技术领域
[0001] 本
发明涉及药学
生物相容载体以及用于
治疗、
预防、成像以及诊断应用的活性剂的靶向递送的领域。更具体地,本发明涉及由天然分泌的生物相容递送组件
(biocompatible delivery module,BDM)与改造的药物包裹组件(engineered drug
encapsulation module,EDEM)的受控结合产生的生物相容杂交载体。
背景技术
[0002] 当代药物治疗方法主要基于新的治疗分子的发展以及组合
治疗方案的进步。然而,这些方法的临床功效内在地受到无意中因预期作用部位的有限浓度和广泛的整体生物
分布引起的它们的物理化学、药代动
力学和交叉
反应性属性的限制。
[0003] 在努力解决上述挑战的过程中,出现的对
纳米技术的使用正有利于向不健康器官、组织和/或细胞递送药物分子。最先进的纳米技术启发的药物递送平台集中于治疗活性
分子在合成脂质基载体系统中的捕获。包裹有利于药物与体内环境隔开,从而克服药物的
不理想的性质,包括有限的溶解性、血清
稳定性、循环
半衰期和生物分布。
[0004] 由无毒组分组成且由靶细胞特异性内化的理想的合成纳米载体至今仍难以捉摸。因此,这些系统没有纳米技术能够提供的全部潜力。对究竟分子如何本质上被传送的理解
可以提供针对有效的生物相容药物递送媒介的设计图。
[0005] 已知细胞通过分泌可溶因子或通过直接相互作用交换信息。最近的研究得出了以下结论:细胞还释放对邻近和远离的细胞都有影响的膜来源的小泡(Marcus&Leonard,
2013)。这些细胞外小泡由大部分细胞分泌,是大部分生物
流体的生理组成部分(Vlassov,
Magdaleno,Setterquist,&Conrad,2012)。细胞外小泡导致(entail)亚型凋亡体、微泡和外
来体(EL Andaloussi, Breakefield,&Wood,2013)。
[0006] 虽然有关细胞外小泡是怎么能够起细胞间通信的介质作用的研究仍处于早期阶段,但是探索它们在将生物活性货物从“供体”细胞递送给“受体”细胞中的传承作用对于洞
察最佳药物递送的复杂性有贡献价值。各种研究已经确定了细胞外小泡能够起治疗载体的
作用的数种条件。这些载体具有使它们在药学上优于合成药物载体的明显特性的证据日益
增多。对这种优越性特别重要的是收集整合在细胞外小泡的表面组成中的膜蛋白与特殊脂
质。
[0007] 存在数个阻碍开发或模拟用于有效药物递送系统的天然载体的障碍。最显著的是,将细胞外小泡从信使转化为药物载体要求将外源性治疗或诊断分子引入“供体”细胞
内。至今提出的各个基因工程方法包括在“供体”细胞上使用
生物工程方法(即,遗传修饰、
病毒
转染、有毒阳离子脂质转染等)以及施用于分离的小泡的强有力的或破坏性操作机制
(即,电穿孔、缀合化学等)。这些方法最终引起了安全性和可量测性的担忧,因而妨碍了向
临床上的转化。其他仍需解决的重要问题包括对载体的结构完整性的控制、活性货物的有
效包裹和额外靶向部分的掺入。
[0008] 理想地,如果可以开发出完整的细胞外小泡膜,则可以避免要求向合成纳米载体中掺入大量生物活性膜组分的复杂的生物模拟功能化途径。相反地,为了克服生物技术方
案的可怕结果,向细胞外小泡引入外源性治疗和靶向组分的策略应该优选不受细胞操作影
响。基于这些假设,用现代纳米特有的药物递送系统中使用的纳米技术策略替代生物工程
技术可能是有利的。
[0009] 鉴于上述缺点,本发明的目的在于提供一种新型的药物载体,该药物载体具有高度限定的属性,没有
现有技术载体的缺点,同时协同加强离体产生的合成纳米载体与体内
产生的细胞外小泡的优点。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物,包含所述新型药物载体。
[0011] 本发明的再一个目的在于提供基于所述新型药物载体或包含所述新型药物载体的药物的用途和方法,用于治疗、监测、预防、分阶段和/或诊断
疾病或病症。
[0012] 本发明的再一个目的在于提供一种用于以涉及到刺激响应性组件的可控方式制备所述新型药物载体的方法。
[0013] 本发明的再一个目的在于提供用于向细胞,特别是向选自白细胞、神经胶质细胞和干细胞的细胞递送一种或多种生物活性剂的方法。
[0014] 本发明的再一个目的在于提供一种以涉及到刺激响应性组件的可控方式生产上述药物载体的方法。
[0015] 本发明的另外的目的和优点将随描述的进行而出现。
发明内容
[0016] 本发明提供一种杂交生物相容载体(杂交体(hybridosome)),其包含源自至少一种生物相容递送组件(BDM)和包含至少一个可调的促融部分的至少一种改造的药物包裹组
件(EDEM)的结构性和生物活性元件。
[0017] 本发明还提供一种药物组合物,包含如上限定的杂交体和至少一种药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
[0018] 本发明还进一步提供一种用于制备杂交生物相容载体(杂交体)的方法,所述杂交体包含源自至少一种生物相容递送组件(BDM)和包含至少一个可调的促融部分的至少一种
改造的药物包裹组件(EDEM)的结构性和生物活性元件,所述的方法包括:
[0019] (a)提供具有至少一个促融部分的至少一种EDEM或包含所述至少一种EDEM的组合物;
[0020] (b)提供至少一种BDM或包含所述至少一种BDM的组合物;
[0021] (c)使所述至少一种EDEM与所述至少一种BDM在低于7.4的pH和0℃~60℃的
温度下
接触,从而使所述至少一种EDEM与所述至少一种BDM结合起来,产生所述杂交体;以及,任
选地,
[0022] (d)使所述杂交体纯化不含未融合的EDEM和/或BDM。
[0023] 本发明还进一步提供一种向白细胞递送一种或多种生物活性剂的方法,所述方法包括:使包含杂交体的组合物与包含所述白细胞的组合物接触,所述杂交体包含所述一种
或多种生物活性剂,其中,所述杂交体由包含至少一个可调节的促融部分的至少一种EDEM
与至少一种白细胞来源的BDM融合产生。
[0024] 本发明还进一步提供一种向神经胶质细胞递送一种或多种生物活性剂的方法,所述方法包括:使包含杂交体的组合物与包含所述神经胶质细胞的组合物接触,所述杂交体
包含所述一种或多种生物活性剂,其中,所述杂交体由包含至少一个可调节的促融部分的
至少一种EDEM与至少一种神经胶质细胞来源的BDM融合产生。
[0025] 本发明还进一步提供一种向在离体扩增过程中的细胞递送一种或多种生物活性剂的方法,所述方法包括使包含杂交体的组合物与包含所述细胞的组合物接触,所述杂交
体包含所述一种或多种生物活性剂,其中,所述杂交体由包含至少一个可调的促融部分的
至少一种EDEM与来源于所述细胞的至少一种BDM融合产生。
附图说明
[0026] 参照所附的附图并通过以下
实施例,本发明的上述及其他特征和优点将更易显而易见,其中,
[0027] 图1是表示Au-iLNP、Au原料和iLNP的紫外可见吸收
光谱的图;
[0028] 图2是Au-iLNP的透射
电子显微镜(TEM)(比例尺:100nm)照片;
[0029] 图3是GBM-exos和空iLNP的直径(通过
纳米粒子跟踪分析(NTA)得到)的图;
[0030] 图4是表示将GBM-exos与iLNP在非电离条件(pH为7.4)下或在融合缓冲液(pH为5.5)中混合后的平均粒径(通过动态光散射(DLS)得到)的图;
[0031] 图5是表示改变缓冲液pH条件的情况下GBM-exos与iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0032] 图6是表示GBM-exos与含有0、30%、40%或50%的DLinDMA含量的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0033] 图7是表示GBM-exo与含有可电离的脂质DODAP或DLinDMA的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0034] 图8是表示GBM-exos与含有不同PEG-脂质含量的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0035] 图9是表示GBM-exos与iLNP在不同温度下的R18融合测定的结果的图;
[0036] 图10是通过GBM-exos与iLNP的混合物在pH 5.5下进行的
荧光交叉相关光谱法(FCCS)得到的图;
[0037] 图11是表示通过动态光散射(DLS)监测到的GBM-exos与iLNP的混合物在pH 5.5下的平均粒径的随时间变化的图;
[0038] 图12是表示通过动态光散射(DLS)监测到的MCL-exos与iLNP的混合物在pH 5.5下的平均粒径和多分散指数随时间变化的图;
[0039] 图13显示出表示iLNP与外来体混合物在pH为5.5下混合3、5、7、9和18分钟后的粒子分布的五个图;
[0040] 图14是表示iLNP、外来体和杂交体的NTA尺寸分布的重叠的图;
[0041] 图15是表示等量的pDNA在iLNP、未融合的iLNP+外来体和杂交体中转染后72小时的GFP表达细胞的流式细胞术分析的图。时间表示转染时间;
[0042] 图16是表示每秒的DLS平均
光子的图,所述每秒的平均光子表示pDNA-iLNP的每个
蔗糖梯度的
密度部分中纳米粒子的存在;
[0043] 图17是表示用合并的粒子密度转染后72小时的GFP表达细胞的流式细胞术分析的结果的图;
[0044] 图18是表示等量的纯化后的杂交体转染后72小时的GFP表达细胞的流式细胞术分析的结果的图。时间表示转染时间;
[0045] 图19是表示用IgG第二
抗体标记的纯化后的IgG杂交体孵育24小时的流式细胞术的结果的图(对照:浅灰色;IgG第二抗体:灰色);
[0046] 图20是表示外来体与含有寡核苷酸的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0047] 图21是表示外来体与包裹固体纳米粒子的iLNP或同时包裹寡核苷酸/纳米粒子的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0048] 图22是表示外来体与包裹蛋白的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0049] 图23是表示外来体与表面修饰的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0050] 图24是表示单独的MCL-外来体或与iLNP混合的MCL-外来体的芘融合测定的结果的图,所述与iLNP混合的MCL-外来体是通过微流体快速混合或通过挤出制得的;
[0051] 图25是表示在融合缓冲液或pH为7.4的缓冲液中的空iLNP与标记的PMN-MV以及包裹不同种类货物的iLNP的R18融合测定的结果的图;
[0052] 图26是表示空iLNP与标记的PLT-MV在融合缓冲液或pH为7.0的缓冲液中的R18融合测定的结果的图。
[0053] 图27是表示用由NBD标记的iLNP制备的杂交体或单独用NBD标记的iLNP转染1小时的Jeko1细胞的平均荧光强度的柱状图(n=160个细胞,误差线表示标准误差)。
具体实施方式
[0054] 本发明的第一方面提供了一种杂交生物相容载体(杂交体),包含源自至少一种生物相容递送组件(BDM)和包含至少一个可调的促融部分的至少一种改造的药物包裹组件
(EDEM)的结构性和生物活性元件。
[0055] 如本文所使用的,术语“杂交生物相容载体”或“杂交体”是指包含源自至少一种生物相容递送组件(BDM)(例如,外来体、微泡、凋亡体)和包含可调的促融部分的至少一种改
造的药物包裹组件(EDEM)的结构性和生物活性元件(例如,脂质、糖类、
脂肪酸、多核苷酸或
多肽)的杂交生物相容载体。在具体的实施方式中,杂交体的内部容积体(internal
volume)包含至少一种源自在体内分泌的BDM的生物活性剂(例如内源性多核苷酸、酶或多
肽)和至少一种包裹在体外制备的EDEM中的生物活性剂。在另一种实施方式中,所述杂交体
的内部容积体仅包含源自BDM的天然组分,并且可以作进一步处理。本发明的杂交体由将一
种BDM与一种EDEM、数种BDM与一种EDEM、数种EDEM与一种BDM或数种BDM与数种EDEM结合起
来产生。该结合事件可以通过BDM和EDEM的尺寸、它们各自的电荷以及在结合反应过程中使
用的条件(例如,BDM/EDEM的比,pH、温度和反应时间)来控制。这样的由单独的单元组装新
型组合物的组分策略可以提供新的改造灵活度。这种信使与治疗组分的结合可以赋予得到
的杂交载体独特的特性,而该独特的特性通过单一系统不能得到。
[0056] 如本文所使用的,“生物相容递送组件(BDM)”是指包含脂双层且在体内产生而被释放到细胞外环境中的天然分泌的小泡。BDM由各种类型的细胞分泌,包括但不限于上皮细
胞、
肿瘤细胞和其它免疫细胞(例如,肥大细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞、树突细胞)。本发明
中使用的BDM分离自从受试者(优选为人受试者)取得的生理流体或组织样品,或分离自培
养基。在一种具体的实施方式中,本发明中使用的BDM来源于细胞培养物,其中细胞是天然
的或是之前已经被无限增殖和/或改造的。细胞培养物可以是均一的(一种类型的细胞)或
是不均一的(数种类型的细胞),并且可以由分离的细胞和/或组织组成。BDM可以分离自或
来源于有
机体,包括原核生物、真核生物、细菌、
真菌、
酵母、无
脊椎动物、脊椎动物、爬行类、鱼、昆虫、
植物和动物。从培养的细胞中取得的培养基(“条件培养基”、细胞培养基(cell
media/cell culture media))可以是生物流体。
[0057] BDM可以使用本领域普通技术人员已知的方法收集和分离。例如,BDM可以通过选自由以下组成的组,但不限于以下的一种或多种技术从细胞培养物或组织上清液中收集:
差速超离心、梯度超离心、过滤、切向流动过滤(TFF)、低压径迹蚀刻
膜过滤(track-etched
membrane filtration)和它们的组合。在一种实施方式中,本发明中使用的BDM通过将培养
物上清液离心以沉淀不希望的细胞碎片,之后进行超离心以沉淀外来体,进行密度梯度超
离心(例如,用蔗糖梯度)或这些方法的组合来制备。
[0058] 对于本发明有用的BDM的尺寸范围为约30nm至约2000nm,并且该BDM可以含有生物活性分子(例如,多核苷酸和/或多肽)。BDM的实例包括但不限于:“外来体”(直径为约30nm
至约200nm)、“微泡”(直径为约100nm至约2000nm)和“凋亡体”(直径为约300nm至约
2000nm)。术语BDM可以与“外来体”、“微泡”或“凋亡体”、“膜粒子”、“膜小泡”、“外来体样小泡”、“核外粒体样小泡”、“核外粒体”或“外小泡”互换使用。BDM脂双层来源于供
体细胞的膜。来源于不同细胞类型的BDM相比于质膜可以表现出脂质组成的不同。在外来体的发生期
间,跨膜和外周膜蛋白可以包埋在小泡膜中,同时胞质组分也可以掺入小泡中。
[0059] 如本文所使用的,术语“内源性”是指由细胞天然产生的或来源于细胞的化合物。例如,如果多肽是在得到BDM的细胞内产生的,那么BDM含有该内源性多肽。
[0060] 如本文所使用的,如适用于载体、粒子、小泡或分子的术语“天然分泌”是指通过天然存在的过程从细胞、有机体或组织中释放到环境中的载体、粒子、小泡或分子。例如,可以
与来源分离且尚未由人在实验室中从该来源的边界中进行物理易位的外来体是天然分泌
的。天然分泌粒子的过程的另外的非限制性实例为细胞内细胞器与细胞膜的融合和细胞膜
的起泡。
[0061] 如本文所使用的,“改造的药物包裹组件(EDEM)”是指包含已经在体外产生的一种或多种膜的小泡。在本发明中有用的EDEM选自但不限于:脂质基纳米粒子(LNP)、脂质体、聚
合物稳定的LNP、蜂蜡体(cerasome)、神经鞘体(sphingosome)、囊泡(niosome)、
聚合物囊泡
(polymersome)、合成纳米粒子稳定的LNP、核壳式脂质聚合物杂交纳米粒子、天然膜来源的
LNP、快速消除式脂质纳米粒子(reLNP)和天然膜包覆的LNP。本发明中使用的EDEM具有至少
一种使它们与BDM的结合能够受控的结构性质。在一种实施方式中,所述结构性质由EDEM的
脂双层的一种或多种组成部分提供。在一种具体的实施方式中,本发明中使用的EDEM为可
电离的LNP(iLNP)。
[0062] 本发明中使用的EDEM可以具有各种形态。它们可以包含一个脂双层(
单层的小泡)、一系列由狭窄的
水性区室隔开的同心双层(多层小泡或MLV)或膜形成聚合物。此外,与
BDM相反,EDEM基本上在尺寸和密度分布上是均一的。本文使用的EDEM的直径(平均粒径)为
约15至约500nm。在一些实施方式中,EDEM的直径为约300nm或更小、250nm或更小、200nm或
更小、150nm或更小、100nm或更小,或50nm或更小。在一个具体的实施方式中,本发明中使用
的EDEM的直径为约15至约150nm。
[0063] 在本发明中有用的EDEM被制成显示特定的物理化学特性。每种特定的EDEM的物理化学特性可以随其中包载的活性剂的性质和浓度、聚合物膜或脂双层的膜组成、分散有
EDEM的介质的性质、它们的尺寸和多分散性的不同而不同。在本发明的一个具体的实施方
式中,EDEM包含脂双层膜,该脂双层膜包含可电离的阳离子脂质和辅助脂质。在一些具体的
实施方式中,用于产生本发明的杂交体的EDEM是基于DlinDMA:Chol:DSPC:PEG-Cer的摩尔
比(摩尔比为40:40:17.5:2.5)来制备的。
[0064] EDEM的制备可以通过本领域已知的各种方法进行,例如在以下参考文献中所公开的。例如,这些方法包括超声处理、挤出、高压/均质化、微流体化、
洗涤剂透析法、小脂质体
的
钙诱导融合和脂质膜水合法。例如,LNP可以使用以前记载的预先形成的小泡的方法来制
备(Maurer等人,2001)。通常,该方法由挤出LNP穿过小孔聚
碳酸酯膜以将LNP尺寸减少至充
分限定的尺寸分布组成,并且在后期,如果需要,将治疗剂装载到预先形成的小泡中。或者,
可以通过
微流体系统中的自发自组装制备EDEMS。用这样的制备技术生产充分限定的尺寸
分布的方案在本领域中是已知的(Belliveau等人,2012)。优选地,本发明中使用的EDEM在
尺寸和密度分布上基本上是均一的,以促进从BDM的亚群和杂交体中分离出来。该分离通过
使用本领域中公知的技术进行,例如,尺寸排阻色谱法和密度梯度离心。在一个具体的实施
方式中,EDEM的密度低于杂交体中的EDEM的密度,从而有利于通过蔗糖密度梯度离心使杂
交小泡与EDEM分离。
[0065] 如本文所使用的,“促融部分”是指EDEM或杂交体的促融脂质或任何其它促融组分。这样的促融部分增强膜的破坏或膜与脂双层之间的脂质混合,或使得膜能够被破坏或
膜与脂双层之间能够进行脂质混合。例如,第一膜可以来自于EDEM,而第二膜包括BDM。或
者,第一膜可以是杂交体的膜,而第二膜是外细胞表面膜、内体膜、溶酶体膜或核膜。促融部
分增大EDEM与第二膜的相互作用或包含所述促融部分的杂交体与第二膜的相互作用,从而
促进膜脂质的混合以及内部容积体与包裹的内容物的混合。或者,促融部分可以增加进入
或离开细胞区室。这样的区室可以是例如内体或核。在某些实施方式中,促融部分可以为例
如靶向因子(例如,膜破坏性合成聚合物)或者例如为pH响应型膜易位多肽(例如,
蜂毒肽)。
在一些实施方式中,促融部分可以包含促融区段(例如,脂质的头基、脂质的尾基、聚合物的
段或区域、肽的区段)。
[0066] 按照本文使用的术语“可调的”来讲,其意味着通过改变本发明的方法的反应条件(例如,pH、温度、盐)和/或通过改变EDEM的促融组分(例如,可电离的脂质、促融脂质、pH响
应型聚合物、辅助脂质、促融靶向部分)的量,在结合反应期间选择性地赋予EDEM和/或BDM
高促融性,而在结合前或结合后保持较低的相对促融性是可能的。优选地,在各种情况下,
促融部分可以在其需要量(例如,浓度)下具有可调的促融性。促融部分的促融特性可以通
过本领域中已知的合适的测定方法确定。例如,聚合物的促融性可以在体外细胞测定(例如
红细胞的细胞溶血测定)中确定。在体外细胞测定中可以确定内体溶解性(endosomolytic)
聚合物活性。
[0067] 术语“促融脂质”可以用于指,与在高pH(即为约7.4的pH)下的电荷或结构相比,在低pH(即约5.5的pH)下经历结构和/或电荷变化的脂质,这导致脂质变得更加促融。这些促
融脂质可以是阴离子型脂质、中性脂质或pH敏感型脂质,该pH敏感性脂质的特征在于,当pH
从约pH 7变化到约pH 4时,脂质经历电荷或结构的变化,从而使得它们变得更加促融。反之
pH从约4变化到约6时,也可以发生电荷或结构的变化。在其他实施方式中,当温度升高超过
相转变温度例如20℃时,促融脂质经历结构变化以使其呈现六
角形结构或形成锥体的结
构。这种类型的另外的促融脂质在本领域中是已知的,可以用在本文描述的制剂、复合物和
方法中。这些“促融”脂质的一些实例改变结构以采取六角形结构,而这些脂质的其他实例
经历电荷变化。这些促融脂质还可以包括在本领域中称为“形成锥体的”脂质的那些脂质。
术语“促融脂质”还可以用于指表现出锥体形成的分子形状性质以使脂质构架包含小的横
截面头基和较大的酰基链横截面积的脂质。不希望受到任何特定理论的限制,在超过具体
的温度(例如20℃)时,认为这些脂质引发非双层六角形HII相转变。
[0068] 如本文所使用的,术语“脂质”和“类脂”是指一组包含与亲油性尾基通过连接基团结合的极性头基的有机化合物。脂质通常通过不可溶于水,但溶于许多
有机溶剂来表征。通
常将脂质分成三类:“简单脂质”,包括脂肪和油;“化合物脂质”,包括磷脂和糖脂;和“衍生的脂质”,如类固醇。术语“脂质”和“类脂”可以互换使用。
[0069] 如本文所使用的,“辅助脂质”是指稳定脂质,包括中性脂质和阴离子型脂质。本发明中使用的一些EDEM包括或可加入一种或多种辅助脂质,如胆甾醇和1,2-二硬脂酰基-sn-
甘油-3-胆
碱磷酸(DSPC)。中性脂质是指在生理pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存
在的数种脂质形式。代表性的脂质包括但不限于:二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰
基-磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基-磷脂酰甘油(DOPG)、二
棕榈酰基-磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰
乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱
(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基-磷脂
酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-
O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和
1,2-二反油酰基(dielaidoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。阴离子脂质为在生理
pH下带有负电荷的脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰丝
氨酸、双磷脂酰甘油和
用阴离子修饰基团修饰的中性脂质。
[0070] 如本文所使用的,“可电离的阳离子脂质”是指在所选的pH(例如,低于生理pH)下带有净正电荷的脂质。这样的脂质包括但不限于:1,2-二亚油基
氧基-N,N-二甲氨基丙烷
(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-
(二甲基氨基)丁酸(6,9,28,31-四烯-19-基)三十七醇酯(DLin-MC3-DMA)、二(十八烷基)二
甲基铵(DODMA)、二硬脂基二甲基铵(DSDMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基
氯化铵(DODAC)、N-
(2,3-二油基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基-3-二甲铵丙烷
(DODAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙-1-铵(DOBAQ)、YSK05、4-
(((2,3-双(油酰氧基)丙基)-(甲基)氨基)甲基)苯
甲酸(DOBAT)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二
甲基-2,3-双(油酰氧基)丙-1-铵(DOBAQ)、3-((2,3-双(油酰氧基)丙基)(甲基)氨基)丙酸
(DOPAT)、N-(2-羧基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双-(油酰氧基)-丙-1-铵(DOMPAQ)、N-(羧基甲
基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙-1-铵(DOAAQ)、Alny-100、3-(二甲基氨基)-丙基
(12Z,15Z)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基]-二十一碳-12,15-二烯酯(DMAP-BLP)
和3-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆甾醇(DC-Chol)。
[0071] 在某些实施方式中,可电离的阳离子脂质可以是氨基脂质。如本文所使用的,术语“氨基脂质”意味着包括那些含有一种或多种脂肪酸或脂肪烷基链以及氨基头基(包括烷基
氨基或二烷基氨基基团)的可质子化形成阳离子脂质的脂质。在某些实施方式中,本发明的
氨基或阳离子脂质具有至少一种可质子化或去质子化的基团,以使所述脂质在生理pH(例
如,pH 7.4)或低于该生理pH的pH下带有正电荷,而在第二pH(优选为生理pH或高于该生理
pH)下为中性。当然,应懂得的是,根据pH加入或移除质子是一个平衡过程,而且提到带电荷
的或中性脂质是指占主导地位的物质的性质,并不要求全部脂质呈带电荷形式或中性形
式。在本发明的使用中并不排除具有不止一种可质子化或去质子化基团的脂质或两性离子
脂质。
[0072] 在一种实施方式中,阳离子脂质可以通过本领域已知的方法和/或国际公开号WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、
WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、WO2012044638、WO2010080724、WO201021865
和WO2014089239以及美国公开号US20140309277中记载的方法合成;它们每个都通过引用
以其整体并入本文。
[0073] 应注意的是,术语“可电离的”是指分子结构中具有至少一个可电离的部位的化合物,而并不一定指“电离的”,即可电离的阳离子脂质可以是电离的形式或未电离的形式。在
一些具体的实施方式中,本发明中使用的EDEM包括上述可电离的阳离子脂质的组合(例如,
DLinDMA、DLin-KC2-DMA和/或DLin-MC3-DMA),以精确地调整杂交体在生理pH下的净阳离子
表面电荷。
[0074] 术语“pH响应型聚合物”是指,与在生理pH(pH为约7.4)下的电荷或结构相比,在低pH下经历结构或电荷变化造成聚合物变得更加促融的聚合物。在本发明的一些非限制性实
施方式中,聚合物可以由烷基
丙烯酸(如丁基丙烯酸(BAA)或丙基丙烯酸(PAA))的均聚物制
备,或可以是乙基丙烯酸(EAA)的共聚物。还可以使用烷基胺的聚合物或
马来酸酐与甲基乙
烯基醚或苯乙烯的共聚物的烷基醇衍生物。在一些实施方式中,聚合物可以与其它
单体制
成共聚物。其它单体的加入可以提高聚合物的效能,或增加具有有用功能的化学基团以促
进与其它分子实体(包括靶向部分和/或其他佐剂物质,如聚(乙二醇))的缔合
(association)。这些共聚物可以包括但不限于具有含有能够与靶向部分交联的基团的单
体的共聚物。
[0075] 通常,pH响应型聚合物由具有特定性质的单体残基构成。阴离子单体残基包括带阴离子电荷或可带有阴离子电荷的物质,包括可质子化的阴离子物质。阴离子单体残基可
以在7.2-7.4的约为中性的pH下为阴离子。阳离子单体残基包括带有阳离子电荷或可带有
阳离子电荷的物质,包括可去质子化的阳离子物质。阳离子单体残基可以在7.2-7.4的约为
中性的pH下为阳离子。疏水单体残基包含疏水性物质。亲水单体残基包含亲水性物质。
[0076] 通常,每种聚合物可以是均聚物(来源于一个单一类型的单体(具有基本上相同的化学组成)的聚合)或共聚物(来源于两种或更多种不同单体(具有不同的化学组成)的聚
合)。为共聚物的聚合物包括无规共聚物链或嵌段共聚物链(例如,二嵌段共聚物、三嵌段共
聚物、更高级(higher-ordered)的嵌段共聚物等)。任何已知的嵌段共聚物链可以根据本领
域已知的方法按常规进行构造和实现。通常,各聚合物可以是线性聚合物或非线性聚合物。
非线性聚合物可以具有各种结构,例如包括支链聚合物、刷状聚合物、星形聚合物、树枝状
聚合物,并且可以是交联聚合物、半交联聚合物、接枝聚合物及它们的组合。
[0077] 如本文所使用的,术语“结合起来(unite,uniting,unification)”或“融合”是指一种或多种EDEM和BDM的膜和/或膜的组成部分之间的直接相互作用。术语“直接相互作用”
可以指简单的聚集、脂质交换、结构破裂、半融合和融合。术语“半融合”和“融合”是指BDM与EDEM的膜的组分的完全混合以及形成包含原包含在BDM/EDEM中的每一个中、形成该融合粒
子的物质(例如,活性剂、内源性蛋白或核酸)的共同的内部空间。术语“融合效率”是指由发
生融合的EDEM和BDM产生的杂交体的相对量。
[0078] 如本文所使用的,术语“膜”是指包含诸如脂肪酸、脂质分子或聚合物等脂族分子的“壳”,并包围一个内部区室。这样,该术语可以用于限定脂质纳米粒子的膜、聚合物囊泡
(polymersome)的膜、天然分泌的粒子的膜或任何类型的细胞的膜,所述任何类型的细胞包
括细菌、真菌、植物、动物或人细胞(例如上皮细胞)。术语膜也包括细胞内脂双层,例如内体
或溶酶体膜以及核膜。
[0079]
发明人惊奇地发现,本发明的杂交体相比于本领域已知的其他药物载体呈现出数个优势,这些优势是通过将EDEM与BDM物理结合起来并协同加强这些组件中每个显示的优
点得到的。另一方面,EDEM可以设计成具有精确限定的物理化学性质、可调的促融性、对大
量活性剂的高包裹效率,承受得住缀合化学需要的严酷环境,并且满足临床制备条件。另一
方面,BDM具有安全的毒性和免疫原性谱,表现出对靶(例如,细胞、组织或器官)固有特异
性,并且优化了有机体循环性质。因此,本发明的杂交体对治疗、成像和诊断应用特别有益。
大量活性剂可以容易地体外包裹到EDEM中,并且通过使所述EDEM与源自受试者的特定的
BDM结合起来,产生包含活性剂的个体化的(personalized)生物相容杂交体。本发明的生物
杂交体还可以呈现以下优点中的一个或多个:(a)与网状内皮系统(RES)的巨噬细胞隔绝
(sequestration)下降;(b)免疫系统应答减少;(c)
循环寿命增加;(d)递送具有特异性且靶
向增强;以及(e)治疗和/或监测效果提高。
[0080] 有利地,本发明的杂交体的尺寸可以制作成适合极为具体的靶向应用。因此,在本发明的一些实施方式中,可以选择用于产生杂交体的EDEM和BDM的具体的结构特性以促进
杂交体分配到靶组织中。例如,为了靶向实体肿瘤组织,可以选择一种或多种基本组件
(EDEM或BDM),以使得到的杂交体的尺寸比在实体肿瘤中的“漏”血管中发现的窗状间隙小。
这样,该定制的杂交体可容易地
外渗穿过血管的膜孔,直接从间质空间靶向肿瘤细胞。同样
地,为了靶向
肝细胞,可以选择和/或改造基本组件中的一种或多种,以使得到的杂交体比
肝中内皮层
内衬肝血窦的膜孔小。这样,杂交体能够容易地渗透内皮膜孔到达靶向的肝细
胞。相反,本发明的杂交体可以这样的方式设计,即其尺寸将限制或避免其分布到某些细胞
或组织上。在一些具体的实施方式中,杂交体的尺寸为20nm~800nm,优选为50nm~400nm,
更优选为100nm~200nm。
[0081] 在一些具体的实施方式中,用于产生杂交体的BDM和/或EDEM包含以下中的一种或多种:受体介导的胞吞、网格蛋白介导的和胞膜窖介导的胞吞、吞噬和大胞饮、促融性、内体
或溶酶体破坏和/或使这样的杂交体相对于其他同样类型的递送系统具有优势的可释放性
能。
[0082] 本发明中使用的EDEM的细胞毒性和/或
生物相容性通过具体选择包含在其脂双层中的脂质而被降低,从而进一步提高得到的杂交体的生物相容性。因此,本发明中使用的
EDEM没有有毒转染脂质,如脂质转染胺
试剂(Lipofectamine)和HiPer-Fect,该有毒转染脂
质被一种或多种可电离的阳离子脂质如DLinDMA、DLin-KC2-DMA和/或Dlin-MC3-DMA有利地
取代。可电离的阳离子脂质可以用作EDEM的唯一的可电离的脂质(例如,iLNP),或可以与辅
助脂质和/或PEG修饰的脂质组合。
[0083] 如上所述,使用EDEM作为本发明的杂交体的一种组分使得出现巨大优势:(1)EDEM可通过大规模方法生产,且可以生产大量包裹的活性剂;(2)活性剂的包裹效率高;(3)制备
的EDEM的尺寸可控,从而使得可生产得到的杂交体具有治疗上最佳尺寸;(4)由于EDEM在体
外生产,可以保持一些特定的结构特性,以便容易分离未结合的亚群;(5)EDEM能够承受缀
合化学所需要的严酷环境;以及(6)本发明中使用的EDEM具有可调的促融性。由于数种EDEM
可以与一种或多种BDM结合起来,有可能分别产生包裹不同活性剂的EDEM(出于一些原因,
如在溶剂中的溶解性不同等,不同的活性剂不能被包裹在一起,),然后将所述各不同的
EDEM与一种或多种BDM结合起来,从而产生包含所有需要的活性剂的杂交体。
[0084] 在一些具体的实施方式中,本发明中使用的EDEM用靶向部分和/或稳定部分修饰。
[0085] 本发明中使用的EDEM与BDM亚单位相比显示出提高的物理和化学稳定性。因此,虽然BDM在生理环境中显示出良好稳定性,但是EDEM能够承受缀合化学和后插入要求的通用
环境。例如,EDEM在与还原剂(例如,二硫苏糖醇(DDT))接触时可以保留稳定性。结合该增强
的稳定性,本发明考虑通过使用另外的赋形剂来对EDEM表面进行修饰。在一种实施方式中,
术语“修饰”可以用于表征相对于制备的EDEM经修饰的EDEM,所述经修饰的EDEM是由制备的
EDEM制得的。因此,“修饰”也可以指EDEM制剂的变化,因为为了进一步靶向组织或细胞,本
发明的EDEM组合物可以加入促融部分或另外的阳离子、非阳离子和PEG修饰的脂质。
[0086] 可以制备本发明中使用的EDEM,以实现杂交体优先靶向特定的组织、细胞或器官,如心脏、
肺脏、肾脏和/或脑。例如,可以制备EDEM(如iLNP)以实现向靶细胞和组织的增强的
递送。
[0087] 如本文所使用的,“靶向部分”是可以在体外与EDEM结合(共价或非共价地)以促使杂交体与特定的靶细胞或靶组织相互作用的赋形剂。如本公开中所使用的,“结合”或“缀
合”是指两个实体(此处为靶向部分和载体小泡)在实现两个实体之间缔合的治疗/诊断益
处的充分的
亲和性下缔合。例如,靶向可以通过在杂交体内或杂交体上包含一种或多种靶
向配体(例如,单克隆抗体)来介导,以促进向靶细胞或组织的递送。通过靶向组织对靶向配
体的识别积极地促进靶细胞和组织对杂交体的内容物进行组织分配和细胞吸收。基于配体
的物理、化学或生物性质(例如,选择性亲和性和/或对靶细胞表面标记或特征的识别)选择
合适的配体。
[0088] 选择靶向配体,以使利用靶细胞的独特的特性,从而使杂交体能区别靶细胞和非靶细胞。这样的靶向部分可以包括但不限于以下中的任何成员:特异性结合对、抗体、单克
隆抗体以及它们的衍生物或类似物,包括可变区(FV)
片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段、F
(ab')2片段、单域抗体;抗体片段、人源化抗体、抗体片段;前述的多价形式。
[0089] 考虑包含能够提高组合物对一种或多种靶细胞或组织的亲和性的一种或多种配体(例如,肽、适配体、寡核苷酸、维生素或其他分子)的杂交体。在一些实施方式中,靶向配
体可以跨越包埋或包裹在杂交体中的脂质纳米粒子(例如,糖胺聚糖)的表面。在一个实施
方式中,杂交体包括多价结合试剂,所述的多价结合试剂包括但不限于:单特异性或双特异
性抗体,例如二硫键稳定的抗Fv片段、scFv
串联((SCFV)2片段)、双抗体、三抗体或四抗体,
它们通常为以共价键连接或其它方式稳定的(即,亮氨酸
拉链或螺旋稳定的)scFv片段;并
且,其它归巢部分包括例如适配体、受体和融合蛋白。
[0090] 在一些实施方式中,杂交体可以用于多特异性亲和性机制(multi-specific affinity regimes)。由此杂交体包含至少两种与杂交体表面共价连接的不同靶向部分。第
一靶向部分特异性地结合至细胞表面上的
抗原或分子(即细胞表面抗原),而第二靶向部分
结合至细胞内靶。在一些实施方式中,第一靶向部分和第二靶向部分包含在单个多肽链中。
在某些实施方式中,靶向部分的部分或全部由氨基酸(包括天然的、非天然的和修饰的氨基
酸)、核酸和适配体或糖类组成。在某些实施方式中,靶向部分是小分子。在某些实施方式
中,细胞内靶向部分是外源性,并缀合至EDEM,而细胞外靶向部分在BDM上且在体内产生。在
另一种实施方式中,在体内产生的细胞内靶向部分在BDM上,而细胞外靶向部分与EDEM缀
合。
[0091] 在双特异性实施方式中的“第一靶向部分”可以是抗体、抗体样分子、肽或小分子(例如维生素(例如叶酸))、糖(例如乳糖和半乳糖)或其它小分子。细胞表面抗原可以是任
何经历内化的细胞表面分子,例如,细胞表面上的蛋白、糖、脂质头基或其它抗原。在本发明
的环境中有用的细胞表面抗原的实例包括但不限于:四跨膜蛋白(tetraspanins)、EGF受
体、HER2/Neu、VEGF受体、整联蛋白、CD38、CD33、CD19、CD20、CD22和脱唾液酸糖蛋白受体。
[0092] 在双特异性实施方式中的“第二靶向部分”识别细胞内靶。该靶向部分特异性结合至细胞内膜表面或抗原,例如蛋白。在某些实施方式中,细胞内靶向部分将增强物质到希望
的细胞内
位置的
定位。在一些实施方式中,第二靶向部分为
蛋白质的,而在某些实施方式
中,为抗体或抗体样分子。其它第二靶向部分包括肽(例如合成的
蜂毒肽类似物)和有机大
分子,该有机大分子借助它们的大小(分子重量>500g)、电荷或其它物理化学性质不能或勉
强能够独立地进入细胞。在一些实施方式中,第二靶向部分为核酸适配体。第二靶向部分可
以结合至胞质蛋白;结合至质膜的内面的蛋白,或细胞的核膜、线粒体膜或其它膜;或核蛋
白或其它亚细胞区室中的蛋白。对于本领域技术人员而言将显而易见的是,阻断细胞内信
号传导的关键功能的靶向部分将是用作第二靶向部分的良好候选物。第二靶向部分可以直
接抑制蛋白的活性,或阻断与蛋白的底物的相互作用,或者它们可以阻断蛋白-蛋白相互作
用。
[0093] 另外的实施方式包括掺入用于增强活性杂交体细胞内转运的互补功能性靶向部分。用于增强细胞内转运的实例是通过使用能够“劫持”、结合或
啮合天然活性细胞转运系
统的靶向部分实现的。例如,将微管动力复合物的这些蛋白之一与动力蛋白结合肽结合起
来允许沿微管转运网络主动转运。示例性的动力蛋白包括但不限于动力蛋白和驱动蛋白。
[0094] 在某些实施方式中,第二靶向部分具有双重作用,即膜渗透能力和细胞内靶向功能。例如,肽毒蜂肽或其类似物在低pH下具有膜相互作用能力,并且在细胞溶胶内具有核归
巢功能。这种双重作用可归功于第二靶向部分的区段。例如,核靶向功能通过核定位序列
(例如,肽序列“KRK”)和包含在相同的第二靶向部分中的两亲α螺旋区段调节。因此,在某些
实施方式中,第二靶向部分的双重功能可以介导杂交体的两个互补功能。下面的实施例中
描述了用双重目的的第二靶向部分修饰的示例性杂交体组合物。
[0095] 此外,本发明的EDEM可以被修饰以表现在它们表面具有两亲性质的分子,如细胞渗透肽。这些肽的特征在于它们能够通过
缺陷的产生、破裂或通过孔形成来破坏膜双层完
整性,导致EDEM与BDMS之间相互作用。这样的肽的实例可以来源于蛋白(例如,Tat和Rev)以
及来源于毒素的肽(例如响尾蛇胺或蜂毒肽)。适于用在本发明中的优选类型的细胞渗透肽
包含在生理pH下是“惰性的”而在低pH环境下具有活性的疏水性结构域。当pH诱导疏水性结
构域解折叠和暴露时,该部分结合至脂双层,并实现EDEM与BDM或杂交体与内体区室之间相
互作用。在下面的实施例中描述了促融肽的示例性缀合。
[0096] 本发明还考虑向EDEM中或EDEM上掺入化学选择性和生物
正交互补功能分子,以提高部位与BDM的特异性结合。例如,向EDEM脂双层(如SNARE蛋白,可溶性N-乙基马来酰亚胺
敏感性因子附着蛋白受体)或其合成模拟物中掺入融合肽,允许EDEM与BDM之间有受体特异
性相互作用。
[0097] 在一种实施方式中,为了促进靶向部分缀合到EDEM,一部分摩尔比的PEG修饰的脂质可以代替具有功能实体(如马来酰亚胺,例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-
N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000])或在PEG的远端具有胺基(例如,1,2-二硬脂酰基-sn-甘
油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000])的PEG修饰的脂质。下面的实施例中描述了
示例性的缀合方法。
[0098] 本文描述的EDEM还可以包含锚固到脂双层中的遮蔽部分。如本文中所使用的,术语“稳定部分”是指能够通过包含在杂交体中的EDEM组分修饰杂交体的表面性质的分子。稳
定部分可以防止杂交体彼此粘附或粘附到血细胞或血管壁上。在某些实施方式中,具有稳
定部分的杂交体在被给予受试者时具有降低的免疫原性。在一种实施方式中,稳定部分还
可以增加杂交体在受试者体内的血液循环时间。用在本发明中的稳定部分可以包括本领域
公知的那些。
[0099] 稳定部分的实例包括但不限于包含聚乙二醇的化合物以及其他化合物,例如但不限于树状聚合物、聚环氧烷、聚乙烯醇、聚
羧酸酯、多糖和/或羟乙基
淀粉,这些化合物减小
复合物与体内或体外存在的物质(例如,血清补充蛋白、辅因子、
激素或维生素)的相互作用
或结合。术语“PEG修饰的脂质”是指但不限于:共价缀合到具有C6-C20长度的烷基链的脂质
的长度高达20kDa的聚乙二醇链。在某些实施方式中,合适的聚乙二醇脂质包括PEG修饰的
磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG修饰的神经酰胺(例如,PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG
修饰的二酰基甘油和PEG修饰的二烷基甘油。在一种实施方式中,聚乙二醇脂质为(甲氧基
聚乙二醇)2000-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)。PEG修饰的脂质的另外的非限制性实例包括
PEG-二烷氧基丙基(DAA)、R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆
蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DOMG)和N-乙酰半乳糖胺-((R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-l-(甲
氧基聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯))(GalNAc-PEG-DSG)。
[0100] 本发明考虑提供的PEG显示在EDEM、BDM和/或杂交体的表面,可以使用除脂质之外的化合物,例如,肽、疏水锚或聚合物、糖类、金属或其它离子,以与PEG缀合,从而将这些化
合物锚固到脂双层中。
[0101] 转到BDM,本发明考虑在BDM的发生期间掺入细胞溶胶和质膜中的生物活性分子,产生具有允许BDM用作活性剂的有效纳米粒子载体的独特功能性质的BDM。在这方面,BDM能
够将活性剂递送至靶细胞和组织,同时保留内源性货物以及活性剂的生物活性。特别地,
BDM表现出以进化方式优化的血清半衰期和与靶组织和/或细胞的相互作用。在一种或多种
BDM与一种或多种EDEM结合后,BDM的有利的递送能力被转移给本发明的杂交体。此外,BDM
能够将内源性生物活性组分转移给杂交体。在一种具体的实施方式中,一种或多种BDM被收
集起来,用于促进由供体细胞在体内产生的内源性miRNA、多核苷酸和多肽释放到由本发明
的杂交体包围的容积体中。在另一种实施方式中,一种或多种BDM被收集起来,用于促进BDM
膜中包埋的生物活性分子和/或多肽转移作为杂交体的膜的组成部分。
[0102] 在一些实施方式中,本发明中使用的BDM来源于患有疾病或失调(例如,癌症)的供体受试者。不受任何特定理论的限制,预期从受试者收集的BDM中的至少一些具有特异性靶
向与疾病或失调相关的细胞的能力,因此被有利地用于监测或治疗疾病。此外,本发明中使
用的BDM的组分可以与特定的性细胞相互作用,并促进胞吞,从而使得包裹物质能够靶向递
送到特定的细胞、细胞类型或组织中。不受任何特定理论的限制,用在本发明中的BDM的靶
细胞特异性取决于得到BDM的细胞类型。例如,来源于B细胞或成胶质细胞瘤细胞的BDM可用
于产生本发明的杂交体。这样的BDM可以将一种或多种在体内产生的内源性B细胞或成胶质
细胞瘤靶向部分转移给杂交体,从而使杂交体具有B细胞或成胶质细胞瘤特异性。此外,预
期将杂交体重新引入得到用于产生该杂交体的BDM的受试者,转移到杂交体中的BDM组分使
得该杂交体与该受试者的免疫系统相容。
[0103] 在一些实施方式中,得到BDM的细胞是肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是初级肿瘤细胞或可以由肿瘤细胞产生得到,例如,通过传代、培养、扩增、无限增殖(immortalization)等。因
此,肿瘤细胞可以来自癌症或初癌患者的肿瘤,或者可以来自肿瘤或癌细胞系。肿瘤细胞可
以来自良性肿瘤或
恶性肿瘤。
[0104] 在其它实施方式中,得到BDM的细胞是受感染的细胞,即含有病原体的细胞。
[0105] 在其它实施方式中,得到BDM的细胞是突变细胞。例如,在一些实施方式中,突变细胞表达突变体或错折叠的蛋白。在一些实施方式中,突变的细胞超表达一种或多种蛋白。在
一些实施方式中,突变体细胞包含在退行性失调中,如蛋白质病(proteopathic)失调中。在
一些实施方式中,细胞为中枢神经系统细胞。
[0106] 在一种实施方式中,本发明的药物组合物包含在其内区室中不含有任何治疗剂和/或
诊断剂的杂交体。这样的杂交体可以例如通过将“空的”EDEM与BDM结合起来产生。在
一些具体的实施方式中,“空的”EDEM在其膜中包含一些结构性元件,其可以方便通过本领
域已知的技术(例如,电穿孔)进一步装载活性剂。
[0107] 如本文所使用的,“活性剂”或“生物活性剂”是指在与活的有机体(例如,哺乳动物,例如人)接触时产生生理结果(例如,有益的或有用的结果)的任何化合物或化合物的混
合物。活性剂不同于递送组合物的其它组分(如,载体、稀释剂、黏合剂、
着色剂等)。活性剂
可以是能够调节活的受试者的生物学过程的任何分子以及其结合部分或片段。在某些实施
方式中,活性剂可以为用在疾病的诊断、治疗或预防或作为药物治疗的组分的物质。在某些
实施方式中,活性剂可以指促进获得有关活的有机体(例如,
哺乳动物)或人的身体内靶向
部位的诊断信息。例如,
显像剂可以归为本发明中的活性剂,因为它们是提供诊断需要的成
像信息的物质。
[0108] 在一些其他实施方式中,组合物的杂交体包含一种或多种治疗剂和/或诊断剂。如上所述的,首先将这些治疗剂和/或诊断剂包裹在EDEM中,然后通过将所述EDEM与BDM结合
起来将其转移到杂交体的内区室中。
[0109] 如本文所使用的,“治疗剂”是能够在动物(如哺乳动物或人)的靶向部位产生希望的生物学效果的生理学或药理学活性物质。该治疗剂可以是任何无机或有机化合物。治疗
剂可以降低、抑制、削弱、消除、停滞或稳定动物(如哺乳动物或人)的疾病、失调或细胞生长
的发展或进展。实例包括但不限于:肽、蛋白、核酸(包括siRNA、miRNA和DNA)、聚合物以及小
分子。在各种实施方式中,治疗剂可以被表征或不被表征。
[0110] 在一种实施方式中,在结合EDEM与BDM二者之前,治疗剂可存在于EDEM或BDM中。例如,BDM可以含有一种或多种得到BDM的细胞内源性的治疗剂(例如,miRNA),而EDEM可以在
与BDM结合之前包含一种或多种治疗剂(例如,
抗肿瘤剂)。用于将活性剂包裹到EDEM中的方
法在本领域中是已知的(Bao,Mitragotri,&Tong,2013)。或者,在EDEM和BDM结合起来后,可
以通过共价或非共价结合到细胞表面、后插入杂交体膜中,或通过开孔进入到杂交体的膜
中以使活性剂进入被包裹的容积体中(例如,电穿孔法)来给杂交体装载治疗剂。
[0111] 本发明的治疗剂也可以是各种各样的形式。这样的形式包括但不限于:未改变的分子、分子复合物以及药理学上可接受的盐(例如,
盐酸盐、溴酸盐、
硫酸盐、
磷酸盐、亚
硝酸盐、硝酸盐、
硼酸盐、乙酸盐、马来酸盐、
酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐等)。在一些实施方式
中,治疗剂可以用金属、胺或有机阳离子的盐(例如,季铵盐)来修饰。药物的衍生物,例如
碱、酯和酰胺,也可以用作治疗剂。
水溶性治疗剂可以以其水溶性衍生物的形式(如碱性衍
生物(base derivative))使用。在这样的情况下,衍生物治疗剂在被递送至靶部位时可以
被转化为原始治疗活性形式。这样的转化可以通过各种代谢过程发生(包括酶切割、通过体
内pH的
水解)或通过其他类似过程发生。
[0112] 如本发明所考虑的,合适的治疗剂包括但不限于:化疗剂(即抗肿瘤剂)、麻醉剂、β-肾上腺素能阻滞剂、抗
高血压剂、抗抑郁剂、抗惊厥剂、止吐剂(anti-emetic agent)、抗
组胺剂、抗心律不齐剂、抗疟剂、抗增殖剂、抗血管形成剂、创伤修复剂、组织修复剂、
热疗剂
及它们的组合。
[0113] 在一些实施方式中,合适的治疗剂还可以为但不限于免疫
抑制剂、细胞因子、细胞毒剂、溶核化合物、
放射性同位素、受体、前体药物活化酶。本发明的治疗剂可天然地分泌或
通过合成或重组方法或它们的任何组合产生。
[0114] 各种各样的治疗剂可以与本文描述的EDEM结合使用。这样的治疗剂的非限制实例包括抗肿瘤剂、抗感染剂、局部麻醉剂、抗过敏剂、抗贫血剂、血管发生、抑制剂、β-肾上腺素能阻滞剂、钙通道拮抗剂、抗高血压剂、抗抑郁剂、抗惊厥剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒
剂、抗
风湿剂、抗蠕虫剂、抗寄生虫剂、糖皮质激素、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递
质拮抗剂、抗糖尿病剂、抗
癫痫剂、
止血剂、抗
张力亢进药(anti-hypertonics)、抗
青光眼剂、免疫调节细胞因子、
镇静剂、趋化因子、维生素、毒素、麻醉药、植物来源剂(例如来自叶、根、花、
种子、茎或枝的提取物)及其组合。
[0115] 在各种实施方式中,受经典的多药耐药性影响的药物作为本发明的治疗剂可以具有特定的效用。这样的药物包括但不限于长春花生物碱(例如,长春碱)、蒽环类(例如,阿霉
素)和RNA转录抑制剂。
[0116] 在另外的实施方式中,治疗剂可以是癌症化疗剂。合适的癌症化疗剂的实例包括但不限于:氮芥、亚硝基脲、吖丙啶、链烷磺酸盐、四嗪、铂化合物,嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗
代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱和拓扑异构酶抑制剂和激
素药。
[0117] 另外的可以用作本发明的治疗剂的癌症化疗剂包括但不限于:烷基化剂,例如,环磷酰胺;
烷基磺酸盐;氮丙啶;吖丙啶和甲基三聚氰胺(methylamelamine);抗代谢物;嘧啶
类似物;抗肾上腺素剂(anti-adrenals);叶酸补充剂(folic acid replenisher);视黄酸;
以及上述的任意一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0118] 另外的适合用在本发明中的治疗剂包括但不限于起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂。这样的抗激素剂的非限制性实例包括:抗雌激素剂,例如包括他莫昔芬和托
瑞米芬;抗雄激素剂,例如亮脯利特;以及上述任意一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0119] 在本发明的另外的实施方式中,细胞因子可以用作治疗剂。这样的细胞因子的非限制性实例为淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。另外的实例包括生长激素,如人生长
激素、N-甲硫氨酰人生长激素和
牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;
松弛素;松弛素原(prorelaxin);糖蛋白激素,例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺素(TSH)和
黄体生成素(LH);肝生长因子;
成纤维细胞生长因子;催乳素;胎盘催乳素;肿瘤
坏死因子α
和肿瘤坏死因子β;缪勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激
素相关肽;抑制素;活化素;血管内皮生长因子;整合素;血小板生成素(TPO);神经生长因
子,如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF),如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子I
和胰岛素样生长因子II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素,如干扰素α、干扰素β和
干扰素γ;集落刺激因子(CSF),如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)
和粒细胞-CSF(GCSF);白细胞介素(ILS);肿瘤坏死因子,如TNF-α或TNF-β;以及其他多肽因
子,包括LIF和kit配体(KL)。如本文所使用的,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组
来源的蛋白(例如,来自T-细胞培养物和天然序列的细胞因子的生物活性的等同物)。
[0120] 在另外的实施方式中,治疗剂还可以是抗体基治疗剂,非限制性实例包括赫赛汀、爱必妥(Erbitux)、阿瓦斯汀、利妥昔单抗、舒莱、依那西普、阿达木单抗和英夫利昔单抗。
[0121] 在一些实施方式中,治疗剂可以是纳米粒子。这样的纳米粒子的非限制性实例包括任何金属和
半导体基纳米粒子,其包括但不限于:金、
银、氧化
铁、
量子点和碳
纳米管。例
如,在一些实施方式中,纳米粒子可以是能够用于热
切除或热治疗的纳米粒子。
[0122] 在一些实施方式中,EDEM装载有阴离子治疗剂。阴离子治疗剂包括任何具有净负电荷或具有能够与杂交体的可电离的脂质相互作用的带负电的基团的治疗剂。这样的治疗
剂包括任何已知的或潜在的治疗剂,包括药物和化合物,例如但不限于带负电荷基团的寡
核苷酸、核酸、修饰的核酸(包括蛋白-核酸等)、蛋白和肽,具有负电荷基团的常规药物,如
植物碱及类似物等。内在地不是阴离子的治疗剂可以衍生具有阴离子基团,以有利于它们
在本发明中的使用。例如,紫杉醇可以衍生具有聚谷氨酸基团。
[0123] 在一种实施方式中,杂交体包含待引入细胞的带负电的核酸。预期用在本发明中的核酸的非限制性实例有siRNA、微小RNA(miRNA)、小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)、指导
RNA(gRNA)、成簇的规律间隔的短回文重复RNA(crRNA)、反式激活成簇的规律间隔的短回文
重复RNA(tracrRNA)、免疫刺激寡核苷酸、质粒、反义核酸和核酶。本发明考虑的是,包含在
杂交体中的核酸可以对得到BDM的细胞是内源性的和/或为由EDEM包裹的外源性核酸。
[0124] 在一些实施方式中,出于调节或以其它方式减少或消除内源性核酸或基因的表达的目的,杂交体包裹的多核苷酸编码小干扰RNA(siRNA)或反义RNA。在某些实施方式中,这
样被包裹的多核苷酸可以是天然的或本质上重组的,并且可以利用有义或反义作用机制
(例如,通过调节靶基因或核酸的表达)发挥它们的治疗活性。如本文所使用的,术语“调节”
是指改变靶多核苷酸或多肽的表达。调节可以是指增加或提高,也可以是指减少或降低。
[0125] 在其它一些实施方式中,本发明的杂交体包含编码感兴趣的多肽或蛋白的多核苷酸,所述多肽或蛋白例如激素、酶、受体或调节肽。在一些具体的实施方式中,杂交体包含生
物活性剂,就进一步的转染而言,该生物活性剂能够产生可以使另外的杂交体容易靶向/转
染到靶细胞的功能多肽。在某些实施方式中,本文描述的杂交体使用多官能策略以促进包
裹物质(例如,一种或多种多核苷酸)的递送以及与靶细胞相互作用时随后的释放。
[0126] 通常,供用作特定癌症类型的
疫苗的药物组合物将包含来源于特定癌症类型的肿瘤/癌细胞的BDM。例如,用在成胶质细胞瘤癌症疫苗中的药物组合物通常包含纯化不含成
胶质细胞瘤肿瘤/癌细胞的BDM。这样,BDM包含肿瘤相关抗原,该抗原刺激针对待治疗/对抗
的肿瘤/癌细胞上存在的抗原的适应性免疫应答。其它疾病也适用同样的原点/意图匹配。
[0127] 在一种实施方式中,本发明有用的BDM可以是通过破坏细菌外膜或寄生物或由细菌外膜或寄生物起泡以由外膜形成保留抗原的小泡而得到的任何脂蛋白体(参见国际公开
号WO2014122232和WO201108027,它们每个都通过引用以其整体并入本文)。来源于细菌和
寄生物的BDM具有许多使它们成为对免疫治疗递送平台有吸引力的候选物的性质,包括:
(i)强免疫原性;(ii)自佐剂活性;(iii)能与哺乳动物细胞相互作用且能够通过膜融合或
借助黏着受体进行的细胞附着被吸收;以及(iv)有通过重组工程掺入异种抗原表达的可能
性。
[0128] 因此,包含本发明的杂交体和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以用于治疗或预防各种疾病和失调。
[0129] 如本文所使用的,“诊断剂”是指在受试者体内或测试样品中可以被检测到的组分,其进一步地描述在本文中。在一些实施方式中,本发明的诊断剂可以是提供关于动物
(如哺乳动物或人)体内靶向部位的成像信息的物质。本发明中使用的诊断剂可以包括本领
域中已知的任何诊断剂。
[0130] 诊断剂可以通过各种各样的方式检测,包括作为提供和/或增强可检测到的
信号的试剂,所述的可检测到的信号包括但不限于γ-发射信号、放射性信号、光学信号、荧光吸
收信号、回声信号、磁信号和
断层信号。用于对诊断剂成像的技术可以包括但不限于计算机
断层术(CT)、
磁共振成像(MRI)、光学成像、单光子发射计算机断层术(SPECT)、
正电子发射
断层术(PET)、x-射线成像和γ射线成像等。
[0131] 在一种实施方式中,放射性同位素可以起诊断剂的作用,因而可以掺入到本文描述的杂交体中,其可以包括发射γ射线、正电子、β和α粒子以及
X射线的
放射性核素。合适的
放射性核素包括但不限于:225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、123I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、
188 47 153 89 99m 88 90
Re、Sc、 Sm、Sr、 Tc、Y和 Y。
[0132] 在一些实施方式中,有效负载(payload)可以是可检测到的试剂,例如但不限于:各种有机小分子、无机化合物、纳米粒子、酶或酶底物、荧光物质、发光物质(例如,发光氨)、
生物发光物质(例如,荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白)、
化学发光物质。这样的光学可检测
到的标记例如包括但不限于:十八烷罗丹明B、7-硝基-2-1,3-苯并 二唑-4-基、4-乙酰氨
基-4’-异硫氰酸基芪-2,2’-二磺酸、吖啶及衍生物、5-(2’-氨基乙基)氨基
萘-1-磺酸
(EDANS)、4-氨基-N-(3-[乙烯基磺酰基]苯基)萘二甲酰亚胺-3,6-二磺酸二锂盐、N-(4-苯
胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、BODIPY、亮黄、香豆素及衍生物、花青染料、焰
红染料(cyanosine)、4’,6-联脒(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、溴代邻苯三酚红、7-二
乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、二亚乙基三胺五乙酸、4,4'-二异硫氰
酸基二氢-芪-2,2’-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸基芪-2,2’-二磺酸、丹磺酰氯、4-二甲基氨基
苯基偶氮苯基-4’-异氰酸酯(DABITC)、曙红及衍生物、赤藓红及衍生物、乙锭、荧光素、5-羧
基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二
氯-6-羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、X-罗丹明-5(6)-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC)、荧光胺、
烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-,氢氧化物、内盐与n,n-二乙基乙胺(1:1)的
化合物(IR144)、5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯
基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑高氯酸盐(IR140)、孔雀石绿异硫氰酸
酯、4-甲基伞形
酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副蔷薇苯胺、酚红、B-藻红蛋白、邻苯二甲
醛、芘、芘丁酸酯、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯量子点(succinimidyl 1-pyrene,butyrate quantum
dots)、活性红4(CibacronTM亮红3B-A)、罗丹明及衍生物、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗
丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸
酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N’,
N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异氰酸酯(TRITC)、核黄素、
玫红酸、铽
螯合物衍生物、花青-3(Cy3)、花青-5(Cy5)、花青-5.5(Cy5.5)、花青-7(Cy7)、IRD
700、IRD 800、Alexa 647、La Jolta蓝、酞花青以及萘酞花青(naphthalo cyanine)。
[0133] 对于包含光学成像的实施方式,诊断剂可以是
造影剂,例如半导体
纳米晶体或量子点。对于光学相干断层成像(optical coherence tomography imaging),诊断剂可以为
金属(例如金或银)纳米笼粒子。在一些实施方式中,诊断剂可以是金属纳米粒子,如金纳米
粒子或银纳米粒子。
[0134] 在一些实施方式中,诊断剂可以包括磁共振(MR)显像剂。示例性的磁共振剂包括但不限于:顺磁剂和超顺磁剂等。示例性的顺磁剂可以包括但不限于钆喷酸、钆、钆特醇或
钆酸。超顺磁剂可以包括但不限于:超顺
磁性氧化铁以及氧化铁和氧化亚铁复合物
(ferristene)。在某些实施方式中,诊断剂可以包括X射线造影剂。X射线造影剂的实例包括
但不限于碘帕醇、碘美普尔、碘海醇、碘喷托和甲泛葡胺。
[0135] 类似于上述治疗剂,诊断剂可以以各种各样的方式与杂交体缔合,这样的方式例如包括包埋、包裹或栓至杂交体上。在一些实施方式中,诊断剂可以是可以共价或非共价粘
附到粒子表面的
金属离子复合物/缀合物。在一些实施方式中,诊断剂可以是可共价或非共
价粘附到杂交体表面的放射性核素。同样地,诊断剂的装载可以通过本领域已知的各种各
样的方式进行。在实施例部分存在将诊断剂装载到EDEM中的一个实例。
[0136] 因此,本发明的一种实施方式涉及包含至少一种EDEM的杂交体,所述EDEM可以包含活性剂,如诊断剂和/或治疗剂。杂交体可以用作用于对疾病或病症(包括疾病,例如癌
症)进行治疗、监测、预防、分阶段和/或诊断的组合物的一部分。这可以例如通过在杂交体
中将治疗剂和诊断剂组合起来实现。这也可以通过给予包含装载治疗剂的第一亚群和装载
诊断剂的第二亚群的杂交体来实现。在另一种实施方式中,本发明提供用于诊断可以通过
给予诊断剂诊断的疾病或病症的方法,包括将本发明的杂交体给予有需要的受试者。
[0137] 因此,包含本发明的杂交体和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以用于诊断目的。
[0138] 在另外的方面,本发明提供一种包含杂交体的药物组合物,其中,在BDM中掺入的活性剂引起对一种或多种疾病相关抗原(例如,肿瘤抗原)的免疫。考虑的是,包含能够引起
免疫应答的杂交体的药物组合物可以用在免疫疗法(例如抗癌或抗感染)的环境中。
[0139] 在一些实施方式中,BDM包括在体内产生的疾病相关抗原,例如,一种或多种肿瘤相关抗原、一种或多种病原体相关抗原或一种或多种退行性失调相关抗原。术语“疾病相关
抗原”可以涉及在疾病相关细胞中产生的蛋白,该疾病相关细胞与非疾病相关细胞相比存
在结构异常和/或表达模式异常。异常蛋白也由感染肿瘤病毒(例如,EBV和HPV)的细胞产
生。例如,在一些实施方式中,BDM非常适合提呈在受试者体内可以刺激希望的免疫应答的
抗原。可以出现这种优势,因为BDM是由细胞产生的,而不是人工合成的,因此提供的是“天
然”抗原。即,由细胞产生并在BDM中发现的抗原可以是由细胞以与受试者体内的免疫细胞
经历的抗原类似的程度处理(例如,
糖化等)和折叠的全长肽。除了蛋白之外,在疾病相关细
胞中其它像细胞表面糖脂和糖蛋白一样的物质也可以具有异常结构,因此可以作为免疫系
统的靶。这样,BDM抗原可以用在抗例如癌症的疫苗或治疗中。在一些实施方式中,因此,一
种或多种抗原各自可以包括癌细胞抗原。作为非限制性实例,癌细胞抗原可以是胎盘型碱
性磷酸酶、p53、p63、p73、mdm-2、组织蛋白酶-D酶原(procathepsin-D)、B23、C23、PLAP、
CA125、MUC-1、cerB/HER2、NY-ESO-1.SCP1、SSX-1、SSX-2、SSX-4、HSP27、HSP60、HSP90、
GRP78、TAG72、HoxA7、HoxB7、EpCAM、ras、间皮素(mesothelin)、存活蛋白、EGFK、MUC-1和c-myc。
[0140] 在另一种实施方式中,BDM来源于抗原提呈蛋白。本发明特别地考虑来源于病态抗原提呈细胞的BDM。在具体的实施方式中,BDM包含来自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和套细
胞淋巴瘤的肿瘤相关抗原。在非限制性实例中,BDM来源于具有酪氨酸蛋白激酶跨膜受体
ROR1的套细胞淋巴瘤细胞。
[0141] 在另外的方面,本发明提供了包含杂交体的药物组合物,其中,在BDM中掺入的活性剂为组合物带来免疫抑制能力(例如,如在自身免疫疾病、感染、过敏症和移植的环境中
所需要的),以避免受试者的免疫系统的有害激活和/或过度反应。这个方面可以通过分离
提供一种或多种免疫抑制剂的BDM来实现。在一种实施方式中,BDM抑制作为同种异体/异种
细胞移植或
基因治疗的结果出现的免疫反应。如在实施例部分所示,一种实施方式包含从
血小板和激活的多形核嗜中性粒细胞分离的免疫抑制性BDM。
[0142] 在另外的方面,本发明提供包含用于递送治疗剂的杂交体的药物组合物。
[0143] 如本文所使用的,“药物组合物”是指包含待以单次或多次剂量给予的物理分离单位的组合物,每个单位包含预定量的至少一种药学活性成分和至少一种选自药学上可接受
的赋形剂的其它成分。例如,本发明提供一种包含用于向活的有机体的组织或细胞靶向递
送一种或多种活性剂的杂交体的药物组合物。在另外的实施例中,本发明提供一种用于在
体外向组织或细胞递送一种或多种活性剂的杂交体的药物组合物。
[0144] 在一些实施方式中,本发明的杂交体可以用作用于向动物(如哺乳动物或人)的靶细胞或组织递送活性剂(如治疗剂和/或诊断剂)的系统。在某些实施方式中,本发明提供用
于向靶细胞或组织中引入活性剂的方法。本发明的粒子可包含各种各样的治疗剂和/或诊
断剂。在另一方面,本发明提供一种用于将治疗剂和/或诊断剂给予受试者的方法。在该方
法中,将本发明的包含治疗剂和/或诊断剂的杂交体给予有需要的患者。在某些实施方式
中,递送活性剂(例如,治疗剂和/或诊断剂)可以构成疗法的手段。
[0145] 术语“疗法”或“治疗”是指预期使像哺乳动物那样的个体,例如,人(通常称为患者)或动物的病症产生有益变化的过程。有益变化可以包括例如以下中的一种或多种:功能
的恢复;症状的减少;疾病、失调或病症的进展的限制或延迟;或患者病症、疾病或失调的恶
化的预防、限制或延迟。除了别的之外,这样的疗法通常包括借助杂交体给予活性剂。
[0146] 术语“治疗”是本领域公认的,包括防止易于患,但尚未被诊断出的疾病、失调和/或病症的活的有机体(例如哺乳动物或人)发生疾病、失调或病症;抑制疾病、失调或病症,
例如阻碍其发展;以及减轻疾病、失调或病症,例如引起疾病、失调和/或病症的衰退。治疗
疾病或病症包括减轻具体疾病或病症的至少一个症状,尽管潜在的病理生理学没有受到影
响,例如,通过给予止痛剂来治疗受试者的
疼痛,尽管这样的止痛剂并没有治疗疼痛的原
因。
[0147] 如上所述的,本发明的杂交体可以包含可以根据需要治疗的疾病的类型来选择的治疗剂。例如,某些类型的癌症或肿瘤,例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、癌和肉瘤以及实体肿
瘤和混合肿瘤,可以涉及给予相同或可能不同的治疗剂。
[0148] 本领域普通技术人员还将认识到本发明的杂交体可以出于各种目的使用。本发明的方法比现有技术的方法有许多优势。利用活性剂治疗患者的方法已经使用了很长一段时
间了。然而,在大多数现有技术的方法中,活性剂通常被递送至整个人体或动物体,而不靶
向至受疾病影响的特定的部位。因此,在现有技术的方法中,活性剂均匀地分布在整个有机
体中。现有技术的方法的一个缺陷在于人或动物体未受影响的区域也可以受到活性剂的影
响。此外,只有一小部分活性剂可以在患病部位起作用。
[0149] 如本发明所考虑的,杂交体提高了将适量的包裹物质(例如,治疗剂和/或诊断剂)递送至靶细胞或组织的可能性,接着使与未结合的组件或它们的包裹内容物有关的潜在全
身性不良作用或毒性最小化。例如,当EDEM(例如,iLNP)包含或以其它方式加入一种或多种
可电离的脂质时,一个或多个靶细胞的脂双层中的相转变可以促进包裹物质(例如,脂质纳
米粒子中包裹的一种或多种活性剂)递送至靶细胞。同样地,在某些实施方式中,本文公开
的化合物可用于制备以在体内具有降低的毒性为特征的杂交体。在某些实施方式中,降低
的毒性是与本文公开的组合物有关的高转染效率的函数,从而使得可以将减少量的这样的
组合物给予受试者来实现希望的治疗响应或结果。
[0150] 本发明的杂交体可以设计为促进包裹物质(例如,一种或多种活性剂)的包裹和释放到一个或多个靶细胞和/或组织中。例如,当杂交体包含或以其它方式加入一种或多种促
融脂质时,一种或多种靶细胞的脂双层中的相转变和潜在的破坏可促进包裹物质(例如,杂
交体中包裹的一种或多种活性剂)的递送。
[0151] 同样地,在某些实施方式中,将具有可电离的亲
水头基的脂质掺入到EDEM中可用来促进内体或溶酶体释放杂交体中包裹的内容物。这样的增强的释放可以通过质子-海绵
介导的破坏机制来实现,在该机制中,EDEM中的化合物可以缓冲内体的
酸化的能力反过来
又促进内体或溶酶体脂质膜的渗透溶胀和破坏,从而促进其中包裹的货物释放到靶细胞
中。
[0152] 在另外的实施方式中,本发明的杂交体还可以提供以下用于治疗的另外的优势中的至少一种:(1)增加递送系统的循环时间;(2)通过使用患者来源的BDM和任选地加入稳定
部分减缓了杂交体的RES吸收;(3)由于稳定包裹,防止了杂交体内的货物过早释放;(4)在
引入受试者体内时由于存在内源性BDM组分而减少了免疫系统应答;(5)由于BDM上的内源
性靶向部分或栓至EDEM上的外源性靶向部分,增强了杂交体穿过血管的生物屏障(例如,内
皮屏障、血脑屏障)的转胞吞作用;(6)增加了杂交体在患病部位(如肿瘤部位)的积聚;(7)
由于源自BDM的内源性靶向部分,增加了向靶细胞的内体的内化,以及由于EDEM提供的促融
性质,增加了随后的内体释放。
[0153] 如上所讨论的,在某些实施方式中,本发明的杂交体允许优先将活性剂递送至患病部位。这样的靶向递送还可以允许人们避免高剂量的活性剂。这样的靶向递送可以增强
活性剂的功效。这可以反过来帮助阻止与给予高剂量的各种活性剂有关的毒
副作用或与载
体自身(例如,脂质、外源性靶向载体)有关的作用。在某些实施方式中,有可能可以用低剂
量的活性剂以靶向的方式治疗或检测疾病,而不影响身体的未涉及的区域。
[0154] 本发明还考虑包含具有可内源性获得的靶向部分的BDM的杂交体,该可内源性获得的靶向部分可以促进成功地将活性剂递送至本领域已知的难以在体内和体外转染的细
胞类型(例如,干细胞和免疫细胞)。例如,包含来源于白细胞的BDM的杂交体可以表现出增
强的细胞吸收,而EDEM单独表现出减少的细胞吸收。
[0155] 本发明的杂交体可用于治疗、监测、预防和/或诊断许多疾病和病症(例如,
炎症,例如与癌症有关的炎症)。某些实施方式可以包括向受疾病或病症影响的部位递送相同或
可能不同的治疗剂。在某些实施方式中,本发明的递送系统可能对于肿瘤学方面的应用特
别有用,例如用于治疗、监测、预防和/或诊断癌性病症(例如,恶性肿瘤细胞)。在这样的实
施方式中,本发明的杂交体可用于将活性剂(例如,治疗和/或诊断剂)递送至受癌症(例如,
肿瘤)影响的部位。可以治疗、监测、预防和/或诊断的癌性病症的非限制性实例包括但不限
于:白血病、淋巴瘤、
皮肤癌(包括黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、上皮性头颈部癌、肺
癌(包括鳞状细胞癌或表皮样癌、小细胞癌、腺癌和大细胞癌)、
乳腺癌、胃肠道癌、甲状腺的
恶性肿瘤、骨和软组织肉瘤、卵巢癌、输卵管癌、子宫癌、
宫颈癌、
前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌和肝细胞癌。在一些实施方式中,本发明提供一种用于治疗患有以实体肿
瘤为特征的癌症的受试者的方法。在一些实施方式中,疾病选自由癌症和
帕金森病组成的
组。
[0156] 在另外的实施方式中,本发明的杂交体可用于将活性剂递送至
病毒感染的细胞。在这样的实施方式中,本发明的杂交体可用于治疗、监测、预防和/或诊断病毒感染。
[0157] 在一些实施方式中,本发明的杂交体可以用于靶向受试者的发炎部位。因此,在这样的实施方式中,本发明的杂交体可用于治疗、预防、监测和/或诊断与炎症有关的病症或
疾病。代表性的病症包括但不限于:过敏;哮喘;阿尔茨海默病;糖尿病;激素失衡(hormonal
imbalance);自身免疫疾病,例如,类风湿性关节炎和银屑病;骨关节炎;骨质疏松症;动脉
粥样硬化,包括
冠状动脉疾病;血管炎;慢性炎性病症,例如,
肥胖症;溃疡,例如马乔林溃
疡;由
石棉或烟雾引起的
呼吸道炎症;包皮炎症;由病毒(例如人
乳头状瘤病毒、乙型
肝炎病
毒或丙型肝炎病毒或Epstein-Bar病毒)引起的炎症;血吸虫病;盆腔炎病;卵巢上皮炎症;
巴雷特化生;幽
门螺杆菌(H.pylori)胃炎;慢性胰腺炎;中华肝吸虫侵扰;慢性胆囊炎和炎
症性肠病;炎症相关癌症,例如,前列腺癌、结肠癌、乳腺癌;胃肠道癌,例如胃癌,肝细胞癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、鼻咽癌、食道癌、胆管癌、胆囊癌和肛殖癌(anogenital
cancer);体壁癌(intergumentary cancer),例如,皮肤癌;呼吸道癌,例如支气管癌和间皮
瘤;泌尿生殖道癌,例如包茎、阴茎癌和膀胱癌;以及生殖系统癌,例如卵巢癌。本发明的杂
交体可与其他已知的疾病治疗方法结合或同时使用,其他已知的疾病治疗方法包括但不限
于化疗和放疗。
[0158] 在一种实施方式中,本发明提供了一种调节靶核苷酸或多肽的表达的方法。这些方法通常包括使细胞与本发明的与能够调节靶多核苷酸或多肽的表达的核酸有关的杂交
体接触。
[0159] 在相关实施方式中,本发明提供了一种治疗受试者的以超表达多肽为特征的疾病或失调的方法,包括给受试者提供本发明的杂交体,其中,治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡
核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒,并且其中所述siRNA、微RNA或反义
RNA包含特异性结合至编码多肽的多核苷酸的多核苷酸或其互补物。
[0160] 这些方法可以通过使本发明的杂交体与细胞接触一段足以使细胞内递送发生(例如,在核内)的时间来进行。典型的应用包括使用公知的方法来提供siRNA的细胞内递送,以
敲落特定的细胞靶或使其沉默。或者,应用包括递送编码治疗有用的多肽的DNA或mRNA序
列。以这种方式,通过提供缺陷基因产物或缺失基因产物(absent gene products)来为遗
传疾病提供疗法。
[0161] 本发明还考虑的是通过本文描述的杂交体向靶细胞同时递送一种或多种独特的包裹物质。因此,通过使具有独特的活性剂的两种独特的EDEM合并成单个杂交体,具体的实
施方式可用于治疗单一失调或缺陷,其中,每种这样的活性剂通过不同的作用机制起作用。
例如,本发明的杂交体可以将以下二者合并起来:包含被包裹的多核苷酸、意图使出故障的
内源性多核苷酸及其蛋白或酶产物失活或“敲掉”的EDEM,和包含被包裹的酶、意图提供酶
取代的第二EDEM。在某些实施方式中,含有诊断剂(例如,金纳米粒子)的EDEM可以与BDM在
杂交体中融合,治疗失调,并通过诊断
可视化技术定位受影响的细胞或器官。或者,本发明
的具体的实施方式通过使两种独特的BDM合并到相同的EDEM中可以促进同时递送例如两种
独特的内源性产生的多核苷酸(例如,miRNA)。
[0162] 本发明的一种实施方式适合治疗与靶细胞内的或由靶细胞分泌的蛋白和/酶的缺陷有关的疾病或失调。例如,疾病的症状可以通过提供本发明的组合物得到改善(例如,囊
性纤维化)。本发明对其有用的失调包括但不限于诸如以下的失调:庞帕病(Pompe
Disease)、高歇病(Gaucher Disease)、β地中海贫血、亨廷顿氏病、帕金森病、肌肉萎缩症
(例如,迪歇纳病(Duchenne)和贝克尔征(Becker))、血友病、SMN1相关脊髓性肌肉萎缩
(SMA)、肌肉萎缩侧索硬化症(ALS)、半乳糖血症、囊性纤维化(CF)、半乳糖脑苷酯酶缺乏
(galactocerebrosidase deficiencies)、弗里德赖希氏
共济失调、佩梅病和尼曼匹克病。
[0163] 另外,本发明为基于同时递送能够提呈抗原的BDM和含有佐剂的EDEM的高度免疫原性疫苗的开发提供了新的平台。佐剂与抗原提呈BDM的结合递送代表了用于通过利用这
两种组分的主要性质来引起固有免疫应答的治疗性疫苗的有前途的策略:(1)由EDEM提供
的强佐剂活性;以及(2)针对由BDM提呈且与靶疾病相关的抗原的特异性适应性免疫应答。
例如,BDM可提呈任何疾病相关抗原,例如一种或多种用于癌症疗法的肿瘤相关抗原、一种
或多种用于治疗感染的致病抗原或与其它疾病相关的任何其它抗原或抗原的组合,特别是
用于免疫受损病症和/或需要强的免疫增强的情况(例如,在年老的人中)的抗原或抗原的
组合。另外,本发明提供了杂交体组合物,其诱发对疫苗(例如,抗癌、肝炎、流感、疟疾和HIV
的那些疫苗)重要的强免疫应答。本发明还对其中抗原的组合提呈至患者的免疫系统可能
有利的任何疗法有用。
[0164] 在另外的实施方式中,可通过递送可包含疾病相关抗原的杂交体来引起免疫应答(美国公开号20120189700,其通过引用以其整体并入本文)。在一种实施方式中,EDEM可配
制为用在例如但不限于抗病原体或抗癌的疫苗中。
[0165] 在一种实施方式中,EDEM可配制为用作疫苗。在一种实施方式中,EDEM可包裹编码至少一种抗原的至少一种修饰的核酸分子和/或mRNA。作为非限制性实例,EDEM可包含至少
一种外源性抗原和用于疫苗剂型的赋形剂(参见国际公开号WO2011150264和美国公开号
US20110293723,它们均通过引用以其整体并入本文)。疫苗剂型可以通过本文描述的方法、
本领域已知的方法和/或国际公开号WO2011150258和美国公开号US20120027806中记载的
方法选择,国际公开号WO2011150258和美国公开号US20120027806均通过引用以其整体并
入本文。
[0166] 在一种实施方式中,EDEM可以包含至少一种佐剂。在另一种实施方式中,EDEM可以包含至少一种治疗剂和至少一种佐剂。作为非限制性实例,包含佐剂的EDEM可通过国际公
开号WO2011150240和美国公开号US20110293700(它们均通过引用以其整体并入本文)中记
载的方法配制。
[0167] 在一种实施方式中,EDEM可包裹至少一种外源性疾病相关抗原,该抗原编码来自病毒的肽、片段或区域。作为非限制性实例,EDEM可以包含但不限于国际公开号
WO2012024621、WO201202629、WO2012024632和美国公开号US20120064110、US20120058153
和US20120058154中记载的抗原,这些文献均通过引用以其整体并入本文。
[0168] 本发明的杂交体可用于将治疗剂在体外或体内递送至细胞或组织。所述方法和制剂可容易地
修改为用于递送用于治疗任何可接受这样的治疗的疾病或失调的任何治疗剂。
本发明的方法可在体外、离体或体内实施。例如,本发明的杂交体也可利用本领域技术人员
已知的方法用于将核酸在体内递送至细胞。在另外的方面,本发明提供了一种包含本发明
的杂交体和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。药学上可接受的稀释剂的实例包括用于
静脉内注射的溶液(例如,盐水或
葡萄糖)。组合物还可采取乳膏、
软膏、凝胶、悬液或乳液的
形式。
[0169] 对于体内
给药,本发明的包含杂交体的药物组合物优选通过非肠道(例如,关节内、静脉内、腹膜内、皮下、肌内)给药。在具体的实施方式中,药物组合物通过快速浓注
(bolus injection)经静脉内或腹膜内给药。其它给药途径包括局部(皮肤、眼部、黏膜)、口
服、肺部、鼻内、舌下、直肠和
阴道。此外,可以制备适合眼部给药的药物组合物。这样的制剂
可以例如为眼药水的形式,眼药水包括例如活性成分在水性或油性液体赋形剂中的0.1/
1.0%(重量/重量)溶液和/或悬液。这样的眼药水可以进一步包含缓冲剂、盐和/或一种或
多种任何本文描述的另外的成分。
[0170] 在另外的方面,本发明提供根据以上所述的用于递送诊断剂的药物组合物。
[0171] 除了递送用于治疗的活性剂外,本发明的杂交体可以提供用于检测受到疾病或病症影响的组织和细胞以及检测治疗后的进展或复发的手段。当前非侵入性成像法依赖使用
利用肿瘤内增强的代谢和氨基酸代谢的造影剂,但是这些造影剂受到
背景噪音和非特异性
吸收的限制。因此,本发明提供根据以上所述的直接向靶部位(如肿瘤部位和/或炎症部位)
递送诊断剂以使得能够诊断成像以及其能够精确定位的药物组合物。
[0172] 在另外的方面,本发明提供一种用于制备杂交生物相容载体(杂交体)的方法,所述杂交体包含源自至少一种生物相容递送组件(BDM)和包含至少一个可调的促融部分的至
少一种改造的药物包裹组件(EDEM)的结构性和生物活性元件,所述方法包括:
[0173] (a)提供包含至少一个促融部分的至少一种EDEM或包含所述至少一种EDEM的组合物;
[0174] (b)提供至少一种BDM或包含所述至少一种BDM的组合物;
[0175] (c)使所述至少一种EDEM与所述至少一种BDM在低于7.4的pH和0℃~60℃的温度下接触,从而使所述至少一种EDEM与所述至少一种BDM结合起来,产生所述杂交体;以及,任
选地,
[0176] (d)使所述杂交体纯化不含未融合的EDEM和/或BDM。
[0177] 本发明的方法具有数个重要的特性,使得其对本领域具有重大实用性。本发明提供一种通过使一种或多种EDEM与一种或多种BDM结合起来制备显示原始EDEM和BDM组分的
特性的杂交组分来产生杂交体的方法。使EDEM与BDM结合起来涉及促融性通过改变反应环
境可调的两种组分中的任一种中存在的至少一种促融物质。在某些实施方式中,EDEM(例
如,iLNP)选择性地表现出与BDM结合增强的能力(例如,静电相互作用)。在某些实施方式
中,BDM(例如,外来体)选择性地表现出与BDM结合增强的能力(例如,较高的膜流动性)。因
此,本文提供的是用于通过限定反应环境来产生杂交体的方法。这样的方法通常包括使本
文使用的BDM与EDEM(例如,iLNP)接触的步骤,以使该接触造成简单的聚集和/或通过半融
合和/或融合进行脂质混合时的膜破坏,导致EDEM与BDM群体的一些部分合并成杂交体的亚
群(sub-population)。由此考虑的方法由于诱导、控制、限制和/或终止相应的结合机制的
手段而具有巨大的优势。此外,本发明的方法使组件实体被取代或重排来制作治疗相关的
结构。
[0178] 在一种实施方式中,包含具有限定的形态和物理特性的预先形成的小泡的水性EDEM混合物(其中,一种或多种脂质具有或呈现出促融特性)通过一个入口被加入到单个室
中,而收集的BDM的水性混合物被加入到第二入口。然后,使这些组分在公共室中接触。在一
种实施方式中,所述接触通过借助扩散进行的原始组合物的混合得到增强。在优选的实施
方式中,通过机械手段(例如,摇晃)进行混合。或者,BDM与EDEM的结合可通过受控的流体动
力学促进,例如在微流体混合设备中。在这样的实施方式中,EDEM与BDM被注射到微流体室
的不同的入口中,并通过室的几何形状和流动曲线(flow profile)发生受控的混合。
[0179] 本发明涉及用于生产杂交体的方法,其中,所述方法提供对EDEM和BDM的促融性质的控制。对于生产本发明的杂交体,包含其中EDEM和/或BDM的组分呈现出增强的促融属性
的反应环境是优选的实施方式。在一种实施方式中,酸性反应环境增加EDEM的净阳离子表
面电荷,并且可同时具有呈现出增强的净阴离子表面电荷的BDM。在优选的实施方式中,结
合发生在pH为约4至约6的酸性缓冲液中。不受任何理论的限制,在另一种实施方式中,可调
节反应温度,以造成EDEM中脂质从双层到六角相的相转变,而同时降低BDM中的膜硬度。由
于BDM组成部分(例如,蛋白)的潜在降解,反应温度被限制在约60℃。在优选的实施方式中,
反应温度被设置为37℃。在一种实施方式中,反应环境显示出生理离子强度。本发明考虑但
不限于使用NaCl或KCl的混合物。在另外的实施方式中,反应溶液可以存在钙离子。
[0180] 本发明因此提供一种用于生产杂交体的方法,其中通过在反应环境中共孵育一段时间来促进EDEM与BDM结合,该时间包括但不限于5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、5小
时或更长。在一种优选的实施方式中,共孵育发生约1小时。
[0181] 在该方法的具体的变型中,改变混合环境来限制组件的结合。一般而言,EDEM与BDM结合受到许多参数的限制,这些参数可以包括粒子浓度净表面电荷、电荷密度、pH、离子
强度、添加剂浓度和温度。用于改变混合环境的方法在本领域中是公知的。例如,但不限于,
可使用加入具有更高缓冲能力的溶液或透析组件混合物来改变反应溶液的性质。在一种优
选的实施方式中,脱盐柱可用于改变溶质性质。
[0182] 本发明还涉及一种用于产生杂交体的方法,其中,所述方法可任选地包括使这些杂交体纯化不含过量的各个组件。对于生产本发明的杂交体,包含纯化步骤是优选的实施
方式。在需要纯化杂交体的情况下,纯化可通过蔗糖密度梯度或其它适合形成密度梯度的
介质进行的离心来实现。然而,理解的是,也可以使用其它纯化方法,例如色谱法、过滤、相
分配、沉淀或吸收。纯化方法包括例如通过蔗糖密度梯度进行的离心纯化或通过尺寸排阻
柱进行的纯化。蔗糖梯度可为约0%的蔗糖至约60%的蔗糖,优选为约5%的蔗糖至约30%
的蔗糖。制备蔗糖梯度的缓冲液可以为任何适合存储含复合物的部分的水性缓冲液,优选
适合将杂交体给予到细胞或组织的缓冲液。备选的分离技术可以包括但不限于等电聚焦
和/或免疫亲和色谱法。例如,包含可电离的脂质的EDEM显示出净阳离子表面电荷,并且可
通过
电泳分离。在本发明的一种实施方式中,杂交体的纯化可通过顺序的纯化技术来实现。
例如,与对BDM表面分子的亲和性有关的第一免疫亲和色谱法,接着进行与PEG分子的亲和
性有关的第二免疫亲和色谱法可以顺序地将杂交体与过量的BDM和EDEM分离开。另外的分
离技术可以包括与多角度光散射(multi angle light scattering)连接的非对称流场流
分级,以分级反应物和产物小泡。
[0183] 本发明的方法中使用的EDEM促进或提高包裹物质(例如,活性剂)的包裹和释放到一种或多种靶BDM(例如,通过渗透或与BDM的脂质膜融合)中。在某些实施方式中,本文描述
的EDEM与BDM的结构特性证明了高融合效率。术语“融合效率”是指由进行融合的EDEM与BDM
产生的杂交体的相对量。在某些实施方式中,本文描述的EDEM与BDM的结构特性证明了高融
合效率,从而提高了适量的包裹物质(例如,活性剂)与内源性生物物质在杂交体中结合,接
着使与化合物或它们包裹的内容物有关的潜在全身性不良作用或毒性最小化的可能性。
[0184] 在某些实施方式中,EDEM制剂具有可调的属性,以使得产生其中这样的组件是组分的杂交体(例如,膜相容性)。例如,向本文公开的EDEM中掺入可电离的脂质、辅助脂质、
PEG修饰的脂质、pH响应型聚合物和/或pH活化型细胞渗透肽可以控制这样的组件(或其中
这样的组件为组分的杂交体的组件)与一种或多种靶BDM的脂质膜的融合性,从而提高例如
对EDEM-BDM结合的控制。不受特定理论的限制,iLNP脂质彼此的相对摩尔比以所选脂质的
特性、靶BDM的性质、被包裹的物质的特性和预期递送靶(例如,细胞、组织或器官)的那些性
质为
基础。另外的考虑包括例如所选脂质的烷基链的毒性、尺寸、电荷、pKa、促融性及饱和
度。
[0185] 在某些实施方式中,本文使用的EDEM组合物的可电离的脂质成分表征为具有一种或多种使得这样的组件相对于其它分类亚单位有优势的性质。例如,在某些实施方式中,本
文使用的EDEM允许控制和调整(tailor)结合性质(例如,表面电荷)。特别地,本文公开的化
合物可通过限定的和可调的阳离子性质以及它们能够与潜在带相反电荷的BDM结合的能力
来表征。这样的能力可包括例如受控的离子对形成、促融能力和/或促进包裹物质(例如,活
性剂)释放到产生的组合物中。
[0186] 在某些实施方式中,EDEM制剂具有可调的属性,以赋予EDEM与BDM之间的膜相容性。例如,调整辅助脂质掺入到本文公开的EDEM中可以使这样的组件的膜硬度相容,以促进
与一种或多种靶BDM的脂质膜结合。具体地,可以使脂质与甾醇(例如胆甾醇)的相对摩尔比
相匹配,以与靶BDM的特性类似。另外的考虑包括例如其中这样的组件为组分的杂交体的得
到的硬度,以确保与靶细胞或组织相互作用。
[0187] 在本发明的一种实施方式中,BDM具有可调的属性,以赋予EDEM与BDM之间的膜相容性。例如,高含量的BDM膜组分(例如但不限于鞘磷脂、掺入磷脂中的
饱和脂肪酸和胆甾
醇)可以引起硬度比得到它的供体细胞的硬度高。同时,由于BDM膜组分可能与得到该BDM的
细胞的质膜的膜组分不同,导致硬度更高,因此BDM在生产过程中可表现出增强的稳定性。
然而,在酸性pH环境(例如,约pH 5)中,预计本发明的BDM膜显示出较低的硬度(以及较高的
促融性),并且可允许与EDEM的膜结合。
[0188] 在某些实施方式中,向使用的EDEM中掺入可电离的脂质(例如,具有一个或多个烷氨基基团或部分)(例如,头基)可通过利用它们的促融性来进一步促进BDM膜破裂。这可能
不仅基于优化的pKa以及由此导致的脂质的pH依赖性阳离子性质,而且还基于优化的相转
变温度,促进从双层相转变为高度融合的反转六角HII相(Semple等人,2010)。认为该结果促
进阳离子状态的可电离的脂质与阴离子脂质之间的离子对的形成,由此破坏BDM膜结构,从
而将内容物转移到杂交体中。
[0189] 本文使用的EDEM可用于产生促进或提高包裹物质(例如,活性剂)包裹和释放到一种或多种靶BDM(例如,通过渗透BDM的脂质膜或与BDM的脂质膜融合)中。例如,当脂质基组
合物(例如,iLNP)包含或以其它方式加入一种或多种可电离的脂质时,一种或多种BDM的脂
双层中的相转变可促进包裹物质(例如,包裹在液体纳米粒子中的活性剂)递送至一种或多
种杂交体中。
[0190] 在本发明的某些实施方式中,控制EDEM中可电离的脂质的总量可以用于控制本文公开的杂交体的结构特性。因此,在本发明的某些实施方式中,EDEM的物理特性与可电离的
脂质含量成比例。例如,直径小的EDEM与直径大的EDEM相比,整体可电离的脂质含量更低。
因此,本文公开的EDEM中的一种或多种可以与相同的BDM结合,直到实现中性净表面电荷以
及如此受限的尺寸。
[0191] 在本发明的一种实施方式中,EDEM可以制备成包裹酶和生物活性催化化合物,所述酶和生物活性催化化合物在整合到杂交体中时能够与源自BDM的一种或多种化合物相互
作用。例如,EDEM可以制成含有能够降解通过BDM转移到杂交体中的任何内源性多核苷酸的
核糖核酸酶。
[0192] 通过举例说明的方式给出进一步描述本发明的以下实施例,这些实施例并不意图以任何方式限制本发明。
[0193] 实施例1
[0194] iLNP作为改造的和药物包裹组件的生产
[0195] 实施例1-4的材料和方法
[0196] A)化学品
[0197] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](胺-PEG-DSPE)、[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并 二唑-4-基)]
(NBD-PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]
(mal-PEG-DSPE)、二硬脂酰基-磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷(DODAP)、
N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000](PEG-Cer)和胆甾醇购自Avanti
Polar Lipids(Alabaster、AL)。1,2-二亚油基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLinDMA)和PEG-脂质
的合成以前已有记载(Heyes、Palmer、Bremner、&MacLachlan、2005)。
[0198] B)基于挤出的iLNP的制剂
[0199] 预先形成的小泡的制备:根据所需的小泡的性质,将可电离的阳离子脂质(DLinDMA或DODAP)、DSPC、胆甾醇和PEG-脂质(PEG-s-DMG或PEG-Cer)以适当的摩尔比(例
如,40:17.5:40:2.5)溶解于乙醇中。为了形成小泡,在涡旋下将脂质制剂混入低pH的含水
缓冲液(50nM的乙酸乙酯,pH为4)中,直到达到最终浓度为大约10nM和乙醇与含水缓冲液的
比为3:7。然后,在室温下,利用微型
挤出机(Avanti)将产生的多层小泡挤出穿过孔径为
80nm或100nm的两个层叠的NucleporeTM聚碳酸酯
过滤器(Whatman)。
[0200] 预先形成的小泡寡核苷酸的包裹:使用以前记载的预先形成的小泡的方法实现寡核苷酸包裹(Maurer等人,2001)。一般而言,将寡核苷酸溶解于与挤出的小泡的水溶液
(50mM乙酸酯,pH为4,30%的乙醇)匹配的水溶液中,随后在涡旋混合下逐滴加入到单层小
泡中。分别在质粒与脂质(重量/重量)比为1:30和RNA与脂质(重量/重量)比为1:16下,进行
质粒、siRNA和shRNA的包裹。然后,将混合物在37℃下孵育30分钟,接着在4℃下用PBS(pH为
7.4)交换彻底透析除去残留的乙醇和缓冲剂交换物。通过与PBS(pH为7.4)平衡的阴离子交
换旋转柱(Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc.)除去未被包裹的shRNA和质粒。用酸
性异丙醇(10%HCl)以1:5的体积比溶解装载的小泡后,通过260nm处的吸收(Spectramax
M5e,分子装置)来确定寡核苷酸的包裹效率。
[0201] 蛋白包裹iLNP:与上述方案相比,通过预先将蛋白溶解于含水缓冲液(50mM乙酸钠,pH为5.5)中以分别达到最终浓度为1.5mg/ml和1mg/ml,接着在涡旋混合下逐滴加入脂
质混合物(DlinDMA:DSPC:Chol:PEG-Cer摩尔比为40:17.5:40:2.5)的乙醇溶液(最终EtOH
含量为20%)来制备包裹牛血清
白蛋白(BSA,Sigma Aldrich)的iLNP和包裹人血红蛋白
(Sigma Aldrich)的iLNP。将该溶液在37℃下孵育1小时。将包裹BSA的脂质小泡按如上所述
挤出。通过用PBS(pH为7.4,4℃)交换的彻底透析((300kDA MWCO,仕必纯(Spectrumlabs))
实现除去游离蛋白、残留乙醇和缓冲剂交换物。在用10%的Triton X-100(Sigma Aldrich)
溶解iLNP后,通过BCATM蛋白测定
试剂盒(Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc.)确定
蛋白包裹效率。在蛋白定量期间通过抑制(withhold)洗涤剂来监测游离蛋白的彻底除去。
[0202] 包裹小分子的iLNP:类似于上述方案,通过预先将小分子溶解于含水缓冲液(25mM乙酸钠,pH为5.5)中以达到最终浓度为1mM,接着在涡旋混合下逐滴加入脂质混合物
(DODAP:DSPC:Chol:PEG-Cer摩尔比为40:17.5:40:2.5)的乙醇溶液(最终EtOH含量为20%)
来制备包裹羧基荧光素的iLNP。将该溶液在37℃下孵育1小时,接着按如上所述挤出。通过
用PBS(pH为7.4,4℃)交换的彻底透析((300kDA MWCO,仕必纯)实现除去小分子、残留乙醇
和缓冲剂交换物。
[0203] 包裹Au纳米粒子的iLNP:由于Au纳米粒子在阴离子缓冲液中不稳定,通过以金与脂质重量比为1:20将Au纳米粒子保持在去离子水溶液中实现对20nm Au纳米粒子(Nanocs
Inc.)的包裹。如上所述的,加入乙醇的脂质混合物,挤出溶液,并通过透析将缓冲剂交换为
PBS。在PBS中,游离的Au纳米粒子聚集并沉淀。通过Au-iLNP在525nm左右的等离子共振
波长下的紫外-可见光吸收度以及透射电子显微镜(TEM)监测被包裹的金纳米粒子的存在。按以
前的记载,与空小泡相比在450nm处的紫外-可见光吸收的增加用于确定金浓度(Haiss,
Thanh,Aveyard,&Fernig,2007)。如图1中所示,原料金纳米粒子和Au-iLNP二者的紫外-可
见光吸收光谱都表示特征
表面等离子共振峰在约550nm处。具体地,根据与空iLNP和DNA-
iLNP相比在450nm处吸收读数的相对增加确定Au-iLNP的包裹效率为30%,Au-DNA-iLNP的
包裹效率为26%。图2中示出的电子显微照片支持了被包裹的金纳米粒子的存在。
[0204] C)iLNP的微流体基制剂
[0205] 通过利用快速混合微流体系统进行的装载siRNA的脂质纳米粒子的制备:根据制造商的使用说明在NanoassemblrTM微流体系统(Precision NanoSystems)上制备脂质纳米
粒子。根据希望的制剂,制备类似于预先形成小泡途径的由DLinDMA、胆甾醇、DSPC和PEG-
lipid以适当的摩尔比(例如40:40:18:2)组成的总脂质浓度为10mM的乙醇溶液。此外,在pH
为4.0的25nM乙酸酯缓冲液中制备siRNA与脂质重量比(重量/重量)为1:16的siRNA水溶液。
根据生产的总体积,使用1ml和3ml的
注射器产生总流速为12ml/min的入口流。对于每种制
剂,将siRNA水溶液与乙醇-脂质溶液在室温下以3:1(Aq:Et)的流速比混合。然后,将产物通
过用PBS交换透析,除去残留乙醇以及将pH升至7.4,并按照上述预先形成的小泡的方法除
去游离的siRNA。
[0206] 实施例2
[0207] 细胞外小泡(EV)分离作为生物相容递送组件
[0208] 外来体:通过由Thery等(Théry,Amigorena,Raposo,&Clayton,2006)以前记载的差速离心将外来体与套细胞淋巴瘤(MCL-exo)和成胶质细胞瘤细胞系(GBM-exo)的上清液
分离。然后使用BCATM蛋白测定试剂盒(Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc.)测量外来
体的蛋白含量,并将外来体等分试样储存于-80℃下。至于额外的纯化,将外来体沉淀溶解
于PBS中,使用标准方案使其在蔗糖垫(sucrose cushion)的顶部成层。
[0209] 微泡:从人样本中分离出人血小板来源的和激活的多形核嗜中性粒细胞来源的微泡(PLT-MV和PMN-MV)样品。简而言之,按以前所述(Sadallah,Eken,Martin,&Schifferli,
2011)通过差速离心来源于健康供体输血的血小板浓缩物分离出PLT-MV。PMN-MV按最近公
开的方式纯化(Eken,Sadallah,Martin,Treves,&Schifferli,2013);从健康的血液供体的
新鲜的暗黄
覆盖层中分离出PMN。将它们用甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸活化,并通过差速
离心分离脱落的(shed)微泡。
[0210] 实施例3
[0211] 通过将加入聚乙二醇的脂质与Fab’片段、抗体片段、肽和糖胺聚糖偶联对iLNP进行表面修饰
[0212] 通过将还原的抗体、Fab’片段、融合肽和糖胺聚糖缀合到锚固到iLNP的膜上的加入聚乙二醇的脂质上来证明iLNP的改造相容性。与实施例1的制剂相比,0.5mol%的加入聚
乙二醇的脂质替代在PEG的远端有马来酰亚胺基团或胺基的PEG修饰的脂质。缀合根据基于
以下之间的反应的标准方案进行:(1)在远端PEG末端的马来酰亚胺基团与还原的抗体、
Fab’片段或末端巯基化的肽的游离的巯基之间的反应;(2)远端PEG末端的胺基与糖胺聚糖
(GAG)的糖胺聚糖链上的活化的羧基基团之间的反应。
[0213] 方法:
[0214] Fab’片段:首先,用2-硫基乙胺利用供应商的使用说明提到的最终浓度的五分之一还原抗-CD38F(ab)2片段。将60μg F(ab)2在37℃下用10mM MEA在反应缓冲液(1mM EDTA,
PBS)中孵育90分钟。使用ZebaTM旋转脱盐柱(Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc.)通
过与反应缓冲液进行缓冲剂交换除去MEA。立即加入装载有siRNA的iLNP(mal:Fab’比为2:
1),并在4℃下在摇晃板上孵育过夜。在用PBS(pH为7.4)平衡的琼脂糖CL-4
B柱上分离未结
合的抗体/片段。含有Fab’片段的部分由280nm处的吸收读数确定,将该部分合并到一起,并
在10kDa离心过滤器( Ultra-0.5,Merck Millipore)中浓缩。在非还原条件下使
用10%的丙烯酰胺进行凝胶电泳(SDS-PAGE),以证实在F(ab)2到Fab’的还原过程之后Fab’
片段的完整性。
[0215] IgG抗体:用二硫苏糖醇(DTT)(Sigma)还原IgG抗体。在偶联反应之前,将抗体用TM
25mM DTT在PBS中在4℃下还原1小时。通过使用用PBS(pH为7.4)平衡的40kDa的Zeba 旋转
脱盐柱(Pierce-Thermo Fisher Scientific Inc.)将还原的Ab与过量的DTT分离。在PBS
(pH为7.4)中在4℃下进行缀合(mal:抗体的比为1:4)过夜。在琼脂糖CL-2柱上除去未结合
的抗体。如针对Fab’片段所进行的描述,由280nm处的吸收读数确定抗体缀合。
[0216] 肽:将具有N-末端半胱氨酸的26-氨基酸蜂毒肽类似物肽通过与巯基化的肽(thiolated peptide)以肽与马来酰亚胺为1:1的摩尔比混合缀合到pDNA-iLNP上,并在室
温下孵育过夜。
[0217] 糖胺聚糖:通过常规EDC-磺基NHS偶联反应使糖胺聚糖(5k MW)缀合到远端PEG末端的胺基上。首先,通过DIW中的EDC/NHS(EDC:COOH比为1:1,EDC/NHS比为1:1)将糖胺聚糖
活化1小时,接着加入在PBS(pH为8.2)中的iLNP(糖胺聚糖:胺比为5:1)。反应继续2小时后,
在室温下通过用PBS(pH为7.4)交换的透析(截留分子量:10kDa),以除去未结合的糖胺聚
糖。
[0218] 通过
流体力学直径的DLS测量结果来进一步确定成功缀合。如表1中所见,在IgG、融合肽、Fab’片段和糖胺聚糖的偶联后,由DLS测得的流体力学直径(Dh)、iLNP的平均直径
增加了。
[0219] 实施例4
[0220] 对体内分泌的iLNP和Ev的表征
[0221] 如实施例1、2和3中所述制备iLNP和分离EV后,使用标准的方案利用DLS(Zetasizer NS,Malvern)和NTA(LM20,Nanosight)记录iLNP和EV的尺寸分布。如表1中所
示,平均尺寸随货物的包裹或iLNP的表面修饰而增加。由于合成条件受控,可以产生具有小
的多分散指数(PDI)的iLNP,这也反应在了尖锐的单模态(mono-modal)NTA尺寸分布中。作
为分泌的小泡,外来体具有遗传的多分散性。如图3中所示,NTA分析的单种粒子方法揭示出
了空iLNP和不同尺寸的GBM-exo的亚群的单模态尺寸分布。
[0222]
[0223] 表1:iLNP和外来体的尺寸确定以及货物包裹效率
[0224] 实施例5
[0225] BDM与EDEM的相互作用的受控引发
[0226] 研究了iLNP与外来体之间的相互作用是否可以通过改变环境的pH来诱导。如图4中所示,iLNP/外来体溶液的平均直径在融合(10mM MES,pH 5.5,145mM NaCl,5mM KCl)缓
冲液中增加,而在pH为7.4时明显没有显著变化。由于DLS测量的整体性质使得难以
正面推
断出两个亚单位之间存在相互作用,因此接下来焦点转向外来体与iLNP二者的脂质膜之间
的相互作用。
[0227] 除了尺寸变化,两种膜之间的脂质混合给出了另外确定融合事件的方法。在融合过程中,来自两种膜的脂质分散在新形成的膜中。通过由亲油性自猝灭罗丹明染料(R18)的
稀释产生的荧光的增加来监测脂质混合。用1μl十八烷基罗丹明B氯化物(R18)(Biotium)
(1mM)在MES缓冲液(10mM MES,pH 5.5,145mM NaCl,5mM KCl)中的乙醇溶液标记外来体(20
μg蛋白)。将该溶液在室温下孵育30分钟。通过使用用MES融合缓冲液(10mM MES,pH 5.5,
145mM NaCl,5mM KCl)平衡的 脱盐柱(截留分子量为40kDa)除去未掺入的R18。
将R18-标记的外来体(5μg总蛋白)悬于搅拌的
石英比色皿中的适当的缓冲液中,通过LS55
荧光分光光度计(Perkin Elmer)测量560nm激发波长和590nm发射波长处样品的荧光。平衡
3分钟后,向外来体中加入未标记的iLNP(30μg总脂质),并监测荧光另外30分钟。通过加入
用于破坏膜的Triton X-100得到最大R18稀释。将脂质混合的程度作为与单独外来体的平
衡荧光的差测量,并表示为洗涤剂破坏后最大荧光去猝灭的%。与外来体类似,微泡样品
(0.25μg PLT-MV和1.2μg PMN-MV总蛋白)用R18的乙醇溶液标记,接着去除游离染料,并如
上所述监测荧光的增加。
[0228] 在未标记的iLNP与R18标记的外来体之间融合时,掺入外来体的膜中的罗丹明分散到未标记的脂质体膜蛋白中,导致近四分之一的自猝灭减少,随后荧光与膜融合程度成
比例增加。如图5中所示,荧光的快速增加发生在pH为5.5时,荧光连续较慢的增加发生在pH
为6.6时,而脂质混合在pH为7.6时受到阻碍。为了证实iLNP的阳离子性质是脂质混合背后
的驱动力,而不是pH的变化,图6表明加入0%的DLinDMA脂质体(DSPC/Chol/PEG)没有导致
去猝灭。为了排除对可电离的脂质DLinDMA特异的促融性质潜在地为脂质混合背后的驱动
力,制备了其中用可电离的脂质DODAP替代DLinDMA的iLNP。在向R18标记的外来体中加入这
些DODAP-iLNP时观察到了脂质混合(图7)。另外,在将iLNP的PEG-脂质含量从2.5mol%增大
至10mol%(图8)和改变温度(图9)时进行了类似试验。
[0229] 实施例6
[0230] 在单一粒子上探测的BDM与EDEM的相互作用
[0231] 接下来,研究专注于外来体与iLNP在单一粒子水平下的相互作用。包含外来体蛋白和脂质体膜的混合物的粒子的临时出现在荧光交叉-相关色谱法(fluorescence cross-
correlation spectroscopy,FCC)装置中定量。在准备FCCS测量时,用亲油性BodipyTM(630/
650)标记iLNP膜,同时通过与BodipyTMNHS酯(493/502)缀合来标记外来体表面蛋白。然后,
将外来体与iLNP二者在融合缓冲液中以可比较的粒子数目混合,并记录两个通道
(channel)中相关强度
波动的出现。两个监测器上的
同步信号表示聚集的或融合的外来体
和iLNP,同时各个粒子产生临时独立的信号。在图10中,在外来体-BodipyTM(493)与iLNP-
BodipyTM(630)混合时随时间表现出了交叉相关度(θ)的增加。在刚混合两种粒子后未观察
到绿色通道与红色通道之间的相关性。在8分钟的时间内,各个粒子的交叉相关度从0%增
加到了大约70%,意味着探测的粒子的总荧光猝发(burst)的近70%显示了外来体表面蛋
白和脂质体膜。
[0232] 使用两种亲水性染料(488和633)的对照混合物确定了检测的最小交叉相关度。作为阳性对照,双标记的互补DNA链(488/633)IBA标准(IBA GmbH)用于得到可实现的最大交
叉相关度。
[0233] 实施例7
[0234] 促融EDEM和BDM融合形成杂交体
[0235] 为了排除简单聚集、结构破裂或由于脂质交换造成的
假阳性融合测定的可能性,通过DLS和NTA在不同的时间点记录pH为5.5的缓冲液中较少货物的iLNP/外来体混合物的
平均尺寸和尺寸分布。使用相同的试验条件监测z-均平均尺寸10小时。如图11中所示,在混
合的第一小时,平均粒径快速增大,并在接下来的9个小时内保持基本不受影响。在聚集的
情况下,带相反电荷的小泡具有连续聚集成静电结构形式的能力,然而不是这种情况。另外
排除聚集的指示物是直径增加的程度。两种融合球的体积以V∝r3的方式与半径成比例,由
此85nm与130nm球的融合将会产生141nm的粒子。另一方面,在聚集的情况下,半径与每个加
入聚集体的另外的球成线性比例关系。这将使多个亚单位的直径范围中大直径增加的证
明。这进一步得到如图12中所示的支持,siRNA-iLNP与MCL-exos的混合物在融合缓冲液(室
温下储存)中在9天的时间内没有表现出平均直径的显著增加。
[0236] 为了排除由DLS揭示的平均尺寸或高斯尺寸分布的变化不是平均化亚群的人为现象,评价了基于各个粒子的NTA测量的外来体、iLNP和融合产物的尺寸分布。在分析前,将
iLNP与外来体用融合缓冲液稀释(对于iLNP,稀释20000倍;而对于外来体,0.01mg外来体蛋
白/ml)。对于融合反应,将外来体与iLNP按1:1的比孵育,并每2分钟记录从反应混合物中取
出的样品。每次测量,记录1800
帧的动画。使用具有自动模糊设置、最小轨道长度和最小预
期粒径的NTA分析
软件套件版本3.0分析数据。
[0237] 监测融合反应中随时间的尺寸分布(图13)表明,在混合3分钟后,50-90nm的iLNP群体大大减少,而90-125nm的亚群增加。在18分钟的时间内,尺寸分布示出了144.2nm的粒
子峰,可以推断出,通过在BMD的存在下增加EDEM的促融性产生了显示出不同尺寸分布的粒
子。外来体、iLNP和新形成的粒子的这些独特的尺寸分布描绘在了图14中。新形成的小泡的
群体被称为“杂交体”。
[0238] 图14中充分限定的尺寸分布或图11和图12中所见的产生的小泡的直径延长的稳定性是融合后衰减的净表面电荷的指示。结果,连续融合受到阻碍,且系统显示出一个自发
反馈回路。
[0239] 实施例8
[0240] 杂交体介导的基因转移导致GFP表达
[0241] 为了证实杂交体介导的遗传货物的递送的功能,由GBM细胞系外来体和包裹GFP质粒的iLNP制备杂交体。通过流式细胞术和共聚焦显微镜法分析用测试制剂转染的GBM细胞
中的报道基因GFP的表达。细胞(在前一天接种的50000个细胞)用iLNP(500ng GFP-pDNA/
孔)转染并装载杂交体(5μg总蛋白/孔)。在转染前通过使外来体与pDNA-iLNP在融合缓冲液
中混合30分钟制备杂交体。为了排除转染是由于外来体诱导的胞吞造成iLNP的偶然内化的
结果,还将细胞用未融合的iLNP(500ng GFP-pDNA/孔)和外来体(5μg总蛋白/孔)同时转染。
在转染0.5小时、1小时、2小时或24小时后,用PBS清洗细胞两次,加入新鲜的培养基,并培养
细胞72小时。表达GFP的细胞的量用流式细胞术分析(参见图15)。杂交体表现出与pDNA-
iLNP或用外来体共转染的未融合的pDNA-iLNP相比更高的转染速率。
[0242] 实施例9
[0243] 杂交体的纯化
[0244] 为了排除转染试验中未融合的iLNP的干扰,通过连续蔗糖密度梯度离心将它们与杂交体分开。为了确定pDNA-iLNP的密度,以0-55%的连续蔗糖(重量/体积)梯度(190000g,
14小时)离心,并进行柱
分馏。蔗糖馏分的密度通过折射计确定,粒子的存在通过DLS中的光
子计数分析。数据揭示出pDNA-iLNP的最大密度为1.05g/ml(参见图16)。
[0245] pDNA-iLNP/外来体融合混合物(蛋白与质粒的重量比为1:0.1)在相应蔗糖梯度上的离心在梯度的顶部产生了包含未融合的iLNP的明显乳白色带。合并对应密度为1.06-
1.08、1.09-1.18和1.19-1.25g/ml的粒子的蔗糖馏分,并通过用PBS交换透析除去蔗糖。
[0246] 通过与细胞(72h,50’000个细胞/孔)一起孵育和通过流式细胞术分析表达GFP的细胞的数量来监测这些馏分转染GFP的能力。如图17和16中所示,所有馏分都产生了GFP表
达。
[0247] 将pDNA-杂交体(低于1.05g/ml的粒子)合并,通过透析除去蔗糖,并在独立的转染研究中再次测试它们。用pDNA-杂交体(基于合并的馏分的BCA测定的2.5μg蛋白/孔)转染细
胞(50000个细胞)0.5小时、1小时、2小时或24小时。在
指定的转染时间后,用PBS清洗细胞2
次,并加入新鲜的培养基。通过流式细胞术分析培养72小时后的表达GFP的细胞的量(参见
图18)。
[0248] 实施例10
[0249] 杂交体上的外源性靶向部分
[0250] 使用如上所示的IgG表面修饰的iLNP来制备在表面上具有IgG片段的杂交体。类似于实施例9中加入装载有质粒的杂交体,将栓有IgG的iLNP与GBM来源的外来体在融合缓冲
液中混合30分钟(脂质与外来体蛋白的重量比为6:1),并以蔗糖梯度分离未融合的iLNP。密
度为1.12-1.14g/ml(Rf=0.62,相比之下,装载有质粒的杂交体的Rf=0.36)的微粒层可见。
将低于1.08g/ml的馏分合并,并通过用PBS交换透析除去残留的蔗糖。在非还原条件下使用
10%的丙烯酰胺进行凝胶电泳(SDS-PAGE),以证实IgG与外来体蛋白二者都存在。
[0251] 用蔗糖梯度纯化的IgG-杂交体(如通过BCA测定所确定的1.4μg蛋白含量/孔)转染GBM细胞系(在前一天接种的50000个细胞/孔)。孵育24小时后,清洗细胞,如图19所示,流式
细胞术确定大概80%的细胞对于第二抗IgG标记的抗体为阳性。
[0252] 实施例11
[0253] 用于通用杂交体的不同EDEM
[0254] 通过两种类型的融合测定确定通过改变EDEM货物或表面修饰来产生不同杂交体的能力。
[0255] R18测定如实施例5中所概述的进行。简而言之,通过在融合缓冲液中混合实施例1中示出的不同iLNP物质与R18标记的GBM细胞系来源的外来体来确定融合。与包裹寡核苷
酸、蛋白和金纳米粒子(单独金纳米粒子或与pDNA同时被包裹的金纳米粒子)的iLNP的融合
在图20至图22中示出。外来体和具有肽和IgG表面修饰的iLNP之间的融合在图23中示出。
[0256] 使用芘测定确定MCL-外来体与装载有siRNA的iLNP的融合。这些siRNA-iLNP通过挤出或通过快速混合微流体芯片(如实施例1中所概述的)制备。
[0257] 该测定是以标记膜与未标记的膜融合时芘激发物的稀释造成的单体荧光(大约400nm)的增加为基础。用1μl的2.5mM 1-芘十二烷酸的乙醇溶液(Life Technologies)在37
℃下标记100μl的PBS中的外来体(35μg总蛋白)30分钟。通过以100000g进行60分钟的超离
心来进行双重沉淀(two-fold pelleting)和用MES缓冲液清洗(0.2M MES,150mM NaCl,pH
5.5)来除去过量的1-芘十二烷酸。在除去游离的芘后,将标记的外来体(10μg总蛋白/孔)悬
于96孔板中的MES缓冲液(0.2M MES 150mM NaCl,pH 5.5)中。在37℃用Synergy HT酶标仪
(Biotek)记录加入未标记的iLNP(5μg总脂质)时单体荧光的增加。如图24中所示,在外来体
与通过挤出(ext)和微流体芯片(mf)产生的iLNP混合后出现了单体信号的增加。
[0258] 实施例12
[0259] 作为用于通用杂交体的生物相容递送组件的细胞外小泡
[0260] 由不同类型的细胞分泌的微泡与不同iLNP之间的融合通过R18融合测定确定。
[0261] 如实施例2中所示,将人微泡与血小板(PLT-MV)和多形核嗜中性粒细胞(PMN-MV)分离。
[0262] 类似于实施例5,用R18的乙醇溶液标记微泡样品(0.25μg PLT-MV和1.2μg PMN-MV总蛋白),接着除去游离染料。在加入不同iLNP物质时监测荧光的增加。
[0263] 如图25中所示,在融合缓冲液中混合iLNP与PMN-MV导致R18去猝灭。确定了pH依赖型iLNP与PMN-MV的相互作用,因为加入pH为7.4的iLNP没有导致去猝灭。与pDNA-iLNP和
BSA-iLNP混合导致了R18去猝灭。
[0264] 如图26中所示,PLT-MV与空iLNP的混合是pH依赖性的,且与空iLNP与外来体的混合类似。PMN-MV与PLT-MV由于具有抗炎性和免疫抑制性质而作为BDM令人们特别感兴趣。已
经证明了,PMN-MV能够抑制细胞因子的释放(肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1、白细胞介素
8、白细胞介素10和白细胞介素12p70),并减少人单核细胞来源的树突细胞中的免疫激活受
体(CD40、CD80、CD83、CD86、CCR7、HLA-DP、HA-DQ和HA-DR)(Sadallah,Eken,&Schifferli,
2011)。
[0265] 实施例13
[0266] 难以转染的细胞中杂交体的细胞吸收
[0267] 荧光显微镜用于确定难以转染的淋巴细胞系(Jeko1)进行的杂交体的细胞吸收。由MCL-exo和NBD标记的iLNP(iLNP制剂DlinDMA:Chol:DSPC:PEG-S-DMG:NBD-PC 40:40:
17.5:2:0.5制剂)制备杂交体。将MCL-Exo(2μg总蛋白/孔)与NBD标记的iLNP(1μg总脂质/
孔)在反应缓冲液(10mM MES,pH 6.0,145mM NaCl,5mM KCl)中混合,并在
振荡器上在37℃
下孵育30分钟。
[0268] 将杂交体与iLNP用靶
细胞转染1小时,然后用PBS清洗2次,以除去表面结合的且未内化的小泡。然后,将细胞重悬于PBS中,在相同的仪器设置下生成荧光图像。通过在开放的
源软件ImageJ中进行
图像分析确定每孔中iLNP膜染料的平均荧光强度。如在图27中所示,
在用杂交体转染1小时后,Jeko1细胞(n=160)表现出的iLNP膜染料的平均强度是单独用
iLNP转染的平均强度的近7倍。
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