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调节免疫细胞的方法和组合物

阅读：119发布：2023-01-22

专利汇可以提供调节免疫细胞的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的特征在于可以结合并调节期望的免疫细胞(例如T细胞)群体的水凝胶复合物。在某些实施方案中，所述复合物可以溶解，且由此与其靶细胞解离，代表用于处理免疫细胞(例如T细胞)用于临床用途的安全且有效的方法。本发明还提供了用于合成水凝胶复合物的方法和设备，以及使用该复合物来生成扩增的免疫细胞(例如T细胞)群体作为过继性免疫细胞(例如T细胞)疗法系统的一部分的方法。，下面是调节免疫细胞的方法和组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.包含复合物的颗粒，所述复合物包含水凝胶和结合部分，其中：
(a)所述水凝胶包含聚合物；且
(b)所述结合部分被配置为结合免疫细胞的细胞表面组分。
2.权利要求1的颗粒，其中所述聚合物包含天然聚合物。
3.权利要求2的颗粒，其中所述天然聚合物选自藻酸盐、琼脂糖、角叉菜胶、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、透明质酸、聚氨基酸、胶原、明胶、血纤蛋白、基于纤维蛋白的生物聚合物及其任何组合。
4.权利要求1的颗粒，其中所述聚合物包含合成聚合物。
5.权利要求4的颗粒，其中所述合成聚合物选自藻酸-聚乙二醇共聚物、聚(乙二醇)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)和聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯)、聚(α-酯)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(L-乳酸)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、丁酰基-三己基-柠檬酸酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、二异壬基-1,2-环己烷二羧酸酯、膨胀的聚四氟乙烯、乙烯乙烯醇共聚物、聚(六亚甲基二异氰酸酯)、高度交联的聚(乙烯)、聚(异佛尔酮二异氰酸酯)、聚(酰胺)、聚(丙烯腈)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯二醇)、聚(D-乳酸)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(二氧杂环己酮)、聚(乙烯)、聚醚醚酮、聚酯聚合物掺合物、聚醚砜、聚(乙二醇对苯二甲酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基戊烯)、聚(丙烯)、聚砜、聚(氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)及其任何组合。
6.权利要求1-5中任一项的颗粒，其中所述细胞表面组分是CD2、CD3、CD19、CD24、CD27、CD28、CD31、CD34、CD45、CD46、CD80、CD86、CD133、CD134、CD135、CD137、CD160、CD335、CD337、CD40L、ICOS、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、ILT3、ILT4、CDTL-4、PD-1、BTLA、MHC-I、MHC-II、DLL-Fc、DLL-1或DLL-4。
7.权利要求1-6中任一项的颗粒，其中所述结合部分是细胞因子或抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求7的颗粒，其中所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF-α或IFN-γ。
9.权利要求7的颗粒，其中所述抗体或其抗原结合片段是抗CD2、抗CD3、抗CD19、抗CD24、抗CD27、抗CD28、抗CD31、抗CD34、抗CD45、抗CD46、抗CD80、抗CD86、抗CD133、抗CD134、抗CD135、抗CD137、抗CD160、抗CD335、抗CD337、抗CD40L、抗ICOS、抗GITR、抗HVEM、抗半乳凝素9、抗TIM-1、抗LFA-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗B7-H3、抗B7-H4、抗ILT3、抗ILT4、抗CDTL-4、抗PD-1、抗BTLA、抗MHC-I、抗MHC-II、抗DLL-Fc、抗DLL-1或抗DLL-4。
10.权利要求1-6中任一项的颗粒，其中所述结合部分是趋化因子(C-X-C基序)配体12或低密度脂蛋白。
11.权利要求1-10中任一项的颗粒，其中所述免疫细胞选自调节性T细胞、NK细胞、NK T细胞、CIK细胞、TIL细胞、HS细胞(未分化和分化的)、MS细胞(未分化和分化的)、iPS细胞(未分化和分化的)和ES细胞(未分化和分化的)。
12.权利要求1-11中任一项的颗粒，其中响应于所述聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，所述聚合物从固体基质变为溶液或悬浮液。
13.权利要求12的颗粒，其中所述聚合物的环境中的阳离子浓度的降低由存在EDTA、EGTA、柠檬酸钠、BAPTA、冠醚、穴状配体、菲咯啉磺酸酯、磺酸联吡啶酯、二氧杂环己烷、DME、二甘醇二甲醚或三甘醇二甲醚引起。
14.权利要求1-13中任一项的颗粒，其中所述阳离子是Li+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+或Al3+。
15.权利要求1-14中任一项的颗粒，其中所述水凝胶具有小于100,000帕斯卡(Pa)的弹性模量。
16.权利要求1-15中任一项的颗粒，其中所述复合物具有至少一个约1μm和约50μm之间的横截面尺寸。
17.权利要求1-16中任一项的颗粒，其中所述复合物是基本上球形的，并且具有约1μm和100μm之间的直径。
18.权利要求17的颗粒，其中所述复合物具有约5μm和15μm之间的直径。
19.权利要求1-18中任一项的颗粒，其中所述结合部分共价连接至所述水凝胶。
20.权利要求1-19中任一项的颗粒，其中所述结合部分包含信号1刺激物。
21.权利要求20的颗粒，其进一步包含信号2刺激物。
22.权利要求21的颗粒，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比在约1:100和约100:1之间。
23.权利要求22的颗粒，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比为约1:1。
24.权利要求20-23中任一项的颗粒，其中所述信号1刺激物是抗原特异性的。
25.权利要求1-24中任一项的颗粒，其中所述结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求25的颗粒，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段、Fab、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子、双特异性单链Fv ((scFv’)2)分子、结构域抗体、双体、三体、亲和体、结构域抗体、SMIP、纳米抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)
2分子或串联scFv (taFv)片段。
27.权利要求1的颗粒，其中所述细胞表面组分选自CD19、CD133、CD135、CD335、CD337、δ样配体、WNT3、干细胞因子和血小板生成素。
28.权利要求20的颗粒，其中所述信号1刺激物是抗CD3和/或所述信号2刺激物是抗CD28。
29.权利要求1-28中任一项的颗粒，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少一个结合部分。
30.权利要求29的颗粒，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少十个结合部分。
31.复合物，其包含水凝胶和结合部分，其中：
(a)所述水凝胶包含藻酸-聚乙二醇(PEG)共聚物；且
(b)所述结合部分被配置为结合T细胞的细胞表面组分。
32.权利要求31的复合物，其中响应于聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，藻酸-PEG共聚物从固体基质变为溶液或悬浮液。
33.权利要求32的复合物，其中所述聚合物的环境中的阳离子浓度的降低由存在EDTA、EGTA、柠檬酸钠、BAPTA、冠醚、穴状配体、菲咯啉磺酸酯、磺酸联吡啶酯、二氧杂环己烷、DME、二甘醇二甲醚或三甘醇二甲醚引起。
34.权利要求32或33的复合物，其中所述阳离子是Li+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+或Al3+。
35.权利要求31-34中任一项的复合物，其中所述水凝胶具有小于100,000帕斯卡(Pa)的弹性模量。
36.权利要求31-35中任一项的复合物，其中所述藻酸-PEG共聚物包含多臂PEG分子。
37.权利要求36的复合物，其中所述多臂PEG分子是四臂PEG分子。
38.权利要求31-37中任一项的复合物，其中所述复合物具有至少一个约1μm和约50μm之间的横截面尺寸。
39.权利要求31-38中任一项的复合物，其中所述复合物是基本上球形的，并且具有约1μm和100μm之间的直径。
40.权利要求39的复合物，其中所述复合物具有约5μm和15μm之间的直径。
41.权利要求31-40中任一项的复合物，其中所述结合部分共价连接至所述水凝胶。
42.权利要求31-41中任一项的复合物，其中所述结合部分包含信号1刺激物。
43.权利要求42的复合物，其进一步包含信号2刺激物。
44.权利要求43的复合物，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比在约1:
100和约100:1之间。
45.权利要求44的复合物，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比为约1:
1。
46.权利要求42-45中任一项的复合物，其中所述信号1刺激物是抗原特异性的。
47.权利要求31-46中任一项的复合物，其中所述结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
48.权利要求47的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段、Fab、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子、双特异性单链Fv ((scFv’)2)分子、结构域抗体、双体、三体、亲和体、结构域抗体、SMIP、纳米抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子或串联scFv (taFv)片段。
49.权利要求47的复合物，其中所述结合部分选自抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD46、抗CD137及其抗原结合片段。
50.权利要求43的复合物，其中所述信号1刺激物是抗CD3和/或所述信号2刺激物是抗CD28。
51.权利要求31-50中任一项的复合物，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少一个结合部分。
52.权利要求51的复合物，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少十个结合部分。
53.复合物，其包含水凝胶颗粒和至少两个结合部分，其中所述水凝胶颗粒包含藻酸-
2+ 2+
PEG共聚物和Ca ，且所述结合部分包含抗CD3和抗CD28，其中响应于共聚物的环境中的Ca浓度的充分降低，藻酸-PEG共聚物从固体基质变为溶液或悬浮液。
54.权利要求31-53中任一项的复合物，其通过如下产生：
(a)使藻酸-PEG共聚物溶液通过雾化器以产生雾化喷雾；
(b)使所述雾化喷雾与包含阳离子的接收溶液接触，由此生成藻酸-PEG颗粒；和
(c)使所述结合部分与藻酸-PEG颗粒缀合以产生复合物。
55.权利要求54的复合物，其中所述藻酸-PEG共聚物溶液以30%至90%的体积百分比流过雾化器。
56.权利要求54或55的复合物，其中所述雾化器在1至200磅/平方英寸(psi)的压力下注入气体。
57.权利要求54-56中任一项的复合物，其中所述藻酸-PEG共聚物溶液以0.1至100 mL/分钟的流速注入雾化器。
58.权利要求54-57中任一项的复合物，其中所述雾化器是外部混合雾化器。
59.权利要求54-58中任一项的复合物，其中所述雾化器产生圆形喷雾模式。
60.权利要求54-59中任一项的复合物，其中所述雾化器产生10°至30°的喷雾角。
61.产生藻酸-PEG颗粒的方法，所述方法包括：
(a)使藻酸-PEG共聚物溶液通过雾化器以产生雾化溶液；和
(b)使所述雾化溶液与包含阳离子的接收溶液接触，由此生成藻酸-PEG颗粒。
62.权利要求61的方法，其进一步包括将结合部分缀合至藻酸-PEG颗粒以产生水凝胶复合物。
63.权利要求62的方法，其中所述水凝胶复合物具有小于100,000 Pa的弹性模量。
64.权利要求61-63中任一项的方法，其中所述结合部分结合T细胞的表面组分。
65.权利要求61-64中任一项的方法，其中所述藻酸-PEG共聚物溶液以30%至90%的体积百分比流过雾化器。
66.权利要求61-65中任一项的方法，其中所述雾化器在1至200 psi的压力下注入气体。
67.权利要求61-66中任一项的方法，其中所述藻酸-PEG共聚物溶液以0.1至100 mL/分钟的流速注入雾化器。
68.权利要求61-67中任一项的方法，其中所述雾化器是外部混合雾化器。
69.权利要求61-68中任一项的方法，其中所述雾化器产生圆形喷雾模式。
70.权利要求61-69中任一项的方法，其中所述雾化器产生10°至30°的喷雾角。
71.生成扩增的T细胞的群体的方法，所述方法包括使T细胞的起始群体与多种复合物接触，每种复合物包含水凝胶和结合部分，其中：
(i)所述水凝胶包含藻酸-PEG共聚物；且
(ii)所述结合部分结合T细胞的细胞表面组分；
且其中所述接触可操作以在T细胞的起始群体中诱导代谢变化，由此生成扩增的T细胞的群体。
72.权利要求71的方法，其中响应于所述聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，所述复合物从固体基质变为溶液或悬浮液。
73.权利要求71或72的方法，其中将所述复合物以1:1至20:1的复合物:细胞比率施用于包含T细胞的群体的培养物。
74.权利要求73的方法，其中所述复合物:细胞比率是复合物:T细胞比率。
75.权利要求74的方法，其中所述复合物:T细胞比率为约5∶1。
76.权利要求73的方法，其中所述复合物:细胞比率是复合物:外周血单核细胞(PBMC)比率。
77.权利要求76的方法，其中所述复合物:PBMC比率为约10∶1。
78.权利要求71-77中任一项的方法，其中扩增的T细胞的群体包含比起始群体更大数目或百分比的CD8+ T细胞。
79.权利要求71-78中任一项的方法，其中扩增的T细胞的群体包含比起始群体更低数+
目或百分比的CD4 T细胞。
80.权利要求71-79中任一项的方法，其中扩增的T细胞的群体包含比起始群体更大的CD8:CD4 T细胞比率。
81.权利要求71-80中任一项的方法，其中扩增的T细胞的群体包含相对于起始群体100倍数目的T细胞。
82.权利要求71-81中任一项的方法，其中扩增的T细胞的群体包含活化的T细胞。
83.权利要求61-82中任一项的方法，其中所述水凝胶具有小于100,000帕斯卡(Pa)的弹性模量。
84.权利要求61-83中任一项的方法，其中所述藻酸-PEG共聚物包含多臂PEG分子。
85.权利要求84的方法，其中所述多臂PEG分子是四臂PEG分子。
86.权利要求61-85中任一项的方法，其中所述复合物具有至少一个约1μm和约50μm之间的横截面尺寸。
87.权利要求61-86中任一项的方法，其中所述复合物是基本上球形的，并且具有约1μm和100μm之间的直径。
88.权利要求87的方法，其中所述复合物具有约5μm和15μm之间的直径。
89.权利要求61-88中任一项的方法，其中所述结合部分共价连接至所述水凝胶。
90.权利要求61-89中任一项的方法，其中所述结合部分包含信号1刺激物。
91.权利要求90的方法，其中所述复合物进一步包含信号2刺激物。
92.权利要求91的方法，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比在约1:100和约100:1之间。
93.权利要求92的方法，其中所述信号1刺激物和所述信号2刺激物的摩尔比为约1:1。
94.权利要求90-93中任一项的方法，其中所述信号1刺激物是抗原特异性的。
95.权利要求61-94中任一项的方法，其中所述结合部分包含抗体或其抗原结合片段。
96.权利要求95的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段、Fab、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子、双特异性单链Fv ((scFv’)2)分子、结构域抗体、双体、三体、亲和体、结构域抗体、SMIP、纳米抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)
2分子或串联scFv (taFv)片段。
97.权利要求96的方法，其中所述结合部分选自抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD46、抗CD137及其抗原结合片段。
98.权利要求91的方法，其中所述信号1刺激物是抗CD3和/或所述信号2刺激物是抗CD28。
99.权利要求61-98中任一项的方法，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少一个结合部分。
100.权利要求99的方法，其中所述复合物每平方μm的表面积包含平均至少十个结合部分。
101.生成扩增的免疫细胞的群体的方法，所述方法包括使免疫细胞的起始群体与多个权利要求1-30中任一项的颗粒接触；
其中所述接触可操作以在免疫细胞的起始群体中诱导代谢变化，由此生成扩增的免疫细胞的群体。
102.权利要求101的方法，其中响应于所述聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，所述颗粒从固体基质变为溶液或悬浮液。
103.权利要求101或102的方法，其中将所述颗粒以1:20至20:1的颗粒:细胞比率施用于包含免疫细胞的群体的培养物。
104.权利要求103的方法，其中所述颗粒:细胞比率是颗粒:免疫细胞比率。
105.权利要求104的方法，其中所述颗粒:免疫细胞比率为约5∶1。
106.权利要求103的方法，其中所述颗粒:细胞比率是复合物:外周血单核细胞(PBMC)比率。
107.权利要求106的方法，其中所述颗粒:PBMC比率为约10∶1。
108.权利要求101-107中任一项的方法，其中扩增的免疫细胞的群体包含相对于起始群体100倍数目的免疫细胞。
109.权利要求101-108中任一项的方法，其中扩增的免疫细胞的群体包含活化的免疫细胞。

说明书全文

调节免疫细胞的方法和组合物

[0001] 背景快速出现的治疗研究领域涉及将自体或同种异体免疫细胞移植至患者中以治疗癌症
和其他疾病。为此目的，正在评估许多类型的免疫细胞，包括淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、CIK细胞、树突状细胞、干细胞衍生的免疫细胞以及其他免疫细胞类型和亚型。迄今为止，尽管其他免疫细胞类型在临床前研究中已显示可观的治疗前景，但基于T淋巴细胞的疗法在临床上进展最快。在各种各样的体外、体内和临床研究和治疗应用中利用从全血分离的T淋巴细胞。实例包括研究免疫应答、T细胞受体信号转导、细胞因子释放和基因表达概况分析。
也许最重要的是，分离和随后的离体工程改造T淋巴细胞用于随后移植至临床患者中作为一种新型的癌症疗法显示巨大的希望。对此的主要方法是工程改造T细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在两种方法中，T细胞从全血分离，活化并离体扩增，并随后输注至人受试者中。

[0002] 尽管可以容易地从全血分离多克隆和抗原特异性T细胞两者，但它们的数目是有限的。因此，广泛使用活化T细胞并促进T细胞的离体扩增的方案。然而，此类离体操作可能降低T细胞活力、增殖和输注后的存活。因此，用于T细胞活化的方法的选择对临床效力具有重要意义。

[0003] 良好确立的是，在体内，T细胞的活化取决于两种信号；T细胞受体与抗原的接合(信号1)和共刺激分子的连接(信号2)。两者都是有效免疫应答所需的。离体T细胞活化最通常通过将T细胞暴露于针对T细胞表面标志物CD3和CD28的抗体以接合T细胞受体并同时递送共刺激信号来诱导。

[0004] 传统的使用磁珠的离体T细胞活化方案存在显著的缺点，其由连接至细胞的残余磁珠的存在所导致。这些可以负面影响功能和活力两者。临床前临床应用要求细胞不含污染的颗粒，同时维持高活力。例如，June等人 (Pilot study of redirected autologous T cells engineered to contain humanized anti-CD19 in patients with relapsed or refractory CD19+ leukemia and lymphoma previously treated with cell therapy (2015) ClinicalTrials.gov)指定IND中的最终产品发布标准包括如下规格：抗CD3/抗CD28包被的顺磁珠的数目不应超过100/3x106个细胞，并且细胞活力应大于70%。然而，由于大多数抗体包被的基于磁珠的产品缺乏以不改变分离的细胞的活力和表型的方式容易地从捕获分子释放结合细胞的能力，所以使珠粒的数目最小化代表在此类疗法的临床转化中的巨大障碍。

[0005] 考虑到对基于T细胞工程改造的癌症疗法的极大兴趣和迅速扩展，迫切需要改进的T细胞扩增和收获方法，其克服现有方法的上述限制，特别是用于下游临床应用。具体地，迫切需要使得离体细胞扩增方案能够满足临床规范、一致且可重复地扩增T和其他免疫细胞、保持细胞活力和功能并适用于不同细胞来源和扩增剂的技术。

[0006] 发明概述本发明的特征在于生物相容的水凝胶复合物，其能够结合、活化和扩增免疫细胞，例如T细胞。在某些实施方案中，可以例如简单地通过降低阳离子浓度，例如通过引入螯合剂来溶解水凝胶复合物，使得能够有效产生大量T细胞用于过继性转移系统和免疫细胞的其他用途。本文还提供了用于产生水凝胶复合物的方法和使用本发明的水凝胶复合物生成扩增和/或活化的免疫细胞(例如T细胞)群体的方法。

[0007] 在一个方面，本发明的特征在于包含复合物的颗粒，所述复合物包含水凝胶和结合部分，其中所述水凝胶包含聚合物；且所述结合部分被配置为结合免疫细胞的细胞表面组分。

[0008] 在一些实施方案中，所述聚合物包括天然聚合物。示例性天然聚合物是藻酸盐、琼脂糖、角叉菜胶、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、透明质酸、聚氨基酸、胶原、明胶、血纤蛋白、基于纤维蛋白的生物聚合物及其任何组合。在其他实施方案中，所述聚合物包括合成聚合物。示例性合成聚合物是藻酸-聚乙二醇共聚物、聚(乙二醇)(PEG)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOXA)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)和聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸正丁酯)、聚(α-酯)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(L-乳酸)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、丁酰基-三己基-柠檬酸酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、二异壬基-1,2-环己烷二羧酸酯、聚四氟乙烯(例如，膨胀的)、乙烯乙烯醇共聚物、聚(六亚甲基二异氰酸酯)、聚(乙烯)(例如，高密度、低密度或超高分子量)、高度交联的聚(乙烯)、聚(异佛尔酮二异氰酸酯)、聚(酰胺)、聚(丙烯腈)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯二醇)、聚(D-乳酸)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(二氧杂环己酮)、聚醚醚酮、聚酯聚合物掺合物、聚醚砜、聚(乙二醇对苯二甲酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基戊烯)、聚(丙烯)、聚砜、聚(氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)及其任何组合。

[0009] 所述聚合物也可以是共聚物，例如天然聚合物(例如藻酸盐)与合成聚合物(例如PEG或PMOXA)的共聚物。或者，所述聚合物不是藻酸盐和PEG的共聚物。其他实例包括透明质酸与PEG或葡聚糖与PEG的共聚物。在其他实施方案中，所述聚合物不是藻酸盐与含氟聚合物或硅酮的共聚物。

[0010] 在一些实施方案中，所述细胞表面组分是CD2、CD3、CD19、CD24、CD27、CD28、CD31、CD34、CD45、CD46、CD80、CD86、CD133、CD134、CD135、CD137、CD160、CD335、CD337、CD40L、ICOS、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、ILT3、ILT4、CDTL-4、PD-1、BTLA、MHC-I、MHC-II、δ样配体(例如DLL-Fc、DLL-1或DLL-4)、WNT3、干细胞因子或血小板生成素。在一些实施方案中，所述细胞表面组分是CD2、CD3、CD27、CD28、CD46、CD80、CD86、CD134、CD137、CD160、CD40L、ICOS、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、ILT3、ILT4、CDTL-4、PD-1、BTLA、MHC-I或MHC-II。或者，所述细胞表面组分不是CD2、CD3、CD27、CD28、CD46、CD80、CD86、CD134、CD137、CD160、CD40L、ICOS、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、ILT3、ILT4、CDTL-4、PD-1、BTLA、MHC-I或MHC-II，尤其是当聚合物是藻酸盐的共聚物、例如藻酸盐和PEG的共聚物时。在其他实施方案中，所述细胞表面组分是CD24、CD31、CD34或CD45。或者，所述细胞表面组分不是CD24、CD31、CD34或CD45，尤其是当聚合物是藻酸盐的共聚物、例如藻酸盐和PEG的共聚物时。在其他实施方案中，所述细胞表面组分是CD19、CD34、CD45、CD133、CD135、CD335、CD337、DLL-Fc、DLL-1或DLL-4、WNT3、干细胞因子或血小板生成素，例如CD19、CD133、CD135、CD335、CD337、δ样配体(例如，DLL-Fc、DLL-1或DLL-4)、WNT3、干细胞因子或血小板生成素。

[0011] 在一些实施方案中，颗粒的表面包括每平方μm至少一个结合部分(例如，每平方μm至少1个结合部分，每平方μm至少2个结合部分，每平方μm至少3个结合部分，每平方μm至少4个结合部分，每平方μm至少5个结合部分，每平方μm至少10个结合部分，每平方μm至少20个结合部分，每平方μm至少30个结合部分，每平方μm至少40个结合部分，或每平方μm至少50个结合部分)。在一些情况下，所述结合部分中的一个或多个是抗体或其抗原结合片段。

[0012] 所述颗粒可以包括一个、两个、三个或更多个不同的结合部分。

[0013] 结合部分可以是抗体或其抗原结合片段。例如，结合部分是单克隆抗体或其抗原结合片段、Fab、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子、双特异性单链Fv ((scFv’)2)分子、结构域抗体、双体、三体、亲和体、结构域抗体、SMIP、纳米抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子或串联scFv (taFv)片段。所述抗体或其抗原结合片段是例如抗CD2、抗CD3、抗CD19、抗CD24、抗CD27、抗CD28、抗CD31、抗CD34、抗CD45、抗CD46、抗CD80、抗CD86、抗CD133、抗CD134、抗CD135、抗CD137、抗CD160、抗CD335、抗CD337、抗CD40L、抗ICOS、抗GITR、抗HVEM、抗半乳凝素9、抗TIM-1、抗LFA-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗B7-H3、抗B7-H4、抗ILT3、抗-ILT4、抗CDTL-4、抗PD-1、抗BTLA、抗MHC-I、抗MHC-II、抗δ样配体(例如，抗DLL-Fc、抗DLL-1或抗DLL-
4)、抗WNT3、抗干细胞因子或抗血小板生成素。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD46、抗CD80、抗CD86、抗CD134、抗CD137、抗CD160、抗CD40L、抗ICOS、抗GITR、抗HVEM、抗半乳凝素9、抗TIM-1、抗LFA-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗B7-H3、抗B7-H4、抗ILT3、抗ILT4、抗CDTL-4、抗PD-1、抗BTLA、抗MHC-I或抗MHC-II。或者，所述抗体或其抗原结合片段不是抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD46、抗CD80、抗CD86、抗CD134、抗CD137、抗CD160、抗CD40L、抗ICOS、抗GITR、抗HVEM、抗半乳凝素9、抗TIM-1、抗LFA-
1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗B7-H3、抗B7-H4、抗ILT3、抗ILT4、抗CDTL-4、抗PD-1、抗BTLA、抗MHC-I或抗MHC-II，尤其是当聚合物是藻酸盐的共聚物、例如藻酸盐和PEG的共聚物时。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗CD24、抗CD31、抗CD34或抗CD45。或者，所述抗体或其抗原结合片段不是抗CD24、抗CD31、抗CD34或抗CD45，尤其是当聚合物是藻酸盐的共聚物、例如藻酸盐和PEG的共聚物时。在其他实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗CD19、抗CD34、抗CD45、抗CD133、抗CD335、抗CD337、抗DLL-Fc、抗DLL-1、抗-DLL-4抗WNT3、抗干细胞因子或抗血小板生成素，例如抗CD19、抗CD133、抗CD335、抗CD337、抗δ样配体(例如，抗DLL- Fc、抗DLL-1或抗DLL-4)、抗WNT3、抗干细胞因子或抗血小板生成素。

[0014] 所述结合部分可以是信号1刺激物(例如，抗CD3)或信号2刺激物(例如，抗CD28)。在具有信号1刺激物(例如，抗CD3)和信号2刺激物(例如，抗CD28)两者的复合物中，信号1刺激物和信号2刺激物的摩尔比可以在约1:100和约100:1之间(例如，1:80至80:1，1:60至60:
1，1:50至50:1，1:40至40:1，1:30至30:1，1:20至20:1，1:10至10:1，1:5至5:1，1:2至2:1，或约1:1)。在一些实施方案中，所述信号1刺激物是抗原特异性的。

[0015] 或者，复合物可以包括三种或更多种类型的结合部分。例如，在一些实施方案中，所述复合物包括信号1刺激物(例如抗CD3)，信号2刺激物(例如抗CD28)，和额外的刺激物，诸如活化刺激物、抑制刺激物或极化刺激物，诸如细胞因子(例如，表面结合的细胞因子，例如，反式呈递的白介素)。

[0016] 在某些实施方案中，所述结合部分是细胞因子。例如，所述细胞因子是IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF-α或IFN-γ。在其他实施方案中，所述结合部分是趋化因子(C-X-C基序)配体12或低密度脂蛋白。

[0017] 所述免疫细胞是，例如，幼稚和记忆T细胞、T辅助细胞、调节性T细胞、NK细胞、NK T细胞、CIK细胞、TIL细胞、HS细胞(未分化和分化的)、MS细胞(未分化和分化的)、iPS细胞(未分化和分化的)、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、基质细胞和ES细胞(未分化和分化的)。在某些实施方案中，所述免疫细胞是NK细胞、CIK细胞、TIL细胞、HS细胞(未分化和分化的)、MS细胞(未分化和分化的)、iPS细胞(未分化和分化的)或ES细胞(未分化和分化的)。在其他实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，例如幼稚或记忆T细胞、T辅助细胞、调节性T细胞、自然杀伤性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞或B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞或基质细胞。

[0018] 在一些实施方案中，例如响应于聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低、温度的变化、pH的变化，由于水解、氧化、酶促降解、物理降解或其他机制，聚合物可从固体基质变为溶液或悬浮液。例如，聚合物的环境中的阳离子浓度的降低可以由存在EDTA、EGTA、柠檬酸钠、BAPTA、冠醚、穴状配体、菲咯啉磺酸酯、磺酸联吡啶酯、二氧杂环己烷、DME、二甘醇二甲醚或三甘醇二甲醚引起。在一些实施方案中，所述阳离子是Li+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+或Al3+。在一些实施方案中，颗粒例如响应于颗粒的环境中的阳离子浓度的充分降低而完全液化，例如，颗粒不进一步包括分离单元，诸如磁珠基质或磁性颗粒。

[0019] 在一些实施方案中，所述水凝胶具有小于1吉帕斯卡(GPa)、例如0.8 GPa、0.6 GPa、0.4 GPa、0.2 GPa、0.1 GPa、0.08 GPa、0.06 GPa、0.04 GPa、0.02 GPa、0.01 GPa、0.008 GPa、0.006 GPa、0.004 GPa、0.002 GPa、0.001 GPa、0.0008 GPa、0.0006 GPa、
0.0004 GPa、0.0002 GPa或0.0001 GPa的弹性模量。在一些实施方案中，所述水凝胶具有小于100,000帕斯卡(Pa)的弹性模量。

[0020] 在某些实施方案中，所述颗粒具有至少一种约50 nm和约100 μm之间(例如，1μm至50μm)的横截面尺寸。例如，所述复合物是基本上球形的，并且具有约1μm和100μm之间(例如，2μm至80μm、3μm至50μm、4μm至25μm、5μm至15μm、8μm至12μm或约10μm)的直径。在一些实施方案中，多种复合物的平均直径为约1μm和100μm之间(例如，2μm至80μm、3μm至50μm、4μm至25μm、5μm至15μm、8μm至12μm或约10μm)。

[0021] 所述复合物的结合部分可以共价或非共价连接至水凝胶。在一些实施方案中，所述结合部分通过接头、诸如抗生物素蛋白-生物素接头(例如，链霉抗生物素蛋白-生物素接头)连接。例如，将水凝胶与链霉抗生物素蛋白共价缀合，随后非共价缀合至生物素化的结合部分。

[0022] 在某些实施方案中，所述聚合物是藻酸盐例如与PEG或PMOXA的共聚物。在此类实施方案中，所述免疫细胞是例如NK细胞、CIK细胞、TIL细胞、HS细胞(未分化和分化的)、MS细胞(未分化和分化的)、iPS细胞(未分化和分化的)或ES细胞(未分化和分化的)。在其他此类实施方案中，所述结合部分是细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF-α或IFN-γ，或所述结合部分是趋化因子(C-X-C基序)配体12或低密度脂蛋白。在进一步此类实施方案中，所述细胞表面组分是CD19、CD133、CD134、CD335、CD337、δ样配体(例如，DLL-Fc、DLL-1或DLL-4)、WNT3、干细胞因子或血小板生成素。例如，所述结合部分是抗CD19、抗CD133、抗CD134、抗CD335、抗CD337、抗δ样配体(例如，抗DLL-Fc、抗DLL-1或抗DLL-4)、抗WNT3、抗干细胞因子或抗血小板生成素。

[0023] 在一个进一步方面，本发明的特征在于通过使免疫细胞的起始群体与本发明的多个颗粒接触来生成扩增的免疫细胞的群体的方法，其中所述接触可操作以诱导免疫细胞的起始群体中的代谢变化，由此生成扩增的免疫细胞的群体。

[0024] 在某些实施方案中，例如，响应于聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，颗粒从固体基质变为溶液或悬浮液。在其他实施方案中，将颗粒以1:20至20:1的颗粒:细胞比率施用于包含免疫细胞的群体的培养物。例如，颗粒:细胞比率是颗粒:免疫细胞比率，例如约5:1。或者，颗粒:细胞比率是复合物:外周血单核细胞(PBMC)比率，例如约10:1。在某些实施方案中，扩增的免疫细胞的群体包括相对于起始群体100倍数目的免疫细胞。在其他实施方案中，扩增的免疫细胞的群体包括活化的免疫细胞。

[0025] 在一个方面，本发明的特征在于包含水凝胶和结合部分的复合物，其中所述水凝胶包含藻酸-聚乙二醇(PEG)共聚物；且所述结合部分被配置为结合T细胞的细胞表面组分。响应于聚合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，藻酸-PEG共聚物可以从固体基质变为溶液或悬浮液。例如，聚合物的环境中的阳离子浓度的降低可以由存在EDTA、EGTA、柠檬酸钠、BAPTA、冠醚、穴状配体、菲咯啉磺酸酯、磺酸联吡啶酯、二氧杂环己烷、DME、二甘醇二甲醚或三甘醇二甲醚引起。在一些实施方案中，所述阳离子是Li+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+或
3+
Al 。

[0026] 在一些实施方案中，所述复合物响应于复合物的环境中的阳离子浓度的充分降低而完全液化，例如，所述复合物不进一步包括分离单元，诸如磁珠基质或磁性颗粒。

[0027] 在一些实施方案中，所述水凝胶的弹性模量既足以诱导扩增，又足以歪曲正在扩增的群体的表型。例如，所述水凝胶可以具有小于100,000帕斯卡(Pa)的弹性模量。此类特性可以由共聚物的分子结构赋予。例如，藻酸-PEG共聚物可包括多臂PEG分子(例如，四臂PEG分子)。

[0028] 水凝胶复合物的几何形状影响其与细胞的接触，且因此可影响扩增。在一些实施方案中，所述复合物具有至少一种约50 nm和约100 μm之间(例如，1μm至50μm)的横截面尺寸。例如，所述复合物可以是基本上球形的，并且具有约1μm和100μm之间(例如，2μm至80μm、3μm至50μm、4μm至25μm、5μm至15μm、8μm至12μm或约10μm)的直径。在一些实施方案中，多种复合物的平均直径为约1μm和100μm之间(例如，2μm至80μm、3μm至50μm、4μm至25μm、5μm至15μm、8μm至12μm或约10μm)。

[0029] 所述复合物的结合部分可以共价或非共价连接至水凝胶(例如，水凝胶颗粒，例如，共价连接至藻酸-PEG共聚物的藻酸结构域)。在一些实施方案中，所述结合部分可以通过接头、诸如抗生物素蛋白-生物素接头(例如，链霉抗生物素蛋白-生物素接头)连接。例如，可以将水凝胶与链霉抗生物素蛋白共价缀合，随后非共价缀合至生物素化的结合部分。

[0030] 在一些实施方案中，所述水凝胶复合物的表面包括每平方μm至少一个结合部分(例如，每平方μm至少1个结合部分，每平方μm至少2个结合部分，每平方μm至少3个结合部分，每平方μm至少4个结合部分，每平方μm至少5个结合部分，每平方μm至少10个结合部分，每平方μm至少20个结合部分，每平方μm至少30个结合部分，每平方μm至少40个结合部分，或每平方μm至少50个结合部分)。在一些情况下，所述结合部分中的一个或多个是抗体或其抗原结合片段。

[0031] 所述结合部分可以是信号1刺激物(例如，抗CD3)或信号2刺激物(例如，抗CD28)。在具有信号1刺激物(例如，抗CD3)和信号2刺激物(例如，抗CD28)两者的复合物中，信号1刺激物和信号2刺激物的摩尔比可以在约1:100和约100:1之间(例如，1:80至80:1，1:60至60:
1，1:50至50:1，1:40至40:1，1:30至30:1，1:20至20:1，1:10至10:1，1:5至5:1，1:2至2:1，或约1:1)。在一些实施方案中，所述信号1刺激物是抗原特异性的。

[0032] 或者，复合物可以包括三种或更多种类型的结合部分。例如，在一些实施方案中，所述复合物包括信号1刺激物(例如抗CD3)，信号2刺激物(例如抗CD28)，和额外的刺激物，诸如活化刺激物、抑制刺激物或极化刺激物，诸如细胞因子(例如，表面结合的细胞因子，例如，反式呈递的白介素)。

[0033] 结合部分可以是抗体或其抗原结合片段。例如，结合部分可以是单克隆抗体或其抗原结合片段、Fab、人源化抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或其抗原结合片段、单价抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、单链Fv分子、双特异性单链Fv ((scFv’)2)分子、结构域抗体、双体、三体、亲和体、结构域抗体、SMIP、纳米抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab’)2分子或串联scFv (taFv)片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD46或抗CD137。

[0034] 在一个方面，本发明的特征在于包含水凝胶颗粒和至少两个结合部分的复合物，2+
其中所述水凝胶颗粒包括藻酸-PEG共聚物和Ca ，且所述结合部分包括抗CD3和抗CD28，其中响应于共聚物的环境中的Ca2+浓度的充分降低，藻酸-PEG共聚物从固体基质变为溶液或悬浮液。

[0035] 在一些实施方案中，所述复合物响应于复合物的环境中的阳离子浓度的充分降低而完全液化，例如，所述复合物不进一步包括分离单元，诸如磁珠基质或磁性颗粒。

[0036] 在另一个方面，本发明的特征在于通过藻酸-PEG共聚物的雾化产生的本发明的复合物。例如，可使藻酸-PEG共聚物溶液通过雾化器以产生雾化喷雾。可以将喷雾引导至阳离子浓度足以导致藻酸-PEG共聚物的交联的接收溶液中，由此生成藻酸-PEG颗粒(例如，微粒或纳米颗粒)。为了产生复合物，然后将颗粒与结合部分缀合。

[0037] 在一些实施方案中，所述藻酸-PEG共聚物溶液以30%至90%的体积百分比流过雾化器。可以在雾化器中通过注入例如1至200磅/平方英寸(psi)的气体(例如，压缩气体，例如，压缩空气或氮气)来产生液滴。在一些实施方案中，所述藻酸-PEG共聚物溶液可以以0.1至100 mL/分钟的速率流过雾化器。在其他实施方案中，通过雾化器的气流速率与藻酸-PEG共聚物溶液的速率无关，诸如在外部混合雾化器的情况下。在进一步实施方案中，所述雾化器产生圆形的喷雾模式，例如以10°至30°的喷雾角。

[0038] 在一些实施方案中，通过雾化产生的复合物响应于复合物的环境中的阳离子浓度的充分降低而完全液化，例如，所述复合物不进一步包括分离单元，诸如磁珠基质或磁性颗粒。

[0039] 在另一个方面，本发明提供了通过使藻酸-PEG共聚物溶液通过雾化器以产生雾化溶液来产生藻酸-PEG颗粒的方法。使雾化溶液与具有阳离子的接收溶液接触，其生成藻酸颗粒。在一些实施方案中，将结合部分进一步缀合至藻酸-PEG颗粒以产生水凝胶复合物。所述水凝胶复合物可具有小于100,000 Pa的弹性模量。在一些实施方案中，所述结合部分结合T细胞的细胞表面组分。

[0040] 在一些实施方案中，所述藻酸-PEG共聚物溶液以30%至90%的体积百分比流过雾化器。可以在雾化器中通过注入例如1至200磅/平方英寸(psi)的气体(例如，压缩气体，例如，压缩空气或氮气)来产生液滴。在一些实施方案中，所述藻酸-PEG共聚物溶液可以以0.1至100 mL/分钟的速率流过雾化器。在其他实施方案中，通过雾化器的气流速率与藻酸-PEG共聚物溶液的速率无关，诸如在外部混合雾化器的情况下。在进一步实施方案中，所述雾化器产生圆形的喷雾模式，例如以10°至30°的喷雾角。

[0041] 在另一个方面，本发明的特征在于生成扩增的T细胞的群体的方法，其中所述方法涉及使T细胞的起始群体与前述方面中任一项的多种复合物接触，其中所述接触诱导T细胞的起始群体中的代谢变化，由此生成扩增的T细胞的群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过将阳离子螯合剂暴露于复合物和扩增的T细胞的群体来液化所有复合物中的一些。在一些实施方案中，所述复合物响应于复合物的环境中的阳离子浓度的充分降低而完全液化，例如，所述复合物不进一步包括分离单元，诸如磁珠基质或磁性颗粒。

[0042] 可以将复合物以1:1至20:1或1:20至20:1的复合物:细胞比率(例如，复合物与任何表型的细胞(包括T细胞和其他细胞类型，例如，B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞或基质细胞)的比率)施用于具有T细胞群体的培养物中。另外或可替代地，可以将复合物以约1:1至20:1(例如约5:1)的复合物:T细胞比率施用于包含T细胞的群体的培养物。另外或可替代地，可以将复合物以约1:1至约20:1(例如约10:1)的复合物:外周血单核细胞(PBMC)比率施用于包含T细胞的群体的培养物。

[0043] 本发明的方法使得能够扩增T细胞群体，使得与起始群体相比，扩增的T细胞在表型上不同。例如，与起始群体相比，扩增的群体可具有更大数目的活化T细胞。另外或可替代地，扩增的群体可以包括比起始群体更大数目或百分比的CD8+ T细胞。相反，扩增的T细胞的群体可以包括比起始群体更低数目或百分比的CD4+ T细胞。另外或可替代地，扩增的T细胞的群体可以包括比起始群体更大的CD8:CD4 T细胞比率。通常，扩增的T细胞的群体将包括相对于起始群体更大总数的T细胞(例如，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或超过100倍数目的T细胞)。扩增的T细胞的全部或部分可具有活化的表型。在一些实施方案中，响应于复合物的环境中的阳离子浓度的充分降低，所述复合物被完全液化。

[0044] 在一些实施方案中，所得细胞群体具有至少2%(例如，至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%或更多，例如约5%、约10%、约15%或更多)的幼稚T细胞。在一些实施方案中，所得细胞群体具有相对于参考群体(例如，通过对照珠粒扩增的细胞)更大数目或百分比(例如，多10%、多20%、多50%、多100%或更多，例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多)的幼稚T细胞。另外或可替代地，所得细胞群体可以具有比参考群体更大数目或百分比的中央记忆T细胞(例如，多10%、多20%、多30%、多40%、多50%、多75%、多100%、多
150%、多200%、多300%、多400%、多500%、多1,000%、多5,000%、多10,000%或更多)。在一些实+ + + + +
施方案中，所述幼稚T细胞是CD45RA细胞、CD45RACD62L细胞或CD45RACCR7细胞。在其他实施方案中，所述幼稚T细胞分泌比参考细胞群体(例如，其中所述参考群体是起始群体、中央记忆细胞群体、效应记忆细胞群体或活化的群体)更少量的IL-4和/或IFN-γ。

[0045] 在一个实施方案中，T细胞群体分离自受试者。在一个不同的实施方案中，T细胞群体衍生自细胞系。在一个方面，T细胞的起始群体包括基因修饰，诸如由嵌合抗原受体(CAR)修饰导致的基因修饰。

[0046] 在一个方面，通过使T细胞与复合物接触而在T细胞中诱导的代谢变化包括生物化学或形态学改变。这种变化可以是细胞分裂的更高频率，细胞因子分泌概况(例如，IL-4和/或IFN-γ的分泌概况)的改变，中值细胞直径的增加，表面分子表达概况的改变，或细胞运动性的改变。

[0047] 如本文所用，术语“平均值”广义上是指离散对象的群体的值或特征的集合的任何代表性值。例如，颗粒(例如，纳米颗粒或微粒)或复合物的平均直径可以指平均值、中值、众数或其任何加权变体，包括从排除外围数据推导的平均值。除非另有说明，否则颗粒或复合物的“大小”是其直径。

[0048] 如本文所用，术语“液滴”是指雾化器的液体产物，而“颗粒”在本文中是指固体(例如，凝胶或水凝胶)球形或基本上球形的构建体(例如，纳米颗粒或微粒)。液滴在固化后变为颗粒(例如，凝胶化，例如在暴露于阳离子后，导致藻酸盐交联)。

[0049] 如本文所用，术语“复合物”是指与一个或多个结合部分缔合(例如缀合)的水凝胶构建体(例如，颗粒、盘、棒或其他形状)。

[0050] 如本文所用，“通过雾化器的液体的体积百分比”及其语法变体是指相对于通过雾化器的总体积流量(包括气体)的通过雾化器的液体的体积。例如，在给定的时间段内流过雾化器的液体的体积百分比为：其中是在给定时间段内通过雾化器的液体体积，且是在给定时间段内通过雾化器
的气体体积。

[0051] 如本文所用，“参考群体”是指任何合适的对照细胞群体。例如，可以将细胞群体的特征与其从其扩增的起始群体进行比较。或者，所述参考群体可以是未处理的对照或已经通过替代方式处理(例如，扩增)的对照。T细胞扩增的替代方法包括任何常规方法，诸如使用可溶性、板结合和/或珠粒或颗粒结合的抗体或细胞因子(例如，T细胞活化抗体，诸如抗CD3和/或抗CD28)。例如，可以使用定制的或市售的对照珠粒(例如，DYNABEADS®)来生成T细胞的扩增群体的参考群体。

[0052] 附图简述图1：显示示例性喷雾设备的横截面视图的示意图。

[0053] 图2A-2D：显示本发明的水凝胶颗粒的显微照片。图3A和3B显示在高密度(图2A；1.16 x 108个颗粒/mL)和低密度(图2B；1.16 x 107个颗粒/mL)下结合部分缀合前的水凝胶颗粒。图2C和2D显示以4 x 107个颗粒/mL的浓度与抗CD3和抗CD28抗体缀合后的水凝胶颗粒。每个图像中的比例尺代表10 µm。

[0054] 图3：显示与对照珠粒和未处理的细胞相比通过抗CD3/抗CD28抗体包被的水凝胶复合物的T细胞扩增的图。用水凝胶复合物以10:1和5:1的复合物:细胞比率处理细胞。

[0055] 图4A-4B：显示扩增9天后T细胞中的CD4和CD8表达的变化的柱状图。图4A显示由于水凝胶复合物处理相比于对照复合物处理而导致的CD4+细胞的百分比的变化。图4B显示由于水凝胶复合物处理相比于对照复合物处理而导致的CD4+细胞的百分比的变化。用水凝胶复合物以10:1和5:1的复合物:细胞比率处理细胞。

[0056] 图5A-5D：显示通过水凝胶复合物相对于对照珠粒扩增9天的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的表达水平活化标志物的图。图5A和5B显示随时间的表达CD25的CD8+ T细胞(图5A)和CD4+ T细胞(图5B)的百分比。图5C和5D显示随时间的表达CD69的CD8+ T细胞(图5C)和CD4+ T细胞(图5D)的百分比。

[0057] 图6A-6D：流式细胞术图，其代表用于测定CD8+ T细胞(图6A和6C)和CD4+ T细胞(图6B和6D)上的活化标志物表达水平(CD25和CD69)的数据。图6A显示在扩增期的第2天(左列)和在扩增期的第5天(右列)用对照珠粒(上行)和水凝胶复合物以10:1复合物:细胞比率(下行)处理的CD8+ T细胞的CD25表达。图6B显示在扩增期的第2天(左列)和在扩增期的第5天(右列)用对照珠粒(上行)和水凝胶复合物以10:1复合物:细胞比率(下行)处理的CD4+ T细胞的CD25表达。图6C显示在扩增期的第2天(左列)和在扩增期的第5天(右列)用对照珠粒(上行)和水凝胶复合物以10:1复合物:细胞比率(下行)处理的CD8+ T细胞的CD69表达。图
6D显示在扩增期的第2天(左列)和在扩增期的第5天(右列)用对照珠粒(上行)和水凝胶复合物以10:1复合物:细胞比率(下行)处理的CD4+ T细胞的CD69表达。每个图的群体均来自+ +
在对单一细胞门控后对CD4 或CD8 事件的亲本门控。绘制相比于活化标志物(CD25或CD69)的侧向散射(SSC)。

[0058] 图7：显示配体和配体密度的调节调节T细胞扩增的图。

[0059] 图8：显示配体和配体密度的调节调节T细胞表型的一系列图。

[0060] 图9：显示配体和配体密度的调节调节记忆表型的一系列图。

[0061] 发明详述本发明提供了用于调节免疫细胞的新型颗粒和水凝胶复合物。所述颗粒和复合物可以与在其内部的分离单元诸如磁珠一起使用。残余的磁性颗粒代表可能的毒理学风险。另外，去除残余的磁性颗粒需要增加磁性分离步骤，其增加工作流程成本、时间和复杂性，并且导致细胞损失，减少扩增后回收细胞的总数。这些工作流程挑战对于细胞疗法生物处理应用而言是重要的，因此对于开发不含顺磁性珠粒的水凝胶颗粒设计的动力而言是重要的。例如，现有的T细胞扩增方法利用磁性颗粒(例如，顺磁性颗粒)来介导细胞分离。对于不需要细胞分离的T细胞扩增方法，顺磁性颗粒还引入工作流程复杂性和挑战。

[0062] 本发明提供了不需要基质、诸如磁性颗粒并且结合并调节免疫细胞、例如扩增期望的T细胞群体的颗粒或水凝胶复合物。在某些实施方案中，所述颗粒或复合物可以在扩增后轻轻地解离，例如，导致纯的扩增的T细胞群体。

[0063] 本文还提供了用于合成本发明的颗粒或水凝胶复合物的方法，例如通过将可交联共聚物的雾化液滴悬浮液喷雾至具有阳离子的接收溶液中以使共聚物交联以形成水凝胶颗粒，所述水凝胶颗粒然后可与结合部分结合以形成复合物。本发明还提供了使用此类颗粒或复合物作为过继性T细胞治疗方法和系统的部分的方法。

[0064] 结合部分本发明的特征在于复合物，其包含与水凝胶结构(例如水凝胶颗粒)连接的结合部分。
通常，结合部分位于水凝胶结构的表面上。

[0065] 结合部分可以结合与靶细胞结合的另一结合部分，例如抗体或其抗原结合片段。例如，结合单元可以是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且其可以结合已经用生物素(例如经由生物素化的抗体)标记的靶细胞。其他此类结合部分包括结合与靶细胞结合的抗体的蛋白A、蛋白G和抗-物种抗体(例如山羊抗兔抗体)。

[0066] 结合部分结合部分可以结合免疫细胞(例如T细胞)的表面组分。示例性表面组分是CD2、CD3、CD19、CD24、CD27、CD28、CD31、CD34、CD45、CD46、CD80、CD86、CD133、CD134、CD135、CD137、CD160、CD335、CD337、CD40L、ICOS、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、ILT3、ILT4、CDTL-4、PD-1、BTLA、MHC-I、MHC-II、δ样配体(例如DLL-Fc、DLL-1或DLL-4)、WNT3、干细胞因子和血小板生成素。所述结合部分可以是抗体或其抗原结合片段或结合表面组分的另一种分子，例如细胞因子。合适的细胞因子包括，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF-α和IFN-γ。示例性抗体或其抗原结合片段包括抗CD2、抗CD3、抗CD19、抗CD24、抗CD27、抗CD28、抗CD31、抗CD34、抗CD45、抗CD46、抗CD80、抗CD86、抗CD133、抗CD134、抗CD135、抗CD137、抗CD160、抗CD335、抗CD337、抗CD40L、抗ICOS、抗GITR、抗HVEM、抗半乳凝素9、抗TIM-1、抗LFA-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗B7-H3、抗B7-H4、抗ILT3、抗-ILT4、抗CDTL-4、抗PD-1、抗BTLA、抗MHC-I、抗MHC-II、抗δ样配体(例如，抗DLL-Fc、抗DLL-1或抗DLL-4)、抗WNT3、抗干细胞因子或抗血小板生成素。所述结合部分可以是趋化因子(C-X-C基序)配体12或低密度脂蛋白。优选地，该结合事件可导致免疫细胞(例如T细胞)内的信号转导，例如导致靶细胞的调节，诸如活化、扩增(即增殖)和/或其他表型改变(例如，极化(例如，向Th1、Th2、Th17、Treg或另一T细胞亚表型的极化)或在没有活化的+
情况下的扩增，例如，保留幼稚表型(例如，CD45RA))。已知几种免疫细胞(例如T细胞)表面分子具有这种下游作用。对于T细胞，诱导T细胞受体的簇集(信号1)的配体可以刺激T细胞增殖，并且取决于二级信号(信号2)的存在、浓度、亲和力或亲合力，T细胞可区分特定表型或朝向特定表型极化。本发明的信号1药剂可以是抗CD3，并且本发明的信号2药剂可以是抗CD28。信号1刺激物的其他实例包括MHC-1或MHC-II，以及本领域中已知的各种其他T细胞受体组分的激动剂。信号2刺激物的其他实例包括作为共刺激分子的激动剂的抗原呈递细胞表面分子(例如，CD80、CD86、CD40、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、LIGHT、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3)，针对除了CD28以外的T细胞共刺激表面分子(例如，CD40L、ICOS、CD27、OX40、
4-1BB、GITR、HVEM、半乳凝素9、TIM-1、LFA-1和CD2)的抗体，作为共抑制分子抗原的激动剂的细胞呈递表面分子(例如，CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT3或ILT4)，以及针对共抑制分子(例如，CDTL-4、PD-1、BTLA或CD160)的抗体。已显示信号2刺激物影响T细胞活化的多个方面。通常，信号2刺激被认为降低诱导培养物中的增殖应答所需的抗CD3的浓度，并增强细胞因子产生以指导T细胞分化途径。重要的是，共刺激可以帮助活化CD8+ T细胞的细胞裂解潜力。可以靶向其他分子，包括但不限于CD2和CD137，以活化和扩增来自小鼠和人样品的各种T细胞群体，诸如幼稚和记忆T细胞，T辅助细胞，调节性T细胞，天然杀伤性T细胞和细胞毒性T淋巴细胞。可用作用于本发明中的信号1和信号2刺激物的抗体、配体和其他试剂的额外实例描述于WO 2003/024989中。

[0067] 本发明的颗粒或复合物可以包括两个或更多个不同的结合部分。例如，所述结合部分可以结合至少一种活化受体和同源配体，其进而可以与共刺激信号和/或细胞因子串联工作以引发免疫细胞的生长和活化。以下论述涉及T细胞，但类似过程对于其他免疫细胞是已知的。

[0068] 抗原特异性T细胞接合在本发明的一个方面，结合部分可以以抗原特异性的方式结合T细胞受体，其类似于T细胞受体和抗原呈递细胞上的肽-MHC之间发生的结合。以抗原特异性方式(即在天然抗原呈递细胞不存在的情况下)接合T细胞的合成方法包括I类MHC和II类MHC多聚体(例如，二聚体、四聚体和dextramer)。说明性实例描述于美国专利号7,202,349和U.S. 2009/0061478中。MHC-肽复合物的多聚化发挥功能以增强肽-MHC和T细胞之间相互作用的亲合力，其增加信号1转导的功效。实现抗原特异性T细胞受体配体的多价呈递的另一种方式是通过将配体栓系至水凝胶结构(例如，水凝胶颗粒)的表面。与亲合力相比，亲和力描述了每个单独分子的结合强度。肽-MHC对T细胞受体的亲和力可急剧变化，并决定信号1刺激物的下游影响，如下所论述。用于本发明中的抗原及其肽包括，但不限于，被T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)、黑色素瘤GP100、乳腺癌抗原、Her-2/Neu和粘蛋白抗原。其他相关抗原及其来源描述于例如美国专利号8,637,307中。

[0069] 在一些实施方案中，存在确定下游结果的初始活化信号传导事件，即，多种免疫细胞类型的活化通过配体、受体-配体相互作用的半衰期和配体浓度调节。以下论述涉及T细胞，但类似过程对于其他免疫细胞是已知的。

[0070] T细胞结合程度的影响信号1和信号2结合的相对程度可影响TCR信号转导并导致各种下游表型影响。例如，在信号2不存在的情况下，对低亲合力信号1的高亲和力引发幼稚CD4+ T细胞以开启FoxP3表达并向调节表型分化(Gottschalk等人, Journal of Experimental Medicine 207
(2010): 1701)。或者，在没有足够的信号2刺激物的情况下，响应于高亲合力信号1刺激物，幼稚T细胞更可能经历耗竭，导致功能性无能(参见Ferris等人, J Immunol Aug 15;193 (2014): 1525-1530)。这些影响中的任一种在癌症过继性免疫疗法的情况下都是不期望的，但在引发调节性T细胞用于自身免疫治疗时可以是有帮助的。因此，取决于应用，通过将官能化的复合物暴露于期望比率的结合部分，可以合理地调节信号1和信号2的相对贡献。

[0071] 所述结合部分可以与相同表面或分开表面偶联。在一个优选实施方案中，将信号1刺激物和信号2刺激物以1:1比率固定在表面(例如，水凝胶颗粒的表面)上。在本发明的某些方面，将信号1刺激物和信号2刺激物以除了1:1以外的比率(例如，在约1:100和约100:1之间，在约1:10和10:1之间，在约1:2和2:1之间)固定在表面上。或者，固定在表面上的信号1刺激物与信号2刺激物的比率大于1:1，或小于1:1。

[0072] 信号1和信号2之间的信号传导的相对强度的影响还取决于靶T细胞的活化状态。例如，幼稚T细胞对T细胞受体刺激和共刺激的反应与经历抗原的T细胞不同。当选择本发明的结合部分的构型时，技术人员将理解这种影响，尤其是在慢性感染或异常免疫耐受的情况下，并相应地配置结合部分。

[0073] 水凝胶本发明的颗粒和复合物包含水凝胶。在一些实施方案中，可通过改变其环境的离子组成来溶解(即液化)水凝胶。本发明的水凝胶可以由天然聚合物、合成聚合物及其共聚物形成。示例性天然聚合物是藻酸盐、琼脂糖、角叉菜胶、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、透明质酸、聚氨基酸、胶原、明胶、血纤蛋白、基于纤维蛋白的生物聚合物(例如，丝、角蛋白、弹性蛋白和节肢弹性蛋白)及其任何组合。合成聚合物包括聚(乙二醇)(PEG)、聚(2-甲基-
2-噁唑啉)(PMOXA)、聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)和聚(丙烯酰胺)(PAAm)、聚(丙烯酸正丁酯)、聚(α-酯)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAM)、丁酰基-三己基-柠檬酸酯、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯、二异壬基-1,2-环己烷二羧酸酯、膨胀的聚四氟乙烯(PTFE)、乙烯乙烯醇共聚物、聚(六亚甲基二异氰酸酯)、高密度聚(乙烯)(PE)、高度交联的PE、聚(异佛尔酮二异氰酸酯)、低密度PE、聚(酰胺)、聚(丙烯腈)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯二醇)、聚(D-乳酸)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(二氧杂环己酮)、聚(乙烯)、聚醚醚酮、聚酯聚合物掺合物、聚醚砜、聚(乙二醇对苯二甲酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基戊烯)、聚(丙烯)、聚砜、聚(氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)、超高分子量PE及其任何组合。具体的共聚物包括藻酸盐-PEG共聚物或藻酸盐-PMOXA共聚物。

[0074] 在一个实施方案中，本发明的水凝胶可以由缀合至聚环氧烷、例如聚乙二醇(PEG)的藻酸(即藻酸盐)形成，如WO 2012/106658中通常所述。PEG可以是多官能PEG(例如，多臂PEG，例如，4-臂PEG)。与仅通过藻酸盐的离子交联所实现的机械强度相比，藻酸与多官能PEG(例如4-臂PEG)的缀合赋予更大的机械强度。因此，可以通过增加每个PEG分子上的官能团的数目来调节机械特性(例如刚度)。PEG可用作本发明的一部分，因为其具有优异的亲水特性，所述特性防止蛋白吸附至本发明的复合物。血清蛋白吸附至复合物可导致相邻细胞中的异常信号传导途径，诸如由Fc受体接合引起的那些。PEG的亲水特性也对维持复合物内部的高扩散性有功能，使得离子螯合剂可快速接近复合物内部以便快速掩蔽维持刚性的阳离子。因此，在水凝胶内并入分支PEG分子确保了在暴露于适当刺激后水凝胶结构的快速溶解。通过形成PEG与除了藻酸盐以外的聚合物的共聚物可以实现类似的效果，如本文所述。或者，任何其他生物相容性的亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇及其共聚物)可以取代PEG(参见，例如美国专利号7,214,245)，例如用藻酸盐或另一种聚合物取代。PMOXA也可以包括在与藻酸盐或另一种聚合物的共聚物中，如本文所述。

[0075] 本发明的水凝胶复合物可具有适合于免疫细胞调节、例如T细胞扩增的一种或多种机械特性(例如，弹性模量、杨氏模量、压缩模量或刚度)。例如，可以调整水凝胶的机械特性以适合于允许T细胞的群体(例如，含有扩增的T细胞的群体)在与本发明的复合物接触后保留幼稚表型的一种或多种特征(例如，如方法部分中所述)。水凝胶的弹性模量(例如，其适合于允许T细胞的群体保留幼稚表型的一种或多种特征)可以在100帕斯卡(Pa)和100,000,000Pa之间(例如，100 Pa至1,000 Pa，1,000 Pa至10,000 Pa，10,000 Pa至100,000 Pa之间，100,000 Pa和1,000,000 Pa之间，1,000,000 Pa和10,000,000 Pa之间，或10,000,
000 Pa和100,000,000 Pa之间，例如，小于1,000,000 Pa，小于900,000 Pa，小于800,000 Pa，小于700,000 Pa，小于600,000 Pa，小于500,000 Pa，小于400,000 Pa，小于300,000 Pa，小于200,000 Pa，小于100,000 Pa，小于50,000 Pa或小于10,000 Pa)。在其他实施方案中，所述颗粒或复合物的弹性模量为小于1吉帕斯卡(GPa)，例如0.8 GPa、0.6 GPa、0.4 GPa、0.2 GPa、0.1 GPa、0.08 GPa、0.06 GPa、0.04 GPa、0.02 GPa、0.01 GPa、0.008 GPa、
0.006 GPa、0.004 GPa、0.002 GPa、0.001 GPa、0.0008 GPa、0.0006 GPa、0.0004 GPa、
0.0002 GPa或0.0001 GPa。

[0076] 在其他实施方案中，所述水凝胶的机械特性可以被配置为优先扩增CD8+ T细胞+(例如，相对于CD4 T细胞，或相对于总细胞群体，例如，总CD3+ T细胞或总淋巴细胞)。例如，配置为优先扩增CD8+ T细胞的水凝胶的弹性模量为100帕斯卡(Pa)和100,000,000Pa之间(例如，100 Pa至1,000 Pa，1,000 Pa至10,000 Pa，10,000 Pa至100,000 Pa之间，100,
000 Pa和1,000,000 Pa之间，1,000,000 Pa和10,000,000 Pa之间，或10,000,000 Pa和
100,000,000 Pa之间，例如，小于1,000,000 Pa，小于900,000 Pa，小于800,000 Pa，小于
700,000 Pa，小于600,000 Pa，小于500,000 Pa，小于400,000 Pa，小于300,000 Pa，小于
200,000 Pa，小于100,000 Pa，小于50,000 Pa或小于10,000 Pa)。

[0077] 除非另有说明，提及藻酸还指盐形式，例如藻酸钠。根据已知原理，聚合物部分的藻酸含量将影响聚合物部分的刚度(例如，聚合物部分的阳离子含量)。根据已知方法，可以改变藻酸盐聚合物部分的刚度，同时维持恒定或接近恒定的密度。

[0078] 聚环氧烷，例如PEG和聚环氧丙烷，是本领域中已知的。可以采用直链或支链聚环氧烷，例如4-臂或8-臂聚环氧烷，例如PEG。所述聚环氧烷，例如PEG，优选具有10kDa和20kDa之间的分子量。聚环氧烷(例如PEG)与藻酸的示例性比率为按重量1:2。

[0079] 藻酸天然地具有多个羧基，其提供便于与聚环氧烷(例如PEG)和/或结合部分缀合的基团。聚环氧烷(例如PEG)和结合部分天然地具有或被修饰以具有适合于缀合羧基的基团。合适的基团包括胺基团，其通常存在于包含氨基酸的结合部分中或可以引入至结合部分和聚环氧烷，例如PEG。例如，可以采用胺封端的聚环氧烷，例如PEG。在其他实施方案中，可使用接头将聚环氧烷(例如PEG)或结合部分上的适当基团与藻酸上的羧基缀合。在水凝胶中，单个聚环氧烷，例如PEG，可以与一个或多个藻酸分子缀合。当聚环氧烷结合多于一个藻酸时，组合物中此类交联的数目可能足以或可能不足以形成凝胶。结合部分可以直接结合藻酸，或者可以结合与藻酸结合的聚环氧烷(例如PEG)。

[0080] 通过藻酸与阳离子(例如，Li+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+或Al3+)的非共价交联，形成水凝胶。优选的阳离子是Ca2+。本发明的水凝胶的凝胶化可以通过与阳离子的螯合剂(例如，EDTA、EGTA、柠檬酸钠、BAPTA、冠醚、穴状配体、菲咯啉磺酸酯、磺酸联吡啶酯、二氧杂环己烷、DME、二甘醇二甲醚或三甘醇二甲醚)接触来逆转。优选地，所述螯合剂是生物惰性分子，诸如EDTA，众所周知其在与复合物溶解相关的浓度下不干扰细胞生长和增殖途径。

[0081] 对于除了藻酸盐和/或PEG以外的聚合物，本领域中已知以类似于用于藻酸盐和PEG的那些的方式结合结合部分和形成共聚物的方法。

[0082] 复合物的大小和形状所述复合物可以是与接触免疫细胞(例如，T细胞)的表面相容的任何形状。由于该原因，经常优选使复合物具有高表面积:体积比率以使可用的结合表面最大化。已经评估具有不同大小和形状的人工抗原呈递细胞平台的各种功能益处(参见Fadel等人, Nano
Letters 8 (2008): 2070-2076; Sunshine等人, Biomaterials 35 (2014): 269-277)。
该结构的形状可以是任何合适的形状，诸如细长形的，如丝，管状的，即具有内腔、平面或球形。在一些实施方案中，所述复合物可具有经配置为复制抗原呈递细胞和T细胞之间的免疫突触的表面。免疫突触的大小可以范围为小于50 nm至约20 µm。在一些实施方案中，本发明的复合物是颗粒，例如其为球形的。在大多数实施方案中，直径小于1,000μm。例如，所述复合物的直径可以在50 nm和20 μm之间(例如，在100 nm和15 μm之间，在200 nm和14 μm之间，在500 nm和13 μm之间，在1 μm和12 μm之间，或约10 µm)。例如，所述复合物可以是抗原呈递细胞、诸如树突状细胞或巨噬细胞的大小，其范围为约10-20 μm。或者，所述复合物可以包括较大基质，诸如多孔支架，其可以被机械地暴露，例如浸入细胞的悬浮液中。用于合成此类支架的方法(包括通过使用藻酸盐)是本领域中已知的。

[0083] 合成本发明的组合物可以通过任何合适的方式合成。本发明的方法包括合成共聚物(例如藻酸-PEG)以形成共聚物溶液。

[0084] 藻酸或另一种聚合物可以以下百分比(例如，重量/体积百分比)存在于共聚物溶液中：在0.01和10%之间 (例如，0.1%至0.15%、0.15%至0.2%、0.2%至0.3%、0.3%至0.4%、0.4%至0.5%、0.5%至0.6%、0.6%至0.7%、0.7%至0.8%、0.8%至0.9%、0.9%至1.0%、1.0%至2%、2%至2.5%、2.5%至3%、3%至4%、4%至5%、5%至7.5%或7.5%至10%，例如，约0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、
0.4%、0.45%、0.5%、0.6%、0.7%、0.75%、0.8%、0.9%、1.0%、1.5%、2.0%、2.25%、2.5%、3%、3.5%、
4%、4.5%、5%或10%)。

[0085] 合适的藻酸是中等粘度藻酸(例如，1-100 kDa中等粘度藻酸，例如，20 kDa中等粘度藻酸)。中等粘度藻酸(例如，20 kDa中等粘度藻酸)在水或水溶液中可以具有以下粘度：1至100,000厘泊(cP；例如，1至50 cP，50至100 cP，100至200 cP，200至500 cP，500至1,000 cP，1,000至5,000 cP，5,000至10,000 cP，10,000至20,000 cP，20,000至30,000 cP，30,000至40,000 cP，40,000至50,000 cP，或50,000至100,000 cP)，这取决于其浓度和/或组成(例如，作为共聚物，例如，作为藻酸-PEG共聚物的缀合物)。

[0086] 通过缀合单体(例如，藻酸与环氧烷，例如PEG，例如多臂PEG，例如4-臂PEG)来合成共聚物的方法是本领域中已知的。例如，藻酸盐-PEG共聚物可使用在藻酸、1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的分批反应(其使PEG与藻酸上的羧酸酯基缀合)中组合的胺化PEG来合成。在一些实施方案中，PEG(例如4-臂PEG-胺)以1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1或更大的摩尔比与藻酸缀合。在一些实施方案中，将PEG(例如4-臂PEG-胺)以约2:1的质量比与藻酸缀合。例如，在一些实施方案中，使10-100 mg/mL藻酸(例如，约22.5 mg/mL藻酸)与5-50 mg/mL PEG-胺(例如，4-臂PEG-胺；例如，约11.25 mg/ml PEG-胺，例如4-臂PEG-胺)反应。合适的缀合反应的条件是本领域中已知的。在一些实施方案中，在含有0.5 mg/ml至2.0 mg/ml磺基-NHS(例如，1.1 mg/ml磺基-NHS)和0.1 mg/ml至1.0 mg/ml EDC(例如，约0.4 mg/ml EDC)的溶液中，将藻酸与PEG在室温下缀合12-24小时(例如18小时，例如过夜)。

[0087] 所得共聚物溶液的粘度范围将取决于共聚物浓度。例如，具有30至40 mg/mL的藻酸-PEG浓度的共聚物溶液具有以下粘度：50至50,000 cP (例如，1至50 cP、50至100 cP、100至200 cP、200至500 cP、500至1,000 cP、1,000至5,000 cP、5,000至10,000 cP、10,000至20,000 cP、20,000至30,000 cP、30,000至40,000 cP、40,000至50,000 cP)
本发明提供了使用喷雾设备合成水凝胶复合物的方法。在一些实施方案中，将共聚物喷雾至作为阳离子溶液的接收溶液(例如，具有0.1 M至100 M、例如0.5 M至10 M、1 M至5
2+
M、2 M至4 M或3 M至3.5 M、例如约3.33 M的Ca 浓度的溶液)中。

[0088] 本发明提供了以有效和可缩放的方式合成水凝胶复合物的方法。例如，可以使用喷雾设备(例如，包括雾化器的设备)来合成水凝胶复合物。

[0089] 通常，聚合物溶液(例如，藻酸-PEG的水溶液)可以与压缩气体(例如氮气)同时注入雾化器中以雾化聚合物溶液，并产生液滴喷雾。这种喷雾可以被导入接收液体中以产生颗粒。该接收溶液可包含阳离子(例如聚阳离子，例如Ca2+)，并且在藻酸-PEG液滴和阳离子接收溶液之间接触后，液滴内的藻酸分子可以通过阳离子变得交联并形成水凝胶颗粒。可以包括额外组分作为接收溶液的一部分。例如，接收溶液可包括异丙醇，例如在阳离子交联期间和/或之后进一步硬化颗粒。另外或可替代地，根据需要，接收溶液可包括本领域中已知的其他稳定剂和/或表面活性剂。

[0090] 通过调整本发明方法的各种参数可以实现期望的颗粒大小。通常，颗粒大小(和，例如，所得的水凝胶复合物大小)与雾化喷雾中形成的液滴的大小有关(例如，颗粒大小与雾化喷雾中形成的液滴的大小成比例(例如成正比)或比其略小)。在没有外部变量的情况下，液滴大小(以及所得的颗粒或复合物大小)倾向于随着以下降低：(i)增加通过雾化器的气体压力或气体流速，(ii)降低流过雾化器的液体的体积百分比，(iii)降低聚合物溶液的粘度，和(iv)增加喷雾角。

[0091] 在一些实施方案中，使用雾化器形成水凝胶颗粒，所述雾化器以30%至90%(例如以体积计35%至80%、40%至75%、45%至70%、50%至65%或55%至60%液滴，例如以体积计35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%或75%至80%液滴)的液体的体积百分比喷雾。在这些体积分数下，所得水凝胶颗粒的大小将取决于上面论述的其他因素，但平均直径范围可以为10nm-1,000μm。在一些实施方案中，本文鉴定的液体与气体的体积百分比将产生微粒(例如，具有1.0 µm至1,000 µm、例如1.0 µm至500 µm、1.0 µm至200 µm、1.0 µm至100 µm、1.0至50 µm、1.0 µm至25 µm、1.0 µm至20 µm、2.0 µm至20 µm、2.0至15 µm、2.0 µm至10 µm或2.0 µm至5 µm的直径的颗粒)。在其他情况下，本文鉴定的液体与气体的体积百分比将产生纳米颗粒(例如，具有1.0 nm至1,000 nm、例如5 nm至800 nm、10 nm至600 nm、15 nm至500 nm、20 nm至400 nm、25 nm至300 nm、50 nm至250 nm或
100nm至200 nm、例如1 nm至50 nm、50 nm至100 nm、100 nm至200 nm、200 nm至300 nm、300 nm至400 nm、400 nm至500 nm、500 nm至600 nm、600 nm至700 nm、700 nm至800 nm、800 nm至900 nm或900 nm至1,000 nm的直径的颗粒)。

[0092] 液体(例如共聚物溶液)与气体(例如氮气)的体积百分比是通过雾化器的液体相对于气体的流速的函数。因此，增加通过雾化器的气体相对于液体的流速将倾向于导致较小的液滴大小(和例如较小的颗粒大小)。可通过加压储器控制气体流速。在许多实施方案中，气源是加压罐，并且通过压力控制和/或调节阀控制进入雾化器的气体流速。或者，可以通过其他方式，诸如泵(例如压力控制泵)使气体流过雾化器。提供流入(例如，基本上恒定流入)雾化器的任何气体储器都适合用作本发明的一部分。

[0093] 类似地，液体(例如聚合物溶液)可以使用加压储器，诸如注射泵(例如设定为恒定流速的注射泵)通过雾化器。或者，其他泵形式可用于驱动液体流动(例如聚合物溶液流动)，诸如蠕动泵。通过在延长的持续时间内进行大体积液体处理，系统诸如蠕动泵提供可扩展性的益处。然而，提供流入(例如，基本上恒定流入)雾化器的任何液体储器都适合用作本发明的一部分。

[0094] 在本发明的一些实施方案中，配置雾化器，使得可独立地控制液体流动和气体流动。此类雾化器包括外部混合雾化器，其中气体和液体流在不同的点离开雾化器喷嘴。外部混合雾化器使得平均雾化液滴大小(和例如所得的平均颗粒大小)能够增加或减少，例如分别通过降低或增加气体流速，同时保持液体流速恒定。

[0095] 或者，可以使用内部混合雾化器作为本发明的部分。内部混合雾化器在喷嘴内将气体引入液体。

[0096] 可以维持对液体(例如聚合物溶液)与气体(例如氮气)的体积百分比的进一步控制，例如通过使用球阀将液体储器(例如注射泵)连接至雾化器，以允许在液体加压后液体流动，由此防止雾化过程开始和结束时体积百分比的变化。

[0097] 本发明的聚合物溶液可以是粘性的(例如在20-25℃，粘度大于水，即大于近似0.9-1厘泊(cP))。粘度将取决于聚合物(例如藻酸-PEG共聚物)的浓度和温度。液体的粘度与雾化的液滴大小(和例如所得的颗粒大小)正相关。粘性溶液的雾化液滴大小与相应的雾化水滴之间的关系可以如下估算：
其中 =粘性液体的液滴大小， =水的液滴大小，并且 =粘性液体的粘度(cP)。

[0098] 应当理解，在非牛顿流体的情况下，粘度随剪切速率而变化。例如，含有藻酸和/或PEG的共聚物溶液可表现出剪切稀化行为，使得其粘度随剪切速率的增加而降低。在一些实施方案中，在雾化器内暴露剪切力后，共聚物溶液的表观粘度降低大于50％(在雾化器内暴露于剪切力后，降低大于60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)。因此，在评估粘度对水凝胶颗粒大小的影响时，应考虑共聚物溶液在雾化器孔内的表观粘度。影响给定剪切速率下(例如在雾化器内)的非牛顿流体的表观粘度的因素是本领域中已知的，并且可以通过已知方法计算和/或凭经验测试。

[0099] 雾化器的喷雾角是影响液滴大小的又另一种参数。通常，较宽的喷雾角与较小的所得液滴大小相关。本发明提供了使用1 °至50°(例如，5°至40°、10°至30°或15°至25°，例如1°至5°、5°至10°、10°至15 °、15°至20°、20°至25°、25°至30°、30°至35°、35°至40°、40°至45°或45°至50°)的喷雾角合成微粒(例如，具有1.0 µm至1,000 µm、例如1.0 µm至500 µm、
1.0 µm至200 µm、1.0 µm至100 µm、1.0至50 µm、1.0 µm至25 µm、1.0 µm至20 µm、2.0 µm至
20 µm、2.0至15 µm、2.0 µm至10 µm或2.0 µm至5 µm的直径的颗粒)的方式。或者，纳米颗粒(例如，具有1.0 nm至1,000 nm、例如5 nm至800 nm、10 nm至600 nm、15 nm至500 nm、20 nm至400 nm、25 nm至300 nm、50 nm至250 nm或100nm至200 nm、例如1 nm至50 nm、50 nm至
100 nm、100 nm至200 nm、200 nm至300 nm、300 nm至400 nm、400 nm至500 nm、500 nm至
600 nm、600 nm至700 nm、700 nm至800 nm、800 nm至900 nm或900 nm至1,000 nm的直径的颗粒)可以使用50°至150° (例如，60°至140°、70°至130°、80°至120°或90°至110°、例如50°至60°、60°至70°、70°至80°、80°至90°、90°至100°、100°至110°、110°至120°、120°至130°、
130°至140°或140°至150°)的喷雾角进行合成。

[0100] 在一些实施方案中，所述雾化器产生圆形喷雾模式，其产生圆锥形、半圆锥形、圆顶形或半圆柱形的喷雾形状，这取决于喷雾角、流速和液滴大小。因此，喷雾角与雾化喷雾的总体积正相关。在本发明的一些实施方案中，所述雾化器将共聚物液滴向下喷雾(例如，喷入接收溶液中)，并且所述喷雾角决定喷雾的宽度(例如，直径)。在一些实施方案中，在接收溶液的表面的喷雾的宽度为1.0 cm至1,000 cm (例如，2.0 cm至100 cm、3.0 cm至80 cm、5 cm至70 cm、10 cm至60 cm、20 cm至50 cm或20 cm至40 cm，例如，1.0 cm至2.0 cm、2.0 cm至3.0 cm、3.0 cm至4.0 cm、5.0 cm至6.0 cm、6.0 cm至7.0 cm、7.0 cm至8.0 cm、
8.0 cm至9.0 cm、10 cm至15 cm、15 cm至20 cm、20 cm至30 cm、40 cm至50 cm、50 cm至60 cm、60 cm至70 cm、70 cm至80 cm、80 cm至90 cm、90 cm至100 cm或更大)。

[0101] 在一些实施方案中，将所述雾化器定位在接收溶液的表面上方5 cm至1,000 cm(例如，接收溶液的表面上方10 cm至100 cm、15 cm至85 cm、20 cm至80 cm、25 cm至75 cm、30 cm至70 cm、35 cm至65 cm或40 cm至60 cm，例如，5 cm至10 cm、10 cm至15 cm、15 cm至
20 cm、20 cm至25 cm、25 cm至30 cm、30 cm至40 cm、40 cm至50 cm、50 cm至60 cm、60 cm至70 cm、70 cm至80 cm、80 cm至90 cm、90 cm至100 cm或更大)的高度。

[0102] 给定上述喷雾的高度、宽度(例如，直径)和形状，喷雾的总体积可以近似为圆锥体、圆柱体的相应体积或它们之间的值。因此，本发明包括1.3 cm3至1000 m3 (例如，2 cm33 3 3 3 3 3 3 3 3 3
至100 m、5 cm 至10 m、10 cm至5 m、50 cm至1 m 、100 cm至0.1 m 或1,000 cm至0.01 m3)的圆锥形总喷雾体积，3 cm3至3000 m3 (例如，2 cm3至100 m3、5 cm3至10 m3、10 cm3至5 m3、50 cm3至1 m3、100 cm3至0.1 m3或1,000 cm3至0.01 m3)的半圆柱形喷雾体积，以及从其中衍生上述值的圆锥形和圆柱形的体积之间的任何体积。

[0103] 本发明的特征在于容纳以上配置中的任何一种或多种的喷雾设备。在一些实施方案中，本发明的特征在于模块化喷雾设备，其可以进行修改以容纳例如从雾化器至接收溶液和/或接收储器的各种距离。在该情况下，所述喷雾设备包括桩脚式平台组件，以使得使用者能够改变喷雾的总体积(例如，通过必要时相对于雾化器上下移动接收溶液)。

[0104] 在水凝胶颗粒合成后，可以使用标准方法(例如无菌过滤方法，例如使用140μm尼龙过滤器)过滤颗粒。可以通过例如标准离心/重悬方法，另外浓缩或纯化颗粒悬浮液。

[0105] 另外或可替代地，可以使用本领域中目前已知的方法合成本发明的水凝胶颗粒和/或复合物。例如，水凝胶复合物可通过常规微乳方法配制成微粒。用于合成藻酸盐珠粒用于各种应用的方法是本领域中已知的(参见，例如，Hatch等人，Langmuir 27 (2011): 4257-4264和Sosnik, ISRN Pharmaceutics (2014):1-17)。

[0106] 可以使用标准缀合技术，包括马来酰亚胺/硫醇和EDC/NHS连接实施结合部分缀合(例如抗体缀合)。其他有用的缀合方法描述于Hermanson等人，(2013) Bioconjugate Techniques：Academic Press。在一些实施方案中，在颗粒形成后立即发生结合部分缀合，例如如上所述。或者，在与结合部分缀合之前将颗粒储存(例如作为冷冻悬浮液或冻干粉末)，并且在细胞处理之前(例如在临细胞处理之前，进行或不进行进一步纯化，例如过滤和/或离心/重悬)进行结合部分缀合。

[0107] 使用方法本发明的特征在于使用上述颗粒或水凝胶复合物调节免疫细胞、例如扩增T细胞群体的方法。在调节例如扩增之前，可以从受试者或替代来源(例如冷冻细胞储备物或细胞系)获得免疫细胞(例如T细胞)的来源。免疫细胞(例如T细胞)可以获得自许多来源，包括外周血单核细胞(PBMC)，骨髓，淋巴结组织，脾组织，肿瘤或同种异体或自体细胞的冷冻储备物。
在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域中可获得的免疫细胞，例如T细胞。免疫细胞，例如T细胞，也可以使用技术人员已知的任何数目技术，诸如Ficoll分离或通过PERCOLL®梯度从收集自受试者的血液单元获得。来自受试者的循环血液的细胞(例如，PBMC)可以通过血液分离术或白细胞分离术获得。血液分离术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白血细胞、红血细胞和血小板。可以洗涤通过血液分离术收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞放置在适当的缓冲液或介质中用于随后的处理步骤。
在用本发明的复合物处理之前，可以通过常规技术诸如磁珠阴性选择或荧光活化细胞分选(FACS)来富集免疫细胞，例如T细胞。免疫细胞，例如T细胞，可以是抗原特异性的、抗原非特异性的或肿瘤特异性的。它们可以包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK T细胞的群体，或者对于自身免疫或移植排斥疗法，包括调节性T细胞的群体。它们可以包括调节性T细胞、NK细胞、NK T细胞、CIK细胞、TIL细胞、HS细胞(未分化和分化的)、MS细胞(未分化和分化的)、iPS细胞(未分化和分化的)或ES细胞(未分化和分化的)的群体。

[0108] 除了分离步骤以外，可以在与本发明的复合物孵育之前或之后进一步处理已从受试者获得的免疫细胞，例如T细胞。例如，细胞可以经历基因工程改造，使其具有某些功能特征，诸如在嵌合抗原受体(CAR)工程改造的过程中，其使患者的细胞识别癌抗原。在该情况下，可以在用本发明的复合物处理之前进行CAR工程改造程序，以将初始少量的CAR T细胞扩增为大量的活化群体。用于过继性疗法的其他基因程序论述于Rosenburg等人 (Nat Rev Cancer 8 (2008): 299-308)。在其他实施方案(诸如不涉及基因修饰的那些，诸如双特异性T细胞接合剂(BITE)技术(参见，例如，WO 2011/057124))中，可以在已使用本发明扩增细胞后进行程序。其他非基因处理程序包括但不限于用IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21或TGF-β处理。

[0109] 样品处理在本发明的一个方面，将起始免疫细胞群体、例如T细胞群体与复合物一起孵育。复合物与起始细胞数目的比率将取决于复合物的大小和形状。为此目的，本领域技术人员将理解，靶免疫细胞(例如，T细胞)和复合物之间的表面积的比率是决定所得免疫细胞(例如T细胞)扩增和/或活化的程度的重要因素。在一些实施方案中，靶细胞和颗粒复合物(例如，微粒复合物，例如具有1μm和100μm之间(例如约10μm)的平均直径的复合物)的表面积比率为约1:100和约100:1之间(例如，约1:100、约1:80、约1:50、约1:25、约1:10、约1:5、约1:4、约
1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约10:1、约25:1、约50:1、约80:1或约100:
1)。在一些实施方案中，颗粒复合物相对于细胞的量通过复合物相对于细胞的量来测量。例如，在含有1.2 x 106个T细胞/mL的初始细胞培养物或在具有约400 mL的体积的初始细胞培养物中，颗粒复合物(例如，微粒复合物，例如具有1 µm和100 µm之间(例如，约10 µm)的平均直径的复合物)的初始数目可以是0.1 x 106至20 x 106，0.5 x 106至10 x 106，1 x
106至6 x 106。在一些实施方案中，可以按质量测量复合物。例如，在含有1.2 x 106个T细胞/mL的初始细胞培养物或在具有约400 mL的体积的初始细胞培养物中，复合物(例如，微粒复合物，例如具有1 µm和100 µm之间(例如，约10 µm)的平均直径的复合物)的初始质量可以是1.0 µg/mL至1.0 mg/mL (例如，2.0 µg/mL至800 µg/mL、5.0 µg/mL至500 µg/mL、10 µg/mL至400 µg/mL、20 µg/mL至300 µg/mL、50 µg/mL至250 µg/mL，例如，1.0 µg/mL至5.0 µg/mL、5.0 µg/mL至10 µg/mL、10 µg/mL至20 µg/mL、20 µg/mL至30 µg/mL、30 µg/mL至40 µg/mL、40 µg/mL至50 µg/mL、50 µg/mL至60 µg/mL、60 µg/mL至75 µg/mL、75 µg/mL至100 µg/mL、100 µg/mL至200 µg/mL、200 µg/mL至250 µg/mL、250 µg/mL至500 µg/mL、500 µg/mL至750 µg/mL、750 µg/mL至1.0 mg/mL、1.0 mg/mL至1.5 mg/mL或1.5 mg/mL至2.0 mg/mL。应理解，任何上述参考量可以随者培养物内的细胞浓度可缩放。当将起始免疫细胞(例如T细胞)与复合物一起孵育时应考虑的其他因素是复合物表面上的结合部分的密度和选择的特异性结合部分(例如，其结合亲和力，或EC50，免疫细胞(例如T细胞)上的受体浓度)。
应当理解，当免疫细胞(例如T细胞)在多天的过程中增殖时，它们的体积需求将增加，这可能限制可分配至复合物的总体积。

[0110] 孵育程序本发明的方法包括在合适的容器中将免疫细胞(例如T细胞)与复合物一起孵育。此类细胞培养容器是本领域中已知的，并且可以包括任何合适大小的细胞培养板、烧瓶或生物反应器。容器的类型或大小可以随着细胞群体扩增而改变(例如，从6孔板至T25烧瓶至T75烧瓶)。细胞培养容器优选是无菌的，并且可以被配置用于最佳的气体交换或培养基交换，诸如可灌注系统，其为本领域中已知的。含有免疫细胞(例如T细胞)的细胞群体可以以任何
6 6
合适的浓度接种，用于诱导扩增，如本领域中已知。例如，可以以约0.2 x 10 和10 x 10 个细胞/ml之间(例如，0.5 x 106和1.5 x 106之间，例如约0.5 x 106或约1.2 x 106个细胞/ml)的浓度接种细胞。

[0111] 复合物可能需要特殊的离子条件，例如，以维持溶液中的固体结构。例如，细胞培2+
养基可以通过添加盐(例如CaCl2)来用离子(诸如阳离子，例如聚阳离子，例如Ca )补充。离子可以以任何生理上合适的浓度(例如，1.0 nM至100 mM，例如，1.0 μM至10 mM，例如，0.1 mM至10 mM，例如，0.1 mM、0.2 mM、0.5 mM、1.0 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM或10 mM)存在。

[0112] 免疫细胞(例如T细胞)扩增培养基中可以包括额外因子。此类因子包括本领域中已知的小分子、肽和蛋白因子，例如维生素、氨基酸、细胞因子或生长因子。已知支持免疫细胞(例如T细胞)扩增的细胞因子包括白介素-1 (IL-1)、IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23和干扰素-γ(IFN-γ)。扩增培养基中可包括的小分子因子包括mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)和AKT抑制剂(例如AKT抑制剂VIII)。

[0113] 细胞扩增离体免疫细胞(例如T细胞)扩增方案得到充分开发，尤其是对于人样品，并且在培养多周的过程中，通常可以使细胞数在百倍范围内增加。因此，可能需要多轮扩增来克服对物理空间和培养基营养物耗竭的限制。为了适应这些限制，本发明的复合物可以在免疫细胞(例如T细胞)扩增方案的过程中(例如，在1周至6周的过程中，例如在1至2周、2至3周或3至4周的过程中，例如在7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、21天或更多天的过程中)溶解和重新应用多次(例如，一次、两次或3-12次)。可以通过在每次溶解后通过离心或其他已知方法从介质中洗去阳离子螯合剂来实现此类溶解/重新应用循环。或者，可以在不去除现有复合物的分离单元的情况下将额外复合物引入培养物中，因此无需进行培养基改变。

[0114] 在本发明的一个方面，免疫细胞(例如T细胞)扩增方案进行预定的时间长度，其适合于生成期望数目的T细胞、代表性表型或两者。例如，本发明的方法可用于使起始细胞(例+ +如，T细胞，例如，CD4 T细胞和/或CD8 T细胞)的数目扩增1倍至1,000,000倍或更多倍(例如，大于10倍、大于100倍、大于1,000倍、大于10,000倍、大于100,000倍或大于1,000,000倍，例如1倍至10倍、10倍至100倍、100倍至1,000倍、1,000倍至10,000倍、10,000倍至100,
000倍或100,000倍至1,000,000倍)。在一些实施方案中，使起始群体在9天内扩增100倍至
1,000倍(例如，200倍至400倍，或300倍至350倍)。

[0115] 可以通过各种方法监测本发明的免疫细胞群体、例如T细胞群体的表型特性，并且可以在获得期望表型之后进行分离。相关表型是代谢变化，诸如生物化学或形态学变化(例如，细胞分裂的频率的变化，细胞因子表达概况的改变，细胞直径(例如，中值细胞直径)的变化，表面分子表达的变化，或细胞运动性的变化)。用于监测此类变化的测定包括标准流式细胞术方法、ELISA、显微镜检查、迁移测定、代谢测定和本领域技术人员已知的其他技术。可以相对于参考细胞或参考群体确定所得细胞的表型。在通过流式细胞术测定的标志物的表达水平的情况下，例如，参考群体可以是未染色或用同种型抗体染色的细胞的群体(例如，“荧光减一”对照)。

[0116] 本发明的方法提供了含有免疫细胞(例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)的细胞群体的扩增。在一些实施方案中，当细胞扩增时，所述水凝胶复合物的一种或多种特性(例如，结合部分的刚度、亲水性、密度和/或结合部分)影响细胞的表型，如前所论述。例如，通过用具有低弹性模量聚合物部分(例如，在与细胞孵育的过程中的一个或多个时间点具有100帕斯卡(Pa)和100,000,000 Pa之间(例如，100 Pa至1,000 Pa，1,000 Pa至10,000 Pa，10,000 Pa至100,000 Pa之间，100,000 Pa和1,000,000 Pa之间，1,000,000 Pa和10,000,000 Pa之间，或10,000,000 Pa和100,000,000 Pa之间，例如小于1,000,000 Pa，小于900,000 Pa，小于800,000 Pa，小于700,000 Pa，小于600,000 Pa，小于500,000 Pa，小于400,000 Pa，小于300,000 Pa，小于200,000 Pa，小于100,000 Pa，小于50,000 Pa，或小于10,000 Pa)的弹性模量的基于藻酸的聚合物部分)的复合物培养免疫细胞(例如T细胞)的起始群体，所得的免疫细胞(例如T细胞)的群体可具有相对于参考群体(例如起始群体或对照群体，例如，使用对照珠粒或可溶性因子)更大数目或百分比的特定细胞，例如CD8+ T细胞。例如，扩增的群体可含有相对于其参考群体(例如起始群体或对照群体，例如，使用对照珠粒或可溶性因子)大于1.1倍、大于1.2倍、大于1.3倍、大于1.4倍、大于1.5倍、大于1.6倍、大于1.7倍、大于
1.8倍、大于1.9倍、大于2倍、大于2.5倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于7倍、大于8倍、大于9倍、大于10倍、大于12倍、大于15倍、大于20倍、大于30倍、大于40倍、大于50倍或大于100倍)数目的特定细胞，例如CD8+ T细胞。类似地，使用本发明的复合物扩增的免疫细胞(例如T细胞)的群体可具有相对于参考群体(例如起始群体或对照群体，例如，使用对照珠粒或可溶性因子)较少数目或百分比的特定细胞，例如CD4+ T细胞。例如，扩增的群体可以含有相对于其参考群体(例如，起始群体或对照群体，例如，使用对照珠粒或可溶性因子)少95%以上、少90%以上、少80%以上、少70%以上、少60%以上、少50%以上、少40%以上或少
30%以上的特定细胞，例如CD4+ T细胞。类似地，扩增的T细胞群体可以具有比参考群体更大的细胞比率，例如，CD8:CD4 T细胞比率。例如，扩增的群体中的细胞比率(例如CD8:CD4 T细胞比率)可以是相对于其参考群体的大于1.1倍、大于1.2倍、大于1.3倍、大于1.4倍、大于
1.5倍、大于1.6倍、大于1.7倍、大于1.8倍、大于1.9倍、大于2倍、大于2.5倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于7倍、大于8倍、大于9倍、大于10倍、大于12倍、大于15倍、大于20倍、大于30倍、大于40倍、大于50倍或大于100倍。一般而言，本发明的方法可用于扩增群体中的免疫细胞(例如T细胞)，例如使得所得的细胞群体(例如，混合淋巴细胞的群体)含有相对于其参考群体的大于1.1倍、大于1.2倍、大于1.3倍、大于1.4倍、大于1.5倍、大于1.6倍、大于1.7倍、大于1.8倍、大于1.9倍、大于2倍、大于2.5倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于7倍、大于8倍、大于9倍、大于10倍、大于12倍、大于15倍、大于20倍、大于30倍、大于
40倍、大于50倍或大于100倍数目的免疫细胞(例如T细胞)。

[0117] 在一些实施方案中，本发明的方法允许扩增含有幼稚T细胞、中央记忆T细胞和/或效应记忆细胞的免疫细胞的群体。水凝胶的组成可影响群体(例如扩增的群体)中存在的幼稚T细胞、中央记忆T细胞和/或效应记忆细胞的百分比和/或总数。例如，通过用具有低弹性模量聚合物部分(例如，在与细胞孵育的过程中的一个或多个时间点具有100帕斯卡(Pa)和100,000,000 Pa之间(例如，100 Pa至1,000 Pa，1,000 Pa至10,000 Pa，10,000 Pa至100,
000 Pa之间，100,000 Pa和1,000,000 Pa之间，1,000,000 Pa和10,000,000 Pa之间，或10,
000,000 Pa和100,000,000 Pa之间，例如小于1,000,000 Pa，小于900,000 Pa，小于800,
000 Pa，小于700,000 Pa，小于600,000 Pa，小于500,000 Pa，小于400,000 Pa，小于300,
000 Pa，小于200,000 Pa，小于100,000 Pa，小于50,000 Pa，或小于10,000 Pa)的弹性模量的基于藻酸的聚合物部分)的复合物培养T细胞的起始群体，所得的T细胞的群体可包括高百分比的幼稚T细胞(例如，幼稚CD4+ T细胞或幼稚CD8+ T细胞)。在一些情况下，幼稚T细胞被表征为具有表I的一种或多种特性(表面标志物或分泌的细胞因子)(例如，相对于参考群体)。

[0118] 表I. 记忆T细胞亚型标志物表达的模型T细胞亚型表面标志物表达概况分泌概况
幼稚T细胞 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ CD62L+ IL-4- IFN-γ-
- + + + - -
中央记忆T细胞 CD45RA CD45RO CCR7 CD62L IL-4 IFN-γ
效应记忆T细胞 CD45RA- CD45RO+ CCR7- CD62L- IL-4+ IFN-γ+

[0119] 使用本文提供的水凝胶复合物的方法还可以诱导不同的活化标志物表达概况(例如，CD25、CD69和/或其他活化标志物的表达概况(例如，表面标志物和/或细胞因子分泌))。例如，用具有低弹性模量聚合物部分(例如，在与细胞孵育的过程中的一个或多个时间点具有100帕斯卡(Pa)和100,000,000 Pa之间(例如，100 Pa至1,000 Pa，1,000 Pa至10,000 Pa，10,000 Pa至100,000 Pa之间，100,000 Pa和1,000,000 Pa之间，1,000,000 Pa和10,
000,000 Pa之间，或10,000,000 Pa和100,000,000 Pa之间，例如小于1,000,000 Pa，小于
900,000 Pa，小于800,000 Pa，小于700,000 Pa，小于600,000 Pa，小于500,000 Pa，小于
400,000 Pa，小于300,000 Pa，小于200,000 Pa，小于100,000 Pa，小于50,000 Pa，或小于
10,000 Pa)的弹性模量的基于藻酸的聚合物部分)的复合物培养T细胞的起始群体可以导致相对于参考群体的活化标志物表达(例如CD25和/或CD69)的更低表达。例如，活化标志物可以在沿着扩增方案的一个或多个时间点具有更低的相对表达(例如，活化标志物的峰值表达)，活化标志物可以以相对于对照组较慢的速率增加，或者活化标志物可以在相对于对照组更大的程度上被下调(例如，在初始表达或上调之后)。

[0120] 在本文所述的方法的一些实施方案中，水凝胶复合物处理以相对于对照组更慢的速率(例如，小于速率的95%，小于速率的90%，小于速率的80%，小于速率的70%，小于速率的+ +60%，小于速率的50%，小于速率的40%或小于速率的30%)诱导CD4 T细胞和/或CD8 T细胞上的CD25上调。在一些实施方案中，CD25表达在沿着扩增期的任何点(例如，在扩增期结束时)相对于对照组降低(例如，少至少10%，少至少20%，少至少30%，少至少40%，少至少50%，少至少60%，少至少70%，少至少80%或少至少90%)。

[0121] 用水凝胶复合物处理也可以影响CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CD69表达。在一些实施方案中，水凝胶复合物处理诱导相对于对照组更慢的CD69上调速率(例如，小于速率的95%，小于速率的90%，小于速率的80%，小于速率的70%，小于速率的60%，小于速率的50%，小于速率的40%或小于速率的30%)。在一些实施方案中，CD69表达在沿着扩增期的任何点(例如，在其峰值表达时或在扩增期结束时)相对于对照组降低(例如，少至少10%，少至少20%，少至少30%，少至少40%，少至少50%，少至少60%，少至少70%，少至少80%或少至少90%)。另外或可替代地，作为水凝胶复合物处理的结果，CD69的峰值表达可以相对于对照组更低(例如，对照组的峰值表达的小于95%、小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%或小于20%)。

[0122] 纯化在阳离子(例如，钙)存在的情况下，将藻酸交联并固化。在完成免疫细胞(例如，T细胞)处理后，可通过在含有螯合剂的释放缓冲液中孵育，以使复合物液化并释放免疫细胞(例如，T细胞)，来溶解(例如液化)水凝胶。由此可以清除所得的免疫细胞(例如，T细胞)的杂质，并准备输注至有需要的患者中。

[0123] EDTA是用于本发明中的充分表征的钙螯合剂。EDTA可以以生理惰性缓冲液的形式以0.1 mM至10 mm的浓度(例如，以0.5 mM至5 mM、0.7 mM至3 mM或1.0 mM至2.0 mM的浓度，例如以1.0 mM、1.5 mM或2.0 mM的浓度)使用。本发明的释放缓冲液还可以包括例如NaCl(例如，约137 mM)，KCl (例如，约2.7 mM)，Hepes(例如，约25 mM)和/或Na2H2PO4∙2H2O(例如，约0.75 mM)。

[0124] 可以通过离心和随后将细胞沉淀物再悬浮于例如EDTA缓冲液中来将细胞培养基换成离子螯合剂溶液，例如EDTA缓冲液。也可以使用其他方法。例如，可通过可控地或逐渐地添加低浓度的螯合剂和/或通过除去Ca2+补充物来实现缓慢释放。细胞/离子螯合剂悬浮液也可以例如通过移液或涡旋约5秒来搅拌。在该步骤期间，水凝胶溶解，并释放细胞。然后可以将分离的细胞返回至细胞培养基或等渗溶液(例如，用于施用于患者)。

[0125] 在某些实施方案中，在本发明的复合物不存在的情况下，使结合免疫细胞(例如，T细胞)的结合部分(例如抗体)与细胞接触。然后可以添加结合与T细胞结合的结合部分的复合物用于孵育和/或扩增。

[0126] 溶解水凝胶的替代方法在本文中描述并且是本领域中已知的。例如，可以通过温度变化、pH变化、水解、氧化、酶促降解或物理降解来溶解水凝胶。实施例

[0127] 实施例1. 喷雾设备组装如下制备喷雾设备。将32-加仑罐(70 cm高X 55 cm宽；RUBBERMAID® BRUTE®圆形容
器)置于15.5 cm水平块上，使得从罐顶部至地面的距离为85.5 cm。将罐的内部用70%异丙醇喷雾并擦拭。调节桩脚式平台(jack rig)以将平台保持在20 cm的高度，并使用水平仪进行调平。将桩脚式平台置于罐的底部的四个螺栓上。

[0128] 将与罐的横截面匹配的喷雾储器用70%异丙醇喷雾并擦拭。在将喷雾储器组装在罐内前，向其中添加2.0 L的接收溶液。通过合并1,000 mL的70%异丙醇、970 mL的无菌水和30mL的3.33 M CaCl2来制备接收溶液，产生2 L体积的35%异丙醇、50 mM CaCl2。然后将喷雾储器置于罐内的桩脚式平台上。

[0129] 将喷嘴座用70%异丙醇喷雾并擦拭，并置于罐的顶部边缘上，其中其雾化器配件面朝上。使用预先测量的罐和喷嘴座上的标记，将喷嘴座置于罐上的中央。使用2-3/4英寸螺钉将喷嘴座固定至罐。

[0130] 圆形喷雾雾化器(XA 050A；BETE Fog Nozzle, Inc.)在其液体进口侧处连接至球阀，所述球阀经由TYGON®管道连接至30 mL注射器。依次将10 mL 70%异丙醇、10 mL水和30 mL空气转移至注射器中，并通过雾化器冲洗。

[0131] 雾化器的进气侧经由管道连接至压缩氮气罐调节阀，并将雾化器置于喷嘴座上的配件内。使用2-3/4英寸螺钉将压缩的氮气管道固定至喷嘴座，注意不要过度拧紧螺钉，以避免压缩管道。在雾化器上，通过将橡皮带从一个螺钉拉至另一个螺钉，将雾化器固定在配件内。

[0132] 打开压缩氮气罐阀门以将压力设置为50 psi，此时关闭调节阀。

[0133] 将罐盖用70%异丙醇喷雾并擦拭，并定位在罐的顶部边缘上，使得盖开口与管道的两端对齐。使用橡皮条将罐盖固定到位，其使用螺钉固定至罐的侧面和罐盖的顶部。

[0134] 实施例2. 水凝胶复合物的合成首先通过将藻酸钠与4-臂PEG胺缀合来合成藻酸-PEG共聚物。将藻酸钠和4-臂PEG胺以
2:1藻酸钠与PEG-胺(22.5 mg/mL藻酸钠和11.25 mg/mL PEG-胺)的比率溶解于水中，随后添加EDC (0.4 mg/mL)和磺基-NHS (1.1 mg/mL)。PEG -藻酸盐缀合反应在室温下发生过夜。

[0135] 使用如实施例1中制备且在图2中举例说明的喷雾设备将水凝胶复合物形成为微粒。通常，喷雾设备包括注射泵以将共聚物溶液注射至雾化器中，所述雾化器在来自气体筒的压力下将溶液作为气溶胶引导至含有阳离子液体的喷雾容器中，在所述喷雾容器中水凝胶固化为颗粒。

[0136] 用上述制备的聚合物溶液装载注射器。打开调节阀以在50 psi的压力下诱导来自压缩氮气罐的氮气流。使用设置为10 mL/分钟的流速的注射泵将聚合物溶液自动注入雾化器。雾化器以约60 mm的喷雾半径相对于每个进气阀垂直向下喷洒雾化的喷雾。喷雾在混合下与喷雾储器中的接收溶液接触，并使水凝胶颗粒固化。

[0137] 将所得的水凝胶颗粒的悬浮液从喷雾储器转移至重力过滤系统(STERIFIL®无菌系统和保持器；140 µm尼龙过滤器)中，并收集在1L Erlenmeyer烧瓶中。将水凝胶颗粒通过离心浓缩，并重悬浮于HEPES缓冲盐水(HBS)中。

[0138] 在细胞培养前立即将抗体与水凝胶颗粒缀合。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆28.2)在含有标准浓度的EDC和磺基-NHS的HBS中与微粒一起孵育，以缀合至藻酸-PEG水凝胶微粒的表面。

[0139] 为了评价复合物的大小和形态分布，将悬浮液在高和低浓度下在显微镜下可视化，如图2A-2D中所示。然后复合物通过离心洗涤并储存于含有20 mM Ca2+的HBS (pH 7.4)中。

[0140] 实施例3. 使用抗CD3/抗CD28水凝胶复合物扩增T细胞通过使用常规方法选择CD3表达来从人外周血纯化T细胞。将T细胞每孔以0.5 x 106个细胞/400 mL培养基(补充有胎牛血清(FBS)、GLUTAMAXTM、HEPES、15 ng/mL IL-2和2 mM CaCl2的RPMI)接种于24孔板中。如实施例2所述生成的水凝胶复合物以5:1或10:1的复合物:细胞比率添加，并且通过温和搅拌混合每种复合物/细胞悬浮液。根据制造商的说明，对照组包括未刺激的细胞以及以3:1的珠粒:细胞比率用对照抗CD3/抗CD28珠粒处理的细胞。

[0141] 在细胞增殖的过程中，根据需要每2-3天将细胞培养物转移至较大的容器中，并用新鲜培养基补充。具体而言，将培养物从24孔板转移至6孔板，从6孔板转移至T25烧瓶，并且从T25烧瓶转移至T75烧瓶。

[0142] 9天后，将细胞培养物离心并弃去上清液，并将细胞和复合物重悬浮于含有1 mM EDTA的缓冲液中。该悬浮液的搅拌使复合物溶解，并通过离心洗涤细胞。

[0143] 在扩增的过程中，对细胞总数计数。如图3中所示，水凝胶复合物在比对照珠粒相似或更大的程度上诱导T细胞增殖(即，从0.5 x 106个细胞至160 x 106个细胞和180 x 106个细胞之间，即从约320倍至约360倍)。重要的是，相对于对照珠粒，由水凝胶复合物扩增的T细胞包括显著更大数目和频率的CD8+细胞，如图4A和4B中所示。图4A显示，尽管对照珠粒在处理9天后对扩增群体中的CD4+细胞的百分比几乎没有影响，但水凝胶复合物在5:1复合物:细胞比率下使CD4+细胞的相对数目减少超过30%，并且在10:1复合物:细胞比率下使CD4++细胞的相对数目减少约60%。相反，图4B显示，扩增群体中的CD8细胞的百分比在5:1复合物:细胞比率下增加约100%，并且在10:1复合物:细胞比率下增加接近175%，而CD8+频率作为用对照珠粒扩增的结果略微下降。因此，水凝胶复合物达到或超过对照珠粒的扩增，同时将扩增的T细胞表型偏向细胞毒性CD8+细胞。

[0144] 在处理的过程中在CD8+ T细胞和CD4+ T细胞上表达的活化标志物显示于图5A-5D中。与对照珠粒相比，作为用水凝胶复合物处理的结果，CD25和CD69的表达概况不同。具体而言，水凝胶复合物诱导CD8+ T细胞和CD4+ T细胞两者中的CD25表达的逐渐增加，其在第5天达到峰值。相反，对照珠粒触发CD8+ T细胞和CD4+ T细胞两者中的CD25表达的迅速增加，其在第2天达到100%表达，并且在整个9天培养中得到维持。(图5A和5B)。图5C和5D显示CD69表达的动力学，其在水凝胶复合物处理的细胞中在比对照珠粒处理的细胞中更小的程度上上调，并且在培养的第2天和第5天之间在所有处理组中都降低。对于每种细胞类型，相对于5:1水凝胶复合物:细胞比率，10:1水凝胶复合物:细胞比率诱导CD25和CD69的略微更高的表达。图6A-6D显示对应于分别如图5A-5D中所示的在第2天和第8天以10:1复合物:细胞比率的对照珠粒和水凝胶复合物的流式细胞术图。

[0145] 实施例4. 配体和配体密度的调节调节T细胞扩增原代人CD3+ T淋巴细胞以1x106个细胞/mL的密度接种，并且在补充有胎牛血清、谷氨酸、HEPES和重组人IL-2的高级RPMI培养基中培养。在第0天，用相等数目的与各种比率的抗体(图7中所示的比率的抗CD3、抗CD27或抗CD28抗体)缀合的水凝胶复合物刺激细胞。细胞扩增呈现为群体倍增数(P.D.)，并且表明配体和配体密度对T细胞生长的影响。

[0146] 实施例5. 配体和配体密度的调节调节T细胞表型原代人CD3+ T淋巴细胞以1x 106个细胞/mL的密度接种，并且在补充有胎牛血清、谷氨酸、HEPES和重组人IL-2的高级RPMI培养基中培养。在第0天，用相等数目的与各种比率的抗体(图8中所示的比率的抗CD3、抗CD27或抗CD28抗体)缀合的水凝胶复合物刺激细胞。扩增细胞群体中的CD4+和CD8+ T细胞的数目呈现为%细胞群体，并且表明配体和配体密度对扩增细胞群体相比于第0天起始群体的CD4+/CD8+比率的影响。

[0147] 实施例6. 配体和配体密度的调节调节记忆表型原代人CD3+ T淋巴细胞以1x 106个细胞/mL的密度接种，并且在补充有胎牛血清、谷氨酸、HEPES和重组人IL-2的高级RPMI培养基中培养。在第0天，用相等数目的与各种比率的抗体(图9中所示的比率的抗CD3、抗CD27或抗CD28抗体)缀合的水凝胶复合物刺激细胞。分析扩增细胞群体中的CD4+和CD8+ T细胞的早期T细胞记忆表型标志物CD45RA和CCR7的表达，数据呈现为%细胞群体，并且表明配体和配体密度对扩增的CD4+和CD8+细胞群体相比于第0天起始群体的表达CD45RA和/或CCR7的群体比率的影响。

[0148] 其他实施方案在权利要求中。

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