利用固相固定的微生物转谷氨酰胺酶MTG和溶液中的MTG对抗
体赖氨酸残基的位点特异性缀合
[0001] 本
发明涉及使用微珠固定的MTG(微生物转谷氨酰胺酶MTG)和/或溶液中的MTG
聚合物缀合物和/或溶液中的游离MTG使有机分子与
蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法。
[0002] 近年来，蛋白质的酶促位点特异性官能化已经在生物缀合领域引起了相当大的兴趣。通过酶进行的生物缀合反应通常显示出在低
试剂浓度(亚毫摩尔)下的快速动
力学、高转化效率并且可以在生理条件下进行。
[0003] 尽管有这些益处，但随后必须从混合物中除去酶以避免任何下游干扰并因此损失。通过固相固定，可以通过简单的酶回收来避免这种情况。迄今为止，酶的固定的几乎仅应用于小化合物的转化，并且据报道，其增强酶的
稳定性并且还可以导致提高的活性、选择性或选择性。尚未报道在不同蛋白质形式的数轮缀合的连续操作下对大分子量底物例如蛋白质进行位点特异性修饰的固定化酶的可调性质(即对某些残基增强的选择性)。
[0004] 最近Policarpo等表明酶与Ni-NTA琼脂糖珠的缀合。不幸的是，这种缀合具有非共价性质并且显示出柱流失的高
风险。
[0005] 因此，本发明的目的是提供这样的方法，该方法提供用于在活性流动反应器柱或旋转柱中使用以实现高速率的牢固固定的酶和/或在溶液中的酶，以用于有机分子与蛋白质的期望缀合，同时避免酶的任何显著的柱流失。
[0006] 根据本发明，该目的通过使用固定和/或非固定形式的MTG(微生物转谷氨酰胺酶)使有机分子与靶蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法实现，其包括以下步骤：
[0007] a)通过暴露聚合物的交叉
反应性基团将所述MTG连接到所述聚合物以固定所述MTG；
[0008] b)将所述MTG聚合物缀合物
吸附在微珠上或使所述MTG聚合物缀合物成为溶液；
[0009] c)用吸附有所述MTG聚合物缀合物的微珠和/或包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含所述MTG的溶液填充活性流动反应器柱；
[0010] d)在确定的条件下在
流体中提供所述靶蛋白质和所述有机分子并使所述流体通过经填充的活性流动反应器柱或将所述流体与包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含MTG的溶液混合，从而在所述MTG的催化作用下使所述有机分子与所述蛋白质缀合；
[0011] e)从所述流体中提取蛋白质有机分子缀合物。
[0012] 该方法首次提供了以析出物的高转化使有机分子与蛋白质缀合以有效地形成蛋白质有机分子缀合物的机会。由于MTG与聚合物的共价结合，MTG的流失可以被抑制到有利的程度。通过酶的固定，该方法出乎意料地导致在多种反应性残基的存在下对待缀合的蛋白质、肽或其他生物分子上的一种(或更多种期望的)酶反应性残基的增强的选择性，而如果在溶液中用非固定的酶进行缀合，所有这些残基都将被靶向。这将导致缀合至不同程度或所有残基完全缀合的分子的不期望的混合物。因此使用固定形式的MTG，仅分别靶向和缀合一种(或更多种期望的)残基。当然，MTG也可以作为其在溶液中的游离形式和/或作为成为溶液的MTG聚合物缀合物使用。关于MTG，本领域技术人员理解MTG优选地来自生物体茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)。
[0013] 当聚合物经历与微珠的离子和/或共价结合时，聚合物与微珠的结合可以以稳定的方式实现。聚合物的优选实例可以是第二代树状化聚合物(de-PG2)。
[0014] 根据本发明的优选实施方案，靶蛋白质可以选自由以下组成的组：IgG、IgM、IgA或IgE形式的
抗体或其
片段，并且优选为单克隆的，其任选地选择为嵌合的、人源化的、人的或者双特异性的、去糖基化的或非糖基化的，其包含N297突变(例如N297Q或N297A)(EU编号方案)，并且优选地还包含能够进行MTG介导的缀合的抗体骨架中的其他反应性谷氨酰胺残基突变。
[0015] 根据本发明的另一个优选实施方案，靶蛋白质是肽，例如Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab)’3、Dab、Fv、单链Fv(scFv)片段scFv-Fc(scFv)2，其中另外可能的蛋白质和/或肽包括参与其他蛋白质和肽之识别的蛋白质和肽，包括但不限于蛋白激酶，例如丝裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)激酶，和直接或间接使MAP激酶、Januse激酶(JAKI)和细胞周期蛋白依赖性激酶磷
酸化的激酶，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体，血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)受体，
成纤维细胞衍生生长因子(fibroblast-derived growth factor，FGF)受体，胰岛素受体和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)，工程化蛋白质，例如darpin、亲和体/纳米体或纤连蛋白片段，或载体蛋白质，或引发免疫反应并因此对
疫苗接种重要的半
抗原，例如白喉毒素突变体CRM197，或GBS67(PI-2a的辅助蛋白)；此外，其优选地还包括与非蛋白质结构的缀合，例如单或多聚右旋糖酐，例如葡聚糖。
[0016] 关于酶，酶可以用有机分子修饰靶蛋白质上的一个或更多个反应性谷氨酰胺残基(例如抗体中的Q295和N297Q)或一个或更多个反应性赖氨酸残基(例如抗体中的K288或K290、K340)；其中所述残基是内源的或通过遗传方法人工引入的或者其组合。
[0017] 待与靶蛋白质缀合的有机分子的优选实施方案可选自由以下组成的组：
荧光染料/标记(例如Alexa488、Alexa647)，细胞的细胞毒性或影响部分，例如毒素或细胞调节剂、免疫细胞免疫调节/刺激化合物，适于SPECT/PET或MRI的金属螯合剂(例如NODA-GA)，功能性肽(例如α防御素NP-1)，适于点击反应例如应变促进的叠氮化物-炔
烃点击化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)或四嗪-烯烃连接的化学部分，包括叠氮化物和环辛炔衍生物(例如DIFO、BCN、DIBAC、DIBO、ADIBO)，以及四嗪和反式环辛烯衍生物，其具有用于MTG介导的缀合的伯胺，和具有Cn＞20的间隔物部分。
[0018] 此外，有机分子可选自由以下组成的组：与功能部分缀合的具有(C+N)n＞20的肽，所述功能部分例如细胞毒性部分、
荧光染料、金属螯合剂，或适于SPAAC点击反应的化学部分(例如叠氮基或DBCO-基团)或四嗪和反式环辛烯基团或其衍生物。特别地，肽可包含赖氨酸(例如KNAA或KAYA)或谷氨酰胺残基(例如FGLQPRY)并且其被MTG靶向(即MTG的底物)，任选地其包含Cn＞20的间隔物部分(例如聚-乙二醇、烷基基团)和/或通过伯胺缀合。
[0019] 此外，有机分子可以选自由以下组成的组：肽，所述肽包含在任何
位置的赖氨酸(例如KNAAGGG或KDAAGGG或KAYAGGG或AKETAA)或在任何位置的谷氨酰胺残基(例如FGLQPRY、SLLQGR)，并且被MTG靶向(即MTG的底物)，并且任选地包含可酶促切割的肽序列(例如缬氨酸-瓜氨酸(VC)，KNAAGGG-VC)；所述赖氨酸肽的大小(长度)为(C+N)n＞20且所述谷氨酰胺肽的大小(长度)为1<(C+N)n＜200。
[0020] 微珠或微珠
树脂的优选实施方案可以选自由以下组成的组：玻璃、镍、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)(poly(4-methulbutene))、聚苯乙烯、聚
丙烯酸酯、聚对苯二
甲酸乙二醇酯、人造丝、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PCDF)、
硅酮、聚甲
醛、
纤维素、乙酸纤维素、硝化纤维素等。其他固体支持物包括明胶、玻璃、琼脂糖大珠、交联葡聚糖珠或葡聚糖微载体，例如 (Pharmacia，Uppsala，Sweden)，多糖，例如琼脂糖、藻酸盐、
角叉菜胶、几丁质、纤维素、葡聚糖或
淀粉，聚己内酯(PCL)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚二甲基硅
氧烷、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、全氟化
碳，无机化合物，例如
二氧化硅、玻璃、
硅藻土、氧化
铝、金、
铁氧化物、
石墨烯和
石墨烯氧化物或其他金属氧化物，或由两种或更多种天然存在的聚合物、合成聚合物或无机化合物的任意组合组成的共聚物。珠大小可以为1nm至100nm或100nm至1000nm或1μm至10μm或10μm至1000μm。
[0021] 流体的合适的实例可以选自由以下组成的组：含有合适缓冲剂(例如Tris)和盐添加剂(例如NaCl)的
水，所述缓冲水溶液还可含有高达60％的甘油和其他
有机溶剂，例如
乙醇、丙醇、异丙醇、1-丙醇、DMSO、甲醇、乙腈。
[0022] 除第一代和第二代和更高代树状化聚合物(de-PG2)外，合适的聚合物可以选自由以下组成的组：聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷、聚(烷基 唑啉)、聚乙烯吡咯烷酮、聚赖氨酸和聚谷氨酸、聚(乙基 唑啉)、聚甲基丙烯酸和聚丙烯酸(polypropacrylic acid)或其混合物和树枝状结构。还包括基于糖残基的聚合物、聚-N-异丙基丙烯酰胺(聚NIPAM)、聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)、聚四氟乙烯(PTFE)和聚(乙烯-交替-四氟乙烯)(ETFE)、聚(寡聚乙二醇)甲基丙烯酸酯(POEGMA)、聚(2-甲基-2- 唑啉)(PMOXA)、聚(乙烯醇)(PVA)和聚(亚乙基亚胺)及其衍生物。
[0023] 在一些实施方案中，MTG和聚合物的缀合涉及在聚合物和MTG中的接头(间隔物)，所述接头可以选自由以下组成的组：双官能接头系统S-HyNic(琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺、S-4FB(4-甲酰基
苯甲酸酯)或其衍生物，或SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-
马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-
羧酸酯)或其衍生物，具有类似Y-S-Z(Y也可以是Z，反之亦然)结构的同型-或异型双官能间隔物，其中Y和Z是以下基团或其衍生物：四嗪、反式环辛烯、叠氮化物、环辛烯(例如二苄基环辛炔或双环壬炔)、n-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、异硫氰酸酯、醛、环氧化物、醇、胺、硫醇、膦酸酯、炔烃、酰基三氟
硼酸
钾、α-
酮酸-羟胺、O-酰基羟胺、羧酸、肼、亚胺、降
冰片烯、腈和环丙烯，且S是作为聚合物或其衍生物、氨基酸或肽衍生物的间隔物实体，所述聚合物或其衍生物例如寡聚或聚(乙二醇)(PEG)、葡聚糖，其由烷基部分构成。
[0024] 当确定的条件包括以下细节时，可以实现用于进行缀合的合适条件：
温度为0℃至50℃，
接触时间为数秒至168小时(或7天)，活性流动反应器柱中的流速/速率为小于1μL/分钟或1μL/分钟至10ml/分钟，蛋白质浓度为1μM至1mM，有机分子与靶蛋白质的摩尔比为0.5至50×或50至500×或500至10,000×，并且MTG浓度为每ml树脂或微珠或缀合溶液
0.001mg/ml至0.01mg/ml或0.01mg/ml至10mg/ml，此外优选地还包括有机分子与靶蛋白质的缀合效率为至少30％且高达100％转化，且流动压力为0.1巴至20巴。
[0025] 此外，官能化微珠还可以置于适合旋转柱的装置中，其中反应混合物与珠一起孵育1秒至60秒、1分钟至60分钟、1小时至168小时的一定量的时间。然后通过离心并取出上清液将混合物再次从微珠中移出，或者在离心过程中将溶液推过合适的过滤装置，其保留微珠而不保留反应期望的混合物。
[0026] 下面参考
附图更详细地描述本发明的优选实施方案，附图描述如下：图1示意性地示出了微生物转谷氨酰胺酶MTG在de-PG2聚合物上的固定过程和随后在微珠上的吸附；
[0027] 图2在de-PG2聚合物上的MTG缀合的表征和定量，MTG、MTG-聚合物缀合物活性归一化至1μM MTG；
[0028] 图3示意性地示出了使用微珠固定的MTG使功能分子与抗体样骨架例如scFV和Fab片段缀合；
[0029] 图4示意性地示出了使用微珠固定的MTG使功能分子与(非糖基化的)抗体(N297S或N297Q突变体)缀合；并通过抗MTG抗体进行聚合物上附着的MTG的检测；和
[0030] 图5与在溶液中进行缀合时相比，固定的MTG在多种反应性氨基酸的存在下增强的选择性。
[0031] 图6使用不同的pH条件筛选与去糖基化IgG1(赫赛汀)的含谷氨酰胺的肽(右表中给出的序列)。发现在pH 7.6下肽2最有效，可产生≥50％的缀合。
[0032] 图7肽2(左)及其叠氮化物衍生物(右)的结构。
[0033] 图8使用固相固定的MTG使去糖基化IgGl与肽FGLQRPY(肽2)缀合。
[0034] 图9用固定的MTG(左)和用溶液中的MTG(右)使肽2与IgG1(含有N297S突变)缀合，产生＞70％的缀合。
[0035] 图10用固定的MTG(左)和用溶液中的MTG(右)使肽2-叠氮化物衍生物与IgG1 N297S抗体的赖氨酸340和赖氨酸288/290缀合，产生＞70％的缀合。
[0036] 图11使用固定的(左)和溶液中的MTG(右)与IgG1 N297S抗体的双位点特异性缀合，产生约40％的双位点特异性修饰的IgG1。使用用于谷氨酰胺Q295缀合的底物TCO-PEG3-NH2和用于赖氨酸340(和288/290)缀合的肽2叠氮化物-衍生物。
[0037] 图12赖氨酸缀合抗体的SDS-PAGE考马斯和荧光分析。仅重链被选择性缀合，而轻链没有。
[0038] MTG-聚合物-缀合物的形成和表征
[0039] 对于N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(4FB)与微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的缀合(图1)，研究了不同的接头过量，目的是每个MTG一个接头。用LC-MS和UV-VIS分光光度法定量接头比率，并发现两种方法相关性良好(图2a)。在MTG与4FB的相等接头量下，获得约0.4的缀合比，而对于过量2，其提高至约0.8(图2a)。虽然0.8的比率似乎是理想的，但我们选择使用1.5当量的4FB，使得接头比率为约0.5，因为在实验过程中我们观察到0.8的过高接头比率导致酶-聚合物缀合物可能由于样品沉淀而不能通过超速离心进行纯化。这可以归因于在2当量，双连接的MTG(MTG-(4FB)2)的量＞20％，而在1.5当量，其保持<10％(图
2b)。过高量的MTG-(4FB)2导致在相同或另一聚合物链上的不期望的过度交联、MTG活性降低以及酶-聚合物缀合物的
溶解度降低。由于这些原因，特别强调不要过度缀合MTG并选择
1.5过量的4FB比MTG，产生＞90％纯度的单连接MTG。
[0040] 然后将与N-琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸酯(S-HyNic)-接头缀合的聚合物de-PG2500(图1)与MTG-4FB一起孵育。这两种连接的化合物的混合导致特征峰的形成和354nm处的吸收增加，如通过UV-VIS所示(图2c)，其对应于双-芳基-腙(BAH)-键的形成和酶-聚合物缀合物的成功生成。
[0041] 用比色羟胺-胺测定法在溶液中测定聚合物-酶缀合物的活性，发现MTG仍具有催化活性，尽管与天然MTG相比明显降低(图2d)。活性的降低可以通过与未结合的天然MTG相比，聚合物固定的MTG的降低的旋转
自由度和排列可能性来解释，使得羟胺更难以进入酶的活性位点。已经报道了溶液中的在相同聚合物上固定的蛋白酶K的活性降低的类似观察结果。尽管如此，最重要的是MTG在固定后仍具有催化活性。
[0042] 计算微珠玻璃表面上吸附的MTG-聚合物缀合物的量
[0043] 在354nm(29000M-1cm-1)处UV-VIS可量化的双-芳基-腙键使得可以从洗脱体积来估计珠固定的MTG量。孵育1小时后，洗脱体积中的浓度确定为1.6±0.15μM，考虑到起始浓度为5μM，约70％的缀合物已吸附在珠上。由于MTG主要与聚合物单交联，因此我们可以估计吸附
质量为约300ng/cm2或约7.8pmol MTG/cm2。这些值与先前公布的使用固定在denpol-聚合物上的蛋白酶K或辣根过氧化物酶以及共价固定在二氧化硅聚合物表面上的其他酶的结果一致。
[0044] 微珠固定的MTG用于功能分子与蛋白质的位点特异性缀合的
[0045] 为了MTG-聚合物缀合物的稳定固定，选择使用玻璃微珠，这是因为带正电荷的denpol-胺对带负电荷的玻璃表面具有强亲和力，并且因为珠可以容易地组装到基于流的微反应器中。这样的装配能够以良好可控的方式重复进行样品珠溢流，因此可用于驱动反应完成。此外，在缀合过程后可以简单地洗涤微珠，从而回收固定的MTG用于下一轮缀合。
[0046] 较小抗体样骨架的
治疗相关蛋白质(包括scFV、纳米体或Fab片段)由于其与较大抗体相比具有增加的
肿瘤渗透能力、易于生产和更快速清除而具有相当大的兴趣。因此在第一次使蛋白质官能化的尝试中，目的是使Fab-片段和scFV缀合，二者先前已显示使用生物素-尸胺作为胺通过其C末端myc标记中的谷氨酰胺2(‘Q2’)被溶液中的MTG有效缀合，胺是进一步下游应用，包括固定在链霉抗生物素蛋白涂层表面的理想底物。虽然已知含有谷氨酰胺的蛋白质上的柔性环和末端标记优先被MTG靶向，但是球状结构和可接近的末端标记的存在允许表面固定的MTG的缀合，并且与庞大抗体上的环结构如谷氨酰胺295相比，进入酶活性位点的难度更小。因此将生物素-尸胺与c-末端myc-标记的Fab-片段和scFV混合，并使溶液流过微反应器中微珠固定的MTG(图1和3a)。将溶液在微反应器上
泵送30分钟并进行LC-MS分析。发现≥95％完全转化为期望的生物素-缀合的Fab-片段，未检测到未缀合的物质(图3b)。同样，在相同条件下仅在30分钟，c-myc-标记的scFV有效缀合以产生≥95％的期望的缀合物(图3b)。
[0047] 丹磺酰尸胺(MTG的荧光胺供体)也以仅8等摩尔的过量下与Fab和scFV缀合(图3a)，其在30分钟内产生≥95％丹磺酰标记的Fab片段和≥90％的scFV(图3b)。
[0048] 在某些情况下，庞大的含伯胺的底物与MTG反应性谷氨酰胺的直接缀合偶尔会导致不完全的产物转化，残留未缀合物质。这种情况尤其发生在那些在金属螯合剂上含有高亲水基团例如羧基基团的底物上。使用两步法，其中首先在蛋白质上安装“可点击”部分，然后进行期望分子的点击缀合，可以避免这个问题，产生定量缀合。因此探讨了是否可以用适于SPAAC(应变促进的叠氮化物-炔烃环加成)点击化学的胺-PEG3-叠氮化物(图3c)与myc-标记的scFV进行缀合。使Myc标记的scFV流过柱，30分钟后，取出样品并进行LC-MS分析，已经得到期望的scFV-N3转化为82％(图3c)。持续珠溢流90分钟导致97％的转化，而在持续过夜流动(14小时)后不再能检测到未缀合的物质(图3c)。这些结果清楚地表明，即使在低试剂过量下，微珠固定的MTG也能够在不到90分钟内定量地使多种底物与myc标记的蛋白质缀合。
[0049] 基于这些结果，探讨了完整抗体是否也可以通过珠固定的MTG缀合。先前指出，去糖基化抗体的位于Fc结构域的柔性C’E环上的谷氨酰胺295(Q295)是抗体骨架中唯一的MTG靶位点，因此如果引入N297Q点突变来清除糖基化位点，则产生具有两个或四个附着位点的确定的抗体缀合物。表面上的抗体缀合可能比在溶液中更具挑战性，因为抗体的庞大性限制了其定向可能性，因此使得分别进入环的Q295和Q297的MTG进入可能更困难。
[0050] 因此，使固定的MTG接受含有N297S点突变以消除去糖基化的IgG1抗体和生物素-尸胺(图4a)。在室温下30分钟后，还原抗体的LC-MS分析已显示37％的重链转化，并且1小时后为72％，在过夜孵育期间增加至≥95％(图4a)。与具有相同药物负荷的常规非特异性缀合的抗体相比，认为具有4至6的高药物-抗体比率(drug-to-antibody-ratio，DAR)的位点特异性修饰的抗体能有效地将缀合的药物递送至肿瘤靶位点，使得这样的ADC作为改进的癌症疗法非常有吸引力。因此，研究了固定的MTG是否能够维持与N297Q抗体的两个非常接近的负责SPAAC的双官能接头缀合的能力(图4b)。发现珠固定的MTG确实可以定量和有效地缀合两个接头，产生具有每个抗体4个接头的比率的N297Q抗体(图4b)。
[0051] 这些研究清楚地表明在固定后保持了MTG的特异性和有效缀合能力，甚至能够调节蛋白质的残基特异性。
[0052] MTG-聚合物缀合物的稳定性研究和微珠上的MTG活性
[0053] 先前已表明denpol-聚合物的聚阳离子性质在阴离子玻璃表面上提供稳定的表面锚定数周。由于固体酶固定对于下游应用尤其对于预期的治疗性蛋白质是重要的，因此使用狭缝印迹测定和抗MTG抗体解决了酶
泄漏。选择狭缝印迹，因为其允许应用大量样品并且由于其灵敏度。作为阳性对照的MTG-聚合物缀合物显示出强
信号(图4c，泳道1I)，也可以检测到未缀合的MTG(泳道1，ii)，而HyNic-聚合物不产生信号(泳道1iii)，证明另外在与聚合物缀合时，抗体特异性识别MTG。在连续操作14小时后，MTG保持牢固附着(泳道2，i和ii)，并且另外在进行数次缀合的40小时操作之后，MTG保持牢固附着于聚合物而没有酶可检测到(泳道2，iii)。在后一种条件下，固定的MTG在3小时后仍能够使＞90％BC与N297S IgG1缀合。从这些数据可以得出结论，MTG不仅保持紧密附着于玻璃微珠，而且分别在较长的时期和数轮缀合后也是活性的，因此，是用于与MTG类似大小的蛋白质的缀合的非常有前途的工具。
[0054] 固定的MTG在多种MTG反应性氨基酸的存在下提高的残基选择性
[0055] 还报道了固定的酶对底物显示出提高的选择性，因此认为其也可以应用于固定的MTG。在溶液中使用MTG使ZQG-Tamra-尸胺(ZQG-TC)与具有多个反应性赖氨酸残基的抗生物素蛋白(用作模型蛋白质)缀合，在去卷积LC-MS谱中显示出两个主峰。这些峰对应于具有一个ZQG-TC的抗生物素蛋白和具有两个缀合的ZQG-TC的抗生物素蛋白以及一些未经修饰的抗生物素蛋白(图5，左图)。使用固定的MTG进行相同的实验，出乎意料地发现MTG几乎仅靶向抗生物素蛋白的一个赖氨酸残基，而与第二残基仅有限缀合(图5，右图)，可能是因为旋转MTG-柔性降低。这些数据显示固定的MTG确实可用于调节残基选择性，而这用其中两个残基显著缀合的溶液相缀合是无法实现的。
[0056] 含有谷氨酰胺的小肽与去糖基化和无糖基化IgG1的赖氨酸残基的位点特异性缀合
[0057] 尽管已经报道了使用ZQG衍生物通过赖氨酸
侧链进行MTG介导的抗体官能化，但是缀合产率不令人满意(即<20％)并且没有报道修饰的赖氨酸位点。因此，进一步研究的目的是在溶液中和用固定的MTG靶向无糖基化和去糖基化IgG1的赖氨酸残基。推断与常用的ZQG或其衍生物相比，不同的谷氨酰胺肽可更有效地与IgG1上的赖氨酸残基缀合。因此，首先在我们随后希望应用于固定的MTG的不同pH条件下在溶液中筛选具有报道的高MTG活性的含谷氨酰胺的肽的小文库。实际上，在室温下孵育16小时后，能够鉴定具有与去糖基化IgG1的有利缀合比的序列，使用LC-MS分析显示出比ZQG更高的反应活性(图6)。特别地，在pH 7.6的溶液中，肽序列NH2-FGLQRPY-COOH显示出比ZQG高几乎两倍的与去糖基化IgG1的几乎50％的缀合效率(图6)。在室温下使去糖基化IgG1和肽FGLQRPY(肽2，图7左侧的肽结构)经受固定的MTG过夜，发现30％缀合(图8)。值得注意的是，使用IgGl无糖基化N297S突变体和FGLQRPY，用固定的和溶液中的MTG使缀合比提高至71％(分别为图9左和右)。使用FGLQRPY叠氮化物衍生物(图7右侧的肽结构)，用固定的MTG和溶液中的MTG(分别为图10左和右)，使用LC-MS分析获得了相同的结果。使用LC-MS分析，主要发现了单修饰的物质和仅少量的第二缀合，二者均仅位于重链上。肽图谱证实了在Lys288或Lys 290和Lys340处有两个修饰位点。
[0058] 用固定的和溶液中的MTG与无糖基化IgG1(N297S突变体)的位点特异性双重缀合[0059] 已经建立用固定的和溶液中的MTG进行谷氨酰胺和赖氨酸缀合，通过修饰N297S IgG1的Q295和K340、K288/K290推断用固定的和溶液中的MTG进行位点特异性双重修饰是否可行。具有例如两个成像探针的这种双重修饰的抗体将非常适于例如非侵入性和/或术中/术后组织成像。或者，可以连接显示出协同效应的两种不同的毒性有效
载荷。将Q295首先用NH2-PEG3-TCO修饰至≥95％，然后用肽-2叠氮化物衍生物修饰，导致略低产率的38％双重位点特异性修饰的IgG1(图11，左)。用溶液中的MTG进行双重位点特异性缀合产生类似的结果(图11，右)。SDS-PAGE证实了与赖氨酸残基的重链特异性缀合，对于双重缀合的抗体也证实了LC-MS结果(图12)。
[0060] 官能化赖氨酸肽与去糖基化抗体的缀合
[0061] 还研究了含有赖氨酸残基的肽是否也可用于用溶液中的MTG在谷氨酰胺295位置对去糖基化抗体进行位点特异性修饰，这迄今为止尚未在文献中描述。在第一种情况下，向这些肽配备官能团例如N3-基团(KAYA-GGG-N3)或金属螯合剂(例如NODAGA)将允许随后在低摩尔当量下通过SPAAC点击化学来连接另一部分。在第二种情况下，功能部分可以直接缀合，因此不需要第二步来促进进一步的下游处理。此外，通过在肽中引入亲水性氨基酸，可以增加功能部分(“有效载荷”)的溶解度，这对疏水性有效载荷非常有益。在本发明的工作中，已经表明可以使KAYA-GGG-N3以及KNAA-GK-PEG3-NODAGA和KAYA-GK-PEG3-NODAGA以高效率(＞95％)与去糖基化抗体缀合。
