技术领域
[0001] 本
发明涉及纳米探针技术领域，特别是指一种成像用荧光纳米探针及其制备方法。
背景技术
[0002] 近年来，
近红外荧光成像成为国外前哨淋巴结活检的新技术和新趋势，有代替
放射性核素的应用前景。近红外荧光成像是利用
生物体组织在近红外(发射
波长650-1000nm)区域自体光吸收或荧光强度小、致密介质(如组织)的光散射低、激发光的穿透性强、自发荧光的背景干扰小等特点，能对生物体较深部组织进行有效成像的一种影像学新技术。近红外
荧光染料吲哚菁绿经美国食品和药物管理局批准可用于淋巴流和前哨淋巴结成像的临床实验。临床实验结果表明，近红外成像系统以低剂量(10-100μg)吲哚菁绿可以高效且准确的检出
乳腺癌和黑色素瘤患者的前哨淋巴结。然而由于吲哚菁绿缺乏反应基团，很难通过将其与其他材料接合，来增加其分子粒径大小，以此延迟成像维持时间。随着
纳米技术的成熟，多种
纳米粒子已被用于前哨淋巴结
定位研究，如
量子点、金纳米笼、近红外发光纳米胶
聚合物和超顺
磁性纳米粒子等，但均处于临床前研究阶段，且都有还未攻破的
缺陷，如潜在的生物毒性、昂贵的价格、不适合术中前哨淋巴结定位、制作工艺复杂等。
[0003] 由于
纳米级聚合物的灵活性和可调节性，近年来，该体系用于生物成像的研究受到研究者们的重视。纳米级聚合物包括共轭聚合物、纳米胶聚合物、纳米复合物、脂质体纳米聚合物等，可以选择不同的骨架物质(支链
淀粉、γ-谷
氨酸和磷脂等无毒物质)，通过在其内部或表面接上不同
显像剂来达到作为前哨淋巴结示踪剂所需的要求，也可为其接上多种显像剂用于多模式成像，但是现有的聚合物粒径都较大，大于50nm，不能即时成像SLN。虽然它们具有良好的生物兼容性，为低毒物质，但是掺杂入显像剂的它们很可能变成带有毒性的物质。
发明内容
[0004] 本发明提出一种成像用荧光纳米探针及其制备方法，该纳米探针用作SLN示踪剂，通过巯基化小分子葡聚糖，再接上疏
水的脱
氧胆酸，在水溶液里自组装成纳米级葡聚糖胶，通过化学反应引入荧光染料Cy7，该探针具有良好的
生物相容性、在SLN内长滞留时间、高效率、高
分辨率、高耐光漂泊性和无毒无害等特性。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 一种结构式如式(Ⅰ)所示的物质作为成像用荧光纳米探针使用；
[0007]
[0008] 作为优选的技术方案，所述式(Ⅰ)所示的物质携带荧光基团。
[0009] 作为优选的技术方案，所述荧光基团为Cy7。
[0010] 一种成像用荧光纳米探针的制备方法，包括：
[0011] 葡聚糖与对硝基苯基
碳酸酯(PNC)反应得到Dextran-PNC；
[0012] 所述Dextran-PNC与巯基乙胺反应得到巯基化葡聚糖(Dextran-SH)；
[0013] 所述Dextran-SH与2-吡啶半胱氨
盐酸盐(PDA)反应得到Dex-SS-NH2；
[0014] 运用EDC法活化激活脱氧胆酸(DCA)的羧基；活化后的所述脱氧胆酸在室温条件下与Dex-SS-NH2反应，得到Dex-SS-DCA；
[0015] 所述Dex-SS-DCA和荧光染料Cy7溶于二甲基亚砜，室温避光反应，之后
透析、冻干即得Dextran-Cy7粉末。
[0016] 作为优选的技术方案，所述葡聚糖与对硝基苯基碳酸酯的
质量比为3-5:1-3；反应条件为：
温度25℃，反应时间30-50h。
[0017] 作为优选的技术方案，所述Dextran-PNC与巯基乙胺的质量比1-2:4-5；反应条件为：温度25℃，反应时间20-30h。
[0018] 作为优选的技术方案，所述Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐的质量比1-2:2-3；反应条件为：温度25℃，反应时间20-30h。
[0019] 作为优选的技术方案，所述脱氧胆酸与Dex-SS-NH2的质量比10-20:1-3；反应条件为：温度25℃，反应时间30-50h。
[0020] 作为优选的技术方案，所述Dex-SS-DCA与荧光染料Cy7的质量比35-40:1；反应条件为:温度25℃，反应时间30-50h。
[0021] 作为优选的技术方案，所述透析使用截流3500分子量的透析袋。
[0022] 作为优选的技术方案，所述冻干的条件为0.1mbar的
负压。
[0023] 有益效果
[0024] (1)本发明的成像用荧光纳米探针与量子点相比，这探针几乎是由无毒物质组成，对
机体无害；与ICG相比，探针粒径较大，可以在淋巴结内驻留更长时间，可以提供更长的手术时间和手术准确率；与美兰相比，可以成像定位深部淋巴结，准确性高，再加之近红外成像，对机体无
辐射。
[0025] (2)本发明的成像用荧光纳米探针具有较好生物相容性、适合术前及术中同时定位前哨淋巴结、制备方法简单且廉价的纳米级探针，借助近红外成像系统该探针能够高效且清晰的定位深埋在组织下的前哨淋巴结，并且能够维持较长时间的成像，且对机体无毒害作用、放射性损伤等不良
副作用。
[0026] 探针进入机体后,在体内还原环境的作用下，连接DCA和葡聚糖间的二硫键被快速代谢分解，探针分解成几乎无毒的葡聚糖和脱氧胆酸,再经肝肾等排泄器官代谢出体外。
[0027] (3)本发明制得的纳米探针粒径控制在10-50nm，表面结构含有可修饰基团，易于连接其他功能基团。
附图说明
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施方案或
现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029] 图1为
实施例1Dextran-Cy7的电学
显微镜照片。
[0030] 图2为实施例1Dextran-Cy7的荧光分光光度计绘制的荧光
光谱；1为Cy7,2为Dex--Cy7。
[0031] 图3为实施例1Cy7标准曲线图，及所得回归方程。
[0032] 图4为实施例1Dextran-Cy7活体成像小鼠腋窝淋巴结。
具体实施方式
[0033] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0034] 如何构建巯基化葡聚糖是本发明的一个关键技术难点；另外，还要活化脱氧胆酸(DCA)的羟基，并通过控制硝基苯基碳酸酯(PNC)和葡聚糖的投料比来得到不同分子量的带有二硫键及脱氧胆酸的葡聚糖分子(Dextran-SS-DCA)，使得合成产物将粒径控制在10-50nm、表面结构含有可修饰基团，易于连接其他功能基团。下面详述之。
[0035] 下述实施例中使用的原料均为市售。下述制备过程中的原料之间的比例可以在所给的范围内进行选择，所得Dextran-Cy7粉末均可作为成像用纳米探针使用。葡聚糖与对硝基苯基碳酸酯的质量比为3-5:1-3；Dextran-PNC与巯基乙胺的质量比1-2:4-5；Dextran-SH与2-吡啶半胱氨盐酸盐的质量比1-2:2-3；脱氧胆酸与Dex-SS-NH2的质量比
10-20:1-3；Dex-SS-DCA与荧光染料Cy7的质量比35-40:1。
[0036] 实施例1
[0037] 葡聚糖50mg与对硝基苯基碳酸酯(PNC)30mg，在25℃温度反应40h，得到Dextran-PNC，Dextran-PNC20mg与巯基乙胺50mg，在25℃温度反应30h时间，反应得到巯基化葡聚糖(Dextran-SH)，Dextran-SH(50mg，)与2-吡啶半胱氨盐酸盐(75mg)溶于5ml水，室温反应过夜，
超滤(MWCO3000)提纯，冻干得到Dex-SS-NH2；运用EDC法活化激活脱氧胆酸(DCA100mg)的羧基；用3mL水溶解Dex-SS-NH2(10mg)，用吡啶中和盐酸后PH>7，加入到上述活化好的DCA溶液中，室温搅拌48h。用30mL
乙醇沉淀上述反应溶液，7000×g离心5min，用水溶解沉淀，透析(MWCO3500)后冻干，即得到最终产物Dex10k-SSDCA。取Dex10k-SSDCA(15mg)和
水溶性菁染料Cy7(0.4mg)溶于DMSO，室温避光置于摇床反应48h后，使用截流3500分子量的透析袋避光透析、冻干后得到Dextran-Cy7粉末。
[0038] 核磁的检测结果：1HNMR(400mHz)特征峰(DMSO-d6)：δ0.67～1.60ppm(DCA)，3.0～3.8和4.5～5.0(葡聚糖)。
[0039] 上述制备得到结构式如式(Ⅰ)所示的物质。该物质作为成像用荧光纳米探针使用。该物质携带荧光基团为Cy7。
[0040]
[0041] 如图1-4所示：
[0042] 各图在最下方上述制得的Dextran-Cy7荧光探针的表征：对合成的Dextran-Cy7进行表征：取适量Dextran-Cy7粉末溶于
磷酸盐缓冲液(PBS)中，用电学显微镜观察其形态，用激光粒度仪-Zeta电位计检测其粒径和分布，荧光分光光度计绘制荧光光谱。
[0043] 上述Dextran-Cy7载荧光染料Cy7量测定：用紫外线可见光分光光度计测定Dextran-Cy7溶液中Cy7的含量，检测波长750nm(Cy7在750nm波长处有特征性吸收峰)。取适量Cy7浓缩液，以PBS定容，分别配置成浓度梯度为0.375、0.75、1.5、3、6nmol/ml的溶液，以PBS为空白对照，测定其吸光度并绘制标准曲线。称取0.3mgDextran-Cy7置于5ml离心管中，加入3mlPBS震荡待其溶解，用紫外线可见光分光光度计在750nm测定其A值，带入标准曲线回归方程，计算溶液中的Cy7浓度。
[0044] 效果实施例
[0045] 一、药效学研究
[0046] 本发明用于近红外活体小鼠腋窝淋巴结成像：按1mL/kg体质量
腹腔注射4％水合氯
醛麻醉实验小鼠，用8％硫化钠对检查部位进行脱毛。制备2mg/mL的Dextran-Cy7纳米胶的生理盐溶液，小鼠左前掌垫皮下注射0.05mL(5mg/kg剂量)，并按摩
注射部位，之后侧卧位固定于成像台，观察近红外荧光成像效果，在30min后能清晰并准确定位小鼠腋窝淋巴结。
[0047] 二、药物毒性试验
[0048] 1、细胞毒性试验
[0049] 使用Alarmblue检测液测试Dextran-Cy7对树突细胞DC2.4的细胞毒性，将DC2.4细胞以10000个/孔接种在96孔板内，37C
培养箱培养24h后，弃原液后加入浓度梯度为50、100、200、400、600、800、1000μg/mL的Dextran-Cy7溶液，37C培养箱培养48h后，弃原液加入200μL/孔Alarmblue工作浓度的检测液，37C培养箱培养4h后，每孔取出180μL转移到新的96孔板，用酶标仪检测(570、630nm波长)的吸光值，计算得到细胞存活率。
[0050] 结果显示与对照组相比Dextran-Cy7对细胞几乎无毒性，对细胞生存率无影响。
[0051] 2、小鼠肝肾功能毒性检测
[0052] 配制浓度为5mg/mL的Dextran-Cy7溶液，按照12.5mg/kg、25mg/kg的剂量随机尾静脉注射两组实验小鼠(昆明小鼠30只，25g/只，10只/组，雌雄各半，)体内，空白对照组无特殊处理，每日观察动物
给药后的反应，包括精神状态，行为活动，毛色、
摄食、二便等情况。养育14天后处死，取肝脏和肾脏福尔
马林固定后，
石蜡包埋后做切片并HE
染色；取血行肝肾功能检测。
[0053] 结果表明，Dextran-Cy7对小鼠的一般状况、体重、摄食、肝肾功能无明显影响，与对照组无明显差异，解剖动物内脏未发现异常改变，各脏器指数无明显差异，病理学检查未见中毒性反应。
[0054] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
