细胞量是最多的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架具有最好的生物相容性。
[0068] (4)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化，离心条件为：5min、1500rpm，去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，24h后换为含地塞米松培养基(含10％FCS、50mM的抗坏血酸，10mMβ-磷酸甘油二钠和100nM地塞米松的高糖DMEM)，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0069] 将样品从培养板中取出，PBS清洗3次后，加入100μL细胞裂解液，4℃裂解过夜，超声破碎。加入500μL碱性磷酸酶底物反应液，37℃水浴反应30min后，加入0.1M的NaOH溶液500μL终止反应，立即在紫外-可见光分光光度计测定405nm处的吸收值。如图8所示，纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性随时间延长不断增加，但是本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性是最高的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架能够支持骨髓间充质干细胞的增殖和分化，且效果是最好的。
[0070] 对比实施例3
[0071] (1)将去蛹的蚕茧剪碎，将5g的蚕茧加入200ml、浓度为0.2wt％的NaCO3水溶液，在100℃下煮3h进行脱胶形成丝素。脱胶后用去离子水清洗丝素至中性，然后再重复上述步骤一次，最后就洗至中性的丝素于50℃烘干，得到丝素蛋白；取丝素蛋白，加入浓度为9.8mol/L溴化锂水溶液中，50℃水浴加热6h后用去离子水透析4天(透析袋的截留分子量为8000)，其中每天换水两次，然后于25℃、10000r/min离心10min，离心两次，得到浓度为4wt％的丝素蛋白溶液；
[0072] (2)将加入60mg羟基磷灰石加入1ml步骤(1)的4wt％丝素蛋白溶液中，搅拌均匀，-60℃冷冻干燥24h，得到羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架。羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架的扫描电镜图如图5所示。从图5可以知道，该复合支架的孔隙率为70-
85％，孔径为150-180um，羟基磷灰石均匀分布于支架中。
85％，孔径为150-180um，羟基磷灰石均匀分布于支架中。
[0073] (3)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化，离心条件为：5min、1500rpm，去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0074] 在96孔板中，每孔加入100μL MTT溶液，置于37℃培养箱中继续孵育4h。用镊子取出上面所得到复合支架放入到2mL离心管中，加入1mL DMSO，吹打至结晶物完全溶解。吸取200αL加入酶标板中，在酶标仪(Bio-Rad 550)上测定570nm的吸光度。如图7所示，羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架中的细胞数量随着时间的延长而增加，但是本专利实施例1制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架的细胞量是最多的，表明本方法制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架具有最好的生物相容性。
[0075] (4)将步骤(2)所得到的多孔支架进行紫外灭菌后，放入496孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将前成骨细胞MC3T3-E1从培养盘消化、离心条件为：5min，1500rpm、去除上清夜后，加入浓度为10％的胎牛血清的新鲜α-MEM培养基，将细胞悬液浓度调节为2.5×106/mL。然后将10μL细胞悬液加入多孔支架中，孵化2h后，每孔加入100μL培养基，24h后换为含地塞米松培养基(含10％FCS、50mM的抗坏血酸，10mMβ-磷酸甘油二钠和100nM地塞米松的高糖DMEM)，在37℃培养箱中培养至所需时间。隔天换液，以保持细胞的营养供应。
[0076] 将样品从培养板中取出，PBS清洗3次后，加入100μL细胞裂解液，4℃裂解过夜，超声破碎。加入500μL碱性磷酸酶底物反应液，37℃水浴反应30min后，加入0.1M的NaOH溶液500μL终止反应，立即在紫外-可见光分光光度计测定405nm处的吸收值。如图8所示，羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性随时间延长不断增加，但是本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架上细胞的碱性磷酸酶活性是最高的，表明本专利制备的羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白多孔支架能够支持骨髓间充质干细胞的增殖和分化，且效果是最好的。
[0077] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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