荧光纳米探针及其制备方法
阅读：5发布：2020-05-13
专利汇可以提供荧光纳米探针及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 荧光 纳米探针 ，包括聚乙交酯丙交酯形成的 内核 、环绕所述内核表面的磷脂形成的 中间层 及部分穿插于所述中间层的含 氨 基或羧基的二硬脂酰磷脂酰 乙醇 胺-聚乙二醇形成的 外壳 ，其中，所述内核中分散有吲哚菁绿。通过形成 核壳结构 将吲哚菁绿包裹在聚乙交酯丙交酯中，可以有效避免吲哚菁绿发生聚集而分解， 稳定性 增强，包裹的吲哚菁绿具有 近红外 荧光特性，穿透组织的背景荧光较小，可以较为准确的应用于 生物 荧 光标 记。，下面是荧光纳米探针及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：混合吲哚菁绿溶液和聚乙交酯丙交酯溶液，得到吲哚菁绿与聚乙交酯丙交酯的混合溶液；
步骤二：提供磷脂及含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，制备磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液；
步骤三：将所述吲哚菁绿与聚乙交酯丙交酯的混合溶液逐滴加入至磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液中，在30～40℃的温度下搅拌反应2～
6小时，得到所述荧光纳米探针；
其中，所述步骤二中，所述制备磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液包括如下步骤：
配制体积比为8～10:1的氯仿甲醇混合溶剂，将所述磷脂溶于所述氯仿甲醇混合溶剂中，得到磷脂溶液；
将所述磷脂溶液及含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇加入至浓度为
2%～8%的乙醇水溶液中，加热至50～70℃，搅拌2～5分钟，得到所述磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液，其中，混合溶液中，磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的质量比为3～5:1。
2.如权利要求1所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述磷脂为大豆卵磷脂。
3.如权利要求1所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述吲哚菁绿溶液是浓度为0.5～2mg/mL的吲哚菁绿水溶液。
4.如权利要求1所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述聚乙交酯丙交酯溶液是浓度为1～5mg/mL的聚乙交酯丙交酯乙腈溶液。
5.如权利要求1所述的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述吲哚菁绿溶液与所述聚乙交酯丙交酯溶液按的体积比为1:5～20。
荧光纳米探针及其制备方法
【技术领域】
[0002] 吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)是一种被美国食品药品监督管理局批准的可用于临床诊断的近红外荧光染料，其在近红外光区具有特征吸收峰，可用于生物荧光标记领域。但ICG的稳定性较差，在极性溶剂中会迅速聚集并分解，且在光照环境下会加速分解。因此，科研人员为改善其稳定性使其能够用于荧光标记进行了大量的研究。如Kirchherr等(Kirchherr A K，Briel A，and Mader K.Stabilization of Indocyanine Green by Encapsulation within MIicellar Systems[J].Molecular pharmaceutics，2009，6(2)：480-491.)将ICG包裹在胶束体系中制备了在极性溶剂中低聚集、量子产率是原来3倍的ICG胶束，平均粒径为12nm，表面电位为-2.1mV；Mark Kester等(Kester M，Heakal Y，Fox T，et al.Calcium Phosphate Nanocomposite Particles for In Vitro Imaging and Encapsulated Chemotherapeutic Drug Delivery to Cancer Cells[J].Nano letters，2008，8(12)：4116-4121.)把ICG包埋在磷酸钙中制备了粒径在20-30nm范围内的纳米探针，该纳米颗粒在极性溶剂中的稳定性得到提高；Altinoglu等( E I，Russin T J，Kaiser J M，et al.Near-Infrared Emitting Fluorophore-Doped Calcium Phosphate Nanoparticles for In Vivo Imaging of Human Breast Cancer[J].ACS NANO，
2008，2(10)：2075-2084.)将ICG包埋在磷酸钙纳米颗粒中，制备了荧光性质相对稳定且对乳腺癌肿瘤细胞具有识别功能的近红外荧光探针，为肿瘤的早期诊断研究奠定了基础。但传统的基于ICG的荧光纳米探针，稳定性不高，且与生物体相容性不足。
【发明内容】
2008，2(10)：2075-2084.)将ICG包埋在磷酸钙纳米颗粒中，制备了荧光性质相对稳定且对乳腺癌肿瘤细胞具有识别功能的近红外荧光探针，为肿瘤的早期诊断研究奠定了基础。但传统的基于ICG的荧光纳米探针，稳定性不高，且与生物体相容性不足。
【发明内容】
[0003] 基于此，有必要提供一种稳定性较高、生物相容性较好的荧光纳米探针及其制备方法。
[0004] 一种荧光纳米探针，包括聚乙交酯丙交酯形成的内核、环绕所述内核表面的磷脂形成的中间层及部分穿插于所述中间层的含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇形成的外壳，其中，所述内核中分散有吲哚菁绿。
[0005] 优选的，所述磷脂为大豆卵磷脂。
[0006] 优选的，所述荧光纳米探针的直径为80～150nm。
[0007] 通过形成核壳结构将吲哚菁绿(ICG)包裹在聚乙交酯丙交酯(PLGA)中，可以有效避免ICG发生聚集而分解，稳定性增强，包裹的ICG具有近红外荧光特性，穿透组织的背景荧光较小，可以较为准确的应用于生物荧光标记。此外，磷脂环绕于聚乙交酯丙交酯表面形成亲水性单层结构能使探针避免免疫系统的识别，增强探针在系统内循环的半衰期；含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH)穿插于单层磷脂中提供PEG外壳，可以使得颗粒具备空间稳定性、静电稳定性以及长循环等特点；氨基或羧基易于交联抗体、肽、叶酸及其他探针等配体，从而使得颗粒具有靶向性；磷脂、DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)及PLGA有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，对生物体伤害小。
[0008] 一种荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤一：混合吲哚菁绿溶液和聚乙交酯丙交酯溶液，得到吲哚菁绿与聚乙交酯丙交酯的混合溶液；
[0010] 步骤二：提供磷脂及含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，制备磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液；
[0011] 步骤三：将所述吲哚菁绿与聚乙交酯丙交酯的混合溶液逐滴加入至磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液中，在30～40℃的温度下搅拌反应2～6小时，得到所述荧光纳米探针。
[0012] 优选的，所述磷脂为大豆卵磷脂。
[0013] 优选的，步骤一中，所述吲哚菁绿溶液是浓度为0.5～2mg/mL的吲哚菁绿水溶液。
[0014] 优选的，步骤一中，所述聚乙交酯丙交酯溶液是浓度为1～5mg/mL的聚乙交酯丙交酯乙腈溶液。
[0015] 优选的，步骤一中，所述吲哚菁绿溶液与所述聚乙交酯丙交酯溶液按的体积比为1∶5～20。
[0016] 优选的，步骤二中，所述制备磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液包括如下步骤：
[0017] 配制体积比为8～10∶1的氯仿甲醇混合溶剂，将所述磷脂溶于所述氯仿甲醇混合溶剂中，得到磷脂溶液；
[0018] 将所述磷脂溶液及含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇加入至浓度为2％～8％的乙醇水溶液中，加热至50～70℃，搅拌2～5分钟，得到所述磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的混合溶液，其中，混合溶液中，磷脂与含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的质量比为3～5∶1。
[0020] 图1为荧光纳米探针的结构示意图；
[0021] 图2为实施例1中的荧光纳米探针的透射电镜图片；
[0022] 图3为实施例1中的荧光纳米探针的粒度分布图；
[0023] 图4为实施例1中的荧光纳米探针的荧光光谱。【具体实施方式】
[0024] 下面主要结合附图及具体实施例对荧光纳米探针及其制备方法作进一步详细的说明。
[0025] 如图1所示，一实施方式的荧光纳米探针，具有核壳结构，包括吲哚菁绿(ICG)、聚乙交酯丙交酯(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)、磷脂及含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH)。其中，PLGA构成内核，磷脂环绕内核表面形成中间层，DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH部分穿插于中间层中形成外壳。ICG分散在内核中。
[0026] 磷脂优选但不限于生物相容性较好的大豆卵磷脂。
[0027] 羧基或氨基可以交联具有靶向作用的抗体，肽等，连上靶向基团后具有识别生物体内配体的靶向作用。
[0028] 本实施方式荧光纳米探针的直径为80～150nm。
[0029] 通过形成核壳结构将ICG包裹在PLGA中，可以有效避免ICG发生聚集而分解，稳定性增强，包裹的ICG具有近红外荧光特性，穿透组织的背景荧光较小，可以较为准确的应用于生物荧光标记。
[0030] 此外，磷脂环绕于PLGA表面形成亲水性单层结构能使探针避免免疫系统的识别，增强探针在系统内循环的半衰期；DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH穿插于单层磷脂中提供PEG外壳，可以使得颗粒具备空间稳定性、静电稳定性以及长循环等特点；氨基或羧基易于交联抗体、肽等配体，从而使得颗粒具有靶向性；磷脂、DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)及PLGA有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，对生物体伤害小。
[0031] 一种上述荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
[0032] 步骤S1：提供ICG及PLGA，分别制备ICG溶液及PLGA溶液，再将ICG溶液与PLGA溶液混合，得到ICG与PLGA的混合溶液。
[0033] 其中，ICG溶液优选浓度为0.5～2mg/mL的ICG水溶液。PLGA溶液优选浓度为1～5mg/mL的PLGA乙腈溶液。
[0034] 混合过程中，按照体积比1∶5～20的比例量取相应体积的ICG溶液与PLGA溶液混合。
[0035] 步 骤S2：提 供 磷 脂 及 DSPE-PEG-NH2( 或DSPE-PEG-COOH)，制 备 磷 脂 与DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)的混合溶液。具体包括如下步骤：
[0036] 将磷脂溶于体积比为8～10∶1的氯仿甲醇混合溶剂中，得到磷脂溶液；
[0037] 将磷脂溶液及DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)加入至浓度为2％～8％的乙醇水溶液中，加热至50～70℃，搅拌2～5分钟，得到磷脂与DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)的混合溶液，其中，混合溶液中，磷脂与DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)的质量比为3～5∶1。
[0038] 磷脂优选但不限于生物相容性较好的大豆卵磷脂。
[0039] 步骤S3：将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加入至磷脂与DSPE-PEG-NH2(或DSPE-PEG-COOH)的混合溶液中，30～40℃条件下搅拌反应2～6小时，得到核壳结构的荧光纳米探针。
[0040] 该制备方法简便易行，对设备要求低，便于操作推广。
[0041] 以下为具体实施例部分：
[0042] 以下实验用水为超纯水。
[0043] 实施例1：
[0044] (1)、分别制备浓度为1mg/mL的ICG水溶液及浓度为2mg/mL的PLGA乙腈溶液，取100μL ICG水溶液与1mL PLGA乙腈溶液超声混合，得到ICG与PLGA的混合溶液；
[0045] (2)、称取0.24mg大豆卵磷脂溶于体积比为9∶1的氯仿甲醇溶剂中，得到磷脂溶液，再称取0.06mg DSPE-PEG-COOH，将磷脂溶液与DSPE-PEG-COOH加入到3mL 4％乙醇水溶液中，加热至65℃并搅拌3min，得到磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液；
[0046] (3)、将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加至磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液中反应，35℃连续搅拌4h，期间允许溶剂挥发，即得平均直径为95.7nm的荧光纳米探针，如图2、图3(横轴：直径(Diameter)，左纵轴：微分密度(Differential Intensity)，右纵轴：累积密度(Cumulative Intensity))际。图4为该实施例荧光纳米探针的荧光光谱图，从图中可以看出该荧光纳米探针近红外光区(800nm附近)具有特征吸收峰，与单纯的ICG荧光光谱曲线基本相符，因此，该荧光纳米探针可以作为近红外荧光染料，应用于生物荧光标记领域。
[0047] 实施例2：
[0048] (1)、分别制备浓度为1mg/mL的ICG水溶液及浓度为2mg/mL的PLGA乙腈溶液，取50μL ICG水溶液与1mL PLGA乙腈溶液超声混合，得到ICG与PLGA的混合溶液；
[0049] (2)、称取0.24mg大豆卵磷脂溶于体积比为9∶1的氯仿甲醇溶剂中，得到磷脂溶液，再称取0.06mg DSPE-PEG-COOH，将磷脂溶液与DSPE-PEG-COOH加入到3mL 4％乙醇水溶液中，加热至65℃并搅拌3min，得到磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液；
[0050] (3)、将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加至磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液中反应，35℃连续搅拌4h，期间允许溶剂挥发，即得平均直径为84.8nm的荧光纳米探针。
[0051] 实施例3：
[0052] (1)、分别制备浓度为1mg/mL的ICG水溶液及浓度为2mg/mL的PLGA乙腈溶液，取200μL ICG水溶液与1mL PLGA乙腈溶液超声混合，得到ICG与PLGA的混合溶液；
[0053] (2)、称取0.24mg大豆卵磷脂溶于体积比为9∶1的氯仿甲醇溶剂中，得到磷脂溶液，再称取0.06mg DSPE-PEG-COOH，将磷脂溶液与DSPE-PEG-COOH加入到3mL 4％乙醇水溶液中，加热至65℃并搅拌3min，得到磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液；
[0054] (3)、将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加至磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液中反应，35℃连续搅拌4h，期间允许溶剂挥发，即得平均直径为102.3nm的荧光纳米探针。
[0055] 实施例4：
[0056] (1)、分别制备浓度为1mg/mL的ICG水溶液及浓度为1mg/mL的PLGA乙腈溶液，取100μL ICG水溶液与1mL PLGA乙腈溶液超声混合，得到ICG与PLGA的混合溶液；
[0057] (2)、称取0.24mg大豆卵磷脂溶于体积比为9∶1的氯仿甲醇溶剂中，得到磷脂溶液，再称取0.06mg DSPE-PEG-COOH，将磷脂溶液与DSPE-PEG-COOH加入到3mL 4％乙醇水溶液中，加热至65℃并搅拌3min，得到磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液；
[0058] (3)、将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加至磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液中反应，35℃连续搅拌4h，期间允许溶剂挥发，即得平均直径为99.6nm的荧光纳米探针。
[0059] 实施例5：
[0060] (1)、分别制备浓度为1mg/mL的ICG水溶液及浓度为5mg/mL的PLGA乙腈溶液，取100μL ICG水溶液与1mL PLGA乙腈溶液超声混合，得到ICG与PLGA的混合溶液；
[0061] (2)、称取0.24mg大豆卵磷脂溶于体积比为9∶1的氯仿甲醇溶剂中，得到磷脂溶液，再称取0.06mg DSPE-PEG-COOH，将磷脂溶液与DSPE-PEG-COOH加入到3mL 4％乙醇水溶液中，加热至65℃并搅拌3min，得到磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液；
[0062] (3)、将ICG与PLGA的混合溶液逐滴加至磷脂与DSPE-PEG-COOH的混合溶液中反应，35℃连续搅拌4h，期间允许溶剂挥发，即得平均直径为113.4nm的荧光纳米探针。
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