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用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物

阅读：636发布：2022-10-06

专利汇可以提供用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于将核酸偶联至官能化的表面或载体的方法和组合物。尤其，本发明提供了一种用于将胺化的核酸偶联至被羧酸基团官能化的载体的改进方法，其中在有机溶剂存在下进行所述偶联反应。本发明进一步涉及用于执行所述偶联反应的组合物和试剂盒以及加载核酸的载体用于多种应用的用途。，下面是用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于将核酸偶联至载体的方法，所述方法包括：
(a)提供载体，所述载体在其上包含羧酸基团，
(b)提供核酸，其中所述核酸包含至少一个伯胺官能团，
(c)通过使在载体上的羧酸基团与碳二亚胺或其衍生物接触以形成反应性酸酐来活化所述载体，
(d)使所述反应性酸酐与所述核酸的至少一个伯胺官能团反应以形成共价酰胺键，由此将所述核酸偶联至所述载体，
其中在有机溶剂存在下进行步骤(c)和(d)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在盐存在下进行步骤(c)和(d)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述盐是无机盐。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述盐是LiCl或NaCl。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述盐以至少约0.1M且小于约1.0M或至少约0.2M且小于约0.8M的浓度存在于步骤(c)和/或(d)中。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，将所述盐溶解在有机溶剂中。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二乙基亚砜或其混合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂以每总体积至少约50％且小于95％的浓度存在于步骤(c)和/或步骤(d)中。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在有水或水性缓冲液存在下进行步骤(c)和/或步骤(d)，其中所述水或水性缓冲液的浓度是每总体积小于20％，优选地小于
10％。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳二亚胺是EDC。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，将所述碳二亚胺或其衍生物溶解在水性缓冲液中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水性缓冲液是MES或咪唑缓冲液。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述水性缓冲液包含在约5.0和约
7.0之间的pH。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在约4.5和约7.0之间的pH执行步骤(c)和/或(d)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(c)中之前，在有机溶剂中提供所述载体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用在步骤(d)中之前，在有机溶剂中提供所述核酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中活化所述载体之前，将所述核酸与所述载体组合。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中活化所述载体之后，将所述核酸与所述载体组合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约10和约10,000pmol/mg载体之间或约50和约5,000pmol/mg载体之间的浓度提供所述核酸。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在室温执行步骤(c)和(d)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将步骤(d)执行至少3小时，优选地至少10小时。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，将所述载体上至少
0.1％的羧酸基团键合至核酸分子。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括(e)将步骤(d)的偶联溶液和所述载体分离并且洗涤所述载体，任选地其中用水性溶液或水执行所述洗涤。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括(f)使所述载体与NaOH溶液接触和/或加热所述载体。
25.一种组合物，其包含：
在其上包含羧酸基团的载体，
包含至少一个伯胺官能团的核酸，
碳二亚胺或其衍生物，和
有机溶剂。
26.一种组合物，其包含：
在其上包含羧酸基团的载体，
其中所述羧酸基团的至少第一部分被反应性酸酐修饰且所述羧酸基团的至少第二部分经由羰基-酰胺键键合至核酸，
有机溶剂，和
任选的异脲副产物。
27.根据权利要求26所述的组合物，进一步包含：
在溶液中具有至少一个伯胺官能团的核酸，
和/或碳二亚胺或其衍生物。
28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中经由羰基-酰胺键键合至核酸的载体上的羧酸基团的百分比是至少0.1％，优选地至少0.2％。
29.一种用于将核酸偶联至固体载体的试剂盒，包含：
在其上包含羧酸基团的载体，
有机溶剂，
碳二亚胺或其衍生物，
和任选的核酸。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的组合物或试剂盒，进一步包含盐。
31.根据权利要求30所述的组合物或试剂盒，其中所述盐是无机盐，任选地其中所述盐是LiCl或NaCl。
32.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述盐以至少约0.1M且小于约1.0M或至少约0.2M且小于0.8M的浓度存在。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和二乙基亚砜或其混合物。
34.根据权利要求25至28或30至33中任一项所述的组合物，包含浓度为每总体积至少约50％且小于95％的有机溶剂。
35.根据权利要求25至28或30至34中任一项所述的组合物，进一步包含浓度为每总体积小于20％、优选地小于10％的水或水性缓冲液。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述碳二亚胺是EDC。
37.根据权利要求29至31、33或36中任一项所述的试剂盒，其进一步包含水性缓冲液，任选地其中所述水性缓冲液是MES或咪唑缓冲液。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述水性缓冲液包含在约5.0和约7.0之间的pH。
39.根据权利要求25至28或30至36中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有在约
4.5和约7.0之间的pH。
40.根据权利要求25至28或30至36和39中任一项所述的组合物，其中所述核酸具有在约10和约10,000pmol/mg载体之间或在约50和约5,000pmol/mg载体之间的浓度。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体选自颗粒、球、微米颗粒、纳米颗粒、珠，任选地其中所述载体是单分散的。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是磁性的。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是发荧光的。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体选自DynabeadsTM M-270Carboxylic Acid、DynabeadsTM MyOneTMCarboxylic Acid、Carboxyl、Sera-MagTMMagnetic羧酸酯修饰的颗粒、 Super Paramagnetic TM
Microspheres、ProMag 1 Series COOH Surfactant-Free Microspheres、Absolute MagTMCarboxyl Magnetic Particles、MagnosphereTMMS160/Carboxyl颗粒、Mono Mag Carboxylic Acid Beads、 Microspheres或Carboxylate-modified FluoSpheresTM。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是聚苯乙烯聚合物颗粒。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述载体是多孔的，任选地其中所述载体具有在约50％和约70％之间的孔隙率。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子是DNA。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子是单链的。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子选自寡核苷酸、引物、探针、锁核酸或适体。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子被标记，任选地其中所述标记物选自荧光染料、生物素或碱性磷酸酯。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述至少一个伯胺官能团位于所述核酸分子的5’末端或3’末端。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述至少一个伯胺官能团和所述核酸分子的5′或3’末端被间隔链隔开。
53.根据权利要求52所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述间隔链是包含3、6或12个亚甲基的疏水链。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子具有约15至约50个碱基的长度。
55.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或试剂盒，其中所述核酸分子含有一个或多个碱基类似物，如PNA或LNA。
56.一种组合物，其包含：
在其上包含经由羰基-酰胺键键合至核酸的羧酸基团的载体，和有机溶剂，其中所述载体是具有在约40和约1,000pmol/mg载体之间或在约50和约800pmol/mg载体之间的核酸偶联密度的珠。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述珠是磁性的。

说明书全文

用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物

[0001] 序列表

[0002] 本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入。创建于2018年8月22日的所述ASCII副本被命名为LT01290PCT_SL.txt且具有1,529的大小。

[0003] 本发明涉及用于将核酸偶联至官能化的表面或固体载体的方法和组合物。具体地，本发明涉及用于将胺化的核酸偶联至被羧酸基团官能化的载体的方法和组合物，以及这样的经修饰的载体用于多种应用的用途。

背景技术

[0004] 可以为了多种应用将核酸固定化在固体载体上，所述应用包括在载体上的化学或酶促核酸合成、测序反应、用于纯化物质的亲和色谱法、或用在体外诊断中以鉴别和定量非常少量的靶标的杂交测定。固定化的核酸经常被用于从复杂混合物或生物样品特异性地分离靶配体，其中将核酸设计成与期望的靶分子选择性地杂交。

[0005] 适合用于固定化核酸的不同类型的材料是本领域已知的，包括尼龙、硝化纤维素、活化的琼脂糖、重氮化的纤维素、胶乳颗粒、塑料、聚苯乙烯、玻璃和聚合物包被的表面。这些材料以许多形式使用，诸如膜、平板、载玻片、芯片、树脂、珠、探针、微量滴定板、浸渍棒等。多种化学修饰可用于核酸与这些载体(它们经常被称作(固体)载体)的共价偶联(直接地或通过接头)。为了允许核酸分子的结合，典型地将载体官能化以暴露亲核基团，其与核酸上的反应性基团反应。可替换地，将反应性基团引入载体以与存在于核酸中的亲核体反应。合适的基团或部分包括羟基、巯基、氨基和活化的羧酸基团，而能够与这些反应的基团包括二氯三嗪基、烷基环氧基、马来酰亚胺基、溴乙酰基和其它。用于将核酸偶联至不同类型的官能化的固体载体的策略描述在例如Gosh和Musso(Nuc.Acid Res.,15(13),5353-5372,1987)或Devor等人(“Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports”,Integrated DNA Technologies,2005)。取决于反应性基团或亲核基团在固体载体和核酸分子上的存在，可以直接执行偶联或用双官能试剂或交联剂执行偶联。双官能试剂和偶联剂是本领域众所周知的且可从商业来源诸如Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、ProteoChem等得到。

[0006] 一种广泛使用的用于将核酸附接至固体载体的表面化学类型是羧酸官能团。具有羧酸官能团的表面通常可以如下提供：用带有这样的羧酸基团的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物处理未包被的表面(例如未包被的聚合物颗粒)。例如，与甲基丙烯酸的溶液共聚得到带有末端羧基的聚合物涂层。为了允许与羧酸包被的表面的共价偶联，典型地用官能性反应性基团修饰核酸。例如，可以在它的5’或3’末端给核酸提供伯氨基以允许胺化的分子与活化的羧酸酯表面的偶联(例如使用碳二亚胺化学)，这产生共价的羰基酰胺键。可替换地，可以将核酸以巯基修饰形式提供并可以经由烷基化剂共价地连接至马来酰亚胺修饰的表面。

[0007] 许多应用需要非常有效的偶联方法以允许核酸向给定的载体上的定量负载，这会促进偶联产率的可预测性并因而促进偶联反应的可靠性。但是，当在水性缓冲液中使用标准程序将胺化的核酸偶联至羧酸官能化的载体时(例如通过使用碳二亚胺化学以活化羧酸基团)，通过本领域已知的方法实现的偶联效率是有限的。经常通过提供增加的量的核酸以得到固定化的核酸的足够产率来补偿低偶联效率。标准偶联程序的另一个经常观察到的缺点是经由核酸的内部仲胺基团的非特异性偶联事件的高发率或固定化的寡核苷酸的不利杂交动力学，它们二者可能导致在不同测定中的高背景。

[0008] 因而，普遍希望开发具有提高的偶联效率的方法，其导致表面结合的核酸的高且可预测的产率，而不需要增加向偶联反应中加入的核酸分子的量。

[0009] 因此，本发明的一个目的是，提供允许以较高效率将核酸偶联至固体载体的组合物和方法。本发明的另一个目的是，提供这样的组合物和方法：其减少达到期望的偶联产率所需的核酸的量。本发明的另一个目的是，提供这样的组合物和方法：其减少核酸分子与固体载体的非特异性偶联。

发明内容

[0010] 用于将核酸偶联在羧酸酯官能化的载体上的现有技术程序具有低偶联效率，且需要不实际的量的核酸才能达到适当水平的偶联产率。发明人已经令人惊讶地发现，当在有机相中进行活化和偶联反应时(即在有机溶剂存在下)，可以有效地提高偶联效率，由此同时减少非特异性偶联。

[0011] 因此，本发明部分地涉及用于将核酸偶联至固体载体的方法和组合物。具体地，本发明寻求提高胺化的核酸分子与被羧酸基团官能化的固体表面的偶联效率。已经认识到，通过在有机溶剂存在下进行活化和偶联反应两者，可以实现这些目的。已经进一步认识到，通过向偶联反应中添加盐，可以进一步减少非特异性偶联。

[0012] 因此，本发明的第一方面提供了一种用于将核酸分子偶联至载体的方法，所述方法包括：(a)提供载体，所述载体在其上包含羧酸基团，(b)提供核酸，其中所述核酸包含至少一个伯胺官能团，(c)通过使在载体上的羧酸基团与碳二亚胺或其衍生物接触以形成反应性酸酐来活化所述载体，(d)使所述反应性酸酐与所述核酸的至少一个伯胺官能团反应以形成共价酰胺键，由此将所述核酸偶联至所述载体，其中在有机溶剂存在下进行步骤(c)和(d)。在某些实施方案中，在盐存在下进行步骤(c)和(d)。根据第一方面的一种方法可以进一步包括(e)分离步骤(d)的偶联溶液和所述载体以及洗涤所述载体。

[0013] 本发明的第二方面提供了一种用于将核酸偶联至官能化的载体的组合物。在第一个实施方案中，所述组合物包含在其上包含羧酸基团的载体、包含至少一个伯胺官能团的核酸、碳二亚胺或其衍生物和有机溶剂。在第二个实施方案中，所述组合物包含在其上包含羧酸基团的载体、有机溶剂和任选的异脲副产物，其中至少所述羧酸基团的第一部分被反应性酸酐修饰且至少所述羧酸基团的第二部分经由羰基-酰胺键键合至核酸。在第三个实施方案中，所述组合物包含载体和有机溶剂，所述载体在其上包含经由羰基-酰胺键键合至核酸的羧酸基团，其中所述载体是具有约10至约10,000pmol/mg载体之间或约50至约5,000pmol/mg载体之间的核酸偶联密度的珠。

[0014] 本发明的第三方面提供了一种用于将核酸偶联至固体载体的试剂盒，所述试剂盒包含在其上包含羧酸基团的载体、有机溶剂、碳二亚胺或其衍生物、和任选的核酸。

[0015] 本发明的方法、组合物和试剂盒不限于刚刚提及的主题，而是，非限制性地在以下说明书和权利要求中更充分地描述。

[0016] 特别在所附权利要求中阐述了本发明的新颖特征。参考以下阐述示例性实施方案的详细描述(其中利用了本发明的原理)和附图将更好地理解本发明的特征和优点。

附图说明

[0017] 图1是一种示例性偶联程序的示意图，所述偶联程序包括将胺化的寡核苷酸偶联至被羧酸基团官能化的固体载体。

[0018] 图2显示了根据不同实施方案在水性相中(左图)或在有机溶剂存在下(右图)当使用将寡核苷酸偶联至DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid官能化的载体的标准方法时得到的偶联产率(A)和偶联效率(B)的对比。

[0019] 图3显示了在水性相中(左图)或在有机溶剂存在下(右图)当使用将寡核苷酸偶联TM至Dynabeads MyOne Carboxylic Acid官能化的载体的标准方法时得到的偶联产率(A)和偶联效率(B)的对比。

[0020] 图4是杂交测定的示意图，所述杂交测定可以用于确定根据不同实施方案用标准程序(在水性相中)或改进的偶联方法(在有机相中)得到的核酸偶联产率。

[0021] 图5显示了盐LiCl(A)和NaCl(B)对有机溶剂中的核酸的偶联产率和非特异性结合的影响。

[0022] 图6显示了盐的不存在(A)或存在(B)和DMSO的不同浓度对核酸的偶联产率和非特异性结合的影响。

具体实施方式

[0023] 贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含”和“含有”及其变体是指“包括、但不限于”，且它们无意(且不会)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求，单数包括复数，除非上下文另外要求。具体地，在使用不定冠词的情况下，描述应理解为涵盖复数以及单数，除非上下文另外要求。

[0024] 应当理解，当在本教导所讨论的温度、浓度、量、倍数、数字、范围、覆盖等前面使用“约”时，轻微的且非实质的偏差是在本教导的范围内。

[0025] 作为百分比值给出的浓度应当理解为指体积百分比，除非另外明确地阐明。

[0026] 结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应当理解为可适用于本文描述的任意其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。在本说明书(包括任何伴随的权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任意组合进行组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤相互排斥的组合以外。本发明不限于本文中公开的任何实施方案的细节。本发明延伸至在本说明书(包括任何伴随的权利要求、摘要和附图)中公开的特征中的任何新颖个体或任何新颖组合，或延伸至如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖个体或任何新颖组合。

[0027] 读者的注意指向所有这样的论文和文件：其与本申请的相关说明书一起并行地或更早地提交，且其与本说明书一起向公众开放查阅，并且所有这样的论文和文件的内容通过引用并入本文。

[0028] 在本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

[0029] 在下文中更详细地描述本发明的方面，包括示例性的方法、组合物和用途以及优选的实施方案。

[0030] 在第一方面，公开的方法和组合物提供了用于在其上偶联核酸的载体。

[0031] 本文中使用的术语“核酸”或“核酸分子”表示一个或多个共价地连接的核苷酸或碱基(例如，对于RNA，为核糖核苷酸；和对于DNA，为脱氧核糖核苷酸；但是也包括DNA/RNA杂合体，其中DNA是在单独的链中或在同一个链中)的序列，其中一个核苷酸的戊糖的3’位置通过磷酸二酯键连接至下一个核苷酸的戊糖的5’位置。核酸可以是单链的或双链的或部分地双链的，可以是直链的或环状的。核酸可以由完全互补的单链或部分地互补的单链组成。

[0032] 核酸具有“5’-端”和“3’-端”，因为核酸磷酸二酯键存在于取代基单核苷酸的戊糖环的5’碳和3’碳之间。新连接在此连接至5’碳的核酸末端是它的5’端核苷酸。新连接在此连接至3’碳的核酸分子末端是它的3’端核苷酸。本文中使用的末端核苷酸或碱基是在3’或5’端的末端位置处的核苷酸。核酸也表示较短的核酸分子，经常被称作，例如，如下面讨论的引物或探针。并且，术语“5’”和“3’”表示核酸的链。因而，直链单链核酸将具有5’末端和
3’末端。但是，直链双链核酸将在每条链具有5’末端和3’末端。

[0033] 在不同的实施方案中使用的核酸可以包含核苷酸的化学地、酶促地或代谢地修饰的形式或它们的组合。化学合成的核酸分子可以表示典型地长度小于或等于200个核苷酸(例如，长度在5-200个之间、在10-150个之间、在15-100个之间或在20-50个之间的核苷酸)的核酸，而酶促地合成的核酸分子可以包括更小以及更大的核酸分子。核酸分子的酶促合成可以包括使用酶诸如聚合酶、连接酶、外切核酸酶、内切核酸酶、重组酶等或它们的组合的分步过程。

[0034] 根据不同实施方案的核酸可以包含构象上受限制的或带有核苷碱基类似物的寡聚体诸如“锁核酸”(LNA)或“肽核酸”(PNA)。LNA包含这样的构象上受限制的核苷酸类似物：其具有一个额外的添加至核糖环的2’-O,4’-C-亚甲基桥，其将核糖“锁”在3’-内构象。通过使用标准的DNA合成化学可以实现LNA碱基的合成和掺入。锁核酸的合成程序描述在例如Singh等人(Chem.Comm.455-456,1998)和Wengel J.(Ace.Chem.Res.,32,301-310,1998)。
LNA亚磷酰胺的具体类型已经报告在例如美国专利号6,268,490。LNA对外切和内切核酸酶具有抗性，从而导致在体内和体外应用中的高稳定性。已经证实含有LNA的寡核苷酸以序列特异性的方式结合双链质粒DNA。LNA寡核苷酸的高结合亲和力允许将LNA应用在用于结合测定或基于杂交的测定中的探针中，且具体地用作在反义方案中的短探针。具体地，LNA可以用在要求高特异性和/或再现性的任何杂交测定中，例如，双标记的探针、原位杂交探针、分子信标和PCR引物。此外，LNA会提供在多路测定中调节引物和探针的解链温度(Tm)值的可能性。在寡核苷酸中的每个LNA碱基添加会使Tm增加直到80℃。作为这些显著特征的结果，LNA修饰的核酸(例如寡核苷酸)越来越多地用在反义药物开发中。

[0035] 本文中使用的术语“PNA”是指肽核酸，即人工合成的与DNA或RNA类似的聚合物，其被用在生物研究和医学治疗中，但是已知其不会天然地存在。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含有酰胺的主链替代，且典型地由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至主链。核苷碱基被保留且直接地或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。通常象肽那样描述PNA，N-端在第一个位置且C-端在最后一个位置(从左至右)。教导PNA化合物的制备的代表性专利包括、但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可以参见Nielsen等人(Science,254,第1497页,1991)。已经证实PNA保留杂交性能。此外，已经证实，PNA双链体在包含大量DMSO的溶剂中表现出未受影响的稳定性(Sen A.和Nielsen P.E,Nucleic Acids Res.,35,3367-3374,2007)，这使得PNA成为特别合适的根据不同实施方案在有机溶剂中偶联至固体载体的候选物。

[0036] 本文中使用的术语核酸包含在下面进一步定义的寡核苷酸、引物、探针和适体。

[0037] 本文中使用的术语“寡核苷酸”或“寡聚物”表示含有寡聚体(包括如上所述的LNA或PNA)的DNA、RNA和核苷碱基类似物，并表示是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷、但是典型地是DNA的核酸的任意其它类型。寡核苷酸因而是核酸的子集，且可以是单链的或双链的。寡核苷酸可以具有至少2个、或通常约5个至约200个、或更常见地约20至约100个核苷酸的长度。寡核苷酸的长度经常小于200个核苷酸，更典型地小于100个核苷酸。因而，“引物”通常落入寡核苷酸的范畴内。另外，寡核苷酸可以是核酸酶抗性的，且包括、但不限于2’-0-甲基核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、二硫代磷酸酯核苷酸、氨基磷酸酯核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。

[0038] 寡核苷酸可以是合成的，且可以在它们的5’或3’末端端部中的一个或两个处被修饰。寡核苷酸可以包含额外的官能团或分子(或原子)，其已经共价地或非共价地连接。这些额外的基团或分子(或原子)可以连接至寡核苷酸上的几乎任何位点(取决于下游应用)，且可以用于将配体连接至寡核苷酸和/或用于将寡核苷酸偶联至固体表面。例如，通过如下面讨论的附接一个或多个末端反应性胺官能团可以修饰寡核苷酸，产生胺-修饰的或氨基-修饰的或胺化的寡核苷酸，且这些术语可以在本文中互换使用。

[0039] 通过任意合适的方法可以制备寡核苷酸，所述方法包括通过诸如以下方法的直接化学合成：Narang等人(Meth.Enzymol.68,90-99,1979)的磷酸三酯方法；Brown等人(Meth.Enzymol.68,109-151,1979)的磷酸二酯方法；Beaucage等人(Tetrahedron Letters 22,1859-1862,1981)的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体载体方法。在Goodchild(Bioconjugate Chemistry 1,165-187,1990)中提供了寡核苷酸和修饰的核苷酸的缀合物的合成方法的综述。在适当的情况下，术语寡核苷酸可以表示引物或探针或配体，且这些术语可以在本文中互换使用。

[0040] 本文中使用的术语“引物”或“探针”表示在合适的条件下能够至少部分地与靶核酸杂交的短核酸。本文中使用的术语“杂交”表示使核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。杂交和杂交的强度(例如，核酸之间缔合的强度)受诸如以下因素影响：核酸之间的互补性程度，涉及的条件的严谨性，形成的杂合体的Tm，和在核酸内的G:C比率。

[0041] 而探针典型地被设计与靶分子内的序列杂交并可检测地标记，引物经常被称作酶促组装反应的启动核酸分子。

[0042] 对于引物，这样的条件包括其中在适当的缓冲液中和在合适的温度下在有不同的核苷三磷酸(例如，A、C、G、T和/或U)和用于延伸的试剂(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)存在下诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的那些。引物或探针通常由单链DNA组成，但是为了特定应用可以提供为双链分子。任选地，引物或探针可以是天然存在的或使用重组程序的化学合成来合成。

[0043] 引物或探针的适当长度取决于它的预期用途，但是典型地在约5至约200个核苷酸的范围内，包括中间范围，诸如约10至约50个核苷酸、约15至约35个核苷酸、约18至约75个核苷酸、约20至约120个和约25至约150个核苷酸。用于选定应用的合适引物或探针的设计是本领域众所周知的且描述在文献中(参见例如OligoPerfectTM Designer,Thermo Fisher Scientific)。引物或探针可以包含额外的特性，其允许引物或探针的检测或固定化，但是不会改变基本性质或功能性。例如，探针可以具有修饰，诸如使探针不可被核酸聚合酶延伸的3’末端修饰，和一个或多个发色团。具有相同序列的寡核苷酸可以在一个测定中充当引物和在不同的测定中充当探针。对靶分子具有特异性结合性能的寡核苷酸也可以被称作“配体”。

[0044] 在某些实施方案中，核酸可以是适体。本文中使用的术语“适体”是特异性地结合一种或多种靶分子(例如蛋白或肽)的单链核酸(DNA或RNA)。适体包括在使各个核酸和靶分子配偶体发生接触的先前步骤以后，可能检测其与单个给定靶分子或与多个给定靶分子的复合物的那些。适体经由基本上不同于杂交的机制结合它们的靶分子。适体通常特征在于包含环和茎的二级结构。换而言之，适体的活性构象(即其中适体能够结合它们的靶蛋白的构象)是非直链的。

[0045] 适体通常包含5-120之间个核苷酸，且可以根据被称作SELEX(指数富集法配体系统进化)的方法在体外选择。适体具有许多优点。由于它们的寡核苷酸性质，适体具有低免疫原性和对严谨物理化学条件(脲的存在，DMSO的存在，非常酸性或非常碱性pH的存在，有机溶剂的应用，或高温的应用)的高抗性，从而导致在用作亲和配体的背景下不同的消毒策略。此外，它们具有高选择性。最后，适体的生产涉及相对有限的成本。在某些实施方案中，适体可以包含非核苷酸或核苷酸部分，例如如下面讨论的非核苷酸间隔链，其连接所述适体的核酸部分的5′或3′末端之一和用于偶联至预活化的载体的反应性胺官能团。

[0046] 根据不同实施方案的核酸可以具有如上所述的任何结构或化学，且可以包含引物、探针或适体，它们在下文中共同地称作寡核苷酸。通过多种方式，包括例如寡核苷酸合成的常规方法，可以得到根据不同实施方案与固体载体偶联的寡核苷酸。

[0047] 常规寡核苷酸合成方法遵循一系列基本步骤，它们经常一起称作“合成循环”，其可以包括至少下述示例性步骤b)至f)，具有使用一种或多种溶剂诸如乙腈、乙酸乙酯或适合用于实现固相合成的其它洗涤试剂的适当洗涤步骤：

[0048] 在示例性步骤a)中，将已经在5’位置被保护的第一个亚磷酰胺(或者，在某些其中合成在5’至3’方向进行的实施方案中，第一个亚磷酰胺可以在3’位置被保护)根据本发明(例如通过偶联至通用接头)衍生化至固体载体诸如聚合物颗粒，或如本文别处所述预衍生化得到；

[0049] 在示例性步骤b)中，将第一个亚磷酰胺(其可以是修饰的或未修饰的)的5’二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基除去，例如经由去三苯甲基化。这个经常被称作“解封闭”的过程典型地使用酸，例如在二氯甲烷(DCM)中的三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA)或在甲苯中的DCA。可替换地，电化学地产生的酸(“EGA”)或光产生的酸(PGA)可以用于去保护。示例性的EGA或PGA组合物描述在例如WO 2013/049227、申请号PCT/US2015/064700或Maurer等人,“Electrochemically Generated Acid and Its Containment to 100Micron Reaction Areas for the Production of DNA Microarrays”,PLoS,2006,Issue 1,e34中。

[0050] 在示例性步骤c)中，将第二个亚磷酰胺(其具有被保护的磷、糖和碱基基团)添加至第一个亚磷酰胺的解封闭的5’-OH基团。在偶联第二个亚磷酰胺之前，典型地将它活化，这可以使用咪唑-型或四唑-型催化剂(例如四唑或4,5-二氰基咪唑)实现。然后使活化的第二个亚磷酰胺与第一个亚磷酰胺的5’-OH基团反应以得到三价亚磷酸酯三酯。该过程经常被称作“偶联”且具有超过99％(典型地约99.8％)的总效率，剩下非常小数目的5’-OH基团未反应。

[0051] 在示例性步骤d)中，将第一个亚磷酰胺的未反应的5’-OH基团加帽并由此从后续偶联反应排除以避免消除的积累。这个经常被称作“加帽”的过程典型地通过乙酰化执行，使用例如乙酸酐和N-甲基咪唑，优选地在有碱(诸如二甲基吡啶或吡啶)存在下；

[0052] 在示例性步骤e)中，将从步骤c)产生的亚磷酸酯三酯氧化以形成更稳定的磷酸酯三酯，该过程经常被称作“氧化”。氧化典型地使用碘试剂(例如在THF/吡啶/水中的碘)实现。在合成硫代磷酸酯寡聚物的情况下，氧化步骤e)可以用硫化步骤替换。

[0053] 在示例性步骤f)中，取决于寡核苷酸的期望长度，根据需要重复包括步骤b)至e)的合成循环。本领域技术人员会认识到，在本发明的某些实施方案中，步骤的次序可以变化，或根据使用的方案可以在适当时重复一些步骤，包括洗涤步骤。例如，在最终的步骤e)以后，可以执行另一个步骤b)以从最后偶联的亚磷酰胺除去5’-DMT基团。在合成过程中，可以在正气压下(例如使用氩或氮或任意其它惰性气体)进行步骤b)至e)，以防止反应性中间体向空气的暴露。

[0054] 合成以后，可以对寡核苷酸进行示例性步骤g)，其包括从固体载体切割寡核苷酸和除去保护基，该过程经常被称作“切割和去保护”。这典型地使用氨水或氨气在升高的温度下实现。两个反应可以随后或在单个步骤中执行，取决于使用的条件。例如，在使用气态无水氨的情况下，两个步骤同时发生并用水或缓冲液从载体洗脱完全去保护的寡核苷酸，取决于随后的定量或纯化步骤。去保护条件也可以变化，取决于用于合成的亚磷酰胺的修饰类型或用于合成寡核苷酸主链的核苷碱基保护的类型。例如，用常规基团(例如Bz-dA、Bz-dC、iBu-dG)保护的标准DNA碱基可以使用氢氧化铵去保护。

[0055] 在某些实施方案中，可能期望通过不执行最终的解封闭步骤b)将末端5’-DMT基团留在合成的寡核苷酸上用于后续纯化。然后可以使用三苯甲基经由与C18二氧化硅或聚苯乙烯载体的疏水相互作用来纯化全长寡核苷酸。可替换地或另外，通过常规方法诸如脱盐、反相HPLC、聚丙烯酰胺凝胶电泳(“PAGE”)或阴离子交换HPLC，可以纯化寡核苷酸。

[0056] 本文中使用的核酸可以包含一个或多个反应性基团，其可能与另一个实体所提供的适当反应性基团反应。例如，可以用一个或多个反应性基团进一步修饰核酸以允许随后标记(例如用染料、生物素、碱性磷酸酶等)或偶联至官能化的表面。可以在寡核苷酸合成过程中或以后提供这样的化学修饰。多种修饰可用于在合成时掺入寡核苷酸中。这可以使用经修饰的合成载体实现，例如适合用于3’修饰的经修饰的CPG载体，或用于内部和5’修饰的氨基修饰的亚磷酰胺。修饰类型和位置的选择主要取决于随后的应用或预期的用途。

[0057] 在不同的实施方案中，给核酸提供反应性胺官能团用于随后的偶联反应。在某些实施方案中，在合成以后将反应性胺官能团添加至寡核苷酸。在某些实施方案中，在合成过程中将反应性胺添加至寡核苷酸。在某些实施方案中，将反应性胺官能团添加至寡核苷酸的5’末端，其在许多情况下为用于修饰的靶末端，因为在自动化合成的最后一步中容易掺入。在其它实施方案中，将反应性胺官能团添加至寡核苷酸的3’末端。

[0058] 反应性胺官能团可以具体地包括伯胺。伯胺典型地由式“R-NH2”表示，且不同于由核苷酸的嘌呤或嘧啶环提供的芳族胺，其中胺官能团直接键合至芳族基团。在伯胺分子中的NH2基团被称作伯胺基团。根据不同的实施方案，核酸可以在它的3′或5′末端包含反应性胺官能团，这意味着反应性胺官能团偶联至所述核酸的核苷酸部分。换而言之，至少伯胺官能团可以位于核酸分子的5’末端或3’末端处。在核酸的5’末端处引入的氨基基团(例如使用在Chu和Orgel(DNA 4,327-331,1985)中描述的一步反应方法)导致烷基接头的末端伯氨基基团与碱基的氨基官能团相比更大的亲核性。因此预见到，在载体上暴露的羧酸基团优先与这些伯氨基基团反应。核酸可以在它的3′或5′末端的“侧面”包含反应性胺官能团，这意味着所述胺官能团不直接偶联至核酸的核苷酸部分，而是共价地键合至所述核酸的非核苷酸部分。所述非核苷酸部分优选地键合至多核苷酸。术语“非核苷酸部分”意图指不是基本上由多核苷酸组成的化学单元。

[0059] 核酸的非核苷酸部分可以例如是非核苷酸间隔链，其插入在所述反应性胺官能团与所述核酸的核苷酸部分的所述末端之间。如果键合至寡核苷酸的3′或5′末端，所述间隔链可以充当“胺修饰物”(如在下面更详细地描述的)以将官能胺基团掺入核酸中。因而，可以将反应性胺官能团附接至核酸的核苷酸部分的3′或5′末端或间隔链。间隔链可以使核酸在物理上远离载体的表面，由此增加用于随后结合反应的核酸的核苷酸部分的相对移动性和减小它的位阻。因而，在某些实施方案中，反应性胺官能团和寡核苷酸的5-′或3′-末端被间隔链隔开。

[0060] 间隔链可以属于任何类型。间隔链基本上含有碳-碳、碳-氧和碳-氮类型的键。例如，间隔链可以是疏水链或亲水链，所述疏水链由3、6、12或更多个(例如18个)亚甲基(CH2)(也经常分别被称作C3、C6或C12)组成的链形成，所述亲水链可以属于聚乙二醇类型，例如六甘醇(HEG)，或11-氨基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-基(随后被称作亲水C11)或非特异性的寡核苷酸，任选地被伯胺官能团取代。优选地，间隔链不包含除了伯胺官能团或仲胺官能团以外的可电离基团。通常，间隔链不包含对碱性pH或对氧化或还原反应敏感的基团或键。具体地，间隔链不含有任何二硫键或巯基基团。

[0061] 根据本领域技术人员众所周知的方法可以引入间隔链，具体地作为多核苷酸的化学合成的最终步骤。在该特定情况下，借助于包含亚磷酰胺官能团的衍生物，可以将间隔链引入在多核苷酸的5′末端。该反应的一般原理显示在Greco和Tor(Nature Protocols 2,305-316,2007)的图2中。也可能通过在有EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和咪唑存在下偶联二胺诸如乙二胺将含有伯胺的分子引入多核苷酸的5′位置(参见Thermo Fisher Scientific公开的技术单No.TR0030.5)。也可以参考Hermanson(Bioconjugate Techniques,第2版,Academic Press,San Diego,2008)的参考手册，具体地参考第27章第
970页。

[0062] 使用所谓的“氨基修饰物”可以将反应性胺官能团诸如伯氨基基团附接至核酸。氨基修饰物可以具有不同的化学和长度。例如用于碱基dA、dC、dG和dT的氨基修饰物是可得到的，且可以在最后的合成循环中加入替代各个常规碱基。考虑到下游应用(其中诸如位阻、静电排斥、结合动力学、电荷密度、疏水性和/或杂交效率等因素是关键性的)，氨基修饰物可以具有各种化学和长度(包括C3、C6、C12亚甲基(CH2)或更长)的间隔臂以提供灵活性。例如，在将寡核苷酸附接至载体用于用在杂交测定(例如DNA阵列)中的情况下，将寡核苷酸连接至载体的间隔臂的长度、电荷和疏水性可能显著地影响与靶核酸的杂交的效率(Shchepinov等人,Nucleic Acids Res.25,第1155页,1997)。在许多情况下，在六碳间隔物的末端处具有伯氨基基团的C6氨基修饰物被用于标准的5’标记。对于某些应用，也可以使用具有更长间隔链(例如C12)的修饰物。对于3’标记，经常使用氨基修饰物C7或C3，其分别含有支链七碳或三碳间隔物。通过许多氨基修饰物(包括C6-dA、C6-dC、C6-dG和C6-dT)可以将内部氨基官能团引入寡核苷酸序列，且可以分别添加在dA、dC、dG和dT残基的位置。

[0063] 用于核酸的5’和/或3’修饰的不同化学和长度的氨基修饰物可得自商业供应商例如Sigma-AldrichTM(参见例如“Custom Oligonucleotide Modifications Guide”,Sigma-Aldrich)、Link Technologies Ltd.、Glen Research、Integrated DNA Technologies、TMExiqon等。被广泛用在自动化DNA合成仪中的氨基修饰物的一个例子是Uni-Link AminoModifier(Clontech Laboratories,Inc.)，其为将脂族伯胺直接掺入核酸分子中的氰乙基亚磷酰胺。

[0064] 伯氨基基团可以用于将多种标记、染料或其它官能团缀合至核酸。例如，带有伯氨基基团的寡核苷酸可以与标记或用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,C4H5NO3)酯(例如生物素-XX-NHS酯)或异硫氰酸酯(例如异硫氰酸荧光素、FITC)活化的其它分子反应。但是，也可以通过其它官能团连接标记。

[0065] 因而，在某些实施方案中，寡核苷酸、引物、探针、配体或适体包括可检测的部分或标记。所述标记可以产生或造成产生可检测信号。在某些实施方案中，所述可检测信号可以从化学或物理变化(例如，热、光、电、pH、盐浓度、酶活性或接近事件)产生。在某些实施方案中，所述标记可以包括发光的、光致发光的、电致发光的、生物发光的、化学发光的、荧光的、磷光的或电化学的化合物。在某些实施方案中，所述标记可以包括为荧光团、发色团、放射性同位素、半抗原、亲和标签、原子或酶的化合物。在某些实施方案中，所述标记包含不典型地存在于天然存在的核苷酸中的部分。例如，所述标记可以包括荧光的、发光的或放射性的部分。许多标记核酸的方法是技术人员已知的。例如，WO 2014/095952 A1公开了制备用于用作杂交探针的经标记的寡核苷酸的方法。

[0066] 可替换地，末端氨基基团可以用于将核酸偶联至官能化的表面诸如羧酸酯修饰的载体。

[0067] 本文中使用的术语“固体载体”、“载体”、“固体表面”、“表面”或类似的术语表示可以在其上合成、附接和/或固定核酸(包括如上面讨论的寡核苷酸、引物、探针等)的材料或衬底。载体可以具有许多形状中的任一种，诸如针、条带、平板、芯片、圆盘、棒、纤维、弯头、圆柱形结构、平坦表面、凹陷或凸出表面或毛细管或圆柱，或可以是球形、微粒、椭圆形、多角形等。载体或表面可以是二维的(诸如载玻片)或三维的诸如珠或球。载体或表面可以是颗粒，包括珠、微米颗粒、纳米颗粒等。例如，载体可以包含聚合物颗粒诸如聚苯乙烯颗粒，或可以具有凝胶状结构。在某些实施方案中，载体可以是磁性颗粒，珠或球。固体载体可以是类似大小的非珠型颗粒(例如，丝)。载体可以是阵列或芯片、载玻片等或其结构。在许多情况下，载体选自颗粒、球、微米颗粒、纳米颗粒或珠。

[0068] 载体或其表面可以是亲水的或能够被赋予亲水性，且包括无机粉末诸如二氧化硅、硫酸镁和氧化铝；天然聚合材料，特别是纤维质材料和从纤维素衍生出的材料，诸如含有纤维的纸诸如滤纸、色谱纸等。可以将载体或表面固定在载体(诸如多孔板、载玻片或微芯片)的可接近位置处。载体可以是疏松的(例如，在瓶或柱中的树脂材料，或在孔中的珠/颗粒)，或可以可逆地固定或连接至载体(例如通过可切割的化学键或磁力等)。在某些实施方案中，固体载体可以是可片段化的。固体载体可以是合成的或经修饰的天然存在的聚合物，诸如硝化纤维素、碳、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联的葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、玻璃、可控孔度玻璃、磁性可控孔度玻璃、磁性或非磁珠、陶瓷制品、金属等；任一种单独使用或与其它材料结合使用。本文中使用的固体载体可以包含固体以及半固体材料诸如水凝胶。

[0069] 载体可以具有不同的宽度和大小。例如,可以用于实践本发明的方面的颗粒或珠(例如，磁珠)的大小可以宽泛地变化，但是包括具有在0.01μm和100μm之间、在0.005μm和100μm之间、在0.005μm和10μm之间、在0.01μm和100μm之间、在0.01μm和1,000μm之间、在1.0μm和2.0μm之间、在1.0μm和100μm之间、在2.0μm和100μm之间、在3.0μm和100μm之间、在0.5μm和50μm之间、在0.5μm和20μm之间、在1.0μm和10μm之间、在1.0μm和20μm之间、在1.0μm和30μm之间、在10μm和40μm之间、在10μm和60μm之间、在10μm和80μm之间或在0.5μm和10μm之间的直径的珠。

[0070] 包含根据各个方面的颗粒或珠的固体载体可以是单分散的。术语“单分散的”意味着，对于多个颗粒(例如至少100个，更优选地至少1,000个)，所述颗粒具有小于20％、例如小于15％、典型地小于10％和任选地小于8％、例如小于5％的它们的直径的变动系数(CV)或％多分散性。术语单分散的在本文中用于表征具有低异质性和同质尺寸分布的颗粒群体或颗粒。颗粒的尺寸分布可以通过百分比CV(变动系数)来确定，后者可以在CPS圆盘式离心机上确定。CV被定义为100x(标准差)/平均值，其中“平均值”是平均粒径，且标准差是颗粒尺寸的标准差。多个颗粒的CV可以例如是在50-100％的范围内。例如，单分散的颗粒群体可以在超过90％、优选地超过95％的颗粒中具有在它们的平均直径±5％内的大小。

[0071] 证实了单分散的颗粒或珠在磁性分离测定中提供某些优点。例如，通过使用单分散的颗粒，反应速率和其它参数是特别均匀的。具体地，单分散的和超顺磁的颗粒极大地辅助在其中涉及颗粒的反应的动力学。通过使用超顺磁的颗粒或珠(即含有铁磁性材料的亚颗粒的颗粒，所述亚颗粒小于维持永久磁性所需的域大小)，人们可以避免在反应过程中颗粒的磁性聚集或团集，从而再次确保均匀的且快速的反应动力学。因而，本发明的方法和组合物可以提供单分散的和/或超顺磁的固体载体。这样的颗粒描述在例如美国专利号5,512,439中。

[0072] 载体可以具有光滑或颗粒表面，且可以是致密的或多孔的。术语表面在本文中也可以用于描述暴露于溶剂或溶剂可接近的载体的层或部分，例如多孔材料的孔。本文中使用的术语“多孔的”是指，所述材料或颗粒含有可能具有不均匀的或均匀的直径(例如在nm范围内)的孔。多孔材料通常包括合成的过滤材料、树脂、珠、膜等。在这样的多孔材料中，反应(例如分子的原位合成或附接)可以发生在孔内。

[0073] 因而，根据不同实施方案的载体可以是多孔的。例如，多孔微粒载体诸如珠可以特征在于特定孔体积，其中，例如，每1克聚合物1ml孔体积等于50％孔隙率。例如，具有2.2ml孔体积/g聚合物的颗粒具有70％的孔隙率。颗粒孔隙率取决于使用的聚合物。在某些情况下，适合用于本发明的方面的颗粒的孔体积可以是在0.1-2.5ml/g聚合物的范围内。在某些实施例中，所述颗粒具有约1.0至约2.0ml/g聚合物之间的孔体积。但是，也可以在体积基础上定义孔隙率。对于公开的方法和组合物可能有用的颗粒孔隙率可以是在约50％至约70％、约55％至约65％的范围内，例如约60％。在某些情况下，可以使用具有高达99％的孔隙率的颗粒。Chou等人(Sensors.12,15467-15499,2012)已经综述了在诊断应用诸如护理点试验中使用基于多孔珠的平台的优点。

[0074] 在某些情况下，具有较小孔的无孔的(“致密的”)载体或材料的应用可能是优选的。例如，更少孔的颗粒可能具有在约1％至约10％、约2％至约20％、或约5％至约50％范围内的孔隙率。在某些方面，颗粒可能具有规则的或“光滑的”结构。不像不规则的颗粒，光滑的颗粒在所有方向提供均匀的磁信号。当暴露于磁场时，这会提供更一致的性能。光滑颗粒的另一个优点是，所有外表面是例如溶液可容易接近的。

[0075] 适合用于附接或缀合分子的表面经常以官能化的形式提供。载体可以用多种反应性基团官能化或包被或修饰。例如，可以将配体点滴在活化的玻璃表面或其它载体上，诸如用氨基硅烷、聚赖氨酸、醛、环氧或活性酯包被的那种(参见例如Zammatteo等人,Anal.Biochem.280,143-50,2000)。经常用于共价附接肽或核酸的一类官能化的表面是羧酸酯化的衬底，即用羧酸基团包被的表面。根据不同的实施方案，用羧酸基团修饰载体以允许偶联至带有反应性胺官能团的分子。在某些实施方案中，所述羧酸基团直接附接至载体。在某些实施方案中，所述羧酸基团从载体表面直接伸出，即没有将羧酸基团附接至载体的任何间隔物或交联剂或其它化学部分。在某些实施方案中，通过用带有羧酸基团的聚合物包被载体来引入羧酸基团。

[0076] 在不同的实施方案中，可以在偶联反应之前活化羧酸基团。本文中使用的术语“活化的羧酸基团”意图指从能够与亲核体、尤其是伯胺反应从而形成酰胺键的“羧酸”官能团衍生出的化学官能团。活化的羧酸官能团是本领域技术人员众所周知的，并且包括酰基氯、混合酸酐和酯官能团。活化的羧酸官能团可以例如呈酯的形式，其源自所述羧酸官能团与选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、HOAt和N-羟基琥珀酰亚胺或其衍生物的化合物的反应。在某些实施方案中，活化的羧酸官能团并非源自附接至载体表面的活化的聚丙烯酸。

[0077] 根据不同实施方案用于核酸偶联的合适官能化载体的选择可能取决于多种参数，且应当与下游应用相容。例如，使用用于荧光免疫测定的磁珠的一个主要问题是，珠的自发荧光强烈地干扰靶检测信号。因而，当将在使用基于经标记的探针的荧光读出的测定中使用加载核酸的载体时，由不包含或包含有限固有自发荧光的材料组成或包被的载体可能是优选的，以降低散射或荧光背景的水平。本领域描述了多种包含低自发荧光性能的载体，包括载玻片、微量培养板或聚合物颗粒。例如，通过保持颗粒基本上不具有共轭离域电子体系(除了在苯环中的那些以外)，可以减少或避免聚合物颗粒的自发荧光，如在WO 2004/053490 A1中所述。这样的颗粒不会与二乙烯基苯交联，因为任何未反应的化合物将自动发荧光。此外，当在荧光测定中使用颗粒时，通过选择较小尺寸(例如小于或至多约1μm)的颗粒，诸如在例如美国公开号2012/0141798 A1(通过引用并入本文)中描述的亚微米珠，可以进一步限制从自发荧光颗粒衍生出的背景信号。

[0078] 在某些情况下，可以使用荧光载体。例如，荧光微米颗粒已经被用在非常多路的液体阵列应用中，且可得自多个供应商，包括Thermo Fisher Scientific和Applied BioCode。这样的平台使用用不同的荧光染料组合独特地标记过且加载了核酸(寡核苷酸、探针等)的珠，所述核酸可以在溶液中与经标记的靶配体(其它核酸或肽)杂交。在特异性杂交靶标以后，可以确定从这样的“带条形码的”颗粒和结合的经标记的靶标衍生出的组合的荧光信号，例如通过流式细胞计量术。加载了核酸的带条形码的珠用于液体阵列应用的用途描述在例如Yang等人(Genome Research 11,1888-1898,2001)或Defoort等人(J.Clin.Microbiol.38,1066-1071,2000)中。根据不同实施方案可以使用的荧光颗粒具体TM
地包括被羧酸基团官能化的那些。例如，羧酸酯修饰的FluoSpheres (Thermo Fisher Scientific)在它们的表面上具有羧酸的高密度，且可以用于根据本文所述的方法偶联胺化的核酸。

[0079] 关于选择适当载体的一般考虑可以包括载体的负载能力，其可能取决于下述特征中的一个或多个：结构、大小、表面积、孔隙率、表面化学、要固定化的具体分子的大小等。尽管非常低的负载能力可能导致随后测定中的低信号并由此影响测定灵敏度，但是过高的负载能力可能在核酸偶联过程中导致高背景信号或位阻效应，这可能由于偶联的核酸的有限可达性而损害靶分子的随后结合。因而，对于某些应用，可以使用具有非常高负载能力的载体，而对于其它应用，具有低和受控负载能力的载体可能是优选的。例如Guo等人(Nucleic Acids Res.,22,5456-5465,1994)已经研究了核酸表面密度对杂交效率的影响，其确定了可以结合最大量的互补靶核酸时的最佳表面覆盖。例如在Beaucage,S.L.(Curr.Med.Chem.,8,1213-44,2001)中讨论了用于诊断应用的寡核苷酸阵列的制备策略。

[0080] 官能化的载体的负载密度受限于偶联反应可接近的载体表面上的反应性基团的量。尽管二维载体诸如平板、载玻片或芯片对于特定应用而言可能是适当的，它们的平坦结构限制了反应性基团的可用性，并因而限制了最大核酸负载能力。因而，在许多情况下，合适的羧酸官能化的载体可能具有三维或微粒结构，诸如球、微粒或珠。

[0081] 由于较大的表面与体积比(尤其当由多孔材料组成时)，微粒载体典型地具有较高的负载能力。因而，根据不同实施方案的载体可以由它的表面积限定。在许多情况下，可以使用具有高表面积的多孔微粒载体。具体地，小直径颗粒每单位重量呈现更多的表面积，而较大的颗粒每颗粒呈现更多的表面积。例如，根据Brunauer、Emmett和Teller所开发的方法可以确定多孔聚合物颗粒的表面积，该方法被称作BET方法，它是基于蒸气或气体在固体表面上的物理吸附(Brunauer,S.,Emmett,P.和Teller,E.,J.Amer.Chem.Soc.60,309-319,1938)。该方法使用干燥颗粒进行试验，所以为了准确测量，孔当暴露于溶剂时与干燥时相比应当具有稳定的体积。在某些实施方案中，根据不同实施方案的颗粒表面积可以是约10至约1,000m2/g、在约100至约700m2/g之间、约200至约600m2/g之间、约300至约400m2/g之间
2 2
的范围内，例如约350m/g。在某些实施方案中，颗粒可以具有在约2至约100m /g、约5至约
50m2/g或约2至约5m2/g范围内的比表面积。

[0082] 在某些实施方案中，具有高负载能力的磁珠可以用作固体载体。例如，磁珠经常被用在包含亲和分离、靶标纯化或杂交步骤的应用中。具有羧酸包被的表面的磁珠可商购得TM TM TM自不同供应商，包括Dynabeads M-270 Carboxylic Acid和Dynabeads MyOne
Carboxylic Acid(Thermo Fisher Scientific), Carboxyl(Bangs
Laboratories Inc.),Sera-MagTM Magnetic羧酸酯修饰的颗粒(GE Healthcare),
Super Paramagnetic Microspheres(Merck Chimie SAS),ProMagTM 1 Series
COOH Surfactant-Free Microspheres(PolySciences Inc.),Absolute MagTM Carboxyl Magnetic Particles(Ademtech),MagnosphereTM MS160/Carboxyl颗粒(JSRLife
Sciences),Mono Mag Carboxylic Acid Beads(Ocean Nanotech),或
Microspheres(Luminex)等。

[0083] 氨基修饰的或胺化的核酸与固体载体的共价键要求在与胺反应后形成羧酰胺、磺酰胺、脲或硫脲的酰化剂。在偶联核酸之前，典型地用水溶性的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(也被称作EDC、EDAC、EDC盐酸盐、WSC盐酸盐，且可替换地书写为N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化被羧酸基团官能化的载体。碳二亚胺(RN＝C＝NR)及其衍生物可得自不同供应商，包括例如Thermo Fisher Scientific Pierce。在图1中解释了一种使用碳二亚胺化学的典型偶联程序。在步骤(1)中，将羧酸酯修饰的载体(由黑色球表示)用碳二亚胺EDC活化以形成反应性酸酐或O-酰基异脲(即脲的O-酰化衍生物)。在步骤(2)中，企图消除脲单元的高反应性中间体与胺化的寡核苷酸的伯胺官能团反应以形成稳定的羰基酰胺键，异脲作为副产物释放。该程序可以用于将氨基修饰的寡核苷酸经由5’或3’末端(取决于伯氨基基团存在的地方)偶联至活化的羧酸酯化的表面。

[0084] 在本领域已知的方法中，典型地在水性相中进行在步骤(1)中的活化和在步骤(2)中的偶联反应。已经证实EDC对羧酸基团的活化在4.5和7.2之间的pH是有效的。因此，许多可利用的方案提示使用具有约5或6的pH的MES(2-吗啉代乙磺酸)缓冲液或pH 7.0的咪唑缓冲液用于活化和偶联反应(Nakajima和Ikada,Bioconjugate Chemistry,6,第123页,1995)。大体而言，缓冲液应当不含有干扰反应或与反应竞争的任何化合物。例如，磷酸盐和乙酸盐缓冲液可以减小碳二亚胺的反应性，因而不推荐用于偶联至羧酸酯化的载体。此外，当使用胺反应性的试剂时，至关重要的是，在偶联步骤中，使用的缓冲液不含有会干扰偶联反应的任何游离胺(诸如Tris或甘氨酸)。

[0085] 发明人已经令人惊讶地发现，当在包含有机溶剂的溶液中执行步骤(1)和(2)中的活化和偶联反应二者时，可以显著地增加在羧酸酯化的载体上固定化的胺化的寡核苷酸的收率。

[0086] 因此，根据不同的实施方案，本发明提供了一种用于将核酸偶联至载体的方法，所述方法包括：

[0087] (a)提供载体，所述载体在其上包含羧酸基团，

[0088] (b)提供核酸，其中所述核酸包含至少一个伯胺官能团，

[0089] (c)通过使在载体上的羧酸基团与碳二亚胺或其衍生物接触以形成反应性酸酐来活化所述载体，

[0090] (d)使所述活化的载体上的反应性酸酐与所述核酸的至少一个伯胺官能团反应以形成共价酰胺键，由此将所述核酸偶联至所述载体，

[0091] 其中在有机溶剂存在下进行步骤(c)和(d)。

[0092] 如在实施例1中描述和在图2和3中图示的数据所支持的，与其中在水性相中执行活化和偶联反应的标准方法相比，该改进的程序导致与示例性的羧酸官能化的载体偶联的核酸的多达约3倍增加的收率。此外，已经观察到，在有机溶剂存在下，减少了非特异性偶联事件(图2A和3A)。不希望受任何理论约束，申请人相信有机溶剂的低极性(与水相比)会影响核酸的折叠性能或构象并减少二级结构的量，其可能提供伯氨基基团(其连接至核酸，用于与活化的载体相互作用)的更好可达性。其次，不希望受任何理论约束，如果存在的话，胺化的核酸的脂族间隔链可能通过与非质子溶剂的相互作用变得更暴露。第三，有机溶剂阻止O-酰基异脲中间体(其在水性溶剂中是不稳定的)水解以保持羧酸基团处于活化的状态，由此有利于胺化的核酸偶联至官能化的载体。总之，这些效应中的一种或多种可能促进：(i)更高的总偶联率，和(ii)相对于偶联至碱基的氨基官能团的非特异性，核酸经由它们的伯胺官能团的优选偶联。并且，由于增加的偶联效率，有效偶联需要更少的核酸(图2B和
3B)。

[0093] 根据不同实施方案的有机溶剂是可与水混溶的。在某些情况下，有机溶剂可以是疏水的。在某些实施方案中，有机溶剂可以是非质子的极性溶剂。有机溶剂可以选自二甲基亚砜(DMSO、C2H6SO)、二甲基甲酰胺(DMF、C3H7NO)、四甲基脲、甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙酮(C3H6O)、非质子的乙二醇二醚诸如双(2-甲氧基乙基)醚(也被称作二甘醇二甲醚)或(双(甲氧基丙基)醚(也被称作ProglydeTM)、乙酰胺、二乙基亚砜(DESO)或其任意混合物。在某些实施方案中，有机溶剂可以是二甲基亚砜。DMSO是一种无毒的有机溶剂且因此是特别用户友好的。

[0094] 在某些实施方案中，在活化过程中存在的有机溶剂的浓度是至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在某些实施方案中，在活化过程中存在的有机溶剂的浓度小于100％。在某些实施方案中，在活化过程中存在的有机溶剂的浓度是在约50％至约100％的范围内，例如约90％。在某些实施方案中，在活化过程中存在的有机溶剂的浓度是至少约50％且不超过约95％，优选地不超过约90％。
在某些实施方案中，在偶联过程中存在的有机溶剂的浓度是至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的有机溶剂的浓度小于100％。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的有机溶剂的浓度是在约50％至约100％的范围内，例如约90％。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的有机溶剂的浓度是至少约50％且不超过约95％，优选地不超过约90％。在某些实施方案中，在活化和/或偶联过程中存在的水或水性组分的浓度不超过20％，优选地不超过
10％。因而，在某些实施方案中，在有水或水性缓冲液存在下进行本发明的方法的步骤(c)和/或步骤(d)，其中水或水性缓冲液的浓度是每总体积小于20％，优选地小于10％。

[0095] 在某些实施方案中，在有机溶剂和水或水性组分存在下进行活化和/或偶联，其中在最终的反应混合物中有机溶剂与水的比率在约1:1至约9:1(体积份)之间。在某些实施方案中，在最终的反应混合物中有机溶剂与水的比率是至少约9:1。在某些实施方案中，考虑到要偶联的核酸的长度，可以调节活化和/或偶联溶液的水含量，因为较长的核酸可能需要较高量的水以保持可溶性于有机溶剂中。例如，约20个碱基的较短寡核苷酸可能可溶于仅含有约1％的水的几乎无水的溶液中。在这样的情况下，活化和/或偶联溶液的水含量可以是至少1％。因此，在活化和/或偶联溶液中的有机溶剂的含量可以是至少约90％且小于100％。在某些情况下，要求的水含量可能取决于使用的具体有机溶剂。

[0096] 在一个优选的实施方案中，在盐存在下进行活化步骤(c)和/或偶联步骤(d)。发明人已经令人惊讶地发现，在没有盐存在下，可能发生更多的非特异性偶联(即核酸与载体的结合，其中这样的结合不是由末端反应性胺官能团介导)，如分别在实施例4和图5和6中所述。因此，盐向反应混合物的添加可能增加特定核酸与活化的载体偶联的效率。盐优选地在有机溶剂中是高可溶性的。盐可以是无机或有机盐。在某些实施方案中，盐可以是LiCl或NaCl。在某些情况下，盐可以不包括铵盐。

[0097] 在活化和/或偶联反应过程中存在的盐的最佳量可能取决于多种因素，包括在有机溶剂中的溶解度、沉淀核酸的能力等。例如，盐的量可能足够高以减少非特异性偶联，但是可能足够低以避免核酸的沉淀或团集。在某些实施方案中，在活化过程中存在的盐的浓度是至少约0.1M。在某些实施方案中，在活化过程中存在的盐的浓度小于约1M，或小于约0.9M。在某些实施方案中，在活化过程中存在的盐的浓度是在约0.2M至约0.8M的优选范围内，例如约0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或在所述优选范围内的任何值。在某些实施方案中，在活化过程中存在的盐的浓度是不小于约0.2M且不超过约0.8M。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的盐的浓度是至少约0.1M。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的盐的浓度小于约1M，或小于约0.9M。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的盐的浓度是在约0.2M至约0.8M的优选范围内，例如约0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或在所述优选范围内的任何值。在某些实施方案中，在偶联过程中存在的盐的浓度是不小于约
0.2M且不超过约0.8M。在某些实施方案中，盐可以在活化和偶联过程中以约相等的浓度存在。例如，盐可以在活化和偶联过程中以约0.75M的浓度存在。

[0098] 在某些实施方案中，加入反应中以支持有效偶联的盐的量可能取决于反应溶液的有机溶剂含量。

[0099] 在某些实施方案中，在用于活化步骤(c)中之前，即在使盐与载体接触之前，可以将所述盐溶解在有机溶剂中。例如，在使盐溶液与载体和任选的核酸混合之前，可以将所述盐溶解在有机溶剂(诸如DMSO)中。在某些实施方案中，在用于活化步骤(c)和/或偶联步骤(d)中之前，即在使核酸与载体接触之前，可以将所述核酸溶解在有机溶剂中。例如，在使核酸溶液与载体和任选的盐混合之前，可以将所述核酸溶解在有机溶剂(诸如DMSO)中。在某些实施方案中，在用于活化和/或偶联中之前，可以将盐和核酸二者一起溶解在有机溶剂中。

[0100] 在某些实施方案中，在使载体与盐和/或核酸接触之前，可以将载体溶解在有机溶剂中、与有机溶剂混合、用有机溶剂覆盖或与有机溶剂接触。在某些实施方案中，在与有机溶剂混合或接触之前，用NaOH和/或适当的缓冲液或水洗涤载体。例如，可以将载体用NaOH溶液洗涤一次或几次，并任选地用“反渗透”(RO)(即经纯化的、去离子的)水洗涤一次或几次。为了例证的目的，可以将载体例如用10mM NaOH溶液洗涤2次，并随后用RO-水洗涤2-4次。已知用于官能化的载体的不同洗涤方法可以用于除去水性缓冲液或痕量的水或其它污染物(诸如RNA酶等)，它们否则可能干扰偶联反应。

[0101] 在某些实施方案中，用于活化载体的碳二亚胺或其衍生物可以是水溶性的碳二亚胺。在某些情况下，碳二亚胺可以是1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺，其也被称作EDC、EDAC、EDCI、EDC盐酸盐、WSC盐酸盐或可替换地称作N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。在某些情况下，碳二亚胺可以是N,N′-二环己基碳二亚胺，也被称作DCC。在其它情况下，碳二亚胺可以是N,N’-二异丙基碳二亚胺，也被称作DIC。在不同的方面，在用于活化步骤中之前将水溶性的碳二亚胺或其衍生物溶解在水性缓冲液或水中。水性缓冲液可以是例如2-吗啉代乙磺酸(同义词包括2-(4-吗啉代)乙磺酸；2-(N-吗啉代)乙磺酸MES水合物；和吗啉-4-乙磺酸水合物)缓冲液，广泛地称作“MES”缓冲液。在某些情况下，水性缓冲液可以具有在约4.5至约7之间的pH。在某些情况下，水性缓冲液可以具有高于4.5且低于7的pH。在某些情况下，水性缓冲液可以具有在约5.0至约7之间的pH。在某些情况下，水性缓冲液可以具有约5.0、5.5、6.0、6.5或7的pH。优选地将碳二亚胺或其衍生物溶解于水性缓冲液中，然后立即用在活化步骤(c)中。作为例证，也可能通过EDC和NHS的组合使用活化方法。例如，可以将水溶性的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺加入活化的载体中。由N-羟基化合物形成的活性酯中间体将替代由碳二亚胺形成的不稳定的O-酰基异脲中间体，且对水解更稳定，并且仍然对于后续偶联反应而言是反应性的。在某些实施方案中，所述碳二亚胺或其衍生物(诸如DCC或DIC)可溶于有机溶剂中，并可以在用在活化步骤中之前溶解在有机溶剂中。

[0102] 在某些实施方案中，在约4.5至约7.0之间的pH执行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在约4.7至约6.7之间的pH执行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在高于4.5的pH执行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在低于7.0的pH执行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在约4.5至约7.0之间的pH执行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在约4.7至约6.7之间的pH执行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在高于4.5的pH执行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在低于7.0的pH执行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在相等pH执行活化步骤(c)和偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在约4.7至约6.7之间的pH执行活化步骤(c)和偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在约6.7的pH执行活化步骤(c)和偶联步骤(d)。

[0103] 在某些实施方案中，在约4℃至约30℃之间的温度进行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在至少约4℃的温度进行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在小于30℃的温度进行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在室温进行活化步骤(c)。在某些实施方案中，在约4℃至约30℃之间的温度进行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在至少约4℃的温度进行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在小于30℃的温度进行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在室温进行偶联步骤(d)。在某些实施方案中，在室温进行活化和偶联二者。本文中使用的术语“室温”是指在典型实验室条件下的环境温度，其典型地在约20℃至约25℃之间。因此室温(或如在实施例中使用的“RT”)可以表示温度范围或在该范围内的具体温度值，例如20℃、21℃或25℃。在某些情况下,室温等于25℃。

[0104] 在某些实施方案中，与所述偶联独立地进行所述活化。这可以如下实现：在活化反应结束以后，将核酸加给载体。在某些实施方案中，当活化仍然在进行中时已经开始偶联。这可以如下实现：在加入碳二亚胺之前，将核酸和羧酸酯载体混合。在反应性中间体不稳定的情况下，可能优选的是，在通过加入碳二亚胺或其衍生物开始活化反应之前混合核酸和载体。

[0105] 在某些实施方案中，允许偶联反应进行至少3小时，优选地至少6小时，更优选地至少10小时。在某些实施方案中，允许偶联反应进行至少14-18小时以完成偶联反应。

[0106] 在某些实施方案中，可以将偶联效率定义为经由酰胺键键合至核酸的载体上的羧酸基团的百分比。在某些实施方案中，可以将偶联效率定义为在偶联反应过程中提供的输入核酸的百分比，所述输入核酸共价地结合至载体上的活化的羧酸基团。例如，根据不同实施方案核酸经由酰胺键偶联至的固体载体可以表现出约50至约800pmol/mg载体的核酸密度。在某些实施方案中，所述偶联效率是至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约50％。在某些情况下，偶联效率可以是在约5％至约20％之间，在约10％至约50％之间，在约50％至约90％之间，例如约50％、约60％、约70％、约80％或约
90％。

[0107] 通过多种方式可以确定将核酸偶联至载体的效率。例如，通过在偶联反应之前和之后测量偶联溶液的吸光度的变化。一个经常用于确定固体载体上的寡核苷酸的偶联效率的试验是在图4中所示的杂交测定。在图4的第一个偶联步骤(1.)中，将寡核苷酸(例如寡(dT)25)偶联至载体(例如由黑色球表示的珠)。在随后的杂交步骤(2.)中，将寡聚物包被的载体与以下试剂组合：(a)互补寡核苷酸(在该实施例中，寡(dA)25)，(b)随机序列且相等长度的非互补寡核苷酸，或(c)无寡核苷酸。在一个或多个洗涤步骤(3.)以后，将杂交的寡核苷酸洗脱(4.)，并测量来自样品(a)、(b)和(c)的洗脱的寡核苷酸的量，以确定载体偶联的寡(dT)25(来自样品a)的量、在杂交过程中的非特异性结合水平(来自样品b)和用于校正的背景信号(来自样品c)。根据不同实施方案可以使用这样的杂交测定以评估加载核酸的载体对于用在特定应用中的适合性。也可以使用其它方法来确定固定化在固体载体上的核酸的量。例如，可以使偶联的核酸与染料标记的探针杂交或用仅在结合核酸分子后发荧光的染料(例如荧光团诸如Quant-iTTM OliGreenTM)标记，并可以将测得的信号(例如在给定波长的荧光强度)与参考值对比，如例如在WO 2017/100283A1中所述。

[0108] 本发明的方法可以进一步包括步骤(e)：将步骤(d)的偶联溶液与载体分离以及洗涤所述载体。通过文献中已知的任何方式可以除去溶液。例如，通过倾析、吸量、抽吸等可以除去溶液。在载体包含磁性材料的情况下，可以在已经将磁性载体固定化在磁体上以后除去溶液。可替换地，通过使用磁体，例如磁性移液器尖头，可以从溶液除去磁性载体。在从偶联溶液分离载体以后，可以将载体洗涤一次或几次。这样的洗涤可以用水性溶液(例如水性缓冲液或水)执行。然后可以根据下游应用将包含偶联的核酸的载体储存在水或适当的缓冲液中用于进一步使用。

[0109] 可以将包含偶联的核酸的载体进一步处理以除去可能干扰下游应用的痕量污染物。例如，通过用含有去污剂的溶液(例如包含0.1％吐温的Tris缓冲液)洗涤载体，可以除去试剂，诸如缓冲液组分、有机溶剂或盐。通过加入NaOH溶液(在单独的洗涤步骤中或与去污剂一起)，可以将具有酶活性的组分(诸如RNA酶)除去或灭活。此外，可以对包含偶联的核酸的固体载体进行加热步骤以将非特异性地或非共价地连接至载体(例如经由对偶联的核酸分子的结合或杂交)的任何核酸除去或变性。因而，载体的洗涤和/或加热可能可用于除去污染物以及非特异性地结合的核酸分子。另外，这样的处理可能破坏偶联的核酸的二级结构和发夹结构以增加在随后的基于杂交的测定中的结合效率。

[0110] 因而，本发明的方法可以进一步包括步骤(f)：洗涤和/或加热载体。在一个示例性实施方案中，步骤(f)可以包括使载体与包含NaOH和/或去污剂的溶液接触。任选的加热步骤可以是一个单独步骤(在洗涤之前或之后执行)，或可以在洗涤步骤过程中执行或与洗涤步骤组合。例如，可以将载体加热至至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约70℃。更一般而言，可以将载体加热至反映偶联的核酸分子的具体解链温度(Tm)的温度。可以将载体加热至少约2min、至少约5min、至少约10min或至少约20min。

[0111] 根据不同实施方案要偶联至载体的核酸(例如寡核苷酸)的长度可以随载体的结构/大小或化学性质和/或负载的载体的后续用途而变化。在某些情况下，寡核苷酸可以具有至少约5、10、15、20或25个核苷酸的长度。在将负载的载体用在杂交测定中的情况下，偶联的核酸的长度应当足以允许互补核酸分子的有效杂交。本文中使用的术语“互补的”或“互补性”表示在允许的盐和温度条件下通过碱基配对实现的核酸(引物、探针、寡核苷酸等)的天然结合。例如，序列“5’-A-G-T-3’”结合互补序列“3’-T-C-A-5’”。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，使得核酸中的仅一些结合，或它可以是“完全的”，使得总互补性存在于单链分子之间。核酸之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。这在杂交反应中是特别重要的，其取决于核酸链之间的结合。寡核苷酸和靶核酸之间的互补性区域越长，它们之间的相互作用越强。但是，超过某个长度的寡核苷酸可能粘在一起或形成二级结构由此在载体上产生位阻，这可能影响结合效率。因而，载体结合的寡核苷酸对于杂交或配体结合测定的最佳长度可以是在约10至50个核苷酸之间，优选地在约15至30个核苷酸之间。也可以考虑到在载体上的官能团的数目或密度来调节核酸的最佳长度以确保核酸分子在载体上的最佳分布。此外，可以有效地偶联至官能化的载体的核酸的长度也可能取决于核酸在有机溶剂中的溶解度。例如，具有多达30个碱基的单链DNA寡核苷酸可能比具有50个或更多个碱基的寡核苷酸更可溶于某些有机溶剂。

[0112] 本发明进一步提供了一种组合物，其包含：

[0113] 在其上包含(活化的)羧酸基团的载体，

[0114] 包含至少一个伯胺官能团的核酸，和

[0115] 有机溶剂。

[0116] 这样的组合物可以用于将胺化的核酸以高效率偶联至羧酸酯载体。

[0117] 本发明进一步提供了一种组合物，其包含：

[0118] 在其上包含羧酸基团的载体，其中至少所述羧酸基团的第一部分被反应性酸酐修饰且至少所述羧酸基团的第二部分经由羰基-酰胺键键合至核酸，有机溶剂，和任选的异脲副产物。

[0119] 所述组合物可以进一步包含在溶液中的具有至少一个伯胺官能团的核酸。所述组合物可以进一步包含碳二亚胺或其衍生物。

[0120] 本发明进一步提供了一种组合物，其包含：

[0121] 在其上包含羧酸基团的载体，所述羧酸基团经由羰基-酰胺键键合至核酸，和有机溶剂，

[0122] 其中所述载体是具有约40至约1,000pmol/mg载体之间、或约50至约800pmol/mg载体之间的核酸偶联密度的珠。

[0123] 根据不同的实施方案，所述组合物可以进一步包含盐。所述盐可以属于在本发明的方法的上下文中在上面描述的任何类型和浓度。所述盐可以是例如LiCl或NaCl且以约0.2至0.8M之间的浓度存在。所述组合物可以具有在约4.5至8.0之间的pH。在某些实施方案中，所述组合物不包含NHS化合物。在某些实施方案中，所述组合物不包含聚丙烯酸。

[0124] 可供偶联的官能团的量取决于载体的类型。在某些情况下，在固体或半固体载体上的羧酸基团的最初密度可以是在5μmol/ml至25μmol/ml载体之间。

[0125] 为了例证的目的，在微粒载体(例如珠)上的官能团的数目可以是在约100至约1,000nmol/mg之间，例如在约140至280nmol/mg之间或在约400至800ng/mg之间。基于在这样的固体载体上的官能团的数目，在偶联以后参与与核酸分子的共价结合的羧酸基团的数目可能在约0.08至0.16％之间变化。假定例如要将5nmol的核酸加入反应中，偶联密度可以是在约0.6至约3.6％之间，取决于载体的类型和在载体表面处的官能团的数目。

[0126] 因而，根据本发明的偶联方法，可能衍生化至少0.1％的最初存在于固体载体表面处的羧酸官能团，有利地至少0.2％、更好地至少1％和甚至更好地至少2％的所述羧酸基团。在某些实施方案中，在经由羰基-酰胺键键合至核酸的载体上的羧酸基团的百分比是至少0.1％、至少0.5％、至少5％、至少10％或至少20％。可以被核酸分子占据的羧酸基团的百分比也取决于典型地用于偶联反应的核酸的量或浓度。例如，在偶联反应过程中的核酸浓度可以是在约10至约10,000pmol/mg载体或约50至约5,000pmol/mg载体的范围内。

[0127] 此外，在本发明的方法的上下文中在上面关于载体、碳二亚胺或其衍生物、核酸和有机溶剂(单独地或组合地)描述的任何实施方案或特征同样适用于本发明的组合物。

[0128] 根据不同实施方案的组合物可以进一步包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的浓度的有机溶剂。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂的浓度小于100％。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂的浓度是在约50％至约100％的范围内，例如约90％。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂的浓度是至少约50％且不超过约95％，优选地不超过约90％。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂的含量是至少约90％且小于100％。在某些实施方案中，所述组合物包含有机溶剂和水或水性组分。在某些实施方案中，所述组合物中的水或水性组分的浓度不超过20％，优选地不超过10％。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂与水的比率是约1:1至约9:1(体积份)。在某些实施方案中，所述组合物中的有机溶剂与水的比率是至少约9:1。在某些实施方案中，考虑到要偶联的核酸的长度可以调节所述组合物的水含量，因为较长的核酸可能要求较高量的水以保持可溶于有机溶剂中。例如，在存在约20个碱基的核酸时，所述组合物的水含量可以是约1％。在某些情况下，需要的水含量可能取决于使用的具体有机溶剂。

[0129] 作为例证，一种示例性的组合物可以包含(任选地磁性)颗粒作为固体载体，其中所述颗粒被羧酸基团官能化。所述组合物可以进一步包含带有5’或3’伯胺官能团的单链DNA寡核苷酸。所述寡核苷酸可以具有约15至约30个碱基的长度。所述组合物可以进一步包含DMSO作为有机溶剂。所述组合物可以进一步包含约0.2至0.8M之间的浓度的LiCl或NaCl作为盐。所述组合物可以具有约6.0至7.0之间的pH。所述组合物可以进一步包含EDC用于活化羧酸基团。所述组合物可以进一步包含多达约10％的水含量。

[0130] 本发明进一步提供了一种用于将核酸偶联至固体载体的试剂盒，其包含：

[0131] 在其上包含羧酸基团的载体，

[0132] 有机溶剂，

[0133] 碳二亚胺或其衍生物，

[0134] 和任选的核酸。

[0135] 根据不同实施方案的试剂盒可以进一步包含盐。所述盐可以属于在本发明的方法和组合物的上下文中在上面描述的任何类型和浓度。可以将所述盐作为粉末或在溶液中(例如以缓冲液的形式)提供。在某些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含核酸。所述核酸可以包含至少一个伯胺官能团或可以与如上所述的氨基修饰物一起提供。与试剂盒一起提供或被包含在根据不同实施方案的组合物中的核酸可以进一步用上面描述的任何标记进行标记。在某些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含用于溶解碳二亚胺或其衍生物的缓冲液。这样的缓冲液可以是水性缓冲液，例如MES缓冲液。所述试剂盒可以进一步包含随机寡核苷酸用于在杂交测定中用作对照。在某些实施方案中，所述载体可以是磁性颗粒或珠。

[0136] 此外，在方法和/或组合物的上下文中在上面关于载体、碳二亚胺或其衍生物、核酸和有机溶剂描述的任何实施方案可以同样适用于本发明的试剂盒。例如，使用上述的活化和偶联程序中的任一种，可以使用本发明的试剂盒将胺化的核酸偶联至羧酸酯化的载体。

[0137] 本发明进一步涉及本文描述的方法、组合物和试剂盒用于多种应用的用途。设计了越来越多数目的应用或体外测定以允许用固定化在固体载体上的核酸从不同样品类型特异性地捕获靶标(诸如核酸或肽)。本文描述的加载核酸的载体可以用于多种应用，包括微阵列、杂交测定、生物和/或亲和分离、磁性分离，用于用在液体阵列中或用作仪器标准品等。例如，根据不同实施方案得到的固定化的寡核苷酸的阵列可以用于杂交测序和基于阵列的基因表达分析。具体地，基于寡核苷酸的DNA微阵列正在变成对于基因表达和单核苷酸多态性(SNP)的分析而言越来越有用的工具。此外，通过本发明的方法、组合物和试剂盒得到的加载核酸的珠可以用于超高灵敏度应用诸如生物条形码测定，如在例如Hill和Mirkin(Nat.Protoc.1,324-36,2006)中所述。其它应用包括mRNA的捕获或纯化(例如用于后续治疗用途)。例如使用本发明的方法可以将寡(dT)偶联至固体载体诸如珠。然后可以使用寡(dT)载体从样品或混合物特异性地分离聚腺苷酸化的mRNA分子。本发明将促成使这样的测定更灵敏和特异性且因而更有效。

[0138] 实施例

[0139] 实施例1:氨基修饰的寡核苷酸向羧酸珠的偶联

[0140] 用来自Thermo Fisher Scientific的DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid和DynabeadsTM MyOneTM Carboxylic Acid进行偶联。将珠彻底悬浮于管形瓶中，并将各自对应于1mg珠的体积转移至0.5mL试管。将珠用100μL的10mM NaOH洗涤2次，并在好混合下温育5分钟。将珠固定化至DynaMagTM-2磁体(Thermo Fisher Scientific)2分钟并除去上清液。
将珠用RO-水和用DMSO(Sigma Aldrich)洗涤4次，然后将珠应用于磁体2分钟并除去上清液。将18.2μL的0.75M LiCl溶解在DMSO中，并将71.1μL的DMSO加入珠样品，并给每个样品提供0.7μL(1nmol/μL)的5’氨基C6修饰的寡核苷酸(dT)25(Thermo Fisher Scientific)或作为阴性对照的未修饰的寡核苷酸(dT)25(Thermo Fisher Scientific)。两种寡核苷酸作为在DMSO中的1mM储备溶液提供。将包含珠、寡核苷酸和盐的混合物涡旋，声处理1min并在滚筒混合器上在室温温育30min。在即将使用之前，将15mg EDC(Thermo Fisher Scientific)溶解在100μl MES缓冲液(100mM,pH 6.0)中并将10μL加入珠样品。将样品混合并在滚筒上在室温温育过夜。将溶液从珠除去并将珠用200μL水洗涤。然后将珠重新悬浮在100μL的
10mM NaOH中并加热至70℃保持20分钟以消除残余的RNA酶活性和减少寡核苷酸的非特异性偶联。将NaOH溶液除去，并将珠用200μL水洗涤2次。将珠重新悬浮于100μL的50mM Tris缓冲液pH 7.4、0.1％吐温-20中并在70℃加热10分钟。然后将珠用200μL的50mM Tris缓冲液pH 7.4、0.1％吐温-20洗涤另外2次。最后，将珠在4℃储存在100μL的50mM Tris缓冲液pH
7.4中，产生10mg/mL的珠浓度。用水性缓冲液(例如25mM MES缓冲液pH 5.0或100mM MES缓冲液pH 4.8)替代DMSO在类似的条件下执行平行偶联程序(在本文中被称作“标准程序”)。

[0141] 图2A显示了DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid的偶联产率，图3A显示了DynabeadsTM MyOne Carboxylic Acid的偶联产率，其使用在实施例2和图4中描述的杂交测定来确定。将互补寡核苷酸(黑色条)或具有随机碱基组成的非互补寡核苷酸(白色条)用于与固定化的寡核苷酸的后续杂交。数据指示，当在有机溶剂(而不是纯水性相)存在下偶联胺化的寡核苷酸(用“+”指示，与此相比，用“-”指示用作阴性对照的未修饰的寡核苷酸)时，TM固定化的核酸的产率分别增加了约3倍(对于Dynabeads M-270 Carboxylic Acid)和约
1.8倍(对于DynabeadsTM MyOne Carboxylic Acid)(对比具有胺化的寡核苷酸的样品的黑色条)。通过将偶联产率(由杂交的互补寡核苷酸的量反映)用偶联所用的寡核苷酸的量归一化，计算偶联效率百分比。用两种不同程序实现的偶联效率分别显示在图2B和3B中。

[0142] 此外，对于DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid(“M-270”)和DynabeadsTM MyOne Carboxylic Acid(“MyOne”)而言，当在有机溶剂中进行偶联时，特异性结合相对于非特异性结合的比率增加，如在表1中所总结的。

[0143] 表1:偶联产率和效率

[0144]

[0145]

[0146] 实施例2：杂交测定

[0147] 使用在图4中解释的杂交测定，间接地确定胺化的寡核苷酸与羧酸固体载体的偶联效率。为此目的，将10mg/mL的加载了寡(dT)25(SEQ ID NO:1)的DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid在滚筒/旋转器上在室温混合20分钟，并将20μL的加载了寡(dT)的珠分配进3个具有螺旋帽的1.5mL微管中。加入200μL的杂交缓冲液(0.9M NaCl,60mM磷酸钠缓冲液pH 7.4,6mM EDTA)以后，将样品涡旋，在滚筒上放置5分钟，并在磁体(DynaMagTM-2；Thermo Fisher Scientific)上放置30秒。抽吸以后，抛弃上清液，将200μL新鲜杂交缓冲液加入每个试管并将珠通过脉冲涡旋进行重新悬浮。然后给第一个珠样品提供10μL互补的寡(dA)25(SEQ ID NO:2)(图4，小图(a))，给第二个样品提供10μL随机寡核苷酸(SEQ ID NO:3)(图4，小图(b))，并给第三个样品提供10μL仅缓冲液(图4，小图(c))。然后将样品在滚筒上在室温放置10分钟以允许杂交发生。除去上清液以后，加入200μL洗涤缓冲液(含有0.1％吐温-20的杂交缓冲液)，并将样品脉冲涡旋直到珠完全重新悬浮，随后在滚筒上温育5分钟。将洗涤步骤重复2次，然后将试管在磁体上放置30秒，并小心地除去上清液。为了洗脱杂交的寡聚物，将20μL的TE缓冲液(10mM Tris缓冲液pH 8.0,1mM EDTA)加入所有试管，并将样品脉冲涡旋以完全重新悬浮珠。然后将样品在加热块上在80℃温育5分钟，然后将它们快速地旋转并在磁体上放置5-10秒直到所有珠收集在磁体处。然后将洗脱液快速地转移进新鲜的1.5mL微管以避免重新杂交。为了确定洗脱的寡核苷酸的浓度，在NanodropTM ND-1000(Thermo Fisher Scientific)上用2μL洗脱液在260nm测量每个样品的吸光度3次。将样品(c)(阴性对照)的吸光度的测量结果用于背景校正。洗脱的互补寡聚物的量反映了共价地偶联至珠的寡核苷酸的产率，而洗脱的随机寡聚物的量指示了与共价地偶联的寡核苷酸的非特异性杂交。然后通过将偶联产率用偶联所用的寡核苷酸的量归一化，计算偶联效率。

[0148] 关于替代读出，将10μL的每种洗脱液分别转移至新鲜试管。将590μL的TE缓冲液加至600μL的总体积并将样品彻底混合。对于标准曲线，分别从互补和随机寡核苷酸制备在TE缓冲液中的从0.0至1,562.5ng/mL(0、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5、312.5和1,562.5ng/mL)的一系列稀释液。将100μL的洗脱液稀释液和标准样品分别各自分配进96-孔板的3个孔中。制备Quant-iTTM OliGreenTM ssDNA试剂(Thermo Fisher Scientific)在TE缓冲液中的1:200稀释液，并将100μL该溶液分配进每个孔中。然后使用微量培养板读数器(BioTek Instruments Inc)测量每个孔中的荧光。

[0149] 实施例3：盐和有机溶剂的量对偶联产率和非特异性结合的影响

[0150] 使用在实施例2中描述的杂交测定，确定盐和有机溶剂的量对偶联产率和核酸与羧酸酯官能化的固体载体的非特异性结合的影响。

[0151] 在第一个实验中，在有或没有0.2M LiCl存在下(图5A，分别左图和右图)或在有或没有0.2M NaCl存在下(图5B，分别左图和右图)将DynabeadsTM MyOne Carboxylic Acid珠(Thermo Fisher Scientific)偶联至寡(dT)25。使用胺化的寡核苷酸(在图5A和B中分别用“+”指示)或不带有末端NH2基团的未修饰的寡核苷酸(用“-”指示“)，在有50％DMSO(图5A)或90％DMSO(图5B)存在下进行偶联反应。

[0152] 数据表明，在没有盐存在下，(i)更多的核酸(胺化的以及未修饰的寡核苷酸)偶联至载体(将图5A和B的第三和第四列分别与第一和第二列对比)，并且(ii)使用较高量的有机溶剂，两种类型的寡核苷酸的偶联产率增加(分别对比图5A和B的第三和第四列)。此外，数据指示，(iii)与特异性偶联相比，盐的添加对非特异性偶联具有更强烈的影响(对比分别在有或没有盐存在下“-”和“+”图之间的产率差异)。

[0153] 在第二个实验中，在没有(图6A)或有(图6B)0.2M NaCl存在下，将DynabeadsTM MyOne Carboxylic Acid珠(Thermo Fisher Scientific)偶联至3种不同的寡核苷酸序列。使用胺化的寡核苷酸(在图6A和B中用“+”指示)或不带有末端NH2基团的未修饰的寡核苷酸(用“-”指示“)，在有50％DMSO(图6A和B，左图)或90％DMSO(图6A和B，右图)存在下进行偶联反应。评估了3种具有不同碱基组成具有等量的A、T、G和C的(寡(dN)，富含A和T的寡(dA)，和富含G和C的寡(dGC))的示例性寡核苷酸：

[0154] 寡(dN):5’-TCATGATCCGGTGTACGGCACTAAC-3’(SEQ ID NO:4)；

[0155] 寡(dAT):5’-TCATAATCTAATGTAATGTACTAAC-3’(SEQ ID NO:5)；

[0156] 寡(dGC):5’-CCATGCCCTGGTGGACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO:6)。

[0157] 数据表明，在有盐和50％DMSO存在下，减少了非特异性和特异性偶联(分别对比图6A和B的左图之间的产率的差异)。当在盐存在下使有机溶剂的量进一步增加至90％时，对于所有试验的寡核苷酸观察到特异性偶联的增加，而非特异性偶联进一步减少(对比图6B的左图和右图的“-”和“+”样品之间的产率的差异)。

[0158] 总之，这些数据表明，在偶联反应过程中盐的添加能够进一步减少非特异性结合，并且在偶联过程中存在的有机溶剂的量可以调节总结合产率。

[0159] 尽管在本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会明白，这样的实施方案仅作为示例提供。现在本领域技术人员会做出众多变体、变化和置换而不脱离本发明。应当理解，本文描述的发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。以下权利要求意图限定本发明的范围，并且由此覆盖在这些权利要求和它们的等同方案的范围内的方法和结构。

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用于将核酸偶联至官能化的载体的方法和组合物

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