含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
阅读：232发布：2022-10-09
专利汇可以提供含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文中揭露非天然 氨 基酸和包含至少一个非天然氨基酸的多肽，以及制备这些非天然氨基酸和多肽的方法。非天然氨基酸(自身或作为多肽的一部分)可包含多种可能的官能基，但通常具有至少一个肟基、羰基、二羰基及/或羟胺基。本文中也揭露翻译后经进一步修饰的非天然氨基酸多肽，实现这些修饰的方法，以及纯化这些多肽的方法。通常，经修饰的非天然氨基酸多肽包含至少一个肟基、羰基、二羰基及/或羟胺基。进一步揭露使用这些天然氨基酸多肽及经修饰的天然氨基酸多肽的方法，其包含 治疗 、诊断和其他 生物 技术用途。，下面是含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途专利的具体信息内容。
1.一种化合物，或其盐，其包括式(I)：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团 时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个以下基团的双环或三环状环烷基或杂环 烷基：羰基，其包含二羰基；经保护羰基，其包含经保护二羰基；或经掩蔽羰基，其 包含经掩蔽二羰基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个以下基团的单环或双环状环烷基或杂环烷基： 羰基，其包含二羰基；至少一个经保护羰基，其包含经保护二羰基；至少一个经掩蔽 羰基，其包含经掩蔽二羰基；或其组合；
其限制条件为当A为亚苯基且R3各自为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且R3 各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在且R3各自为H时，R 不为甲基；
或其活性代谢物，或医药学上可接受的前药或溶剂合物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A为经取代或未经取代的低级亚烷基，或 未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳 基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(XXXIII)：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或 N(R′)(经取代亚烷基)。
4.根据权利要求3所述的化合物，其对应于式(XXXIII-A)：
5.根据权利要求3所述的化合物，其对应于式(XXXIII-B)：
6.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(XXXIV)：
其中X1为C、S或S(O)；且n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的 R8与R9基团各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组， 或任何R8和R9可共同形成＝O或环烷基，或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
7.根据权利要求6所述的化合物，其对应于式(XXXIV-A)：
7.根据权利要求6所述的化合物，其对应于式(XXXIV-B)：
8.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(XXXV)：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或 N(R′)(经取代亚烷基)。
9.根据权利要求8所述的化合物，其对应于式(XXXV-A)：
10.根据权利要求8所述的化合物，其对应于式(XXXV-B)：
11.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(XXXX)：
其中：
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与所述A基团键结且(b)指示与各别羰基键结；且
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或 经取代环烷基。
12.根据权利要求11所述的化合物，其对应于式(XXXXIII)：
13.根据权利要求12所述的化合物，其是选自：
14.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(III)：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-O R′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其是选自由以下各物组成的群组：
以及
16.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(VI)：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
17.根据权利要求16所述的化合物，其是选自由以下各物组成的群组：
以及
18.根据权利要求1所述的化合物，其对应于式(IX)：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
19.根据权利要求18所述的化合物，其是选自由以下各物组成的群组：
以及
20.根据权利要求1所述的化合物，其中所述-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个 羰基、经保护羰基或经掩蔽羰基的双环或三环状环烷基或杂环烷基。
21.根据权利要求20所述的化合物，其是选自由以下各物组成的群组：
以及
22.根据权利要求1所述的化合物，其中所述-J-R基团共同形成包括至少一个羰基、 经保护羰基或经掩蔽羰基的单环或双环状环烷基或杂环烷基。
23.根据权利要求22所述的化合物，其具有以下结构：
24.一种多肽，其并有至少一种根据权利要求1所述的化合物。
25.一种化合物，或其盐，其包括式(XI)：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、 经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、 经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、 烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二 醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应 性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶 性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分； 放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分； 可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团； 可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部 分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及上述物 质的任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经 取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或 经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
其限制条件为当A和B不存在时，R不为甲基；
或其活性代谢物，或医药学上可接受的前药或溶剂合物。
26.根据权利要求25所述的化合物，其中A为亚苯基或经取代亚苯基。
27.根据权利要求25所述的化合物，其对应于式(XII)：
28.一种多肽，其并有至少一种根据权利要求25所述的化合物。
29.根据权利要求25所述的化合物，其中X为选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、 染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束组成的群组的生物 活性剂。
30.根据权利要求29所述的化合物，其中X为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、 消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子以及甾族剂组成的群组的药 物。
31.根据权利要求29所述的化合物，其中X为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 β-半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶组成的群组的酶。
32.根据权利要求25所述的化合物，其中X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发 光部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分以 及能量转移部分组成的群组的可检测标记。
33.一种制备包括至少一个具有式(I)的结构的氨基酸的多肽的方法：
所述方法包括将式(I)的氨基酸并入多肽内的末端位置或内部位置中，其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团 时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个以下基团的双环或三环状环烷基或杂环 烷基：羰基，其包含二羰基；经保护羰基，其包含经保护二羰基；或经掩蔽羰基，其 包含经掩蔽二羰基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个以下基团的单环或双环状环烷基或杂环烷基： 羰基，其包含二羰基；经保护羰基，其包含经保护二羰基；或经掩蔽羰基，其包含经 掩蔽二羰基；
其限制条件为当A为亚苯基且R3各自为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且R3 各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在且R3各自为H时，R 不为甲基。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述氨基酸是使用翻译系统并入所述多肽内 的特定位点中，所述翻译系统包括：
(i)编码所述多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包括对应于并入所述式(I) 氨基酸的预先指定位点的选择密码子，以及
(ii)包括所述氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对所述选择密码子具有特异性。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述翻译系统包括氨酰基化到式(I)氨基酸 上的tRNA。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述翻译系统为包括选自由细菌细胞、古细 菌细胞和真核细胞组成的群组的细胞的活体内翻译系统。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述氨基酸具有对应于式(III)的结构：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述氨基酸是选自由以下各物组成的群组：
以及
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述氨基酸具有对应于式(VI)的结构：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述氨基酸是选自由以下各物组成的群组：
以及
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述氨基酸具有对应于式(IX)的结构：
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、其中k为1、2或3的-C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各 自独立地为H、烷基或经取代烷基。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述氨基酸是选自由以下各物组成的群组：
以及
43.根据权利要求36所述的方法，其中所述-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个以 下基团的双环或三环状环烷基或杂环烷基：羰基，其包含二羰基；经保护羰基，其包含 经保护二羰基；或经掩蔽羰基，其包含经掩蔽二羰基。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述氨基酸是选自由以下各物组成的群组：
以及
45.根据权利要求36所述的方法，其中所述-J-R基团共同形成包括至少一个以下基 团的单环或双环状环烷基或杂环烷基：羰基，其包含二羰基；经保护羰基，其包含经保 护二羰基；或经掩蔽羰基，其包含经掩蔽二羰基。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述氨基酸为：
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述式(I)氨基酸具有式(XXX)的结构：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)。
48.根据权利要求36所述的方法，其中所述式(I)氨基酸具有式(XXXIII)的结构：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)。
49.根据权利要求36所述的方法，其对应于式(XXXX)：
其中：
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与所述A基团键结且(b)指示与各别羰基键结；且
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或 经取代环烷基。
50.根据权利要求49所述的方法，其对应于式(XXXXIII)：
51.一种用于衍生化包括式(I)氨基酸的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与 式(XIX)的试剂接触，其中式(I)对应于：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取 代低级亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经 取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；
其中式(XIX)对应于：
其中：
X各自独立地为可检测标记、生物活性剂或聚合物；
L各自为独立地选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、 亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -(亚烷基或经取代亚烷基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；
W为-ON(R1)2或-C(＝O)R2，其中R1各自独立地为H或氨基保护基，且R2为H 或OR′；且
n为1至3。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述氨基酸对应于式(II)：
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述试剂对应于式(XXVII)：
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述衍生多肽包括至少一个具有式(XI)的 结构的含肟氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取 代低级亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经 取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、 经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、 经取代芳烷基、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、 经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳 基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R5为L-X，其中
X为可检测标记、生物活性剂或聚合物；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经 取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、 -N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N- 以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其限制条件为当A与B不存在时，R不为甲基。
55.根据权利要求51所述的方法，其中使所述多肽在水溶液中在适度酸性条件下与 所述式(XIX)的试剂接触。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述条件为pH2至8。
57.根据权利要求51所述的方法，其中使所述多肽在促进剂存在下与所述式(XIX) 的试剂接触，所述促进剂是选自由以下各物组成的群组：
以及
58.根据权利要求51所述的方法，其中所述式(I)氨基酸具有式(XXX)的结构：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)。
59.根据权利要求51所述的方法，其中所述式(I)氨基酸具有式(XXXIII)的结构：
其中X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)。
60.根据权利要求51所述的方法，其对应于式(XXXX)：
其中：
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与所述A基团键结且(b)指示与各别羰基键结；且
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或 经取代环烷基。
61.根据权利要求60所述的方法，其对应于式(XXXXIII)：
62.一种治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有效量的包括至少一 个含肟的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，其中所述含肟的非天然氨基酸是使用翻译 系统并入所述多肽内的特定位点中，所述翻译系统包括：
(i)编码所述多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包括对应于并入所述含肟 氨基酸的预先指定位点的选择密码子，以及
(ii)包括所述含肟氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对所述选择密码子具有特 异性。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述翻译系统为包括选自以下群组的生物体 的细胞的活体内翻译系统：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌(Escherichia coli)、 真菌、假单胞菌种(species of Pseudomonas)、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫以及 原生生物。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸为含肟氨基酸且 所述含肟的非天然氨基酸具有对应于式(XI)的结构：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、 经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、 经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、 烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二 醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应 性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶 性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分； 放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分； 可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团； 可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部 分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及上述物 质的任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经 取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或 经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
其限制条件为当A和B不存在时，R不为甲基。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XII)的结构：
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XIII)的结 构：
67.根据权利要求64所述的方法，其中X为水溶性聚合物。
68.根据权利要求64所述的方法，其中X为聚乙二醇的衍生物。
69.根据权利要求64所述的方法，其中X为细胞毒性化合物。
70.根据权利要求64所述的方法，其中X为药物。
71.根据权利要求64所述的方法，其中X为第二多肽。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二多肽为含肟的非天然氨基酸多肽。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述第二多肽具有与根据权利要求62所述的 非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构。
74.根据权利要求62所述的方法，其进一步包括医药学上可接受的载剂。
75.根据权利要求62所述的方法，其中所述含肟的非天然氨基酸多肽为经修饰的含 肟的非天然氨基酸多肽。
76.一种用于检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包括投与有效量的包括至少一 个含肟的非天然氨基酸的同源非天然氨基酸多肽，其中所述含肟氨基酸是使用翻译系统 并入所述多肽内的特定位点中，所述翻译系统包括：
(i)编码所述多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包括对应于并入所述含肟 氨基酸的预先指定位点的选择密码子，以及
(ii)包括所述含肟氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对所述选择密码子具有特 异性。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述翻译系统为包括选自以下群组的生物体 的细胞的活体内翻译系统：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、假单胞菌种、 真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫以及原生生物。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述含肟的非天然氨基酸多肽包括至少一个 具有式(XI)的结构的含肟氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、 经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、 经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)S R″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、 烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二 醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应 性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶 性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分； 放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分； 可光异构化部分；生物索；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团； 可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部 分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及上述物 质的任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经 取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或 经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-；-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
其限制条件为当A和B不存在时，R不为甲基。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XII)的结构：
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XIII)的结 构：
81.根据权利要求78所述的方法，其中X是选自由以下各物组成的群组：标记；染 料；亲和性标记；光亲和性标记；自旋标记；荧光团；放射性部分；结合有重原子的部 分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；发色团；能量转移剂；可检测标记；以及上述物质的任何组合。
82.根据权利要求78所述的方法，其中所述生物合成含肟非天然氨基酸多肽为经修 饰的生物合成含肟非天然氨基酸多肽。
83.一种易化多肽的分离性质的方法，其包括利用包括至少一个含肟非天然氨基酸的 同源非天然氨基酸多肽，其中所述含肟氨基酸是使用翻译系统并入所述多肽内的特定位 点中，所述翻译系统包括：
(i)编码所述多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包括对应于并入所述含肟 氨基酸的预先指定位点的选择密码子，以及
(ii)包括所述含肟氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对所述选择密码子具有特 异性。
84.根据权利要求83的方法，其中所述翻译系统为包括选自以下群组的生物体的细 胞的活体内翻译系统：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、假单胞菌种、 酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫以及原生生物。
85.根据权利要求83的方法，其中所述含肟的非天然氨基酸多肽包括至少一个具有 式(XI)的结构的含肟氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经 取代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取 代亚杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚 杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚 杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、其中 k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或 经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两 个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、 经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷 基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、 经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、 烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二 醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应 性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶 性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分； 放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分； 可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团； 可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部 分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及上述物 质的任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经 取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、其中k为1、2或3的-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或 经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基 或经取代烷基；
其限制条件为当A和B不存在时，R不为甲基。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XII)的结构：
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述含肟氨基酸具有对应于式(XIII)的结 构：
88.根据权利要求86所述的方法，其中X为水溶性聚合物。
89.根据权利要求86所述的方法，其中X为聚乙二醇的衍生物。
90.根据权利要求78所述的方法，其中所述含肟的非天然氨基酸多肽为经修饰的含 肟的非天然氨基酸多肽。
技术领域
无
背景技术
将非遗传性编码氨基酸(即，“非天然氨基酸”)并入蛋白质中的能力使得允许引入 化学官能基，其可提供天然存在官能基(诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组 氨酸的亚氨基等)的有价值替代物。已知某些化学官能基对20种常见遗传性编码氨基 酸中存在的官能基为惰性的，但与可结合于非天然氨基酸上的官能基清洁且有效地反应 以形成稳定键联。
如今可用方法来选择性地引入蛋白质中不存在的化学官能基，其对20种常见遗传 性编码氨基酸中所存在的所有官能基为化学惰性的且其可用于与包括某些官能基的试 剂有效且选择性地反应以形成稳定共价键。
发明内容
本文中描述用于制造、纯化、表征及使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。一方面为衍生非天然氨基酸及/ 或非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。在一实施例中，这些方法、组合物、 技术和策略涉及化学衍生，在其他实施例中涉及生物衍生，在其他实施例中涉及物理衍 生，在其他实施例中涉及衍生的组合。在其他或额外实施例中，这些衍生具有区域选择 性。在其他或额外实施例中，这些衍生具有区域专一性。在其他或额外实施例中，这些 衍生在周围温度下为迅速的。在其他或额外实施例中，这些衍生在水溶液中发生。在其 他或额外实施例中，这些衍生在介于约4与约10之间的pH值下发生。在其他或额外实 施例中，通过添加促进剂，在含有非天然氨基酸的试剂与衍生试剂中，这些衍生为化学 计量、接近化学计量或类化学计量的。在其他或额外实施例中提供通过添加促进剂容许 所需基团化学计量、接近化学计量或类化学计量地结合于非天然氨基酸多肽上的方法。 在其他或额外实施例中提供通过添加促进剂容许所需基团化学计量、接近化学计量或类 化学计量地结合于非天然氨基酸多肽上的策略、反应混合物、合成条件。
一方面为用于基于肟键化学衍生肽和蛋白质的非天然氨基酸。在其他或额外实施例 中，将非天然氨基酸并入多肽中，即，这些实施例为非天然氨基酸多肽。在其他或额外 实施例中，非天然氨基酸在其侧链上经官能化以使得其与衍生分子反应产生肟键。在其 他或额外实施例中为可与衍生分子反应产生含肟非天然氨基酸多肽的非天然氨基酸多 肽。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸是选自具有羰基、二羰基、缩醛、羟胺或肟 侧链的氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸是选自具有经保护或经掩蔽的羰 基、二羰基、羟胺或肟侧链的氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括经肟 掩蔽的侧链。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括羰基或二羰基侧链，其中羰基 或二羰基是选自酮或醛。在另一实施例中为含有用适当官能化共反应物处理后能够形成 肟的官能基的非天然氨基酸。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸在结构上类似于天 然氨基酸，但含有前述官能基中的一种。在另一或其他实施例中，非天然氨基酸类似于 苯丙氨酸或酪氨酸(芳族氨基酸)；而在另一实施例中，非天然氨基酸类似于丙氨酸与 亮氨酸(疏水氨基酸)。在一实施例中，非天然氨基酸具有与天然氨基酸的那些性质不 同的性质。在一实施例中，这些不同性质为侧链的化学反应性，在另一实施例中此不同 化学反应性允许非天然氨基酸的侧链经历反应，而作为多肽的单元，即使同一多肽中的 天然存在氨基酸单元的侧链也不经历前述反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链 具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括 含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电子试剂的部分 可经历亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。在这个段落中前述实施例中的任一者中，非天 然氨基酸可作为独立分子存在或可并入任何长度的多肽中；如果为后者，那么所述多肽 可进一步合并天然存在或非天然氨基酸。
另一方面为用于制备基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的经羟胺取代的分子。在另 一实施例中为用于通过在衍生分子与含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽之间形成 肟键衍生含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的经羟胺取代的分子。在其他实施例 中，前述含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽为含有酮基的非天然氨基酸多肽。在其 他或额外实施例中，含有羰基或二羰基的非天然氨基酸包括选自酮或醛的侧链。在其他 或额外实施例中，经羟胺取代的分子包括选自以下各物的群：标记；染料；聚合物；水 溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光 亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。在其他或额 外实施例中，经羟胺取代的分子为经羟胺取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例 中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然 氨基酸与经羟胺取代的分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与 含有羟胺的分子选择性反应的含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的 侧链上的含亲电子试剂的部分可经历亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这个段落中 描述的实施例有关的另一方面为由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰的 非天然氨基酸多肽。其他实施例包含对已修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面为用于制备基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的 分子。在另一实施例中为用于通过衍生分子与含有肟的肽或蛋白质之间的肟交换反应衍 生含有肟的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子。在另一实施例中为可在介 于约4与约8之间的pH值范围内经历肟与以含有肟的非天然氨基酸多肽交换的经羰基 或二羰基取代的分子。在另一实施例中为用于通过在衍生分子与含有肟(因此通过交换 类型反应形成新的肟键)或含有羟胺的非天然氨基酸多肽之间形成肟键衍生含有肟或含 有羟胺的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子。在另一实施例中，经羰基或 二羰基取代的分子为经醛取代的分子。在其他实施例中，经羰基或二羰基取代的分子包 括选自以下各物的群：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交 联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第 二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水 化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、 生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基； 与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位 体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基 团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性 部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制 性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放 射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑 制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定 基、受体、反胶束以及其任何组合。在其他或额外实施例中，经醛取代的分子为经醛取 代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨 基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羰基或二羰基取代的分子选择性 反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与含有羰基或二羰基的分子选择性反 应的部分，例如肟基或羟胺基；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的亲核部分可 经历亲电子进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这个段落中描述的实施例相关的另一方面 为由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰的非天然氨基酸多肽。其他实施例 包含对已修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面为用于产生基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的单官能、双官能以及多官 能连接子。在一实施例中为可用于连接含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽与其他分 子的分子连接子(双官能以及多官能)。在另一实施例中为可用于连接含有肟或羟胺的 非天然氨基酸多肽与其他分子的分子连接子(双官能以及多官能)。在另一实施例中， 含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽包括酮及/或醛侧链。在利用含有肟或羟胺的非天 然氨基酸多肽的实施例中，分子连接子在其一末端含有羰基或二羰基；在其他实施例中， 羰基或二羰基是选自醛基或酮基。在其他或额外实施例中，经羟胺取代的连接子分子为 经羟胺取代的聚乙二醇(PEG)连接子分子。在其他或额外实施例中，经羰基或二羰基 取代的连接子分子为经羰基或二羰基取代的聚乙二醇(PEG)连接子分子。在其他实施 例中，短语“其他分子”包含(仅举例来说)蛋白质、其他聚合物及小分子。在其他或 额外实施例中，含有羟胺的连接子分子在所有末端上包括相同或等效的基团，以便在与 含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含有羰基或二羰基的非天然 氨基酸多肽的同多聚化物。在其他实施例中，同多聚化为同二聚化。在其他或额外实施 例中，含有羰基或二羰基的分子连接子在所有末端上包括相同或等效的基团，以便在与 含有肟或羟胺的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含有肟或羟胺的非天然氨基酸多 肽的同多聚化物。在其他实施例中，同多聚化为同二聚化。在另一实施例中，非天然氨 基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羟 胺取代的连接子分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存 在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羰基或二羰基取代的连接子 分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与含有羟胺的连接子分子 选择性反应的含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电 子试剂的部分可经历含有羟胺的连接子分子的亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这 个段落中描述的实施例相关的另一方面为由连接子分子与非天然氨基酸多肽反应产生 的键联的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽。其他实施例包含对键联的“经修 饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
一方面为通过羰基或二羰基与羟胺反应物的缩合产生肟基产物来衍生蛋白质的方 法。这个方面内包含用于基于含有羰基或二羰基的反应物与含有羟胺的反应物缩合产生 肟衍生的蛋白质加合物衍生蛋白质的方法。在额外或其他实施例中为以经羟胺官能化的 聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮蛋白质的方法。在额外或其他方面中为通过含有羰基或 二羰基的衍生分子与含有肟的肽或蛋白质之间的肟交换反应衍生含肟蛋白质的方法。在 额外或其他方面中，经羟胺取代的分子可包含蛋白质、其他聚合物以及小分子。
另一方面为化学合成用于衍生经酮取代的蛋白质的经羟胺取代的分子的方法。另一 方面为化学合成用于衍生经醛取代的蛋白质的经羟胺取代的分子的方法。在一实施例 中，经羟胺取代的分子可包括肽、其他聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在一实施例 中为制备适于衍生含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽(仅举例来说，其包含含酮的 非天然氨基酸多肽)的经羟胺取代的分子的方法。在另一或额外实施例中，非天然氨基 酸在蛋白质的活体内翻译期间位点特异地并入。在另一或额外实施例中，经羟胺取代的 分子通过羰基或二羰基的亲核进攻容许此含有羰基或二羰基的非天然氨基酸的位点特 异性衍生以以位点特异性方式形成肟衍生的多肽。在另一或额外实施例中，制备经羟胺 取代的分子的方法提供得到多种位点特异性衍生多肽的方法。在另一或额外实施例中为 合成经羟胺官能化的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为化学合成用于衍生经肟取代的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取 代的分子的方法。在一实施例中，经羰基或二羰基取代的分子为经酮取代的分子。在一 实施例中，经羰基或二羰基取代的分子为经醛取代的分子。在另一实施例中，经羰基或 二羰基取代的分子包含蛋白质、聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在另一或额外实施 例中，这些方法补充能够在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性并入非天然氨基酸的技 术。在另一或额外实施例中为制备适于与含肟非天然氨基酸多肽反应以提供位点特异性 衍生的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子的一般方法。在另一或额外实施 例中为合成经羰基或二羰基取代的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为使用含有羟胺的双官能连接子化学衍生经羰基或二羰基取代的非天然 氨基酸多肽的方法。在一实施例中为通过缩合反应产生肟键来连接经羟胺取代的连接子 与经羰基或二羰基取代的蛋白质的方法。在其他或额外实施例中，经羰基或二羰基取代 的非天然氨基酸为经酮取代的非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，使用含有羟胺的 双官能连接子，非天然氨基酸多肽经位点特异性地衍生及/或三维结构得到精确控制地衍 生。在一实施例中，这些方法用于将分子连接子(包含(但不限于)单官能、双官能以 及多官能连接子)连接到含有羰基或二羰基(包含(但不限于)含酮及含醛)的非天然 氨基酸多肽上，其中至少一个连接子末端含有羟胺基，其可通过肟键键联到含有羰基或 二羰基的非天然氨基酸多肽上。在另一或额外实施例中，这些连接子用于连接含有羰基 或二羰基的非天然氨基酸多肽与其他分子，其包含(例如)蛋白质、其他聚合物(分枝 和未分枝)和小分子。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽键联到水溶性聚合物上。在一些实施例中，水 溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，聚乙二醇分子为双官能聚合物。在一 些实施例中，双官能聚合物键联到第二多肽上。在一些实施例中，第二多肽与第一多肽 相同，在其他实施例中，第二多肽为不同的多肽。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽 包括至少两种键联到水溶性聚合物(包括聚乙二醇部分)上的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基酸多肽对受体的亲和力的 取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基酸多肽的 稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基 酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大所 产生的非天然氨基酸多肽在宿主细胞中的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中， 相对于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽，非天然氨基酸多肽包括调节蛋白酶抗性、 血清半衰期、免疫原性及/或表达的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽为促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂 或反向促效剂。在一些实施例中，促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向促 效剂包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚 乙二醇部分。在一些实施例中，包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽(例如) 可防止相应受体的二聚化。在一些实施例中，包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸 的多肽调节多肽与结合搭配物、配位体或受体的结合。在一些实施例中，包括与水溶性 聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽的一种或一种以上的性质或活性。
在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子(amber codon)、赭石密码子 (ochre codon)、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子(unique codon)、稀有密码子 (rare codon)、非天然密码子(unnatural codon)、五碱基密码子(five-base codon)以及 四碱基密码子(four-base codon)组成的群组。
本文中也描述制造与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸多肽的方法。在一些实施例 中，所述方法包括使包括非天然氨基酸的经分离多肽与包括与非天然氨基酸反应的部分 的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入的非天然氨基酸对与20种常见氨基酸中 的任一种不具有反应性的水溶性聚合物有反应性。在一些实施例中，水基聚合物包括聚 乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于)介于约100Da与 约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、 800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量 在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000 Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇 分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含 (但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、 70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000 Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、 7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da及1,000Da。在一些实施 例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG 的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约 5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000 Da之间。
本文中也描述包括包含至少一种本文中所述的非天然氨基酸和医药学上可接受的 载剂的组合物。在一些实施例中，非天然氨基酸键联至水溶性聚合物上。本文中也描述 包括医药学上可接受的载剂和多肽的医药组合物，其中至少一个氨基酸经非天然氨基酸 取代。在一些实施例中，非天然氨基酸包括糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通 过糖部分键联至多肽上。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的前药；本文中进一步描述包括这些前药和医药学上可接受的载剂的组 合物。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的 代谢物；这些代谢物可具有补充或协同加强非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰 的非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸、非 天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽向生物体(包含需要此代谢物的患者)提 供所需代谢物的用途。
本文中也描述包括编码多肽且包括选择密码子的聚核苷酸的细胞。在一些实施例 中，细胞包括用于将非天然氨基酸代入多肽中的正交RNA合成酶及/或正交tRNA。在 一些实施例中，细胞是在细胞培养物中，而在其他实施例中为多细胞生物(包含两栖动 物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)的部分的细胞。在细胞实施例的任一者中，其他实施 例包含产生非天然氨基酸多肽的聚核苷酸的表达。在其他实施例中为可利用本文中所述 的非天然氨基酸产生非天然氨基酸多肽(包含经修饰的非天然氨基酸多肽)的生物体。 在其他实施例中为含有本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽及/或经修饰的非 天然氨基酸多肽的生物体。这些生物体包含单细胞生物和多细胞生物，其包含两栖动物、 爬行动物、鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在活体外产生。在 一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在细胞溶解产物中产生。在一些实施例中，非天然 氨基酸多肽通过核糖体翻译产生。
本文中也描述制造包括非天然氨基酸的多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包 括在容许多肽表达的条件下培养包括编码多肽、正交RNA合成酶及/或正交tRNA的聚 核苷酸的细胞；和从细胞及/或培养基中纯化多肽。
本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸的库或本文中所述的非天然氨基酸多肽 的库，或本文中所述的经修饰的非天然氨基酸多肽的库，或其组合库。本文中也描述含 有至少一种非天然氨基酸、至少一种非天然氨基酸多肽及/或至少一种经修饰的非天然氨 基酸的阵列。本文中也描述含有至少一种编码多肽且包括选择密码子的聚核苷酸的阵 列。本文中所述的阵列可用于筛检生物体中非天然氨基酸多肽的产生(通过检测编码多 肽的聚核苷酸的转录或通过检测多肽的翻译)。
本文中也描述筛检本文中所述的库的所需活性的方法，或使用本文中所述的阵列筛 检本文中所述的库或其他化合物及/或多肽及/或聚核苷酸的库的所需活性的方法。本文 中也描述来自库筛检的此活性数据用于开发和发现新的治疗剂的用途，以及治疗剂本 身。
本文中也描述增大多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。在一些实施 例中，方法包括用至少一种非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任一或多种氨基酸及/ 或使多肽与水溶性聚合物偶合。
本文中也描述以有效量的医药组合物治疗需要此治疗的患者的方法，其中所述医药 组合物包括包含非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天 然氨基酸与水溶性聚合物偶合。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸是选自 由含肟非天然氨基酸、含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸和含羟胺非天然氨 基酸组成的群组。在其他实施例中，这些非天然氨基酸通过生物合成并入本文中所述的 多肽中。在其他或替代实施例中，这些非天然氨基酸多肽包括至少一种选自式I-XVIII、 式XXX-XXXIV(A和B)或式XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增强多肽的生物可用性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增加多肽的安全概况。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的水溶性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的治疗半衰期。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的血清半衰期。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽延长多肽的循环时间。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽调节多肽的生物活性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
应了解本文中所述的方法和组合物不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞株、 构筑体和试剂且同样可改变。同样应了解本文中使用的术语仅为了描述特定实施例的目 的，且并非意欲限制本文中所述的方法和组合物的范畴，其应仅由随附权利要求来限制。
除非上下文另外明确指出，否则如本文中及随附权利要求中所使用，单数形式“一” 以及“所述”包含复数提及。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有如本文中描述的本 发明所属领域的技术人员通常所了解的相同含义。尽管与本文中所述的那些类似或等效 的任何方法、装置和材料可用于本文中所述的本发明的实施或测试中，但现在描述优选 方法、装置及材料。
本文中提及的所有公开案和专利是为了描述和揭露(例如)公开案中描述的构筑体 以及方法的目的以引用的方式全部并入本文中，其可连同本文中描述的本发明一起使 用。本文中论述的公开案仅在本申请案的申请日期之前提供其揭露内容。本文中任何事 物不应理解为承认本文中所述的本发明者由于先前发明或为任何其他原因无权提早此 揭露内容的日期。
如本文中所使用的术语“亲和性标记”指的是可逆或不可逆地与另一分子结合以对 其进行修饰、将其破坏或与其形成化合物的标记。举例来说，亲和性标记包含酶及其基 质，或抗体及其抗原。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”以及“烷硫基”是以其常规意义使用，且指的是分别 通过氧原子、氨基、硫原子键联至分子上的烷基。
除非另外指出，否则术语“烷基”(自身或作为另一分子的部分)意谓直链或支链， 或环状烃基，或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的且可包含具有指定碳 原子数目(即C1-C10意谓1至10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包含 (但不限于)以下基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、 仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛 基及其类似基团的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上的双键或三键的 烷基。不饱和烷基的实例包含(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、 2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔 基以及更高级的同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”也意谓包含本文中 更详细定义的烷基的那些衍生物，诸如“杂烷基”、“卤烷基”和“高烷基”。
术语“亚烷基”(自身或作为另一分子的部分)意谓由烷烃衍生的二价基团，如由 (-CH2-)n例示，其中n可为1至约24。仅举例来说，这些基团包含(但不限于)具有10 个或更少碳原子的基团，诸如结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-。“低级烷基”或“低级 亚烷基”为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。除非另外指出，否则术 语“亚烷基”也意谓包含本文中描述为“亚杂烷基”的那些基团。
术语“氨基酸”指的是天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在氨 基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基 酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、 组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天 然存在氨基酸相同的基本化学结构(仅举例来说，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的 α-碳)的化合物。这些类似物可具有经修饰的R基团(举例来说，正亮氨酸)或可具有 经修饰的肽主链，而仍保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非 限制性实例包含高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍。
氨基酸在本文中可由其名称、其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学 命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号称 呼。另外，核苷酸可由其通常接受的单字母代码称呼。
“氨基末端修饰基团”指的是可连接至末端氨基上的任何分子。举例来说，这些末 端氨基可在聚合分子的末端处，其中这些聚合分子包含(但不限于)多肽、聚核苷酸以 及多糖。末端修饰基团包含(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说， 末端修饰基团包含聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合分子的治疗特 征，其包含(但不限于)增大肽的血清半衰期。
“抗体片段”意谓除全长形式之外的抗体的任何形式。在本文中抗体片段包含为存 在于全长抗体内的较小组分的抗体，以及经工程化设计的抗体。抗体片段包含(但不限 于)Fv、Fc、Fab，以及(Fab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双 功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、构架区、恒定区、重链、 轻链和可变区，以及替代性骨架非抗体分子、双特异性抗体及其类似物(Maynard和 Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol. 9：395-402)。另一功能性亚结构为单链Fv(scFv)，其包括由肽连接子共价连接的免疫球 蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小 (Mr 25,000)蛋白质通常保持对单一多肽中的抗原的特异性和亲和性且可为较大的抗原 特异性分子提供适当构建单元。除非另外特定指出，否则使用术语“抗体”的陈述和权 利要求明确包含“抗体片段”。
如本文中所使用，术语“芳族”或“芳基”指的是具有至少一个具有共轭π电子系 统的环且包含碳环芳基与杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳族”)的闭合环结构。碳环 或杂环芳族基团可含有5至20个环原子。所述术语包含共价键联的单环或稠合的多环 (即，共用相邻碳原子对的环)基团。芳族基团可未经取代或经取代。“芳族”或“芳 基”基团的非限制性实例包含苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、蒽基和菲基。上述芳 基和杂芳基环系统中的每一者的取代基是选自本文中描述的可接受的取代基的群组。
为了简便起见，当与其他术语组合使用(包含(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、 芳烷基)时，术语“芳族”或“芳基”包含如上所定义的芳基环与杂芳基环两者。因此， 术语“芳烷基”或“烷芳基”意谓包含其中芳基连接至烷基上的那些基团(其包含(但 不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基及其类似基团)，其中所述烷基包含其中碳原子(包 含(但不限于)亚甲基)已由杂原子(仅举例来说，氧原子)取代的那些烷基。这些芳 基的实例包含(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基及其类 似基团。
如本文中所使用，术语“亚芳基”指的是二价芳基。“亚芳基”的非限制性实例包 含亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基以及亚噻吩基。亚芳基的取代基选自本文中描述的可接 受的取代基的群组。
“双官能聚合物”，也被称作“双官能连接子”，其指的是包括两个能够与其他部分 特异性反应以形成共价键或非共价键的官能基的聚合物。这些部分可包含(但不限于) 天然氨基酸或非天然氨基酸或含有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基。仅举 例来说，双官能连接子可具有与第一肽上的基团有反应性的官能基，以及与第二肽上的 基团有反应性的另一官能基，藉此形成包含第一肽、双官能连接子以及第二肽的接合物。 已知用于将多种化合物与肽连接的众多程序和连接子分子。参见(例如)欧洲专利申请 案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784 号；第4,680,338号；以及第4,569,789号，其是以引用的方式全部并入本文中。“多官 能聚合物”也被称作“多官能连接子”，其指的是包括两个或两个以上能够与其他部分 反应的官能基的聚合物。这些部分可包含(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含 有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基(包含(但不限于)氨基酸侧基)以形 成共价键或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可为任何所需长度或分子量，且可 经选定以在键联至化合物的一个或一个以上的分子与其结合的分子或化合物之间提供 特定所需间隔或构象。
如本文中所使用，术语“生物可用性”指的是物质或其活性部分从医药剂型递送且 在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以及程度。生物可用性的增加指的是增加 物质或其活性部分从医药剂型递送且在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以 及程度。举例来说，生物可用性的增加可指示为与其他物质或活性部分相比时血液中物 质或其活性部分浓度的增加。评估生物可用性增加的方法的非限制性实例于实例88-92 中给出。这种方法可用于评估任何多肽的生物可用性。
当在本文中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意 谓可影响生物系统、路径、分子的任何物理或生物化学性质或与生物体相关的相互作用 的任何物质，所述生物体包含(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆 虫、真菌、植物、动物以及人类。具体来说，如本文中所使用，生物活性分子包含(但 不限于)意欲用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其他动物的疾病，或另外用于 增强人类或动物的身体或精神健康的任何物质。生物活性分子的实例包含(但不限于) 肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性毒品、软性毒品、碳水化合物、无机原子或分子、 染料、脂质、核苷、放射性核、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束。 适于以本文中所述的方法以及组合物使用的生物活性剂的种类包含(但不限于)药物、 前药、放射性核、显像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、 心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、甾族剂、微生物来源的毒素及其类似物。
“调节生物活性”意谓提高或降低多肽的反应性，改变多肽的选择性，增强或降低 多肽的底物选择性。分析生物活性改变可通过比较非天然多肽的生物活性与天然多肽的 生物活性来进行。
如本文中所使用，术语“生物材料”指的是生物来源的材料，其包含(但不限于) 从生物反应器及/或由重组方法和技术获得的材料。
如本文中所使用，术语“生物物理探针”指的是可检测或监测分子的结构变化的探 针。这些分子包含(但不限于)蛋白质且“生物物理探针”可用于检测或监测蛋白质与 其他大分子的相互作用。生物物理探针的实例包含(但不限于)自旋标记、荧光团以及 可光活化基团。
如本文中所使用，术语“生物合成”指的是利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何 方法，其包含使用以下组分中的至少一者：聚核苷酸、密码子、tRNA以及核糖体。举 例来说，非天然氨基酸可使用部分VIII“活体内产生包括非天然氨基酸的多肽”以及非 限制性实例14中所述的方法和技术“通过生物合成并入”非天然氨基酸多肽中。另外， 选择可“通过生物合成并入”非天然氨基酸多肽中的适用非天然氨基酸的方法描述于非 限制性实例15-16中。
如本文中所使用，术语“生物素类似物”(或亦被称作“生物素模拟物”)为除生物 素之外以高亲和力与抗生物素蛋白及/或链霉抗生物素蛋白结合的任何分子。
如本文中所使用的术语“羰基”指的是在部分上含有选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2- 及-C(S)-组成的群组的基团，其包含(但不限于)含有至少一个酮基及/或至少一个醛基 及/或至少一个酯基及/或至少一个羧酸基团及/或至少一个硫酯基的基团。这些羰基包含 酮、醛、羧酸、酯以及硫酯。另外，这些基团可为线性、分枝或环状分子的部分。
术语“羧基末端修饰基团”指的是可连接至末端羧基上的任何分子。举例来说，这 些末端羧基可在聚合分子的末端处，其中这些聚合分子包含(但不限于)多肽、聚核苷 酸和多糖。末端修饰基团包含(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来 说，末端修饰基团包含聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合分子的治 疗特征，其包含(但不限于)增加肽的血清半衰期。
如本文中所使用，术语“可化学裂解基团”(亦被称作“化学上不稳定”)指的是在 暴露于酸、碱、氧化剂、还原剂、化学引发剂或自由基引发剂后分解或裂解的基团。
如本文中所使用，术语“化学发光基团”指的是在不额外加热的情况下由于化学反 应而发光的基团。仅举例来说，在碱和金属催化剂的存在下，鲁米诺(luminol)(5-氨 基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)与氧化剂(如过氧化氢(H2O2))反应产生激发态产物(3- 氨基邻苯二甲酸盐，3-APA)。
如本文中所使用，术语“发色团”指的是吸收可见光波长、UV波长或IR波长的光 的分子。
如本文中所使用，术语“辅因子”指的是大分子的作用必需的原子或分子。辅因子 包含(但不限于)无机离子、辅酶、蛋白质或酶的活性必需的一些其他因子。实例包含 血色素中的亚铁血红素、叶绿素中的镁，以及蛋白质的金属离子。
如本文中所使用，“共折叠”指的是使用至少两个彼此相互作用的分子且使得未折 叠或不当折叠的分子转变为适当折叠的分子的再折叠过程、反应或方法。仅举例来说， “共折叠”使用至少两个彼此相互作用的多肽且使得未折叠或不当折叠的多肽转变为天 然、适当折叠的多肽。这些多肽可含有天然氨基酸及/或至少一个非天然氨基酸。
如本文中所使用，“比较窗口”指的是在两个序列经最佳比对后用于比较相同数目 邻接位置的序列与参照序列的邻接位置的任一者的区段。这些邻接位置包含(但不限于) 由约20至约600个连续单元组成的群组，其包含约50至约200个连续单元，以及约100 至约150个连续单元。仅举例来说，这些序列包含多肽和含有非天然氨基酸的多肽，其 中连续单元包含(但不限于)天然氨基酸和非天然氨基酸。另外，仅举例来说，这些序 列包含聚核苷酸，其中核苷酸为相应连续单元。用于比较的序列比对方法在所属领域中 为熟知的。可由以下方法进行用于比较的最佳序列比对，其包含(但不限于)Smith和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci. USA 85：2444的相似性搜索方法、这些算法的电脑化实现(威斯康辛遗传学软件包 (Wisconsin Genetics Software Package)(Genetics Computer Group，575 Science Dr.， Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手工比对以及视觉检查(参 见(例如)Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
举例来说，可用于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人.(1997)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，以及Altschul 等人.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物科技 信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数 W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W) 为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两个链的比较作为默认值。对于氨基酸序列， BLASTP程序使用字长为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff 和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)为50、期望值(E) 为10、M＝5、N＝-4以及两个链的比较作为默认值。BLAST算法通常在“低复杂性”过 滤器关闭的情况下进行。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(参见(例如)Karlin和Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量 度为最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率 的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，或 小于约0.01，或小于约0.001，那么就认为核酸与参考序列相似。
术语“经保守性修饰的变体”应用于天然和非天然氨基酸序列以及天然和非天然核 酸序列，及其组合。关于特定核酸序列，“经保守性修饰的变体”指的是编码相同或基 本上相同的天然和非天然氨基酸序列，或其中天然和非天然核酸不编码天然和非天然氨 基酸序列(对于基本上相同的序列)的那些天然和非天然核酸。举例来说，由于遗传密 码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、 GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每一位置处， 密码子可改变为任一相应密码子而不改变所编码的多肽。这些核酸变异为“沉默变异”， 其为经保守性修饰的变异中的一种。因此例如编码天然或非天然多肽的本文中的每一天 然或非天然核酸序列也描述天然或非天然核酸的每一可能沉默变异。所属领域的技术人 员应了解天然或非天然核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，其中AUG通常仅 为甲硫氨酸的密码子，TGG通常仅为色氨酸的密码子)可经修饰以产生功能上相同的分 子。因此，编码天然和非天然多肽的天然和非天然核酸的每一沉默变异暗含于每一所述 序列中。
关于氨基酸序列，对改变、添加或缺失编码序列中单一天然和非天然氨基酸或小百 分比的天然和非天然氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为 “经保守性修饰的变体”，其中改变造成氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或天然和非天 然氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域中熟知提供功能上类似的天然氨基酸的 保守取代表。这些经保守性修饰的变体不同于多态变体、种间同源物以及本文中所述方 法和组合物的等位基因且不排除这些物质。以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基 酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见(例如)Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.；第2版(1993年12月))。
除非另外指出，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”(自身或与其他术语组合)分 别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包含饱和、部分不 饱和和完全不饱和的环键联。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接至分子的其 余部分的位置。杂原子可包含(但不限于)氧、氮或硫。环烷基的实例包含(但不限于) 环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基以及其类似基团。杂环烷基的实例 包含(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、 3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、 2-哌嗪基以及其类似基团。另外，术语涵盖多环状结构，其包含(但不限于)双环状环 结构和三环状环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”(自身或作为另一分子的部分)意 谓衍生自杂环烷基的二价基团，且术语“亚环烷基”(自身或作为另一分子的部分)意 谓衍生自环烷基的二价基团。
如本文中所使用，术语“环糊精”指的是在环构成中由至少6至8个葡萄糖分子组 成的环状碳水化合物。环的外部含有水溶性基团；在环的中心为能够容纳小分子的相对 非极性空穴。
如本文中所使用，术语“细胞毒性”指的是伤害细胞的化合物。
如本文中所使用，“变性剂”指的是会造成聚合物可逆性伸展的任何化合物或物质。 仅举例来说，“变性剂”可造成蛋白质的可逆性伸展。变性剂的强度将由特定变性剂的 性质和浓度来决定。举例来说，变性剂包含(但不限于)离液剂、去污剂、水可混溶有 机溶剂、磷脂或其组合。离液剂的非限制性实例包含(但不限于)尿素、胍以及硫氰酸 钠。去污剂的非限制性实例可包含(但不限于)：强去污剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚 氧乙烯醚(例如Tween或Triton去污剂)、十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和非离子 去污剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))；温和阳离子去污剂，诸如N-＞2，3-(二油烯氧 基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子去污剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子 去污剂，其包含(但不限于)磺酸甜菜碱(Zwiftergent)、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基 -1-丙烷硫酸盐(CHAPS)以及3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐 (CHAPSO)。水可混溶有机溶剂的非限制性实例包含(但不限于)乙腈、低级烷醇(尤 其C2-C4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)，或低级烷二醇(C2-C4烷二醇，诸如乙二醇)可用 作变性剂。磷脂的非限制性实例包含(但不限于)天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基卵磷脂 或二庚酰基卵磷脂。
如本文中所使用，术语“可检测标记”指的是可使用分析技术观测到的标记，这些 分析技术包含(但不限于)荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见吸收光谱、质谱、 核磁共振、磁共振以及电化学方法。
如本文中所使用的术语“二羰基”指的是含有至少两个选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2- 和-C(S)-组成的群组的部分的基团，其包含(但不限于)1，2-二羰基、1，3-二羰基和1，4- 二羰基，以及含有至少一个酮基及/或至少一个醛基及/或至少一个酯基及/或至少一个羧 酸基团及/或至少一个硫酯基的基团。这些二羰基包含二酮、酮醛、酮酸、酮酯以及酮硫 酯。另外，这些基团可为线性、分枝或环状分子的部分。二羰基中的两个部分可相同或 不同，且可包含会在两个部分的任一者处产生(仅举例来说)酯、酮、醛、硫酯或酰胺 的取代基。
如本文中所使用，术语“药物”指的是在预防、诊断、缓解、治疗或治愈疾病或病 状中使用的任何物质。
如本文中所使用，术语“染料”指的是含有发色团的可溶染色物质。
如本文中所使用，术语“有效量”指的是会在一定程度上减轻一种或一种以上所治 疗的疾病或病状的症状的所投与的药剂或化合物的足够量。结果可为疾病的症候、症状 或病因的降低及/或缓解，或生物系统的任何其他所需改变。举例来说，所投与的药剂或 化合物包含(但不限于)天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多 肽，或经修饰的非氨基酸多肽。可投与含有这些天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、 经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物用于预防性、增强及/ 或治疗性治疗。在任何个别情况下的适当“有效”量可使用诸如剂量增加研究的技术来 确定。
如本文中所使用，术语“电子致密基团”指的是当以电子束照射时散射电子的基团。 这些基团包含(但不限于)钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉、99％、碳酰肼、六水合氯化 铁、六亚甲基四胺、98.5％、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、 硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银(Ag 检定：8.0-8.5％)“强”、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫 脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰以及硫酸氧钒。
如本文中所使用，术语“能量转移剂”指的是可贡献或接受来自另一分子的能量的 分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过这个过程 荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发受体分子上，其随后以较长波长荧 光发射获赠的能量。
术语“增强”意谓增加或延长所需效应的效力或持续时间。举例来说，“增强”治 疗剂的效应指的是在治疗疾病、病症或病状期间增加或延长治疗剂的效力或持续时间、 效应的能力。如本文中所使用，“增强有效量”指的是在治疗疾病、病症或病状期间足 以增强治疗剂的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量应取决于疾病、病症 或病状的严重性和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师 的判断。
如本文中所使用，术语“真核生物”指的是属于种系发生学上真核域(domain Eucarya)的生物体，其包含(但不限于)动物(包含(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬 行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包含(但不限于)单子叶植物、双子叶植物以及藻 类)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫以及原生生物。
如本文中所使用，术语“脂肪酸”指的是具有约C6或更长烃侧链的羧酸。
如本文中所使用，术语“荧光团”指的是经激发后发射光子且进而发荧光的分子。
如本文中所使用，术语“官能基”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应 性位点”、“化学反应性基团”以及“化学反应性部分”指的是发生化学反应的分子的部 分或单元。这些术语在化学领域中有些同义且在本文中用于指示执行一些功能或活性且 与其他分子有反应性的分子的部分。
术语“卤素”包含氟、氯、碘以及溴。
如本文中所使用，术语“卤酰基”指的是含有卤素部分的酰基，其包含(但不限于) -C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3以及其类似基团。
如本文中所使用，术语“卤烷基”指的是含有卤素部分的烷基，其包含(但不限于) -CF3和-CH2CF3以及其类似基团。
如本文中所使用，术语“杂烷基”指的是直链或支链或环状烃基，或其组合，其由 烷基和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，且其中氮原子和硫原 子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷 基的任何内部位置或位于烷基连接至分子的其余部分的位置处。实例包含(但不限于) -CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、 -CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、 -CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。另外，至多两个杂原子可为连续的，诸如， -CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
如本文中所使用，术语“亚杂烷基”指的是由杂烷基衍生的二价基团，如由 -CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示(但并非限制)。对于亚杂烷基 来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包含(但不限于)亚烷基氧基、 亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基以及其类似基团)。更进 一步地，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，键联基团的方向并非由书写键联基团的 式的方向暗示。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-与-R′C(O)2-两者。
如本文中所使用，术语“杂芳基”或“杂芳族”指的是含有至少一个选自N、O和 S的杂原子的芳基；其中氮原子和硫原子可视情况经氧化，且氮原子可视情况经季铵化。 杂芳基可经取代或未经取代。杂芳基可通过杂原子连接到分子的其余部分上。杂芳基的 非限制性实例包含1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡 嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5- 异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、 2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并 咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6- 喹啉基。
如本文中所使用的术语“高烷基”指的是作为烃基的烷基。
如本文中所使用，术语“一致”指的是相同的两个或两个以上的序列或子序列。另 外，如本文中所使用，术语“实质上一致”指的是当经比较窗口或如使用比较算法或由 手工比对和视觉检查测量的指定区域比较和比对最大对应性时，具有一定百分比的相同 连续单元的两个或两个以上的序列。仅举例来说，如果在指定区域上连续单元为约60％ 一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一 致或约95％一致，那么两个或两个以上的序列可为“实质上一致的”。这些百分比描述 两个或两个以上序列的“一致性百分比”。序列的一致性可存在于长度为至少约75-100 个连续单元的区域上、长度为约50个连续单元的区域上，或(如果未指定)整个序列 上。这个定义也涉及测试序列的互补序列。仅举例来说，当氨基酸残基相同时，两个或 两个以上的多肽序列为一致的，而如果氨基酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％ 一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一 致，那么两个或两个以上的多肽序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少 约75-100个氨基酸的区域上、长度为约50个氨基酸的区域上，或(如果未指定)多肽 序列的整个序列上。另外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或两个以上的聚核苷 酸序列为一致的，而如果核酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％一致、约70％一 致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两 个以上的聚核苷酸序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少约75-100个核 酸的区域上、长度为约50个核酸的区域上，或(如果未指定)聚核苷酸序列的整个序 列上。
关于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参考序列。当使用序列 比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑中，指定子序列坐标，(必要时)且指定 序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法基于 程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文中所使用，术语“免疫原性”指的是对投与治疗药物有反应的抗体。针对治 疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性可使用用于检测生物流体中抗非天然氨基酸多肽抗 体的定量和定性检定来获得。这些检定包含(但不限于)放射性免疫测定(RIA)、酶联 免疫吸附检定(ELISA)、发光免疫检定(LIA)以及荧光免疫检定(FIA)。针对治疗性 非天然氨基酸多肽的免疫原性的分析包括比较投与治疗性非天然氨基酸多肽后的抗体 反应和投与治疗性天然氨基酸多肽后的抗体反应。
如本文中所使用，术语“插入剂”(也被称作“插入基团”)指的是可插入分子的分 子内空间或分子之间的分子间空间中的化学品。仅举例来说，插入剂或插入基团可为插 入DNA双螺旋的堆积碱基中的分子。
如本文中所使用，术语“分离”指的是从不关注的组分中分离且移出所关注的组分。 经分离的物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液形式，其包含(但不限于)水溶液。经 分离的组分可为均质状态或经分离的组分可为包括额外医药学上可接受的载剂及/或赋 形剂的医药组合物的部分。纯度和均质性可使用分析化学技术来测定，其中所述技术包 含(但不限于)聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。另外，当所关注的组分经分离且 为制剂中存在的主要物质时，所述组分在本文中描述为经实质上纯化。如本文中所使用， 术语“纯化”指的是至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或更纯的所关注 的组分。仅举例来说，当核酸或蛋白质不含至少一些在天然状态下与其缔合的细胞组分， 或核酸或蛋白质已经浓缩为比其在活体内或活体外产生的浓度高的水平时，这些核酸或 蛋白质为“经分离的”。同样，例如，当与位于基因外侧且编码蛋白质而非所关注的基 因的开放阅读框分离时，所述基因为经分离的。
如本文中所使用，术语“标记”指的是并入化合物中且易于检测，藉此可检测及/ 或监测其物理分布的物质。
如本文中所使用，术语“键联”指的是由连接子的官能基与另一分子之间的化学反 应形成的键或化学部分。这些键可包含(但不限于)共价键和非共价键，而这些化学部 分可包含(但不限于)酯、碳酸酯、亚胺、磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键以及寡核 苷酸键。水解上稳定的键联意谓所述键联在水中实质上稳定且在适用pH值下(其包含 (但不限于)在生理条件下)长期(或许甚至无限期地)不与水反应。水解上不稳定或 可降解的键联意谓所述键联可在水或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不稳定或可 降解的键联意谓所述键联可由一或一种以上的酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物 可包含在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能基之 间的连接子基团中的可降解键联。这些可降解键联包含(但不限于)由PEG羧酸或活化 PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中这些酯基通常在生理条件下水解 以释放生物活性剂。其他水解可降解键联包含(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应形 成的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键； 作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由氨基(包 含(但不限于)在诸如PEG的聚合物的末端上)与肽的羧基形成的肽键；以及由亚磷酰 胺基(包含(但不限于)在聚合物的末端上)与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
如本文中所使用，术语“培养基”指的是用于生长和收集细胞及/或由这些细胞表达 及/或分泌的产物的任何培养基。这些“培养基”包含(但不限于)溶液、固体、半固体 或可支持或含有任何宿主细胞的刚性载体，所述宿主细胞包含(例如)细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO 细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞，以及 细胞内含物。这些“培养基”包含(但不限于)其中宿主细胞已生长于多肽已分泌于其 中的培养基，其包含在增殖步骤之前或之后的培养基。这些“培养基”也包含(但不限 于)含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，例如细胞内产生的多肽且宿主细胞溶解或 分裂以释放多肽。
如本文中所使用，术语“代谢物”指的是化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨 基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)的衍生物，其是在 化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰 的非天然氨基酸多肽)代谢时形成的。术语“医药活性代谢物”或“活性代谢物”指的 是化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修 饰的非天然氨基酸多肽)的生物活性衍生物，其是在此化合物(例如天然氨基酸多肽、 非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)代谢时形 成的。
如本文中所使用，术语“代谢”指的是特定物质由生物体改变的过程的和。这些过 程包含(但不限于)水解反应和由酶催化的反应。关于新陈代谢的其他信息可获自The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill(1996)。仅举例来说，天然 氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多 肽的代谢物可通过将天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或 经修饰的非天然氨基酸多肽投与宿主且分析来自宿主的组织样本来鉴别，或通过将天然 氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多 肽与肝细胞一起活体外培养且分析所得化合物来鉴别。
如本文中所使用，术语“金属螯合剂”指的是与金属离子形成金属络合物的分子。 举例来说，这些分子可与中心金属离子形成两个或两个以上的配位键且可形成环结构。
如本文中所使用，术语“含金属部分”指的是含有金属离子、原子或粒子的基团。 这些部分包含(但不限于)顺铂(cisplatin)、螯合金属离子(诸如镍、铁和铂)，以及 金属纳米粒子(诸如镍、铁和铂)。
如本文中所使用，术语“结合有重原子的部分”指的是结合有通常比碳更重的原子 的离子的基团。这些离子或原子包含(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
如本文中所使用，术语“经修饰”指的是存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然 氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。这些改变或修饰可通过天然氨基酸、非天然氨 基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰，或通过天然氨基酸、非天然 氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的共翻译修饰或翻译后修饰来获得。形式 “经修饰或未经修饰”意谓所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非 天然氨基酸多肽视情况经修饰，即所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多 肽或非天然氨基酸多肽可经修饰或未经修饰。
如本文中所使用，术语“经调节的血清半衰期”指的是经修饰的生物活性分子相对 于其非未经修饰形式的循环半衰期的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活性分 子包含(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。 举例来说，血清半衰期是通过在投与生物活性分子或经修饰的生物活性分子后的多个时 间点取血液样本且测定每一样本中那种分子的浓度来测量的。血清浓度与时间的相关性 使得可以计算血清半衰期。举例来说，经调节的血清半衰期可为血清半衰期增加，其可 使得能够得到改良的给药方案或避免毒性效应。此血清增加可为至少约两倍、至少约三 倍、至少约五倍，或至少约十倍。评估血清半衰期增加的方法的非限制性实例于实例 88-92中给出。这个方法可用于评估任何多肽的血清半衰期。
如本文中所使用，术语“经调节的治疗半衰期”指的是治疗有效量的经修饰生物活 性分子相对于其未经修饰形式的半衰期的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活 性分子包含(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸 多肽。举例来说，治疗半衰期通过在投药后的多个时间点测量分子的药物动力学及/或药 效学性质来测量。增加的治疗半衰期可使得能够得到特定有益给药方案、特定有益总剂 量，或避免不当效应。举例来说，增加的治疗半衰期可由增大的效力、经修饰的分子与 其标靶的结合增加或减少、未经修饰的分子的另一参数或作用机制的增大或减小，或分 子由酶(诸如，仅举例来说，蛋白酶)分解增加或减少产生。评估治疗半衰期增加的方 法的非限制性实例于实例88-92中给出。这个方法可用于评估任何多肽的治疗半衰期。
如本文中所使用，术语“纳米粒子”指的是具有约500nm至约1nm之间的粒度的 粒子。
如本文中所使用，术语“接近化学计量”指的是参与化学反应的化合物的摩尔比为 约0.75至约1.5。
如本文中所使用，术语“非真核生物”指的是非真核生物体。举例来说，非真核生 物体可属于真细菌(Eubacteria)(其包含(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜 热栖热菌(Thermus thermophilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、种系发生学上的域，或古生菌(Archaea)，其包 含(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、热自养甲烷杆菌 (Methanobacterium thermoautotrophicum)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强 烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌 (Aeuropyrum pernix)，或嗜盐杆菌(Halobacterium)，诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)以及嗜盐杆菌种NRC-1，或种系发生学上的域。
“非天然氨基酸”指的是不为20种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种 的氨基酸。可与术语“非天然氨基酸”同义使用的其他术语为“非天然编码氨基酸”、“非 自然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”，以及其各种带有连字符和不带连字符的形式。术 语“非天然氨基酸”包含(但不限于)通过修饰天然编码氨基酸(包含(但不限于)20 种常见氨基酸或焦赖氨酸以及硒半胱氨酸)天然存在但并非通过翻译复合物自身并入生 长的多肽链中的氨基酸。不为天然编码的天然存在氨基酸的实例包含(但不限于)N-乙 酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖氨基-L-苏氨酸以及O-磷酸基酪氨酸。另外，术语“非 天然氨基酸”包含(但不限于)序非天然存在且可由合成获得或可通过修饰非天然氨基 酸获得的氨基酸。
如本文中所使用，术语“核酸”指的是脱氧核苷酸、脱氧核苷、核苷或核苷酸以及 其单链或双链形式的聚合物。仅举例来说，这些核酸和核酸聚合物包含(但不限于)(i) 天然核苷酸的类似物，其具有与参考核酸类似的结合性质且以类似于天然存在核苷酸的 方式代谢；(ii)寡核苷酸类似物，其包含(但不限于)PNA(肽基核酸)、反义技术中 使用的DNA的类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，以及其类似物)；(iii)其经保守性 修饰的变体(包含(但不限于)简并密码子取代)以及互补序列和明确指出的序列。举 例来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三 位置经混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人， Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
如本文中所使用，术语“氧化剂”指的是能够从被氧化的化合物移除电子的化合物 或物质。举例来说，氧化剂包含(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型 二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇(oxidized erythreitol)，以及氧。多种氧化剂适用于本文 中描述的方法和组合物中。
如本文中所使用，术语“医药学上可接受”指的是包含(但不限于)盐、载剂或稀 释剂的物质，其不消除化合物的生物活性或性质，且相对无毒，即，所述物质可投与个 体而不造成不当生物效应或以有害方式与其包含于其中的组合物的组分中的任一者相 互作用。
如本文中所使用，术语“光亲和性标记”指的是具有在曝露于光中之后与标记对其 具有亲和性的分子形成键联的基团的标记。仅举例来说，此键联可为共价或非共价键联。
如本文中所使用，术语“光笼蔽部分”指的是在特定波长下照射后共价或非共价地 结合其他离子或分子的基团。
如本文中所使用，术语“可光裂解基团”指的是在曝露于光中之后断裂的基团。
如本文中所使用，术语“光交联剂”指的是包括两个或两个以上在曝露于光中之后 可与两个或两个以上单体或聚合分子反应且形成共价或非共价键联的官能基的化合物。
如本文中所使用，术语“可光异构化部分”指的是其中经光照射后从一种异构形式 变为另一种异构形式的基团。
如本文中所使用，术语“聚亚烷基二醇”指的是线性或分枝聚合聚醚多元醇。这些 聚亚烷基二醇包含(但不限于)聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇以及其衍生物。其他例 示性实施例列出于(例如)商业供应商目录中，诸如Shearwater Corporation的目录“聚 乙二醇和用于生物医学应用的衍生物”(“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”)(2001)。仅举例来说，这些聚合聚醚多元醇具有约0.1kDa至 约100kDa之间的平均分子量。举例来说，这些聚合聚醚多元醇包含(但不限于)约100 Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、 800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量 在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000 Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇 分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含 (但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、 70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000 Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、 7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施 例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG 的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约 5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000 Da之间。
如本文中所使用，术语“聚合物”指的是由重复亚单元组成的分子。这些分子包含 (但不限于)多肽、聚核苷酸或多糖或聚亚烷基二醇。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来提及氨基酸残基的聚合物。 即，针对于多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，且反之亦然。这些 术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上的氨基酸残基为非天然氨 基酸的氨基酸聚合物。另外，这些“多肽”、“肽”和“蛋白质”包含任何长度的氨基酸 链，其包含全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键键联。
术语“翻译后修饰”指的是在天然或非天然氨基酸已经翻译并入多肽链中之后发生 的所述氨基酸的任何修饰。这些修饰包含(但不限于)共翻译活体内修饰、共翻译活体 外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。
如本文中所使用，术语“前药”或“医药学上可接受的前药”指的是在活体内或活 体外转变为母体药物的药剂，其中其不消除药物的生物活性或性质，且相对无毒，即， 所述物质可投与个体而不造成不当生物效应或以有害方式与其包含于其中的组合物的 组分中的任一者相互作用。前药通常为药物前驱物，在投与受检者且随后吸收后，其通 过某些过程(诸如由代谢途径转变)转变为具有活性或具有更高活性的物质。一些前药 具有存在于前药上的化学基团，其使得前药活性较小及/或赋予药物溶解性或一些其他性 质。一旦化学基团裂解及/或经修饰，活性药物就从前药中产生。前药通过酶促反应或非 酶促反应在体内转变为活性药物。前药可提供改良的物理化学性质，诸如更好的溶解性、 增强的递送特性(诸如特异性靶向特定细胞、组织、器官或配位体)以及改良的药物治 疗价值。这些前药的益处包含(但不限于)：(i)与母体药物相比，易于投药；(ii)前药 可通过口服投药生物利用，而母体不可以；以及(iii)与母体药物相比，前药也可具有 改良的于医药组合物中的溶解性。前药包含活性药物的药理学非活性或活性降低的衍生 物。前药可经设计用于调节药物或生物活性分子的量，其通过操纵药物的性质(诸如物 理化学性质、生物医药性质或药物动力学性质)到达所需作用部位。前药的实例(不加 限制地)可为以酯(“前药”)的形式投与以利于穿过细胞膜传送的非天然氨基酸多肽， 其中水溶性对迁移率有害，但一旦在其中水溶性为有益的细胞内部，其就随后代谢水解 为羧酸(活性实体)。前药可经设计为可逆药物衍生物，以用作改性剂以增强向位点特 异性组织的药物传送。
如本文中所使用，术语“预防有效量”指的是预防性地应用于患者中的含有至少一 种非天然氨基酸多肽或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量，其会在一定 程度上减轻一种或一种以上所治疗的疾病、病状或病症的症状。在这些预防性应用中， 所述量可视患者的健康状况、体重及其类似因素而定。充分相信所属领域的技术人员可 通过常规实验(包含(但不限于)剂量增加临床试验)确定这些预防有效量。
如本文中所使用，术语“经保护”指的是存在防止化学反应性官能基在某些反应条 件下反应的“保护基”或部分。保护基会根据所保护的化学反应性基团的类型而改变。 仅举例来说，(i)如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基 (t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；(ii)如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基 可为邻吡啶基二硫化物；且(iii)如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟 基，那么保护基可为苄基或烷基，诸如甲基、乙基或叔丁基。
仅举例来说，阻塞/保护基(blocking/protecting group)也可选自：
另外，保护基包含(但不限于)包含对光不稳定的基团(诸如Nvoc和MeNvoc)以 及所属领域中已知的其他保护基。其他保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，其是以引用的方 式全部并入本文中。
如本文中所使用，术语“放射性部分”指的是其核自发发出核辐射(诸如α粒子、 β粒子或γ粒子)的基团；其中，α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能光子。
如本文中所使用，术语“反应性化合物”指的是在适当条件下对另一原子、分子或 化合物有反应性的化合物。
术语“重组宿主细胞”(也被称作“宿主细胞”)指的是包含外源聚核苷酸的细胞， 其中用于将外源聚核苷酸插入细胞中的方法包含(但不限于)直接吸收、转导、f-配对 或产生重组宿主细胞所属领域中已知的其他方法。仅举例来说，所述外源聚核苷酸可为 非整合载体(包含(但不限于)质粒)，或可整合入宿主基因组中。
如本文中所使用，术语“氧化还原活性剂”指的是氧化或还原另一分子，藉此氧化 还原活性剂变得被还原或氧化的分子。氧化还原活性剂的实例包含(但不限于)二茂铁、 醌、Ru2+/3+络合物、Co2+/3+络合物以及Os2+/3+络合物。
如本文中所使用，术语“还原剂”指的是能够向所还原的化合物添加电子的化合物 或物质。举例来说，还原剂包含(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤 藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)，以及还原型谷胱甘肽。可使用这些还原剂 (仅举例来说)以将巯基保持为还原状态且减少分子内或分子间二硫键。
如本文中所使用的“再折叠”描述将不当折叠或未折叠状态转变为自然或适当折叠 构象的任何过程、反应或方法。仅举例来说，再折叠将含有二硫键的多肽由不当折叠或 未折叠状态转变为关于二硫键的自然或适当折叠构象。这些含有二硫键的多肽可为天然 氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。
如本文中所使用，术语“树脂”指的是高分子量不溶性聚合物珠粒。仅举例来说， 这些珠粒可用作用于固相肽合成的载体，或在纯化之前附着分子的位点。
如本文中所使用，术语“糖类”指的是一系列碳水化合物，其包含(但不限于)糖、 单糖、寡糖以及多糖。
如本文中所使用，术语“安全性”或“安全性概况”指的是相对于已投与药物的次 数而言可能与药物投与相关的副作用。举例来说，将已投与多次且仅温和地产成副作用 或无副作用的药物称为具有出色的安全性概况。评估安全性概况的方法的非限制性实例 于实例92中给出。这种方法可用于评估任何多肽的安全性概况。
如本文中所使用，短语“选择性杂交”或“特异性杂交”指的是当特定核苷酸序列 存在于复杂混合物(包含(但不限于)总细胞或库DNA或RNA)中时，在严格杂交条 件下分子与所述序列的结合、成双或杂交。
如本文中所使用，术语“自旋标记”指的是可通过电子自旋共振光谱检测且可连接 到另一分子上的含有展现未成对电子自旋的原子或原子团(即稳定顺磁基团)的分子。 这些自旋标记分子包含(但不限于)硝酰基以及硝基氧，且可为单一自旋标记或双重自 旋标记。
如本文中所使用，术语“化学计量”指的是参与化学反应的化合物的摩尔比为约0.9 至约1.1。
如本文中所使用，术语“类化学计量”指的是在反应条件改变后或添加剂存在下变 为化学计量或接近化学计量的化学反应。这些反应条件的变化包含(但不限于)温度升 高或pH值改变。这些添加剂含(但不限于)促进剂。
短语“严格杂交条件”指的是在低离子浓度和高温度的条件下，DNA、RNA、PNA 或其他核酸模拟物或其组合的序列的杂交。举例来说，在严格条件下探针会与核酸的复 杂混合物(包含(但不限于)总细胞或库DNA或RNA)中的其目标子序列杂交，而不 与复杂混合物中的其他序列杂交。严格条件为序列依赖性的且在不同情况下会不同。举 例来说，较长序列在较高温度下特异性杂交。严格杂交条件包含(但不限于)：(i)在确 定离子浓度和pH值下比特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃-10℃；(ii)在约pH 7.0 至约pH 8.3下盐浓度为约0.01M至约1.0M，且对于短探针(包含(但不限于)10至 50个核苷酸)，温度为至少约30℃，且对于长探针(包含(但不限于)多于50个核苷 酸)温度为至少约60℃；(iii)添加去稳定剂，其包含(但不限于)甲酰胺；(iv)50％ 甲酰胺，5X SSC，和1％ SDS，在42℃下培养，或5X SSC，1％ SDS，在65℃下培养， 其中在65℃下于0.2X SSC以及0.1％ SDS中洗涤约5分钟至约120分钟之间。仅举例 来说，选择性或特异性杂交的检测包含(但不限于)阳性信号至少为背景的两倍。关于 核酸杂交的详尽指南见于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。
如本文中所使用，术语“受检者”指的是作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举 例来说，受检者可为(但不限于)哺乳动物，其包含(但不限于)人类。
如本文中所使用，术语“实质上经纯化”指的是可实质上或基本上不含在纯化之前 通常伴随所关注的组分或与所关注的组分相互作用的其他组分的所关注的组分。仅举例 来说，当所关注的组分的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、 小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计) 的污染组分时，所关注的组分可为“实质上经纯化”的。因此，“实质上经纯化”的所 关注的组分可具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约 97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。仅举例来说，在重组产生的天然氨基酸多肽 或非天然氨基酸多肽的情况下，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可从天然细胞或宿 主细胞中纯化。举例来说，当制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约 15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以 干重计)的污染物质时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制剂可为“实质上经纯 化”的。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天 然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、 约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的量存在。举例来说，当天然氨 基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸 多肽可以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约 500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的量 存在于培养基中。举例来说，“实质上经纯化”的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽 可具有如由适当方法(其包含(但不限于)SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛细 管电泳)测定的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、 约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的纯度水平。
术语“取代基”(也被称作“非干扰取代基”)指的是可用于置换分子上的另一基团 的基团。这些基团包含(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10 烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12环烷基、C4-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、 二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12 氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m 为1至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基 烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、 -C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、 -C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、 -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自为1至8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、 -NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐，以及其类似基团。前述列表中的每一R基团包含(但 不限于)H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基，或烷芳基。当取代基由其从左向 右书写的常规化学式指定时，其同样涵盖可由从右向左书写结构产生的化学上相同的取 代基，例如，-CH2O-等于-OCH2-。
仅举例来说，烷基和杂烷基(包含被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、 环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基包含(但不限于)：-OR、 ＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、 -OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、 -S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN以及-NO2。前述列表中的每一R基团包含(但不限于)氢、 经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包含(但不限于)经1-3个卤 素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基。当两个R基 团连接至同一氮原子上时，其可与氮原子组合以形成5员环、6员环或7员环。举例来 说，-NR2意谓包含(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。
举例来说，芳基和杂芳基的取代基包含(但不限于)-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、 -SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、 -NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、 -CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，数目在零到芳族 环系统上的开放价态的总数的范围内；且其中前述列表中的每一R基团包含(但不限于) 氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
如本文中所使用，术语“治疗有效量”指的是投与已患有疾病、病状或病症的患者、 足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上减轻至少一种所治疗的疾病、病症或病状的症 状的含有至少一种非天然氨基酸多肽及/或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合 物的量。这些组合物的功效视以下条件而定，其包含(但不限于)疾病、病症或病状的 严重性和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师的判断。 仅举例来说，治疗有效量可由常规实验(包含(但不限于)剂量增加临床试验)确定。
如本文中所使用，术语“硫烷氧基”指的是通过氧原子与分子键联的含硫烷基。
术语“热熔点”或Tm为在平衡状态下50％的与目标互补的探针与目标序列杂交的 温度(在确定离子浓度、pH值以及核酸浓度下)。
如本文中所使用，术语“毒性部分”指的是可造成伤害或死亡的化合物。
如本文中所使用，术语“治疗”包含缓解、缓和或改善疾病或病状症状，预防其他 症状，改善或预防症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病状，例如，阻止疾病或病状的发 展，减轻疾病或病状，使得疾病或病状回归，减轻由疾病或病状造成的病状，或终止疾 病或病状的症状。术语“治疗”包含(但不限于)预防性及/或治疗性治疗。
如本文中所使用，术语“水溶性聚合物”指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。 这些水溶性聚合物包含(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳 氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其是以引用的方式并入本文中)、单甲 氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2- 羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化 丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维 素以及纤维素衍生物(包含(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、 淀粉以及淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇以及其衍生物、聚亚烷基二醇和其衍生物的 共聚物、聚乙烯基乙基醚，以及α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺，以及其类似物或其混 合物。仅举例来说，这些水溶性聚合物与天然氨基酸多肽或非天然多肽的偶合可产生改 变，其包含(但不限于)相对于未经修饰的形式，水溶性增加、血清半衰期增加或受到 调节、治疗半衰期增加或受到调节、生物可用性增大、生物活性受到调节、循环时间延 长、免疫原性受到调节、物理缔合特性受到调节，其包含(但不限于)聚集以及多聚体 形成、受体结合改变、与一种或一种以上结合搭配物的结合改变，以及受体二聚化或多 聚化作用改变。另外，这些水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性。
除非另外指示，否则使用所属领域内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化 学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
本文中提出的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)包含经同位素标记的化合物， 其与以本文中提出的各种式和结构中叙述的那些化合物相同，但一个或一个以上原子经 具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子取代。可 并入本发明的化合物中的同位素的实例包含氢、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分别 诸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、15F、36Cl。本文中描述的某些经同位素标 记的化合物(例如诸如3H和14C的放射性同位素并入其中的那些化合物)适用于药物 及/或底物组织分布检定。此外，用诸如氘(即2H)的同位素取代可提供某些由较高代 谢稳定性产生的治疗优点，例如活体内半衰期增加或剂量需求降低。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)具有不对称碳原子且可因此 以对映异构体或非对映异构体形式存在。基于其物理化学差异，由已知方法(例如，色 谱及/或分级结晶)可将非对映异构混合物分离为其个别非对映异构体。可通过由与适当 光学活性化合物(例如，醇)反应将对映异构混合物转变为非对映异构混合物，分离非 对映异构体且将个别非对映异构体转变(例如，水解)为相应纯对映异构体而将对映异 构体分离。包含非对映异构体、对映异构体及其混合物的所有这些异构体均被视作本文 中描述的组合物的部分。
在额外或其他实施例中，本文中描述的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)是 以前药的形式使用。在额外或其他实施例中，本文中描述的化合物(包含(但不限于) 非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化 合物的试剂)在投与需要产生代谢物的生物体之后代谢，所述代谢物随后用于产生所需 效应，其包含所需治疗效应。在其他或额外实施例中为非天然氨基酸和“经修饰或未经 修饰的”非天然氨基酸多肽的活性代谢物。
本文中描述的方法和配方包含使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的N-氧化物、结晶形式(也被称作多晶型物)或医药学上可接受的盐。 在某些实施例中，非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽以及经修饰的非天然氨基酸多肽可 以互变异构体形式存在。所有互变异构体均包含于本文中提出的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的范畴内。另外，本文中描述的非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽以及经修饰的非天然氨基酸多肽可以非溶剂合物形式以及与医药学 上可接受的溶剂(诸如水、乙醇以及其类似物)形成的溶剂合物形式存在。本文中提出 的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的溶剂合物形式也视 为揭露于本文中。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的试剂)可以若干互变异构形式存在。 所有这些互变异构形式均被视作本文中描述的组合物的部分。同样，例如本文中的任何 化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸 多肽以及用于制备前述化合物的试剂)的所有烯醇-酮形式均被视作本文中描述的组合物 的部分。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的任一者的试剂)具有酸性且可与医药 学上可接受的阳离子形成盐。本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的试剂)可具 有碱性且因此可与医药学上可接受的阴离子形成盐。包含二盐的所有这些盐在本文中描 述的组合物的范畴内且其可通过常规方法来制备。举例来说，盐可通过在水性、非水性 或部分水性介质中使酸性实体与碱性实体接触来制备。通过使用以下技术中的至少一种 来回收盐：过滤；以非溶剂沉淀，接着过滤；蒸发溶剂；或(在水溶液的情况下)冻干。
当母体非天然氨基酸多肽中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金 属离子或铝离子)置换，或与有机碱配位时，可形成本文中揭露的非天然氨基酸多肽的 医药学上可接受的盐。另外，所揭露的非天然氨基酸多肽的盐形式可使用起始物质或中 间物的盐来制备。本文中描述的非天然氨基酸多肽可通过使本文中描述的非天然氨基酸 多肽的游离碱形式与医药学上可接受的无机酸或有机酸反应制备为医药学上可接受的 酸加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)。或者，本文中描述的非天然氨基酸多肽 可通过使本文中描述的非天然氨基酸多肽的游离酸形式与医药学上可接受的无机碱或 有机碱反应制备为医药学上可接受的碱加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)。
医药学上可接受的盐的类型包含(但不限于)：(1)与无机酸或有机酸形成的酸加 成盐，其中所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸以及其类似酸；所述有机 酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹 果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、 扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双 环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、 三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂 酸、粘糠酸以及其类似酸；(2)当母体化合物中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金 属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱配位时形成的盐。可接受的有机碱 包含乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺以及其类似物。可接受的 无机碱包含氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠以及其类似物。
非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐的相应抗衡离子可使用多种方法来分析和 鉴别，这些方法包含(但不限于)离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、感应耦合等 离子体、原子吸收光谱、质谱或其任何组合。另外，这些非天然氨基酸多肽医药学上可 接受的盐的治疗活性可使用实例87-91中描述的技术和方法来测试。
应了解，盐的提及包含其溶剂加成形式或晶体形式，尤其溶剂合物或多晶型物。溶 剂合物含有化学计量或非化学计量之量的溶剂，且通常在结晶过程中与医药学上可接受 的溶剂(诸如水、乙醇以及其类似物)形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇 时形成醇化物。多晶型物包含相同元素组成的化合物的不同晶体组合排列。多晶型物通 常具有不同X射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学性质和电 学性质、稳定性和溶解性。诸如再结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可使得单 一晶体形式占优势。
非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐多晶型物及/或溶剂合物的筛检和表征可使 用多种技术来实现，所述技术包含(但不限于)热分析、X射线衍射、光谱学、蒸气吸 附以及显微镜检查。热分析方法专注于热化学降解或热物理过程(包含(但不限于)多 晶型物转变)，且使用这些方法分析多晶型形式之间的关系、测定重量损失以找出玻璃 化转变温度或用于赋形剂相容性研究。这些方法包含(但不限于)差示扫描量热法 (DSC)、调制差示扫描量热法(MDSC)、热重分析(TGA)，以及热重和红外分析(TG/IR)。 X射线衍射方法包含(但不限于)单晶和粉末衍射计以及同步加速器源。使用的各种光 谱技术包含(但不限于)拉曼、FTIR、UVIS和NMR(液态和固态)。各种显微镜检查 技术包含(但不限于)偏振光显微镜、伴随能量分散型X射线分析(EDX)的扫描电子 显微镜(SEM)、伴随EDX的环境扫描电子显微镜(在气体或水蒸气气氛中)、IR显微 镜，以及拉曼显微镜。
附图说明
通过参照提出说明性实施例的以下详细描述可获得对本发明的方法和组合物的特 征和优点的更佳理解，所述实施例中利用我们的方法、组合物、设备和装置的原理，且 附随图式为：
图1呈示本文中描述的方法、组合物、策略和技术的某些方面的关系的示意性代表 图。
图2呈示本文中描述的非天然氨基酸的类型的说明性、非限制性实例。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图3呈示本文中描述的非天然氨基酸的类型的说明性、非限制性实例。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图4呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图5呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图6呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图7呈示以含羟胺的试剂翻译后修饰含羰基的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的含 肟非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用 于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的 非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图8呈示可用于增强含羰基的非天然氨基酸多肽与含羟胺的试剂的反应以形成经修 饰的含肟非天然氨基酸多肽的添加剂的说明性、非限制性实例。
图9呈示以含羰基的试剂翻译后修饰含肟的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的含肟 非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用于 制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图10呈示以含羰基的试剂翻译后修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的 含肟非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入 用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰 的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图11呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图12呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图13呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有酰胺基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图14呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有氨基甲酸酯基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图15呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有氨基甲酸酯基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图16呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含简单PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图17呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含分枝PEG的试剂的说明性、非限制性实例，以及一种此试剂用于修饰基于羰基 的非天然氨基酸多肽的用途。
图18呈示可用于修饰和键联非天然氨基酸多肽的双官能连接子基团的合成的说明 性、非限制性实例。
图19呈示可用于修饰和键联非天然氨基酸多肽的多官能连接子基团的说明性、非 限制性实例。
图20呈示双官能连接子基团用于修饰非天然氨基酸多肽且将非天然氨基酸多肽键 联至PEG基团的用途的说明性、非限制性代表图。
图21呈示双官能连接子基团用于修饰非天然氨基酸多肽且将非天然氨基酸多肽键 联至PEG基团的用途的说明性、非限制性实例。
图22呈示双官能连接子基团将两个非天然氨基酸多肽键联在一起以形成同型二聚 体的用途的说明性、非限制性代表图。
图23呈示双官能连接子基团将两个不同非天然氨基酸多肽键联在一起以形成异质 二聚体的用途的说明性、非限制性代表图。
图24呈示含羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图25呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图26呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。
图27呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图28呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图29呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图30呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图31呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图32呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图33呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图34呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图35呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性 代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非 天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和 策略中的任一者中。
图36呈示非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可 用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多 肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图37呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图38呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图39呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图40呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图41呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图42呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图43呈示(a)经保护或未经保护的含1，3-酮醛的非天然氨基酸，以及(b)含1-3- 酮羧基(硫)酯的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于 或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和 经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图44呈示含酰肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图45呈示含酰肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图46A和46B呈示含肟的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图，且图46C呈 示含肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用 于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的 非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图47呈示一步接合至非天然氨基酸多肽和两步接合至非天然氨基酸多肽的说明性、 非限制性代表图。举例来说，这些接合包含非天然氨基酸多肽的PEG化。
图48呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图49呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图50呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图51呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图52呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图53呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图54呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图55呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图56呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图57呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图58呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图59呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图60呈示羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用 于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽 和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图61呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图62A呈示羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图；图62B呈示mPEG化 合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯 化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基 酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图63呈示(A)通过化学转变为含羰基的(包含含二羰基的)非天然氨基酸多肽修 饰非天然氨基酸多肽以及(B)通过化学转变为含羟胺的非天然氨基酸多肽修饰非天然 氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用于制备、 纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨 基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图64呈示PEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图65呈示PEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
如今可用方法来选择性地引入蛋白质中不存在的化学官能基，其对20种常见遗传 性编码氨基酸中所存在的所有官能基为化学惰性的且其可用于与包括某些官能基的试 剂有效且选择性地反应以形成稳定共价键。
发明内容
本文中描述用于制造、纯化、表征及使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。一方面为衍生非天然氨基酸及/ 或非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。在一实施例中，这些方法、组合物、 技术和策略涉及化学衍生，在其他实施例中涉及生物衍生，在其他实施例中涉及物理衍 生，在其他实施例中涉及衍生的组合。在其他或额外实施例中，这些衍生具有区域选择 性。在其他或额外实施例中，这些衍生具有区域专一性。在其他或额外实施例中，这些 衍生在周围温度下为迅速的。在其他或额外实施例中，这些衍生在水溶液中发生。在其 他或额外实施例中，这些衍生在介于约4与约10之间的pH值下发生。在其他或额外实 施例中，通过添加促进剂，在含有非天然氨基酸的试剂与衍生试剂中，这些衍生为化学 计量、接近化学计量或类化学计量的。在其他或额外实施例中提供通过添加促进剂容许 所需基团化学计量、接近化学计量或类化学计量地结合于非天然氨基酸多肽上的方法。 在其他或额外实施例中提供通过添加促进剂容许所需基团化学计量、接近化学计量或类 化学计量地结合于非天然氨基酸多肽上的策略、反应混合物、合成条件。
一方面为用于基于肟键化学衍生肽和蛋白质的非天然氨基酸。在其他或额外实施例 中，将非天然氨基酸并入多肽中，即，这些实施例为非天然氨基酸多肽。在其他或额外 实施例中，非天然氨基酸在其侧链上经官能化以使得其与衍生分子反应产生肟键。在其 他或额外实施例中为可与衍生分子反应产生含肟非天然氨基酸多肽的非天然氨基酸多 肽。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸是选自具有羰基、二羰基、缩醛、羟胺或肟 侧链的氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸是选自具有经保护或经掩蔽的羰 基、二羰基、羟胺或肟侧链的氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括经肟 掩蔽的侧链。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括羰基或二羰基侧链，其中羰基 或二羰基是选自酮或醛。在另一实施例中为含有用适当官能化共反应物处理后能够形成 肟的官能基的非天然氨基酸。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸在结构上类似于天 然氨基酸，但含有前述官能基中的一种。在另一或其他实施例中，非天然氨基酸类似于 苯丙氨酸或酪氨酸(芳族氨基酸)；而在另一实施例中，非天然氨基酸类似于丙氨酸与 亮氨酸(疏水氨基酸)。在一实施例中，非天然氨基酸具有与天然氨基酸的那些性质不 同的性质。在一实施例中，这些不同性质为侧链的化学反应性，在另一实施例中此不同 化学反应性允许非天然氨基酸的侧链经历反应，而作为多肽的单元，即使同一多肽中的 天然存在氨基酸单元的侧链也不经历前述反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链 具有与天然存在氨基酸的侧链正交的化学。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括 含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电子试剂的部分 可经历亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。在这个段落中前述实施例中的任一者中，非天 然氨基酸可作为独立分子存在或可并入任何长度的多肽中；如果为后者，那么所述多肽 可进一步合并天然存在或非天然氨基酸。
另一方面为用于制备基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的经羟胺取代的分子。在另 一实施例中为用于通过在衍生分子与含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽之间形成 肟键衍生含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的经羟胺取代的分子。在其他实施例 中，前述含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽为含有酮基的非天然氨基酸多肽。在其 他或额外实施例中，含有羰基或二羰基的非天然氨基酸包括选自酮或醛的侧链。在其他 或额外实施例中，经羟胺取代的分子包括选自以下各物的群：标记；染料；聚合物；水 溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光 亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。在其他或额 外实施例中，经羟胺取代的分子为经羟胺取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例 中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然 氨基酸与经羟胺取代的分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与 含有羟胺的分子选择性反应的含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的 侧链上的含亲电子试剂的部分可经历亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这个段落中 描述的实施例有关的另一方面为由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰的 非天然氨基酸多肽。其他实施例包含对已修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面为用于制备基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的 分子。在另一实施例中为用于通过衍生分子与含有肟的肽或蛋白质之间的肟交换反应衍 生含有肟的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子。在另一实施例中为可在介 于约4与约8之间的pH值范围内经历肟与以含有肟的非天然氨基酸多肽交换的经羰基 或二羰基取代的分子。在另一实施例中为用于通过在衍生分子与含有肟(因此通过交换 类型反应形成新的肟键)或含有羟胺的非天然氨基酸多肽之间形成肟键衍生含有肟或含 有羟胺的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子。在另一实施例中，经羰基或 二羰基取代的分子为经醛取代的分子。在其他实施例中，经羰基或二羰基取代的分子包 括选自以下各物的群：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交 联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第 二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水 化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、 生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基； 与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位 体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基 团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性 部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制 性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放 射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑 制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定 基、受体、反胶束以及其任何组合。在其他或额外实施例中，经醛取代的分子为经醛取 代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨 基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羰基或二羰基取代的分子选择性 反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与含有羰基或二羰基的分子选择性反 应的部分，例如肟基或羟胺基；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的亲核部分可 经历亲电子进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这个段落中描述的实施例相关的另一方面 为由衍生分子与非天然氨基酸多肽反应产生的经修饰的非天然氨基酸多肽。其他实施例 包含对已修饰非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面为用于产生基于肟键的衍生非天然氨基酸多肽的单官能、双官能以及多官 能连接子。在一实施例中为可用于连接含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽与其他分 子的分子连接子(双官能以及多官能)。在另一实施例中为可用于连接含有肟或羟胺的 非天然氨基酸多肽与其他分子的分子连接子(双官能以及多官能)。在另一实施例中， 含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽包括酮及/或醛侧链。在利用含有肟或羟胺的非天 然氨基酸多肽的实施例中，分子连接子在其一末端含有羰基或二羰基；在其他实施例中， 羰基或二羰基是选自醛基或酮基。在其他或额外实施例中，经羟胺取代的连接子分子为 经羟胺取代的聚乙二醇(PEG)连接子分子。在其他或额外实施例中，经羰基或二羰基 取代的连接子分子为经羰基或二羰基取代的聚乙二醇(PEG)连接子分子。在其他实施 例中，短语“其他分子”包含(仅举例来说)蛋白质、其他聚合物及小分子。在其他或 额外实施例中，含有羟胺的连接子分子在所有末端上包括相同或等效的基团，以便在与 含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含有羰基或二羰基的非天然 氨基酸多肽的同多聚化物。在其他实施例中，同多聚化为同二聚化。在其他或额外实施 例中，含有羰基或二羰基的分子连接子在所有末端上包括相同或等效的基团，以便在与 含有肟或羟胺的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物为含有肟或羟胺的非天然氨基酸多 肽的同多聚化物。在其他实施例中，同多聚化为同二聚化。在另一实施例中，非天然氨 基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羟 胺取代的连接子分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存 在氨基酸的那些侧链正交的化学，其容许非天然氨基酸与经羰基或二羰基取代的连接子 分子选择性反应。在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链包括与含有羟胺的连接子分子 选择性反应的含亲电子试剂的部分；在另一实施例中，非天然氨基酸的侧链上的含亲电 子试剂的部分可经历含有羟胺的连接子分子的亲核进攻以产生肟衍生的蛋白质。与在这 个段落中描述的实施例相关的另一方面为由连接子分子与非天然氨基酸多肽反应产生 的键联的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽。其他实施例包含对键联的“经修 饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
一方面为通过羰基或二羰基与羟胺反应物的缩合产生肟基产物来衍生蛋白质的方 法。这个方面内包含用于基于含有羰基或二羰基的反应物与含有羟胺的反应物缩合产生 肟衍生的蛋白质加合物衍生蛋白质的方法。在额外或其他实施例中为以经羟胺官能化的 聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮蛋白质的方法。在额外或其他方面中为通过含有羰基或 二羰基的衍生分子与含有肟的肽或蛋白质之间的肟交换反应衍生含肟蛋白质的方法。在 额外或其他方面中，经羟胺取代的分子可包含蛋白质、其他聚合物以及小分子。
另一方面为化学合成用于衍生经酮取代的蛋白质的经羟胺取代的分子的方法。另一 方面为化学合成用于衍生经醛取代的蛋白质的经羟胺取代的分子的方法。在一实施例 中，经羟胺取代的分子可包括肽、其他聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在一实施例 中为制备适于衍生含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽(仅举例来说，其包含含酮的 非天然氨基酸多肽)的经羟胺取代的分子的方法。在另一或额外实施例中，非天然氨基 酸在蛋白质的活体内翻译期间位点特异地并入。在另一或额外实施例中，经羟胺取代的 分子通过羰基或二羰基的亲核进攻容许此含有羰基或二羰基的非天然氨基酸的位点特 异性衍生以以位点特异性方式形成肟衍生的多肽。在另一或额外实施例中，制备经羟胺 取代的分子的方法提供得到多种位点特异性衍生多肽的方法。在另一或额外实施例中为 合成经羟胺官能化的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为化学合成用于衍生经肟取代的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取 代的分子的方法。在一实施例中，经羰基或二羰基取代的分子为经酮取代的分子。在一 实施例中，经羰基或二羰基取代的分子为经醛取代的分子。在另一实施例中，经羰基或 二羰基取代的分子包含蛋白质、聚合物(未分枝和分枝)和小分子。在另一或额外实施 例中，这些方法补充能够在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性并入非天然氨基酸的技 术。在另一或额外实施例中为制备适于与含肟非天然氨基酸多肽反应以提供位点特异性 衍生的非天然氨基酸多肽的经羰基或二羰基取代的分子的一般方法。在另一或额外实施 例中为合成经羰基或二羰基取代的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面为使用含有羟胺的双官能连接子化学衍生经羰基或二羰基取代的非天然 氨基酸多肽的方法。在一实施例中为通过缩合反应产生肟键来连接经羟胺取代的连接子 与经羰基或二羰基取代的蛋白质的方法。在其他或额外实施例中，经羰基或二羰基取代 的非天然氨基酸为经酮取代的非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，使用含有羟胺的 双官能连接子，非天然氨基酸多肽经位点特异性地衍生及/或三维结构得到精确控制地衍 生。在一实施例中，这些方法用于将分子连接子(包含(但不限于)单官能、双官能以 及多官能连接子)连接到含有羰基或二羰基(包含(但不限于)含酮及含醛)的非天然 氨基酸多肽上，其中至少一个连接子末端含有羟胺基，其可通过肟键键联到含有羰基或 二羰基的非天然氨基酸多肽上。在另一或额外实施例中，这些连接子用于连接含有羰基 或二羰基的非天然氨基酸多肽与其他分子，其包含(例如)蛋白质、其他聚合物(分枝 和未分枝)和小分子。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽键联到水溶性聚合物上。在一些实施例中，水 溶性聚合物包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，聚乙二醇分子为双官能聚合物。在一 些实施例中，双官能聚合物键联到第二多肽上。在一些实施例中，第二多肽与第一多肽 相同，在其他实施例中，第二多肽为不同的多肽。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽 包括至少两种键联到水溶性聚合物(包括聚乙二醇部分)上的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基酸多肽对受体的亲和力的 取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基酸多肽的 稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大非天然氨基 酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包括增大所 产生的非天然氨基酸多肽在宿主细胞中的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中， 相对于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽，非天然氨基酸多肽包括调节蛋白酶抗性、 血清半衰期、免疫原性及/或表达的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽为促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂 或反向促效剂。在一些实施例中，促效剂、部分促效剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向促 效剂包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包括聚 乙二醇部分。在一些实施例中，包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽(例如) 可防止相应受体的二聚化。在一些实施例中，包括与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸 的多肽调节多肽与结合搭配物、配位体或受体的结合。在一些实施例中，包括与水溶性 聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽的一种或一种以上的性质或活性。
在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子(amber codon)、赭石密码子 (ochre codon)、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子(unique codon)、稀有密码子 (rare codon)、非天然密码子(unnatural codon)、五碱基密码子(five-base codon)以及 四碱基密码子(four-base codon)组成的群组。
本文中也描述制造与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸多肽的方法。在一些实施例 中，所述方法包括使包括非天然氨基酸的经分离多肽与包括与非天然氨基酸反应的部分 的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入的非天然氨基酸对与20种常见氨基酸中 的任一种不具有反应性的水溶性聚合物有反应性。在一些实施例中，水基聚合物包括聚 乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于)介于约100Da与 约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、 800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量 在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000 Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇 分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含 (但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、 70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000 Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、 7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da及1,000Da。在一些实施 例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG 的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约 5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000 Da之间。
本文中也描述包括包含至少一种本文中所述的非天然氨基酸和医药学上可接受的 载剂的组合物。在一些实施例中，非天然氨基酸键联至水溶性聚合物上。本文中也描述 包括医药学上可接受的载剂和多肽的医药组合物，其中至少一个氨基酸经非天然氨基酸 取代。在一些实施例中，非天然氨基酸包括糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通 过糖部分键联至多肽上。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的前药；本文中进一步描述包括这些前药和医药学上可接受的载剂的组 合物。本文中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的 代谢物；这些代谢物可具有补充或协同加强非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰 的非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸、非 天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽向生物体(包含需要此代谢物的患者)提 供所需代谢物的用途。
本文中也描述包括编码多肽且包括选择密码子的聚核苷酸的细胞。在一些实施例 中，细胞包括用于将非天然氨基酸代入多肽中的正交RNA合成酶及/或正交tRNA。在 一些实施例中，细胞是在细胞培养物中，而在其他实施例中为多细胞生物(包含两栖动 物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)的部分的细胞。在细胞实施例的任一者中，其他实施 例包含产生非天然氨基酸多肽的聚核苷酸的表达。在其他实施例中为可利用本文中所述 的非天然氨基酸产生非天然氨基酸多肽(包含经修饰的非天然氨基酸多肽)的生物体。 在其他实施例中为含有本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽及/或经修饰的非 天然氨基酸多肽的生物体。这些生物体包含单细胞生物和多细胞生物，其包含两栖动物、 爬行动物、鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在活体外产生。在 一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在细胞溶解产物中产生。在一些实施例中，非天然 氨基酸多肽通过核糖体翻译产生。
本文中也描述制造包括非天然氨基酸的多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包 括在容许多肽表达的条件下培养包括编码多肽、正交RNA合成酶及/或正交tRNA的聚 核苷酸的细胞；和从细胞及/或培养基中纯化多肽。
本文中也描述本文中所述的非天然氨基酸的库或本文中所述的非天然氨基酸多肽 的库，或本文中所述的经修饰的非天然氨基酸多肽的库，或其组合库。本文中也描述含 有至少一种非天然氨基酸、至少一种非天然氨基酸多肽及/或至少一种经修饰的非天然氨 基酸的阵列。本文中也描述含有至少一种编码多肽且包括选择密码子的聚核苷酸的阵 列。本文中所述的阵列可用于筛检生物体中非天然氨基酸多肽的产生(通过检测编码多 肽的聚核苷酸的转录或通过检测多肽的翻译)。
本文中也描述筛检本文中所述的库的所需活性的方法，或使用本文中所述的阵列筛 检本文中所述的库或其他化合物及/或多肽及/或聚核苷酸的库的所需活性的方法。本文 中也描述来自库筛检的此活性数据用于开发和发现新的治疗剂的用途，以及治疗剂本 身。
本文中也描述增大多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。在一些实施 例中，方法包括用至少一种非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任一或多种氨基酸及/ 或使多肽与水溶性聚合物偶合。
本文中也描述以有效量的医药组合物治疗需要此治疗的患者的方法，其中所述医药 组合物包括包含非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天 然氨基酸与水溶性聚合物偶合。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，其中所述非天然氨基酸是选自 由含肟非天然氨基酸、含羰基非天然氨基酸、含二羰基非天然氨基酸和含羟胺非天然氨 基酸组成的群组。在其他实施例中，这些非天然氨基酸通过生物合成并入本文中所述的 多肽中。在其他或替代实施例中，这些非天然氨基酸多肽包括至少一种选自式I-XVIII、 式XXX-XXXIV(A和B)或式XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增强多肽的生物可用性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增加多肽的安全概况。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的水溶性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的治疗半衰期。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽增大多肽的血清半衰期。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽延长多肽的循环时间。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽调节多肽的生物活性。
在其他或替代实施例中为治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包括投与治疗有 效量的包括至少一种含肟非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，且相对于同源天然存在氨 基酸多肽来说，所得生物合成的含肟非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
应了解本文中所述的方法和组合物不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞株、 构筑体和试剂且同样可改变。同样应了解本文中使用的术语仅为了描述特定实施例的目 的，且并非意欲限制本文中所述的方法和组合物的范畴，其应仅由随附权利要求来限制。
除非上下文另外明确指出，否则如本文中及随附权利要求中所使用，单数形式“一” 以及“所述”包含复数提及。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有如本文中描述的本 发明所属领域的技术人员通常所了解的相同含义。尽管与本文中所述的那些类似或等效 的任何方法、装置和材料可用于本文中所述的本发明的实施或测试中，但现在描述优选 方法、装置及材料。
本文中提及的所有公开案和专利是为了描述和揭露(例如)公开案中描述的构筑体 以及方法的目的以引用的方式全部并入本文中，其可连同本文中描述的本发明一起使 用。本文中论述的公开案仅在本申请案的申请日期之前提供其揭露内容。本文中任何事 物不应理解为承认本文中所述的本发明者由于先前发明或为任何其他原因无权提早此 揭露内容的日期。
如本文中所使用的术语“亲和性标记”指的是可逆或不可逆地与另一分子结合以对 其进行修饰、将其破坏或与其形成化合物的标记。举例来说，亲和性标记包含酶及其基 质，或抗体及其抗原。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”以及“烷硫基”是以其常规意义使用，且指的是分别 通过氧原子、氨基、硫原子键联至分子上的烷基。
除非另外指出，否则术语“烷基”(自身或作为另一分子的部分)意谓直链或支链， 或环状烃基，或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的且可包含具有指定碳 原子数目(即C1-C10意谓1至10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包含 (但不限于)以下基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、 仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛 基及其类似基团的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上的双键或三键的 烷基。不饱和烷基的实例包含(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、 2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔 基以及更高级的同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”也意谓包含本文中 更详细定义的烷基的那些衍生物，诸如“杂烷基”、“卤烷基”和“高烷基”。
术语“亚烷基”(自身或作为另一分子的部分)意谓由烷烃衍生的二价基团，如由 (-CH2-)n例示，其中n可为1至约24。仅举例来说，这些基团包含(但不限于)具有10 个或更少碳原子的基团，诸如结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-。“低级烷基”或“低级 亚烷基”为通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。除非另外指出，否则术 语“亚烷基”也意谓包含本文中描述为“亚杂烷基”的那些基团。
术语“氨基酸”指的是天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在氨 基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基 酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、 组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及焦赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天 然存在氨基酸相同的基本化学结构(仅举例来说，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的 α-碳)的化合物。这些类似物可具有经修饰的R基团(举例来说，正亮氨酸)或可具有 经修饰的肽主链，而仍保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非 限制性实例包含高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸硫氧化物、甲硫氨酸甲基锍。
氨基酸在本文中可由其名称、其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学 命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号称 呼。另外，核苷酸可由其通常接受的单字母代码称呼。
“氨基末端修饰基团”指的是可连接至末端氨基上的任何分子。举例来说，这些末 端氨基可在聚合分子的末端处，其中这些聚合分子包含(但不限于)多肽、聚核苷酸以 及多糖。末端修饰基团包含(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来说， 末端修饰基团包含聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合分子的治疗特 征，其包含(但不限于)增大肽的血清半衰期。
“抗体片段”意谓除全长形式之外的抗体的任何形式。在本文中抗体片段包含为存 在于全长抗体内的较小组分的抗体，以及经工程化设计的抗体。抗体片段包含(但不限 于)Fv、Fc、Fab，以及(Fab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双 功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、构架区、恒定区、重链、 轻链和可变区，以及替代性骨架非抗体分子、双特异性抗体及其类似物(Maynard和 Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol. 9：395-402)。另一功能性亚结构为单链Fv(scFv)，其包括由肽连接子共价连接的免疫球 蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小 (Mr 25,000)蛋白质通常保持对单一多肽中的抗原的特异性和亲和性且可为较大的抗原 特异性分子提供适当构建单元。除非另外特定指出，否则使用术语“抗体”的陈述和权 利要求明确包含“抗体片段”。
如本文中所使用，术语“芳族”或“芳基”指的是具有至少一个具有共轭π电子系 统的环且包含碳环芳基与杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳族”)的闭合环结构。碳环 或杂环芳族基团可含有5至20个环原子。所述术语包含共价键联的单环或稠合的多环 (即，共用相邻碳原子对的环)基团。芳族基团可未经取代或经取代。“芳族”或“芳 基”基团的非限制性实例包含苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、蒽基和菲基。上述芳 基和杂芳基环系统中的每一者的取代基是选自本文中描述的可接受的取代基的群组。
为了简便起见，当与其他术语组合使用(包含(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、 芳烷基)时，术语“芳族”或“芳基”包含如上所定义的芳基环与杂芳基环两者。因此， 术语“芳烷基”或“烷芳基”意谓包含其中芳基连接至烷基上的那些基团(其包含(但 不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基及其类似基团)，其中所述烷基包含其中碳原子(包 含(但不限于)亚甲基)已由杂原子(仅举例来说，氧原子)取代的那些烷基。这些芳 基的实例包含(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基及其类 似基团。
如本文中所使用，术语“亚芳基”指的是二价芳基。“亚芳基”的非限制性实例包 含亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基以及亚噻吩基。亚芳基的取代基选自本文中描述的可接 受的取代基的群组。
“双官能聚合物”，也被称作“双官能连接子”，其指的是包括两个能够与其他部分 特异性反应以形成共价键或非共价键的官能基的聚合物。这些部分可包含(但不限于) 天然氨基酸或非天然氨基酸或含有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基。仅举 例来说，双官能连接子可具有与第一肽上的基团有反应性的官能基，以及与第二肽上的 基团有反应性的另一官能基，藉此形成包含第一肽、双官能连接子以及第二肽的接合物。 已知用于将多种化合物与肽连接的众多程序和连接子分子。参见(例如)欧洲专利申请 案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784 号；第4,680,338号；以及第4,569,789号，其是以引用的方式全部并入本文中。“多官 能聚合物”也被称作“多官能连接子”，其指的是包括两个或两个以上能够与其他部分 反应的官能基的聚合物。这些部分可包含(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含 有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基(包含(但不限于)氨基酸侧基)以形 成共价键或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物可为任何所需长度或分子量，且可 经选定以在键联至化合物的一个或一个以上的分子与其结合的分子或化合物之间提供 特定所需间隔或构象。
如本文中所使用，术语“生物可用性”指的是物质或其活性部分从医药剂型递送且 在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以及程度。生物可用性的增加指的是增加 物质或其活性部分从医药剂型递送且在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以 及程度。举例来说，生物可用性的增加可指示为与其他物质或活性部分相比时血液中物 质或其活性部分浓度的增加。评估生物可用性增加的方法的非限制性实例于实例88-92 中给出。这种方法可用于评估任何多肽的生物可用性。
当在本文中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”意 谓可影响生物系统、路径、分子的任何物理或生物化学性质或与生物体相关的相互作用 的任何物质，所述生物体包含(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆 虫、真菌、植物、动物以及人类。具体来说，如本文中所使用，生物活性分子包含(但 不限于)意欲用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其他动物的疾病，或另外用于 增强人类或动物的身体或精神健康的任何物质。生物活性分子的实例包含(但不限于) 肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性毒品、软性毒品、碳水化合物、无机原子或分子、 染料、脂质、核苷、放射性核、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束。 适于以本文中所述的方法以及组合物使用的生物活性剂的种类包含(但不限于)药物、 前药、放射性核、显像剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、 心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、甾族剂、微生物来源的毒素及其类似物。
“调节生物活性”意谓提高或降低多肽的反应性，改变多肽的选择性，增强或降低 多肽的底物选择性。分析生物活性改变可通过比较非天然多肽的生物活性与天然多肽的 生物活性来进行。
如本文中所使用，术语“生物材料”指的是生物来源的材料，其包含(但不限于) 从生物反应器及/或由重组方法和技术获得的材料。
如本文中所使用，术语“生物物理探针”指的是可检测或监测分子的结构变化的探 针。这些分子包含(但不限于)蛋白质且“生物物理探针”可用于检测或监测蛋白质与 其他大分子的相互作用。生物物理探针的实例包含(但不限于)自旋标记、荧光团以及 可光活化基团。
如本文中所使用，术语“生物合成”指的是利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何 方法，其包含使用以下组分中的至少一者：聚核苷酸、密码子、tRNA以及核糖体。举 例来说，非天然氨基酸可使用部分VIII“活体内产生包括非天然氨基酸的多肽”以及非 限制性实例14中所述的方法和技术“通过生物合成并入”非天然氨基酸多肽中。另外， 选择可“通过生物合成并入”非天然氨基酸多肽中的适用非天然氨基酸的方法描述于非 限制性实例15-16中。
如本文中所使用，术语“生物素类似物”(或亦被称作“生物素模拟物”)为除生物 素之外以高亲和力与抗生物素蛋白及/或链霉抗生物素蛋白结合的任何分子。
如本文中所使用的术语“羰基”指的是在部分上含有选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2- 及-C(S)-组成的群组的基团，其包含(但不限于)含有至少一个酮基及/或至少一个醛基 及/或至少一个酯基及/或至少一个羧酸基团及/或至少一个硫酯基的基团。这些羰基包含 酮、醛、羧酸、酯以及硫酯。另外，这些基团可为线性、分枝或环状分子的部分。
术语“羧基末端修饰基团”指的是可连接至末端羧基上的任何分子。举例来说，这 些末端羧基可在聚合分子的末端处，其中这些聚合分子包含(但不限于)多肽、聚核苷 酸和多糖。末端修饰基团包含(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质。仅举例来 说，末端修饰基团包含聚乙二醇或血清白蛋白。末端修饰基团可用于改变聚合分子的治 疗特征，其包含(但不限于)增加肽的血清半衰期。
如本文中所使用，术语“可化学裂解基团”(亦被称作“化学上不稳定”)指的是在 暴露于酸、碱、氧化剂、还原剂、化学引发剂或自由基引发剂后分解或裂解的基团。
如本文中所使用，术语“化学发光基团”指的是在不额外加热的情况下由于化学反 应而发光的基团。仅举例来说，在碱和金属催化剂的存在下，鲁米诺(luminol)(5-氨 基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)与氧化剂(如过氧化氢(H2O2))反应产生激发态产物(3- 氨基邻苯二甲酸盐，3-APA)。
如本文中所使用，术语“发色团”指的是吸收可见光波长、UV波长或IR波长的光 的分子。
如本文中所使用，术语“辅因子”指的是大分子的作用必需的原子或分子。辅因子 包含(但不限于)无机离子、辅酶、蛋白质或酶的活性必需的一些其他因子。实例包含 血色素中的亚铁血红素、叶绿素中的镁，以及蛋白质的金属离子。
如本文中所使用，“共折叠”指的是使用至少两个彼此相互作用的分子且使得未折 叠或不当折叠的分子转变为适当折叠的分子的再折叠过程、反应或方法。仅举例来说， “共折叠”使用至少两个彼此相互作用的多肽且使得未折叠或不当折叠的多肽转变为天 然、适当折叠的多肽。这些多肽可含有天然氨基酸及/或至少一个非天然氨基酸。
如本文中所使用，“比较窗口”指的是在两个序列经最佳比对后用于比较相同数目 邻接位置的序列与参照序列的邻接位置的任一者的区段。这些邻接位置包含(但不限于) 由约20至约600个连续单元组成的群组，其包含约50至约200个连续单元，以及约100 至约150个连续单元。仅举例来说，这些序列包含多肽和含有非天然氨基酸的多肽，其 中连续单元包含(但不限于)天然氨基酸和非天然氨基酸。另外，仅举例来说，这些序 列包含聚核苷酸，其中核苷酸为相应连续单元。用于比较的序列比对方法在所属领域中 为熟知的。可由以下方法进行用于比较的最佳序列比对，其包含(但不限于)Smith和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci. USA 85：2444的相似性搜索方法、这些算法的电脑化实现(威斯康辛遗传学软件包 (Wisconsin Genetics Software Package)(Genetics Computer Group，575 Science Dr.， Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手工比对以及视觉检查(参 见(例如)Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
举例来说，可用于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人.(1997)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，以及Altschul 等人.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物科技 信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数 W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W) 为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两个链的比较作为默认值。对于氨基酸序列， BLASTP程序使用字长为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff 和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)为50、期望值(E) 为10、M＝5、N＝-4以及两个链的比较作为默认值。BLAST算法通常在“低复杂性”过 滤器关闭的情况下进行。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(参见(例如)Karlin和Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量 度为最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率 的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，或 小于约0.01，或小于约0.001，那么就认为核酸与参考序列相似。
术语“经保守性修饰的变体”应用于天然和非天然氨基酸序列以及天然和非天然核 酸序列，及其组合。关于特定核酸序列，“经保守性修饰的变体”指的是编码相同或基 本上相同的天然和非天然氨基酸序列，或其中天然和非天然核酸不编码天然和非天然氨 基酸序列(对于基本上相同的序列)的那些天然和非天然核酸。举例来说，由于遗传密 码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、 GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每一位置处， 密码子可改变为任一相应密码子而不改变所编码的多肽。这些核酸变异为“沉默变异”， 其为经保守性修饰的变异中的一种。因此例如编码天然或非天然多肽的本文中的每一天 然或非天然核酸序列也描述天然或非天然核酸的每一可能沉默变异。所属领域的技术人 员应了解天然或非天然核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，其中AUG通常仅 为甲硫氨酸的密码子，TGG通常仅为色氨酸的密码子)可经修饰以产生功能上相同的分 子。因此，编码天然和非天然多肽的天然和非天然核酸的每一沉默变异暗含于每一所述 序列中。
关于氨基酸序列，对改变、添加或缺失编码序列中单一天然和非天然氨基酸或小百 分比的天然和非天然氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为 “经保守性修饰的变体”，其中改变造成氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或天然和非天 然氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域中熟知提供功能上类似的天然氨基酸的 保守取代表。这些经保守性修饰的变体不同于多态变体、种间同源物以及本文中所述方 法和组合物的等位基因且不排除这些物质。以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基 酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见(例如)Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.；第2版(1993年12月))。
除非另外指出，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”(自身或与其他术语组合)分 别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包含饱和、部分不 饱和和完全不饱和的环键联。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接至分子的其 余部分的位置。杂原子可包含(但不限于)氧、氮或硫。环烷基的实例包含(但不限于) 环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基以及其类似基团。杂环烷基的实例 包含(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、 3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、 2-哌嗪基以及其类似基团。另外，术语涵盖多环状结构，其包含(但不限于)双环状环 结构和三环状环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”(自身或作为另一分子的部分)意 谓衍生自杂环烷基的二价基团，且术语“亚环烷基”(自身或作为另一分子的部分)意 谓衍生自环烷基的二价基团。
如本文中所使用，术语“环糊精”指的是在环构成中由至少6至8个葡萄糖分子组 成的环状碳水化合物。环的外部含有水溶性基团；在环的中心为能够容纳小分子的相对 非极性空穴。
如本文中所使用，术语“细胞毒性”指的是伤害细胞的化合物。
如本文中所使用，“变性剂”指的是会造成聚合物可逆性伸展的任何化合物或物质。 仅举例来说，“变性剂”可造成蛋白质的可逆性伸展。变性剂的强度将由特定变性剂的 性质和浓度来决定。举例来说，变性剂包含(但不限于)离液剂、去污剂、水可混溶有 机溶剂、磷脂或其组合。离液剂的非限制性实例包含(但不限于)尿素、胍以及硫氰酸 钠。去污剂的非限制性实例可包含(但不限于)：强去污剂，诸如十二烷基硫酸钠或聚 氧乙烯醚(例如Tween或Triton去污剂)、十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)；温和非离子 去污剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))；温和阳离子去污剂，诸如N-＞2，3-(二油烯氧 基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子去污剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子 去污剂，其包含(但不限于)磺酸甜菜碱(Zwiftergent)、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基 -1-丙烷硫酸盐(CHAPS)以及3-(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐 (CHAPSO)。水可混溶有机溶剂的非限制性实例包含(但不限于)乙腈、低级烷醇(尤 其C2-C4烷醇，诸如乙醇或异丙醇)，或低级烷二醇(C2-C4烷二醇，诸如乙二醇)可用 作变性剂。磷脂的非限制性实例包含(但不限于)天然存在的磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、 卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变体，诸如二己酰基卵磷脂 或二庚酰基卵磷脂。
如本文中所使用，术语“可检测标记”指的是可使用分析技术观测到的标记，这些 分析技术包含(但不限于)荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见吸收光谱、质谱、 核磁共振、磁共振以及电化学方法。
如本文中所使用的术语“二羰基”指的是含有至少两个选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2- 和-C(S)-组成的群组的部分的基团，其包含(但不限于)1，2-二羰基、1，3-二羰基和1，4- 二羰基，以及含有至少一个酮基及/或至少一个醛基及/或至少一个酯基及/或至少一个羧 酸基团及/或至少一个硫酯基的基团。这些二羰基包含二酮、酮醛、酮酸、酮酯以及酮硫 酯。另外，这些基团可为线性、分枝或环状分子的部分。二羰基中的两个部分可相同或 不同，且可包含会在两个部分的任一者处产生(仅举例来说)酯、酮、醛、硫酯或酰胺 的取代基。
如本文中所使用，术语“药物”指的是在预防、诊断、缓解、治疗或治愈疾病或病 状中使用的任何物质。
如本文中所使用，术语“染料”指的是含有发色团的可溶染色物质。
如本文中所使用，术语“有效量”指的是会在一定程度上减轻一种或一种以上所治 疗的疾病或病状的症状的所投与的药剂或化合物的足够量。结果可为疾病的症候、症状 或病因的降低及/或缓解，或生物系统的任何其他所需改变。举例来说，所投与的药剂或 化合物包含(但不限于)天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多 肽，或经修饰的非氨基酸多肽。可投与含有这些天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、 经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物用于预防性、增强及/ 或治疗性治疗。在任何个别情况下的适当“有效”量可使用诸如剂量增加研究的技术来 确定。
如本文中所使用，术语“电子致密基团”指的是当以电子束照射时散射电子的基团。 这些基团包含(但不限于)钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉、99％、碳酰肼、六水合氯化 铁、六亚甲基四胺、98.5％、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、 硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银(Ag 检定：8.0-8.5％)“强”、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫 脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰以及硫酸氧钒。
如本文中所使用，术语“能量转移剂”指的是可贡献或接受来自另一分子的能量的 分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)为偶极-偶极偶合过程，通过这个过程 荧光供体分子的激发态能量非辐射性地转移到未激发受体分子上，其随后以较长波长荧 光发射获赠的能量。
术语“增强”意谓增加或延长所需效应的效力或持续时间。举例来说，“增强”治 疗剂的效应指的是在治疗疾病、病症或病状期间增加或延长治疗剂的效力或持续时间、 效应的能力。如本文中所使用，“增强有效量”指的是在治疗疾病、病症或病状期间足 以增强治疗剂的效应的量。当用于患者中时，对于此用途有效的量应取决于疾病、病症 或病状的严重性和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师 的判断。
如本文中所使用，术语“真核生物”指的是属于种系发生学上真核域(domain Eucarya)的生物体，其包含(但不限于)动物(包含(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬 行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包含(但不限于)单子叶植物、双子叶植物以及藻 类)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫以及原生生物。
如本文中所使用，术语“脂肪酸”指的是具有约C6或更长烃侧链的羧酸。
如本文中所使用，术语“荧光团”指的是经激发后发射光子且进而发荧光的分子。
如本文中所使用，术语“官能基”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应 性位点”、“化学反应性基团”以及“化学反应性部分”指的是发生化学反应的分子的部 分或单元。这些术语在化学领域中有些同义且在本文中用于指示执行一些功能或活性且 与其他分子有反应性的分子的部分。
术语“卤素”包含氟、氯、碘以及溴。
如本文中所使用，术语“卤酰基”指的是含有卤素部分的酰基，其包含(但不限于) -C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3以及其类似基团。
如本文中所使用，术语“卤烷基”指的是含有卤素部分的烷基，其包含(但不限于) -CF3和-CH2CF3以及其类似基团。
如本文中所使用，术语“杂烷基”指的是直链或支链或环状烃基，或其组合，其由 烷基和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，且其中氮原子和硫原 子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷 基的任何内部位置或位于烷基连接至分子的其余部分的位置处。实例包含(但不限于) -CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、 -CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、 -CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。另外，至多两个杂原子可为连续的，诸如， -CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
如本文中所使用，术语“亚杂烷基”指的是由杂烷基衍生的二价基团，如由 -CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示(但并非限制)。对于亚杂烷基 来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包含(但不限于)亚烷基氧基、 亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基以及其类似基团)。更进 一步地，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，键联基团的方向并非由书写键联基团的 式的方向暗示。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-与-R′C(O)2-两者。
如本文中所使用，术语“杂芳基”或“杂芳族”指的是含有至少一个选自N、O和 S的杂原子的芳基；其中氮原子和硫原子可视情况经氧化，且氮原子可视情况经季铵化。 杂芳基可经取代或未经取代。杂芳基可通过杂原子连接到分子的其余部分上。杂芳基的 非限制性实例包含1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡 嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5- 异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、 2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并 咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6- 喹啉基。
如本文中所使用的术语“高烷基”指的是作为烃基的烷基。
如本文中所使用，术语“一致”指的是相同的两个或两个以上的序列或子序列。另 外，如本文中所使用，术语“实质上一致”指的是当经比较窗口或如使用比较算法或由 手工比对和视觉检查测量的指定区域比较和比对最大对应性时，具有一定百分比的相同 连续单元的两个或两个以上的序列。仅举例来说，如果在指定区域上连续单元为约60％ 一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一 致或约95％一致，那么两个或两个以上的序列可为“实质上一致的”。这些百分比描述 两个或两个以上序列的“一致性百分比”。序列的一致性可存在于长度为至少约75-100 个连续单元的区域上、长度为约50个连续单元的区域上，或(如果未指定)整个序列 上。这个定义也涉及测试序列的互补序列。仅举例来说，当氨基酸残基相同时，两个或 两个以上的多肽序列为一致的，而如果氨基酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％ 一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一 致，那么两个或两个以上的多肽序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少 约75-100个氨基酸的区域上、长度为约50个氨基酸的区域上，或(如果未指定)多肽 序列的整个序列上。另外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或两个以上的聚核苷 酸序列为一致的，而如果核酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％一致、约70％一 致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两 个以上的聚核苷酸序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少约75-100个核 酸的区域上、长度为约50个核酸的区域上，或(如果未指定)聚核苷酸序列的整个序 列上。
关于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参考序列。当使用序列 比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑中，指定子序列坐标，(必要时)且指定 序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后序列比较算法基于 程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文中所使用，术语“免疫原性”指的是对投与治疗药物有反应的抗体。针对治 疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性可使用用于检测生物流体中抗非天然氨基酸多肽抗 体的定量和定性检定来获得。这些检定包含(但不限于)放射性免疫测定(RIA)、酶联 免疫吸附检定(ELISA)、发光免疫检定(LIA)以及荧光免疫检定(FIA)。针对治疗性 非天然氨基酸多肽的免疫原性的分析包括比较投与治疗性非天然氨基酸多肽后的抗体 反应和投与治疗性天然氨基酸多肽后的抗体反应。
如本文中所使用，术语“插入剂”(也被称作“插入基团”)指的是可插入分子的分 子内空间或分子之间的分子间空间中的化学品。仅举例来说，插入剂或插入基团可为插 入DNA双螺旋的堆积碱基中的分子。
如本文中所使用，术语“分离”指的是从不关注的组分中分离且移出所关注的组分。 经分离的物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液形式，其包含(但不限于)水溶液。经 分离的组分可为均质状态或经分离的组分可为包括额外医药学上可接受的载剂及/或赋 形剂的医药组合物的部分。纯度和均质性可使用分析化学技术来测定，其中所述技术包 含(但不限于)聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。另外，当所关注的组分经分离且 为制剂中存在的主要物质时，所述组分在本文中描述为经实质上纯化。如本文中所使用， 术语“纯化”指的是至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或更纯的所关注 的组分。仅举例来说，当核酸或蛋白质不含至少一些在天然状态下与其缔合的细胞组分， 或核酸或蛋白质已经浓缩为比其在活体内或活体外产生的浓度高的水平时，这些核酸或 蛋白质为“经分离的”。同样，例如，当与位于基因外侧且编码蛋白质而非所关注的基 因的开放阅读框分离时，所述基因为经分离的。
如本文中所使用，术语“标记”指的是并入化合物中且易于检测，藉此可检测及/ 或监测其物理分布的物质。
如本文中所使用，术语“键联”指的是由连接子的官能基与另一分子之间的化学反 应形成的键或化学部分。这些键可包含(但不限于)共价键和非共价键，而这些化学部 分可包含(但不限于)酯、碳酸酯、亚胺、磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键以及寡核 苷酸键。水解上稳定的键联意谓所述键联在水中实质上稳定且在适用pH值下(其包含 (但不限于)在生理条件下)长期(或许甚至无限期地)不与水反应。水解上不稳定或 可降解的键联意谓所述键联可在水或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不稳定或可 降解的键联意谓所述键联可由一或一种以上的酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物 可包含在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能基之 间的连接子基团中的可降解键联。这些可降解键联包含(但不限于)由PEG羧酸或活化 PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中这些酯基通常在生理条件下水解 以释放生物活性剂。其他水解可降解键联包含(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应形 成的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键； 作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由氨基(包 含(但不限于)在诸如PEG的聚合物的末端上)与肽的羧基形成的肽键；以及由亚磷酰 胺基(包含(但不限于)在聚合物的末端上)与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
如本文中所使用，术语“培养基”指的是用于生长和收集细胞及/或由这些细胞表达 及/或分泌的产物的任何培养基。这些“培养基”包含(但不限于)溶液、固体、半固体 或可支持或含有任何宿主细胞的刚性载体，所述宿主细胞包含(例如)细菌宿主细胞、 酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO 细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞，以及 细胞内含物。这些“培养基”包含(但不限于)其中宿主细胞已生长于多肽已分泌于其 中的培养基，其包含在增殖步骤之前或之后的培养基。这些“培养基”也包含(但不限 于)含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，例如细胞内产生的多肽且宿主细胞溶解或 分裂以释放多肽。
如本文中所使用，术语“代谢物”指的是化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨 基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)的衍生物，其是在 化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰 的非天然氨基酸多肽)代谢时形成的。术语“医药活性代谢物”或“活性代谢物”指的 是化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修 饰的非天然氨基酸多肽)的生物活性衍生物，其是在此化合物(例如天然氨基酸多肽、 非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)代谢时形 成的。
如本文中所使用，术语“代谢”指的是特定物质由生物体改变的过程的和。这些过 程包含(但不限于)水解反应和由酶催化的反应。关于新陈代谢的其他信息可获自The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill(1996)。仅举例来说，天然 氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多 肽的代谢物可通过将天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或 经修饰的非天然氨基酸多肽投与宿主且分析来自宿主的组织样本来鉴别，或通过将天然 氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多 肽与肝细胞一起活体外培养且分析所得化合物来鉴别。
如本文中所使用，术语“金属螯合剂”指的是与金属离子形成金属络合物的分子。 举例来说，这些分子可与中心金属离子形成两个或两个以上的配位键且可形成环结构。
如本文中所使用，术语“含金属部分”指的是含有金属离子、原子或粒子的基团。 这些部分包含(但不限于)顺铂(cisplatin)、螯合金属离子(诸如镍、铁和铂)，以及 金属纳米粒子(诸如镍、铁和铂)。
如本文中所使用，术语“结合有重原子的部分”指的是结合有通常比碳更重的原子 的离子的基团。这些离子或原子包含(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
如本文中所使用，术语“经修饰”指的是存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然 氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。这些改变或修饰可通过天然氨基酸、非天然氨 基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰，或通过天然氨基酸、非天然 氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的共翻译修饰或翻译后修饰来获得。形式 “经修饰或未经修饰”意谓所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非 天然氨基酸多肽视情况经修饰，即所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多 肽或非天然氨基酸多肽可经修饰或未经修饰。
如本文中所使用，术语“经调节的血清半衰期”指的是经修饰的生物活性分子相对 于其非未经修饰形式的循环半衰期的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活性分 子包含(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。 举例来说，血清半衰期是通过在投与生物活性分子或经修饰的生物活性分子后的多个时 间点取血液样本且测定每一样本中那种分子的浓度来测量的。血清浓度与时间的相关性 使得可以计算血清半衰期。举例来说，经调节的血清半衰期可为血清半衰期增加，其可 使得能够得到改良的给药方案或避免毒性效应。此血清增加可为至少约两倍、至少约三 倍、至少约五倍，或至少约十倍。评估血清半衰期增加的方法的非限制性实例于实例 88-92中给出。这个方法可用于评估任何多肽的血清半衰期。
如本文中所使用，术语“经调节的治疗半衰期”指的是治疗有效量的经修饰生物活 性分子相对于其未经修饰形式的半衰期的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活 性分子包含(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸 多肽。举例来说，治疗半衰期通过在投药后的多个时间点测量分子的药物动力学及/或药 效学性质来测量。增加的治疗半衰期可使得能够得到特定有益给药方案、特定有益总剂 量，或避免不当效应。举例来说，增加的治疗半衰期可由增大的效力、经修饰的分子与 其标靶的结合增加或减少、未经修饰的分子的另一参数或作用机制的增大或减小，或分 子由酶(诸如，仅举例来说，蛋白酶)分解增加或减少产生。评估治疗半衰期增加的方 法的非限制性实例于实例88-92中给出。这个方法可用于评估任何多肽的治疗半衰期。
如本文中所使用，术语“纳米粒子”指的是具有约500nm至约1nm之间的粒度的 粒子。
如本文中所使用，术语“接近化学计量”指的是参与化学反应的化合物的摩尔比为 约0.75至约1.5。
如本文中所使用，术语“非真核生物”指的是非真核生物体。举例来说，非真核生 物体可属于真细菌(Eubacteria)(其包含(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜 热栖热菌(Thermus thermophilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、种系发生学上的域，或古生菌(Archaea)，其包 含(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、热自养甲烷杆菌 (Methanobacterium thermoautotrophicum)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强 烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌 (Aeuropyrum pernix)，或嗜盐杆菌(Halobacterium)，诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)以及嗜盐杆菌种NRC-1，或种系发生学上的域。
“非天然氨基酸”指的是不为20种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种 的氨基酸。可与术语“非天然氨基酸”同义使用的其他术语为“非天然编码氨基酸”、“非 自然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”，以及其各种带有连字符和不带连字符的形式。术 语“非天然氨基酸”包含(但不限于)通过修饰天然编码氨基酸(包含(但不限于)20 种常见氨基酸或焦赖氨酸以及硒半胱氨酸)天然存在但并非通过翻译复合物自身并入生 长的多肽链中的氨基酸。不为天然编码的天然存在氨基酸的实例包含(但不限于)N-乙 酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖氨基-L-苏氨酸以及O-磷酸基酪氨酸。另外，术语“非 天然氨基酸”包含(但不限于)序非天然存在且可由合成获得或可通过修饰非天然氨基 酸获得的氨基酸。
如本文中所使用，术语“核酸”指的是脱氧核苷酸、脱氧核苷、核苷或核苷酸以及 其单链或双链形式的聚合物。仅举例来说，这些核酸和核酸聚合物包含(但不限于)(i) 天然核苷酸的类似物，其具有与参考核酸类似的结合性质且以类似于天然存在核苷酸的 方式代谢；(ii)寡核苷酸类似物，其包含(但不限于)PNA(肽基核酸)、反义技术中 使用的DNA的类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，以及其类似物)；(iii)其经保守性 修饰的变体(包含(但不限于)简并密码子取代)以及互补序列和明确指出的序列。举 例来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三 位置经混合碱基及/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人， Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
如本文中所使用，术语“氧化剂”指的是能够从被氧化的化合物移除电子的化合物 或物质。举例来说，氧化剂包含(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型 二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇(oxidized erythreitol)，以及氧。多种氧化剂适用于本文 中描述的方法和组合物中。
如本文中所使用，术语“医药学上可接受”指的是包含(但不限于)盐、载剂或稀 释剂的物质，其不消除化合物的生物活性或性质，且相对无毒，即，所述物质可投与个 体而不造成不当生物效应或以有害方式与其包含于其中的组合物的组分中的任一者相 互作用。
如本文中所使用，术语“光亲和性标记”指的是具有在曝露于光中之后与标记对其 具有亲和性的分子形成键联的基团的标记。仅举例来说，此键联可为共价或非共价键联。
如本文中所使用，术语“光笼蔽部分”指的是在特定波长下照射后共价或非共价地 结合其他离子或分子的基团。
如本文中所使用，术语“可光裂解基团”指的是在曝露于光中之后断裂的基团。
如本文中所使用，术语“光交联剂”指的是包括两个或两个以上在曝露于光中之后 可与两个或两个以上单体或聚合分子反应且形成共价或非共价键联的官能基的化合物。
如本文中所使用，术语“可光异构化部分”指的是其中经光照射后从一种异构形式 变为另一种异构形式的基团。
如本文中所使用，术语“聚亚烷基二醇”指的是线性或分枝聚合聚醚多元醇。这些 聚亚烷基二醇包含(但不限于)聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇以及其衍生物。其他例 示性实施例列出于(例如)商业供应商目录中，诸如Shearwater Corporation的目录“聚 乙二醇和用于生物医学应用的衍生物”(“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”)(2001)。仅举例来说，这些聚合聚醚多元醇具有约0.1kDa至 约100kDa之间的平均分子量。举例来说，这些聚合聚醚多元醇包含(但不限于)约100 Da与约100,000Da或更高之间。聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、 800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量 在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000 Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇 分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含 (但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、 70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000 Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、 7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施 例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG 的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约 5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000 Da之间。
如本文中所使用，术语“聚合物”指的是由重复亚单元组成的分子。这些分子包含 (但不限于)多肽、聚核苷酸或多糖或聚亚烷基二醇。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来提及氨基酸残基的聚合物。 即，针对于多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，且反之亦然。这些 术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上的氨基酸残基为非天然氨 基酸的氨基酸聚合物。另外，这些“多肽”、“肽”和“蛋白质”包含任何长度的氨基酸 链，其包含全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键键联。
术语“翻译后修饰”指的是在天然或非天然氨基酸已经翻译并入多肽链中之后发生 的所述氨基酸的任何修饰。这些修饰包含(但不限于)共翻译活体内修饰、共翻译活体 外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。
如本文中所使用，术语“前药”或“医药学上可接受的前药”指的是在活体内或活 体外转变为母体药物的药剂，其中其不消除药物的生物活性或性质，且相对无毒，即， 所述物质可投与个体而不造成不当生物效应或以有害方式与其包含于其中的组合物的 组分中的任一者相互作用。前药通常为药物前驱物，在投与受检者且随后吸收后，其通 过某些过程(诸如由代谢途径转变)转变为具有活性或具有更高活性的物质。一些前药 具有存在于前药上的化学基团，其使得前药活性较小及/或赋予药物溶解性或一些其他性 质。一旦化学基团裂解及/或经修饰，活性药物就从前药中产生。前药通过酶促反应或非 酶促反应在体内转变为活性药物。前药可提供改良的物理化学性质，诸如更好的溶解性、 增强的递送特性(诸如特异性靶向特定细胞、组织、器官或配位体)以及改良的药物治 疗价值。这些前药的益处包含(但不限于)：(i)与母体药物相比，易于投药；(ii)前药 可通过口服投药生物利用，而母体不可以；以及(iii)与母体药物相比，前药也可具有 改良的于医药组合物中的溶解性。前药包含活性药物的药理学非活性或活性降低的衍生 物。前药可经设计用于调节药物或生物活性分子的量，其通过操纵药物的性质(诸如物 理化学性质、生物医药性质或药物动力学性质)到达所需作用部位。前药的实例(不加 限制地)可为以酯(“前药”)的形式投与以利于穿过细胞膜传送的非天然氨基酸多肽， 其中水溶性对迁移率有害，但一旦在其中水溶性为有益的细胞内部，其就随后代谢水解 为羧酸(活性实体)。前药可经设计为可逆药物衍生物，以用作改性剂以增强向位点特 异性组织的药物传送。
如本文中所使用，术语“预防有效量”指的是预防性地应用于患者中的含有至少一 种非天然氨基酸多肽或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量，其会在一定 程度上减轻一种或一种以上所治疗的疾病、病状或病症的症状。在这些预防性应用中， 所述量可视患者的健康状况、体重及其类似因素而定。充分相信所属领域的技术人员可 通过常规实验(包含(但不限于)剂量增加临床试验)确定这些预防有效量。
如本文中所使用，术语“经保护”指的是存在防止化学反应性官能基在某些反应条 件下反应的“保护基”或部分。保护基会根据所保护的化学反应性基团的类型而改变。 仅举例来说，(i)如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基 (t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；(ii)如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基 可为邻吡啶基二硫化物；且(iii)如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟 基，那么保护基可为苄基或烷基，诸如甲基、乙基或叔丁基。
仅举例来说，阻塞/保护基(blocking/protecting group)也可选自：
另外，保护基包含(但不限于)包含对光不稳定的基团(诸如Nvoc和MeNvoc)以 及所属领域中已知的其他保护基。其他保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，其是以引用的方 式全部并入本文中。
如本文中所使用，术语“放射性部分”指的是其核自发发出核辐射(诸如α粒子、 β粒子或γ粒子)的基团；其中，α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能光子。
如本文中所使用，术语“反应性化合物”指的是在适当条件下对另一原子、分子或 化合物有反应性的化合物。
术语“重组宿主细胞”(也被称作“宿主细胞”)指的是包含外源聚核苷酸的细胞， 其中用于将外源聚核苷酸插入细胞中的方法包含(但不限于)直接吸收、转导、f-配对 或产生重组宿主细胞所属领域中已知的其他方法。仅举例来说，所述外源聚核苷酸可为 非整合载体(包含(但不限于)质粒)，或可整合入宿主基因组中。
如本文中所使用，术语“氧化还原活性剂”指的是氧化或还原另一分子，藉此氧化 还原活性剂变得被还原或氧化的分子。氧化还原活性剂的实例包含(但不限于)二茂铁、 醌、Ru2+/3+络合物、Co2+/3+络合物以及Os2+/3+络合物。
如本文中所使用，术语“还原剂”指的是能够向所还原的化合物添加电子的化合物 或物质。举例来说，还原剂包含(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤 藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)，以及还原型谷胱甘肽。可使用这些还原剂 (仅举例来说)以将巯基保持为还原状态且减少分子内或分子间二硫键。
如本文中所使用的“再折叠”描述将不当折叠或未折叠状态转变为自然或适当折叠 构象的任何过程、反应或方法。仅举例来说，再折叠将含有二硫键的多肽由不当折叠或 未折叠状态转变为关于二硫键的自然或适当折叠构象。这些含有二硫键的多肽可为天然 氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。
如本文中所使用，术语“树脂”指的是高分子量不溶性聚合物珠粒。仅举例来说， 这些珠粒可用作用于固相肽合成的载体，或在纯化之前附着分子的位点。
如本文中所使用，术语“糖类”指的是一系列碳水化合物，其包含(但不限于)糖、 单糖、寡糖以及多糖。
如本文中所使用，术语“安全性”或“安全性概况”指的是相对于已投与药物的次 数而言可能与药物投与相关的副作用。举例来说，将已投与多次且仅温和地产成副作用 或无副作用的药物称为具有出色的安全性概况。评估安全性概况的方法的非限制性实例 于实例92中给出。这种方法可用于评估任何多肽的安全性概况。
如本文中所使用，短语“选择性杂交”或“特异性杂交”指的是当特定核苷酸序列 存在于复杂混合物(包含(但不限于)总细胞或库DNA或RNA)中时，在严格杂交条 件下分子与所述序列的结合、成双或杂交。
如本文中所使用，术语“自旋标记”指的是可通过电子自旋共振光谱检测且可连接 到另一分子上的含有展现未成对电子自旋的原子或原子团(即稳定顺磁基团)的分子。 这些自旋标记分子包含(但不限于)硝酰基以及硝基氧，且可为单一自旋标记或双重自 旋标记。
如本文中所使用，术语“化学计量”指的是参与化学反应的化合物的摩尔比为约0.9 至约1.1。
如本文中所使用，术语“类化学计量”指的是在反应条件改变后或添加剂存在下变 为化学计量或接近化学计量的化学反应。这些反应条件的变化包含(但不限于)温度升 高或pH值改变。这些添加剂含(但不限于)促进剂。
短语“严格杂交条件”指的是在低离子浓度和高温度的条件下，DNA、RNA、PNA 或其他核酸模拟物或其组合的序列的杂交。举例来说，在严格条件下探针会与核酸的复 杂混合物(包含(但不限于)总细胞或库DNA或RNA)中的其目标子序列杂交，而不 与复杂混合物中的其他序列杂交。严格条件为序列依赖性的且在不同情况下会不同。举 例来说，较长序列在较高温度下特异性杂交。严格杂交条件包含(但不限于)：(i)在确 定离子浓度和pH值下比特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃-10℃；(ii)在约pH 7.0 至约pH 8.3下盐浓度为约0.01M至约1.0M，且对于短探针(包含(但不限于)10至 50个核苷酸)，温度为至少约30℃，且对于长探针(包含(但不限于)多于50个核苷 酸)温度为至少约60℃；(iii)添加去稳定剂，其包含(但不限于)甲酰胺；(iv)50％ 甲酰胺，5X SSC，和1％ SDS，在42℃下培养，或5X SSC，1％ SDS，在65℃下培养， 其中在65℃下于0.2X SSC以及0.1％ SDS中洗涤约5分钟至约120分钟之间。仅举例 来说，选择性或特异性杂交的检测包含(但不限于)阳性信号至少为背景的两倍。关于 核酸杂交的详尽指南见于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。
如本文中所使用，术语“受检者”指的是作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举 例来说，受检者可为(但不限于)哺乳动物，其包含(但不限于)人类。
如本文中所使用，术语“实质上经纯化”指的是可实质上或基本上不含在纯化之前 通常伴随所关注的组分或与所关注的组分相互作用的其他组分的所关注的组分。仅举例 来说，当所关注的组分的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、 小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计) 的污染组分时，所关注的组分可为“实质上经纯化”的。因此，“实质上经纯化”的所 关注的组分可具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约 97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。仅举例来说，在重组产生的天然氨基酸多肽 或非天然氨基酸多肽的情况下，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可从天然细胞或宿 主细胞中纯化。举例来说，当制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约 15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以 干重计)的污染物质时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制剂可为“实质上经纯 化”的。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天 然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、 约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的量存在。举例来说，当天然氨 基酸多肽或非天然氨基酸多肽由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸 多肽可以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约 500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的量 存在于培养基中。举例来说，“实质上经纯化”的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽 可具有如由适当方法(其包含(但不限于)SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛细 管电泳)测定的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、 约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的纯度水平。
术语“取代基”(也被称作“非干扰取代基”)指的是可用于置换分子上的另一基团 的基团。这些基团包含(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10 烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12环烷基、C4-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、 二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12 氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m 为1至8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基 烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、 -C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、 -C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、 -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自为1至8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、 -NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐，以及其类似基团。前述列表中的每一R基团包含(但 不限于)H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基，或烷芳基。当取代基由其从左向 右书写的常规化学式指定时，其同样涵盖可由从右向左书写结构产生的化学上相同的取 代基，例如，-CH2O-等于-OCH2-。
仅举例来说，烷基和杂烷基(包含被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、 环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基包含(但不限于)：-OR、 ＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、 -OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、 -S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN以及-NO2。前述列表中的每一R基团包含(但不限于)氢、 经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包含(但不限于)经1-3个卤 素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基或芳烷基。当两个R基 团连接至同一氮原子上时，其可与氮原子组合以形成5员环、6员环或7员环。举例来 说，-NR2意谓包含(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。
举例来说，芳基和杂芳基的取代基包含(但不限于)-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、 -SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、 -NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、 -CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，数目在零到芳族 环系统上的开放价态的总数的范围内；且其中前述列表中的每一R基团包含(但不限于) 氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
如本文中所使用，术语“治疗有效量”指的是投与已患有疾病、病状或病症的患者、 足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上减轻至少一种所治疗的疾病、病症或病状的症 状的含有至少一种非天然氨基酸多肽及/或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合 物的量。这些组合物的功效视以下条件而定，其包含(但不限于)疾病、病症或病状的 严重性和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师的判断。 仅举例来说，治疗有效量可由常规实验(包含(但不限于)剂量增加临床试验)确定。
如本文中所使用，术语“硫烷氧基”指的是通过氧原子与分子键联的含硫烷基。
术语“热熔点”或Tm为在平衡状态下50％的与目标互补的探针与目标序列杂交的 温度(在确定离子浓度、pH值以及核酸浓度下)。
如本文中所使用，术语“毒性部分”指的是可造成伤害或死亡的化合物。
如本文中所使用，术语“治疗”包含缓解、缓和或改善疾病或病状症状，预防其他 症状，改善或预防症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病状，例如，阻止疾病或病状的发 展，减轻疾病或病状，使得疾病或病状回归，减轻由疾病或病状造成的病状，或终止疾 病或病状的症状。术语“治疗”包含(但不限于)预防性及/或治疗性治疗。
如本文中所使用，术语“水溶性聚合物”指的是可溶于水性溶剂中的任何聚合物。 这些水溶性聚合物包含(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳 氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，其是以引用的方式并入本文中)、单甲 氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2- 羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包含硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化 丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维 素以及纤维素衍生物(包含(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、 淀粉以及淀粉衍生物、多肽、聚亚烷基二醇以及其衍生物、聚亚烷基二醇和其衍生物的 共聚物、聚乙烯基乙基醚，以及α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺，以及其类似物或其混 合物。仅举例来说，这些水溶性聚合物与天然氨基酸多肽或非天然多肽的偶合可产生改 变，其包含(但不限于)相对于未经修饰的形式，水溶性增加、血清半衰期增加或受到 调节、治疗半衰期增加或受到调节、生物可用性增大、生物活性受到调节、循环时间延 长、免疫原性受到调节、物理缔合特性受到调节，其包含(但不限于)聚集以及多聚体 形成、受体结合改变、与一种或一种以上结合搭配物的结合改变，以及受体二聚化或多 聚化作用改变。另外，这些水溶性聚合物可具有或可不具有其自身的生物活性。
除非另外指示，否则使用所属领域内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化 学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
本文中提出的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)包含经同位素标记的化合物， 其与以本文中提出的各种式和结构中叙述的那些化合物相同，但一个或一个以上原子经 具有与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子取代。可 并入本发明的化合物中的同位素的实例包含氢、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分别 诸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、15F、36Cl。本文中描述的某些经同位素标 记的化合物(例如诸如3H和14C的放射性同位素并入其中的那些化合物)适用于药物 及/或底物组织分布检定。此外，用诸如氘(即2H)的同位素取代可提供某些由较高代 谢稳定性产生的治疗优点，例如活体内半衰期增加或剂量需求降低。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)具有不对称碳原子且可因此 以对映异构体或非对映异构体形式存在。基于其物理化学差异，由已知方法(例如，色 谱及/或分级结晶)可将非对映异构混合物分离为其个别非对映异构体。可通过由与适当 光学活性化合物(例如，醇)反应将对映异构混合物转变为非对映异构混合物，分离非 对映异构体且将个别非对映异构体转变(例如，水解)为相应纯对映异构体而将对映异 构体分离。包含非对映异构体、对映异构体及其混合物的所有这些异构体均被视作本文 中描述的组合物的部分。
在额外或其他实施例中，本文中描述的化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)是 以前药的形式使用。在额外或其他实施例中，本文中描述的化合物(包含(但不限于) 非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化 合物的试剂)在投与需要产生代谢物的生物体之后代谢，所述代谢物随后用于产生所需 效应，其包含所需治疗效应。在其他或额外实施例中为非天然氨基酸和“经修饰或未经 修饰的”非天然氨基酸多肽的活性代谢物。
本文中描述的方法和配方包含使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的N-氧化物、结晶形式(也被称作多晶型物)或医药学上可接受的盐。 在某些实施例中，非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽以及经修饰的非天然氨基酸多肽可 以互变异构体形式存在。所有互变异构体均包含于本文中提出的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的范畴内。另外，本文中描述的非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽以及经修饰的非天然氨基酸多肽可以非溶剂合物形式以及与医药学 上可接受的溶剂(诸如水、乙醇以及其类似物)形成的溶剂合物形式存在。本文中提出 的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的溶剂合物形式也视 为揭露于本文中。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的试剂)可以若干互变异构形式存在。 所有这些互变异构形式均被视作本文中描述的组合物的部分。同样，例如本文中的任何 化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸 多肽以及用于制备前述化合物的试剂)的所有烯醇-酮形式均被视作本文中描述的组合物 的部分。
本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修 饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的任一者的试剂)具有酸性且可与医药 学上可接受的阳离子形成盐。本文中的一些化合物(包含(但不限于)非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽以及用于制备前述化合物的试剂)可具 有碱性且因此可与医药学上可接受的阴离子形成盐。包含二盐的所有这些盐在本文中描 述的组合物的范畴内且其可通过常规方法来制备。举例来说，盐可通过在水性、非水性 或部分水性介质中使酸性实体与碱性实体接触来制备。通过使用以下技术中的至少一种 来回收盐：过滤；以非溶剂沉淀，接着过滤；蒸发溶剂；或(在水溶液的情况下)冻干。
当母体非天然氨基酸多肽中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金 属离子或铝离子)置换，或与有机碱配位时，可形成本文中揭露的非天然氨基酸多肽的 医药学上可接受的盐。另外，所揭露的非天然氨基酸多肽的盐形式可使用起始物质或中 间物的盐来制备。本文中描述的非天然氨基酸多肽可通过使本文中描述的非天然氨基酸 多肽的游离碱形式与医药学上可接受的无机酸或有机酸反应制备为医药学上可接受的 酸加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)。或者，本文中描述的非天然氨基酸多肽 可通过使本文中描述的非天然氨基酸多肽的游离酸形式与医药学上可接受的无机碱或 有机碱反应制备为医药学上可接受的碱加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)。
医药学上可接受的盐的类型包含(但不限于)：(1)与无机酸或有机酸形成的酸加 成盐，其中所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸以及其类似酸；所述有机 酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹 果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、 扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双 环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、 三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂 酸、粘糠酸以及其类似酸；(2)当母体化合物中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金 属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱配位时形成的盐。可接受的有机碱 包含乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺以及其类似物。可接受的 无机碱包含氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠以及其类似物。
非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐的相应抗衡离子可使用多种方法来分析和 鉴别，这些方法包含(但不限于)离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、感应耦合等 离子体、原子吸收光谱、质谱或其任何组合。另外，这些非天然氨基酸多肽医药学上可 接受的盐的治疗活性可使用实例87-91中描述的技术和方法来测试。
应了解，盐的提及包含其溶剂加成形式或晶体形式，尤其溶剂合物或多晶型物。溶 剂合物含有化学计量或非化学计量之量的溶剂，且通常在结晶过程中与医药学上可接受 的溶剂(诸如水、乙醇以及其类似物)形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇 时形成醇化物。多晶型物包含相同元素组成的化合物的不同晶体组合排列。多晶型物通 常具有不同X射线衍射图案、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学性质和电 学性质、稳定性和溶解性。诸如再结晶溶剂、结晶速率和储存温度的各种因素可使得单 一晶体形式占优势。
非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐多晶型物及/或溶剂合物的筛检和表征可使 用多种技术来实现，所述技术包含(但不限于)热分析、X射线衍射、光谱学、蒸气吸 附以及显微镜检查。热分析方法专注于热化学降解或热物理过程(包含(但不限于)多 晶型物转变)，且使用这些方法分析多晶型形式之间的关系、测定重量损失以找出玻璃 化转变温度或用于赋形剂相容性研究。这些方法包含(但不限于)差示扫描量热法 (DSC)、调制差示扫描量热法(MDSC)、热重分析(TGA)，以及热重和红外分析(TG/IR)。 X射线衍射方法包含(但不限于)单晶和粉末衍射计以及同步加速器源。使用的各种光 谱技术包含(但不限于)拉曼、FTIR、UVIS和NMR(液态和固态)。各种显微镜检查 技术包含(但不限于)偏振光显微镜、伴随能量分散型X射线分析(EDX)的扫描电子 显微镜(SEM)、伴随EDX的环境扫描电子显微镜(在气体或水蒸气气氛中)、IR显微 镜，以及拉曼显微镜。
附图说明
通过参照提出说明性实施例的以下详细描述可获得对本发明的方法和组合物的特 征和优点的更佳理解，所述实施例中利用我们的方法、组合物、设备和装置的原理，且 附随图式为：
图1呈示本文中描述的方法、组合物、策略和技术的某些方面的关系的示意性代表 图。
图2呈示本文中描述的非天然氨基酸的类型的说明性、非限制性实例。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图3呈示本文中描述的非天然氨基酸的类型的说明性、非限制性实例。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图4呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图5呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图6呈示用于制备本文中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性、非限制性实例。 这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基 酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的 任一者中。
图7呈示以含羟胺的试剂翻译后修饰含羰基的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的含 肟非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用 于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的 非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图8呈示可用于增强含羰基的非天然氨基酸多肽与含羟胺的试剂的反应以形成经修 饰的含肟非天然氨基酸多肽的添加剂的说明性、非限制性实例。
图9呈示以含羰基的试剂翻译后修饰含肟的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的含肟 非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用于 制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非 天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图10呈示以含羰基的试剂翻译后修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽以形成经修饰的 含肟非天然氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入 用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰 的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图11呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含PEG试剂的说明性、非限制性实例。
图12呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图13呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有酰胺基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图14呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有氨基甲酸酯基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图15呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含有氨基甲酸酯基PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图16呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含简单PEG试剂的合成的说明性、非限制性实例。
图17呈示可用于修饰非天然氨基酸多肽以形成含PEG的经肟键联的非天然氨基酸 多肽的含分枝PEG的试剂的说明性、非限制性实例，以及一种此试剂用于修饰基于羰基 的非天然氨基酸多肽的用途。
图18呈示可用于修饰和键联非天然氨基酸多肽的双官能连接子基团的合成的说明 性、非限制性实例。
图19呈示可用于修饰和键联非天然氨基酸多肽的多官能连接子基团的说明性、非 限制性实例。
图20呈示双官能连接子基团用于修饰非天然氨基酸多肽且将非天然氨基酸多肽键 联至PEG基团的用途的说明性、非限制性代表图。
图21呈示双官能连接子基团用于修饰非天然氨基酸多肽且将非天然氨基酸多肽键 联至PEG基团的用途的说明性、非限制性实例。
图22呈示双官能连接子基团将两个非天然氨基酸多肽键联在一起以形成同型二聚 体的用途的说明性、非限制性代表图。
图23呈示双官能连接子基团将两个不同非天然氨基酸多肽键联在一起以形成异质 二聚体的用途的说明性、非限制性代表图。
图24呈示含羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然 氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然 氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图25呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图26呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。
图27呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图28呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图29呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图30呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图31呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图32呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图33呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图34呈示含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天 然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天 然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图35呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性 代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非 天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和 策略中的任一者中。
图36呈示非天然氨基酸的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可 用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多 肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图37呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图38呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图39呈示含羰基的非天然氨基酸和含二羰基的非天然氨基酸的合成的说明性、非 限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描 述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、 技术和策略中的任一者中。
图40呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图41呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图42呈示含二羰基的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图43呈示(a)经保护或未经保护的含1，3-酮醛的非天然氨基酸，以及(b)含1-3- 酮羧基(硫)酯的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于 或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和 经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图44呈示含酰肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图45呈示含酰肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图46A和46B呈示含肟的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图，且图46C呈 示含肼的非天然氨基酸的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用 于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的 非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图47呈示一步接合至非天然氨基酸多肽和两步接合至非天然氨基酸多肽的说明性、 非限制性代表图。举例来说，这些接合包含非天然氨基酸多肽的PEG化。
图48呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图49呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图50呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图51呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图52呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图53呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图54呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图55呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图56呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图57呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图58呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图59呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图60呈示羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用 于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽 和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图61呈示mPEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基 酸可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图62A呈示羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图；图62B呈示mPEG化 合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸可用于或并入用于制备、纯 化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基 酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图63呈示(A)通过化学转变为含羰基的(包含含二羰基的)非天然氨基酸多肽修 饰非天然氨基酸多肽以及(B)通过化学转变为含羟胺的非天然氨基酸多肽修饰非天然 氨基酸多肽的说明性、非限制性实例。这些非天然氨基酸多肽可用于或并入用于制备、 纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨 基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图64呈示PEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
图65呈示PEG-羟胺化合物的合成的说明性、非限制性代表图。这些非天然氨基酸 可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸 多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。
具体实施方式
I.引言
近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其希望克服众多与蛋白质的位点特异性 修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(E.coli)(例如， L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白质生 物合成机制中，其使得能够在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，具有 新颖化学、物理或生物性质的许多新氨基酸(包含光亲和性标记和可光异构化氨基酸、 酮氨基酸和糖基化氨基酸)已有效且高保真性地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中以 回应琥珀密码子TAG。参见(例如)J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz， (2002)，ChemBioChem 3(11)：1135-1137(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin，等人， (2002)，PNAS United States of America 99(17)：11020-11024(以引用的方式全部并入)； 以及，L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-11(以引用的方式全部并入)。 这些研究已证实有可能选择性且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能基，其对20种 常见遗传性编码氨基酸中存在的所有官能基为化学惰性的，且其可用于有效且选择性地 反应以形成稳定共价键。
II.概述
图1呈示对本文中描述的组合物、方法和技术的概述。某种程度上，本文中描述用 于产生和使用包括至少一个非天然氨基酸或经羰基、二羰基、肟基或羟胺基修饰的非天 然氨基酸的多肽的手段(方法、组合物、技术)。这些非天然氨基酸可含有其他官能基， 其包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交 联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第 二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水 化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、 生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能基； 与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位 体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基 团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性 部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂(在此情况下，生物活性剂可 包含具有治疗活性的药剂且非天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸可充当与附属 治疗剂共同的共治疗剂或作为将治疗剂递送至生物体内所需位点的手段)；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。应注意，各种前述官能基并非意谓暗示 一种官能基的成员不可分类为另一种官能基的成员。当然，其会根据特定情况而重叠。 仅举例来说，水溶性聚合物与聚乙二醇的衍生物在范围上重叠，然而重叠并不完全且因 此两种官能基均列于上文。
如图1中所示，一方面为使用本文中描述的方法、组合物和技术来选择和设计欲修 饰的多肽的方法。新颖多肽可从头设计，其包含(仅举例来说)作为高通量筛检方法(在 此情况下，可设计、合成、表征及/或测试众多多肽)的部分或根据研究者的兴趣设计。 新颖多肽也可根据已知或部分表征的多肽的结构进行设计。仅举例来说，生长激素基因 超家族(Growth Hormone Gene Superfamily)(见下文)已成为科学团体广泛研究的主题； 新颖多肽可根据这个基因超家族的成员的结构进行设计。选择哪个氨基酸来取代及/或修 饰的原则单独描述于本文中。使用哪种修饰的选择也描述于本文中，且可用于满足实验 人员或最终使用者的需求。这些需求可包含(但不限于)操纵多肽的治疗功效；改良多 肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学及/或药效；诸如，(仅举例来说)增 加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物 活性；或延长循环时间。另外，这些修饰包含(仅举例来说)向多肽提供其他官能基； 向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质，以及前述修饰的任何组 合。
本文中也描述已经修饰或可经修饰以含有肟基、羰基、二羰基或羟胺基的非天然氨 基酸。这个方面包含用于制备、纯化、表征和使用这些非天然氨基酸的方法。本文中描 述的另一方面为将至少一个所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技术。这个方 面同样包含用于制备、纯化、表征和使用含有至少一个所述非天然氨基酸的这些多肽的 方法。这个方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用可用于制备(至少部分地)含有 至少一个非天然氨基酸的多肽的寡核苷酸(包含DNA和RNA)的组合物和方法。这个 方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用可表达可用于制造(至少部分地)含有至少 一个非天然氨基酸的多肽的这些寡核苷酸的细胞的组合物和方法。
因此，本文中提供和描述包括至少一个非天然氨基酸或经羰基、二羰基、肟基或羟 胺基修饰的非天然氨基酸的多肽。在某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸或经羰 基、二羰基、肟基或羟胺基修饰的非天然氨基酸的多肽包含在多肽上的一些位置上的至 少一次翻译后修饰。在一些实施例中，共翻译或翻译后修饰通过细胞机制(例如，糖基 化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰，以及 其类似机制)发生，在许多情况下，这些基于细胞机制的共翻译或翻译后修饰发生于多 肽上的天然存在氨基酸位点处，然而，在某些实施例中，基于细胞机制的共翻译或翻译 后修饰发生在多肽上的非天然氨基酸位点上。
在其他实施例中，翻译后修饰不利用细胞机制，而是通过利用本文中描述的化学方 法，或适用于特定反应性基团的其他方法将包括第二反应性基团的分子(包含(但不限 于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化 合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或 多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸； DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒 子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或 非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部 分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基 团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标 记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入 基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放 射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗 体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、 抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶 束以及其任何组合)连接至至少一种包括第一反应性基团(包含(但不限于)含有酮、 醛、缩醛、半缩醛、肟或羟胺官能基的非天然氨基酸)的非天然氨基酸来提供官能基。 在某些实施例中，共翻译或翻译后修饰是于真核生物或非真核生物中活体内进行。在某 些实施例中，翻译后修饰是不利用细胞机制在活体外进行。这个方面同样包含用于制备、 纯化、表征和使用含有至少一个这些经共翻译或翻译后修饰的非天然氨基酸的这些多肽 的方法。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术的范畴内也包含能够与作为多肽的部分的 非天然氨基酸(含有羰基或二羰基、肟基、羟胺基，或其掩蔽或保护形式)反应以产生 任何前述翻译后修饰的试剂。一般来说，所得经翻译后修饰的非天然氨基酸应含有至少 一个肟基；所得经修饰的含肟非天然氨基酸可经受随后的修饰反应。这个方面也包含用 于制备、纯化、表征和使用能够进行所述非天然氨基酸的任何所述翻译后修饰的所述试 剂的方法。
在某些实施例中，多肽包含至少一种由一种宿主细胞在活体内进行的共翻译或翻译 后修饰，其中翻译后修饰通常不由另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，多肽包 含至少一种由真核生物在活体内进行的共翻译或翻译后修饰，其中共翻译或翻译后修饰 通常不由非真核生物进行。这些共翻译或翻译后修饰的实例包含(但不限于)糖基化、 乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰，以及其类 似修饰。在一实施例中，共翻译或翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖连 接至天冬酰胺(包含(但不限于)，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc， 以及其类似物)。在另一实施例中，共翻译或翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸、 GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含(但不限于) Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)连接至丝氨酸或苏氨酸。在某些实施例中，蛋白质或多 肽可包括分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合及 /或其类似物。这个方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用含有至少一种此共翻译或 翻译后修饰的这些多肽的方法。在其他实施例中，糖基化非天然氨基酸多肽是以非糖基 化形式制备。糖基化非天然氨基酸的此非糖基化形式可由以下方法或任何这些方法的组 合产生，所述方法包含从经分离或实质上经纯化或未经纯化的糖基化非天然氨基酸多肽 中化学或酶促移除寡糖基团；于不糖基化此非天然氨基酸多肽的宿主中(所述宿主包含 经工程化或突变以不糖基化此多肽的原核生物或真核生物)产生非天然氨基酸，向其中 所述非天然氨基酸多肽是由通常会糖基化此多肽的真核生物产生的细胞培养基中引入 糖基化抑制剂。本文中也描述通常糖基化非天然氨基酸多肽(通常糖基化意谓当在天然 存在多肽经糖基化的条件下制备时会糖基化的多肽)的这些非糖基化形式。当然，通常 糖基化非天然氨基酸多肽的这些非糖基化形式(或实际上本文中描述的任何多肽)可为 未经纯化的形式、实质上经纯化的形式或经分离的形式。
在某些实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一种在促进剂的存在下进行的翻译后 修饰，其中翻译后修饰为化学计量、类化学计量或接近化学计量的。在其他实施例中， 在促进剂的存在下使多肽与式(XIX)的试剂接触。在其他实施例中，促进剂是选自由 以下各物组成的群组：
含有非天然氨基酸的多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少 五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上含有羰基或二羰基、 肟基、羟胺基或其经保护形式的非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在 包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个 或20个以上不同非天然氨基酸的蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同位点。在某些实施例中，以 蛋白质的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一者(但少于全部)经非天然氨基酸 取代。
本文中提供和描述的方法和组合物包含包括至少一个含有羰基或二羰基、肟基、羟 胺基或其经保护或掩蔽形式的非天然氨基酸的多肽。将至少一个非天然氨基酸引入多肽 中可容许应用包括特定化学反应(包含(但不限于)与一或多种非天然氨基酸反应，而 不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。一旦并入，则非天然存在氨基酸侧链 也可利用本文中描述的或适用于天然编码氨基酸中存在的特定官能基或取代基的化学 方法来修饰。
本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物提供具有多种官能基、取代基或部分的物 质与其他物质的接合物，所述其他物质包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。
在某些实施例中，本文中描述的包含式(I)-(XXXIII)的化合物的非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽、连接子和试剂在适度酸性条件下(包含(但不限于)pH 2至8)在 水溶液中稳定。在其他实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少一个月。在其 他实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这些化合 物在适度酸性条件下稳定至少5天。
本文中描述的组合物、方法、技术和策略的另一方面为用于研究或使用前述“经修 饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽中的任一者的方法。这个方面中包含(仅举例来说) 会从包括“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽或蛋白质的多肽中获益的治疗、诊 断、基于检定、工业、化妆品、植物生物学、环境、能量产生、消费者产品及/或军事上 的用途。
III.多肽中非天然氨基酸的定位
本文中描述的方法和组合物包含将一或多个非天然氨基酸并入多肽中。一或多个非 天然氨基酸可在不破坏多肽活性的一或多个特定位置处并入。此举可通过进行“保守性” 取代(包含(但不限于)以非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，以非天然或 天然庞大氨基酸取代庞大氨基酸，以非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸)及 /或将非天然氨基酸插入不需活性的位置中来实现。
可使用多种生物化学和结构方法来选择在多肽内经非天然氨基酸取代的所需位点。 多肽链的任何位置适于选择以并入非天然氨基酸，且对于任何或无特定所需目的，可根 据合理设计或通过随机选择来加以选择。所需位点的选择可基于产生具有任何所需性质 或活性((包含(但不限于)促效剂、超促效剂、部分促效剂、反向促效剂、拮抗剂、 受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节 剂、结合搭配物构象调节剂、二聚体或多聚体形成)、与天然分子相比无活性或性质改 变的非天然氨基酸多肽(其可经进一步修饰或保持未经修饰)，或操纵多肽的任何物理 或化学性质，诸如溶解性、聚集或稳定性。举例来说，可使用包含(但不限于)点突变 分析、丙氨酸扫描或同源物扫描法的方法鉴别需要多肽的生物活性的多肽中的位置。除 经包含(但不限于)丙氨酸或同源物扫描突变形成的方法鉴别为对生物活性关键的那些 残基之外的残基可能根据对于多肽所寻求的所需活性为用非天然氨基酸取代的良好候 选者。或者，经鉴别为对生物活性关键的位点也可能再次根据对于多肽所寻求的所需活 性为用非天然氨基酸取代的良好候选者。另一代替方法可为用非天然氨基酸简单进行多 肽链上每一位置中的连续取代且观察对多肽的活性的影响。在任何多肽中选择用非天然 氨基酸取代的位置的任何手段、技术或方法适用于本文中描述的方法、技术和组合物。
也可研究含有缺失的多肽的天然存在突变体的结构和活性以测定可能容许用非天 然氨基酸取代的蛋白质区域。一旦除去可能容许用非天然氨基酸取代的残基，就可使用 包含(但不限于)相关多肽和任何缔合配位体或结合蛋白的三维结构的方法来研究提出 的取代在每一剩余位置上的影响。在蛋白质数据库(Protein Data Bank)(PDB， www.rcsb.org)(含有蛋白质以及核酸的大分子的三维结构数据的集中数据库)中可获得 许多多肽的X射线结晶和NMR结构，其可用于鉴别可用非天然氨基酸取代的氨基酸位 置。另外，如果三维结构数据不可获得，那么可作出模型来研究多肽的二级结构和三级 结构。因此，可易于获得可用非天然氨基酸取代的氨基酸位置本身。
并入非天然氨基酸的例示性位点包含(但不限于)排除潜在受体结合区域的那些位 点，或与结合蛋白或配位体结合的区域可完全或部分溶剂暴露，与邻近残基具有最小或 无氢键相互作用，可最低程度地暴露于邻近反应性残基，及/或可在如由特定多肽与其相 缔合受体、配位体或结合蛋白的三维晶体结构所预测为高度柔性的区域中。
多种非天然氨基酸可取代或并入多肽中的给定位置中。举例来说，可根据对多肽与 其缔合配位体、受体及/或结合蛋白的三维晶体结构的研究选择用于并入的特定非天然氨 基酸，优选保守性取代。
在一实施例中，本文中描述的方法包含向多肽中并入非天然氨基酸，其中非天然氨 基酸包括第一反应性基团；且使多肽与包括第二反应性基团的分子(包含(但不限于) 标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物； 药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类 似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA； RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自 旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价 相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生 物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延 长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部 分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核 苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、 活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化 剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及 其任何组合)接触。在某些实施例中，第一反应性基团为羰基或二羰基部分且第二反应 性基团为羟胺部分，藉此形成肟键。在某些实施例中，第一反应性基团为羟胺部分且第 二反应性基团为羰基或二羰基部分，藉此形成肟键。在某些实施例中，第一反应性基团 为羰基或二羰基部分且第二反应性基团为肟部分，藉此发生肟交换反应。在某些实施例 中，第一反应性基团为肟部分且第二反应性基团为羰基或二羰基部分，藉此发生肟交换 反应。
在一些情况下，非天然氨基酸取代或并入将与多肽内的其他添加、取代或缺失组合 以影响其他化学、物理、药理及/或生物特性。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可 增加多肽的稳定性(包含(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其适当受 体、配位体及/或结合蛋白的亲和性。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可增大多肽 的溶解度(包含(但不限于)，当以大肠杆菌或其他宿主细胞表达时)。在一些实施例中， 选择用于用天然编码或非天然氨基酸取代的位点，此外，选择另一位点用于并入非天然 氨基酸，以实现在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后增大多肽溶解性的目的。在一 些实施例中，多肽包括调节对缔合配位体、结合蛋白及/或受体的亲和性、调节(包含(但 不限于)增加或减少)受体二聚化、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生 物可用性、利于纯化，或改良或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。类似地， 非天然氨基酸多肽可包括改良多肽的检测(包含(但不限于)GFP)、纯化、传送穿透组 织或细胞膜、前药释放或活化、尺寸减小或其他特性的化学或酶促裂解序列、蛋白酶裂 解序列、反应性基团、抗体结合域(包含(但不限于)FLAG或poly-His)或其他基于 亲和性的序列(包含(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或键联分子(包含(但不 限于)生物素)。
IV.作为范例的生长激素超基因家族
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于特定的多肽或蛋白质类型、种类或 家族。确实，实质上任何多肽可经设计或修饰以包含至少一个本文中描述的“经修饰或 未经修饰的”非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗 蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂 蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、 NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、 降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋 化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-i β、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
因此，生长激素(GH)超基因家族的以下描述是为说明性目的且仅作为实例来提 供，且并非作为对本文中描述的方法、组合物、策略和技术的范畴的限制。此外，本申 请案中对GH多肽的提及意欲使用一般术语作为GH超基因家族中的任何成员的实例。 因此，应了解，关于GH多肽或蛋白质的本文中描述的修饰和化学可同样应用于GH超 基因家族中的任何成员，其包含本文中特定列出的那些成员。
以下蛋白质包含由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的那些蛋白质(Bazan，F.， Immunology Today 11：350-354(1990)；Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；Mott，H. R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen， O.和Ihle，J.N.，Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors(1996))：生长激素、 泌乳刺激素、胎盘催乳激素、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介 素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35次单位)、 IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、 ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨 噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)以及心肌营养素-1 (CT-1)(“GH超基因家族”)。预计这个基因家族的其他成员将来会通过基因克隆和测 序来鉴别。GH超基因家族的成员具有类似二级结构和三级结构，尽管它们通常具有有 限的氨基酸或DNA序列一致性。共同的结构特征使得所述基因家族的新成员易于鉴别 且类似地应用本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物。
包含G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314：435(1992)；Zink等人，Biochemistry 33：8453 (1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K. 等人，Science 154：1779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.224：1075-1085(1992))、 IL-2(Bazan，J.F.和McKay，D.B.，Science 257：410-413(1992))；IL-4(Redfield等人， Biochemistry 30：11029-11035(1991)；Powers等人，Science 256：1673-1677(1992))以及 IL-5(Milburn等人，Nature 363：172-176(1993))的众多细胞因子的结构已由X射线衍 射和NMR研究测定且展示与GH结构的惊人保守性，但缺乏显著的一级序列同源性。 根据模型和其他研究认为IFN为这个家族的成员(Lee等人，J.Interferon Cytokine Res. 15：341(1995)；Murgolo等人，Proteins 17：62(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 4：1453 (1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274：661(1997))。包含睫状神经营养因子(CNTF)、 白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、制瘤素M、巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF) 以及诸如α、β、ω、τ、ε及γ干扰素的IFN的大量其他细胞因子和生长因子属于这个家 族(于Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)； Silvennoinen和Ihle(1996)Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors中回顾)。 如今认为所有上述细胞因子和生长因子包括一个大的基因家族。
除了共有类似的二级结构和三级结构之外，这个家族的成员共有其须使细胞表面受 体寡聚化以活化细胞内信号转导途径的性质。一些GH家族成员(包含(但不限于)GH 和EPO)与单一类型的受体结合且使其形成同型二聚体。包含(但不限于)IL-2、IL4 和IL-6的其他家族成员与一种类型以上的受体结合且使这些受体形成异质二聚体或更 高级的聚集体(Davis等人，(1993)Science 260：1805-1808；Paonessa等人，(1995)EMBO J.14：1942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121 (1995))。诱变研究已展示，如同GH一样，这些其他细胞因子和生长因子含有多个受体 结合位点(通常两个)，且依次与其同源受体结合(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93： 9471-9476)。如同GH一样，这些其他家族成员的主要受体结合位点主要存在于四个α 螺旋和A-B环中。参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸在家族成员中不同。与GH超 基因家族的成员相互作用的大多数细胞表面受体结构上相关且构成第二个大的多基因 家族。参见(例如)美国专利第6,608,183号，其是以引用的方式全部并入本文中。
由对多种GH超基因家族成员的突变研究得到的一般结论为连接α螺旋的环通常趋 向于不参与受体结合。具体来说，对于大多数(若非全部)家族成员中的受体结合来说， 短B-C环似乎并非必要。为此原因，在GH超基因家族的成员中，B-C环可经如本文中 所述的非天然氨基酸取代。A-B环、C-D环(以及干扰素/GH超家族的类IL-10成员的 D-E环)也可经非天然氨基酸取代。最接近螺旋A且远离最后螺旋的氨基酸也趋向于不 参与受体结合且也可为用于引入非天然氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然氨基酸 在包含(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7或7个以上 氨基酸的环结构内的任何位置处取代。在一些实施例中，非天然氨基酸在A-B、B-C、 C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸内取代。
GH家族的某些成员(包含(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、 TPO、IL-10、IL-12 p35、IL-13、IL-15和β干扰素)含有N-键联及/或O-键联的糖。蛋 白质中的糖基化位点几乎全部存在于环区域中且并非存在于α螺旋束中。因为环区域通 常不参与受体结合中且因为其为用于共价连接糖基团的位点，所以其可为用于将非天然 氨基酸取代引入蛋白质中的适用位点。蛋白质中包括N-键联糖基化位点以及O-键联糖 基化位点的氨基酸可为非天然氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸为表面暴露的。因此， 天然蛋白质可容许在这些位点处连接至蛋白质上的庞大糖基团且糖基化位点趋向于位 于远离受体结合位点的部位。
有可能在将来发现GH基因家族的其他成员。GH超基因家族的新成员可通过预测 蛋白质序列的电脑辅助二级结构和三级结构分析，且由设计用来鉴别与特定标靶结合的 分子的选择技术来鉴别。GH超基因家族的成员通常具有四个或五个由非螺旋状氨基酸 (环区域)连接的两性分子螺旋。蛋白质可在其N-末端含有疏水信号序列以促进从细胞 分泌。这些后来发现的GH超基因家族成员也包含在本文中描述的方法和组合物中。
V.非天然氨基酸
本文中描述的方法和组合物中使用的非天然氨基酸具有以下四种性质中的至少一 者：(1)至少一个非天然氨基酸的侧链上的官能基具有至少一种与20种常见遗传性编 码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的化学反应性正交、或至少与包含非天然氨基酸的 多肽中存在的天然存在氨基酸的化学反应性正交的特征及/或活性及/或反应性；(2)经 引入的非天然氨基酸对20种常见遗传性编码氨基酸实质上为化学惰性的；(3)非天然 氨基酸可稳定地并入多肽中，优选地具有与天然存在氨基酸相当的稳定性或在典型生理 条件下具有稳定性，且进一步优选地，所述并入可通过活体内系统发生；以及(4)非 天然氨基酸包含肟官能基或可通过与试剂反应转变为肟基的官能基，优选地在不破坏包 含非天然氨基酸的多肽的生物性质的条件下(除非当然此生物性质的破坏为修饰/转变的 目的)，或其中转变可在介于约4与约8之间的pH值下在水性条件下发生，或其中非天 然氨基酸上的反应性位点为亲电子位点。可用于本文中描述的组合物和方法的满足关于 非天然氨基酸的所述四种性质的氨基酸的说明性、非限制性实例呈示于图2、图3、图 35和图40-43中。可将任意数目的非天然氨基酸引入多肽中。非天然氨基酸也可包含经 保护或掩蔽的肟或可在将保护基团去保护或将掩蔽基团去掩蔽之后转变为肟基的经保 护或掩蔽基团。非天然氨基酸也可包含经保护或掩蔽的羰基或二羰基，其可在将保护基 团去保护或将掩蔽基团去掩蔽之后转变为羰基或二羰基且进而可用于与羟胺或肟反应 以形成肟基。
可用于本文中描述的方法和组合物中的非天然氨基酸包含(但不限于)包括可光活 化交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基 酸、放射性氨基酸、具有新颖官能基的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨 基酸、光笼蔽及/或可光异构化氨基酸、包括生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨 基酸(诸如经糖取代的丝氨酸)、其他经碳水化合物修饰的氨基酸、含酮氨基酸、含醛 氨基酸、包括聚乙二醇或其他聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解及/ 或可光裂解的氨基酸、具有与天然氨基酸相比延长的侧链的氨基酸(包含(但不限于) 聚醚或长链烃，其包含(但不限于)大于约5个碳或大于约10个碳)、含经碳键联的糖 的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸，以及包括一个或一个以上毒 性部分的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸包括糖类部分。这些氨基酸的实例包含N-乙酰基-L- 葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨 酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺以及O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例 也包含其中氨基酸与糖之间的天然存在N-键或O-键由自然界中通常不存在的共价键(包 含(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺以及其类似物)代替的实例。这些氨基酸的实例 也包含天然存在蛋白质中通常不存在的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖以及其 类似物。
通过将非天然氨基酸并入这些多肽中而并入多肽中的化学部分提供多种优点和多 肽的操作。举例来说，羰基或二羰基官能基(包含酮官能基或醛官能基)的独特反应性 容许以众多含肼试剂或含羟胺试剂中的任一者在活体内以及活体外进行蛋白质的选择 性修饰。重原子非天然氨基酸(例如)可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基 酸位点特异性引入重原子也提供在选择重原子的位置时的选择性和灵活性。光反应性非 天然氨基酸(包含(但不限于)具有苯甲酮和芳基叠氮化物(包含(但不限于)苯基叠 氮化物)侧链的氨基酸)(例如)使得多肽的活体内和活体外光交联有效。光反应性非 天然氨基酸的实例包含(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。具有 光反应性非天然氨基酸的多肽随后可通过光反应性基团的激发(提供瞬时控制)来任意 交联。在非限制性实例中，非天然氨基酸的甲基可经同位素标记取代(包含(但不限于) 经甲基取代)，作为局部结构和动力学的探针(包含(但不限于)借助于核磁共振和振 动光谱)。
A.非天然氨基酸：羰基、类羰基、经掩蔽羰基以及经保护羰基的结构和合成
具有亲电子反应性基团的氨基酸容许多种反应以通过各种化学反应(包含(但不限 于)亲核加成反应)键联分子。这些亲电子反应性基团包含羰基或二羰基(包含酮基或 醛基)、类羰基或类二羰基基团(其具有类似于羰基或二羰基的反应性且在结构上与羰 基或二羰基类似)、经掩蔽的羰基或经掩蔽的二羰基(其可易于转变为羰基或二羰基)， 或经保护的羰基或经保护的二羰基(在去保护后其具有与羰基或二羰基类似的反应性)。 这些氨基酸包含具有式(I)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其限制条件为当A为亚苯基且R3各自为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且R3各 自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在且R3各自为H时，R不为甲 基。这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(I) 化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
在式(I)化合物的某些实施例中，B为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、-O-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-N(R′)CO-、-C(O)-、-C(R′)＝N-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(I)化合物的某 些实施例中，B为-O(CH2)-、-CH＝N-、-CH＝N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、 -C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在式(I)化合物的 某些实施例中，R为C1-6烷基或环烷基。在式(I)化合物的某些实施例中，R为-CH3、 -CH(CH3)2或环丙基。在式(I)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、 9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式 (I)化合物的某些实施例中，R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物 的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(I)化合物的某些实 施例中，R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2 为聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(I)化 合物的某些实施例中，R2为tRNA。在式(I)化合物的某些实施例中，tRNA特异性识 别选择密码子。在式(I)化合物的某些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭 石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以 及四碱基密码子组成的群组。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。
在式(I)化合物的某些实施例中，是选自由以下各物组成的群组：
(i)A为经取代低级亚烷基、C4-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚 杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷 基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
(ii)A为可选的，且当存在时为经取代低级亚烷基、C4-亚芳基、经取代亚芳基、 亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、 低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、 -NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
(iii)A为低级亚烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷 基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CSN(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；以及
(iv)A为亚苯基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、 低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、 -NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
J为或
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
另外，包含具有式(II)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其限制条件为当A为亚苯基时，B存在；且当A为-(CH2)4-时，B不为 -NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在时，R不为甲基。这些非天然氨基酸可为盐的 形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(III)的结构的氨基酸：
其中：
B为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低 级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、 -S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基。这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、 聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
这些非天然氨基酸可为视情况氨基经保护的基团、羧基经保护的基团及/或为盐的形 式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(IV)的结构的氨基酸：
其中
-NS(O)2-、-OS(O)2-、可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子： 低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经 取代低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8；
其限制条件为当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。这些非天然氨基酸可 为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译 后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(VIII)的结构的氨基酸：
其中，
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(IX)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(C))2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自 独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(X)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
除了单羰基结构之外，本文中描述的非天然氨基酸可包含诸如二羰基、类二羰基、 经掩蔽二羰基和经保护二羰基的基团。
举例来说，包含以下具有式(V)的结构的氨基酸：
其中，
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(VI)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自 独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护以及羧基经保护，或为其盐。这些非天然氨基酸 可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻 译后修饰。
另外，包含以下具有式(VII)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
，
其中这些化合物视情况氨基经保护以及羧基经保护，或为其盐，或可并入非天然氨 基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
且R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸：
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9 各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和 R9可共同形成＝O或环烷基，或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷 氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可共同形成＝O或环烷基， 或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷 氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可共同形成＝O或环烷基， 或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXX)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXI)的结构的氨基酸：
其中：
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXII)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；且
T3为O或S。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXIII)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包含以下具有式(XXXXIII)的结构的氨基酸：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
羰基或二羰基官能基可在温和条件下于水溶液中与含有羟胺的试剂选择性地反应 以形成在生理条件下稳定的相应肟键。参见(例如)Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81， 475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117(14)：3893-3899(1995)。此外， 羰基或二羰基的独特反应性容许在其他氨基酸侧链存在下的选择性修饰。参见(例如) Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J. G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于以引用的方式并 入的Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。可类似制备其他含有羰基或 二羰基的氨基酸。此外，本文中包含的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈示于图4、 图24-图34以及图36-图39中。
在一些实施例中，包括非天然氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基或二羰基 官能基。例如，适用于接合反应的醛官能基可由具有邻近氨基和羟基的官能基产生。其 中生物活性分子为多肽，例如，可使用N-末端丝氨酸或苏氨酸(其通常可存在或可通过 化学消化或酶促消化暴露)在温和氧化性裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能基。参见 (例如)Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.和Stroh，J.， Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。 然而，所属领域中已知的方法局限于在肽或蛋白质的N-末端的氨基酸。
另外，例如具有邻近羟基和氨基的非天然氨基酸可以“经掩蔽”醛官能基的形式并 入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸具有邻接ε胺的羟基。产生醛的反应条件通常包括 在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其他位点处氧化。氧化反应 的pH值通常为约7.0。典型的反应包括向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高 碘酸钠，接着在黑暗中培养约10分钟。参见(例如)美国专利第6,423,685号。
B.非天然氨基酸：含羟胺的氨基酸的结构和合成
含有羟胺(也称作氨基氧基)基团的非天然氨基酸容许与多种亲电子基团反应以形 成接合物(包含(但不限于)与PEG或其他水溶性聚合物)。如同肼、酰肼和半卡巴肼 一样，氨基氧基的增强的亲核性使其有效且选择性地与含有羰基或二羰基(包含(但不 限于)酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能基)的多种分子反应。参见(例如)Shao， J.和Tarn，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem. Res.34(9)：727-736(2001)。而与肼基的反应结果为相应腙，然而，肟通常由氨基氧基与 含有羰基或二羰基的基团(诸如，酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能基)反应产 生。
因此，在本文中描述的某些实施例中为具有包括以下基团的侧链的非天然氨基酸， 所述侧链包括羟胺基、类羟胺基(其具有类似于羟胺基的反应性且结构上类似于羟胺 基)、经掩蔽羟胺基(其可易于转变为羟胺基)、或经保护羟胺基(在去保护之后其具有 类似于羟胺基的反应性)。这些氨基酸包含具有下式的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、 杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷基、-C(O)R″、 -C(O)2R″、-C(O)N(R″)2、其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯 基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳 烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取 代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，A为亚苯基或经取代亚苯基。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，B为-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S-(亚烷基或经取代亚烷基)-或-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XIV)化合物的 某些实施例中，B为-O(CH2)2、-S(CH2)2-、-NH(CH2)2-、-CO(CH2)2-或-(CH2)n-，其中n 为1至4。在式(XIV)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基 甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，其中R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(XIV)化合 物的某些实施例中，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(XIV)化合物 的某些实施例中，其中R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(XIV)化合物的某 些实施例中，其中R2为聚核苷酸。在式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为核 糖核酸(RNA)。在式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为tRNA。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，其中tRNA特异性识别选择密码子。在式(XIV)化合物的某 些实施例中，其中选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特 密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。在 式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为抑制tRNA。在式(XIV)化合物的某些 实施例中，R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、 烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经 取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基。在式(XIV)化合物 的某些实施例中，R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、甲基、苯基以 及-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为1-50。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，K为-NR6R7。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、 染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束组成的群组的生物 活性剂。在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒 剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子以及甾族剂组成的群组 的药物。在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、β-半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶组成的群组的酶。在式(XIV)化合物的某些实施 例中，X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁 性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分以及能量转移部分组成的群组的可检测标 记。
在某些实施例中，式(XIV)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。 在某些实施例中，式(XIV)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中， 式(XIV)化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为 pH 2至8。
这些氨基酸包含具有式(XV)的结构的氨基酸：
其中
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
非限制性、代表性氨基酸具有以下结构：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
含有氨基氧基的氨基酸可由易于获得的氨基酸前驱物(高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨 酸)来制备。参见(例如)M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。 某些含有氨基氧基的氨基酸(诸如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸)已从天然来源分离 (Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。其他含有氨基氧基的氨基酸可类 似制备。此外，本文中描述的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈示于图5中。
C.非天然氨基酸：含肟氨基酸的化学合成
含有肟基的非天然氨基酸容许与含有某些反应性羰基或二羰基(包含(但不限于) 酮、醛或具有类似反应性的其他基团)的多种试剂反应以形成包括新肟基的新非天然氨 基酸。此肟交换反应容许非天然氨基酸多肽进一步官能化。此外，含有肟基的原始非天 然氨基酸本身可为适用的，只要肟键在将氨基酸并入多肽中所必需的条件下为稳定的 (例如，活体内、活体外以及本文中描述的化学合成方法)。
因此，在本文中描述的某些实施例中为具有包括以下基团的侧链的非天然氨基酸， 所述侧链包括肟基、类肟基(其具有类似于肟基的反应性且结构上类似于肟基)、经掩 蔽肟基(其可易于转变为肟基)、或经保护肟基(在去保护之后其具有类似于肟基的反 应性)。这些氨基酸包含具有式(XI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其限制条件为当A与B不存在时，R不为甲基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在式(XI)化合物的某些实施例中，B为-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XI) 化合物的某些实施例中，B为-O(CH2)-。在式(XI)化合物的某些实施例中，R为C1-6 烷基。在式(XI)化合物的某些实施例中，R为-CH3。在式(XI)化合物的某些实施例 中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基 (TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式(XI)化合物的某些实施例中，R1为树脂、氨基酸、 多肽或聚核苷酸。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或 O-叔丁基。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。 在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为聚核苷酸。
在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(XI)化合物的 某些实施例中，R2为tRNA。在式(XI)化合物的某些实施例中，tRNA特异性识别选 择密码子。在式(XI)化合物的某些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石 密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及 四碱基密码子组成的群组。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。在式 (XI)化合物的某些实施例中，R5为烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、 经取代聚氧化亚烷基或-C(O)2R″。在式(XI)化合物的某些实施例中，R5为-[(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为1-50。在式(XI)化合物的某些 实施例中，R5为-(CH2CH2)-O-CH3或-COOH。
在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(I) 化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
式(XI)的氨基酸包含具有式(XII)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群的连接子：低级亚烷基、经 取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂烷 基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其 中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R-′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2；其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸包含具有式(XIII)结构的氨基酸：
其中，
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸的其他非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，这些氨基酸包含具有式(XIV)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸进一步包含具有式(XVI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
此外，这些氨基酸包含具有式(XVII)的结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基。
这些氨基酸的非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
以及
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，这些氨基酸包含具有式(XVIII)的结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-
(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；且
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′；其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸的非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
以及
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
基于肟的非天然氨基酸可由所属领域中已描述的方法或由本文中描述的方法来合 成，其包含：(a)使含羟胺的非天然氨基酸与含有羰基或二羰基的试剂反应；(b)使含 有羰基或二羰基的非天然氨基酸与含羟胺的试剂反应；或(c)使含肟的非天然氨基酸 与某些含有羰基或二羰基的试剂(包含例如含酮试剂或含醛试剂)反应。图5与图6呈 示这些合成方法的代表性、非限制性实例。
D.非天然氨基酸的细胞吸收
当设计和选择非天然氨基酸(包含(但不限于)用于并入多肽中)时，真核细胞的 非天然氨基酸吸收为通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些 化合物不太可能透过细胞。天然氨基酸是通过基于蛋白质的传输系统的集合吸收于真核 细胞中。可进行评估哪些非天然氨基酸(如果存在的话)由细胞吸收的快速筛检(本文 中的实例15和16说明可对非天然氨基酸进行的测试的非限制性实例)。参见(例如) 标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第2004/198637号(此案是以引用的方式全 部并入本文中)中的毒性检定，以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States 96：4780-4785。尽管吸收易于通过各种检定分析，但设计符合细胞吸收途径的非天然氨 基酸的替代方案为提供活体内产生氨基酸的生物合成途径。
通常，通过如本文中所述的细胞吸收产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质 生物合成的浓度(包含(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如影响其他氨基酸 的浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。
E.非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于用于产生氨基酸和其他化合物的细胞中。虽然特定非天 然氨基酸的生物合成方法可能在自然界(包含(但不限于)细胞)中不存在，但本文中 描述的方法和组合物提供这些方法。举例来说，非天然氨基酸的生物合成途径可通过添 加新的酶或修饰现存宿主细胞途径于宿主细胞中产生。其他新酶包含天然存在的酶或人 工演化的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中的实例所呈示)依赖于添加来自其他生物 体的已知酶的组合。这些酶的基因可通过以包括这些基因的质粒转化细胞而引入真核细 胞中。当于细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促途径。本文中提供视情 况添加的酶的类型的实例。其他酶序列见于(例如)基因库(Genbank)中。人工演化 的酶可以相同方式添加到细胞中。以此方式，操纵细胞的细胞机制和来源以产生非天然 氨基酸。
多种方法可用于制备用于生物合成途径或演化现存途径的新颖酶。举例来说，包含 (但不限于)如由Maxygen，Inc.(可于万维网(world wide web)上以www.maxygen.com 获得)开发的递归重组可用于开发新颖的酶和途径。参见(例如)Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature 370(4)：389-391；以及Stemmer， (1994)，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。由Genencor(可于万维 网上以genencor.com获得)开发的Similarly DesignPathTM视情况用于代谢途径工程设计 中，其包含(但不限于)用于工程设计于细胞中产生非天然氨基酸的途径。此技术使用 新基因的组合(包含(但不限于)通过功能基因组学、分子进化和设计鉴别的那些)来 改造宿主生物体中的现存途径。Diversa Corporation(可于万维网上以diversa.com获得) 也提供快速筛检基因和基因途径的库的技术，其包含(但不限于)产生用于通过生物合 成产生非天然氨基酸的新途径。
通常，以如本文中所述的经工程设计的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以 进行有效蛋白质生物合成的浓度(包含(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如 影响其他氨基酸浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10 mM至约0.05mM。一旦以包括用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞且产 生非天然氨基酸，则视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成与细胞生长进一步 优化非天然氨基酸的产生。
F.其他合成方法
本文中描述的非天然氨基酸可使用所属领域中描述的方法或使用本文中描述的技 术或由其组合来合成。作为辅助，下表提供可经组合以产生所需官能基的各种起始亲电 子试剂和亲核试剂。所提供的信息意欲为说明性的且并非限制本文中描述的合成技术。
表1：共价键以及其前驱物的实例
共价键产物 亲电子试剂 亲核试剂 羧酰胺 活化酯 胺/苯胺 羧酰胺 酰基叠氮化物 胺/苯胺 羧酰胺 酰基卤化物 胺/苯胺 酯 酰基卤化物 醇/酚 酯 酰基腈 醇/酚 羧酰胺 酰基腈 胺/苯胺 亚胺 醛 胺/苯胺 腙 醛或酮 肼 肟 醛或酮 羟胺 烷基胺 烷基卤化物 胺/苯胺
酯 烷基卤化物 羧酸 硫醚 烷基卤化物 硫醇 醚 烷基卤化物 醇/酚 硫醚 磺酸烷基酯 硫醇 酯 磺酸烷基酯 羧酸 醚 磺酸烷基酯 醇/酚 酯 酐 醇/酚 羧酰胺 酐 胺/苯胺 苯硫酚 芳基卤化物 硫醇 芳基胺 芳基卤化物 胺 硫醚 Azindine 硫醇 硼酸酯 硼酸盐 二醇 羧酰胺 羧酸 胺/苯胺 酯 羧酸 醇 肼 酰肼 羧酸 N-酰基脲或酐 碳化二亚胺 羧酸 酯 重氮烷 羧酸 硫醚 环氧化物 硫醇 硫醚 卤基乙酰胺 硫醇 氨基三嗪 卤基三嗪 胺/苯胺 三嗪基醚 卤基三嗪 醇/酚 脒 酰亚胺酯 胺/苯胺 脲 异氰酸酯 胺/苯胺 氨基甲酸酯 异氰酸酯 醇/酚 硫脲 异硫氰酸酯 胺/苯胺 硫醚 马来酰亚胺 硫醇 亚磷酸酯 氨基磷酸酯 醇 硅烷基醚 硅烷基卤化物 醇 烷基胺 磺酸酯 胺/苯胺 硫醚 磺酸酯 硫醇 酯 磺酸酯 羧酸 醚 磺酸酯 醇 磺酰胺 磺酰基卤化物 胺/苯胺 磺酸酯 磺酰基卤化物 酚/醇
一般来说，碳亲电子试剂对于互补亲核试剂(包含碳亲核试剂)的进攻敏感，其中 进攻的亲核试剂向碳亲电子试剂提供电子对以在亲核试剂与碳亲电子试剂之间形成新 键。
碳亲核试剂的非限制性实例包含(但不限于)烷基格氏试剂(alkyl Grignard)、烯 基格氏试剂、芳基格氏试剂以及炔基格氏试剂、有机锂、有机锌、烷基锡试剂、烯基锡 试剂、芳基锡试剂以及炔基锡试剂(有机锡烷)、烷基硼烷试剂、烯基硼烷试剂、芳基 硼烷试剂以及炔基硼烷试剂(有机硼烷以及有机硼酸盐)；这些碳亲核试剂具有在水或 极性有机溶剂中在动力学上稳定的优点。碳亲核试剂的其他非限制性实例包含磷内鎓 盐、烯醇以及烯醇化物试剂；这些碳亲核试剂具有相对易于由合成有机化学领域中的技 术人员熟知的前驱物产生的优点。当与碳亲电子试剂共同使用时，碳亲核试剂在碳亲核 试剂与碳亲电子试剂之间形成新的碳碳键。
适于与碳亲电子试剂偶合的非碳亲核试剂的非限制性实例包含(但不限于)伯胺与 仲胺、硫醇、硫醇盐以及硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、半卡巴肼以及其类似物。当与碳 亲电子试剂共同使用时，这些非碳亲核试剂通常产生杂原子键(C-X-C)，其中X为杂 原子，其包含(但不限于)氧、硫或氮。
VI.具有非天然氨基酸的多肽
为方便起见，这部分中描述的化合物的形式、性质和其他特征已一般性及/或以特定 实例来描述。然而，这部分中描述的形式、性质和其他特征不应仅限于这部分中提供的 一般性描述或特定实例，而是这部分中描述的形式、性质和其他特征同样良好适用于处 于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物， 其包含处于本文中的说明书、权利要求以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A 和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物。
本文中描述的组合物和方法提供将至少一个非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基 酸可存在于多肽上的任何位置处，其包含多肽的任何末端位置或任何内部位置。相对于 同源天然存在氨基酸多肽来说，优选非天然氨基酸不破坏多肽的活性及/或三级结构，除 非活性及/或三级结构的此破坏为将非天然氨基酸并入多肽中的一个目的。此外，相对于 同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天然氨基酸并入多肽中可在一定程度上修饰多肽的 活性(例如，操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、 药理学及/或药效(例如，增大水溶性、生物可用性；增大血清半衰期；增大治疗半衰期； 调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)；向多肽提供其他官能基；向多肽中 并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质；以及前述修饰的任何组合)及/ 或三级结构，而完全不造成活性及/或三级结构的破坏。对活性及/或三级结构的这些修 饰通常为实现这些并入的一个目标，尽管相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天 然氨基酸并入多肽中也可对多肽的活性及/或三级结构不产生影响。相应地，认为非天然 氨基酸多肽、包括非天然氨基酸多肽的组合物、用于制造这些多肽和多肽组合物的方法、 用于纯化、分离和表征这些多肽和多肽组合物的方法，以及使用这些多肽和多肽组合物 的方法在本揭露内容的范畴内。此外，本文中描述的非天然氨基酸多肽也可连接到另一 多肽(包含(例如)非天然氨基酸多肽或天然存在氨基酸多肽)上。
本文中描述的非天然氨基酸多肽可通过生物合成或非生物合成制备。生物合成意谓 利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何方法，其包含使用以下组分中的至少一者：聚核 苷酸、密码子、tRNA以及核糖体。非生物合成意谓不利用翻译系统的任何方法：这种 方法可进一步分为利用固态肽合成方法、固相肽合成方法的方法；利用至少一种酶的方 法；以及不利用至少一种酶的方法；另外，这个细分部分中的任何部分可重叠且许多方 法可利用这些细分部分的组合。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或 家族。确实，实质上任何多肽可包含至少一个本文中描述的非天然氨基酸。仅举例来说， 多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑 制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心 房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、 NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核 细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、 单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、 T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体 因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、 MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮 剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维 蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促 性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、 水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1 受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、 神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、 甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热 外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、 可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长 调节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、 SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综 合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因 子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、 jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮 质酮。在相关或其他实施例中，非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多 肽成员同源。
非天然氨基酸多肽可如本揭露内容中其他地方所述经进一步修饰或非天然氨基酸 多肽可不经进一步修饰而使用。可为多种目的而将非天然氨基酸并入多肽中，其包含(但 不限于)定制蛋白质结构及/或功能的改变，改变蛋白酶靶位点的大小、酸性、亲核性、 氢键、疏水性、可接近性，靶向部分(包含(但不限于)，对于多肽阵列)等。包含非 天然氨基酸的多肽可具有增强的或甚至完全新的催化或生物物理性质。仅举例来说，以 下性质可通过将非天然氨基酸包含于多肽中来加以改造：毒性、生物分布、结构性质、 光谱性质、化学及/或光化学性质、催化能力、半衰期(包含(但不限于)血清半衰期)、 与其他分子反应(包含(但不限于)共价或非共价)的能力以及其类似性质。具有包含 至少一个非天然氨基酸的多肽的组合物适用于(包含，但不限于)新颖治疗、诊断、催 化酶、工业酶、结合蛋白(包含(但不限于)抗体)，以及研究(包含(但不限于)对 蛋白质结构和功能的研究)。参见(例如)Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。
此外，多肽的非天然氨基酸组分的侧链可向多肽提供多种其他官能基；仅举例来说， 且并非加以限制，多肽的非天然氨基酸部分的侧链可包含以下物质中的任一者：标记； 染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒素化合物；药物； 亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物； 抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA； 反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记； 荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用 的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生 物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链； 碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物 理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能 量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子 俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活 化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、 向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。
一方面，组合物包含至少一种具有至少一个(包含(但不限于)至少两个、至少三 个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十 个以上)非天然氨基酸的多肽。这些非天然氨基酸可相同或不同。另外，在包括1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的 不同或相同非天然氨基酸的多肽中可能存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同位点。另一方面，组合物包含其 中多肽中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的多肽。对于 具有一个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，这些非天然氨基酸可相同或不同(诸如， 仅举例来说，多肽可包含两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或可包含两个相同 的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，非天然氨基酸可 相同、不同或为多个数目的相同种类的非天然氨基酸与至少一种不同非天然氨基酸的组 合。
尽管本文中描述的非天然氨基酸多肽的实施例可通过固相肽合成方法(诸如，仅举 例来说，于固体树脂上)、溶液相肽合成方法及/或不借助于酶来化学合成，但本文中描 述的非天然氨基酸多肽的其他实施例容许通过细胞膜、细胞提取物或溶解产物系统，或 通过活体内系统(诸如，仅举例来说，使用原核细胞或真核细胞的细胞机制)来合成。 在其他或额外实施例中，本文中描述的非天然氨基酸多肽的一种关键特征在于其可利用 核糖体来合成。在本文中描述的非天然氨基酸多肽的其他或额外实施例中，非天然氨基 酸多肽可通过方法的组合(包含(但不限于)固体树脂、不借助于酶、借助于核糖体及 /或通过活体内系统的组合)来合成。
通过核糖体及/或活体内系统合成非天然氨基酸多肽具有与于固体树脂上或不借助 于酶合成的非天然氨基酸多肽不同的优点和特征。这些优点和特征包含不同的杂质分 布：利用核糖体及/或活体内系统的系统应具有源于所利用的生物系统的杂质，其包含宿 主细胞蛋白质、膜部分以及脂质，而来自利用固体树脂及/或不借助于酶的系统的杂质分 布可包含有机溶剂、保护基、树脂材料、偶合试剂以及合成程序中使用的其他化学品。 另外，通过使用核糖体及/或活体内系统合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映细 胞利用的原料的同位素模式；另一方面，于固体树脂上及/或不借助于酶合成的非天然氨 基酸多肽的同位素模式可反映合成中利用的氨基酸的同位素模式。此外，通过使用核糖 体及/或活体内系统合成的非天然氨基酸可实质上不含氨基酸的D-异构体及/或可能够易 于将内部半胱氨酸氨基酸并入多肽的结构中，及/或可能很少提供内部氨基酸缺失多肽。 另一方面，通过固体树脂及/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽可具有较高含量的氨基 酸的D-异构体及/或较低含量的内部半胱氨酸氨基酸及/或较高百分比的内部氨基酸缺失 多肽。此外，所属领域的技术人员应能够区分通过使用核糖体及/或活体内系统合成的非 天然氨基酸多肽与通过固体树脂及/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽。
VII.包括核酸和寡核苷酸的组合物和方法
A.用于本文中的通用重组核酸方法
在本文中描述的方法和组合物的众多实施例中，将编码所关注的多肽(包含例如 GH多肽)的核酸分离、克隆且通常使用重组方法改造。这些实施例用于(包含，但不 限于)蛋白质表达或在产生来源于多肽的变体、衍生物、表达盒或其他序列的过程中使 用。在一些实施例中，编码多肽的序列是操作性连接于异源启动子上。
编码包括非天然氨基酸的多肽的核苷酸序列可根据母体多肽的氨基酸序列合成，且 随后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺 失或取代)。核苷酸序列可根据常规方法通过定点突变形成来方便地修饰。或者，核苷 酸序列可通过化学合成来制备，其包含(但不限于)通过使用寡核苷酸合成仪，其中寡 核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列设计，且优选选择重组多肽将产生于其中的宿主细 胞偏爱的那些密码子。举例来说，编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸可由PCR、连 接或连接链反应来合成且组装。参见(例如)Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88： 189-193(1991)；U.S.6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。
本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物利用重组遗传学领域中的常规技术。揭露 用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物的通用方法的基础著作包含Sambrook等 人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编，1994)。
描述分子生物学技术的一般著作包含Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA (Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)以及 Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.的合资企业，(1999全年增补) (″Ausubel″))。这些著作描述突变形成，载体、启动子的用途，以及许多其他相关主题， 其涉及包含(但不限于)包含用于制备包含非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交 tRNA、正交合成酶以及其对的基因或聚核苷酸的产生。
各种类型的突变形成用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物中以为实现多 种目的，其包含(但不限于)用于产生新颖合成酶或tRNA，用于使tRNA分子突变， 用于使编码合成酶、tRNA库的聚核苷酸突变，用于产生合成酶库，用于产生选择密码 子，用于插入编码所关注的蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。其包含(但 不限于)定点突变形成、随机点突变形成、同源重组、DNA改组或其他递归突变形成方 法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的突变形成、寡核苷酸定向诱变、经硫代磷酸酯 修饰的DNA突变形成、使用带缺口的双链DNA或其类似物的突变形成，或其任何组合。 其他适合方法包含点错配修复、使用缺乏修复的宿主菌株的突变形成、限制-选择以及限 制-纯化、缺失突变形成、通过总基因合成诱发突变、双链断裂修复，以及其类似方法。 包含(但不限于)包括嵌合构筑体的突变形成也包含在本文中描述的非天然氨基酸方法 和组合物中。在一实施例中，突变形成可由天然存在分子或变异或突变的天然存在分子 的已知信息(包含(但不限于)序列比较、物理性质、晶体结构或其类似物)指导。
本文中存在的著作和实例描述这些和其他相关程序。其他信息见于以下公开案和其 中引用的参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，在Nucleic Acids & Molecular Biology中(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编， Springer Verlag，Berlin))(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人， Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)； Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500 (1982)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml3 vectors，Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller和Smith， Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等 人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA， Nucl.Acids Res.13：8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人， 5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl. Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12： 9441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人， Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter， Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Methods in Enzymol.154： 382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317： 415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease Sprotein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人， Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesisby microscale′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki， Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)； Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001).W.P.C.Stemmer， Nature 370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8 (1995)。关于许多这些方法的其他细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，其也 描述以各种突变形成方法对产生故障的问题的有效控制。
本文中描述的方法和组合物也包含使用真核宿主细胞、非真核宿主细胞以及生物体 通过正交tRNA/RS对活体内并入非天然氨基酸。宿主细胞经对应于本文中描述的多肽的 聚核苷酸和包含对应于本文中描述的多肽的聚核苷酸的构筑体(包含(但不限于)对应 于本文中描述的多肽的载体，其可为(例如)克隆载体和表达载体)遗传工程化(包含 (但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶以及欲 衍生的蛋白质的编码区域操作性连接至在所需宿主细胞中具有功能的基因表达控制元 件上。载体可为(例如)质粒、粘粒、噬菌体、细菌、病毒、裸露聚核苷酸和接合聚核 苷酸的形式。用标准方法(包含电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824 (1985))、由病毒载体感染、由在小珠粒或粒子的基质内具有核酸的小粒子高速弹道穿透) 将载体引入细胞及/或微生物中，或引至表面上(Klein等人，Nature 327，70-73(1987)) 及/或其类似物。
经工程化设计的宿主细胞可于经改良以适于诸如(例如)筛检步骤、活化启动子或 选择转化株的行为的常规营养培养基中培养。这些细胞可视情况培养为转基因生物体。 其他包含(但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于随后的核酸分离)的适用参考 文献包含Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版， Wiley-Liss，New York以及其中引用的参考文献；Payne等人.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编) (1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual， Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。
可获得将目标核酸引入细胞中的若干种熟知方法，其中任一者可用于本文中描述的 方法和组合物中。其包含：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、射 弹轰击，以及以病毒载体感染(在本文中进一步论述)等。细菌细胞可用于扩增含有对 应于本文中描述的多肽的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长至log阶段且细菌内 的质粒可通过所属领域中已知的多种方法分离(参见，例如.Sambrook)。另外，众多 试剂盒可市面上购得以用于从细菌中纯化质粒，(参见(例如)EasyPrepTM、FlexiPrepTM， 两者均来自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，来自Stratagene；以及QIAprepTM，来自 Qiagen)。经分离且纯化的质粒随后经进一步处理以产生其他质粒，用于转染细胞或并 入用于感染生物体的相关载体中。典型的载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始 序列，以及适用于调节特定目标核酸的表达的启动子。载体视情况包括含有至少一个独 立终止子序列的一般表达盒、容许序列盒在真核生物或原核生物或两者中复制的序列 (包含(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统两者的选择标记。载体适 于在原核生物、真核生物或优选两者中复制和整合。参见，Gillam和Smith，Gene 8：81 (1979)；Roberts等人，Nature，328：731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif. 6(1)：10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(均如上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体 的目录由(例如)ATCC提供，例如，ATCC出版的The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆以及分子生物学的其他方面的 其他基本程序以及潜在理论考虑因素也见于Watson等人.(1992)Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books，NY中。另外，基本上任何核酸(以及实质上 任何经标记核酸，无论标准或非标准)可从多种商业来源的任一者定制或标准定购，这 些商业来源诸如the Midland Certified Reagent Company(Midland，TX mcrc.com)、The Great American Gene Company(Ramona，CA，在万维网上以genco.com获得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，在万维网上以expressgen.com获得)、Operon Technologies Inc.(Alameda， CA)以及许多其他来源。
B.选择密码子
涵盖于本文中描述的方法和组合物中的选择密码子详述蛋白质生物合成机制的遗 传密码子框架。举例来说，选择密码子包含(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码 子(诸如终止密码子，其包含(但不限于)琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、 非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子或其类似物。可引入所需基 因或聚核苷酸中的选择密码子的数目存在广泛范围，其在编码所关注的多肽的至少一部 分的单一聚核苷酸中包含(但不限于)一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、 4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。
在一实施例中，所述方法包括使用作为终止密码子的选择密码子用于活体内并入一 个或一个以上的非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包含(但不限于)UAG) 的O-tRNA且其由O-RS以所需非天然氨基酸氨酰基化。此O-tRNA并不由天然存在宿 主的氨酰基-tRNA合成酶识别。可使用常规定点突变形成在所关注的多肽中的所关注位 点处引入终止密码子(包含(但不限于)UAG)。参见(例如)Sayers，J.R.等人.(1988)，5′，3′ Exonuclease in phosphorothioate-based oligomicleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，16(3)：791-802。当将O-RS、O-tRNA以及编码所关注的多肽的核酸在活体内组合时， 非天然氨基酸回应UAG密码子而得以并入以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多 肽。
可在活体内进行非天然氨基酸的并入而不造成真核宿主细胞的显著混乱。举例来 说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包含(但不限于)琥珀抑制tRNA) 与真核释放因子(包含(但不限于)eRF)(其与终止密码子结合且引起生长中的肽从核 糖体释放)之间的竞争，抑制效率可通过(包含，但不限于)增加O-tRNA及/或抑制tRNA 的表达水平来调节。
选择密码子也包括延长的密码子，其包含(但不限于)四个或四个以上碱基的密码 子(诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子)。四碱基密码子的实例包含(但 不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU以及其类似物。五碱基密码子的实例包含(但 不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC以及其类似物。本 文中描述的方法和组合物的特征包含使用根据移码抑制延长的密码子。四个或四个以上 碱基的密码子可将(包含，但不限于)一或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例 来说，在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt反密码子环)的突变型O-tRNA(包 含(但不限于)特定移码抑制tRNA)的存在下，四个或四个以上碱基的密码子作为单 一氨基酸读取。在其他实施例中，反密码子环可解码，其包含(但不限于)至少一个四 碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多。因为存在256个 可能的四碱基密码子，在同一细胞中多种非天然氨基酸可使用四个或四个以上碱基的密 码子编码。参见Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size， Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ″Shifty″ Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，四碱基密码子已用于使用活体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白 质中。参见(例如)Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939-7945；以及Hohsaka等人， (1999)J.Am.Chem.Soc，121：34-40。以两个化学酰化移码抑制tRNA，使用CGGG和 AGGU在活体外将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBU衍生物同时并入链霉亲合素中。参见 (例如)Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：12194-12195。在活体内研究中， Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、 A、G或C)的能力，且发现四联组UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％ 至26％的效率解码，其中在0或-1框架中仅少许解码。参见，Moore等人，(2000)J.Mol. Biol.，298：195-205。在一实施例中，基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子可用于 本文中描述的方法和组合物中，其可减少在其他不需要的位点处的错义通读和移码抑 制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包含天然三碱基密码子中的一者，其中内源性 系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，其包含缺乏识别天然三碱基密 码子的tRNA的系统，及/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包含非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩大现有遗传符号 系统。一个额外碱基对将三联体密码子的数目由64增加至125。第三碱基对的性质包含 稳定及选择性碱基配对、由聚合酶进行的以高保真度有效酶促并入DNA中，以及在初 生非天然碱基对合成后有效的持续引物延长。对可适合于方法和组合物的非天然碱基对 的描述包含(例如)Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein，Nature Biotechnology，20：177-182，且也参见Wu，Y.等人(2002)J. Am.Chem.Soc.124：14626-14630。其他相关公开案列于本文中。
对于活体内使用，非天然核苷为膜可透过性的且经磷酸化以形成相应三磷酸酯。另 外，增加的遗传信息为稳定的且不由细胞酶破坏。Benner和其他人的先前努力利用与典 型沃森-克里克碱基对(Watson-Crick pair)中的那些氢键类型不同的氢键类型，其中最 值得注意的实例为异-C:异-G对。参见(例如)Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc， 111：8322-8322；以及Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33-37；Kool，(2000)Curr.Opin. Chem.Biol.，4：602-608。这些碱基通常在某种程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。 Kool和合作者证实碱基之间的疏水堆叠相互作用可取代氢键以驱动碱基对的形成。参 见，Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602-608；以及Guckian和Kool，(1998)Angew. Chem.Int.Ed.Engl.，36(24)：2825-2828。在努力开发满足所有上述要求的非天然碱基对 的过程中，Schultz、Romesberg以及合作者已系统地合成且研究了一系列非天然疏水碱 基。发现PICS∶PICS自身配对比天然碱基对更稳定，且其可通过大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段(KF)有效并入DNA中。参见(例如)McMinn等人，(1999)J.Am.Chem. Soc，121：11585-11586；以及Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：3274-3278。 3MN-3MN自身配对可以对于生物功能足够的效率和选择性由KF合成。参见(例如) Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：8803-8804。然而，两种碱基充当进一步复制 的链终止子。最近已发展出可用于复制PICS自身配对的突变型DNA聚合酶。另外，7AI 自身配对可被复制。参见(例如)Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439-7440。 也已开发出在结合Cu(II)后形成稳定配对的新颖金属碱基对Dipic:Py。参见，Meggers 等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714-10715。因为延长的密码子和非天然密码子固 有地与天然密码子正交，所以本文中描述的非天然氨基酸方法可利用此性质以产生与其 有关的正交tRNA。
翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大 序列并入基因中，但不翻译为蛋白质。所述序列含有充当诱发核糖体越过所述序列且在 插入下游继续翻译的信号的结构。
在某些实施例中，本文中描述的方法及/或组合物中所关注的蛋白质或多肽(或其部 分)是由核酸编码。通常，核酸包括至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少 三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、 至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上的 选择密码子。
编码所关注的蛋白质或多肽的基因可在“Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques”指导下使用所属领域的技术人员熟知以及本文中描述的方法进行诱变以包 含(例如)用于并入非天然氨基酸的一个或一个以上的选择密码子。举例来说，将所关 注的蛋白质的核酸诱变以包含一个或一个以上的选择密码子，提供一个或一个以上的非 天然氨基酸的并入。本文中描述的方法和组合物包含任何这种变体，其包含(但不限于) 任何蛋白质(例如，包含至少一个非天然氨基酸)的突变形式。类似地，本文中描述的 方法和组合物包含相应核酸，即，具有一个或一个以上编码或容许一个或一个以上的非 天然氨基酸的活体内并入的选择密码子的任何核酸。
编码所关注的多肽(包含(仅举例来说)GH多肽)的核酸分子可易于突变以在多 肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、 蛋白质或多种其他分子引入至所关注的蛋白质上。适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置 中的方法在所属领域中为熟知的，诸如描述于美国专利第6,608,183号(其是以引用的 方式全部并入本文中)中的那些方法，以及标准突变形成技术。这种引入且利用半胱氨 酸的技术的使用可与本文中描述的引入且利用非天然氨基酸的技术联合使用。
VIII.包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生
为方便起见，这部分中描述的包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生一般性及/或以 特定实例来描述。然而，这部分中描述的包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生不应仅 限于这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的包括非天然氨基酸的多 肽的活体内产生同样良好适用于处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及 XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物，其包含处于本文中的说明书、权利要求以及图 式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何 子式或特定化合物。
本文中描述的多肽可使用经修饰以添加或取代未在天然存在系统中编码的氨基酸 的tRNA和tRNA合成酶而在活体内产生。
产生使用未在天然存在系统中编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述于 (例如)美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)以及2003/0108885(序 号10/126,931)中，其是以引用的方式全部并入本文中。这些方法包括产生独立于对翻 译系统而言为内源性(且因此有时被称作“正交”)的合成酶和tRNA行使功能的翻译机 制。在一实施例中，翻译系统包括编码多肽的聚核苷酸；聚核苷酸可为从相应DNA转 录的mRNA，或mRNA可从RNA病毒载体中产生；此外聚核苷酸包括对应于并入非天 然氨基酸的预先指定位点的选择密码子。翻译系统进一步包括针对且(适当时)也包括 非天然氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对前述选择密码子具有特异性/特异性识别前述 选择密码子；在其他实施例中，非天然氨基酸经氨酰基化。非天然氨基酸包含具有本文 中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII中的任一者的结构 的那些非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，翻译系统包括对所述tRNA具有特异性 的氨酰基合成酶，且在其他或此外的实施例中，翻译系统包括正交tRNA以及正交氨酰 基tRNA合成酶。在其他或额外实施例中，翻译系统包括以下各物中的至少一者：包括 前述聚核苷酸的质粒(诸如，仅举例来说，以DNA的形式)、包括前述聚核苷酸的基因 组DNA(诸如，仅举例来说，以DNA的形式)或前述聚核苷酸整合于其中的基因组 DNA(在其他实施例中，所述整合为稳定整合)。在翻译系统的其他或额外实施例中， 选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码 子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。在翻译系统的其他或 额外实施例中，tRNA为抑制tRNA。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸多肽是由核 糖体来合成。
在其他或额外实施例中，翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA 合成酶(O-RS)。通常，在翻译系统中O-RS优先以至少一种非天然氨基酸氨酰基化 O-tRNA且O-tRNA识别至少一种不由系统中的其他tRNA识别的选择密码子。翻译系 统因此将非天然氨基酸插入系统中产生的多肽中，以回应所编码的选择密码子，进而将 非天然氨基酸“取代”入所编码的多肽中的位置中。
用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA以及氨酰基tRNA合成酶已在 所属领域中描述，且通常适用于本文中描述的方法中以产生本文中描述的非天然氨基酸 多肽。举例来说，酮特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang，L.等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 100(1)：56-61(2003)以及Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003) 中。例示性O-RS或其部分由聚核苷酸序列编码且包含美国专利申请公开案 2003/0082575和2003/0108885(其每一者是以引用的方式全部并入本文中)中揭露的氨 基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案 2003/0082575(序号10/126,927)以及2003/0108885(序号10/126,931)中，其是以引 用的方式全部并入本文中。另外，Mehl等人在J.Am.Chem.Soc.2003；125：935-939中以 及Santoro等人.Nature Biotechnology 2002年10月；20：1044-1048(其是以引用的方式 全部并入本文中)论述筛检方法以及用于将对氨基苯丙氨酸并入多肽中的氨酰基tRNA 合成酶和tRNA分子。
适用于本文中描述的方法中的例示性O-tRNA序列包含(但不限于)如美国专利申 请公开案2003/0108885(序号10/126,931)(其是以引用的方式并入本文中)中所揭露的 核苷酸序列SEQ ID NO：1-3。对特定非天然氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA 合成酶对的其他实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中， 其是以引用的方式全部并入本文中。在酿酒酵母中结合含酮氨基酸与含叠氮化物氨基酸 两者的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的用途包括选择编码非天然氨基酸的特异性密码子。 尽管可使用任何密码子，但通常需要选择很少或从不在O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶在 其中表达的细胞中使用的密码子。仅举例来说，例示性密码子包含无义密码子，诸如终 止密码子(琥珀密码子、赭石密码子以及蛋白石密码子)、四个或四个以上碱基的密码 子以及很少使用或不使用的其他的天然三碱基密码子。
可使用所属领域中已知的突变形成方法(包含(但不限于)定点突变形成、盒式突 变形成、限制选择突变形成等)将特异性选择密码子引入聚核苷酸编码序列的适当位置 中。
产生可用于并入非天然氨基酸的蛋白质生物合成机制(诸如O-RS、O-tRNA以及正 交O-tRNA/O-RS对)的组分的方法描述于Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)； Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42： 6735-6746(2003)中。用于非天然氨基酸的活体内并入的方法和组合物描述于美国专利申 请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其是以引用的方式全部并入本文中。用 于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美 国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931) 中，其是以引用的方式全部并入本文中。另外，标题为“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins”的PCT公开案第WO 04/035743号(其是以引用的方式全部 并入)描述用于并入酮氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO 04/094593号(其是以引用的方式全部并入本文中) 描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)产生来 源于来自第一生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS库， 其中第一生物体包含(但不限于)原核生物体，诸如，仅举例来说，詹氏甲烷球菌、热 自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、强烈炽热球菌、掘越氏热球菌、 敏捷气热菌、嗜热栖热菌或其类似物，或真核生物体；(b)选择(及/或筛检)RS(视 情况突变体RS)库中在非天然氨基酸以及天然氨基酸存在下氨酰基化正交tRNA (O-tRNA)的成员，进而提供活性(视情况突变型)RS的池；及/或，(c)选择(视情 况通过阴性选择)所述池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的活 性RS(包含(但不限于)突变体RS)，进而提供至少一种重组O-RS；其中至少一种重 组O-RS优先以非天然氨基酸氨酰基化O-tRNA。
在一实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变来产生。仅举例 来说，非活性RS可通过使至少约1种、至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少 约5种、至少约6种或至少约10种或10种以上的氨基酸突变为不同氨基酸(包含(但 不限于)丙氨酸)来产生。
突变体RS库可使用所属领域中已知的各种技术来产生，其包含(但不限于)根据 蛋白质三维RS结构的合理设计，或随机或合理设计技术中RS核苷酸的突变形成。仅 举例来说，突变体RS可由位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合 构筑体、合理设计以及本文中描述或所属领域中已知的其他方法来产生。
在一实施例中，选择(及/或筛检)RS(视情况突变体RS)库中的活性成员(其包 含(但不限于)在非天然氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰基化正交tRNA(O-tRNA)的 那些成员)包含(但不限于)：将阳性选择或筛检标记(包含(但不限于)抗生素抗性 基因或其类似物)以及(视情况突变体)RS库引入多个细胞中，其中阳性选择及/或筛 检标记包括至少一种选择密码子，其包含(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子、蛋白 石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子； 在选择剂存在下使所述多个细胞生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一种选择 密码子来鉴别在选择及/或筛检剂存在下存活(或展示特异性反应)的细胞，进而提供含 有活性(视情况突变体)RS的池的阳性选择细胞的子集。视情况，选择及/或筛检剂浓 度可改变。
一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因且选择密码子为CAT基 因中的琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且选择密码子为β- 内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛检标记包括荧光或发光筛检标记 或基于亲和性的筛检标记(包含(但不限于)细胞表面标记)。
在一实施例中，阴性选择或筛检池中的活性RS(视情况突变体)(包含(但不限于) 在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的那些活性RS)包含(但不限 于)：以来自阳性选择或筛检的活性(视情况突变体)RS的池将阴性选择或筛检标记引 入第二生物体的多个细胞，其中阴性选择或筛检标记包括至少一种选择密码子(包含(但 不限于)抗生素抗性基因，其包含(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；且， 鉴别在补充有非天然氨基酸以及筛检或选择剂的第一培养基中存活或展示特异性筛检 反应，但在未补充有非天然氨基酸以及选择或筛检剂的第二培养基中不能存活或展示特 异性反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。仅举例来 说，CAT鉴别方案视情况充当确定适当O-RS重组体的阳性选择及/或阴性筛检。例如， 克隆池视情况在具有或不具有一种或一种以上非天然氨基酸的含有CAT(其包括至少一 种选择密码子)的生长板上复制。在含有非天然氨基酸的板上唯一生长的菌落因此被认 为含有重组O-RS。一方面，改变选择(及/或筛检)剂的浓度。在一些方面中，第一生 物体与第二生物体不同。因此，第一生物体及/或第二生物体视情况包括：原核生物、真 核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物 等。在其他实施例中，筛检标记包括荧光或发光筛检标记或基于亲和性的筛检标记。
在另一实施例中，筛检或选择(包含(但不限于)阴性选择)池中的活性(视情况 突变体)RS包含(但不限于)：分离来自阳性选择步骤(b)中的活性突变体RS的池； 将阴性选择或筛检标记(其中阴性选择或筛检标记包括至少一种选择密码子(包含(但 不限于)毒性标记基因，其包含(但不限于)核糖核酸酶barnase基因，其包括至少一 种选择密码子))和活性(视情况突变体)RS的池引入第二生物体的多个细胞中；且鉴 别在未补充非天然氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛检反应，但在补充有非天 然氨基酸的第二培养基中不能存活或展示特异性筛检反应的细胞，进而提供具有至少一 种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中至少一种重组O-RS对非天然氨基酸具有特 异性。一方面，至少一种选择密码子包括约两个或两个以上的选择密码子。这些实施例 视情况可包含其中至少一种选择密码子包括两个或两个以上的选择密码子，且其中第一 生物体与第二生物体不同(包含(但不限于)，每一生物体视情况包含(但不限于)原 核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、 原生生物等)。同样，一些方面包含其中阴性选择标记包括核糖核酸酶barnase基因(其 包括至少一种选择密码子)。其他方面包含其中筛检标记视情况包括荧光或发光筛检标 记或基于亲和性的筛检标记。在本文中的实施例中，筛检及/或选择视情况包含筛检及/ 或选择严格度的变化。
在另一实施例中，产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进 一步包括：(d)分离至少一种重组O-RS；(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组 O-RS(视情况经突变)；以及，(f)重复步骤(b)和(c)直至获得包括优先氨酰基化 O-tRNA的能力的突变型O-RS。视情况，重复步骤(d)-(f)(包含，但不限于)至少 约两次。一方面，来源于至少一种重组O-RS的第二组突变型O-RS可通过突变形成(包 含(但不限于)随机突变形成、位点特异性突变形成、重组或其组合)产生。
选择/筛检步骤的严格度包含(但不限于)阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检 步骤(c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者，在上述方法中，视情况包含 改变选择/筛检严格度。在另一实施例中，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤 (c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者包括使用报导基因，其中报导基因 是由荧光活化细胞分选技术(FACS)检测或其中报导基因是通过发光检测。视情况， 报导基因显示于细胞表面上、噬菌体显示器或其类似物上且根据涉及非天然氨基酸或类 似物的亲和性或催化活性来选择。在一实施例中，突变型合成酶显示于细胞表面上、噬 菌体显示器或其类似物上。
产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包含(但不限于)：(a)产生来源于至少一 种tRNA(包含(但不限于)来自第一生物体的抑制tRNA)的突变体tRNA的库；(b) 选择(包含(但不限于)阴性选择)或筛检在来自第一生物体的RS不存在的情况下由 来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变体)tRNA的库， 进而提供tRNA(视情况突变体)的池；以及，(c)选择或筛检所述tRNA(视情况突变 体)的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA； 其中至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二生物体的RS有效识别且 由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，至少一种tRNA为抑制tRNA及/或包括天然 及/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、 包括至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一实施 例中，重组O-tRNA具有正交性的提高。应了解，在一些实施例中，O-tRNA视情况从 第二生物体中引入至第一生物体中而无需修饰。在各种实施例中，第一生物体与第二生 物体相同或不同且视情况选自(包含，但不限于)原核生物(包含(但不限于)詹氏甲 烷球菌、热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵 母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA视情况经非天然氨 基酸氨酰基化，其中非天然氨基酸是天然地或通过遗传操作在活体内生物合成。非天然 氨基酸视情况添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中，其中非天然氨基酸 能够达到适当细胞内浓度以容许并入非天然氨基酸多肽中。
一方面，选择(包含(但不限于)阴性选择)或筛检库中由氨酰基-tRNA合成酶(步 骤(b))氨酰基化的(视情况突变体)tRNA包含：将毒性标记基因(其中毒性标记基 因包括至少一种选择密码子(或导致产生毒性剂或静态剂的基因或生物体必需的基因， 其中这种标记基因包括至少一种选择密码子))和(视情况突变体)tRNA的库引入来自 第二生物体的多个细胞中；以及，选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包括至少一种 正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变体)tRNA的池。举例来说，存活细胞可通 过使用比较比率细胞密度检定来选择。
另一方面，毒性标记基因可包含两个或两个以上的选择密码子。在本文中描述的方 法的另一实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase 基因包括至少一个琥珀密码子。视情况，核糖核酸酶barnase基因可包含两个或两个以 上的琥珀密码子。
在一实施例中，选择或筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS) 氨酰基化的成员可包含：将阳性选择或筛检标记基因(其中阳性标记基因包括药物抗性 基因(包含(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包括至少一种选择密码子，诸如至少一个 琥珀终止密码子)或生物体必需的基因，或使得毒性剂解毒的基因)以及O-RS和(视 情况突变体)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中；以及，鉴别在选择或筛检 剂(包含(但不限于)抗生素)存在下生长的存活细胞或筛检细胞，进而提供具有至少 一种重组tRNA的细胞池，其中至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化且将氨基酸插 入由阳性标记基因编码的翻译产物中，以回应所述至少一种选择密码子。在另一实施例 中，改变选择及/或筛检剂的浓度。
提供产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包含(但不限于)：(a)产生来源于 来自第一生物体的至少一种tRNA的突变体tRNA的库；(b)阴性选择或筛检库中在来 自第一生物体的RS不存在的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨 酰基化的(视情况突变体)tRNA，进而提供(视情况突变体)tRNA的池；(c)选择或 筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，进而提 供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第 二生物体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。所述方法也包含(d)产生来源于来 自第三生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS的库；(e) 在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下选择或筛检突变体RS的库中优先氨酰基化所述 至少一种重组O-tRNA的成员，进而提供活性(视情况突变体)RS的池；以及，(f)阴 性选择或筛检池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化所述至少一种重组 O-tRNA的活性(视情况突变体)RS，进而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中 所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包括至少一种对非天然氨基酸和具有特异性的重 组O-RS以及至少一种重组O-tRNA。由本文中描述的方法产生的特异性O-tRNA/O-RS 对包含于本文中描述的范畴和方法中。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包含(包 含，但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS对(诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、 mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对或其类 似物。另外，这些方法包含其中第一生物体和第三生物体相同(包含(但不限于)詹氏 甲烷球菌)。
用于选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法 也包含在本文中描述的方法中。方法包含(但不限于)：将标记基因、tRNA以及从第一 生物体分离或来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第 一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复本细胞组中；以及，选择不 能在复本细胞组中存活的第一组中的存活细胞或筛检展示特异性筛检反应的在复本细 胞组中不能产生这种反应的细胞，其中第一组和复本细胞组是在选择或筛检剂存在下生 长，其中存活细胞或筛检细胞包括用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交 tRNA-tRNA合成酶对。在一实施例中，比较以及选择或筛检包含活体内互补检定。选择 或筛检剂的浓度可改变。
本文中描述的生物体包括多种生物体以及多种组合。在一实施例中，生物体视情况 为原核生物体，其包含(但不限于)詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠 杆菌、闪烁古生球菌、强烈炽热球菌、掘越氏热球菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌或其类 似物。或者，生物体为真核生物体，其包含(但不限于)植物(包含(但不限于)复杂 植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包含(但不限于)酵 母等)、动物(包含(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)或其类似物。
A.在非真核生物和真核生物中的表达
这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的非真核生物和真 核生物中的表达。
为获得所克隆的聚核苷酸的高水平表达，通常将编码所需多肽的聚核苷酸亚克隆到 含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子的表达载体中，且如果是对于编码蛋白质的 核酸来说，则通常亚克隆用于翻译起始的核糖体结合位点。适合细菌启动子描述(例如) 于Sambrook等人以及Ausubel等人中。
用于表达多肽的细菌表达系统可用于(包含，但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌以及沙门氏菌(Salmonella)中(Palva 等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。这些表达 系统的试剂盒可市面上购得。用于哺乳动物细胞、酵母以及昆虫细胞的真核表达系统可 市面上购得。在其中使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(在本文中其他地方描述) 表达多肽的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力来选择。例示性 宿主细胞包含革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)(包含(但不限于)短芽孢杆菌(B. brevis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyce))以及革兰氏阴性菌 (Gram-negative bacteria)(大肠杆菌或荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)， 以及酵母和其他真核细胞。包括O-tRNA/O-RS对的细胞可按照本文中所述来使用。
如本文中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包括大的适用量的非天 然氨基酸的多肽的能力。一方面，组合物视情况包含(但不限于)至少10微克、至少 50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、 至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包括非天然氨基酸 的多肽，或可通过活体内多肽产生方法得到的量(关于重组蛋白质产生和纯化的细节在 本文中提供)。另一方面，多肽视情况以于(包含，但不限于)细胞溶解产物、缓冲液、 医药缓冲液或其他液体悬浮液(包含(但不限于)约1nl至约100L之间的体积)中(包 含，但不限于)每升至少10微克多肽、每升至少50微克多肽、每升至少75微克多肽、 每升至少100微克多肽、每升至少200微克多肽、每升至少250微克多肽、每升至少500 微克多肽、每升至少1毫克多肽或每升至少10毫克多肽或每升10毫克以上的多肽的浓 度存在于组合物中。在包含至少一种非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包含(但不 限于)大于通过其他方法(包含(但不限于)活体外翻译)得到的通常可能的量)蛋白 质为本文中描述的方法、技术和组合物的特征。
如本文中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包括大的适用量的 非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，包括非天然氨基酸的多肽可以于细胞提取物、 细胞溶解产物、培养基、缓冲液及/或其类似物中(包含，但不限于)至少10微克/升、 至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克 /升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/ 升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、 至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、 600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的多肽的浓度 产生。
1.表达系统、培养以及分离
这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的表达系统、培养以 及分离中。非天然氨基酸多肽可以任何数目的适合表达系统(包含(但不限于)酵母、 昆虫细胞、哺乳动物细胞以及细菌)来表达。例示性表达系统的描述在本文中提供。
酵母如本文中所使用，术语“酵母”包含能够表达编码非天然氨基酸多肽的基因 的各种酵母中的任一者。这些酵母包含(但不限于)产子囊酵母(内孢霉目 (Endomycetales)、担子菌酵母以及属于半知菌亚门(Fungi imperfecti)(芽孢纲 (Blastomycetes))群的酵母。产子囊酵母分为两科，蚀精霉科(Spermophthoraceae)以 及酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括四个亚科，裂殖酵母亚科 (Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(genus Schizosaccharomyces))、拿逊酵 母亚科(Nadsonioideae)、脂酵母亚科(Lipomycoideae)以及酵母亚科(Saccharomycoideae) (例如，毕赤酵母属(genus Pichia)、克鲁维酵母属(genus Kluyveromyces)以及酵母 菌属(genus Saccharomyces))。担子菌酵母包含白冬孢酵母属(genus Leucosporidium)、 红冬孢酵母属(genus Rhodosporidium)、锁掷孢酵母属(genus Sporidiobolus)、担子菌 (genus Filobasidium)以及锁担菌(genus Filobasidiella)。属于半知菌亚门(芽孢纲) 群的酵母分为两科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(genus Sporobolomyces)以及布勒掷孢酵母属(genus Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae) (例如，假丝酵母属(genus Candida))。
在某些实施例中，在本文中描述的方法、技术和组合物中使用毕赤酵母属、克鲁维 酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Tondopsis) 以及假丝酵母属内的物种(包含(但不限于)巴氏毕赤酵母(P.pastoris)、P.guillerimondii、 酿酒酵母(S.cerevisiae)、啤酒酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道 格拉斯酵母(S.douglasii)、S.khiyveri、S.norbensis、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克 鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色假丝酵母(C.albicans)、麦 芽糖假丝酵母(C.maltosa)以及多形汉逊酵母(H.polymorpha))。
选择用于表达非天然氨基酸多肽的适合酵母是在所属领域的技术人员的技能范围 内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包含(但不限于)展示具有(例如)良 好分泌能力、低蛋白水解活性以及整体活性的那些宿主。酵母通常可获自多种来源，其 包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理和医学物理系的酵母遗传 储备中心，(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics， University of California(Berkeley，CA))以及美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包含可用作或已用作重组载体或其他转移 DNA的受体的酵母。所述术语包含已接受重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细 胞的后代。应了解，由于偶发或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或与原 始亲本互补的总DNA上完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码非天然氨 基酸多肽的核苷酸序列)表征的亲本的亲本细胞的后代包含于由此定义意谓的后代中。
已开发表达和转化载体(包含染色体外复制子或整合载体)用于转化至许多酵母宿 主中。举例来说，已开发表达载体用于酿酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19； Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA (1978)75：1929)；白色假丝酵母(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)；麦芽糖 假丝酵母(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；多形汉逊酵母(Gleeson 等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET. (1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸 克鲁维酵母(De Louvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人， BIO/TECHNOLOGY(1990)8：135)；P.guillerimondii(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL. (1985)25：141)；巴氏毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；以及第4,837,148 号；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，NATURE(1981)300：706)；以及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica) (Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET. (1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES. COMMUN.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221；以及Yelton等人， PROC NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.nigcr)(Kelly和Hynes， EMBO J.(1985)4：475-479)；T.reesia(EP 0 244 234)；以及丝状真菌，诸如，脉孢菌 (Neurospora)、青霉(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，每一者 是以引用的方式全部并入本文中。
酵母载体的控制序列包含(但不限于)来自诸如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)； 烯醇酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)； 己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；以及丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203) 的基因的启动子区域。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供适用的启动子序列 (Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。用于酵母宿主的其他 适合启动子序列可包含3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980) 255(4)：12073-12080)；和其他糖酵解酶，诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶，以及磷 酸葡萄糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17(23)：4900-4907；Hess等人， J.ADV.ENZYME REG.(1969)7：149-167)的启动子。具有由生长条件控制的转录的其他 优点的可诱导酵母启动子可包含醇脱氢酶2；异细胞色素C；酸性磷酸酶；金属硫蛋白； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与氮代谢相关的降解酶；以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启 动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP 0073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。 举例来说，可将酵母启动子的上游活化序列(UAS)与另一酵母启动子的转录活化区域 连接，产生合成杂合启动子。这些杂合启动子的实例包含与GAP转录活化区域连接的 ADH调节序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式全 部并入本文中。杂合启动子的其他实例包含由与糖酵解酶基因(诸如GAP或PyK)的 转录活化区域组合的ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列组成的启动子。 参见EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包含具有结合酵母RNA聚合酶且引发转录的能 力的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体的部分的其他控制元件包含(例如)来自GAPDH或烯醇酶基 因的终止子(Holland等人，J.BlOL.CHEM.(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒起点 的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适合选择基因为酵母质粒中存在的trpl基因。参 见Tschumper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trpl基 因提供用于缺乏于色氨酸中生长的能力的酵母的突变体菌株的选择标记。类似地，Leu2 缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是由具有Leu2基因的已知质粒互补。
将外源DNA引入酵母宿主中的方法包含(但不限于)转化原生质球或经碱金属阳 离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，酵母的转化可根据Hsiao等人，PROC.NATL. ACAD.SCI.USA(1979)76：3829以及Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946中描述 的方法来进行。然而，将DNA引入细胞中的其他方法(诸如通过核注射、电穿孔或原 生质体融合)也可根据SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中 通常所述来使用。酵母宿主细胞随后可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培 养。
于酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其他方法描述于美国专利公开案第 20020055169号、美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723 号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398 号；美国再审查专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862； WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 460 071；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；以及EP 0 164 556中。也参见Gellissen等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992) 62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
在使用标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可于发酵桶中生长。 由于特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的不同，可将发酵方法加以调节。仅举 例来说，酵母属酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料，复合氮来源(例如，酪蛋白 水解产物)，和补充多种维生素，而对于最佳生长和表达，甲基营养酵母巴氏毕赤酵母 可能需要甘油、甲醇以及微量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐。参见(例如)美国 专利第5,324,639号；Eniott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95；以及Fieschko等人， BIOTECH.BlOENG.(1987)29：1113，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
然而，这些发酵方法可具有不依赖于所使用的酵母宿主菌株的某些共同特征。举例 来说，限制生长营养素(通常为碳)可在扩增阶段期间添加到发酵桶中以容许最大生长。 另外，发酵方法通常使用经设计以含有足够量的碳、氮、基本盐、磷以及其他次要营养 素(维生素、微量矿物质以及盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实 例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其每一者是以引用的方式全部并 入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”指的是可用作或 已用作重组载体或其他转移DNA的受体的昆虫。所述术语包含已经转染的原始昆虫宿 主细胞的后代。应了解，由于偶发或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或 与原始亲本互补的总DNA上不必完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码 非天然氨基酸多肽的核苷酸序列)表征的亲本的亲本细胞的后代包含于由此定义意谓的 后代中。
所属领域的技术人员熟知用于表达多肽的适合昆虫细胞的选择。若干昆虫物种充分 描述于所属领域中且可市面上购得，其包含(但不限于)埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑 蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) 以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时，适合宿主可包含(但 不限于)展示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性以及整体活性的那些宿主。昆虫 通常可获自多种来源，其包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理 和医学物理系的昆虫遗传储备中心(the Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))，以及美国典型培 养物保藏中心(American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。
通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包含转移载体，通常为细菌质粒，其含 有杆状病毒基因组的片段与用于插入所欲表达的异源基因的便利限制位点；具有与转移 载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(此容许异源基因同源重组 进入杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。在构建载体、转染细 胞、挑选菌斑、于培养物中使细胞生长以及其类似过程中使用的材料、方法和技术在所 属领域中为已知的且可获得描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染入昆虫宿主细 胞中，载体与病毒基因组在其中重组。包装的重组病毒经表达且鉴别和纯化重组斑。用 于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自(例如)Invitrogen Corp. (Carlsbad，CA)。说明性技术描述于SUMMERS AND SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555号(1987)中，其是以引用的方式并入本 文中。也参见RICHARDSON，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY： BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE，THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；以及O′REILLY等人， BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白描述于以下参考文献中且这些 技术可适于制备本文中描述的非天然氨基酸多肽。参见(例如)美国专利第6,368,825 号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528，6,225,060号；第 6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第 5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第 5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第 5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032 WO 99/51721； WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400； WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/03628； WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556； WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体包含(但不限于)来源于杆状病毒苜蓿 银纹夜蛾(Autographacalifornica)核多角体病毒(AcNPV)的昆虫表达和转移载体，其 为不依赖于辅助病毒的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多 角体基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参见Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
在将外源基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包括启动子、前导区(必要时)、 所关注的编码序列以及转录终止序列的上述组分组装入中间转位构筑体(转移载体)中。 中间转位构筑体通常维持在复制子中，诸如能够在宿主(诸如细菌)中稳定维持的染色 体外元件(例如，质粒)。复制子应具有复制系统，因而使其维持在用于克隆和扩增的 适合宿主中。更明确地说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人，ANN. REV.MICROBIOL.(1988)42：177)和原核氨苄青霉素(ampicillin)抗性(amp)基因以 及用于在大肠杆菌中选择和繁殖的复制起点。
一种用于将外源基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。所属领域的技术人 员已知的许多其他载体也已经设计包含(例如)pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由 ATG改变为ATT，且其在ATT下游的32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参见Luckow 和Summers，VIROLOGY 170：31-39(1989)。其他市售载体包含(例如) PBlueBac4.5/V5-His；pBlueBacHis2；pMelBac；pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad， CA)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染入昆虫细胞宿主 中。将异源DNA引入杆状病毒中的所需位点中的说明性方法描述于SUMMERS和 SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555号 (1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156；Luckow和Summers，VIROLOGY (1989)170：31-39中。举例来说，可通过同源双重交叉重组插入诸如多角体蛋白基因的基 因中；也可插入经工程化操作进入所需杆状病毒基因中的限制酶位点中。参见Miller等 人，BlOESSAYS(1989)4：91。
转染可使用TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)； Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501中描述的方法通过电穿孔来实现。或者，可 使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。参见(例如)Liebman等人， BlOTECHNlQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050； Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATURE GENETICS (1998)18：45；TILKINS等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin 等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson 等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL CHEM.(1996) 271(37)：22376；Reversey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人， J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；以及Peng等人， BIOTECHNIQUES(1993)14.2：274。市售脂质体包含(例如)和 (Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。另外，可使用磷酸钙转染。参见TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)：5667；以及 Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为能够结合杆状病毒 RNA聚合酶且起始编码序列(例如，结构基因)的下游(3′)转录为mRNA的任何DNA 序列。启动子应具有通常位于编码序列的5′端附近的转录起始区。此转录起始区通常包 含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第 二域，其(若存在)通常远离结构基因。此外，表达可为调节性或组成性的。
在感染循环中的后期大量转录的结构基因提供尤其适用的启动子序列。实例包含来 源于编码病毒多角体蛋白的基因(FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839 以及0 155 476)以及编码p10蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VlROL.(1988)69：765) 的序列。
将新形成的杆状病毒表达载体包裹入感染性重组杆状病毒中且随后生长斑可由诸 如Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETINNO.1555(1987)中描述的那些技术来纯化。
已开发出用于感染入若干昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发 出尤其用于以下各昆虫中的重组杆状病毒：埃及伊蚊(ATCC号CCL-125)、桑蚕(ATCC 号CRL-8910)、果蝇(ATCC号1963)、草地夜蛾以及粉纹夜蛾。参见WO 89/046,699； Wright，NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VlROL.(1985)56：153；Smith等人， MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。通常参见Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL. (1989)25：225。更明确地说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包含(但不限于) Sf9(草地夜蛾)(ATCC号CRL-1711)、Sf21(草地夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号 11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)以及High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉 纹夜蛾)。
用于在杆状病毒/表达中直接表达与融合表达异源多肽的细胞和培养基可在市面上 购得。
细菌细菌表达技术在所属领域中为熟知的。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为 单拷贝或低或高多拷贝载体。载体可用于克隆及/或表达。由于关于载体的丰富的文献， 许多载体的商业可用性，以及甚至描述载体和其限制图谱以及特征的手册，在本文中不 需要广泛论述。众所周知，载体通常包括容许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂 抗性、原养性或免疫性。通常，存在多个标记，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如，结构基因)的下 游(3″)转录为mRNA的任何DNA序列。启动子应具有通常位于编码序列的5′端附近 的转录起始区。此转录起始区通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启 动子也可具有被称作操纵基因的第二域，其可在RNA合成开始的地方与相邻RNA聚合 酶结合位点重叠。操纵基因容许负调节(可诱导)转录，因为基因阻遏蛋白可结合操纵 基因且进而抑制特定基因的转录。在不存在负调节元件(诸如操纵基因)的情况下可发 生组成性表达。另外，正调节可通过基因活化蛋白结合序列(如果存在，那么其通常最 接近RNA聚合酶结合序列的(5′))获得。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白 (CAP)，其帮助起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET. (1984)18：173]。调节性表达因此可为正性或负性的，进而增强或减弱转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其适用的启动子序列。实例包含来源于诸如半乳糖、 乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]和麦芽糖的糖代谢酶的启动子序列。 其他实例包含来源于生物合成酶的启动子序列，诸如色氨酸(trp)(Goeddel等人，NUC. ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美国专利 第4,738,921号；IFNPub.第036 776号以及第121 775号)，其每一者是以引用的方式全 部并入本文中。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and other mistakes.″In Interferon 3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake 等人，NATURE(1981)292：128]以及T5[美国专利第4,689,406号]，其每一者是以引用 的方式全部并入本文中，启动子系统也提供适用的启动子序列。本文中涵盖的优选方法 利用强启动子(诸如T7启动子)以诱发多肽以高水平产生。这些载体的实例包含(但 不限于)来自Novagen的pET29系列，以及WO99/05297(其是以引用的方式全部并入 本文中)中描述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高水平的多肽而不危及宿主 细胞生活力或生长参数。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细 菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，产生 合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号]。举例来说，tac启动子为由trp启动子与受lac 阻遏物调节的lac操纵子序列两者构成的杂合trp-lac启动子[Amann等人，GENE(1983) 25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包 含具有结合细菌RNA聚合酶且起始转录的能力的非细菌来源的天然存在启动子。非细 菌来源的天然存在启动子也可与相容性RNA聚合酶偶合以产生原核生物中一些基因的 高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人， J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074]。另外， 杂合启动子也可包括噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(IFNPub.第267 851号)。
除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于外源基因在原核生物中的表 达。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包含起始密码 子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine 等人，NATURE(1975)254：34]。认为SD序列通过使SD序列与大肠杆菌16S rRNA的 3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，″Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA″，In Biological Regulation and Development：Gene Expression(R.F.Goldberger编，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原 核基因[Sambrook等人.″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”指的是可用作或已用作重组载体或其他转移 DNA的受体的细菌。所述术语包含已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于 偶然或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或与原始亲本互补的总DNA上 不必完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码所需多肽的核苷酸序列)表征 的亲本的母体细胞的后代包含于由此定义意谓的后代中。
所属领域的技术人员熟知用于表达所需多肽的适合宿主细菌的选择。在选择用于表 达的细菌宿主时，适合宿主可包含(但不限于)展示尤其具有以下特征中的至少一者且 优选具有以下特征中的至少两者的那些宿主：良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性、 良好分泌能力、良好可溶性蛋白产生能力以及整体活性。细菌宿主通常可获自多种来源， 其包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理和医学物理系的细菌遗 传储备中心(the Bacterial Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))；以及美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常 使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。因为 其生长参数极其熟知且为活性的，所以这些菌株尤其适用。另外，这些菌株为非病原性 的，出于安全和环境的原因，其为商业上重要的。在本文中描述且涵盖的方法的一实施 例中，大肠杆菌宿主包含(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本文中描 述且涵盖的方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为去蛋白酶菌株，其包含(但不限于) OMP-和LON-。在另一实施例中，细菌宿主为假单胞菌的物种，诸如荧光假单胞菌、铜 绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。假单胞菌表达菌株的实例为荧光假单胞菌生物型I，菌 株MB101(Dow Chemical)。
一旦已建立重组宿主细胞株(即，表达构筑体已引入宿主细胞中且将具有适当表达 构筑体的宿主细胞分离)，就在适于制备多肽的条件下培养重组宿主细胞株。重组宿主 细胞株的培养方法应取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞本身。重组宿主菌株 通常使用所属领域中熟知的方法来培养。重组宿主细胞通常在含有可吸收的碳、氮和无 机盐来源，且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域中熟知的其他蛋白质培 养补充剂的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有防止不需 要的微生物生长的抗生素或抗真菌剂及/或包含(但不限于)用于选择含有表达载体的宿 主细胞的抗生素的化合物。
重组宿主细胞可以分批或连续形式培养，其中以分批或连续形式收集细胞(在其中 所需多肽在细胞内积累的情况下)或收集培养物上清液。对于在原核宿主细胞中制备， 优选分批培养和细胞收集。
在一实施例中，本文中描述的非天然氨基酸多肽是在于重组系统中表达之后纯化。 多肽可由所属领域中已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化。通常，在细菌宿主细 胞中制备的多种多肽可溶性较差或不可溶(以包涵体的形式)。在一实施例中，为增大 重组制备的多肽的溶解性的目的，利用本文中揭露的方法以及所属领域中已知的那些方 法，可易于于经选择的多肽中进行氨基酸取代。在不溶性多肽的情况下，所述多肽可通 过离心或过滤从宿主细胞溶解产物中收集且可进一步接着进行细胞的均质化。在可溶性 差的多肽的情况下，可添加包含(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱发部分 可溶多肽的沉淀。沉淀的多肽随后可通过离心或过滤方便地收集。可使用所属领域的技 术人员熟知的多种方法将重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放包涵体。宿主细胞 破碎或均质化可使用熟知技术进行，所述技术包含(但不限于)酶促细胞破碎、超声波 降解、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破碎。在本文中描述且涵盖 的方法的一实施例中，使用高压释放技术破碎大肠杆菌宿主细胞以释放多肽的包涵体。 已发现通过仅利用大肠杆菌宿主细胞通过均质器的一个通道可增加呈包涵体形式的不 溶性多肽的产率。当处理多肽的包涵体时，由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因 素，最小化重复均质化时间以便最大化包涵体的产率而无损失为有利的。
随后可使用所属领域中已知的众多适合溶解剂中的任一者使不溶性或沉淀的多肽 溶解。举例来说，用尿素或盐酸胍溶解多肽。溶解多肽的体积应最小化以便可使用可方 便处理的批量大小来大批量制备。在其中重组宿主可以体积为上千升的批量生长的大规 模商业装置中此因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，尤其对于 人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损坏机器和容器，或多肽产物本身的苛性 化学品。在本文中描述且涵盖的方法中已展示可用较温和变性剂尿素代替较苛性变性剂 盐酸胍溶解多肽包涵体。尿素的使用显著降低对在多肽的制造和纯化过程中所用的不锈 钢设备损坏的风险，同时有效溶解多肽包涵体。
在可溶性多肽的情况下，肽可分泌入周质空间或培养基中。另外，可溶性肽可存在 于宿主细胞的细胞质中。可溶性肽可在进行纯化步骤之前加以浓缩。可使用标准技术(包 含(但不限于)本文中描述的那些技术)从(例如)细胞溶解产物或培养基中浓缩可溶 性肽。另外，可使用标准技术(包含(但不限于)本文中描述的那些技术)破碎宿主细 胞且从宿主细胞的细胞质或周质空间中释放可溶性肽。
当将多肽制备为融合蛋白时，优选移除融合序列。融合序列的移除可由包含(但不 限于)酶促裂解或化学裂解的方法来实现，其中优选酶促裂解。可使用所属领域的技术 人员熟知的方法来实现融合序列的酶促移除。用于移除融合序列的酶的选择由融合的特 性确定，且反应条件由酶的选择指定。可使用包含(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶以 及其他试剂的试剂来实现化学裂解。裂解的多肽视情况通过熟知方法从裂解的融合序列 中纯化。这些方法将由融合序列和多肽的特性和性质来确定。纯化方法可包含(但不限 于)尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
多肽也视情况经纯化以从蛋白质溶液中移除DNA。DNA可由所属领域中已知的任 何适合方法来移除，其包含(但不限于)沉淀或离子交换色谱。在一实施例中，通过以 核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来移除DNA。可使用标准熟知方法 (包含(但不限于)离心或过滤)将多肽与沉淀的DNA分离。在使用多肽以治疗人类 的环境下，宿主核酸分子的移除为一个重要因素，且本文中描述的方法将宿主细胞DNA 降低至医药学上可接受程度。
小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，其包含(但不限于)发酵桶、 震荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养系统以及搅拌槽生物反 应器系统。这些方法中的每一者可以分批式、流加式或连续模式方法进行。
本文中描述的非天然氨基酸多肽的人类形式通常可使用所属领域中的方法标准回 收。举例来说，培养基或细胞溶解产物可经离心或过滤以移除细胞残骸。上清液可经浓 缩或稀释至所需体积或渗滤入适合缓冲液中以调节制剂用于进一步纯化。本文中描述的 非天然氨基酸多肽的进一步纯化包含(但不限于)使多肽变体的脱酰胺和截短形式与相 应完整形式分离。
以下例示性程序中的任一者可用于纯化本文中描述的非天然氨基酸多肽：亲和色 谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅石色 谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包含，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水相互作 用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦； 置换色谱；电泳程序(包含(但不限于)制备型等电聚焦)、差示溶解性(包含(但不 限于)硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、提取或其任何组合。
根据所属领域的技术人员已知且使用的标准程序，本文中描述的方法和组合物中涵 盖的多肽(包含(但不限于)包括非天然氨基酸的多肽、包括非天然氨基酸的多肽的抗 体、包括非天然氨基酸的多肽的结合搭配物)可部分纯化或实质上纯化为同质。因此， 本文中描述的多肽可由所属领域中熟知的众多方法中的任一者来回收和纯化，这些方法 包含(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱提取、管柱色谱、亲和管柱色谱、阴离子 或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、 凝胶电泳以及其任何组合。在制备恰当折叠的成熟蛋白时，必要时可使用蛋白再折叠步 骤。在需要高纯度的最终纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其他适 合方法。在一实施例中，将针对非天然氨基酸(或包括非天然氨基酸的多肽)制备的抗 体用作(包含，但不限于)包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的基于亲和性的纯 化的纯化试剂。按需要部分纯化或纯化至同质后，多肽即可视情况用于多种效用，其包 含(但不限于)作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂及/或作为用于抗体 制备的免疫原。
除本文中注明的其他参考文献之外，所属领域中熟知多种纯化/蛋白质折叠方法，其 包含(但不限于)以下文献中提出的那些方法：R.Scopes，Protein Purification， Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymologv第182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press，Inc.；Bollag等人.(1996)Protein Methods.第2版Wiley-Liss， NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ；Harris和Angal (1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford， England；Harris和Angal Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版 Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles.High Resolution Methods and Applications.第2版Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；以及其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中制备包括至少一个非天然氨基酸的多肽的一 个优点在于通常多肽会以其天然构象折叠。然而，在本文中描述的方法和组合物的某些 实施例中，在合成、表达及/或纯化之后，多肽可具有不同于相关多肽的所需构象的构象。 在本文中描述的方法和组合物的一方面中，视情况使所表达的蛋白质变性且随后复性。 此可选变性和复性是利用所属领域中已知的方法实现，其中这些方法包含(但不限于) 将伴侣蛋白(chaperonin)添加到所关注的多肽中，以及将多肽溶解于离液剂(包含(但 不限于)盐酸胍)中，且利用蛋白二硫化物异构酶。
一般来说，有时候需要变性和还原所表达的多肽且随后使这些多肽再折叠为优选构 象。举例来说，所述再折叠可通过将胍、尿素、DTT、DTE及/或伴侣蛋白添加到所关注 的翻译产物中来实现。所属领域的技术人员熟知还原、变性以及复性蛋白质的方法(参 见，以上参考文献，以及Debinski等人.(1993)J.Biol.Chem..268：14065-14070；Kreitman 和Pastan(1993)Bioconjug.Chem..4：581-585；和Buchner，等人，(1992)Anal.Biochem.. 205：263-270)。Debinski等人(例如)描述胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。蛋白质 可在含有(包含，但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。 再折叠试剂可流动或否则移动以与一种或一种以上的多肽或其他表达产物接触，或反之 亦然。
在原核制备非天然氨基酸多肽的情况下，如此制备的多肽可能会错误折叠且因此缺 乏生物活性或具有降低的生物活性。蛋白质的生物活性可通过“再折叠”恢复。在一实 施例中，通过使用(例如)一种或一种以上的离液剂(包含(但不限于)尿素及/或胍) 以及能够还原二硫键的还原剂(包含(但不限于)二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇、2-ME) 溶解(其中多肽也为不溶性的)、解折叠且还原多肽链而使错误折叠的多肽再折叠。在 中等浓度的离液剂下，随后添加氧化剂(包含(但不限于)氧、胱氨酸或胱胺)，其容 许再形成二硫键。解折叠或错误折叠的多肽可使用所属领域中已知的标准方法再折叠， 诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号以及第4,512,922号中描述的那些方法， 这些文献的每一者是以引用的方式全部并入本文中。多肽也可与其他蛋白质一起共折叠 以形成异二聚体或异多聚体。在再折叠或共折叠之后，视情况将多肽进一步纯化。
非天然氨基酸多肽的纯化也可使用多种技术来实现，其包含(但不限于)本文中描 述的那些技术，例如疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相 色谱、亲和色谱以及其类似技术或其任何组合。其他纯化也可包含干燥或沉淀经纯化的 蛋白质的步骤。
在纯化之后，可将非天然氨基酸多肽交换入不同缓冲液中及/或由所属领域中已知的 多种方法(包含(但不限于)渗滤和透析)中的任一者浓缩。可使以单一纯化蛋白质形 式提供的hGH经历聚集和沉淀。在某些实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至 少90％纯(如由反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)所测量)。在某些其他实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至少 95％纯，或至少98％纯，或至少99％或更高纯度。不管非天然氨基酸多肽的纯度的确切 数值，非天然氨基酸多肽均足够纯以用作医药产物或用于进一步加工，其包含(但不限 于)与水溶性聚合物(诸如PEG)接合。
在某些实施例中，非天然氨基酸多肽分子在不存在其他活性成分或蛋白质(除了赋 形剂、载剂，以及稳定剂、血清白蛋白以及其类似物)的情况下可用作治疗剂，且在某 些实施例中，非天然氨基酸多肽分子可与另一种多肽或聚合物复合。
2.非天然氨基酸多肽的纯化
一般纯化方法这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的一 般纯化。
可对细胞溶解产物提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细 胞质或包括所需多肽的其他物质或由包含(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水 相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、 膨胀床吸附或其任何组合及/或重复的任何分离步骤且以任何适当次序产生的任何多肽 混合物进行多种分离步骤中的任一者。
用于执行本文中描述的技术的设备和其他必要材料可在市面上购得。泵、馏分收集 器、监控器、记录器以及整个系统是获自(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、 Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)以及Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway， NJ)。包含(但不限于)交换基质材料、介质以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。
使用诸如泵的专业设备可更迅速地实现本文中描述的管柱色谱方法中的平衡和其 他步骤，诸如洗涤和洗提。市售泵包含(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵 P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
馏分收集器的实例包含RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器 以及馏分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可用混合器 以形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包含梯度混合器GM-1和串联式混合器 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、荧光、pH 值以及传导率的信息。探测器的实例包含监控器UV-1、S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。实际上，包含来自Amersham Biosciences的各种 系统(Piscataway，NJ)的整个系统可在市面上购得。
在本文中描述的方法和组合物的一实施例中，例如，多肽可通过首先在尿素中使所 得经纯化的多肽变性，接着稀释于处于适合pH值的含有还原剂(诸如DTT)的TRIS 缓冲液中来还原和变性。在另一实施例中，多肽是在介于约2M至约9M之间的浓度范 围内的尿素中变性，接着稀释于在约5.0至约8.0的范围内的pH值下的TRIS缓冲液中。 随后可培养这个实施例的再折叠混合物。在一实施例中，再折叠混合物在室温下培养4 至24小时。还原和变性的多肽混合物随后可经进一步分离或纯化。
如本文中所陈述，可首先调节第一多肽混合物的pH值，随后执行任何后续分离步 骤。另外，可使用所属领域中已知的技术将第一多肽混合物或其任何后续混合物浓缩。 此外，包括第一多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液可使用所属领域的技术人 员熟知的技术交换为适于下个分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的离 子色谱。
在一实施例中，且作为可选的其他步骤，可对第一多肽混合物进行离子交换色谱。 通常参见ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS(目录 号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换管柱包含 以及管柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。这 些管柱利用强阴离子交换剂，诸如QFast Flow、QHigh Performance，以及QXL；强阳离子交换剂，诸如SPHigh Performance、SPFast Flow，以及SPXL；弱阴离子交换 剂，诸如DEAEFast Flow；以及弱阳离子交换剂，诸如CM Fast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可对处于纯化过程的任何阶段的 多肽进行阴离子或阳离子交换管柱色谱以分离实质上经纯化的多肽。可使用任何适合阳 离子交换基质进行阳离子交换色谱步骤。阳离子交换基质包含(但不限于)纤维状、多 孔、无孔、微粒状、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包含(但 不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、硅石、聚醚或任 何前述物质的复合物。在多肽吸附于阳离子交换剂基质上之后，实质上经纯化的多肽可 通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以将多肽从基质中置换出来而 得以洗提。用于实质上经纯化的多肽的高pH值洗提中的适合缓冲液包含(但不限于) 柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES，以及浓度在至少约5mM至至少约100mM 的范围内的MES缓冲液。
反相色谱这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的反相色 谱。
可根据所属领域的技术人员已知的适合方案来进行RP-HPLC以纯化蛋白质。参见 (例如)Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J. CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可对多肽 进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的多肽。在这方面，可使用具有多种长度(包含(但 不限于)至少约C3至至少约C30、至少约C3至至少约C20，或至少约C3至至少约C18) 树脂的具有烷基官能基的硅石衍生的树脂。或者，可使用聚合树脂。举例来说，可使用 TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷 基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可以诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC管柱。含有离 子对试剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的适合洗提缓冲 液可用于将多肽从RP-HPLC管柱中洗提出。最常用离子对试剂包含(但不限于)乙酸、 甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙 基铵。可使用一种或一种以上的梯度或等度条件进行洗提，其中梯度条件优选减少分离 时间且降低峰宽。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。在本文中使 用的适合洗提缓冲液的实例可包含(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨 基酸多肽的疏水相互作用色谱纯化。
可对多肽执行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参见HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1020-90， Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其是以引用的方式并入本文中。适合HIC基质 可包含(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的 基质，所述基质包含琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、硅石、葡聚糖、聚苯 乙烯、聚甲基丙烯酸酯基质，以及混合形式的树脂，其包含(但不限于)聚乙烯胺树脂 或经丁基或苯基取代的聚甲基丙烯酸酯基质。疏水相互作用管柱色谱的市售来源包含 (但不限于)以及管柱(Amersham Biosciences， Piscataway，NJ)。简言之，在装载之前，HIC管柱可使用所属领域的一般技术人员已知 的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡。硫酸铵可用作 用于装载HIC管柱的缓冲液。在装载多肽之后，随后可使用标准缓冲液和条件洗涤管柱 以移除不需要的物质，但将多肽保留在HIC管柱上。可用约3至约10管柱体积的标准 缓冲液(其中，诸如含有EDTA以及比平衡缓冲液低的硫酸铵浓度的HEPES缓冲液， 或乙酸/氯化钠缓冲液)洗提多肽。使用(例如)磷酸钾梯度的逐渐降低的线性盐梯度也 可用于洗提多肽分子。随后可(例如)通过过滤(诸如渗滤或超滤)来浓缩洗提液。可 利用渗滤以移除用于洗提多肽的盐。
其他纯化技术这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的其 他纯化技术。
可对第一多肽混合物或其任何后续混合物进行使用(例如)凝胶过滤(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences， Piscataway，NJ)，其是以引用的方式全部并入本文中)、羟基磷灰石色谱(适合基质包含 (但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、 Bio-Gel HTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、渗滤、冻干法以及其 类似方法的另一分离步骤以移除任何过量盐且以适于下个分离步骤或甚至调配最终药 物产品的缓冲液来替换缓冲液。可使用各种技术(其包含(但不限于)本文中描述的那 些技术)来监控本文中描述的每一步骤下的包含实质上经纯化的多肽的多肽的产率。这 些技术也可用于评估最后分离步骤之后的实质上经纯化的多肽的产率。举例来说，可使 用若干具有多种烷基链长度的反相高压液相色谱管柱的任一者(诸如氰基RP-HPLC、 C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC来监控多肽的产率。
可使用标准技术(诸如SDS-PAGE)或通过使用西方墨点法(Western blot)以及ELISA 检定测量多肽来测定纯度。举例来说，多克隆抗体可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子 交换回收分离的蛋白质产生。这些抗体也可用于探测污染宿主细胞蛋白质的存在。
在某些实施例中，在每一纯化步骤后的多肽产率可为每一纯化步骤的起始物质中多 肽的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、 至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至 少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。多肽 与蛋白质杂质的分离是根据疏水相互作用的强度的差别。以于稀三氟乙酸中的乙腈梯度 进行洗提。使用不锈钢管柱(填充有2.8升至3.2升的Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。 通过添加三氟乙酸将羟基磷灰石Ultrogel洗出液酸化且装载于Vydac C4管柱上。对于洗 涤和洗提，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。将馏分收集且立即以磷酸盐缓冲液中和。 汇集在IPC限度内的多肽馏分。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由共价结合到琼脂糖凝胶珠粒的表面上的二乙基 氨基乙基(DEAE)基团组成。多肽与DEAE基团的结合由离子相互作用介导。乙腈和 三氟乙酸无滞留地通过管柱。在这些物质经洗出之后，通过以低pH值的乙酸盐缓冲液 洗涤管柱来移除痕量杂质。随后以中性磷酸盐缓冲液洗涤管柱且以具有增加的离子强度 的缓冲液洗提多肽。以DEAE Sepharose fast flow装填管柱。调节管柱体积以确保多肽装 载在每毫升凝胶3-10mg多肽的范围内。以水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤管柱。 装载HPLC洗出液的汇集馏分且以平衡缓冲液洗涤管柱。随后以洗涤缓冲液(乙酸钠缓 冲液)洗涤管柱，接着以平衡缓冲液洗涤。随后，以洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸 钾)将多肽从管柱中洗提出且根据主要洗提概况以单一馏分收集。将DEAE Sepharose 管柱的洗出液调节至指定传导率。将所得药物物质无菌过滤入Teflon瓶中且在-70℃下 储存。
可使用多种方法和程序评估包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的产率和纯 度，其包含(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、考马斯亮蓝染 色SDS-PAGE(coomassie stained SDS-PAGE)、质谱(包含(但不限于)MALDI-TOF) 以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其他方法。
其他方法包含(但不限于)移除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞 (诸如，大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。降低内毒素含量的方法包含(但不限于) 使用硅石载体、玻璃粉末或羟基磷灰石的纯化技术，反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色 谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱，这些方法的组合，以及其类似方法。可能需 要修饰或其他方法以从所关注的多肽中移除诸如共迁移蛋白的污染物。所属领域的一般 技术人员已知测量内毒素含量的方法且其包含(但不限于)鲎变形细胞溶解产物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)检定。
其他方法和程序包含(但不限于)与蛋白质染色方法耦合的SDS-PAGE、免疫转渍 法、基质辅助激光解吸/电离-质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型 阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
在某些实施例中，包含处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII 的范畴内的任何子式或特定化合物的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX- XXXXIII的氨基酸可通过生物合成并入多肽中，进而产生非天然氨基酸多肽。在其他实 施例中，这些氨基酸是在多肽内的特定位点处并入。在其他实施例中，这些氨基酸是使 用翻译系统并入多肽中。在其他实施例中，这些翻译系统包括：(i)编码多肽的聚核苷 酸，其中聚核苷酸包括对应于并入上述氨基酸的预定位点的选择密码子，以及(ii)包 括氨基酸的tRNA，其中tRNA对选择密码子具有特异性。在这些翻译系统的其他实施 例中，聚核苷酸为在翻译系统中产生的mRNA。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译 系统包括质粒或包括聚核苷酸的噬菌体。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统包 括包含聚核苷酸的基因组DNA。在这些翻译系统的其他实施例中，聚核苷酸稳定整合入 基因组DNA中。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统包括对选择密码子具有特 异性的tRNA，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、 独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。 在这些翻译系统的其他实施例中，tRNA为抑制tRNA。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括将被氨酰基化到上述氨基酸上的tRNA。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括对tRNA具有特异性的氨酰基合成酶。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。在这些翻译系统的其他实施例中， 多肽是由核糖体来合成，且在其他实施例中，翻译系统为包括选自由细菌细胞、古细菌 细胞以及真核细胞组成的群组的细胞的活体内翻译系统。在其他实施例中，细胞为大肠 杆菌细胞、酵母细胞、来自假单胞菌的物种的细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细 胞。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统为包括来自细菌细胞、古细菌细胞或真 核细胞的细胞提取物的活体外翻译系统。在其他实施例中，细胞提取物是来自大肠杆菌 细胞、来自假单胞菌的物种的细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。 在其他实施例中，至少一部分多肽是通过固相或溶液相肽合成方法或其组合来合成，而 在其他实施例中，进一步包括将多肽连接到另一多肽上。在其他实施例中，包含处于式 I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合 物的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的氨基酸可通过生物合 成并入多肽中，其中多肽为与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源的蛋白质： α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房 利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、 gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、 细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋 白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、 HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集 落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细 胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细 胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞 生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、 葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细 胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1 受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰 素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递 蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、 成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效 素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛 素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞 介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗 原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、 超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿 瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子 受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、 mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾 丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
B.活体内翻译后修饰
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注的多肽，这些多肽可能 包含真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个非天然氨基酸以及至少一 种由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例 来说，翻译后修饰包含(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加 成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化，以及其类似机制。一方面，翻译后修饰包含通过 GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖(包含(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) 连接到天冬酰胺上。参见表1，其列出真核蛋白质的N-键联寡糖的一些实例(也可存在 其他残基，其未展示)。另一方面，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨 酸键联，或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含(但不限于)Gal-GalNAc、 Gal-GlcNAc等)连接到丝氨酸或苏氨酸上。
表1：通过GlcNAc键联连接的寡糖的实例
在另一方面中，翻译后修饰包含前驱物(包含(但不限于)降血钙素前驱物、降血 钙素基因相关肽前驱物、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原、 前阿黑皮素以及其类似物)的蛋白水解加工、组装为多亚单位蛋白质或大分子组合体， 翻译至细胞中的另一位点(包含(但不限于)细胞器，诸如内质网、高尔基体(golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。 在某些实施例中，蛋白质包括分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨 酸标签、GST融合或其类似物。
非天然氨基酸的一个优点在于其存在可用于添加其他分子的其他化学部分。这些修 饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译 后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。 目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数翻译涉及在亲核与亲电子反应搭配物之间形成 共价键，其包含(但不限于)α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下的 选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定的。在本文中描述或使用本文中描 述的方法制备的多肽中，可使用其他更具有选择性的反应，其包含(但不限于)在活体 外和活体内非天然酮基氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。参见(例如)Cornish 等人，(1996)Am.Chem.Soc.118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128； Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc. 124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99：11020-11024；Wang等人， (2003)Proc.Natl.Acad.Set 100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry.42：6735-6746； 以及Chin等人，(2003)Science 300：964-967。此容许以许多试剂(其包含荧光团、交联 剂、糖衍生物以及细胞毒性分子)选择性标记几乎任何蛋白质。也参见2003年1月16 日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利申请案第10/686,944号，其是以引 用的方式并入本文中。翻译后修饰(包含(但不限于)通过叠氮基氨基酸)也可通过施 陶丁格连接(Staudinger ligation)(包含(但不限于)以三芳基膦试剂)进行。参见(例 如)Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation，PNAS 99(1)：19-24。
IX.用于制备非天然氨基酸多肽的替代性系统
已使用若干策略以在非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基 酸引入蛋白质中。这部分中揭露的替代性系统可应用于制备本文中描述的非天然氨基酸 多肽。举例来说，使具有反应性侧链的氨基酸(诸如Lys、Cys和Tyr)衍生化使得赖氨 酸转变为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的简单方法。随着肽片 段的酶促连接和天然化学连接的最近发展，有可能制造较大的蛋白质。参见(例如)P.E. Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。化学肽连接和天然化学连 接描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开 案第2003/0208046号、WO 02/098902以及WO 03/042235中，其是以引用的方式全部 并入本文中。其中将经所需非天然氨基酸化学酰化的抑制tRNA添加到能够支持蛋白质 生物合成的活体外提取物中的一般活体外生物合成方法已用于将超过100种非天然氨基 酸位点特异性地并入几乎任何大小的多种蛋白质中。参见(例如)V.W.Cornish，D. Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：621-633(1995)；C.J.Noren， S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244 182-188(1989)；以及J.D. Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)。已将多种官能基引入蛋白质中以研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶 机制以及信号转导。
开发了被称作选择性压力并入的活体内方法以开发野生型合成酶的杂交。参见(例 如)N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber， FASEB J..13：41-51(1999)。使其中向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢途径被切断的 营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，同时目标基因的转 录受到抑制。在固定生长阶段开始时，将天然氨基酸耗尽且以非天然氨基酸类似物代替。 诱导重组蛋白表达使得含有非天然类似物的蛋白质累积。举例来说，使用这种策略，已 将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸以及对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且在UV光谱中展示 可易于鉴别的两个特征肩峰。参见(例如)C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa， Anal.Biochem.，284：29-34(2000)；已使用三氟甲硫氨酸取代噬菌体T4溶菌酶中的甲硫 氨酸以通过19F NMR来研究其与壳寡糖配位体的相互作用，参见(例如)H.Duewel，E. Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404-3416(1997)；且并入三氟亮氨酸 代替亮氨酸，其使得亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。参见(例如)Y.Tang， G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int. Ed.Engl..40(8)：1494-1496(2001)。此外，将硒甲硫氨酸和碲甲硫氨酸并入各种重组蛋白 中以利于解析X射线结晶学中的相。参见(例如)W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M. Lemaster，EMBO J.，9(5)：1665-1672(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D. Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol，1：283-284(1994)；N.Budisa， B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.， 230：788-796(1995)；以及N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T. Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.270：616-623(1997)。具有烯或炔官能基 的甲硫氨酸类似物也已有效地并入，其容许通过化学手段进行蛋白质的其他修饰。参见 (例如)J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBS Lett..428：68-70(1998)；J.C.M.van Hest， K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.122：1282-1288(2000)；以及K.L.Kiick和 D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487-9493(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开 案2002/0042097，其是以引用的方式全部并入本文中。
这个方法的成功取决于由氨酰基-tRNA合成酶来识别非天然氨基酸类似物，其通常 需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真性。扩大此方法的范畴的一条途径在于放松氨酰 基-tRNA合成酶的底物特异性，其已在有限数目的情况下实现。仅举例来说，在大肠杆 菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly代替Ala294增大底物结合袋的大小，且 使得tRNAPhe由对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化。参见，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke， Biochemistry.33：7107-7112(1994)。含有此突变体PheRS的大肠杆菌菌株容许并入对氯 苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸代替苯丙氨酸。参见(例如)M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.. 364：272-275(1995)；以及N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.. 467：37-40(2000)。类似地，接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点处的 点突变Phe130Ser展示容许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参见，F.Hamano-Takaku， T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，L Biol.Chem..275(51)：40324-40328(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一策略为修饰具有校对机制的合成酶。 这些合成酶不能区分且因此活化结构上类似于同源天然氨基酸的氨基酸。此错误在个别 位点得到纠正，其将错配氨基酸从tRNA上去酰化以保持蛋白质翻译的保真性。如果合 成酶的校对活性丧失，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。最近已以 缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实此方法。参见，V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle， T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science.292：501-504 (2001)。ValRS可用Cys、Thr或氨基丁酸盐(Abu)错氨酰基化tRNAVal；随后通过编 辑域水解这些非同源氨基酸。在随机诱变大肠杆菌染色体之后，选择在ValRS的编辑位 点中具有突变的突变体大肠杆菌菌株。此编辑缺陷型ValRS错误以Cys装载tRNAVal。 因为Abu在空间上类似Cys(在Abu中Cys的-SH基团经-CH3置换)，所以当此突变体 大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变体ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析 展示在天然蛋白质的每一缬氨酸位置处约24％的缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也容许合成许多含有新颖氨基酸的蛋白质。举例来说，参见 以下公开案和其中引用的参考文献，所述公开案如下：Crick，F.J.C.，Barrett，L.Brenner，S. Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，192(4809)： 1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J，Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes，Acc Chem Res.22(2)：47-54 (1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，109，3808-3810(1987)；Schnolzer，M.， Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides： backbone-engineered HIV protease，Science，256，221-225(1992)；Chaiken，I.M. Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochemu 255-301(1981)；Offord，R.E. Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；以及Jackson， D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266，243-247 (1994)。
化学修饰已用于在活体外将多种包含辅因子、自旋标记以及寡核苷酸的非天然侧链 引入蛋白质中。参见(例如)Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238，1401-1403(1987)； Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymatic specificity， Ann.Rev Biochem，54，565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Science，226，505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E. Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.，M.L.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc， 88(13)：3153-3154(1966)；以及Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，1(242)： 1038-1040(1988)。
或者，使用经化学修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法已用于将若干生物物理探针 并入在活体外合成的蛋白质中。参见以下公开案和其中引用的参考文献：Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，483-514(1993)；以及Krieg， U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl. Acad.Sci.83，8604-8608(1986)。
以前，已证明可在活体外通过向经以含有所需琥珀无义突变的基因程式化的蛋白质 合成反应中添加经化学氨酰基化的抑制tRNA来将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白 质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸来说为营养缺乏型的菌株以紧密结构同源物 取代众多常见20种氨基酸，例如，以氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见(例如)Noren，C.J.， Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science.244：182-188(1989)；M.W. Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin， A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incoiporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc.111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51 (1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural ammo acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.， 202，301-336(1992)；以及Mendel，D.，Cornish，V.W.和Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Strnct.24，435-62 (1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG且经非天然氨基酸化学氨酰基化的抑制tRNA。 使用常规定点突变形成在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。参见(例 如)Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucleic Acids Res.16(3)：791-802(1988)。当将酰化抑 制tRNA与突变体基因在活体外转录/翻译系统中组合时，非天然氨基酸回应UAG密码 子并入得到在指定位置处含有那种氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用α-羟 基酸的实验证实仅所需氨基酸在由UAG密码子指定的位置处并入且此氨基酸并未在蛋 白质中的任何其他位点处并入。参见(例如)Noren等人，同上；Kobayashi等人，(2003) Nature Structural Biology 10(6)：425-432；以及Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255，197-200 (1992)。
微注射技术也已用于将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见(例如)M.W.Nowak，P.C. Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J. Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science， 268：439-442(1995)；以及D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol，4：645(2000)。向爪蟾 卵母细胞中共同注射在活体外制造的两种RNA物质：在所关注的氨基酸位置处具有 UAG终止密码子的编码目标蛋白质的mRNA和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑 制tRNA。随后卵母细胞的翻译机制在由UAG指定的位置处插入非天然氨基酸。此方法 容许完整膜蛋白的活体内结构-功能研究，所述膜蛋白通常不受活体外表达系统作用。实 例包含(但不限于)将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转 移来测量距离，参见(例如)G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot， M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，I Biol.Chem.，271(33)：19991-19998(1996)； 并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中的表面暴露残基，参见(例如)J.P.Gallivan，H.A. Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4(10)：739-749(1997)；使用笼蔽酪氨酸类似物以实 时监控离子通道中的构象变化，参见(例如)J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England， D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619-624(1998)；以及，使用改变离子通道骨 架的α羟基氨基酸以探测其门控机制。参见(例如)P.M.England，Y.Zhang，D.A. Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89-98(1999)；以及T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y. Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4(3)：239-246(2001)。
在活体内将非天然氨基酸直接并入蛋白质中的能力提供突变体蛋白质的高产率、技 术简易、在细胞中或可能在活生物体中研究突变体蛋白质的可能性以及在治疗性治疗中 使用这些突变体蛋白质的优点。将具有各种大小、酸性、亲核性、疏水性以及其他性质 的非天然氨基酸包含入蛋白质中的能力可极大地扩展我们合理且系统性地操纵蛋白质 的结构的能力，以探测蛋白质功能且产生新的蛋白质或具有新颖性质的生物体。
在试图位点特异性地并入对氟苯丙氨酸的过程中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/ 苯基丙氨酰基-tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。参 见(例如)R.Furter，Protein Sci.，7：419-426(1998)。
也有可能使用无细胞(活体外)翻译系统来获得所需聚核苷酸的表达。在这些系统 中，其可包含作为模板的mRNA(活体外翻译)或作为模板的DNA(组合活体外转录 和翻译)，活体外合成由核糖体指导。已应用相当大的努力来开发无细胞蛋白质表达系 统。参见(例如)Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bio engineering， 74(4)：309-316(2001)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542， (2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.-M. 和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66(3)：180-188，(1999)；以及Patnaik，R. 和J.R.Swartz，Biotechniques 24(5)：862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利 公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式全部并入 本文中。可应用于包括非天然氨基酸的多肽的表达的另一种方法包含(但不限于)mRNA- 肽融合技术。参见(例如)R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94 12297-12302(1997)；A.FranKel等人，Chemistry & Biology 10，1043-1050(2003)。在这种 方法中，连接到嘌呤霉素上的mRNA模板在核糖体上翻译为肽。如果修饰一种或一种以 上的tRNA分子，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在读取最后的mRNA密码子之后， 嘌呤霉素捕获肽的C-末端。如果在活体外检定中发现所得mRNA-肽接合物具有有趣的 性质，那么其身份可易于根据mRNA序列揭露。以此方式，可筛检包括一个或一个以上 非天然氨基酸的多肽的库以鉴别具有所需性质的多肽。近来，已报导具有纯化组分的活 体外核糖体翻译容许合成经非天然氨基酸取代的肽。参见(例如)A.Forster等人，Proc. Natl Acad.Sci.(USA)100(11)：6353-6357(2003)。
X.多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰
为方便起见，这部分(XA至XJ)中描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰 一般性及/或以特定实例来描述。然而，这部分中描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译 后修饰不应仅限于这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的多肽的非 天然氨基酸组分的翻译后修饰同样充分适用于处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B) 以及XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物，其包含处于本文中的说明书、权利要求 以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内 的任何子式或特定化合物。
已开发出方法、组合物、技术和策略以在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性地并 入非天然氨基酸。通过并入具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的侧链化学的非天然 氨基酸，此技术使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能。因此，本文中描述的方 法、组合物、技术和策略的主要优点在于衍生化的蛋白质如今可制备为确定同源产物。 然而，本文中描述的方法、组合物、反应混合物、技术和策略不限于由活体内蛋白质翻 译技术形成的非天然氨基酸多肽，而是包含由任何技术形成的非天然氨基酸多肽，所述 技术包含(仅举例来说)表达蛋白质连接、化学合成、基于核糖酶的技术(参见(例如) 本文中标题为“替代性系统中的表达”的部分)。
将非天然氨基酸并入重组蛋白质中的能力广泛扩展可实现用于翻译后衍生化的化 学，其中此衍生化发生在活体内或活体外。更明确地说，在多肽的非天然氨基酸部分上 形成肟键的蛋白质衍生化提供若干优点。第一，天然存在氨基酸通常不形成肟键且因此 经设计以形成肟键的试剂会与多肽的非天然氨基酸组分位点特异性反应(当然假设非天 然氨基酸与相应试剂已经设计以形成肟键)，因此与使用现有技术工艺产生的衍生蛋白 质的混合物相反，位点选择性衍生化蛋白质的能力提供单一均质产物。第二，肟加合物 在生物条件下为稳定的，其暗示由肟交换衍生的蛋白质为治疗应用的有效候选者。第三， 所得肟键的稳定性可根据肟键已形成于其上的非天然氨基酸的性质(即，官能基及/或结 构)来操纵。因此，如实例16中所示，非天然氨基酸的肟键的pH值稳定性可从少于1 小时变化至远远多于1周。因此，在一些实施例中，非天然氨基酸多肽的肟键具有少于 1小时的分解半衰期，在其他实施例中为少于1天，在其他实施例中为少于2天，在其 他实施例中为少于1周且在其他实施例中为多于1周。在其他实施例中，所得肟在适度 酸性条件下稳定至少两周，在其他实施例中，所得肟在适度酸性条件下稳定至少5天。 在其他实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与约8之间的pH值下稳定至少1天； 在其他实施例中，在约2至约6的pH值下稳定至少1天；在其他实施例中，在约2至 约4的pH值下稳定至少1天。在其他实施例中，使用本文中描述的策略、方法、组合 物和技术，所属领域的技术人员应能够合成具有调节至熟练技工所需(例如，用于治疗 用途(诸如持续释放)，或诊断用途，或工业用途或军事用途)的分解半衰期的非天然 氨基酸多肽的肟键。
上述非天然氨基酸多肽适用于(包含，但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、 工业酶、结合蛋白(包含(但不限于)抗体和抗体片段)以及(包含，但不限于)蛋白 质结构和功能的研究。参见(例如)Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。上述非天 然氨基酸多肽的其他用途包含(仅举例来说)基于检定的用途、化妆品用途、植物生物 学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可经历 进一步修饰以并入新的或经修饰的官能基，其包含操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安 全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学及/或药效(例如，增大水溶性、生物可用性； 增大血清半衰期；增大治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)； 向多肽提供其他官能基；向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质； 以及前述修饰的任何组合。
在某些实施例中为易化多肽的分离性质的方法，其包括利用包括至少一个非天然氨 基酸的同源生物合成非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是选自由含肟非天然氨基 酸、含羰基非天然氨基酸以及含羟胺非天然氨基酸组成的群组。在其他实施例中，这些 非天然氨基酸已通过生物合成并入如本文中所述的多肽中。在其他或替代实施例中，这 些非天然氨基酸多肽包括至少一种选自式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽的特定类型、种类或家族。实 际上，几乎任何多肽可包含至少一个本文中描述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可 与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、 抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、 C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、 SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化 蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞 炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、 CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、 补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表 皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、 因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤 维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、 生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、 人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、 胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。 非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
这些修饰包含使其他官能基结合于多肽的非天然氨基酸组分上，这些官能基包含 (但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂； 细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白 质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物； 聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材 料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他 分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可 光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可 光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分； 经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性 基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核 糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性 传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、 抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受 体、反胶束以及其任何组合。
另外，非天然氨基酸多肽可含有可转变为其他官能基的部分，诸如，仅举例来说， 羰基、二羰基或羟胺。图63A说明非天然氨基酸多肽转变为含羰基或二羰基的非天然氨 基酸多肽的化学转变，而图63B说明非天然氨基酸多肽转变为含羟胺的非天然氨基酸多 肽的化学转变。所得含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽以及含羟胺的非天然氨基酸多 肽可用于或并入用于制备、纯化、表征及使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。化学 部分转变为其他官能基(诸如，仅举例来说，羰基、二羰基或羟胺)的化学转变可使用 所属领域的技术人员已知的技术和材料来实现，诸如(例如)于March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY第5版，(Wiley 2001)；以及Carey和Sundberg，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY第4版，A卷和B卷(Plenum 2000，2001)中所述，(所有文献是以引用的方式 全部并入)。
因此，仅举例来说，含有以下氨基酸中的任一者的非天然氨基酸多肽可使用本文中 描述的方法和组合物进一步修饰：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选 的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚 烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经 取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基、 -C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷 芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发 的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可 化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基 硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团； 电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选的，且当存在时为选自由以 下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、 2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
本文中描述的方法和组合物的一方面为包含至少一种具有至少一个(包含(但不限 于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至 少九个，或至少十个或十个以上)已经翻译后修饰的非天然氨基酸的多肽的组合物。经 翻译后修饰的非天然氨基酸可相同或不同，包含(但不限于)在包括1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上不同的经翻译后 修饰的非天然氨基酸的多肽中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同位点。另一方面，组合物包含其中多 肽中存在的至少一个(但少于全部)的特定氨基酸用经翻译后修饰的非天然氨基酸取代 的多肽。对于具有一个以上的经翻译后修饰的非天然氨基酸的给定多肽来说，经翻译后 修饰的非天然氨基酸可相同或不同(包含，但不限于，多肽可包含两个或两个以上不同 类型的经翻译后修饰的非天然氨基酸，或可包含两个相同的经翻译后修饰的非天然氨基 酸)。对于具有两个以上的经翻译后修饰的非天然氨基酸的给定多肽来说，经翻译后修 饰的非天然氨基酸可相同、不同或为多个相同种类的经翻译后修饰的非天然氨基酸与至 少一个不同的经翻译后修饰的非天然氨基酸的组合。
A.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含羰基非天然氨基酸与含羟胺的试剂 的反应
天然存在氨基酸的侧链缺乏高度亲电子性位点。因此，并入具有含亲电子试剂的侧 链的非天然氨基酸(包含(仅举例来说)含有诸如酮或醛的羰基或二羰基的氨基酸)使 得通过羰基或二羰基的亲核进攻的位点特异性衍生化此侧链成为可能。在其中进攻亲核 试剂为羟胺的情况下，会产生肟衍生的蛋白质。用于衍生化及/或进一步修饰的方法可用 在衍生化步骤之前或在衍生化步骤之后纯化的多肽进行。另外，用于衍生化及/或进一步 修饰的方法可用在这些修饰之前或之后纯化的合成聚合物、多糖或聚核苷酸进行。此外， 衍生化步骤可在适度酸性至微碱性条件下发生，所述条件包含(例如)介于约2-8之间 的pH值下，或介于约4-8之间的pH值下。
根据含有羰基或二羰基的多肽与经羟胺取代的分子的反应来衍生化多肽的方法具 有明显的优点。第一，羟胺在2-8的pH值范围内(且在其他实施例中在4-8的pH值范 围内)经历与含有羰基或二羰基的化合物的缩合以产生肟加合物。在这些条件下，天然 存在氨基酸的侧链为无反应性的。第二，此选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白 质成为可能：衍生的蛋白质如今可制备为确定的同源产物。第三，实现本文中描述的羟 胺与本文中描述的含有羰基或二羰基的多肽的反应所需要的温和条件通常不会不可逆 地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的目的即为破坏此三级结构)。最后，尽 管羟胺基团氨基似乎由大肠杆菌代谢，但羟胺与含有羰基或二羰基的分子的缩合产生在 生物条件下稳定的肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为对可用于进一步修饰含有羰基或二羰基的非天然 氨基酸多肽的本文中描述的含羟胺的试剂有反应性的含有羰基或二羰基的氨基酸的类 型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基。
在某些实施例中，式(I)化合物在水溶液中在适度酸性条件下与羟胺具有反应性。 在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
仅举例来说，为前述目的，式(I)化合物包含具有以下结构的化合物：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为一键、亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
仅进一步举例来说，为前述目的，式(I)化合物包含具有式(XXXX)的结构的化 合物：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
包括这些含有羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽的类型实际上并无限制，只要含 有羰基或二羰基的非天然氨基酸位于多肽上从而羟胺试剂可与羰基或二羰基反应且不 产生破坏多肽的三级结构的所得经修饰的非天然氨基酸(当然，除非如果此破坏是反应 的目的)。
仅举例来说，以下含羟胺的试剂为对本文中描述的含有羰基或二羰基的非天然氨基 酸有反应性且可用于进一步修饰含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的含羟胺的试 剂的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或 经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-N(R8)2，其中R8各自独立地为H或氨基保护基；且n为1至3；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修 饰的”非天然氨基酸多肽上的羰基(包含二羰基)反应的羟胺基。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为包括烷基、经取代烷基、烯基、经取代 烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、 聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷 芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基的聚合物。在式(XIX)化合物的某些实 施例中，X为包括聚氧化亚烷基或经取代聚氧化亚烷基的聚合物。在式(XIX)化合物 的某些实施例中，X为包括-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x(其 中x为20-10,000)的聚合物。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为具有在2 KDa 至40 KDa的范围内的分子量的m-PEG。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为选 自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质 体、微粒以及胶束组成的群组的生物活性剂。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X 为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激 素、生长因子以及甾族剂组成的群组的药物。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X 为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶组成的群组的 酶。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光 部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分以及 能量转移部分组成的群组的可检测标记。在式(XIX)化合物的某些实施例中，L选自 由-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-以及-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)- 组成的群组。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XX)的结构的化合物：
X-L-O-NH2
(XX).。
在式(XX)化合物的某些实施例中，为选自由以下各物组成的群组的化合物：
以及
其中在其他实施例中，这些m-PEG或PEG基团具有在5 kDa至30 kDa的范围内的 分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXI)的结构的化合物：
在式(XXI)化合物的某些实施例中，为选自由以下各物组成的群组的化合物：
以及
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXII)的结构的化合物：
在式(XXII)化合物的某些实施例中，L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚 烷基或经取代亚烷基)-。在式(XXII)化合物的某些实施例中，为具有式(XXIII)的结 构的化合物：
其中在式(XXII)化合物的其他实施例中，这些m-PEG基团具有在5kDa至30kDa 的范围内的分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXIV)的结构的化合物：
在式(XXIV)化合物的某些实施例中，L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚 烷基或经取代亚烷基)-或-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XXIV)化合物 的某些实施例中，为具有式(XXV)的结构的化合物：
其中在式(XXIV)化合物的其他实施例中，这些m-PEG基团具有在5kDa至30kDa 的范围内的分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXVI)的结构的化合物：
其中R10各自独立地为H或氨基保护基。
在式(XXVI)化合物的某些实施例中，聚氧化亚烷基为PEG。在式(XXVI)化合 物的其他实施例中，PEG基团具有在5kDa至30kDa的范围内的分子量。在式(XXVI) 化合物的另一实施例中为对应于下式的化合物：
用于将羟胺偶合至多肽上的含羰基非天然氨基酸上的方法的三个说明性实施例呈 示于图7中。在这些说明性实施例中，将羟胺衍生的试剂添加到含羰基的非天然氨基酸 多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。为加速接合， 添加诸如图8中呈示的那些添加剂；这些化合物在本文中也被称为促进剂。在某些实施 例中，促进剂或添加剂能够碱催化。通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来纯化所得含 肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可与经羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽位点 特异性地反应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上 含有羟胺官能基的连接子(单官能性、双官能性或多官能性)。羟胺衍生的连接子与经 酮取代的蛋白质的缩合产生稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如，具有一个或一 个以上其他键联化学的羟胺)容许将不同分子(例如，其他蛋白质、聚合物或小分子) 位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所有末端上经羟胺取代) 促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接子策略与本文中描 述的活体内翻译技术相组合，使得详细说明经化学精制的蛋白质的三维结构成为可能。
在某些实施例中为用于衍生化包括式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的氨基酸(其包含处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包括 使包括至少一个式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或XXXX-XXXXIII的氨基酸的多 肽与式(XIX)的试剂接触。在某些实施例中，多肽在与式(XIX)的试剂接触之前或 之后经纯化。在其他实施例中为包括至少一个对应于式(XI)的含肟氨基酸的所得衍生 多肽，而在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。 在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这 些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少5天。在其他实施例中，所述条件为pH 2至8。 在某些实施例中，保持衍生多肽的三级结构。在其他实施例中，多肽的这些衍生化进一 步包括将衍生多肽连接至另一多肽上。在其他实施例中，这些所衍生的多肽与选自由以 下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、 抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因 子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、 PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、 单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白 -iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、 CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制 剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因 子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、 因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋 白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、 生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长 激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、 类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白 细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在某些实施例中为产生多肽二聚体的方法，其中所述方法包括：
(i)以式(XXVI)的试剂衍生化包括式(I)的氨基酸的第一多肽，以及(ii)使 步骤(i)的所得衍生蛋白质与包括式(I)的氨基酸的第二蛋白质接触，进而形成包括 第一多肽与第二多肽的二聚体。在其他实施例中为产生多肽二聚体的方法，其中第一多 肽与第二多肽包括对应于式(II)的氨基酸。在某些实施例中，多肽是在与式(XXVI) 的试剂接触之前或之后经纯化。在其他实施例中，步骤(i)的所得衍生蛋白质包括至少 一个对应于式(XXVIII)的含肟氨基酸：
B.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：使含肟的非天然氨基酸与含羰基的试 剂反应
基于含肟蛋白质与经羰基或二羰基取代的分子的交换反应的蛋白质衍生方法具有 明显的优点。第一，研究指示基于氨基酸的肟加合物通过与比用于产生原始肟的化合物 更具反应性的含有羰基或二羰基的化合物的平衡经历肟交换。此交换反应发生在4-8的 pH值范围内：在所述条件下，天然存在氨基酸的侧链不具反应性。因此，用于制备适 于与含肟蛋白质反应的经羰基或二羰基取代的分子的一般方法可提供得到多种位点特 异性衍生的蛋白质的途径。在此活体内翻译技术的情况下，用于制备通常用于衍生化蛋 白质的那些分子(包含(仅举例来说)亲水性聚合物，诸如聚乙二醇)的经羰基或二羰 基取代的形式的一般方法为有价值的且会提供得到多种位点特异性衍生的非天然氨基 酸多肽的途径。第二，此选择性化学使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能：衍 生蛋白质如今可为确定同源产物。第三，实现本文中描述的交换反应所需要的温和条件 通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的目的为破坏此三级结 构)。最终，交换反应产生在生物条件下稳定的新肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为与可用于产生新的含肟非天然氨基酸多肽的本文 中描述的含羰基或二羰基的试剂有反应性的含肟氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选 的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚 烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经 取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
仅进一步举例来说，以下非天然氨基酸也为与可用于产生新的含肟非天然氨基酸多 肽的本文中描述的含羰基或二羰基的试剂有反应性的含肟氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基、 -C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷 芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发 的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可 化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基 硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团； 电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选的，且当存在时为选自由以 下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、 2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基。
仅举例来说，以下含羰基或二羰基的试剂为与本文中描述的含肟非天然氨基酸具有 反应性且可用于实现交换反应以形成新肟键且因此修饰含肟非天然氨基酸多肽的含羰 基或二羰基的试剂的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基， 或经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-C(＝O)R9，其中R9为H或OR′；且n为1至3；
或其中L-L1-W共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保 护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够经历与非天然氨基酸或“经修饰或未 经修饰的”非天然氨基酸多肽上的肟基发生肟交换反应的羰基(包含二羰基)。
用于实现多肽上的含肟氨基酸与含羰基的试剂之间的肟交换反应的方法的两个说 明性实施例呈示于图9中。在这些说明性实施例中，将含羰基的试剂添加到含肟非天然 氨基酸多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。通过 HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来纯化经修饰含肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可位点特异性地与经肟取代的非天然氨基酸多肽反 应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羰基或 二羰基官能基的连接子(单官能、双官能或多官能)。羰基或二羰基衍生的连接子与经 肟取代的非天然氨基酸多肽的缩合产生新的稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如， 具有一个或一个以上其他键联化学的羰基或二羰基)容许将不同分子(例如，其他蛋白 质、聚合物或小分子)位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所 有末端上经羰基或二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。 通过将此连接子策略与本文中描述的活体内翻译技术相组合，使得详细说明经化学精制 的蛋白质的三维结构成为可能。
C.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：使含羟胺的非天然氨基酸与含羰基 的试剂反应
上述翻译后修饰技术和组合物也可用于与含羰基或二羰基的试剂反应以产生经修 饰的含肟非天然氨基酸多肽的含羟胺的非天然氨基酸。
基于含羟胺的蛋白质与经羰基或二羰基取代的分子的反应的蛋白质衍生方法具有 明显的优点。第一，羟胺在4-8的pH值范围内经历与含有羰基或二羰基的化合物的缩 合以产生肟加合物。在所述条件下，天然存在氨基酸的侧链不具反应性。第二，此选择 性化学使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能：衍生蛋白质如今可制备为确定同 源产物。第三，实现本文中描述的含羰基或二羰基的试剂与本文中描述的含羟胺多肽的 反应所需要的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的 目的为破坏此三级结构)。最后，尽管羟胺基氨基酸似乎由大肠杆菌代谢，但含羰基或 二羰基的试剂与含羟胺的氨基酸的缩合产生在生物条件下稳定的肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为与可用于进一步修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽 的本文中描述的含羰基或二羰基的试剂具有反应性的含羟胺氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，K为NH2。
包括这些含羟胺的非天然氨基酸的多肽的类型实际上并无限制，只要含羟胺的非天 然氨基酸位于多肽上以便含羰基或二羰基的试剂可与羟胺基反应且不产生破坏多肽的 三级结构的所得经修饰的非天然氨基酸(当然，除非如果此破坏是反应的目的)。
仅举例来说，以下含羰基或二羰基的试剂为与本文中描述的含羟胺的非天然氨基酸 具有反应性且可用于进一步修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽的含羰基或二羰基的试剂 的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基， 或经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-J-R，其中J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；R″各自独立地为H、烷基、 经取代烷基，或保护基，或当存在一个以上的R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基； 且n为1至3；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修 饰的”非天然氨基酸多肽上的羟胺基反应的羰基(包含二羰基)。
在式(XIX)化合物的某些实施例中为具有式(XXI)的结构的化合物：
用于将含羰基的试剂偶合至多肽上的含羟胺的非天然氨基酸上的方法的说明性实 施例呈示于图10中。在这个说明性实施例中，将经羰基衍生的试剂添加到含羟胺的非 天然氨基酸多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。为 加速接合，添加诸如图8中呈示的那些添加剂。通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来 纯化所得含肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可位点特异性地与经羟胺取代的非天然氨基酸多肽 反应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羰基 或二羰基官能基的连接子(单官能、双官能或多官能)。经羰基或二羰基衍生的连接子 与经羟胺取代的蛋白质的缩合产生稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如，具有一 个或一个以上其他键联化学的羰基或二羰基)容许将不同分子(例如，其他蛋白质、聚 合物或小分子)位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所有末端 上经羰基或二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将 此连接子策略与本文中描述的活体内翻译技术组合，使得详细说明经化学精制的蛋白质 的三维结构成为可能。
在某些实施例中为用于衍生化包括式XIV-XVI的氨基酸(其包含处于式XIV-XVI 的范畴内的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包括使包括至少一个 式XIV-XVI的氨基酸的多肽与式(XIX)的试剂接触。在某些实施例中，多肽是在与式 (XIX)的试剂接触之前或之后经纯化。在其他实施例中为包括至少一个对应于式 (XXIX)的含肟氨基酸的所得衍生多肽，
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代 低级亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代 亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、 -C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或 经取代烷基；
L为独立地选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯 基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取 代亚烷基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；且
X独立地为可检测标记、生物活性剂或聚合物。
在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这些 衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少5天。在其他实施例中，所述条件为pH2至8。在 某些实施例中，保持衍生多肽的三级结构。在其他实施例中，多肽的这些衍生化进一步 包括将衍生多肽连接至另一多肽上。在其他实施例中，这些所衍生的多肽与选自由以下 各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、 抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因 子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、 PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、 单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白 -iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、 CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制 剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因 子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、 因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋 白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、 生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长 激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、 类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白 细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
D.添加官能基的实例：偶合至非天然氨基酸多肽上的大分子聚合物
可使用本文中描述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中描述的非天然氨基 酸多肽的各种修饰。这些修饰包含使其他官能基结合于多肽的非天然氨基酸组分上，这 些官能基包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物； 光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂； 第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳 水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊 精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能 基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分； 配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解 的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸； 毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密 基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子； 抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素； 放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成 抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决 定基、受体、反胶束以及其任何组合。作为本文中描述的组合物、方法、技术和策略的 说明性、非限制性实例，以下描述应集中在将大分子聚合物添加至非天然氨基酸多肽上， 同时应了解另外描述的组合物、方法、技术和策略也可用于(必要时加以适当修改，且 所属领域的技术人员可使用本文中的揭露内容进行)添加其他官能基，其包含(但不限 于)上文列出的那些官能基。
多种大分子聚合物以及其他分子可偶合至本文中描述的非天然氨基酸多肽上以调 节非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)的生物性质，及/或向非天然氨基酸多肽 (或相应天然氨基酸多肽)提供新的生物性质。这些大分子聚合物可通过非天然氨基酸， 或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加至非天然氨基酸上的任何取代基或官能基偶 合到非天然氨基酸多肽上。
水溶性聚合物可偶合至并入本文中描述的多肽(天然或合成)、聚核苷酸、多糖或 合成聚合物中的非天然氨基酸上。水溶性聚合物可通过并入多肽中的非天然氨基酸或非 天然氨基酸的任何官能基或取代基，或添加至非天然氨基酸上的任何官能基或取代基偶 合。在一些情况下，本文中描述的非天然氨基酸多肽包括一个或一个以上偶合至水溶性 聚合物上的非天然氨基酸以及一个或一个以上键联至水溶性聚合物上的天然存在氨基 酸。亲水性聚合物与生物活性分子的共价连接表示增加生物活性分子(包含蛋白质、肽 以及尤其疏水分子)的水溶性(诸如在生理环境中)、生物可用性、增加血清半衰期、 增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的一种方法。这些亲水 性聚合物的其他重要特征包含生物相容性、无毒性以及无免疫原性。对于最终产物制剂 的治疗用途，优选聚合物应为医药学上可接受的。
亲水性聚合物的实例包含(但不限于)：聚烷基醚以及其烷氧基封端类似物(例如， 聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/聚氧丙二醇，以及其甲氧基或乙氧基封端类似物，尤其聚氧乙 二醇，后者也被称作聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、 聚烷基噁唑啉以及聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺以及聚羟烷基丙烯酰 胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺以及其衍生物)；聚羟烷基丙烯酸酯；聚唾液酸以 及其类似物；亲水性肽序列；多糖以及其衍生物，其包含葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如， 羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素以及其衍生物，例如，羧甲基纤维素、 羟烷基纤维素；甲壳质以及其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳质、 羧甲基壳聚糖；透明质酸以及其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀 粉以及羧甲基支链淀粉；聚氨基酸以及其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬 氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚 马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述物质的衍 生物。水溶性聚合物可为任何结构形式，其包含(但不限于)线性、叉状或分枝。在一 些实施例中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用。多官能聚合物衍生 物包含(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中每一末端与可相同或不同的官能 基键结。在一些实施例中，水基聚合物包括聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范 围内，其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物 的分子量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000 Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、 55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000 Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000 Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、 300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da 与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量 可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000 Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、 50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000 Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、 2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链 PEG的分子量在约5,000Da与20,000Da之间。所属领域的技术人员应了解关于实质上 水溶性主链的前述列举绝非详尽的且仅为说明性的，且预计具有上述品质的所有聚合材 料适用于本文中描述的方法和组合物中。
如上所述，亲水性聚合物的一个实例为聚乙二醇(缩写为PEG)，其已广泛用于药 物中、人造植入物上，以及其中生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其他应 用中。本文中描述的聚合物∶多肽实施例将使用PEG作为例示性亲水性聚合物，其中应 了解其他亲水性聚合物可类似地用于这些实施例中。
PEG为熟知的水溶性聚合物，其可市面上购得或可根据所属领域中熟知的方法由乙 二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York， 第3卷，第138-161页)。PEG通常透明、无色、无味、可溶于水中、对热稳定、对许 多化学剂惰性、不水解或变质，且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容的，这就是说PEG 能够与活组织或生物体共存，而不造成危害。更明确地说，PEG实质上为非免疫原性的， 这就是说PEG在体内不趋向于产生免疫反应。当连接至体内具有一些需要的功能的分子 (诸如生物活性剂)上时，PEG趋向于掩蔽药剂且可减少或消除任何免疫反应以便生物 体可耐受药剂的存在。PEG接合物趋向于不产生实质的免疫反应或造成凝结或其他不需 要的效应。
广泛使用术语“PEG”涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑大小或在PEG末端上的修饰)， 且当键联至非天然氨基酸多肽上时可由下式表示：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n为2至10,000且X为H或末端修饰，其包含(但不限于)C1-4烷基、保护 基或末端官能基。术语PEG包含(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，其包含双官能 PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉状PEG、分枝PEG(其中每一链具有约1kDa至约100 kDa、约1kDa至约50kDa或约1kDa至约20kDa的分子量)、悬垂PEG(即具有一个 或一个以上悬垂于聚合物主链的官能基的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键联 的PEG。在一实施例中，其中n为约20至约2000的PEG适用于本文中描述的方法和 组合物中。在一些实施例中，水基聚合物包括聚乙二醇部分。PEG聚合物的分子量可在 宽泛范围内，其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。 PEG聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000 Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、 60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000 Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000 Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500 Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100 Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。 在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在 约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链 PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、 95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000 Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、 20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、 4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量在 约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与 40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。 在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000Da之间。广泛范围的PEG 分子描述于(包含，但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录 中，其是以引用的方式并入本文中。
文献中末端官能基的特定实例包含(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(参见(例如) 美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(参见(例如)Buckmann等人，Makromol. Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(参见(例 如)Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯以及丁酸琥珀 酰亚胺酯(参见(例如)Olson等人，在Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications中第170-181页，Harris和Zalipsky编，ACS，Washington，D.C.，1997；也参 见美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(参见(例如)Abuchowski等人， Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381 (1979))、琥珀酰亚胺基酯(参见(例如)美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑(参 见(例如)美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(参见(例如)Pitha等人，Eur.J Biochem. 94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧基羰基咪唑(参 见(例如)Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(参见(例如)Veronese等人，Appl.Biochem. Biotech.，11：141(1985)；以及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛 (参见(例如)Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784 号；美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(参见(例如)Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)；Romani等人，在Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)中；以及 Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见(例如)Woghiren 等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(参见(例如)Sawhney等人，Macromolecules， 26：581(1993))、乙烯基砜(参见(例如)美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献 和专利是以引用的方式全部并入本文中。
在一些情况下，PEG在一端上以羟基或甲氧基终止，即，X为H或CH3(“甲氧基 PEG”)。或者，PEG可以反应性基团终止，进而形成双官能聚合物。典型反应性基团可 包含通常用于与20种常见氨基酸中存在的官能基(包含(但不限于)马来酰亚胺基团、 活化碳酸酯(包含(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包含(但不限于)N-羟基琥珀 酰亚胺、对硝基苯酯)以及醛)以及对20种常见氨基酸惰性但与非天然氨基酸中存在 的互补官能基特异性反应的官能基(包含(但不限于)肟基、羰基或二羰基以及羟胺基) 的那些反应性基团。
应注意在上式中由Y表示的PEG的另一端应通过非天然氨基酸直接或间接地连接 到多肽(合成或天然)、聚核苷酸、多糖或合成聚合物上。当Y为羟胺基时，那么含羟 胺的PEG试剂可与多肽中含有羰基或二羰基的非天然氨基酸反应以形成通过肟键键联 至多肽上的PEG基团。当Y为羰基或二羰基时，那么含有羰基或二羰基的PEG试剂可 与多肽中含羟胺的非天然氨基酸反应以形成通过肟键键联至多肽上的PEG基团。当Y 为羰基或二羰基时，那么含有羰基或二羰基的PEG试剂也可与多肽中含肟的非天然氨基 酸反应以形成通过新的肟键键联至多肽上的PEG基团。适当反应条件、纯化方法和试剂 的实例遍及本说明书和附随图式进行描述。举例来说，图7呈示含羰基的非天然氨基酸 多肽与含羟胺的PEG试剂反应形成键联至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多肽的三 个实例。此外，图9呈示含肟的非天然氨基酸多肽与含羰基的PEG试剂反应形成键联至 PEG基团上的新的含肟的非天然氨基酸多肽的两个实例。且图10呈示含羟胺的非天然 氨基酸多肽与含羰基的PEG试剂反应形成键联至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多 肽的一个实例。
仅举例来说且并非作为对可用于本文中描述的组合物、方法、技术和策略的PEG 试剂的类型或种类的限制，图11呈示可与含羰基的非天然氨基酸多肽反应以形成键联 至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多肽的含羟胺的PEG试剂的其他说明性实例，以 及可与含肟的非天然氨基酸多肽或含羟胺的非天然氨基酸多肽反应以形成键联至PEG 基团上的新的含肟非天然氨基酸多肽的含羰基的PEG试剂的实例。图12呈示用于形成 含羟胺的PEG试剂，或含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或含羟胺的PEG试剂的经掩 蔽形式的合成方法的四个说明性实例。图13呈示用于形成经酰胺键联的含羟胺的PEG 试剂，或经酰胺键联的含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或经酰胺键联的含羟胺的PEG 试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。图14和图15呈示用于形成经氨基甲酸酯 键联的含羟胺的PEG试剂，或经氨基甲酸酯键联的含羟胺的PEG试剂的经保护形式， 或经氨基甲酸酯键联的含羟胺的PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。图 16呈示用于形成简单含羟胺的PEG试剂，或简单含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或 简单含羟胺的PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。此外，图17呈示具有 多个键联PEG基团的支链的含有羟胺的试剂的说明性实例，且进一步展示一种此含羟胺 的多个PEG支链试剂与含羰基的非天然氨基酸多肽形成具有键联的多个PEG支链基团 的含肟非天然氨基酸多肽的反应。
当需要将不同分子连接到聚合物的每一末端上时，异双官能衍生物也为尤其适用 的。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会容许将具有活化亲电子基团(诸如醛、酮、 活化酯、活化碳酸酯等)的分子连接到PEG的一个末端上且将具有亚乙酰基的分子连接 到PEG的另一个末端上。
在一些实施例中，强亲核试剂(包含(但不限于)羟胺)可与非天然氨基酸中存在 的醛基或酮基反应以形成肟，在一些情况下其可通过以适当还原剂处理来进一步还原。 或者，强亲核试剂可通过非天然氨基酸并入多肽中且用于与水溶性聚合物中存在的酮基 或醛基优先反应。通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然氨基酸反应。
因此，在一些实施例中，包括非天然氨基酸的多肽通过非天然氨基酸的侧链键联到 水溶性聚合物(诸如聚乙二醇(PEG))上。本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物提 供用于以PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高度有效方法，其包括将非天然氨基酸(包含 (但不限于)含有20种天然并入氨基酸中不存在的官能基或取代基的那些氨基酸)选 择性并入蛋白质中以回应选择密码子，以及随后以适合反应性PEG衍生物修饰那些氨基 酸。多种已知化学方法适用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物以将水溶性聚合 物并入蛋白质中。
聚合物主链可为线性或分枝的。分枝聚合物主链通常为所属领域中已知的。通常， 分枝聚合物具有中心分枝核部分和多个连接到中心分枝核上的线性聚合物链。PEG是以 分枝形式使用，其可通过将环氧乙烷添加到各种多元醇(诸如丙三醇、丙三醇寡聚物、 季戊四醇以及山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可衍生自若干氨基酸，诸如赖氨酸。 分枝聚乙二醇可以通用形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自核部分，诸如丙三醇、 丙三醇寡聚物或季戊四醇，且m表示臂的数目。多臂PEG分子(诸如美国专利第5,932,462 号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596； WO 96/21469；以及WO 93/21259中描述的那些PEG分子，这些文献的每一者是以引用 的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为键联基团且Z 为通过确定长度的原子链键联到CH上的活化末端基团。另一分枝形式悬垂PEG沿PEG 主链而非在PEG链的末端处具有诸如羧基的反应性基团。
除PEG的这些形式之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来 说，可制备在聚合物主链中具有酯键的PEG，其经历水解。如本文中所示，此水解使得 聚合物裂解为较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域的技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包含所属领域中已知的所 有形式，其包含(但不限于)本文中揭露的那些形式。聚合物的分子量可在宽泛范围内， 其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子 量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、 90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000 Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、 15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、 3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、 300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da 与40,000Da之间。
为最大化PEG的所需性质，PEG聚合物或连接到生物活性分子上的聚合物的总分 子量以及水合状态应足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，诸如水溶性 和循环半衰期增加，而不会不利影响母体分子的生物活性。
本文中描述的方法和组合物可用于制备实质上均质的聚合物∶蛋白质接合物的制剂。 如本文中所使用的“实质上均质”意谓观测到聚合物∶蛋白质接合物分子比总蛋白质的一 半更大。聚合物∶蛋白质接合物具有生物活性且本文中提供的本发明的“实质上均质”PEG 化多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，易于临床应用于批次之间药物动 力学的预测中)的那些制剂。
也可选择制备聚合物∶蛋白质接合物分子的混合物，且本文中提供的优点在于可选择 包含在混合物中的单聚合物∶蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与 所连接的各种数目的聚合物部分(即，二聚物部分、三聚物部分、四聚物部分等)的混 合物且将这些接合物与使用本文中描述的方法制备的单聚合物∶蛋白质接合物组合，且使 混合物具有预定比例的单聚合物∶蛋白质接合物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会随着其在反应混合物中的浓度而改变。一般来 说，最佳比率(就反应效率来说在于存在最小过量的未反应的蛋白质或聚合物)可由所 选聚乙二醇的分子量且关于可用的可用反应性基团的数目来确定。关于分子量，通常聚 合物的分子量越高，可连接到蛋白质上的聚合物分子的数目越少。类似地，当优化这些 参数时，应考虑到聚合物的分枝。通常，分子量越高(或分枝越多)，聚合物∶蛋白质比 率越高。
如本文中所使用，且当涵盖亲水性聚合物∶多肽/蛋白质接合物时，术语“治疗有效 量”进一步指的是向患者提供所需益处增加的量。所述量会随着不同个体而改变且应取 决于众多因素，其包含患者的全面身体状态和所欲治疗的疾病、病症或病状的潜在病因。 本发明的组合物的治疗有效量可易于由所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和 程序来确定。
可调节本文中描述的键联到“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的水溶性 聚合物的数目(即，PEG化或糖基化的程度)以提供改变的(包含(但不限于)增加的 或降低的)药理学、药物动力学或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，多 肽的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、两倍、五倍、10倍、50倍或至少约100倍。
在一实施例中，包括含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的 PEG衍生物修饰，其直接键联到PEG主链上。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均 分子量介于5kDa-40kDa之间)。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于) 介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约 100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、 80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000 Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、 9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的PEG 衍生物修饰，其通过酰胺键键联到PEG主链上。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均 分子量介于5kDa-40kDa之间)。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于) 介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约 100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、 80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000 Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、 9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的PEG 衍生物修饰，其中分枝PEG的每一链具有在10kDa-40kDa范围内的MW，且在其他实 施例中，在5kDa-20kDa范围内。分枝聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不 限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da 与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000 Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、 45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000 Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括非天然氨基酸的多肽经至少一种具有分枝结构的PEG衍生物 修饰。在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存 在，m为2-10且n为100-1,000。聚合物的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一 些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支 链PEG的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da 与20,000Da之间。
可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。参见(例如)Harris，Macromol. Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)； Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6： 150-165(1995)。
用于活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号，以及更多WO 93/15189中，且用于活化聚合物与 酶之间的接合的方法包含(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989)、核糖核酸酶以及超氧化物歧化酶(Veronese 等人，App.Biochem.Biotech.11：141-152(1985))，所有这些文献是以引用的方式全部并 入本文中。
必要时，从疏水色谱获得的本文中描述的PEG化非天然氨基酸多肽可通过一种或一 种以上所属领域的技术人员已知的程序来进一步纯化，这些程序包含(但不限于)亲和 色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅石 色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包含，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水相互 作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚 焦；置换色谱；电泳程序(包含(但不限于)制备型等电聚焦)、差示溶解性(包含(但 不限于)硫酸铵沉淀)或萃取。由GPC通过与球状蛋白标准物比较可估算表观分子量 (Preneta AZ，PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris 和Angal编)IRL Press 1989，293-306)。非天然氨基酸多肽∶PEG接合物的纯度可通过蛋 白水解降解(包含(但不限于)胰蛋白酶裂解)、接着质谱分析来评估。Pepinsky RB. 等人，J.Pharmacol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
键联到本文中描述的多肽的非天然氨基酸上的水溶性聚合物可不加限制地经进一 步衍生或取代。
E.增强对血清白蛋白的亲和性
各种分子也可与本文中描述的非天然氨基酸多肽融合以调节在血清中的半衰期。在 一些实施例中，分子与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽键联或 融合以增强对动物中内源血清白蛋白的亲和性。
举例来说，在一些情况下，进行多肽与白蛋白结合序列的重组融合。例示性白蛋白 结合序列包含(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参见(例如)Makrides 等人，J.Pharmacol Exp.Ther.277(1)：534-542(1996)以及Sjolander等人，J，Immunol. Methods 201：115-123(1997))，或白蛋白结合肽，诸如(例如)Dennis等人，J.Biol.Chem. 277(38)：35035-35043(2002)中描述的那些白蛋白结合肽。
在其他实施例中，本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽经脂肪 酸酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参见(例如)Kurtzhals等人， Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其他实施例中，本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽直接与 血清白蛋白(包含(但不限于)人类血清白蛋白)融合。所属领域的技术人员应了解， 多种其他分子也可键联到如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽上以 调节与血清白蛋白或其他血清组分的结合。
F.本文中描述的非天然氨基酸多肽的糖基化
本文中描述的方法和组合物包含结合有一个或一个以上的带有糖残基的非天然氨 基酸的多肽。糖残基可为天然(包含(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包含 (但不限于)3-氟半乳糖)。所述糖可通过N键联或O键联的糖苷键(包含(但不限于) N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包含(但不限于)肟或相应C键联或S键联 的糖苷)键联到非天然氨基酸上。
糖(包含(但不限于)糖基)部分可在活体内或活体外添加到非天然氨基酸多肽上。 在一些实施例中，包括含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽经用氨基氧基衍生化的糖 修饰以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。一旦连接到非天然氨基酸上，糖可通过以 糖基转移酶和其他酶处理来进一步精制以产生结合到非天然氨基酸多肽上的寡糖。参见 (例如)H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
G.键联基团的使用和包含多肽二聚体和多聚体的应用
除了直接向非天然氨基酸多肽添加官能基之外，多肽的非天然氨基酸部分可首先经 多官能(例如，双官能、三官能、四官能)连接子分子修饰，其随后经进一步修饰。也 就是说，多官能连接子分子的至少一个末端与多肽中的至少一个非天然氨基酸反应且多 官能连接子的至少一个其他末端可用于进一步官能化。如果多官能连接子的所有末端相 同，那么(视化学计量条件而定)可形成非天然氨基酸多肽的同型多聚体。如果多官能 连接子的末端具有不同的化学反应性，那么多官能连接子基团的至少一个末端会与非天 然氨基酸多肽结合且其他末端随后可与不同的官能基反应，这些官能基包含(仅举例来 说)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性 化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽 或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷 酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳 米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共 价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构 化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解 的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位 素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团； 插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、 放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素； 抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、 抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶 束以及其任何组合。
多官能连接子基团具有以下通用结构：
其中：
X各自独立地为NH2、-C(＝O)R9、-SR′或-J-R，其中R9为H或OR′，其中J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；R″各自独立地为H、烷基、 经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；W为NH2、-C(＝O)R9、-SR′或-J-R；且n为1至3；
其限制条件为X和L-L1-W共同各自独立地提供以下各基团中的至少一者：(a)能 够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的羰基(包含二羰基) 反应的羟胺基；(b)能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽 上的羟胺基反应的羰基(包含二羰基)；或(c)能够经历与非天然氨基酸或“经修饰或 未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的肟基发生交换反应的羰基(包含二羰基)。
图18呈示合成双官能同型连接子(其中所述连接子具有两个相同末端，即，羟胺 基)的说明性、非限制性实例。此连接子可用于形成含羰基或二羰基的非天然氨基酸多 肽的同型二聚体以形成两个肟键。或者，如果此连接子的一个末端经保护，那么此部分 经保护的连接子可用于通过肟键使未经保护的羟胺末端与含羰基或二羰基的非天然氨 基酸多肽结合，留下另一个经保护的末端在去保护之后用于其他键联反应。或者，对试 剂的化学计量的仔细操作可提供类似的结果(异质二聚体)，虽然会得到其中所需异质 二聚体会类似地由一些同型二聚体污染的结果。
图19呈示其中每一连接子具有一种以上的类型的末端反应性基团(即，羟胺基、 肟基以及硫酯基)的两种多官能异型连接子的说明性、非限制性实例。使用遍及本说明 书论述的基于肟的化学，此连接子可用于形成非天然氨基酸多肽的异质二聚体。
图20呈示在多步骤合成中使用异型双官能连接子将PEG基团连接到非天然氨基酸 多肽上的示意性说明性、非限制性实例。在第一个步骤中，如此说明性图式中所描述， 含羰基的非天然氨基酸多肽与含羟胺的双官能连接子反应形成经修饰的含肟非天然氨 基酸多肽。然而，双官能连接子仍保留能够与具有适当反应性的试剂(在图式中由匹配 形状的物体说明)反应以形成经修饰的含肟的官能化非天然氨基酸多肽的官能基(本文 中由有形物体说明)。在此特定说明性图式中，官能化为PEG基团，但也可包含前述官 能基中的任一者，或在三官能或四官能连接子的情况下，包含一种以上类型的官能基或 多种类型的相同官能基。图21呈示用于将含羟胺的非天然氨基酸多肽键联到PEG基团 上的四种类型的连接子基团的说明性实例。如前所述，PEG官能基仅为说明性目的而提 供。因此，本文中描述的连接子基团提供以位点选择性方式进一步修饰非天然氨基酸多 肽的另一种方法。
本文中描述的方法和组合物也提供多肽组合，诸如同型二聚体、异质二聚体、同型 多聚体或异质多聚体(即，三聚体、四聚体等)。仅举例来说，以下描述着重于GH超 基因家族成员，然而，这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于呈二聚体和多聚体 形式的可提供益处的几乎任何其他多肽，其包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管 生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多 肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、 GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因 子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性 蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、 D31065、T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、 补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、 MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮 剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维 蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促 性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、 水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1 受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、 神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、 甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒 素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可 溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调 节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、 SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综 合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、 肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、 jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮 质酮。
因此，本文中描述的方法、技术和组合物中涵盖直接结合至多肽主链或通过连接子 结合至另一GH超基因家族成员或其变体或非GH超基因家族成员的任何其他多肽或其 变体上的含有一个或一个以上非天然氨基酸的GH超基因家族成员多肽。由于其与单体 相比分子量增大，所以GH超基因家族成员二聚体或多聚体接合物可展现新颖或需要的 性质，其包含(但不限于)相对于单体GH超基因家族成员，不同的药理学、药物动力 学、药效学、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本文中描 述的GH超基因家族成员二聚体会调节GH超基因家族成员受体的二聚化。在其他实施 例中，本文中描述的GH超基因家族成员二聚体或多聚体会充当GH超基因家族成员受 体拮抗剂、促效剂或调节剂。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽经直接键联，其包含(但不限于)通过 Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键。在一些实施例中，键联的GH超基因家族成员多肽 及/或键联的非GH超基因家族成员会包括促进二聚化的不同的非天然氨基酸，其包含 (但不限于)第一GH超基因家族成员，及/或键联的非GH超基因家族成员，包括与包 括含羟胺的非天然氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽接合的含酮非天然氨基酸的多 肽且所述多肽通过形成相应肟来反应。
或者，两种GH超基因家族成员多肽及/或键联的非GH超基因家族成员是通过连接 子连接。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子连接两种GH超基因家族成 员，及/或键联的非GH超基因家族成员、多肽，其可具有相同或不同一级序列。在一些 情况下，用于将GH超基因家族成员，及/或键联的非GH超基因家族成员、多肽束缚在 一起的连接子可为双官能PEG试剂。
在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供具有哑铃结构的水溶性双官能连 接子，所述结构包含：a)在聚合物主链的至少第一末端上的叠氮化物、炔、肼、酰肼、 羟胺或含有羰基或二羰基的部分；以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二 官能基。第二官能基可与第一官能基相同或不同。在一些实施例中，第二官能基不与第 一官能基反应。在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供包括至少一个分枝分 子结构的臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。
在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供通过与具有以下结构的水溶性活 化聚合物反应形成的包括一种或一种以上GH超基因家族成员的多聚体：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n为约5至3,000，m为2-10，X可为叠氮化物、炔、肼、酰肼、氨基氧基、 羟胺、乙酰基，或含有羰基或二羰基的部分，且R为封端基团、官能基，或可与X相同 或不同的离去基团。R可为(例如)选自由以下各基团组成的群组的官能基：羟基、经 保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀醯亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、碳酸N-羟基琥珀醯亚胺 基酯、碳酸1-苯并三唑基酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙 烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、 经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡 啶、碘乙酰胺、环氧化物、二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯，以及三氟乙基磺酸酯、 烯和酮。
图22呈示使用本文中描述的连接子基团形成本文中描述的非天然氨基酸多肽的同 型二聚体的说明性、非限制性实例。在这个说明性实例中，使含羰基的非天然氨基酸多 肽在适于形成键联的同型二聚体含肟非天然氨基酸多肽的条件下与具有两个可用羟胺 基的双官能连接子基团反应。图式中呈示的方法并不限于与含羟胺的双官能连接子偶合 的含羰基非天然氨基酸多肽。非天然氨基酸多肽可进一步含有能够与含羰基的多官能连 接子基团经历交换反应以形成由含有多个肟基的结构连接的同型多聚体的肟基，或非天 然氨基酸多肽可进一步含有能够与含羰基的多官能连接子基团经历反应以形成由含有 多个肟基的结构连接的同型多聚体的羟胺基。当然，同型多聚体可为同型二聚体、同型 三聚体或同型四聚体。
图23呈示使用异型官能连接子基团形成多肽的异质二聚体的说明性、非限制性实 例，其中异质二聚体中的至少一个成员为本文中描述的非天然氨基酸多肽且其他成员视 情况为如本文中所述的非天然氨基酸多肽、其他类型的非天然氨基酸多肽，或天然存在 氨基酸多肽。在此图式中呈示的实例中，连接子基团含有两个相同的羟胺基，通过控制 化学计量、温度和反应的其他参数，连接子与含羰基的非天然氨基酸多肽反应的主要产 物为连接至具有可用羟胺基的连接子上的经修饰的含肟非天然氨基酸多肽。此后者基团 可进一步与另一种含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反应以形成含肟的非天然氨基 酸多肽的双官能异质二聚体。当然，连接子上的官能基不必相同，且其不必为羟胺基。 使用遍及本说明书详述的化学，所属领域的技术人员可设计其中至少一个官能基可与非 天然氨基酸多肽形成肟基的连接子；连接子上的其他官能基可利用其他已知化学，其包 含有机化学领域中熟知的基于亲核试剂/亲电子试剂的化学。
H.添加官能基的实例：易化多肽的分离性质
天然存在或非天然氨基酸多肽可能因包含(但不限于)多肽的溶解性或结合特征的 多种原因难以从样本中分离。举例来说，在制备用于治疗用途的多肽的过程中，可能从 已经工程化设计以过度生产多肽的重组系统中分离此多肽。然而，由于多肽的溶解性或 结合特征，达到所需程度的纯度通常证明是困难的。本文中描述的方法、组合物、技术 和策略提供这种情形的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽具有改良的分离特 征。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽使通过生物合成制备。在另一或额外实施例 中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸中的一者中。在另一或额 外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良分离 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括与提供改良分离特征的基团的肟键。 在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进一步修饰以形成经修饰的含肟非天然氨基酸 多肽，其中所述修饰提供与提供改良分离特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基 团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非 天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上， 在其他实施例中，需要一系列化学反应来将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予 改良分离特征的基团在所利用的反应条件下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中 的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于可从改良分离特征获益的几乎任何其他多 肽，所述多肽包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗 体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、 T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、 MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核 细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、 SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、 组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤 坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长 因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌 激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良分离特征的基团改良多肽的水溶性；在其他实施 例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其他实施例中，所述基团向多肽提供新的结合 性质(包含(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在其中所述基团改良多肽 的水溶性的实施例中，基团是选自本文中描述的水溶性聚合物，其包含(仅举例来说) 本文中描述的PEG聚合物基团中的任一者。
I.添加官能基的实例：检测多肽的存在
天然存在或非天然氨基酸多肽在样本(包含活体内样本和活体外样本)中可因包含 (但不限于)缺乏可易于与多肽结合的试剂或标记的多种原因而难以检测。本文中描述 的方法、组合物、技术和策略提供这种情形的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽容许检测在活体内 样本和活体外样本中的多肽。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽是通过生物合成制 备。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸 中的一者中。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一 步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸多肽已经具有所需的检测 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸多肽包括至少一个选自由含肟的非天然氨 基酸、含羰基的非天然氨基酸以及含羟胺的非天然氨基酸组成的群组的非天然氨基酸。 在其他实施例中，这些非天然氨基酸已如本文中所述通过生物合成并入多肽中。在其他 或替代实施例中，非天然氨基酸多肽包括至少一个选自式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和 B)或XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基 酸包括与提供改良检测特征的基团的肟键。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进 一步修饰以形成经修饰的含肟的非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改良检测 特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他 实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基 团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上，在其他实施例中，需要一系列化学反应来 将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予改良检测特征的基团在所利用的反应条件 下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在 氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于在活体内样本和活体外样本中需要检测的 几乎任何其他多肽，所述多肽包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、 抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、 C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、 SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化 蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞 炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、 CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、 补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表 皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、 因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤 维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、 生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、 人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、 胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死 因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良检测特征的基团是选自由以下各物组成的群组： 标记；染料；亲和性标记；光亲和性标记；自旋标记；荧光团；放射性部分；结合有重 原子的部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致 密基团；磁性基团；发色团；能量转移剂；可检测标记，以及其任何组合。
J.添加官能基的实例：改良多肽的治疗性质
天然存在或非天然氨基酸多肽应能够向患有特定病症、疾病或病状的患者提供某一 治疗益处。此治疗益处应取决于多种因素，其包含(仅举例来说)：多肽的安全性概况， 以及多肽的药物动力学、药理学及/或药效学(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、 治疗半衰期、免疫原性、生物活性或循环时间)。另外，向多肽提供其他官能基可为有 利的，诸如连接的细胞毒性化合物或药物，或可能需要与其他多肽连接以形成本文中描 述的同型多聚体以及异型多聚体。优选这些修饰不破坏原始多肽的活性及/或三级结构。 本文中描述的方法、组合物、技术和策略提供这些问题的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽具有改良的治疗特 征。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽是通过生物合成制备。在另一或额外实施例 中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸中的一者中。在另一或额 外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良治疗 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括与提供改良治疗特征的基团的肟键。 在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进一步修饰以形成经修饰的含肟非天然氨基酸 多肽，其中所述修饰提供与提供改良治疗特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基 团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非 天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上， 在其他实施例中，需要一系列化学反应来将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予 改良分离特征的基团在所利用的反应条件下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中 的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于可从改良的治疗特征获益的几乎任何其他 多肽，所述包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、 载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、 NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、 降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋 化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、 SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、 组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤 坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长 因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌 激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良治疗特征的基团改良多肽的水溶性；在其他实施 例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其他实施例中，所述基团向多肽提供新的结合 性质(包含(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在其中所述基团改良多肽 的水溶性的实施例中，基团是选自本文中描述的水溶性聚合物，其包含(仅举例来说) PEG聚合物基团。在其他或额外实施例中，所述基团为细胞毒性化合物，而在其他实施 例中，所述基团为药物。在其他实施例中，键联的药物或细胞毒性化合物可从非天然氨 基酸多肽上裂解以将药物或细胞毒性化合物递送到所需治疗位置。在其他实施例中，所 述基团为第二多肽，其包含(举例来说)含肟的非天然氨基酸多肽，其进一步包含(举 例来说)具有与第一非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构的多肽。
在其他或额外实施例中，含肟的非天然氨基酸多肽为经修饰的含肟的非天然氨基酸 多肽。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸 多肽增加多肽的生物可用性。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽， 含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的安全性概况。在其他或额外实施例中，相对于同源 天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的水溶性。在其他或额外实施 例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的治疗半衰 期。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多 肽增加多肽的血清半衰期。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽， 含肟的非天然氨基酸多肽延长多肽的循环时间。在其他或额外实施例中，相对于同源天 然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽调节多肽的活性。在其他或额外实施例中， 相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
XI.经修饰多肽的治疗用途
为方便起见，这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽一般性及/或以特 定实例来描述。然而，这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽不应仅限于 这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非 天然多肽同样充分适用于所有包括至少一个处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以 及XXXX-XXXXIII的范畴内的氨基酸的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽，其包含 处于本文中的说明书、权利要求以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B) 以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽(包含其同型多聚体和异 型多聚体)存在多种用途，其包含(但不限于)：治疗用途、诊断用途、基于检定的用 途、工业用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。 作为非限制性说明，提供“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽适用于治疗多种病症、病 状或疾病。投与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品在人类中 产生由市售多肽制剂证实的任何活性。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品 的平均量可改变且尤其应根据合格医师的建议和处方而改变。“经修饰或未经修饰的” 非天然氨基酸多肽的确切量应优先根据以下因素选择：诸如所治疗的病状的确切类型、 所治疗的患者的病状，以及组合物中的其他成分。所欲给予的量可易于由所属领域的技 术人员根据使用“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的疗法确定。
A.投药和医药组合物
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽(包含其同型多聚体和异 型多聚体)存在多种用途，其包含(但不限于)：治疗用途、诊断用途、基于检定的用 途、工业用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。 作为非限制性说明，提供“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽适用于治疗多种病症。投 与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品在人类中产生由市售多 肽制剂证实的任何活性。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品的平均量可改 变且尤其应根据合格医师的建议和处方而改变。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸 多肽的确切量应优先根据以下因素选择：所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的病 状，以及组合物中的其他成分。所欲给予的量可易于由所属领域的技术人员根据使用“经 修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的疗法确定。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包含(但不限于)合成酶、 包括一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况用于治疗用途，其包含(但不限 于)与适合医药载剂组合。这些组合物(例如)包括治疗有效量的如本文中所述的经修 饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽，以及医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或 赋形剂包含(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇及/或其组合。进 行调配以适应投药模式。一般来说，投与蛋白质的方法为所属领域中所熟知且其可应用 于如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的投药。
根据所属领域中熟知的方法，包括一种或一种以上如本文中所述的经修饰或未经修 饰的非天然氨基酸多肽的治疗组合物视情况于一种或一种以上患病的适当活体外及/或 活体内动物模型中测试以确定功效、组织代谢和估算剂量。具体来说，剂量初始可由非 天然氨基酸相对天然氨基酸同源物(包含(但不限于)将经修饰以包含一个或一个以上 非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽加以比较)的活性、稳定性或其他适合量度(即， 在相关检定中)来测定。
投药是通过通常用于引入分子以最终与血液或组织细胞接触的途径中的任一者来 进行。如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以 上医药学上可接受的载剂一起以任何适合方式投与。可获得向患者投与如本文中所述的 经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的适合方法，且尽管可使用一种以上的途径投与 特定组合物，但特定途径通常可比另一种途径提供更直接以及更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂部分由所投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定 方法确定。因此，存在多种本文中描述的医药组合物的适合配方。
本文中描述的非天然氨基酸多肽和包括这些多肽的组合物可由适用于蛋白质或肽 的任何常规途径来投与，其包含(但不限于)非经肠投与，例如注射，其包含(但不限 于)皮下注射或静脉内注射或注射或输液的任何其他形式。多肽医药组合物(包含本文 中描述的各种非天然氨基酸多肽)可由众多途径来投与，其包含(但不限于)经口、静 脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包括如本文中所述的经 修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体来投与。这些投药途径和 适当配方通常为所属领域的技术人员所已知。本文中描述的非天然氨基酸多肽也可单独 或与其他适合组分(包含(但不限于)医药载剂)组合使用。
单独或与其他适合组分组合的如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸 多肽也可制成可通过吸入来投与的气溶胶配方(即，其可“雾化”)。气溶胶配方可置入 加压的可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮以及其类似物。
适用于非经肠投药(诸如，通过关节内(在关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹 膜内以及皮下途径)的配方包含水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂以及使配方与预定受体的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮 液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。经包装的核酸的配方可存 在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。
非经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治 疗剂的投药途径(包含(但不限于)通常用于EPO、IFN、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、 白细胞介素、抗体及/或任何其他医药递送蛋白质的那些投药途径)以及目前使用的配方 提供用于如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的优选投药途径和配 方。
在本文中描述的组合物和方法的情况下，投与到患者中的剂量足以随时间在患者中 产生有益治疗反应。剂量由特定配方的功效和所使用的经修饰或未经修饰的非天然氨基 酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状，以及所欲治疗的患者的体重或表面 积来确定。剂量大小也由在特定患者中投与特定配方或其类似物伴随的任何有害副作用 的存在、性质和程度来确定。
在确定在治疗或预防疾病(包含(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS或 其类似疾病)时所欲投与的配方的有效量时，医师评估循环血浆水平、配方毒性、疾病 的进展及/或(如果相关)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
投与至(例如)70公斤的患者中的剂量通常在等效于适于相关组合物的改变的活性 或血清半衰期的目前所用治疗蛋白质的剂量的范围内。本文中描述的医药配方可由任何 已知常规疗法(其包含抗体投药、疫苗投药、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核 苷酸类似物、生物反应调节剂以及其类似物的投药)来补充治疗状况。
对于投药来说，本文中描述的医药配方是以由相关配方的LD-50或ED-50及/或对 在各种浓度(其包含(但不限于)当应用于患者的质量和总体健康状况时)下经修饰或 未经修饰的非天然氨基酸多肽的任何副作用的观测确定的速率来投与。投药可通过单次 给药或分次给药来实现。
如果经历配方输液的患者出现发热、发冷或肌肉痛，那么使他/她接收适当剂量的阿 斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其他疼痛/发热控制 药物。使经历输液反应(诸如发热、肌肉痛以及发冷)的患者在未来以阿斯匹林、醋氨 酚或(包含，但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)输液之前提前30分钟用药。对 于对退热剂和抗组胺剂无迅速反应的更严重的发冷和肌肉痛，使用度冷丁(Meperidine)。 视反应的严重性来减缓或停止细胞输液。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可直接投与至哺乳动物受 检者。由通常用于将多肽引入受检者中的途径中的任一种进行投药。如本文中所述的经 修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽包含适用于经口、经直肠、局部、吸入(包含(但 不限于)通过气溶胶)、口腔(包含(但不限于)舌下)、经阴道、非经肠(包含(但不 限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、 局部(即，皮肤与黏膜表面，其包含气管表面)以及经皮投药的那些多肽，尽管在任何 给定情况下最适合的途径应视所治疗的病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身 性的。配方可存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。如本文中所述 的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可制备于与医药学上可接受的载剂的单位剂 量可注射形式(包含(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物中。如本文中所述的 经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽也可由连续输液(使用(包含，但不限于)诸如 渗透泵的微型真空泵)、单一大丸剂或缓慢释放储槽式配方来投与。
适于投药的配方包含水性和非水性溶液、等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂以及使配方等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮 剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒以及先前 描述种类的片剂来制备。
冻干为通常使用的呈现蛋白质的技术，其用来从所关注的蛋白质制剂中移除水。冷 冻干燥(Freeze-drying)或冻干(lyophilization)为首先将所欲干燥的物质冷冻且随后通 过在真空环境中升华来移除冰或冷冻溶剂的过程。赋形剂可包含于预先冻干的配方中以 增加冻干过程中的稳定性及/或改良冻干产物在储存时的稳定性。Pikal，M.Biopharm. 3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)：285-291(1991)。
药物的喷雾干燥也为所属领域的技术人员所已知。举例来说，参见Broadhead，J.等 人，″The Spray Drying of Pharmaceuticals，″Drug Dev.Ind.Pharm，18(11和12)，1169-1206 (1992)。除小分子药物之外，多种生物材料已经喷雾干燥且这些材料包含：酶、血清、 微生物和酵母。喷雾干燥为适用的技术，因为其可以一步法将液体药物制剂转变为精细、 无尘或凝聚的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a)将原料溶液雾化成喷雾；b)喷雾 -空气接触；c)使喷雾干燥；以及d)将经干燥的产物与干燥空气分离。美国专利第 6,235,710号和第6,001,800号(其是以引用的方式全部并入本文中)描述通过喷雾干燥 来制备重组红细胞生成素。
本文中描述的医药组合物可包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学 上可接受的载剂部分由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法确定。因 此，存在多种本文中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的医药组合物(视情 况包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的适合配方，(参见(例如)Remington： The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company， 1995)；Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton， Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第17版(Lippincott Williams & Wilkins，1999))。适合载剂包含缓冲剂，其含 有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐以及其他 有机酸；抗氧化剂，其包含(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，其包含(但不限于) 小于约10个残基的那些多肽；蛋白质，其包含(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫 球蛋白；亲水性聚合物，其包含(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，其包含(但不 限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷 氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，其包含(但不限于)海藻糖、蔗糖、 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，其包含(但不限于)EDTA；二价金属离子，其包含 (但不限于)锌、钴或铜；糖醇，其包含(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡 离子，其包含(但不限于)钠；及/或非离子表面活性剂，其包含(但不限于)TweenTM (包含(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM 以及其他普洛尼克酸(pluronic acid)(包含(但不限于)普洛尼克酸F68(帕洛沙姆188 (poloxamer 188)))或PEG。适合表面活性剂包含例如(但不限于)基于聚氧化乙烯- 聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(即，(PEO-PPO-PEO))，或聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙 烯(即，(PPO-PEO-PPO))，或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商 标名称PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.，Wyandotte，Mich.)市售且进一步描述于美国专利第4,820,352号(其是以引用的 方式全部并入本文中)中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适合的表面活性剂。表面活 性剂或表面活性剂的组合可用于抵抗一种或一种以上应力(包含(但不限于)来自搅拌 的应力)来稳定PEG化非天然氨基酸多肽。一些上述表面活性剂可被称作“膨胀剂”。 一些也可被称作“张力调节剂”。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包含键联到水溶性聚合物 (诸如PEG)上的那些非天然氨基酸多肽)也可由持续释放系统或作为持续释放系统的 部分来投与。持续释放组合物包含(包含，但不限于)为成形物品(其包含(但不限于) 薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包含生物相容性材料，诸如 聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)； Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，如前)或聚 -D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、 聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L- 谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556 (1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、 多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚 乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及聚硅氧。持续释放组合物也包含脂质体包封的化合物。 含有化合物的脂质体是由本身已知的方法制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，77： 4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专 利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。
脂质体包封的多肽可由以下文献中描述的方法来制备：例如，DE 3,218,121；Epstein 等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci. U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641； 日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。 脂质体的组成和大小为熟知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质 体的一些实例描述于(例如)Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331 (1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编)：MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)； Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy，在Teicher B(编)： CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)中；Park JW等人，Clin. Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。
在本文中描述的组合物、配方和方法的情况下投与至患者的剂量应足以随时间在受 检者中产生有益的反应。通常，每剂量非经肠投与的如本文中所述的经修饰或未经修饰 的非天然氨基酸多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01μg至约100μg，或 约0.05mg至约1mg的范围内，尽管其应经受治疗判断。给药频率也经受治疗判断，且 可比经批准用于人类的市售产品的频率更高或频率更低。通常，聚合物∶多肽接合物(包 含(仅举例来说)如本文中所述的PEG化多肽)可通过上述投药途径中的任一种来投与。
实例
实例1
这个实例详述图4中呈示的含羰基的氨基酸的合成。含羰基的非天然氨基酸是如图 4中所述制备。
实例2
这个实例详述图5a中呈示的经保护含羟胺的氨基酸的合成。经保护含羟胺的非天 然氨基酸是如图5a中所述制备。
实例3
这个实例详述图5b中呈示的含羟胺的氨基酸的合成。含羟胺的非天然氨基酸是如 图5b中所述制备。
实例4
这个实例详述图5c中呈示的含羟胺的氨基酸的合成。含羟胺的非天然氨基酸是如 图5c中所述制备。
实例5
这个实例详述图5d中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图5d 中所述制备。
实例6
这个实例详述图6a中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6a 中所述制备。
实例7
这个实例详述图6b中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6b 中所述制备。
实例8
这个实例详述图6c中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6c 中所述制备。
实例9
这个实例详述图24中呈示的含羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向NaOH溶液(40mL，25体积％)中添加乙醚(60mL)。将防爆屏蔽物 置于反应烧瓶前面。经3分钟分3份向所得混合物中添加N-亚硝基-N-甲基脲(6.0g， 57.9mmol)。在0℃下搅拌反应10分钟。随后使乙醚层与氢氧化钠层分离。经5分钟将 有机层逐份(约6次添加)添加到N-Boc-4-羟基甲基苯丙氨酸(7.5g，25.4mmol)于 无水THF(20mL)中的溶液中直至起始物质完全消失(由TLC监测)。随后添加5滴 冰乙酸以中止反应。通过旋转蒸发移除有机溶剂之后，添加乙酸乙酯。将有机层以 NaHCO3饱和溶液、H2O和盐水依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且浓缩以产生 呈白色粉末状的产物(5.9g，75％)。
的合成
在0℃下向醇(6.0g，19.4mmol)和吡啶(12mL，150mmol)于CH2Cl2(400mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin periodinane)(14.2g，33.4mmol)。 在室温下将混合物搅拌过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL) 中止且用CH2Cl2萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，1∶100-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈 白色固体状的醛产物(5.48g，92％)。
的合成
向醛(3.07g，10mmol)于EtOH(40mL)中的溶液中添加乙酸酰肼(1.7g，20mmol)。 将反应混合物在室温下搅拌30分钟且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加 CH2Cl2。将有机层分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯 化残余物得到呈白色固体状的产物(3.29g，90％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.29g，9.1mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌1小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止 反应且以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到白色固体(3.05g，96％)。
的合成
在0℃下向上述酸(3.02g，8.6mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)， 接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈黄色固 体状的产物(2.07g，83％)。
实例10
这个实例详述图25中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向胺(10g，34mmol)于DMF(70mL)中的经搅拌溶液中添加丙酮酸(5 mL，72mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC，20g，104mmol)、 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，85g，71mmol)以及N，N-二异丙基乙基胺(DIEA，35 mL，200mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时且随后以柠檬酸水溶液(5％，500mL) 中止且以EtOAc(500mL)萃取。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物 得到呈固体状的产物(4.78g，40％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(2.96g，8.1mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时。随后将反应以柠檬酸水溶液(5％) 中止且以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到呈黄色固体状的产物(2.87g，100％)。
的合成
在0℃下向上述酸(2.05g，5.9mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(10mL)。将混合物搅拌2小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl(1mL，4N， 于二噁烷中)，接着添加乙醚(400mL)。收集呈白色固体状的沉淀物(1.38g，82％)。
实例11
这个实例详述图26中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在90℃下向4′-甲基苯丙酮(20g，122mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，23g， 130mmol)于苯(300mL)中的溶液中添加2，2′-偶氮双异丁腈(AIBN，0.6g，3.6mmol)。 将所得溶液加热至回流过夜。随后将反应冷却至室温。将褐色溶液以H2O和盐水依次洗 涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物从己烷中结晶以得到呈 浅黄色固体状的产物(27g，87％)。
的合成
在0℃下向EtONa(14.5g，203mmol)于EtOH(400mL)中的溶液中添加乙酰胺 基丙二酸二乙酯(39g，180mmol)，接着添加上述溴化物(27g，119mmol)于EtOH (100mL)中的溶液。将所得混合物加热至回流历时1小时且以柠檬酸(30g)中止且 用H2O(300mL)稀释。在真空中移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机 层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速 色谱(硅石，10∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色固体状的产物(37g，88％)。
的合成
在0℃下向酮(5g，13.8mmol)于乙醚(100mL)中的溶液中添加Br2(0.8mL， 15.6mmol)。在室温下搅拌混合物3小时且随后以NaHCO3饱和水溶液中止。以Et2O萃 取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空 中浓缩以得到呈黄色固体状的产物(5.4g，88％)，其无需进一步纯化即可直接用于下个 步骤中。
的合成
向α-溴酮(5.4g，12.2mmol)和Na2CO3(2.0g，18.9mmol)于DMSO(20mL) 中的溶液中添加KI(2.1g，13.2mmol)。在90℃在氮气氛下搅拌混合物28小时。随后 将反应以H2O中止且以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，6∶1-1∶10己烷∶EtOAc) 纯化残余物以得到呈固体状的产物(1.12g，24％)。
的合成
将二酮(1.12g，3.0mmol)于浓HCl(10mL)和二噁烷(10mL)中的溶液加热 至回流过夜。在真空中移除溶剂后，添加MeOH(3mL)以溶解残余物。随后添加乙醚 (300mL)以沉淀呈浅黄色固体状的产物(302mg，42％)。
实例12
这个实例详述图27中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向C3H7MgCl(2M，50mmol)于乙醚(25mL)中的溶液中添加于乙醚(50 mL)中的苯甲醛(5mL，42.5mmol)。在0℃下搅拌所得溶液30分钟。随后将反应以 NH4Cl饱和溶液中止且以乙醚稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无 水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到粗产物(7.2g)，其无需纯化即可直接用于 下个反应中。
的合成
在0℃下向上述醇(7.2g，43.9mmol)和吡啶(7mL，86.7mmol)于CH2Cl2(300 mL)中的溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(19.2g，45.3mmol)。将所得混合物搅拌过夜且 以Na2S2O3饱和水溶液和NaHCO3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O和盐水依 次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，8∶1-4∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的产物(6.28g，对于两个步骤为91％)。
的合成
在90℃下向上述酮(4.43g，27.3mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，5.5g，30.9 mmol)于苯(150mL)中的溶液中添加2，2′-偶氮双异丁腈(AIBN，0.2g，1.2mmol)。 将所得溶液加热至回流过夜且随后冷却至室温。将褐色溶液以H2O和盐水依次洗涤，随 后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物从己烷中结晶以得到呈白色固 体状的产物(6.21g，95％)。
的合成
在0℃下向EtONa(2.5g，34.9mmol)于EtOH(200mL)中的溶液中添加乙酰胺 基丙二酸二乙酯(6.7g，30.9mmol)，接着添加上述溴化物(6.2g，25.8mmol)于EtOH (100mL)中的溶液。将所得混合物加热至回流历时1小时且随后以柠檬酸(9g)中 止且以H2O稀释。移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机层以H2O和盐水 依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，4∶1-2∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅黄色固体状的产物(8.92g，92％)。
的合成
向上述酮(1.4g，3.71mmol)于HOAc(50mL)中的溶液中添加Br2(0.7mL，13.6 mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜且随后以NaHCO3饱和水溶液中止。以Et2O萃取混 合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，5∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈黄色固体状的产物 (1.23g，73％)。
的合成
向α-溴酮(1.12g，2.46mmol)和Na2CO3(0.4g，3.77mmol)于DMSO(30mL) 中的溶液中添加KI(0.45g，13.2mmol)。将混合物在90℃下搅拌过夜且随后以柠檬酸 (2g)和H2O(200mL)中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗 涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，6∶1-1∶10己 烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈油状的α-羟基酮(0.62g，64％)。
在0℃下向上述醇(0.62g，1.58mmol)和吡啶(0.5mL，6.19mmol)于CH2Cl(100 mL)中的溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.9g，2.12mmol)。将所得混合物搅拌过夜且 随后以Na2S2O3饱和水溶液和NaHCO3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O和盐 水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石， 9∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈黄色油状的产物(287mg，对于两个步骤为 30％)。
的合成
将上述二酮(272mg，0.7mmol)于浓HCl(10mL)和二噁烷(10mL)中的混合 物加热至回流过夜。在真空中移除溶剂后，添加MeOH(1mL)以溶解残余物。随后添 加乙醚(200mL)以沉淀呈黄色固体状的产物(162mg，81％)。
实例13
这个实例详述图28中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。这些化合物是如图28中所 示来合成。
实例14
这个实例详述经修饰多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。使用包括正交tRNA (O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻译系统表达含有非天然 氨基酸的多肽。O-RS优先以非天然氨基酸氨酰基化O-tRNA。接下来，翻译系统将非天 然氨基酸插入多肽中，以回应编码选择密码子。氨基酸和适用于并入非天然氨基酸的 O-tRNA和O-RS的聚核苷酸序列描述于标题为“In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids”的美国专利申请案第10/126,927号以及标题为“Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs”的美国专利申请案第 10/126,931中，这些文献是以引用的方式并入本文中。也可使用以下O-RS和O-tRNA 序列：
SEQ ID NO：1 詹氏甲烷球菌mtRNACUA Tyr tRNA SEQ ID NO：2 HLAD03；优化的琥珀抑制tRNA tRNA SEQ ID NO：3 HL325A；优化的AGGA移码抑制 tRNA tRNA SEQ ID NO：4 用于并入对叠氮基-L-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(6) RS SEQ ID NO：5 用于并入对苯甲酰基-L-苯丙氨酸 的氨酰基tRNA合成酶 p-BpaRS(1) RS SEQ ID NO：6 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：7 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：8 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：9 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(1) RS SEQ ID NO：10 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(3) RS SEQ ID NO：11 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(4) RS SEQ ID NO：12 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(2) RS SEQ ID NO：13 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 RS
氨酰基tRNA合成酶 (LW1) SEQ ID NO：14 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (LW5) RS SEQ ID NO：15 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (LW6) RS SEQ ID NO：16 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (AzPheRS-5) RS SEQ ID NO：17 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (AzPheRS-6) RS
以含有经修饰基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然氨基酸具有 特异性)的质粒转化大肠杆菌容许将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中。在37℃下在 含有介于0.01mM-100mM之间的特定非天然氨基酸的培养基中生长的经转化的大肠杆 菌以高度的保真性和效率表达经修饰的多肽。经His标记的含有非天然氨基酸的多肽是 由大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体形式产生。这些聚集体在变性条件下在6M盐酸 胍中溶解且经亲和纯化。在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)N- 十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)中在4℃下通过透析进行再折叠过夜。随后将所述物质以 20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接着移除His-标签。参 见Boissel等人，J.Biol.Chem.，(1993)268：15983-93。用于纯化多肽的方法在所属领域中 为熟知的且由SDS-PAGE、西方墨点分析或电喷雾电离离子阱质谱以及其类似方法确认。
实例15：测试非天然氨基酸
此实例提供对某些说明性非天然氨基酸进行的四次测试的结果，以有助于预测其并 入非天然氨基酸多肽中的性质。
实例16：测试非天然氨基酸
此实例提供对某些说明性非天然氨基酸进行的pH值稳定性测试的结果，以有助于 预测其并入非天然氨基酸多肽中的性质。
实例17
这个实例详述图29中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向氨基酸pAF(10g，41.1mmol)于H2O-二噁烷(300mL，1∶1)中的溶液中添加 NaHCO3(12g，142.9mmol)和Boc2O(12g，55.0mmol)。将混合物在室温下搅拌7 小时且随后以柠檬酸中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤， 随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到呈白色固体状的N-Boc-pAF(13.7g，定量)。
的合成
在0℃下向NaOH(40mL，25体积％)中添加乙醚(60mL)。将防爆屏蔽物置于 反应烧瓶前面。经3分钟分3份向所得混合物中添加N-亚硝基-N-甲基脲(6.0g，57.9 mmol)。在0℃下搅拌反应10分钟。随后使乙醚层与氢氧化钠层分离。经5分钟将有机 层逐份(约6次添加)添加到N-Boc-pAF(5.0g，16.2mmol)于无水THF(20mL)中 的溶液中直至起始物质完全消失(由TLC监测)。随后添加5滴冰乙酸以中止反应。通 过旋转蒸发移除有机溶剂之后，添加乙酸乙酯。将有机层以NaHCO3饱和溶液、H2O和 盐水依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且浓缩以产生白色粉末(4.1g，80％)。
的合成
向t-BuOK(60mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(3.82g，11.9mmol) 于新蒸馏的丙酸甲酯(20mL，208mmol)中的溶液。在室温下搅拌所得混合物30分钟 且以柠檬酸溶液(10％，300mL)中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐 水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，4∶1-1∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的产物(3.89g，87％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.12g，2.97mmol)于二噁烷(4mL)中的溶液中添加LiOH (4mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌3小时且以柠檬酸水溶液(5％，200mL)中止且 以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且浓缩以得到白色固体(1.02g，94％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.0g，2.75mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(10mL)。将混合物在0℃下搅拌2小时且随后浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)， 接着添加HCl(1.5mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固 体状的产物(701mg，96％)。
实例18
这个实例详述图30中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.09g，3.4mmol) 于二氟乙酸甲酯(6mL，68.7mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌30分钟且 以柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以 H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石， 20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅褐色固体状的产物(1.27g，94％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.26g，3.17mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)中止且 以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到褐色油(1.19g，98％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.19g，3.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物搅拌0.5小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)，接着添 加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体状的产 物(0.82mg，82％)。
实例19
这个实例详述图12a中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12a中所述制备。
实例20
这个实例详述图12b中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12b中所述制备。
实例21
这个实例详述图12c中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12c中所述制备。
实例22
这个实例详述图12d中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12d中所述制备。
实例23
这个实例详述图13中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 13中所述制备。
实例24
这个实例详述图14中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 14中所述制备。
实例25
这个实例详述图15中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 15中所述制备。
实例26
这个实例详述图16a中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图16a中所述制备。
实例27
这个实例详述图16b中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图16b中所述制备。
实例28
这个实例详述图18中呈示的含羟胺的连接子试剂的合成。含羟胺的连接子试剂是 如图18中所述制备。
实例29
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(1)的合成。在氮气压 力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加对甲苯基二硫化物(5.0g，20.3 mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(8.6g，48.4mmol)和60mL无水苯。将溶液加热至95℃。 以一份添加偶氮双异丁腈(.106g，.64mmol)。将反应回流16小时。通过旋转蒸发移除 溶剂且将褐色固体溶解于100mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、去 离子水(1×50mL)和盐水(1×50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫 酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色 谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的1，2- 双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(2.1g，25％)。获得1H NMR光谱数据和质谱。重复反应以 得到(2.0g，23％)的产物。
实例30
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基丙二酸酯)苯基二硫烷(2) 的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加乙酰胺基丙二酸二 乙酯(6.48g，30mmol)和50mL无水EtOH。以一份向溶液中添加乙氧化钠(2.6g， 38mmol)。将反应冷却到0℃。将1，2-双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(4.1g，10.1mmol)溶 解于20mL 1∶1EtOH/THF中且通过加料漏斗经1小时的过程添加到冷溶液中。移除冰浴 且在室温下搅拌反应6小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将红色固体溶解于100mL乙酸 乙酯中。以5％柠檬酸溶液(2×50mL)、去离子水(1×50mL)和盐水(1×50mL)依次 洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用 Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量 溶剂(真空泵)后，得到呈黄色固体状的1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基丙二酸酯)苯基二 硫烷(5.0g，73％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例31
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(3)的合成。在 氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基 丙二酸酯基)苯基二硫烷(1.0g，1.4mmol)、HCl(8mL，12M)和8mL 1，4-二噁烷。 在回流下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发和真空泵移除溶剂以得到呈透明油状的粗1，2- 双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.75g，135％)。获得1H NMR光谱数据和质谱。
实例32
这个实例详述图36中呈示的N，N′-二叔丁氧羰基-1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫 烷(4)的合成。向于干燥圆底烧瓶中的1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.75g， 1.9mmol)中添加5mL 1，4-二噁烷、5mL去离子水、二碳酸二叔丁酯(.65g，3.0mmol) 和碳酸氢钠(0.98g，12mmol)。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且 将透明油溶解于100mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(5mL×2)、去离子水(50mL) 和盐水(50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在 减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓 缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N，N′-二叔丁氧羰基-1，2- 双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.5g，从粗产物为44％，经2个步骤为52％)。获得 1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例33
这个实例详述图36中呈示的N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸(5)的合成。 在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N，N′-二叔丁氧羰基-1，2-双 (4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.5g，0.84mmol)、正丁基膦(0.6mL，2.44mmol) 和15mL无水THF。在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解 于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(2×25mL)、去离子水(25mL)和盐水(25mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸 (0.5g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例34
这个实例详述图36中呈示的2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸盐酸盐(6)的合成。向具 有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸(.5 g，1.6mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温下搅拌反应2小时。通过 旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随 后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸盐酸盐(0.39 g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例35
这个实例详述图37中呈示的2-(4-(2-氧代丙硫基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯 (7)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加(2)(1.1g， 1.6mmol)、n-Bu3P(1.2mL，4.8mmol)和25mL无水THF(25mL)。在室温下搅拌反 应2小时。向反应中添加氯丙酮(0.16mL，2.0mmol)和NaHCO3(0.98g，12mmol)。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100mL乙酸乙 酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL)依次 洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用 Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量 溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的2-(4-(2-氧代丙硫基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二 乙酯(0.62g，98％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例36
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(8)的合成。在 氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加7(0.62g，1.5mmol)、10mL 1，4-二噁烷和10mL 12M HCl。使反应回流且搅拌过夜。通过旋转蒸发移除溶剂以产生 3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.40g，99％粗产物)。
实例37
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸 (9)的合成。在氮气压力下向于具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中的8(0.35g， 1.3mmol)中添加二碳酸二叔丁酯(0.63g，3.0mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、 8mL 1，4-二噁烷和8mL去离子水。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂 且将透明油溶解于100mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(50mL×2)、去离子水(50mL) 和盐水(50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在 减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓 缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2- 氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.30g，从粗产物为66％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC 迹线以及质谱。
实例38
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基 丙酸(10)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加9(150 mg，.4mmol)、8mL冰乙酸和2mL于水中的30％v/v过氧化氢。在室温下搅拌反应2 小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液 (25mL×2)、去离子水(25mL)和盐水(25mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分 离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱 系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到N- 叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.13g，86％粗产物)。获得 HPLC迹线和质谱。
实例39
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(11)的 合成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚 磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸10(0.13g，0.35mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙 酸。在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的 4.0M氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的 3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.072g，从粗产物为74％)。获得1H NMR 光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例40
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙 酸(12)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加9(150mg， 0.4mmol)、8mL冰乙酸和2mL于水中的30％v/v过氧化氢。在室温下搅拌反应24小 时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(25 mL×2)、去离子水(25mL)和盐水(25mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经 无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的 硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到N-叔丁氧羰 基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(12)(0.13g，86％粗产物)。获得HPLC 迹线和质谱。
实例41
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(13)的合 成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰 基)苯基)-2-氨基丙酸12(0.13g，0.35mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M 氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2- 氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.067g，从粗产物为65％)。获得1H NMR光谱数 据、HPLC迹线以及质谱。
实例42
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(14)的合成。 向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙硫基)苯 基)-2-氨基丙酸9(0.10g，.28mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温 下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。 简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2-氧代丙硫 基)苯基)-2-氨基丙酸(0.062g，从粗产物为85％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线 以及质谱。
实例43
这个实例详述图38中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙 酸(15)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加5(0.15g， 0.76mmol)、2-氯环戊酮(0.12mL，1.25mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、15mL 无水THF。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100 mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫基) 苯基)-2-氨基丙酸(0.15g，51％)。获得HPLC迹线和质谱。
实例44
这个实例详述图38中呈示的3-(4-(2-氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙酸(16)的合 成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫 基)苯基)-2-氨基丙酸15(0.15g，0.39mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M 氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2- 氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.108g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC 迹线以及质谱。
实例45
这个实例详述图38中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2-氨基丙酸 (18)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加5(0.15g， 0.76mmol)、1-溴-2-丁酮(0.12mL，1.25mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、15mL 无水THF。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100 mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2- 氨基丙酸(0.15g，51％)。获得HPLC迹线和质谱。
实例46
这个实例详述图38中呈示的化合物19-22的合成。化合物19-22是使用类似于关于 化合物10-14所述的方法来合成。
实例47
这个实例详述图38中呈示的3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2-氨基丙酸(23)的合成。 向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯 基)-2-氨基丙酸18(0.15g，.56mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温 下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。 简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2-氧代丁硫 基)苯基)-2-氨基丙酸(0.149g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例48
这个实例详述图39中呈示的化合物24-27的合成。化合物24-27是使用类似于关于 化合物10-14所述的方法来合成。
实例49
这个实例详述图31中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.0g，3.1mmol) 于三氟乙酸甲酯(5mL，50mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌30分钟且以 柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以EtOAc稀释。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随 后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化 残余物以得到呈浅褐色固体状的产物(1.07g，83％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.0g，2.4mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)中止且 以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到褐色油(0.87g，98％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.0g，2.5mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将所得混合物搅拌0.5小时且在真空中浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)， 接着添加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体 状的产物(0.56g，75％)。
实例50
这个实例详述图32中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.0g，3.1mmol) 于五氟丙酸甲酯(8mL，62mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌1小时且以 柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以H2O(100mL)稀释。移除大部分溶剂后，以EtOAc 萃取残余物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅褐色固体状的产物 (1.1g，76％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.0g，2.1mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。在0℃下将所得混合物搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)以 及H2O中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到呈黄色固体状的产物(0.8g，84％)。
的合成
在0℃下向上述酸(0.7g，2.5mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物在相同温度下搅拌0.5小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)， 接着添加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体 状的产物(0.62g，70％)。
实例51
这个实例详述图33中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向醇1(2.35g，7.6mmol)和吡啶(1.5mL，18.6mmol)于CH2Cl2(150mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(3.5g，8.3mmol)。将混合物在室温下搅拌过 夜且以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2稀释。将有机层 分离且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速 色谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的醛2(2.15g，92％)。 ESI-MS，m/z：292(M+-OH)，232，204，175，131，115(100)。
的合成
在0℃下向二异丙胺(0.33mL，2.33mmol)于THF(60mL)中的经搅拌溶液中添 加正丁基锂(1.46mL，2.34mmol)。在0℃下将混合物搅拌20分钟且冷却至-78℃且随 后添加环戊酮。在-78℃下将混合物搅拌20分钟后，添加醛2(0.5g，1.63mmol)于THF (20mL，以20mL洗涤)中的溶液。在-78℃下将所得混合物搅拌1.0小时且以NH4Cl 饱和水溶液中止。移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机层以H2O和盐水 洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，10∶1-1∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的3(482mg，80％)。
的合成
在0℃下向醇3(0.44g，1.13mmol)和吡啶(0.6mL，7.44mmol)于CH2Cl2(150 mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.6g，1.41mmol)。将混合物在室温下 搅拌过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2萃 取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-2∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的二酮4 (342mg，78％)。ESI-MS，m/z：412(M++Na)，356，312，230，212，184，146(100)。
的合成
在0℃下向甲酯4(330mg，0.85mmol)于二噁烷(4mL)中的溶液中添加LiOH (4mL，1N)。在0℃下将所得混合物搅拌30分钟且以柠檬酸水溶液(5％，100mL) 中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到白色固体(310mg，97％)。ESI-MS，m/z：342，330(M+-COOH)，298， 230，185，119(100)。
的合成
在0℃下向酸5(310mg，0.83mmol)于CH2Cl2(4mL)中的溶液中添加三氟乙酸 (4mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟且在真空中浓缩。向残余物中添加MeOH(1 mL)，接着添加HCl(1mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(100mL)以沉淀呈白 色固体状的产物(241mg，94％)。ESI-MS，m/z：298(M++Na)，276(M++1)，230(M+- COOH)，184，119(100)。
实例52
这个实例详述图34中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向醇(6.0g，19.4mmol)和吡啶(12mL，150mmol)于CH2Cl2(400mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(14.2g，33.4mmol)。将混合物在室温下搅拌 过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL)中止且以CH2Cl2萃取。 将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，1∶100-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的醛(5.48 g，92％)。
的合成
向上述醛(3.41g，11.1mmol)于丙酮(70mL)中的溶液中添加于H2O(10mL) 中的KMnO4(2.5g，15.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。移除大部分溶剂后， 将残余物溶解于柠檬酸水溶液(5％，300mL)中且以EtOAc萃取。将有机层组合且以 H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到呈白色固体状 的产物(2.83g，79％)，其无需进一步纯化即可直接用于下个步骤中。
的合成
在0℃下向上述酸(2.83g，8.76mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加1-氨基 -2-丙醇(1.4mL，17.9mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC， 4.1g，21.4mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，2.2g，18.5mmol)和N，N-二异丙 基乙基胺(DIEA，9mL，51.6mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜且随后以柠檬酸水溶 液(5％，200mL)中止且以EtOAc萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，10∶1-1∶1己烷∶EtOAc) 纯化残余物得到呈白色泡沫状的产物(2.45g，74％)。
的合成
在0℃下向上述醇(2.44g，6.4mmol)和吡啶(4mL，49.6mmol)于CH2Cl2(100 mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(4.1g，9.7mmol)。将混合物在室温下搅 拌过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL)中止且以CH2Cl2萃取。 将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快 速色谱(硅石，1∶1-1∶3己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色固体状的产物(1.84g，76％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.72g，4.6mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且以柠檬酸水溶液(5％)中止。以 EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩以得到呈固体状的产物(1.7g)，其无需纯化即可直接用于下个步骤中。
在0℃下向上述酸(1.7g，4.7mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物在相同温度下搅拌2小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl (1.5mL，4N，于二噁烷中)，接着添加乙醚(400mL)。收集呈白色固体状的沉淀产 物(1.52g，对于2个步骤为90％)。
实例53
这个实例详述图44中呈示的含酰肼的氨基酸的合成。
的合成
向醛(410mg，1.34mmol)于EtOH(15mL)中的溶液中添加甲酸酰肼(170mg， 2.83mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。移除大部分溶剂后，以CH2Cl2萃取残 余物。将有机层组合且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，1∶6-1∶1己烷∶EtOAc)纯化 残余物得到白色固体(390mg，83％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(349mg，1mmol)于二噁烷(7mL)中的溶液中添加LiOH (7mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌10分钟且以柠檬酸(2.5g)中止且以H2O 萃取。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到白色固体(290mg，87％)。
的合成
在0℃下向上述酸(290mg，0.87mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(20mL)。将混合物搅拌20分钟且浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)，接着添 加HCl(1.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈浅黄色固体状 的产物(195mg，83％)。
实例54
这个实例详述图45中呈示的含酰肼的氨基酸的合成。
的合成
向N-叔丁氧羰基-4-羟基甲基苯丙氨酸(11.73g，39.8mmol)于DMF(100mL)中 的溶液中添加丙氨酸甲酯盐酸盐(9.0g，64.5mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳化 二亚胺盐酸盐(EDC，15.4g，80.3mmol)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA，30mL，172mmol) 和1-羟基苯并唑水合物(HOBt，8.4g，70.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜 且随后以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O、柠檬酸(5％)、H2O、NaHCO3、H2O 和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到呈白色固体状的经保护 二肽(13.74g，91％)。
的合成
在0℃下向上述经保护二肽(10.33g，27.2mmol)于CH2Cl2(300mL)中的溶液 中添加吡啶(8mL，99.1mmol)和戴斯-马丁过碘烷(14g，33.0mmol)。将反应混合 物搅拌过夜且随后以NaHCO3/Na2S2O3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O、柠檬 酸、H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅 石，9∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的产物(10.12g，98％)。
的合成
向二肽醛(10.1g，26.7mmol)于EtOH(200mL)中的溶液中添加乙酸酰肼(3.7g， 45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟且浓缩。向残余物中添加H2O(1L)和 CH2Cl2(500mL)。将有机层分离且浓缩以得到白色固体(11.21g，97％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(11.1g，25.6mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液中添加LiOH (50mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌30分钟且随后以柠檬酸(20g)中止且以 H2O(200mL)稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后 经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到白色固体(9.52g，88％)。
的合成
在0℃下向上述酸(9.5g，22.6mmol)于CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(50mL)。将混合物在0℃下搅拌1小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl(7mL， 4N，于二噁烷中)，接着添加乙醚(500mL)。收集呈白色固体状的沉淀物(7.25g，90％)。
实例55
这个实例详述图46A中呈示的含肟的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量羟胺盐酸盐。将反应混合物在室 温下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有机层 分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生呈固 体状的产物(96％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。在0℃下将反应混合物搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(87％)。
实例56
这个实例详述图46B中呈示的含肟的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量甲氧基胺盐酸盐。将反应混合物 在室温下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有 机层分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生 呈固体状的产物(93％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(89％)。
实例57
这个实例详述图46C中呈示的含肼的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量甲基肼。将反应混合物在室温下 搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有机层分离 且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生呈固体状 的产物(93％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(89％)。
实例58
这个实例详述图48A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。将混合物在室温下搅拌15小时。添加乙醚 (200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0 g，100％)。
的合成
向3-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(1.75g，10mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(3.2g，20mmol)、三苯基膦(2.0g，15mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，2.0mL，10.5mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜且浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(100mL)、H2O (100mL)和盐水(100mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1己烷∶EtOAc)纯化粗产物以得到呈白色固体状的 标题化合物(2.6g，81％)。
的合成
向经叔丁氧羰基保护的连接子(2.0g，9.1mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl (4N，于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(1.1g，85％)。
的合成
向mPEG(30K)对硝基苯酚碳酸酯(1.0g，0.033mmol)和胺连接子(53mg，0.21 mmol)于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的的混合物中添加二异丙基乙基胺(50μL，0.28 mmol)和DMAP(5mg，0.041mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(0.83g， 83％)。
的合成
向mPEG邻苯二甲酰亚胺(30K，0.8g，0.0266mmol)于MeOH(5mL)中的溶液 中添加肼(8.5μL，0.27mmol)。在45℃下搅拌所得混合物1.0小时。在反应冷却至室 温后，添加CH2Cl2(150mL)且以HCl水溶液(0.1N，100mL)洗涤溶液。以CH2Cl2 (150mL)萃取水层。将有机层组合且以H2O(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈 白色粉末状的羟胺产物(0.72g，90％)。
实例59
这个实例详述图48B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向2-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(2.8mL，18mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5.8g，36mmol)、三苯基膦(3.6g，27mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，3.6mL，19mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜并浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、 H2O(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空中 浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的快速色谱纯化粗产物以得到呈白色 固体状的含有杂质的标题化合物(12g，206％)。
的合成
向粗的经叔丁氧羰基保护的连接子(12g)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl(4N， 于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空 中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(3.0g，对于两个步骤为68％)。
的合成
向mPEG(30K)对硝基苯酚碳酸酯(1.0g，0.033mmol)和胺连接子(50mg，0.21 mmol)于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(50μL，0.28 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(4mg，0.033mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状 的产物(0.81g，81％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.8g，0.0266mmol)于MeOH(5mL)中的溶液 中添加肼(8.5μL，0.27mmol)。在45℃下搅拌所得混合物1.0小时。在反应冷却至室 温后，添加CH2Cl2(150mL)且以HCl水溶液(0.1N，100mL)洗涤溶液。以CH2Cl2 (150mL)萃取水层。将有机层组合且以H2O(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈 白色粉末状的羟胺产物(0.68g，85％)。
实例60
这个实例详述图49A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(4.0g，15.0mmol)于DMF(50mL)中 的溶液中添加K2CO3(10g，73mmol)和N-羟基氨基甲酸叔丁酯(2.5g，18.8mmol)。 在室温下搅拌反应混合物3小时。将混合物以H2O稀释(200mL)且以EtOAc(200mL) 萃取。将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的产物(3.5g， 72％)。
的合成
向上述邻苯二甲酰亚胺(500mg，1.6mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加肼 (0.25mL，8.0mmol)。在室温下搅拌所得混合物3小时。移除沉淀物后，浓缩滤液。 将残余物留在高真空中过夜。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1EtOAc∶MeOH)纯化残余物 得到呈白色固体状的胺连接子(252mg，85％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色固体状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于无水CH2Cl2(30mL)中的溶液中添 加二异丙基乙基胺(88μL，0.5mmol)和胺连接子(76mg，0.4mmol)。在室温下搅拌 所得混合物15小时。添加乙醚(700mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗 涤且在真空中干燥以得到白色粉末(2.8g，93％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于无水CH2Cl2 (10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加 乙醚(500mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白 色粉末(1.8g，90％)。
实例61
这个实例详述图49B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向N-羟基氨基甲酸叔丁酯(5.0g，37.6mmol)于DMF(30mL)中的溶 液中添加K2CO3(12g，87.6mmol)和N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(10.0g，39.7mmol)。 在室温下搅拌反应混合物3小时。将混合物以H2O稀释(200mL)且以EtOAc(200mL) 萃取。将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的产物(5.2 g，55％)。
的合成
向上述邻苯二甲酰亚胺(500mg，1.6mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加肼 (0.25mL，8.0mmol)。在室温下搅拌所得混合物3小时。移除沉淀物之后，浓缩滤液。 将残余物留在高真空中过夜。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1EtOAc∶MeOH)纯化残余物 得到呈白色固体状的胺连接子(301mg，86％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(4mg，0.033mmol)和 上述胺连接子(64mg，0.31mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。添加乙醚(200 mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(0.85 g，85％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.85g，0.028mmol)于无水CH2Cl2 (10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加 乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白 色粉末(0.68g，80％)。
实例62
这个实例详述图50A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向单叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(2.1g，6.9mmol)于吡啶(50mL)中的 溶液中添加Boc2O(3.3g，15.1mmol)。将所得混合物加热至60℃过夜。在真空中移除 溶剂后，将残余物以EtOAc(200mL)稀释且以柠檬酸(5％，200mL)、水(200mL) 和盐水(200mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色 谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色油状的产物(2.37g，85％)。
的合成
在0℃下向二叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.21g，2.98mmol)于MeOH(15mL) 中的溶液中添加于MeOH中的氨(15mL，7N，105mmol)。在室温下搅拌所得混合物 过夜。滤出沉淀物且在真空中浓缩滤液。通过快速色谱(硅石，10∶1-6∶4EtOAc∶MeOH) 纯化残余物得到呈白色固体状的胺连接子(0.61g，74％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)以沉淀mPEG(30K)产物。将产物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥(1.0g，100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(5mg，0.041mmol)和 上述二叔丁氧羰基胺连接子(90mg，0.33mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(0.82g，82％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.82g，0.027mmol)于无水CH2Cl2 (8mL)中的溶液中添加三氟乙酸(8mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加乙 醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.57g，70％)。
实例63
这个实例详述图50B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向单叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.5g，4.7mmol)于吡啶中的溶液中添 加Boc2O(2.2g，10.0mmol)。将所得混合物加热至60℃过夜。在真空中移除溶剂后， 将残余物以EtOAc(200mL)稀释且以柠檬酸(5％，200mL)、水(200mL)和盐水(200 mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈油状的产物(1.6g，81％)。
的合成
在0℃下向二叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.5g，3.6mmol)于MeOH(15mL)中 的溶液中添加于MeOH中的氨(15mL，7N，105mmol)。在室温下搅拌所得混合物过 夜。滤出沉淀物且在真空中浓缩滤液。通过快速色谱(硅石，10∶1-6∶4EtOAc∶MeOH) 纯化残余物得到呈白色固体状的胺连接子(0.85g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(5mg，0.041mmol)和 上述二叔丁氧羰基胺连接子(100mg，0.34mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(0.89g，89％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.89g，0.030mmol)于无水CH2Cl2 (8mL)中的溶液中添加三氟乙酸(8mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加乙 醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.65g，73％)。
实例64
这个实例详述图51A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，86％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例65
这个实例详述图51B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以水和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。将 沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，85％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例66
这个实例详述图52A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。在室温下搅拌混合物10小 时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。在室温下搅拌所得混合物3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液中 添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将 沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，86％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例67
这个实例详述图52B中呈示的mPEG4-羟胺的合成。
的合成
向mPEG丙醛(30K，0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于 MeOH(10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得 混合物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例68
这个实例详述图53A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2(500 mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在 真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例69
这个实例详述图53B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10 小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例70
这个实例详述图54A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例71
这个实例详述图54B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合 物中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例72
这个实例详述图55中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC，190mg，1.0mmol) 和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以EtOAc (500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O(300mL)和 盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物 溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真 空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合 物中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例73
这个实例详述图56A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例74
这个实例详述图56B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例75
这个实例详述图57中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10 小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。在室温下搅拌所得混合物3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例76
这个实例详述图58A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
mPEG(5K)-OMs的合成
向mPEG(5K)-OH(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(40mL)中的溶液中添加三乙胺(110 μL，0.79mmol)和MsCl(50μL，0.64mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且浓缩。 粗产物(1.0g)无需纯化即可直接用于下个步骤中。
mPEG(5K)-O-NHBoc的合成
向粗mPEG(5K)-OMs(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加叔丁 基-N-羟基氨基甲酸酯(0.3g，2.2mmol)和三乙胺(0.4mL，2.9mmol)。将所得混合 物在45℃下搅拌10小时且冷却至室温。添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色固体状的产物(0.42，42％)。
mPEG(5K)-O-NH 3 + Cl - 的合成
在℃下向mPEG(5K)-ONHBoc(0.2g，0.04mmol)于CH2Cl2(3mL)中的溶液中 添加三氟乙酸(7mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的PEG二羟胺衍生物(170mg，85％)。
实例77
这个实例详述图58B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
mPEG(30K)-OTf的合成
向mPEG(30K)-OH(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加2，6-二 甲基吡啶(60μL，0.5mmol)和Tf2O(65μL，0.4mmol)。在室温下搅拌混合物10小 时。添加乙醚(400mL)至混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(2.7g，90％)。
mPEG(30K)-O-NHBoc的合成
向mPEG(30K)-OTf(2.5g，0.083mmol)于CH2Cl2(25mL)中的溶液中添加N- 羟基氨基甲酸叔丁酯(110mg，0.84mmol)和二异丙基乙基胺(0.2mL，1,1mmol)。 在室温下搅拌混合物过夜。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的产物(2.2g，88％)。
mPEG(30K)-O-NH 3 + Cl - 的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)-ONHBoc(2.0g，0.067mmol)于CH2Cl2(15mL)中 的溶液中添加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的PEG二羟胺衍生物(1.72g，86％)。
实例78
这个实例详述图59A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向2-(2-羟基乙氧基)邻苯二甲酰亚胺(0.5g，2.4mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶 液中添加光气(20％(于甲苯中)，8.0mL，15.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10 小时且在真空中浓缩。残余物(0.45g，70％)无需纯化即可直接用于下个反应。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(3g，0.1mmol)和氯甲酸酯连接子(0.27g，1.0mmol)于CH2Cl2 (30mL)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(0.2mL，1.1mmol)。将所得混合物在室 温下搅拌15小时。添加乙醚(500mL)至混合物中。将沉淀物过滤、洗涤且在真空中 干燥以得到呈白色固体状的产物(2.7g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(2.1g，0.07mmol)于MeOH(15mL)中的溶液中 添加氨(7N，于甲醇中，15mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余 物中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的产物(2.4g，89％)。
实例79
这个实例详述图59B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向(叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸(3.0g，16mmol)于CH2Cl2(80mL)中的溶液 中添加N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC，1.3mL，8mmol)。将混合物在室温下搅拌1 小时且在真空中浓缩。粗产物(4.9g，84％)无需进一步纯化即可直接用于下个步骤中。
的合成
向酐(7.3g，20mmol)于DMF(20mL)中的溶液中添加mPEG(5K)-NH2(20g， 4mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以H2O稀释(200mL)。以CH2Cl2(500mL) 萃取混合物。将有机层以H2O和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩。向残余物中添加CH2Cl2(10mL)，接着添加乙醚(500mL)。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(19.8g，99％)。
的合成
向经叔丁氧羰基保护的mPEG(5K)(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液 中添加三氟乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(2mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，0.1mL)和乙醚(40mL)。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到产物(0.75g，75％)。
实例80
这个实例详述图60A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(4.5g，0.15mmol)于CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加光气(20％， 于甲苯中，1.6mL，3.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10小时且在真空中浓缩。 残余物(4.2g，93％)无需纯化即可直接用于下个反应中。
的合成
向上述活化mPEG(30K)II(4.2g，0.14mmol)和胺连接子VIII(67mg，0.28mmol) 于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(75μL，0.42mmol)。 在室温下搅拌所得混合物15小时后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(3.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺III(3.5g，0.12mmol)于MeOH(15mL)中的溶 液中添加氨(7N，于甲醇中，15mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向 残余物中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300 mL)以沉淀呈白色固体状的产物(3.0g，86％)。
的合成
向2-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(2.8mL，18mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5.8g，36mmol)、三苯基膦(3.6g，27mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，3.6mL，19mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜并浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、去 离子水(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空 中浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的快速色谱纯化粗产物以得到呈白 色固体状的含有杂质的标题化合物(12g，206％)。
的合成
向粗的经叔丁氧羰基保护的连接子(12g)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl(4N， 于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空 中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(3.0g，对于两个步骤为68％)。
实例81
这个实例详述图60B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(5K)-OH(10g，2.0mmol)、Ph3P(790mg，3.0mmol)和N-羟 基邻苯二甲酰亚胺(0.49g，3.0mmol)于CH2Cl2-THF(2∶3，45mL)中的溶液中添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，409μL，2.0mmol)。将混合物在室温下搅拌15小时后， 添加乙醚(1L)至混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色 粉末状的mPEG(5K)-邻苯二甲酰亚胺(9.8g，98％)。
的合成
向mPEG(5K)邻苯二甲酰亚胺(3g，0.6mmol)于MeOH(25mL)中的溶液中添 加氨(7N，于甲醇中，25mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的羟胺(2.5g，83％)。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)-OH(6g，0.2mmol)、Ph3P(80mg，0.3mmol)和N-羟基 邻苯二甲酰亚胺(49mg，0.3mmol)于CH2Cl2-THF(2∶3，45mL)中的溶液中添加偶氮 二甲酸二异丙酯(DIAD，41μL，0.2mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚 (200mL)至混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的 mPEG(30K)-邻苯二甲酰亚胺产物(5.8g，96％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(3g，0.1mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添 加氨(7N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的mPEG(30K)-ONH2(2.6g，87％)。
实例82
这个实例详述图61A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙胺(5.0g，33.8mmol)于DMF(100mL)中的溶 液中添加(叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸(14.2g，74.2mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，28.5g，0.15mol)和N，N′-二异丙基乙基胺(26mL， 0.15mol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物 以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O(300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后 经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。粗产物(14.2g，85％)无需纯化即可直接 用于下个反应中。
的合成
在0℃下向上述二叔丁氧羰基连接子(3.0g，6.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的 溶液中添加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中 添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL) 以沉淀呈白色固体状的二羟胺(1.47g，82％)。
实例83
这个实例详述图61B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向三(乙二醇)(1.5g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(3.72g，82％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.2g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的三(乙二醇)二羟胺连接子(1.1g，87％)。
实例84
这个实例详述图61C中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向四(乙二醇)(1.94g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(3.58g，74％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.42g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的四(乙二醇)二羟胺连接子(1.27g，85％)。
实例85
这个实例详述图62A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向六(乙二醇)(2.82g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(4.40g，77％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.86g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的六(乙二醇)二羟胺连接子(1.68g，87％)。
实例86
这个实例详述图62B中呈示的mPEG化合物的合成。
的合成
向mPEG-OH(30K，3.0g，0.1mmol)于无水CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加双 光气(63μL，0.5mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。添加乙醚(700mL)以沉淀 mPEG。将产物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥(3.0g，100％)。
以下实例描述测量和比较经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体外和活体内 活性与治疗活性天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性的方法。
实例87：细胞结合检定
在0℃下在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未经标记GH、hGH或GM-CSF 的情况下和在125I-GH(约100,000cpm或1ng)存在下将细胞(3×106)在PBS/1％BSA (100μl)中培养(两份)90分钟(总体积：120μl)。随后将细胞悬浮且在350μl塑胶 离心管中的200μl冰冷FCS上分层且离心(1000g；1分钟)。通过切断管的底部来收集 离心块且以γ计数器(Packard)对离心块和上清液分别计数。
以在不存在竞争者的情况下的总结合(双重复的平均值)减去存在100倍过量的未 经标记的GH的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)的形式来测定特异性结合(cpm)。 对所使用的细胞类型的每一者测量非特异性结合。实验是使用相同125I-GH制剂在隔开 的天数进行且应显示内部一致性。125I-GH证实与产生GH受体的细胞的结合。结合以剂 量依赖性方式受到未经标记的天然GH或hGH抑制，但不受GM-CSF或其他阴性对照 抑制。hGH竞争天然125I-GH(类似于天然GH)结合的能力暗示受体同样良好地识别两 种形式。
实例88：PEG化hGH的活体内研究
将PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果应展示由体重显 著增加指示的与未经修饰的hGH相比，本发明的PEG化hGH具有出众的活性和延长的 半衰期。
实例89：接合hGH和未接合hGH以及其变体的活体内半衰期的测量
所有动物实验是于AAALAC质量合格设备中且以由圣路易斯大学(St.Louis University)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee) 认可的方案进行。在室内以12小时灯光/黑暗的循环将大鼠个别圈养于笼中。使动物能 够随意接近合格的Purina啮齿动物食物5001和水。对于切除垂体的大鼠，饮用水额外 含有5％葡萄糖。
实例90：药物动力学研究
在进入动物实验之前通过三次检定来评估每一PEG化突变体hGH的品质。通过用 非还原性条件下的MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)电泳4％-12％丙烯 酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶检测PEG-hGH的纯度。将凝胶以考马斯亮蓝(Coomassie blue) 染色。根据密度测定扫描，PEG-hGH条带的纯度大于95％。通过使用来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2试剂盒的动力学LAL检定来测试每一PEG-hGH 中的内毒素含量，且每剂量小于5EU。以IM-9pSTAT5生物检定评估PEG-hGH的生物 活性，且证实EC50值小于15nM。
在获自Charles River Laboratories的雄性Sprague-Dawley大鼠(261g-425g)中彼 此比较经PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学性质且将其与非PEG化生长激素进 行比较。通过手术将导管安装于颈动脉中用于血液采集。在导管成功安装之后，在给药 之前将动物分配成治疗组(每组三只至六只)。以0.41-0.55ml/kg的给药体积向动物皮 下给药1mg/kg的化合物。在各个时间点通过留置导管采集血样且使其进入经EDTA涂 布的微离心管中。在离心后收集血浆，且储存在-80℃下直至分析。使用来自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗体 夹心生长激素ELISA试剂盒测量化合物浓度。使用对应于所给的类似物的标准来计算浓 度。使用模型程序WinNonlin(Pharsight，版本4.1)来估算药物动力学参数。使用具有 线性上/对数下梯形积分的非房室模型分析(Noncompartmental analysis)，且均一加权浓 度数据。
在于大鼠中单次皮下给药之后，以规则时间间隔获得血浆浓度。向大鼠(每组n＝ 3-6)给予每公斤蛋白质1mg的单一大丸药剂量。将hGH野生型蛋白(WHO hGH)、 His标记hGH多肽(his-hGH)或包括在六个不同位置的每一者处与30kDa PEG共价键 联的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的His标记hGH多肽与WHO hGH和(his)-hGH进 行比较。在规定时间间隔内采取血浆样本且按照所述检定其中的注射化合物。下表显示 单剂量投与各种hGH多肽的药物动力学参数值。由非房室模型分析(Pharsight，版本 4.1)来评估浓度对时间曲线。显示的值为平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；末 期t1/2：末期半衰期；AUC0-＞inf：外推至无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均 滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：在末期阶段期间的表观分布体积。与对照 hGH相比，观测到30KPEG-pAF92(his)hGH循环明显延长，血清半衰期增加且生物可 用性增加。
表：在正常雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下投与单剂量的1mg/kg大丸药的药物 动力学参数值。
实例91：药效学研究
切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠是获自Charles River Laboratories。在3-4周龄 时通过手术移除垂体。使动物适应新环境3周的时期，在此期间监测体重。将在开始研 究之前经7天的时期体重增加0g-8g的动物放入和随机组合为治疗组。对大鼠投与大丸 药剂量或每日皮下给药。在整个研究中，每日且依次对大鼠称重、麻醉、放血且给药(适 当时)。使用肝素化毛细管从眶窦采集血液且置入经EDTA涂布的微离心管中。通过离 心分离血浆且储存在-80℃下直至分析。绘制平均(+/-S.D.)血浆浓度对时间间隔的曲 线。
肽IGF-1为生长调节素或类胰岛素生长因子的家族的成员。IGF-1介导生长激素的 许多促进生长的效应。使用针对提供的大鼠/小鼠IGF-1标准的竞争性结合酶免疫检定试 剂盒(Diagnosic Systems Laboratories)来测量IGF-1浓度。切除大鼠的垂体。对大鼠(每 组n＝5-7)皮下给予单次剂量或每日剂量。每日依次对动物称重、麻醉、放血且给药(适 当时)。获得安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)、His标记hGH((his)hGH)和包括在位 置35和92处与30kDa PEG共价键联的对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。观 测到对于30KPEG-pAF35(his)hGH化合物在第9天时的体重增加与 30KPEG-pAF92(his)hGH化合物在统计学上不同(p＜0.0005)，不同之处在于观测到更 大的体重增加。在投与单次剂量的包括经PEG化的非天然编码氨基酸的hGH多肽后， 通过使用双尾分布、未成对、相等方差的t-测试测定的对循环血浆IGF-1水平的效应具 有显著差异。
实例92：包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的安全性及/或功效的人类临床试验。
目的为比较经皮下投与的PEG化的包括非天然编码氨基酸的重组人类hGH与一种 或一种以上的市售hGH产品(包含(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM (Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM (Serono))的安全性和药物动力学。
患者研究中招收18个年龄在20岁-40岁范围内且体重介于60kg-90kg之间的健 康志愿者。受检者应不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿液毒性筛 检、HIV筛检和肝炎B表面抗原实验值。其应不具有任何以下迹象：高血压；任何原发 性血液疾病史；重大肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖器疾病、代谢疾病、 神经病病史；贫血或癫痫病史；对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白 的已知敏感性；含咖啡因的饮料的习惯性以及重度消费者；在进入研究的30天内参与 任何其他临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内已接触过hGH；在进入研究 的7天内患病；以及在进入研究的14天内对研究前身体检查或临床实验室评估具有显 著异常。对所有受检者评估安全性且定时采集用于药物动力学分析的所有血液采集物。 经机构伦理委员会批准以及患者同意进行所有研究。
研究设计其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机、两 周期交叉研究。将18个受检者随机指派至两个治疗序列组中的一组中(每组9名受检 者)。使用相等剂量的包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH和所选市售产品在大腿上部 以快速皮下注射形式经两个单独给药时期投与GH。投与市售产品的剂量和频率是按照 包装标记中的说明。按照需要，使用市售产品的其他剂量、给药频率或其他参数可通过 包含其他受检者组而添加到研究中。每一给药时期由14天的清洗期隔开。对于两次给 药时期中的每一者，受检者在给药之前至少12小时和给药后72小时被限定在研究中心， 但在给药时期之间无需如此。如果存在其他剂量、频率或其他参数，那么也可添加额外 受检者组来测试PEG化hGH。经批准用于人类用途的多种GH配方可用于此研究中。 HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、 GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)为经批准用于人类用途的市售GH 产品。hGH的实验配方为包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH。
血液取样在投与hGH之前和之后通过直接静脉穿刺连续取血。在给药前约30分 钟、20分钟和10分钟(3个基线样本)且在给药后约以下时间：30分钟和1小时、2 小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小 时、60小时以及72小时获得用于测定血清GH浓度的静脉血样(5mL)。将每一血清样 本分为两个等分试样。将所有血清样本储存在-20℃下。血清样本在干冰上运输。在第1 天初始给药之前即刻、第4天早晨、第16天给药之前即刻以及第19天早晨进行禁食临 床实验测试(血液学、血清化学，以及验尿)。
生物分析方法使用ELISA试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]， Webster TX)测定血清GH浓度。
安全性测定在每一次给药(第1天和第16天)之前以及每一次给药后6小时、24 小时、48小时和72小时立即记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类 型以及临床实验测试自基线的变化。另外，评估生命体征测量结果(包含血压)和身体 检查结果中与研究前的变化。
数据分析通过由给药后值的每一者减去由平均化在给药前30分钟、20分钟和10 分钟时采集的三个样本的GH水平测定的平均基线GH浓度关于给药前基线GH浓度修 正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检定的定量水平，那么其不包含于 平均值的计算中。从关于基线GH浓度修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用 最近版本的BIOAVL软件于Digital Equipment Corporation VAX 8600电脑系统上通过不 依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰血清浓度 (Cmax)；到达峰血清浓度的时间(tmax)；由使用线性梯形规则计算的自时间零点到最后 血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下的面积(AUC)；以及由消除速率常数计算 的末端消除半衰期(t1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末端线性区域内通过连续数据点 的线性回归来估算消除速率常数。对于每一治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差 (SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保持配方/非保持配方)。
安全性结果在治疗组中不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测 试或血压相比无临床上显著变化，且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比无 显著变化。两个治疗组的安全性概况应看来相似。
药物动力学结果在所测量的每一时间点下，将接受单次剂量的一种或一种以上的 市售hGH产品(包含(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、 NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)) 后的所有18名受检者的平均血清GH浓度-时间概况(未关于基线GH含量修正)与包 括非天然编码氨基酸的PEG化hGH进行比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的 给药前基线GH浓度。由关于给药前平均基线GH浓度修正的血清数据测定药物动力学 参数且测定Cmax和tmax。所选的临床比较物(HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM (Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)、Saizen/SerostimTM (Serono))的平均tmax比包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的tmax显著更短。与包 括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的末端半衰期相比，测试的市售hGH产品的末端半 哀期值显著更短。
尽管本发明的研究是在健康男性受检者中进行，但预期在其他患者群体(诸如患有 癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、小儿肾衰竭患者、自体预存程序中的患者，或预 定选择性手术的患者)中可具有类似的吸收特征和安全性概况。
总体来说，经皮下投与的单一剂量的包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH应为安 全的且健康男性受检者对其良好接受。根据不利事件的相对发生率，市售形式的hGH 和包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的临床实验值、生命体征以及身体检查结果和 安全性概况应相当。包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH潜在地对患者和健康护理提 供者提供大的临床效用。
实例93：PEG化hGH和非PEG化hGH的水溶性比较
通过测定可溶解于100μL水的各别多肽的量来获得hGH野生型蛋白(WHO hGH)、 His标记hGH多肽(his-hGH)或包括在位置92处与30kDa PEG共价键联的非天然氨 基酸对乙酰基-苯丙氨酸的His标记hGH多肽的水溶性。PEG化hGH的量大于WHO hGH 和hGH的量，其证明非天然氨基酸多肽的PEG化增加水溶性。
实例94：经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠中，随后将其分为两个组。一组每天用经修饰 的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗且另一组每天用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每天 测量肿瘤大小，且如由用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤大小的减 小所指示，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽具有 改良的治疗功效。
实例95：经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠中，随后将其分为两个组。一组每天用经修饰 的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗且另一组每天用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每天 测量肿瘤大小，且如由用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤大小的减 小所指示，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽具有 改良的治疗功效。
应了解，本文中描述的实例和实施例仅为说明性目的且其各种修饰或变化应可由所 属领域的技术人员提出且包含在本申请案的精神和范围内以及随附权利要求的范畴内。 本文中引用的所有公开案、专利和专利申请案是为所有目的以引用的方式全部并入本文 中。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2004年12月22日申请的美国临时申请案第60/638,418号、2004年 12月22日申请的美国临时申请案第60/638,527号、2004年12月22日申请的美国临时 申请案第60/639,195号、2005年7月1日申请的美国临时申请案第60/696,210号、2005 年7月1日申请的美国临时申请案第60/696,302号和2005年7月1日申请的美国临时 申请案第60/696,068号的利益，其中所述申请案的揭露内容是以引用的方式全部并入本 文中。
序列表
SEQ ID# 序列表 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 1 CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAA TCCGCATGGCGCTGGTTCAAATCCGGCCCGCCGGACCA 詹氏甲烷球菌 mtRNACUA Tyr tRNA 2 CCCAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGACGGACTCTA AATCCGTTCTCGTAGGAGTTCGAGGGTTCGAATCCCTTCC C TGGGACCA HLAD03；优化的琥 珀抑制tRNA tRNA tRNA 3 GCGAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGACGGACTTCC TAATCCGTTCTCGTAGGAGTTCGAGGGTTCGAATCCCTCC CCTCGCACCA HL325A；优化的 AGGA移码抑制tRNA tRNA 4 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基 -L-苯丙氨酸的氨酰 基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(6) RS 5 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTSHYLGVDV AVGGMEQRKIHMLAPJELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对苯甲酰 基-L-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 p-BpaRS(1) RS 6 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKAAIGFEPSGKIHLG HYLQIKKMIDL QNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMG LKAKYVYGSPFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIA REDENPKVAEVIYPIMQVNAIYLAVDVAVGGMEQRKIHML ARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEE IRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGG DLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS 7 MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SPFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNIPY LPVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKVVC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTIKRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS 8 MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SKFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNAIY LAVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKWC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTI KRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS
SEQ ID# 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 9 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(1) RS 10 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELLAJREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(3) RS 11 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPVHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(4) RS 12 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPSHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(2) RS 13 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGCHYRGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW1) RS 14 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGTFIYRGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW5) RS 15 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELLAREDENPKVAEVIYPIMQVNGGHYLGVDV IVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSS SKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW6) RS
SEQ ID# 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 16 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSRFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNVIHYDGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (AzPheRS-5) RS 17 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (AzPheRS-6) RS
近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其希望克服众多与蛋白质的位点特异性 修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(E.coli)(例如， L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白质生 物合成机制中，其使得能够在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，具有 新颖化学、物理或生物性质的许多新氨基酸(包含光亲和性标记和可光异构化氨基酸、 酮氨基酸和糖基化氨基酸)已有效且高保真性地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中以 回应琥珀密码子TAG。参见(例如)J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz， (2002)，ChemBioChem 3(11)：1135-1137(以引用的方式全部并入)；J.W.Chin，等人， (2002)，PNAS United States of America 99(17)：11020-11024(以引用的方式全部并入)； 以及，L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-11(以引用的方式全部并入)。 这些研究已证实有可能选择性且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能基，其对20种 常见遗传性编码氨基酸中存在的所有官能基为化学惰性的，且其可用于有效且选择性地 反应以形成稳定共价键。
II.概述
图1呈示对本文中描述的组合物、方法和技术的概述。某种程度上，本文中描述用 于产生和使用包括至少一个非天然氨基酸或经羰基、二羰基、肟基或羟胺基修饰的非天 然氨基酸的多肽的手段(方法、组合物、技术)。这些非天然氨基酸可含有其他官能基， 其包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交 联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第 二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水 化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、 生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能基； 与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位 体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基 团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性 部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团； 磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂(在此情况下，生物活性剂可 包含具有治疗活性的药剂且非天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸可充当与附属 治疗剂共同的共治疗剂或作为将治疗剂递送至生物体内所需位点的手段)；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。应注意，各种前述官能基并非意谓暗示 一种官能基的成员不可分类为另一种官能基的成员。当然，其会根据特定情况而重叠。 仅举例来说，水溶性聚合物与聚乙二醇的衍生物在范围上重叠，然而重叠并不完全且因 此两种官能基均列于上文。
如图1中所示，一方面为使用本文中描述的方法、组合物和技术来选择和设计欲修 饰的多肽的方法。新颖多肽可从头设计，其包含(仅举例来说)作为高通量筛检方法(在 此情况下，可设计、合成、表征及/或测试众多多肽)的部分或根据研究者的兴趣设计。 新颖多肽也可根据已知或部分表征的多肽的结构进行设计。仅举例来说，生长激素基因 超家族(Growth Hormone Gene Superfamily)(见下文)已成为科学团体广泛研究的主题； 新颖多肽可根据这个基因超家族的成员的结构进行设计。选择哪个氨基酸来取代及/或修 饰的原则单独描述于本文中。使用哪种修饰的选择也描述于本文中，且可用于满足实验 人员或最终使用者的需求。这些需求可包含(但不限于)操纵多肽的治疗功效；改良多 肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学及/或药效；诸如，(仅举例来说)增 加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物 活性；或延长循环时间。另外，这些修饰包含(仅举例来说)向多肽提供其他官能基； 向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质，以及前述修饰的任何组 合。
本文中也描述已经修饰或可经修饰以含有肟基、羰基、二羰基或羟胺基的非天然氨 基酸。这个方面包含用于制备、纯化、表征和使用这些非天然氨基酸的方法。本文中描 述的另一方面为将至少一个所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技术。这个方 面同样包含用于制备、纯化、表征和使用含有至少一个所述非天然氨基酸的这些多肽的 方法。这个方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用可用于制备(至少部分地)含有 至少一个非天然氨基酸的多肽的寡核苷酸(包含DNA和RNA)的组合物和方法。这个 方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用可表达可用于制造(至少部分地)含有至少 一个非天然氨基酸的多肽的这些寡核苷酸的细胞的组合物和方法。
因此，本文中提供和描述包括至少一个非天然氨基酸或经羰基、二羰基、肟基或羟 胺基修饰的非天然氨基酸的多肽。在某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸或经羰 基、二羰基、肟基或羟胺基修饰的非天然氨基酸的多肽包含在多肽上的一些位置上的至 少一次翻译后修饰。在一些实施例中，共翻译或翻译后修饰通过细胞机制(例如，糖基 化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰，以及 其类似机制)发生，在许多情况下，这些基于细胞机制的共翻译或翻译后修饰发生于多 肽上的天然存在氨基酸位点处，然而，在某些实施例中，基于细胞机制的共翻译或翻译 后修饰发生在多肽上的非天然氨基酸位点上。
在其他实施例中，翻译后修饰不利用细胞机制，而是通过利用本文中描述的化学方 法，或适用于特定反应性基团的其他方法将包括第二反应性基团的分子(包含(但不限 于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化 合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或 多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸； DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒 子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或 非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部 分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基 团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标 记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入 基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放 射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗 体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、 抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶 束以及其任何组合)连接至至少一种包括第一反应性基团(包含(但不限于)含有酮、 醛、缩醛、半缩醛、肟或羟胺官能基的非天然氨基酸)的非天然氨基酸来提供官能基。 在某些实施例中，共翻译或翻译后修饰是于真核生物或非真核生物中活体内进行。在某 些实施例中，翻译后修饰是不利用细胞机制在活体外进行。这个方面同样包含用于制备、 纯化、表征和使用含有至少一个这些经共翻译或翻译后修饰的非天然氨基酸的这些多肽 的方法。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术的范畴内也包含能够与作为多肽的部分的 非天然氨基酸(含有羰基或二羰基、肟基、羟胺基，或其掩蔽或保护形式)反应以产生 任何前述翻译后修饰的试剂。一般来说，所得经翻译后修饰的非天然氨基酸应含有至少 一个肟基；所得经修饰的含肟非天然氨基酸可经受随后的修饰反应。这个方面也包含用 于制备、纯化、表征和使用能够进行所述非天然氨基酸的任何所述翻译后修饰的所述试 剂的方法。
在某些实施例中，多肽包含至少一种由一种宿主细胞在活体内进行的共翻译或翻译 后修饰，其中翻译后修饰通常不由另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，多肽包 含至少一种由真核生物在活体内进行的共翻译或翻译后修饰，其中共翻译或翻译后修饰 通常不由非真核生物进行。这些共翻译或翻译后修饰的实例包含(但不限于)糖基化、 乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰，以及其类 似修饰。在一实施例中，共翻译或翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖连 接至天冬酰胺(包含(但不限于)，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc， 以及其类似物)。在另一实施例中，共翻译或翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸、 GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含(但不限于) Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)连接至丝氨酸或苏氨酸。在某些实施例中，蛋白质或多 肽可包括分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合及 /或其类似物。这个方面同样包含用于制备、纯化、表征和使用含有至少一种此共翻译或 翻译后修饰的这些多肽的方法。在其他实施例中，糖基化非天然氨基酸多肽是以非糖基 化形式制备。糖基化非天然氨基酸的此非糖基化形式可由以下方法或任何这些方法的组 合产生，所述方法包含从经分离或实质上经纯化或未经纯化的糖基化非天然氨基酸多肽 中化学或酶促移除寡糖基团；于不糖基化此非天然氨基酸多肽的宿主中(所述宿主包含 经工程化或突变以不糖基化此多肽的原核生物或真核生物)产生非天然氨基酸，向其中 所述非天然氨基酸多肽是由通常会糖基化此多肽的真核生物产生的细胞培养基中引入 糖基化抑制剂。本文中也描述通常糖基化非天然氨基酸多肽(通常糖基化意谓当在天然 存在多肽经糖基化的条件下制备时会糖基化的多肽)的这些非糖基化形式。当然，通常 糖基化非天然氨基酸多肽的这些非糖基化形式(或实际上本文中描述的任何多肽)可为 未经纯化的形式、实质上经纯化的形式或经分离的形式。
在某些实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一种在促进剂的存在下进行的翻译后 修饰，其中翻译后修饰为化学计量、类化学计量或接近化学计量的。在其他实施例中， 在促进剂的存在下使多肽与式(XIX)的试剂接触。在其他实施例中，促进剂是选自由 以下各物组成的群组：
含有非天然氨基酸的多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少 五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上含有羰基或二羰基、 肟基、羟胺基或其经保护形式的非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，在 包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个 或20个以上不同非天然氨基酸的蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同位点。在某些实施例中，以 蛋白质的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一者(但少于全部)经非天然氨基酸 取代。
本文中提供和描述的方法和组合物包含包括至少一个含有羰基或二羰基、肟基、羟 胺基或其经保护或掩蔽形式的非天然氨基酸的多肽。将至少一个非天然氨基酸引入多肽 中可容许应用包括特定化学反应(包含(但不限于)与一或多种非天然氨基酸反应，而 不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。一旦并入，则非天然存在氨基酸侧链 也可利用本文中描述的或适用于天然编码氨基酸中存在的特定官能基或取代基的化学 方法来修饰。
本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物提供具有多种官能基、取代基或部分的物 质与其他物质的接合物，所述其他物质包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。
在某些实施例中，本文中描述的包含式(I)-(XXXIII)的化合物的非天然氨基酸、 非天然氨基酸多肽、连接子和试剂在适度酸性条件下(包含(但不限于)pH 2至8)在 水溶液中稳定。在其他实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少一个月。在其 他实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这些化合 物在适度酸性条件下稳定至少5天。
本文中描述的组合物、方法、技术和策略的另一方面为用于研究或使用前述“经修 饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽中的任一者的方法。这个方面中包含(仅举例来说) 会从包括“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽或蛋白质的多肽中获益的治疗、诊 断、基于检定、工业、化妆品、植物生物学、环境、能量产生、消费者产品及/或军事上 的用途。
III.多肽中非天然氨基酸的定位
本文中描述的方法和组合物包含将一或多个非天然氨基酸并入多肽中。一或多个非 天然氨基酸可在不破坏多肽活性的一或多个特定位置处并入。此举可通过进行“保守性” 取代(包含(但不限于)以非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，以非天然或 天然庞大氨基酸取代庞大氨基酸，以非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸)及 /或将非天然氨基酸插入不需活性的位置中来实现。
可使用多种生物化学和结构方法来选择在多肽内经非天然氨基酸取代的所需位点。 多肽链的任何位置适于选择以并入非天然氨基酸，且对于任何或无特定所需目的，可根 据合理设计或通过随机选择来加以选择。所需位点的选择可基于产生具有任何所需性质 或活性((包含(但不限于)促效剂、超促效剂、部分促效剂、反向促效剂、拮抗剂、 受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节 剂、结合搭配物构象调节剂、二聚体或多聚体形成)、与天然分子相比无活性或性质改 变的非天然氨基酸多肽(其可经进一步修饰或保持未经修饰)，或操纵多肽的任何物理 或化学性质，诸如溶解性、聚集或稳定性。举例来说，可使用包含(但不限于)点突变 分析、丙氨酸扫描或同源物扫描法的方法鉴别需要多肽的生物活性的多肽中的位置。除 经包含(但不限于)丙氨酸或同源物扫描突变形成的方法鉴别为对生物活性关键的那些 残基之外的残基可能根据对于多肽所寻求的所需活性为用非天然氨基酸取代的良好候 选者。或者，经鉴别为对生物活性关键的位点也可能再次根据对于多肽所寻求的所需活 性为用非天然氨基酸取代的良好候选者。另一代替方法可为用非天然氨基酸简单进行多 肽链上每一位置中的连续取代且观察对多肽的活性的影响。在任何多肽中选择用非天然 氨基酸取代的位置的任何手段、技术或方法适用于本文中描述的方法、技术和组合物。
也可研究含有缺失的多肽的天然存在突变体的结构和活性以测定可能容许用非天 然氨基酸取代的蛋白质区域。一旦除去可能容许用非天然氨基酸取代的残基，就可使用 包含(但不限于)相关多肽和任何缔合配位体或结合蛋白的三维结构的方法来研究提出 的取代在每一剩余位置上的影响。在蛋白质数据库(Protein Data Bank)(PDB， www.rcsb.org)(含有蛋白质以及核酸的大分子的三维结构数据的集中数据库)中可获得 许多多肽的X射线结晶和NMR结构，其可用于鉴别可用非天然氨基酸取代的氨基酸位 置。另外，如果三维结构数据不可获得，那么可作出模型来研究多肽的二级结构和三级 结构。因此，可易于获得可用非天然氨基酸取代的氨基酸位置本身。
并入非天然氨基酸的例示性位点包含(但不限于)排除潜在受体结合区域的那些位 点，或与结合蛋白或配位体结合的区域可完全或部分溶剂暴露，与邻近残基具有最小或 无氢键相互作用，可最低程度地暴露于邻近反应性残基，及/或可在如由特定多肽与其相 缔合受体、配位体或结合蛋白的三维晶体结构所预测为高度柔性的区域中。
多种非天然氨基酸可取代或并入多肽中的给定位置中。举例来说，可根据对多肽与 其缔合配位体、受体及/或结合蛋白的三维晶体结构的研究选择用于并入的特定非天然氨 基酸，优选保守性取代。
在一实施例中，本文中描述的方法包含向多肽中并入非天然氨基酸，其中非天然氨 基酸包括第一反应性基团；且使多肽与包括第二反应性基团的分子(包含(但不限于) 标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物； 药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类 似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA； RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自 旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价 相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生 物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延 长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部 分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核 苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、 活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化 剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及 其任何组合)接触。在某些实施例中，第一反应性基团为羰基或二羰基部分且第二反应 性基团为羟胺部分，藉此形成肟键。在某些实施例中，第一反应性基团为羟胺部分且第 二反应性基团为羰基或二羰基部分，藉此形成肟键。在某些实施例中，第一反应性基团 为羰基或二羰基部分且第二反应性基团为肟部分，藉此发生肟交换反应。在某些实施例 中，第一反应性基团为肟部分且第二反应性基团为羰基或二羰基部分，藉此发生肟交换 反应。
在一些情况下，非天然氨基酸取代或并入将与多肽内的其他添加、取代或缺失组合 以影响其他化学、物理、药理及/或生物特性。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可 增加多肽的稳定性(包含(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其适当受 体、配位体及/或结合蛋白的亲和性。在一些情况下，其他添加、取代或缺失可增大多肽 的溶解度(包含(但不限于)，当以大肠杆菌或其他宿主细胞表达时)。在一些实施例中， 选择用于用天然编码或非天然氨基酸取代的位点，此外，选择另一位点用于并入非天然 氨基酸，以实现在大肠杆菌或其他重组宿主细胞中表达后增大多肽溶解性的目的。在一 些实施例中，多肽包括调节对缔合配位体、结合蛋白及/或受体的亲和性、调节(包含(但 不限于)增加或减少)受体二聚化、稳定受体二聚体、调节循环半衰期、调节释放或生 物可用性、利于纯化，或改良或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。类似地， 非天然氨基酸多肽可包括改良多肽的检测(包含(但不限于)GFP)、纯化、传送穿透组 织或细胞膜、前药释放或活化、尺寸减小或其他特性的化学或酶促裂解序列、蛋白酶裂 解序列、反应性基团、抗体结合域(包含(但不限于)FLAG或poly-His)或其他基于 亲和性的序列(包含(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或键联分子(包含(但不 限于)生物素)。
IV.作为范例的生长激素超基因家族
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于特定的多肽或蛋白质类型、种类或 家族。确实，实质上任何多肽可经设计或修饰以包含至少一个本文中描述的“经修饰或 未经修饰的”非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗 蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂 蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、 NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、 降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋 化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1 α、单核细胞炎性蛋白-i β、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
因此，生长激素(GH)超基因家族的以下描述是为说明性目的且仅作为实例来提 供，且并非作为对本文中描述的方法、组合物、策略和技术的范畴的限制。此外，本申 请案中对GH多肽的提及意欲使用一般术语作为GH超基因家族中的任何成员的实例。 因此，应了解，关于GH多肽或蛋白质的本文中描述的修饰和化学可同样应用于GH超 基因家族中的任何成员，其包含本文中特定列出的那些成员。
以下蛋白质包含由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的那些蛋白质(Bazan，F.， Immunology Today 11：350-354(1990)；Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；Mott，H. R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen， O.和Ihle，J.N.，Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors(1996))：生长激素、 泌乳刺激素、胎盘催乳激素、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介 素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35次单位)、 IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、 ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨 噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)以及心肌营养素-1 (CT-1)(“GH超基因家族”)。预计这个基因家族的其他成员将来会通过基因克隆和测 序来鉴别。GH超基因家族的成员具有类似二级结构和三级结构，尽管它们通常具有有 限的氨基酸或DNA序列一致性。共同的结构特征使得所述基因家族的新成员易于鉴别 且类似地应用本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物。
包含G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314：435(1992)；Zink等人，Biochemistry 33：8453 (1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K. 等人，Science 154：1779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.224：1075-1085(1992))、 IL-2(Bazan，J.F.和McKay，D.B.，Science 257：410-413(1992))；IL-4(Redfield等人， Biochemistry 30：11029-11035(1991)；Powers等人，Science 256：1673-1677(1992))以及 IL-5(Milburn等人，Nature 363：172-176(1993))的众多细胞因子的结构已由X射线衍 射和NMR研究测定且展示与GH结构的惊人保守性，但缺乏显著的一级序列同源性。 根据模型和其他研究认为IFN为这个家族的成员(Lee等人，J.Interferon Cytokine Res. 15：341(1995)；Murgolo等人，Proteins 17：62(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 4：1453 (1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274：661(1997))。包含睫状神经营养因子(CNTF)、 白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、制瘤素M、巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF) 以及诸如α、β、ω、τ、ε及γ干扰素的IFN的大量其他细胞因子和生长因子属于这个家 族(于Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)； Silvennoinen和Ihle(1996)Signalling by the Hematopoietic Cytokine Receptors中回顾)。 如今认为所有上述细胞因子和生长因子包括一个大的基因家族。
除了共有类似的二级结构和三级结构之外，这个家族的成员共有其须使细胞表面受 体寡聚化以活化细胞内信号转导途径的性质。一些GH家族成员(包含(但不限于)GH 和EPO)与单一类型的受体结合且使其形成同型二聚体。包含(但不限于)IL-2、IL4 和IL-6的其他家族成员与一种类型以上的受体结合且使这些受体形成异质二聚体或更 高级的聚集体(Davis等人，(1993)Science 260：1805-1808；Paonessa等人，(1995)EMBO J.14：1942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121 (1995))。诱变研究已展示，如同GH一样，这些其他细胞因子和生长因子含有多个受体 结合位点(通常两个)，且依次与其同源受体结合(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93： 9471-9476)。如同GH一样，这些其他家族成员的主要受体结合位点主要存在于四个α 螺旋和A-B环中。参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸在家族成员中不同。与GH超 基因家族的成员相互作用的大多数细胞表面受体结构上相关且构成第二个大的多基因 家族。参见(例如)美国专利第6,608,183号，其是以引用的方式全部并入本文中。
由对多种GH超基因家族成员的突变研究得到的一般结论为连接α螺旋的环通常趋 向于不参与受体结合。具体来说，对于大多数(若非全部)家族成员中的受体结合来说， 短B-C环似乎并非必要。为此原因，在GH超基因家族的成员中，B-C环可经如本文中 所述的非天然氨基酸取代。A-B环、C-D环(以及干扰素/GH超家族的类IL-10成员的 D-E环)也可经非天然氨基酸取代。最接近螺旋A且远离最后螺旋的氨基酸也趋向于不 参与受体结合且也可为用于引入非天然氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然氨基酸 在包含(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7或7个以上 氨基酸的环结构内的任何位置处取代。在一些实施例中，非天然氨基酸在A-B、B-C、 C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸内取代。
GH家族的某些成员(包含(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、 TPO、IL-10、IL-12 p35、IL-13、IL-15和β干扰素)含有N-键联及/或O-键联的糖。蛋 白质中的糖基化位点几乎全部存在于环区域中且并非存在于α螺旋束中。因为环区域通 常不参与受体结合中且因为其为用于共价连接糖基团的位点，所以其可为用于将非天然 氨基酸取代引入蛋白质中的适用位点。蛋白质中包括N-键联糖基化位点以及O-键联糖 基化位点的氨基酸可为非天然氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸为表面暴露的。因此， 天然蛋白质可容许在这些位点处连接至蛋白质上的庞大糖基团且糖基化位点趋向于位 于远离受体结合位点的部位。
有可能在将来发现GH基因家族的其他成员。GH超基因家族的新成员可通过预测 蛋白质序列的电脑辅助二级结构和三级结构分析，且由设计用来鉴别与特定标靶结合的 分子的选择技术来鉴别。GH超基因家族的成员通常具有四个或五个由非螺旋状氨基酸 (环区域)连接的两性分子螺旋。蛋白质可在其N-末端含有疏水信号序列以促进从细胞 分泌。这些后来发现的GH超基因家族成员也包含在本文中描述的方法和组合物中。
V.非天然氨基酸
本文中描述的方法和组合物中使用的非天然氨基酸具有以下四种性质中的至少一 者：(1)至少一个非天然氨基酸的侧链上的官能基具有至少一种与20种常见遗传性编 码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的化学反应性正交、或至少与包含非天然氨基酸的 多肽中存在的天然存在氨基酸的化学反应性正交的特征及/或活性及/或反应性；(2)经 引入的非天然氨基酸对20种常见遗传性编码氨基酸实质上为化学惰性的；(3)非天然 氨基酸可稳定地并入多肽中，优选地具有与天然存在氨基酸相当的稳定性或在典型生理 条件下具有稳定性，且进一步优选地，所述并入可通过活体内系统发生；以及(4)非 天然氨基酸包含肟官能基或可通过与试剂反应转变为肟基的官能基，优选地在不破坏包 含非天然氨基酸的多肽的生物性质的条件下(除非当然此生物性质的破坏为修饰/转变的 目的)，或其中转变可在介于约4与约8之间的pH值下在水性条件下发生，或其中非天 然氨基酸上的反应性位点为亲电子位点。可用于本文中描述的组合物和方法的满足关于 非天然氨基酸的所述四种性质的氨基酸的说明性、非限制性实例呈示于图2、图3、图 35和图40-43中。可将任意数目的非天然氨基酸引入多肽中。非天然氨基酸也可包含经 保护或掩蔽的肟或可在将保护基团去保护或将掩蔽基团去掩蔽之后转变为肟基的经保 护或掩蔽基团。非天然氨基酸也可包含经保护或掩蔽的羰基或二羰基，其可在将保护基 团去保护或将掩蔽基团去掩蔽之后转变为羰基或二羰基且进而可用于与羟胺或肟反应 以形成肟基。
可用于本文中描述的方法和组合物中的非天然氨基酸包含(但不限于)包括可光活 化交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属氨基 酸、放射性氨基酸、具有新颖官能基的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨 基酸、光笼蔽及/或可光异构化氨基酸、包括生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨 基酸(诸如经糖取代的丝氨酸)、其他经碳水化合物修饰的氨基酸、含酮氨基酸、含醛 氨基酸、包括聚乙二醇或其他聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解及/ 或可光裂解的氨基酸、具有与天然氨基酸相比延长的侧链的氨基酸(包含(但不限于) 聚醚或长链烃，其包含(但不限于)大于约5个碳或大于约10个碳)、含经碳键联的糖 的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸，以及包括一个或一个以上毒 性部分的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸包括糖类部分。这些氨基酸的实例包含N-乙酰基-L- 葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨 酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺以及O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例 也包含其中氨基酸与糖之间的天然存在N-键或O-键由自然界中通常不存在的共价键(包 含(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺以及其类似物)代替的实例。这些氨基酸的实例 也包含天然存在蛋白质中通常不存在的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖以及其 类似物。
通过将非天然氨基酸并入这些多肽中而并入多肽中的化学部分提供多种优点和多 肽的操作。举例来说，羰基或二羰基官能基(包含酮官能基或醛官能基)的独特反应性 容许以众多含肼试剂或含羟胺试剂中的任一者在活体内以及活体外进行蛋白质的选择 性修饰。重原子非天然氨基酸(例如)可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基 酸位点特异性引入重原子也提供在选择重原子的位置时的选择性和灵活性。光反应性非 天然氨基酸(包含(但不限于)具有苯甲酮和芳基叠氮化物(包含(但不限于)苯基叠 氮化物)侧链的氨基酸)(例如)使得多肽的活体内和活体外光交联有效。光反应性非 天然氨基酸的实例包含(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。具有 光反应性非天然氨基酸的多肽随后可通过光反应性基团的激发(提供瞬时控制)来任意 交联。在非限制性实例中，非天然氨基酸的甲基可经同位素标记取代(包含(但不限于) 经甲基取代)，作为局部结构和动力学的探针(包含(但不限于)借助于核磁共振和振 动光谱)。
A.非天然氨基酸：羰基、类羰基、经掩蔽羰基以及经保护羰基的结构和合成
具有亲电子反应性基团的氨基酸容许多种反应以通过各种化学反应(包含(但不限 于)亲核加成反应)键联分子。这些亲电子反应性基团包含羰基或二羰基(包含酮基或 醛基)、类羰基或类二羰基基团(其具有类似于羰基或二羰基的反应性且在结构上与羰 基或二羰基类似)、经掩蔽的羰基或经掩蔽的二羰基(其可易于转变为羰基或二羰基)， 或经保护的羰基或经保护的二羰基(在去保护后其具有与羰基或二羰基类似的反应性)。 这些氨基酸包含具有式(I)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其限制条件为当A为亚苯基且R3各自为H时，B存在；且当A为-(CH2)4-且R3各 自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在且R3各自为H时，R不为甲 基。这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(I) 化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
在式(I)化合物的某些实施例中，B为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、-O-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-N(R′)CO-、-C(O)-、-C(R′)＝N-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(I)化合物的某 些实施例中，B为-O(CH2)-、-CH＝N-、-CH＝N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、 -C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在式(I)化合物的 某些实施例中，R为C1-6烷基或环烷基。在式(I)化合物的某些实施例中，R为-CH3、 -CH(CH3)2或环丙基。在式(I)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、 9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式 (I)化合物的某些实施例中，R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物 的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(I)化合物的某些实 施例中，R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2 为聚核苷酸。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(I)化 合物的某些实施例中，R2为tRNA。在式(I)化合物的某些实施例中，tRNA特异性识 别选择密码子。在式(I)化合物的某些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭 石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以 及四碱基密码子组成的群组。在式(I)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。
在式(I)化合物的某些实施例中，是选自由以下各物组成的群组：
(i)A为经取代低级亚烷基、C4-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚 杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷 基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
(ii)A为可选的，且当存在时为经取代低级亚烷基、C4-亚芳基、经取代亚芳基、 亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、 低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、 -NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
(iii)A为低级亚烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷 基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CSN(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；以及
(iv)A为亚苯基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、 低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、 -NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)、 -N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、 -C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
J为或
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
另外，包含具有式(II)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其限制条件为当A为亚苯基时，B存在；且当A为-(CH2)4-时，B不为 -NHC(O)(CH2CH2)-；且当A与B不存在时，R不为甲基。这些非天然氨基酸可为盐的 形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(III)的结构的氨基酸：
其中：
B为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低 级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、 -S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亚烷基或经取代 亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基。这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、 聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
这些非天然氨基酸可为视情况氨基经保护的基团、羧基经保护的基团及/或为盐的形 式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(IV)的结构的氨基酸：
其中
-NS(O)2-、-OS(O)2-、可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子： 低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经 取代低级亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8；
其限制条件为当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。这些非天然氨基酸可 为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译 后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(VIII)的结构的氨基酸：
其中，
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(IX)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(C))2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自 独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(X)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护和羧基 经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况 经翻译后修饰。
除了单羰基结构之外，本文中描述的非天然氨基酸可包含诸如二羰基、类二羰基、 经掩蔽二羰基和经保护二羰基的基团。
举例来说，包含以下具有式(V)的结构的氨基酸：
其中，
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(VI)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
其中Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、 -N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自 独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护以及羧基经保护，或为其盐。这些非天然氨基酸 可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻 译后修饰。
另外，包含以下具有式(VII)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基；且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下氨基酸：
以及
，
其中这些化合物视情况氨基经保护以及羧基经保护，或为其盐，或可并入非天然氨 基酸多肽、聚合物、多糖或聚核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXX-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
且R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸：
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9 各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和 R9可共同形成＝O或环烷基，或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷 氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可共同形成＝O或环烷基， 或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXI-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
n为0、1、2、3、4或5；且每一CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷 氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组，或任何R8和R9可共同形成＝O或环烷基， 或任何与相邻R8基团可共同形成环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII-A)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含以下具有式(XXXII-B)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基)，其中R′为H、 烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXX)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXI)的结构的氨基酸：
其中：
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′，其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXII)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；且
T3为O或S。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，包含具有式(XXXXIII)的结构的氨基酸：
其中：
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外，包含以下具有式(XXXXIII)的结构的氨基酸：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
羰基或二羰基官能基可在温和条件下于水溶液中与含有羟胺的试剂选择性地反应 以形成在生理条件下稳定的相应肟键。参见(例如)Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81， 475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117(14)：3893-3899(1995)。此外， 羰基或二羰基的独特反应性容许在其他氨基酸侧链存在下的选择性修饰。参见(例如) Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J. G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于以引用的方式并 入的Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。可类似制备其他含有羰基或 二羰基的氨基酸。此外，本文中包含的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈示于图4、 图24-图34以及图36-图39中。
在一些实施例中，包括非天然氨基酸的多肽经化学修饰以产生反应性羰基或二羰基 官能基。例如，适用于接合反应的醛官能基可由具有邻近氨基和羟基的官能基产生。其 中生物活性分子为多肽，例如，可使用N-末端丝氨酸或苏氨酸(其通常可存在或可通过 化学消化或酶促消化暴露)在温和氧化性裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能基。参见 (例如)Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.和Stroh，J.， Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。 然而，所属领域中已知的方法局限于在肽或蛋白质的N-末端的氨基酸。
另外，例如具有邻近羟基和氨基的非天然氨基酸可以“经掩蔽”醛官能基的形式并 入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸具有邻接ε胺的羟基。产生醛的反应条件通常包括 在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠以避免在多肽内的其他位点处氧化。氧化反应 的pH值通常为约7.0。典型的反应包括向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高 碘酸钠，接着在黑暗中培养约10分钟。参见(例如)美国专利第6,423,685号。
B.非天然氨基酸：含羟胺的氨基酸的结构和合成
含有羟胺(也称作氨基氧基)基团的非天然氨基酸容许与多种亲电子基团反应以形 成接合物(包含(但不限于)与PEG或其他水溶性聚合物)。如同肼、酰肼和半卡巴肼 一样，氨基氧基的增强的亲核性使其有效且选择性地与含有羰基或二羰基(包含(但不 限于)酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能基)的多种分子反应。参见(例如)Shao， J.和Tarn，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Ace.Chem. Res.34(9)：727-736(2001)。而与肼基的反应结果为相应腙，然而，肟通常由氨基氧基与 含有羰基或二羰基的基团(诸如，酮、醛或具有类似化学反应性的其他官能基)反应产 生。
因此，在本文中描述的某些实施例中为具有包括以下基团的侧链的非天然氨基酸， 所述侧链包括羟胺基、类羟胺基(其具有类似于羟胺基的反应性且结构上类似于羟胺 基)、经掩蔽羟胺基(其可易于转变为羟胺基)、或经保护羟胺基(在去保护之后其具有 类似于羟胺基的反应性)。这些氨基酸包含具有下式的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、 杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷基、-C(O)R″、 -C(O)2R″、-C(O)N(R″)2、其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯 基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳 烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且
L为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取 代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷 基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，A为亚苯基或经取代亚苯基。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，B为-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S-(亚烷基或经取代亚烷基)-或-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XIV)化合物的 某些实施例中，B为-O(CH2)2、-S(CH2)2-、-NH(CH2)2-、-CO(CH2)2-或-(CH2)n-，其中n 为1至4。在式(XIV)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基 甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，其中R1为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(XIV)化合 物的某些实施例中，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(XIV)化合物 的某些实施例中，其中R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。在式(XIV)化合物的某 些实施例中，其中R2为聚核苷酸。在式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为核 糖核酸(RNA)。在式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为tRNA。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，其中tRNA特异性识别选择密码子。在式(XIV)化合物的某 些实施例中，其中选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特 密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。在 式(XIV)化合物的某些实施例中，其中R2为抑制tRNA。在式(XIV)化合物的某些 实施例中，R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、 烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经 取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基。在式(XIV)化合物 的某些实施例中，R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、甲基、苯基以 及-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为1-50。在式(XIV) 化合物的某些实施例中，K为-NR6R7。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、 染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒以及胶束组成的群组的生物 活性剂。在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒 剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子以及甾族剂组成的群组 的药物。在式(XIV)化合物的某些实施例中，X为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、β-半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶组成的群组的酶。在式(XIV)化合物的某些实施 例中，X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁 性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分以及能量转移部分组成的群组的可检测标 记。
在某些实施例中，式(XIV)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。 在某些实施例中，式(XIV)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中， 式(XIV)化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为 pH 2至8。
这些氨基酸包含具有式(XV)的结构的氨基酸：
其中
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
非限制性、代表性氨基酸具有以下结构：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
含有氨基氧基的氨基酸可由易于获得的氨基酸前驱物(高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨 酸)来制备。参见(例如)M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。 某些含有氨基氧基的氨基酸(诸如L-2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸)已从天然来源分离 (Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。其他含有氨基氧基的氨基酸可类 似制备。此外，本文中描述的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈示于图5中。
C.非天然氨基酸：含肟氨基酸的化学合成
含有肟基的非天然氨基酸容许与含有某些反应性羰基或二羰基(包含(但不限于) 酮、醛或具有类似反应性的其他基团)的多种试剂反应以形成包括新肟基的新非天然氨 基酸。此肟交换反应容许非天然氨基酸多肽进一步官能化。此外，含有肟基的原始非天 然氨基酸本身可为适用的，只要肟键在将氨基酸并入多肽中所必需的条件下为稳定的 (例如，活体内、活体外以及本文中描述的化学合成方法)。
因此，在本文中描述的某些实施例中为具有包括以下基团的侧链的非天然氨基酸， 所述侧链包括肟基、类肟基(其具有类似于肟基的反应性且结构上类似于肟基)、经掩 蔽肟基(其可易于转变为肟基)、或经保护肟基(在去保护之后其具有类似于肟基的反 应性)。这些氨基酸包含具有式(XI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其限制条件为当A与B不存在时，R不为甲基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
在式(XI)化合物的某些实施例中，B为-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XI) 化合物的某些实施例中，B为-O(CH2)-。在式(XI)化合物的某些实施例中，R为C1-6 烷基。在式(XI)化合物的某些实施例中，R为-CH3。在式(XI)化合物的某些实施例 中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基 (TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式(XI)化合物的某些实施例中，R1为树脂、氨基酸、 多肽或聚核苷酸。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或 O-叔丁基。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。 在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为聚核苷酸。
在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(XI)化合物的 某些实施例中，R2为tRNA。在式(XI)化合物的某些实施例中，tRNA特异性识别选 择密码子。在式(XI)化合物的某些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石 密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及 四碱基密码子组成的群组。在式(XI)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。在式 (XI)化合物的某些实施例中，R5为烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、 经取代聚氧化亚烷基或-C(O)2R″。在式(XI)化合物的某些实施例中，R5为-[(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为1-50。在式(XI)化合物的某些 实施例中，R5为-(CH2CH2)-O-CH3或-COOH。
在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(I) 化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
式(XI)的氨基酸包含具有式(XII)的结构的氨基酸：
其中，
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群的连接子：低级亚烷基、经 取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂烷 基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其 中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R-′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2；其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸包含具有式(XIII)结构的氨基酸：
其中，
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或 经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚 烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸的其他非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，这些氨基酸包含具有式(XIV)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸进一步包含具有式(XVI)的结构的氨基酸：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
此外，这些氨基酸包含具有式(XVII)的结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基。
这些氨基酸的非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
以及
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
另外，这些氨基酸包含具有式(XVIII)的结构的氨基酸：
其中：
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-
(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，以及经取代芳烷 基、-C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、 烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经 取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光异构化部分； 生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团； 延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的 部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团； 发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；以及其任何组合；且L为可选的，且 当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、 经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经 取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、 -C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中 R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；且
Ra各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、 -C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′以及-S(O)kR′；其中R′各自独立地为 H、烷基或经取代烷基且n为0至8。
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
这些氨基酸的非限制性实例包含具有以下结构的氨基酸：
以及
这些非天然氨基酸可为盐的形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或聚 核苷酸中且视情况经翻译后修饰。
基于肟的非天然氨基酸可由所属领域中已描述的方法或由本文中描述的方法来合 成，其包含：(a)使含羟胺的非天然氨基酸与含有羰基或二羰基的试剂反应；(b)使含 有羰基或二羰基的非天然氨基酸与含羟胺的试剂反应；或(c)使含肟的非天然氨基酸 与某些含有羰基或二羰基的试剂(包含例如含酮试剂或含醛试剂)反应。图5与图6呈 示这些合成方法的代表性、非限制性实例。
D.非天然氨基酸的细胞吸收
当设计和选择非天然氨基酸(包含(但不限于)用于并入多肽中)时，真核细胞的 非天然氨基酸吸收为通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些 化合物不太可能透过细胞。天然氨基酸是通过基于蛋白质的传输系统的集合吸收于真核 细胞中。可进行评估哪些非天然氨基酸(如果存在的话)由细胞吸收的快速筛检(本文 中的实例15和16说明可对非天然氨基酸进行的测试的非限制性实例)。参见(例如) 标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第2004/198637号(此案是以引用的方式全 部并入本文中)中的毒性检定，以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United States 96：4780-4785。尽管吸收易于通过各种检定分析，但设计符合细胞吸收途径的非天然氨 基酸的替代方案为提供活体内产生氨基酸的生物合成途径。
通常，通过如本文中所述的细胞吸收产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质 生物合成的浓度(包含(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如影响其他氨基酸 的浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式产生的典型浓度为约10mM至约0.05mM。
E.非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于用于产生氨基酸和其他化合物的细胞中。虽然特定非天 然氨基酸的生物合成方法可能在自然界(包含(但不限于)细胞)中不存在，但本文中 描述的方法和组合物提供这些方法。举例来说，非天然氨基酸的生物合成途径可通过添 加新的酶或修饰现存宿主细胞途径于宿主细胞中产生。其他新酶包含天然存在的酶或人 工演化的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中的实例所呈示)依赖于添加来自其他生物 体的已知酶的组合。这些酶的基因可通过以包括这些基因的质粒转化细胞而引入真核细 胞中。当于细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促途径。本文中提供视情 况添加的酶的类型的实例。其他酶序列见于(例如)基因库(Genbank)中。人工演化 的酶可以相同方式添加到细胞中。以此方式，操纵细胞的细胞机制和来源以产生非天然 氨基酸。
多种方法可用于制备用于生物合成途径或演化现存途径的新颖酶。举例来说，包含 (但不限于)如由Maxygen，Inc.(可于万维网(world wide web)上以www.maxygen.com 获得)开发的递归重组可用于开发新颖的酶和途径。参见(例如)Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature 370(4)：389-391；以及Stemmer， (1994)，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。由Genencor(可于万维 网上以genencor.com获得)开发的Similarly DesignPathTM视情况用于代谢途径工程设计 中，其包含(但不限于)用于工程设计于细胞中产生非天然氨基酸的途径。此技术使用 新基因的组合(包含(但不限于)通过功能基因组学、分子进化和设计鉴别的那些)来 改造宿主生物体中的现存途径。Diversa Corporation(可于万维网上以diversa.com获得) 也提供快速筛检基因和基因途径的库的技术，其包含(但不限于)产生用于通过生物合 成产生非天然氨基酸的新途径。
通常，以如本文中所述的经工程设计的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以 进行有效蛋白质生物合成的浓度(包含(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如 影响其他氨基酸浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10 mM至约0.05mM。一旦以包括用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞且产 生非天然氨基酸，则视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成与细胞生长进一步 优化非天然氨基酸的产生。
F.其他合成方法
本文中描述的非天然氨基酸可使用所属领域中描述的方法或使用本文中描述的技 术或由其组合来合成。作为辅助，下表提供可经组合以产生所需官能基的各种起始亲电 子试剂和亲核试剂。所提供的信息意欲为说明性的且并非限制本文中描述的合成技术。
表1：共价键以及其前驱物的实例
共价键产物 亲电子试剂 亲核试剂 羧酰胺 活化酯 胺/苯胺 羧酰胺 酰基叠氮化物 胺/苯胺 羧酰胺 酰基卤化物 胺/苯胺 酯 酰基卤化物 醇/酚 酯 酰基腈 醇/酚 羧酰胺 酰基腈 胺/苯胺 亚胺 醛 胺/苯胺 腙 醛或酮 肼 肟 醛或酮 羟胺 烷基胺 烷基卤化物 胺/苯胺
酯 烷基卤化物 羧酸 硫醚 烷基卤化物 硫醇 醚 烷基卤化物 醇/酚 硫醚 磺酸烷基酯 硫醇 酯 磺酸烷基酯 羧酸 醚 磺酸烷基酯 醇/酚 酯 酐 醇/酚 羧酰胺 酐 胺/苯胺 苯硫酚 芳基卤化物 硫醇 芳基胺 芳基卤化物 胺 硫醚 Azindine 硫醇 硼酸酯 硼酸盐 二醇 羧酰胺 羧酸 胺/苯胺 酯 羧酸 醇 肼 酰肼 羧酸 N-酰基脲或酐 碳化二亚胺 羧酸 酯 重氮烷 羧酸 硫醚 环氧化物 硫醇 硫醚 卤基乙酰胺 硫醇 氨基三嗪 卤基三嗪 胺/苯胺 三嗪基醚 卤基三嗪 醇/酚 脒 酰亚胺酯 胺/苯胺 脲 异氰酸酯 胺/苯胺 氨基甲酸酯 异氰酸酯 醇/酚 硫脲 异硫氰酸酯 胺/苯胺 硫醚 马来酰亚胺 硫醇 亚磷酸酯 氨基磷酸酯 醇 硅烷基醚 硅烷基卤化物 醇 烷基胺 磺酸酯 胺/苯胺 硫醚 磺酸酯 硫醇 酯 磺酸酯 羧酸 醚 磺酸酯 醇 磺酰胺 磺酰基卤化物 胺/苯胺 磺酸酯 磺酰基卤化物 酚/醇
一般来说，碳亲电子试剂对于互补亲核试剂(包含碳亲核试剂)的进攻敏感，其中 进攻的亲核试剂向碳亲电子试剂提供电子对以在亲核试剂与碳亲电子试剂之间形成新 键。
碳亲核试剂的非限制性实例包含(但不限于)烷基格氏试剂(alkyl Grignard)、烯 基格氏试剂、芳基格氏试剂以及炔基格氏试剂、有机锂、有机锌、烷基锡试剂、烯基锡 试剂、芳基锡试剂以及炔基锡试剂(有机锡烷)、烷基硼烷试剂、烯基硼烷试剂、芳基 硼烷试剂以及炔基硼烷试剂(有机硼烷以及有机硼酸盐)；这些碳亲核试剂具有在水或 极性有机溶剂中在动力学上稳定的优点。碳亲核试剂的其他非限制性实例包含磷内鎓 盐、烯醇以及烯醇化物试剂；这些碳亲核试剂具有相对易于由合成有机化学领域中的技 术人员熟知的前驱物产生的优点。当与碳亲电子试剂共同使用时，碳亲核试剂在碳亲核 试剂与碳亲电子试剂之间形成新的碳碳键。
适于与碳亲电子试剂偶合的非碳亲核试剂的非限制性实例包含(但不限于)伯胺与 仲胺、硫醇、硫醇盐以及硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、半卡巴肼以及其类似物。当与碳 亲电子试剂共同使用时，这些非碳亲核试剂通常产生杂原子键(C-X-C)，其中X为杂 原子，其包含(但不限于)氧、硫或氮。
VI.具有非天然氨基酸的多肽
为方便起见，这部分中描述的化合物的形式、性质和其他特征已一般性及/或以特定 实例来描述。然而，这部分中描述的形式、性质和其他特征不应仅限于这部分中提供的 一般性描述或特定实例，而是这部分中描述的形式、性质和其他特征同样良好适用于处 于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物， 其包含处于本文中的说明书、权利要求以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A 和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物。
本文中描述的组合物和方法提供将至少一个非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基 酸可存在于多肽上的任何位置处，其包含多肽的任何末端位置或任何内部位置。相对于 同源天然存在氨基酸多肽来说，优选非天然氨基酸不破坏多肽的活性及/或三级结构，除 非活性及/或三级结构的此破坏为将非天然氨基酸并入多肽中的一个目的。此外，相对于 同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天然氨基酸并入多肽中可在一定程度上修饰多肽的 活性(例如，操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、 药理学及/或药效(例如，增大水溶性、生物可用性；增大血清半衰期；增大治疗半衰期； 调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)；向多肽提供其他官能基；向多肽中 并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质；以及前述修饰的任何组合)及/ 或三级结构，而完全不造成活性及/或三级结构的破坏。对活性及/或三级结构的这些修 饰通常为实现这些并入的一个目标，尽管相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天 然氨基酸并入多肽中也可对多肽的活性及/或三级结构不产生影响。相应地，认为非天然 氨基酸多肽、包括非天然氨基酸多肽的组合物、用于制造这些多肽和多肽组合物的方法、 用于纯化、分离和表征这些多肽和多肽组合物的方法，以及使用这些多肽和多肽组合物 的方法在本揭露内容的范畴内。此外，本文中描述的非天然氨基酸多肽也可连接到另一 多肽(包含(例如)非天然氨基酸多肽或天然存在氨基酸多肽)上。
本文中描述的非天然氨基酸多肽可通过生物合成或非生物合成制备。生物合成意谓 利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何方法，其包含使用以下组分中的至少一者：聚核 苷酸、密码子、tRNA以及核糖体。非生物合成意谓不利用翻译系统的任何方法：这种 方法可进一步分为利用固态肽合成方法、固相肽合成方法的方法；利用至少一种酶的方 法；以及不利用至少一种酶的方法；另外，这个细分部分中的任何部分可重叠且许多方 法可利用这些细分部分的组合。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或 家族。确实，实质上任何多肽可包含至少一个本文中描述的非天然氨基酸。仅举例来说， 多肽可与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑 制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心 房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、 NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核 细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、 单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、 T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体 因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、 MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮 剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维 蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促 性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、 水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1 受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、 神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、 甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热 外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、 可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长 调节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、 SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综 合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因 子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、 jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮 质酮。在相关或其他实施例中，非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多 肽成员同源。
非天然氨基酸多肽可如本揭露内容中其他地方所述经进一步修饰或非天然氨基酸 多肽可不经进一步修饰而使用。可为多种目的而将非天然氨基酸并入多肽中，其包含(但 不限于)定制蛋白质结构及/或功能的改变，改变蛋白酶靶位点的大小、酸性、亲核性、 氢键、疏水性、可接近性，靶向部分(包含(但不限于)，对于多肽阵列)等。包含非 天然氨基酸的多肽可具有增强的或甚至完全新的催化或生物物理性质。仅举例来说，以 下性质可通过将非天然氨基酸包含于多肽中来加以改造：毒性、生物分布、结构性质、 光谱性质、化学及/或光化学性质、催化能力、半衰期(包含(但不限于)血清半衰期)、 与其他分子反应(包含(但不限于)共价或非共价)的能力以及其类似性质。具有包含 至少一个非天然氨基酸的多肽的组合物适用于(包含，但不限于)新颖治疗、诊断、催 化酶、工业酶、结合蛋白(包含(但不限于)抗体)，以及研究(包含(但不限于)对 蛋白质结构和功能的研究)。参见(例如)Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。
此外，多肽的非天然氨基酸组分的侧链可向多肽提供多种其他官能基；仅举例来说， 且并非加以限制，多肽的非天然氨基酸部分的侧链可包含以下物质中的任一者：标记； 染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒素化合物；药物； 亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物； 抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA； 反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记； 荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用 的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生 物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链； 碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物 理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能 量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子 俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活 化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、 向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合。
一方面，组合物包含至少一种具有至少一个(包含(但不限于)至少两个、至少三 个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十 个以上)非天然氨基酸的多肽。这些非天然氨基酸可相同或不同。另外，在包括1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的 不同或相同非天然氨基酸的多肽中可能存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同位点。另一方面，组合物包含其 中多肽中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的多肽。对于 具有一个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，这些非天然氨基酸可相同或不同(诸如， 仅举例来说，多肽可包含两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或可包含两个相同 的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，非天然氨基酸可 相同、不同或为多个数目的相同种类的非天然氨基酸与至少一种不同非天然氨基酸的组 合。
尽管本文中描述的非天然氨基酸多肽的实施例可通过固相肽合成方法(诸如，仅举 例来说，于固体树脂上)、溶液相肽合成方法及/或不借助于酶来化学合成，但本文中描 述的非天然氨基酸多肽的其他实施例容许通过细胞膜、细胞提取物或溶解产物系统，或 通过活体内系统(诸如，仅举例来说，使用原核细胞或真核细胞的细胞机制)来合成。 在其他或额外实施例中，本文中描述的非天然氨基酸多肽的一种关键特征在于其可利用 核糖体来合成。在本文中描述的非天然氨基酸多肽的其他或额外实施例中，非天然氨基 酸多肽可通过方法的组合(包含(但不限于)固体树脂、不借助于酶、借助于核糖体及 /或通过活体内系统的组合)来合成。
通过核糖体及/或活体内系统合成非天然氨基酸多肽具有与于固体树脂上或不借助 于酶合成的非天然氨基酸多肽不同的优点和特征。这些优点和特征包含不同的杂质分 布：利用核糖体及/或活体内系统的系统应具有源于所利用的生物系统的杂质，其包含宿 主细胞蛋白质、膜部分以及脂质，而来自利用固体树脂及/或不借助于酶的系统的杂质分 布可包含有机溶剂、保护基、树脂材料、偶合试剂以及合成程序中使用的其他化学品。 另外，通过使用核糖体及/或活体内系统合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映细 胞利用的原料的同位素模式；另一方面，于固体树脂上及/或不借助于酶合成的非天然氨 基酸多肽的同位素模式可反映合成中利用的氨基酸的同位素模式。此外，通过使用核糖 体及/或活体内系统合成的非天然氨基酸可实质上不含氨基酸的D-异构体及/或可能够易 于将内部半胱氨酸氨基酸并入多肽的结构中，及/或可能很少提供内部氨基酸缺失多肽。 另一方面，通过固体树脂及/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽可具有较高含量的氨基 酸的D-异构体及/或较低含量的内部半胱氨酸氨基酸及/或较高百分比的内部氨基酸缺失 多肽。此外，所属领域的技术人员应能够区分通过使用核糖体及/或活体内系统合成的非 天然氨基酸多肽与通过固体树脂及/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽。
VII.包括核酸和寡核苷酸的组合物和方法
A.用于本文中的通用重组核酸方法
在本文中描述的方法和组合物的众多实施例中，将编码所关注的多肽(包含例如 GH多肽)的核酸分离、克隆且通常使用重组方法改造。这些实施例用于(包含，但不 限于)蛋白质表达或在产生来源于多肽的变体、衍生物、表达盒或其他序列的过程中使 用。在一些实施例中，编码多肽的序列是操作性连接于异源启动子上。
编码包括非天然氨基酸的多肽的核苷酸序列可根据母体多肽的氨基酸序列合成，且 随后改变核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺 失或取代)。核苷酸序列可根据常规方法通过定点突变形成来方便地修饰。或者，核苷 酸序列可通过化学合成来制备，其包含(但不限于)通过使用寡核苷酸合成仪，其中寡 核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列设计，且优选选择重组多肽将产生于其中的宿主细 胞偏爱的那些密码子。举例来说，编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸可由PCR、连 接或连接链反应来合成且组装。参见(例如)Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88： 189-193(1991)；U.S.6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。
本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物利用重组遗传学领域中的常规技术。揭露 用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物的通用方法的基础著作包含Sambrook等 人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编，1994)。
描述分子生物学技术的一般著作包含Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA (Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷， Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)以及 Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.的合资企业，(1999全年增补) (″Ausubel″))。这些著作描述突变形成，载体、启动子的用途，以及许多其他相关主题， 其涉及包含(但不限于)包含用于制备包含非天然氨基酸的蛋白质的选择密码子、正交 tRNA、正交合成酶以及其对的基因或聚核苷酸的产生。
各种类型的突变形成用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物中以为实现多 种目的，其包含(但不限于)用于产生新颖合成酶或tRNA，用于使tRNA分子突变， 用于使编码合成酶、tRNA库的聚核苷酸突变，用于产生合成酶库，用于产生选择密码 子，用于插入编码所关注的蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。其包含(但 不限于)定点突变形成、随机点突变形成、同源重组、DNA改组或其他递归突变形成方 法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的突变形成、寡核苷酸定向诱变、经硫代磷酸酯 修饰的DNA突变形成、使用带缺口的双链DNA或其类似物的突变形成，或其任何组合。 其他适合方法包含点错配修复、使用缺乏修复的宿主菌株的突变形成、限制-选择以及限 制-纯化、缺失突变形成、通过总基因合成诱发突变、双链断裂修复，以及其类似方法。 包含(但不限于)包括嵌合构筑体的突变形成也包含在本文中描述的非天然氨基酸方法 和组合物中。在一实施例中，突变形成可由天然存在分子或变异或突变的天然存在分子 的已知信息(包含(但不限于)序列比较、物理性质、晶体结构或其类似物)指导。
本文中存在的著作和实例描述这些和其他相关程序。其他信息见于以下公开案和其 中引用的参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，在Nucleic Acids & Molecular Biology中(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编， Springer Verlag，Berlin))(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人， Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)； Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500 (1982)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml3 vectors，Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller和Smith， Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等 人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA， Nucl.Acids Res.13：8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人， 5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl. Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12： 9441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人， Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter， Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Methods in Enzymol.154： 382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317： 415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease Sprotein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人， Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesisby microscale′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki， Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)； Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001).W.P.C.Stemmer， Nature 370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8 (1995)。关于许多这些方法的其他细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，其也 描述以各种突变形成方法对产生故障的问题的有效控制。
本文中描述的方法和组合物也包含使用真核宿主细胞、非真核宿主细胞以及生物体 通过正交tRNA/RS对活体内并入非天然氨基酸。宿主细胞经对应于本文中描述的多肽的 聚核苷酸和包含对应于本文中描述的多肽的聚核苷酸的构筑体(包含(但不限于)对应 于本文中描述的多肽的载体，其可为(例如)克隆载体和表达载体)遗传工程化(包含 (但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶以及欲 衍生的蛋白质的编码区域操作性连接至在所需宿主细胞中具有功能的基因表达控制元 件上。载体可为(例如)质粒、粘粒、噬菌体、细菌、病毒、裸露聚核苷酸和接合聚核 苷酸的形式。用标准方法(包含电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824 (1985))、由病毒载体感染、由在小珠粒或粒子的基质内具有核酸的小粒子高速弹道穿透) 将载体引入细胞及/或微生物中，或引至表面上(Klein等人，Nature 327，70-73(1987)) 及/或其类似物。
经工程化设计的宿主细胞可于经改良以适于诸如(例如)筛检步骤、活化启动子或 选择转化株的行为的常规营养培养基中培养。这些细胞可视情况培养为转基因生物体。 其他包含(但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于随后的核酸分离)的适用参考 文献包含Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版， Wiley-Liss，New York以及其中引用的参考文献；Payne等人.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编) (1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual， Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。
可获得将目标核酸引入细胞中的若干种熟知方法，其中任一者可用于本文中描述的 方法和组合物中。其包含：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、射 弹轰击，以及以病毒载体感染(在本文中进一步论述)等。细菌细胞可用于扩增含有对 应于本文中描述的多肽的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长至log阶段且细菌内 的质粒可通过所属领域中已知的多种方法分离(参见，例如.Sambrook)。另外，众多 试剂盒可市面上购得以用于从细菌中纯化质粒，(参见(例如)EasyPrepTM、FlexiPrepTM， 两者均来自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，来自Stratagene；以及QIAprepTM，来自 Qiagen)。经分离且纯化的质粒随后经进一步处理以产生其他质粒，用于转染细胞或并 入用于感染生物体的相关载体中。典型的载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始 序列，以及适用于调节特定目标核酸的表达的启动子。载体视情况包括含有至少一个独 立终止子序列的一般表达盒、容许序列盒在真核生物或原核生物或两者中复制的序列 (包含(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统两者的选择标记。载体适 于在原核生物、真核生物或优选两者中复制和整合。参见，Gillam和Smith，Gene 8：81 (1979)；Roberts等人，Nature，328：731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif. 6(1)：10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(均如上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体 的目录由(例如)ATCC提供，例如，ATCC出版的The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆以及分子生物学的其他方面的 其他基本程序以及潜在理论考虑因素也见于Watson等人.(1992)Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books，NY中。另外，基本上任何核酸(以及实质上 任何经标记核酸，无论标准或非标准)可从多种商业来源的任一者定制或标准定购，这 些商业来源诸如the Midland Certified Reagent Company(Midland，TX mcrc.com)、The Great American Gene Company(Ramona，CA，在万维网上以genco.com获得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，在万维网上以expressgen.com获得)、Operon Technologies Inc.(Alameda， CA)以及许多其他来源。
B.选择密码子
涵盖于本文中描述的方法和组合物中的选择密码子详述蛋白质生物合成机制的遗 传密码子框架。举例来说，选择密码子包含(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码 子(诸如终止密码子，其包含(但不限于)琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、 非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子或其类似物。可引入所需基 因或聚核苷酸中的选择密码子的数目存在广泛范围，其在编码所关注的多肽的至少一部 分的单一聚核苷酸中包含(但不限于)一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、 4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上。
在一实施例中，所述方法包括使用作为终止密码子的选择密码子用于活体内并入一 个或一个以上的非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包含(但不限于)UAG) 的O-tRNA且其由O-RS以所需非天然氨基酸氨酰基化。此O-tRNA并不由天然存在宿 主的氨酰基-tRNA合成酶识别。可使用常规定点突变形成在所关注的多肽中的所关注位 点处引入终止密码子(包含(但不限于)UAG)。参见(例如)Sayers，J.R.等人.(1988)，5′，3′ Exonuclease in phosphorothioate-based oligomicleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，16(3)：791-802。当将O-RS、O-tRNA以及编码所关注的多肽的核酸在活体内组合时， 非天然氨基酸回应UAG密码子而得以并入以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多 肽。
可在活体内进行非天然氨基酸的并入而不造成真核宿主细胞的显著混乱。举例来 说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包含(但不限于)琥珀抑制tRNA) 与真核释放因子(包含(但不限于)eRF)(其与终止密码子结合且引起生长中的肽从核 糖体释放)之间的竞争，抑制效率可通过(包含，但不限于)增加O-tRNA及/或抑制tRNA 的表达水平来调节。
选择密码子也包括延长的密码子，其包含(但不限于)四个或四个以上碱基的密码 子(诸如，四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子)。四碱基密码子的实例包含(但 不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU以及其类似物。五碱基密码子的实例包含(但 不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC以及其类似物。本 文中描述的方法和组合物的特征包含使用根据移码抑制延长的密码子。四个或四个以上 碱基的密码子可将(包含，但不限于)一或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例 来说，在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt反密码子环)的突变型O-tRNA(包 含(但不限于)特定移码抑制tRNA)的存在下，四个或四个以上碱基的密码子作为单 一氨基酸读取。在其他实施例中，反密码子环可解码，其包含(但不限于)至少一个四 碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多。因为存在256个 可能的四碱基密码子，在同一细胞中多种非天然氨基酸可使用四个或四个以上碱基的密 码子编码。参见Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size， Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ″Shifty″ Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，四碱基密码子已用于使用活体外生物合成方法将非天然氨基酸并入蛋白 质中。参见(例如)Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939-7945；以及Hohsaka等人， (1999)J.Am.Chem.Soc，121：34-40。以两个化学酰化移码抑制tRNA，使用CGGG和 AGGU在活体外将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBU衍生物同时并入链霉亲合素中。参见 (例如)Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：12194-12195。在活体内研究中， Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、 A、G或C)的能力，且发现四联组UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％ 至26％的效率解码，其中在0或-1框架中仅少许解码。参见，Moore等人，(2000)J.Mol. Biol.，298：195-205。在一实施例中，基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子可用于 本文中描述的方法和组合物中，其可减少在其他不需要的位点处的错义通读和移码抑 制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包含天然三碱基密码子中的一者，其中内源性 系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，其包含缺乏识别天然三碱基密 码子的tRNA的系统，及/或其中三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包含非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩大现有遗传符号 系统。一个额外碱基对将三联体密码子的数目由64增加至125。第三碱基对的性质包含 稳定及选择性碱基配对、由聚合酶进行的以高保真度有效酶促并入DNA中，以及在初 生非天然碱基对合成后有效的持续引物延长。对可适合于方法和组合物的非天然碱基对 的描述包含(例如)Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein，Nature Biotechnology，20：177-182，且也参见Wu，Y.等人(2002)J. Am.Chem.Soc.124：14626-14630。其他相关公开案列于本文中。
对于活体内使用，非天然核苷为膜可透过性的且经磷酸化以形成相应三磷酸酯。另 外，增加的遗传信息为稳定的且不由细胞酶破坏。Benner和其他人的先前努力利用与典 型沃森-克里克碱基对(Watson-Crick pair)中的那些氢键类型不同的氢键类型，其中最 值得注意的实例为异-C:异-G对。参见(例如)Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc， 111：8322-8322；以及Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33-37；Kool，(2000)Curr.Opin. Chem.Biol.，4：602-608。这些碱基通常在某种程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。 Kool和合作者证实碱基之间的疏水堆叠相互作用可取代氢键以驱动碱基对的形成。参 见，Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602-608；以及Guckian和Kool，(1998)Angew. Chem.Int.Ed.Engl.，36(24)：2825-2828。在努力开发满足所有上述要求的非天然碱基对 的过程中，Schultz、Romesberg以及合作者已系统地合成且研究了一系列非天然疏水碱 基。发现PICS∶PICS自身配对比天然碱基对更稳定，且其可通过大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段(KF)有效并入DNA中。参见(例如)McMinn等人，(1999)J.Am.Chem. Soc，121：11585-11586；以及Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：3274-3278。 3MN-3MN自身配对可以对于生物功能足够的效率和选择性由KF合成。参见(例如) Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：8803-8804。然而，两种碱基充当进一步复制 的链终止子。最近已发展出可用于复制PICS自身配对的突变型DNA聚合酶。另外，7AI 自身配对可被复制。参见(例如)Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439-7440。 也已开发出在结合Cu(II)后形成稳定配对的新颖金属碱基对Dipic:Py。参见，Meggers 等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714-10715。因为延长的密码子和非天然密码子固 有地与天然密码子正交，所以本文中描述的非天然氨基酸方法可利用此性质以产生与其 有关的正交tRNA。
翻译旁路系统也可用于将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大 序列并入基因中，但不翻译为蛋白质。所述序列含有充当诱发核糖体越过所述序列且在 插入下游继续翻译的信号的结构。
在某些实施例中，本文中描述的方法及/或组合物中所关注的蛋白质或多肽(或其部 分)是由核酸编码。通常，核酸包括至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少 三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、 至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上的 选择密码子。
编码所关注的蛋白质或多肽的基因可在“Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques”指导下使用所属领域的技术人员熟知以及本文中描述的方法进行诱变以包 含(例如)用于并入非天然氨基酸的一个或一个以上的选择密码子。举例来说，将所关 注的蛋白质的核酸诱变以包含一个或一个以上的选择密码子，提供一个或一个以上的非 天然氨基酸的并入。本文中描述的方法和组合物包含任何这种变体，其包含(但不限于) 任何蛋白质(例如，包含至少一个非天然氨基酸)的突变形式。类似地，本文中描述的 方法和组合物包含相应核酸，即，具有一个或一个以上编码或容许一个或一个以上的非 天然氨基酸的活体内并入的选择密码子的任何核酸。
编码所关注的多肽(包含(仅举例来说)GH多肽)的核酸分子可易于突变以在多 肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、 蛋白质或多种其他分子引入至所关注的蛋白质上。适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置 中的方法在所属领域中为熟知的，诸如描述于美国专利第6,608,183号(其是以引用的 方式全部并入本文中)中的那些方法，以及标准突变形成技术。这种引入且利用半胱氨 酸的技术的使用可与本文中描述的引入且利用非天然氨基酸的技术联合使用。
VIII.包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生
为方便起见，这部分中描述的包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生一般性及/或以 特定实例来描述。然而，这部分中描述的包括非天然氨基酸的多肽的活体内产生不应仅 限于这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的包括非天然氨基酸的多 肽的活体内产生同样良好适用于处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及 XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物，其包含处于本文中的说明书、权利要求以及图 式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何 子式或特定化合物。
本文中描述的多肽可使用经修饰以添加或取代未在天然存在系统中编码的氨基酸 的tRNA和tRNA合成酶而在活体内产生。
产生使用未在天然存在系统中编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述于 (例如)美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)以及2003/0108885(序 号10/126,931)中，其是以引用的方式全部并入本文中。这些方法包括产生独立于对翻 译系统而言为内源性(且因此有时被称作“正交”)的合成酶和tRNA行使功能的翻译机 制。在一实施例中，翻译系统包括编码多肽的聚核苷酸；聚核苷酸可为从相应DNA转 录的mRNA，或mRNA可从RNA病毒载体中产生；此外聚核苷酸包括对应于并入非天 然氨基酸的预先指定位点的选择密码子。翻译系统进一步包括针对且(适当时)也包括 非天然氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对前述选择密码子具有特异性/特异性识别前述 选择密码子；在其他实施例中，非天然氨基酸经氨酰基化。非天然氨基酸包含具有本文 中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII中的任一者的结构 的那些非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，翻译系统包括对所述tRNA具有特异性 的氨酰基合成酶，且在其他或此外的实施例中，翻译系统包括正交tRNA以及正交氨酰 基tRNA合成酶。在其他或额外实施例中，翻译系统包括以下各物中的至少一者：包括 前述聚核苷酸的质粒(诸如，仅举例来说，以DNA的形式)、包括前述聚核苷酸的基因 组DNA(诸如，仅举例来说，以DNA的形式)或前述聚核苷酸整合于其中的基因组 DNA(在其他实施例中，所述整合为稳定整合)。在翻译系统的其他或额外实施例中， 选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码 子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。在翻译系统的其他或 额外实施例中，tRNA为抑制tRNA。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸多肽是由核 糖体来合成。
在其他或额外实施例中，翻译系统包括正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA 合成酶(O-RS)。通常，在翻译系统中O-RS优先以至少一种非天然氨基酸氨酰基化 O-tRNA且O-tRNA识别至少一种不由系统中的其他tRNA识别的选择密码子。翻译系 统因此将非天然氨基酸插入系统中产生的多肽中，以回应所编码的选择密码子，进而将 非天然氨基酸“取代”入所编码的多肽中的位置中。
用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA以及氨酰基tRNA合成酶已在 所属领域中描述，且通常适用于本文中描述的方法中以产生本文中描述的非天然氨基酸 多肽。举例来说，酮特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶描述于Wang，L.等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 100(1)：56-61(2003)以及Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003) 中。例示性O-RS或其部分由聚核苷酸序列编码且包含美国专利申请公开案 2003/0082575和2003/0108885(其每一者是以引用的方式全部并入本文中)中揭露的氨 基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案 2003/0082575(序号10/126,927)以及2003/0108885(序号10/126,931)中，其是以引 用的方式全部并入本文中。另外，Mehl等人在J.Am.Chem.Soc.2003；125：935-939中以 及Santoro等人.Nature Biotechnology 2002年10月；20：1044-1048(其是以引用的方式 全部并入本文中)论述筛检方法以及用于将对氨基苯丙氨酸并入多肽中的氨酰基tRNA 合成酶和tRNA分子。
适用于本文中描述的方法中的例示性O-tRNA序列包含(但不限于)如美国专利申 请公开案2003/0108885(序号10/126,931)(其是以引用的方式并入本文中)中所揭露的 核苷酸序列SEQ ID NO：1-3。对特定非天然氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA 合成酶对的其他实例描述于美国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中， 其是以引用的方式全部并入本文中。在酿酒酵母中结合含酮氨基酸与含叠氮化物氨基酸 两者的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的用途包括选择编码非天然氨基酸的特异性密码子。 尽管可使用任何密码子，但通常需要选择很少或从不在O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶在 其中表达的细胞中使用的密码子。仅举例来说，例示性密码子包含无义密码子，诸如终 止密码子(琥珀密码子、赭石密码子以及蛋白石密码子)、四个或四个以上碱基的密码 子以及很少使用或不使用的其他的天然三碱基密码子。
可使用所属领域中已知的突变形成方法(包含(但不限于)定点突变形成、盒式突 变形成、限制选择突变形成等)将特异性选择密码子引入聚核苷酸编码序列的适当位置 中。
产生可用于并入非天然氨基酸的蛋白质生物合成机制(诸如O-RS、O-tRNA以及正 交O-tRNA/O-RS对)的组分的方法描述于Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)； Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42： 6735-6746(2003)中。用于非天然氨基酸的活体内并入的方法和组合物描述于美国专利申 请公开案2003/0082575(序号10/126,927)中，其是以引用的方式全部并入本文中。用 于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美 国专利申请公开案2003/0082575(序号10/126,927)和2003/0108885(序号10/126,931) 中，其是以引用的方式全部并入本文中。另外，标题为“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins”的PCT公开案第WO 04/035743号(其是以引用的方式全部 并入)描述用于并入酮氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO 04/094593号(其是以引用的方式全部并入本文中) 描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)产生来 源于来自第一生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS库， 其中第一生物体包含(但不限于)原核生物体，诸如，仅举例来说，詹氏甲烷球菌、热 自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠杆菌、闪烁古生球菌、强烈炽热球菌、掘越氏热球菌、 敏捷气热菌、嗜热栖热菌或其类似物，或真核生物体；(b)选择(及/或筛检)RS(视 情况突变体RS)库中在非天然氨基酸以及天然氨基酸存在下氨酰基化正交tRNA (O-tRNA)的成员，进而提供活性(视情况突变型)RS的池；及/或，(c)选择(视情 况通过阴性选择)所述池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的活 性RS(包含(但不限于)突变体RS)，进而提供至少一种重组O-RS；其中至少一种重 组O-RS优先以非天然氨基酸氨酰基化O-tRNA。
在一实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变来产生。仅举例 来说，非活性RS可通过使至少约1种、至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少 约5种、至少约6种或至少约10种或10种以上的氨基酸突变为不同氨基酸(包含(但 不限于)丙氨酸)来产生。
突变体RS库可使用所属领域中已知的各种技术来产生，其包含(但不限于)根据 蛋白质三维RS结构的合理设计，或随机或合理设计技术中RS核苷酸的突变形成。仅 举例来说，突变体RS可由位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合 构筑体、合理设计以及本文中描述或所属领域中已知的其他方法来产生。
在一实施例中，选择(及/或筛检)RS(视情况突变体RS)库中的活性成员(其包 含(但不限于)在非天然氨基酸和天然氨基酸存在下氨酰基化正交tRNA(O-tRNA)的 那些成员)包含(但不限于)：将阳性选择或筛检标记(包含(但不限于)抗生素抗性 基因或其类似物)以及(视情况突变体)RS库引入多个细胞中，其中阳性选择及/或筛 检标记包括至少一种选择密码子，其包含(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子、蛋白 石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子； 在选择剂存在下使所述多个细胞生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一种选择 密码子来鉴别在选择及/或筛检剂存在下存活(或展示特异性反应)的细胞，进而提供含 有活性(视情况突变体)RS的池的阳性选择细胞的子集。视情况，选择及/或筛检剂浓 度可改变。
一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因且选择密码子为CAT基 因中的琥珀终止密码子。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且选择密码子为β- 内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛检标记包括荧光或发光筛检标记 或基于亲和性的筛检标记(包含(但不限于)细胞表面标记)。
在一实施例中，阴性选择或筛检池中的活性RS(视情况突变体)(包含(但不限于) 在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的那些活性RS)包含(但不限 于)：以来自阳性选择或筛检的活性(视情况突变体)RS的池将阴性选择或筛检标记引 入第二生物体的多个细胞，其中阴性选择或筛检标记包括至少一种选择密码子(包含(但 不限于)抗生素抗性基因，其包含(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；且， 鉴别在补充有非天然氨基酸以及筛检或选择剂的第一培养基中存活或展示特异性筛检 反应，但在未补充有非天然氨基酸以及选择或筛检剂的第二培养基中不能存活或展示特 异性反应的细胞，进而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。仅举例来 说，CAT鉴别方案视情况充当确定适当O-RS重组体的阳性选择及/或阴性筛检。例如， 克隆池视情况在具有或不具有一种或一种以上非天然氨基酸的含有CAT(其包括至少一 种选择密码子)的生长板上复制。在含有非天然氨基酸的板上唯一生长的菌落因此被认 为含有重组O-RS。一方面，改变选择(及/或筛检)剂的浓度。在一些方面中，第一生 物体与第二生物体不同。因此，第一生物体及/或第二生物体视情况包括：原核生物、真 核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物 等。在其他实施例中，筛检标记包括荧光或发光筛检标记或基于亲和性的筛检标记。
在另一实施例中，筛检或选择(包含(但不限于)阴性选择)池中的活性(视情况 突变体)RS包含(但不限于)：分离来自阳性选择步骤(b)中的活性突变体RS的池； 将阴性选择或筛检标记(其中阴性选择或筛检标记包括至少一种选择密码子(包含(但 不限于)毒性标记基因，其包含(但不限于)核糖核酸酶barnase基因，其包括至少一 种选择密码子))和活性(视情况突变体)RS的池引入第二生物体的多个细胞中；且鉴 别在未补充非天然氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛检反应，但在补充有非天 然氨基酸的第二培养基中不能存活或展示特异性筛检反应的细胞，进而提供具有至少一 种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中至少一种重组O-RS对非天然氨基酸具有特 异性。一方面，至少一种选择密码子包括约两个或两个以上的选择密码子。这些实施例 视情况可包含其中至少一种选择密码子包括两个或两个以上的选择密码子，且其中第一 生物体与第二生物体不同(包含(但不限于)，每一生物体视情况包含(但不限于)原 核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、 原生生物等)。同样，一些方面包含其中阴性选择标记包括核糖核酸酶barnase基因(其 包括至少一种选择密码子)。其他方面包含其中筛检标记视情况包括荧光或发光筛检标 记或基于亲和性的筛检标记。在本文中的实施例中，筛检及/或选择视情况包含筛检及/ 或选择严格度的变化。
在另一实施例中，产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进 一步包括：(d)分离至少一种重组O-RS；(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组 O-RS(视情况经突变)；以及，(f)重复步骤(b)和(c)直至获得包括优先氨酰基化 O-tRNA的能力的突变型O-RS。视情况，重复步骤(d)-(f)(包含，但不限于)至少 约两次。一方面，来源于至少一种重组O-RS的第二组突变型O-RS可通过突变形成(包 含(但不限于)随机突变形成、位点特异性突变形成、重组或其组合)产生。
选择/筛检步骤的严格度包含(但不限于)阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检 步骤(c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者，在上述方法中，视情况包含 改变选择/筛检严格度。在另一实施例中，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤 (c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者包括使用报导基因，其中报导基因 是由荧光活化细胞分选技术(FACS)检测或其中报导基因是通过发光检测。视情况， 报导基因显示于细胞表面上、噬菌体显示器或其类似物上且根据涉及非天然氨基酸或类 似物的亲和性或催化活性来选择。在一实施例中，突变型合成酶显示于细胞表面上、噬 菌体显示器或其类似物上。
产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包含(但不限于)：(a)产生来源于至少一 种tRNA(包含(但不限于)来自第一生物体的抑制tRNA)的突变体tRNA的库；(b) 选择(包含(但不限于)阴性选择)或筛检在来自第一生物体的RS不存在的情况下由 来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变体)tRNA的库， 进而提供tRNA(视情况突变体)的池；以及，(c)选择或筛检所述tRNA(视情况突变 体)的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，进而提供至少一种重组O-tRNA； 其中至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第二生物体的RS有效识别且 由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，至少一种tRNA为抑制tRNA及/或包括天然 及/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、 包括至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一实施 例中，重组O-tRNA具有正交性的提高。应了解，在一些实施例中，O-tRNA视情况从 第二生物体中引入至第一生物体中而无需修饰。在各种实施例中，第一生物体与第二生 物体相同或不同且视情况选自(包含，但不限于)原核生物(包含(但不限于)詹氏甲 烷球菌、热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐杆菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵 母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA视情况经非天然氨 基酸氨酰基化，其中非天然氨基酸是天然地或通过遗传操作在活体内生物合成。非天然 氨基酸视情况添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中，其中非天然氨基酸 能够达到适当细胞内浓度以容许并入非天然氨基酸多肽中。
一方面，选择(包含(但不限于)阴性选择)或筛检库中由氨酰基-tRNA合成酶(步 骤(b))氨酰基化的(视情况突变体)tRNA包含：将毒性标记基因(其中毒性标记基 因包括至少一种选择密码子(或导致产生毒性剂或静态剂的基因或生物体必需的基因， 其中这种标记基因包括至少一种选择密码子))和(视情况突变体)tRNA的库引入来自 第二生物体的多个细胞中；以及，选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包括至少一种 正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变体)tRNA的池。举例来说，存活细胞可通 过使用比较比率细胞密度检定来选择。
另一方面，毒性标记基因可包含两个或两个以上的选择密码子。在本文中描述的方 法的另一实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase 基因包括至少一个琥珀密码子。视情况，核糖核酸酶barnase基因可包含两个或两个以 上的琥珀密码子。
在一实施例中，选择或筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS) 氨酰基化的成员可包含：将阳性选择或筛检标记基因(其中阳性标记基因包括药物抗性 基因(包含(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包括至少一种选择密码子，诸如至少一个 琥珀终止密码子)或生物体必需的基因，或使得毒性剂解毒的基因)以及O-RS和(视 情况突变体)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中；以及，鉴别在选择或筛检 剂(包含(但不限于)抗生素)存在下生长的存活细胞或筛检细胞，进而提供具有至少 一种重组tRNA的细胞池，其中至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化且将氨基酸插 入由阳性标记基因编码的翻译产物中，以回应所述至少一种选择密码子。在另一实施例 中，改变选择及/或筛检剂的浓度。
提供产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包含(但不限于)：(a)产生来源于 来自第一生物体的至少一种tRNA的突变体tRNA的库；(b)阴性选择或筛检库中在来 自第一生物体的RS不存在的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨 酰基化的(视情况突变体)tRNA，进而提供(视情况突变体)tRNA的池；(c)选择或 筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，进而提 供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且并不由来自第 二生物体的RS有效识别且由O-RS优先氨酰基化。所述方法也包含(d)产生来源于来 自第三生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS的库；(e) 在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下选择或筛检突变体RS的库中优先氨酰基化所述 至少一种重组O-tRNA的成员，进而提供活性(视情况突变体)RS的池；以及，(f)阴 性选择或筛检池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化所述至少一种重组 O-tRNA的活性(视情况突变体)RS，进而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中 所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包括至少一种对非天然氨基酸和具有特异性的重 组O-RS以及至少一种重组O-tRNA。由本文中描述的方法产生的特异性O-tRNA/O-RS 对包含于本文中描述的范畴和方法中。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包含(包 含，但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS对(诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、 mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对或其类 似物。另外，这些方法包含其中第一生物体和第三生物体相同(包含(但不限于)詹氏 甲烷球菌)。
用于选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法 也包含在本文中描述的方法中。方法包含(但不限于)：将标记基因、tRNA以及从第一 生物体分离或来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第 一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复本细胞组中；以及，选择不 能在复本细胞组中存活的第一组中的存活细胞或筛检展示特异性筛检反应的在复本细 胞组中不能产生这种反应的细胞，其中第一组和复本细胞组是在选择或筛检剂存在下生 长，其中存活细胞或筛检细胞包括用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交 tRNA-tRNA合成酶对。在一实施例中，比较以及选择或筛检包含活体内互补检定。选择 或筛检剂的浓度可改变。
本文中描述的生物体包括多种生物体以及多种组合。在一实施例中，生物体视情况 为原核生物体，其包含(但不限于)詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、嗜盐杆菌、大肠 杆菌、闪烁古生球菌、强烈炽热球菌、掘越氏热球菌、敏捷气热菌、嗜热栖热菌或其类 似物。或者，生物体为真核生物体，其包含(但不限于)植物(包含(但不限于)复杂 植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包含(但不限于)酵 母等)、动物(包含(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)或其类似物。
A.在非真核生物和真核生物中的表达
这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的非真核生物和真 核生物中的表达。
为获得所克隆的聚核苷酸的高水平表达，通常将编码所需多肽的聚核苷酸亚克隆到 含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子的表达载体中，且如果是对于编码蛋白质的 核酸来说，则通常亚克隆用于翻译起始的核糖体结合位点。适合细菌启动子描述(例如) 于Sambrook等人以及Ausubel等人中。
用于表达多肽的细菌表达系统可用于(包含，但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌以及沙门氏菌(Salmonella)中(Palva 等人，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach等人，Nature 302：543-545(1983))。这些表达 系统的试剂盒可市面上购得。用于哺乳动物细胞、酵母以及昆虫细胞的真核表达系统可 市面上购得。在其中使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(在本文中其他地方描述) 表达多肽的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力来选择。例示性 宿主细胞包含革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)(包含(但不限于)短芽孢杆菌(B. brevis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyce))以及革兰氏阴性菌 (Gram-negative bacteria)(大肠杆菌或荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)， 以及酵母和其他真核细胞。包括O-tRNA/O-RS对的细胞可按照本文中所述来使用。
如本文中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成包括大的适用量的非天 然氨基酸的多肽的能力。一方面，组合物视情况包含(但不限于)至少10微克、至少 50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、 至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包括非天然氨基酸 的多肽，或可通过活体内多肽产生方法得到的量(关于重组蛋白质产生和纯化的细节在 本文中提供)。另一方面，多肽视情况以于(包含，但不限于)细胞溶解产物、缓冲液、 医药缓冲液或其他液体悬浮液(包含(但不限于)约1nl至约100L之间的体积)中(包 含，但不限于)每升至少10微克多肽、每升至少50微克多肽、每升至少75微克多肽、 每升至少100微克多肽、每升至少200微克多肽、每升至少250微克多肽、每升至少500 微克多肽、每升至少1毫克多肽或每升至少10毫克多肽或每升10毫克以上的多肽的浓 度存在于组合物中。在包含至少一种非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包含(但不 限于)大于通过其他方法(包含(但不限于)活体外翻译)得到的通常可能的量)蛋白 质为本文中描述的方法、技术和组合物的特征。
如本文中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成包括大的适用量的 非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，包括非天然氨基酸的多肽可以于细胞提取物、 细胞溶解产物、培养基、缓冲液及/或其类似物中(包含，但不限于)至少10微克/升、 至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克 /升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/ 升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、 至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、 600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的多肽的浓度 产生。
1.表达系统、培养以及分离
这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的表达系统、培养以 及分离中。非天然氨基酸多肽可以任何数目的适合表达系统(包含(但不限于)酵母、 昆虫细胞、哺乳动物细胞以及细菌)来表达。例示性表达系统的描述在本文中提供。
酵母如本文中所使用，术语“酵母”包含能够表达编码非天然氨基酸多肽的基因 的各种酵母中的任一者。这些酵母包含(但不限于)产子囊酵母(内孢霉目 (Endomycetales)、担子菌酵母以及属于半知菌亚门(Fungi imperfecti)(芽孢纲 (Blastomycetes))群的酵母。产子囊酵母分为两科，蚀精霉科(Spermophthoraceae)以 及酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括四个亚科，裂殖酵母亚科 (Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(genus Schizosaccharomyces))、拿逊酵 母亚科(Nadsonioideae)、脂酵母亚科(Lipomycoideae)以及酵母亚科(Saccharomycoideae) (例如，毕赤酵母属(genus Pichia)、克鲁维酵母属(genus Kluyveromyces)以及酵母 菌属(genus Saccharomyces))。担子菌酵母包含白冬孢酵母属(genus Leucosporidium)、 红冬孢酵母属(genus Rhodosporidium)、锁掷孢酵母属(genus Sporidiobolus)、担子菌 (genus Filobasidium)以及锁担菌(genus Filobasidiella)。属于半知菌亚门(芽孢纲) 群的酵母分为两科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(genus Sporobolomyces)以及布勒掷孢酵母属(genus Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae) (例如，假丝酵母属(genus Candida))。
在某些实施例中，在本文中描述的方法、技术和组合物中使用毕赤酵母属、克鲁维 酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Tondopsis) 以及假丝酵母属内的物种(包含(但不限于)巴氏毕赤酵母(P.pastoris)、P.guillerimondii、 酿酒酵母(S.cerevisiae)、啤酒酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道 格拉斯酵母(S.douglasii)、S.khiyveri、S.norbensis、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克 鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白色假丝酵母(C.albicans)、麦 芽糖假丝酵母(C.maltosa)以及多形汉逊酵母(H.polymorpha))。
选择用于表达非天然氨基酸多肽的适合酵母是在所属领域的技术人员的技能范围 内。在选择用于表达的酵母宿主时，适合宿主可包含(但不限于)展示具有(例如)良 好分泌能力、低蛋白水解活性以及整体活性的那些宿主。酵母通常可获自多种来源，其 包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理和医学物理系的酵母遗传 储备中心，(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics， University of California(Berkeley，CA))以及美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包含可用作或已用作重组载体或其他转移 DNA的受体的酵母。所述术语包含已接受重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细 胞的后代。应了解，由于偶发或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或与原 始亲本互补的总DNA上完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码非天然氨 基酸多肽的核苷酸序列)表征的亲本的亲本细胞的后代包含于由此定义意谓的后代中。
已开发表达和转化载体(包含染色体外复制子或整合载体)用于转化至许多酵母宿 主中。举例来说，已开发表达载体用于酿酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19； Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA (1978)75：1929)；白色假丝酵母(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)；麦芽糖 假丝酵母(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；多形汉逊酵母(Gleeson 等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET. (1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸 克鲁维酵母(De Louvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人， BIO/TECHNOLOGY(1990)8：135)；P.guillerimondii(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL. (1985)25：141)；巴氏毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；以及第4,837,148 号；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，NATURE(1981)300：706)；以及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica) (Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET. (1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES. COMMUN.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221；以及Yelton等人， PROC NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.nigcr)(Kelly和Hynes， EMBO J.(1985)4：475-479)；T.reesia(EP 0 244 234)；以及丝状真菌，诸如，脉孢菌 (Neurospora)、青霉(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，每一者 是以引用的方式全部并入本文中。
酵母载体的控制序列包含(但不限于)来自诸如醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)； 烯醇酶；葡糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)； 己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；以及丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203) 的基因的启动子区域。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可提供适用的启动子序列 (Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。用于酵母宿主的其他 适合启动子序列可包含3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980) 255(4)：12073-12080)；和其他糖酵解酶，诸如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶，以及磷 酸葡萄糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17(23)：4900-4907；Hess等人， J.ADV.ENZYME REG.(1969)7：149-167)的启动子。具有由生长条件控制的转录的其他 优点的可诱导酵母启动子可包含醇脱氢酶2；异细胞色素C；酸性磷酸酶；金属硫蛋白； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与氮代谢相关的降解酶；以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启 动子区域。用于酵母表达中的适合载体和启动子进一步描述于EP 0073 657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。 举例来说，可将酵母启动子的上游活化序列(UAS)与另一酵母启动子的转录活化区域 连接，产生合成杂合启动子。这些杂合启动子的实例包含与GAP转录活化区域连接的 ADH调节序列。参见美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式全 部并入本文中。杂合启动子的其他实例包含由与糖酵解酶基因(诸如GAP或PyK)的 转录活化区域组合的ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列组成的启动子。 参见EP 0 164 556。此外，酵母启动子可包含具有结合酵母RNA聚合酶且引发转录的能 力的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体的部分的其他控制元件包含(例如)来自GAPDH或烯醇酶基 因的终止子(Holland等人，J.BlOL.CHEM.(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒起点 的复制起点适用于酵母。用于酵母中的适合选择基因为酵母质粒中存在的trpl基因。参 见Tschumper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trpl基 因提供用于缺乏于色氨酸中生长的能力的酵母的突变体菌株的选择标记。类似地，Leu2 缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)是由具有Leu2基因的已知质粒互补。
将外源DNA引入酵母宿主中的方法包含(但不限于)转化原生质球或经碱金属阳 离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，酵母的转化可根据Hsiao等人，PROC.NATL. ACAD.SCI.USA(1979)76：3829以及Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946中描述 的方法来进行。然而，将DNA引入细胞中的其他方法(诸如通过核注射、电穿孔或原 生质体融合)也可根据SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中 通常所述来使用。酵母宿主细胞随后可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培 养。
于酵母宿主细胞中表达异源蛋白质的其他方法描述于美国专利公开案第 20020055169号、美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723 号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398 号；美国再审查专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/07862； WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；WO 90/10277；EP 0 460 071；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；以及EP 0 164 556中。也参见Gellissen等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992) 62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
在使用标准进料分批发酵方法的扩增阶段期间，酵母宿主菌株可于发酵桶中生长。 由于特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的不同，可将发酵方法加以调节。仅举 例来说，酵母属酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料，复合氮来源(例如，酪蛋白 水解产物)，和补充多种维生素，而对于最佳生长和表达，甲基营养酵母巴氏毕赤酵母 可能需要甘油、甲醇以及微量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐。参见(例如)美国 专利第5,324,639号；Eniott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95；以及Fieschko等人， BIOTECH.BlOENG.(1987)29：1113，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
然而，这些发酵方法可具有不依赖于所使用的酵母宿主菌株的某些共同特征。举例 来说，限制生长营养素(通常为碳)可在扩增阶段期间添加到发酵桶中以容许最大生长。 另外，发酵方法通常使用经设计以含有足够量的碳、氮、基本盐、磷以及其他次要营养 素(维生素、微量矿物质以及盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实 例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其每一者是以引用的方式全部并 入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”指的是可用作或 已用作重组载体或其他转移DNA的受体的昆虫。所述术语包含已经转染的原始昆虫宿 主细胞的后代。应了解，由于偶发或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或 与原始亲本互补的总DNA上不必完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码 非天然氨基酸多肽的核苷酸序列)表征的亲本的亲本细胞的后代包含于由此定义意谓的 后代中。
所属领域的技术人员熟知用于表达多肽的适合昆虫细胞的选择。若干昆虫物种充分 描述于所属领域中且可市面上购得，其包含(但不限于)埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑 蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) 以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时，适合宿主可包含(但 不限于)展示尤其具有良好分泌能力、低蛋白水解活性以及整体活性的那些宿主。昆虫 通常可获自多种来源，其包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理 和医学物理系的昆虫遗传储备中心(the Insect Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))，以及美国典型培 养物保藏中心(American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。
通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包含转移载体，通常为细菌质粒，其含 有杆状病毒基因组的片段与用于插入所欲表达的异源基因的便利限制位点；具有与转移 载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列的野生型杆状病毒(此容许异源基因同源重组 进入杆状病毒基因组中)；以及适当昆虫宿主细胞和生长培养基。在构建载体、转染细 胞、挑选菌斑、于培养物中使细胞生长以及其类似过程中使用的材料、方法和技术在所 属领域中为已知的且可获得描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染入昆虫宿主细 胞中，载体与病毒基因组在其中重组。包装的重组病毒经表达且鉴别和纯化重组斑。用 于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自(例如)Invitrogen Corp. (Carlsbad，CA)。说明性技术描述于SUMMERS AND SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555号(1987)中，其是以引用的方式并入本 文中。也参见RICHARDSON，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY： BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；KING和POSSEE，THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；以及O′REILLY等人， BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统产生各种异源蛋白描述于以下参考文献中且这些 技术可适于制备本文中描述的非天然氨基酸多肽。参见(例如)美国专利第6,368,825 号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528，6,225,060号；第 6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第 5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第 5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第 5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032 WO 99/51721； WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400； WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/03628； WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556； WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其每一者是以引用的方式全部并入本文中。
适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的载体包含(但不限于)来源于杆状病毒苜蓿 银纹夜蛾(Autographacalifornica)核多角体病毒(AcNPV)的昆虫表达和转移载体，其 为不依赖于辅助病毒的病毒表达载体。来源于此系统的病毒表达载体通常使用强病毒多 角体基因启动子以驱动异源基因的表达。通常参见Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。
在将外源基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包括启动子、前导区(必要时)、 所关注的编码序列以及转录终止序列的上述组分组装入中间转位构筑体(转移载体)中。 中间转位构筑体通常维持在复制子中，诸如能够在宿主(诸如细菌)中稳定维持的染色 体外元件(例如，质粒)。复制子应具有复制系统，因而使其维持在用于克隆和扩增的 适合宿主中。更明确地说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人，ANN. REV.MICROBIOL.(1988)42：177)和原核氨苄青霉素(ampicillin)抗性(amp)基因以 及用于在大肠杆菌中选择和繁殖的复制起点。
一种用于将外源基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。所属领域的技术人 员已知的许多其他载体也已经设计包含(例如)pVL985，其将多角体蛋白起始密码子由 ATG改变为ATT，且其在ATT下游的32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参见Luckow 和Summers，VIROLOGY 170：31-39(1989)。其他市售载体包含(例如) PBlueBac4.5/V5-His；pBlueBacHis2；pMelBac；pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad， CA)。
在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染入昆虫细胞宿主 中。将异源DNA引入杆状病毒中的所需位点中的说明性方法描述于SUMMERS和 SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN第1555号 (1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156；Luckow和Summers，VIROLOGY (1989)170：31-39中。举例来说，可通过同源双重交叉重组插入诸如多角体蛋白基因的基 因中；也可插入经工程化操作进入所需杆状病毒基因中的限制酶位点中。参见Miller等 人，BlOESSAYS(1989)4：91。
转染可使用TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)； Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501中描述的方法通过电穿孔来实现。或者，可 使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。参见(例如)Liebman等人， BlOTECHNlQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050； Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATURE GENETICS (1998)18：45；TILKINS等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin 等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson 等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL CHEM.(1996) 271(37)：22376；Reversey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人， J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；以及Peng等人， BIOTECHNIQUES(1993)14.2：274。市售脂质体包含(例如)和 (Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。另外，可使用磷酸钙转染。参见TROTTER和WOOD，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts，NAR(1990)18(19)：5667；以及 Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子为能够结合杆状病毒 RNA聚合酶且起始编码序列(例如，结构基因)的下游(3′)转录为mRNA的任何DNA 序列。启动子应具有通常位于编码序列的5′端附近的转录起始区。此转录起始区通常包 含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第 二域，其(若存在)通常远离结构基因。此外，表达可为调节性或组成性的。
在感染循环中的后期大量转录的结构基因提供尤其适用的启动子序列。实例包含来 源于编码病毒多角体蛋白的基因(FRIESEN等人，The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839 以及0 155 476)以及编码p10蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VlROL.(1988)69：765) 的序列。
将新形成的杆状病毒表达载体包裹入感染性重组杆状病毒中且随后生长斑可由诸 如Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91；SUMMERS和SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETINNO.1555(1987)中描述的那些技术来纯化。
已开发出用于感染入若干昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发 出尤其用于以下各昆虫中的重组杆状病毒：埃及伊蚊(ATCC号CCL-125)、桑蚕(ATCC 号CRL-8910)、果蝇(ATCC号1963)、草地夜蛾以及粉纹夜蛾。参见WO 89/046,699； Wright，NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VlROL.(1985)56：153；Smith等人， MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。通常参见Fraser等人，IN VITRO CELL.DEV.BIOL. (1989)25：225。更明确地说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包含(但不限于) Sf9(草地夜蛾)(ATCC号CRL-1711)、Sf21(草地夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号 11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)以及High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉 纹夜蛾)。
用于在杆状病毒/表达中直接表达与融合表达异源多肽的细胞和培养基可在市面上 购得。
细菌细菌表达技术在所属领域中为熟知的。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为 单拷贝或低或高多拷贝载体。载体可用于克隆及/或表达。由于关于载体的丰富的文献， 许多载体的商业可用性，以及甚至描述载体和其限制图谱以及特征的手册，在本文中不 需要广泛论述。众所周知，载体通常包括容许选择的标记，这些标记可提供细胞毒性剂 抗性、原养性或免疫性。通常，存在多个标记，其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶且起始编码序列(例如，结构基因)的下 游(3″)转录为mRNA的任何DNA序列。启动子应具有通常位于编码序列的5′端附近 的转录起始区。此转录起始区通常包含RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启 动子也可具有被称作操纵基因的第二域，其可在RNA合成开始的地方与相邻RNA聚合 酶结合位点重叠。操纵基因容许负调节(可诱导)转录，因为基因阻遏蛋白可结合操纵 基因且进而抑制特定基因的转录。在不存在负调节元件(诸如操纵基因)的情况下可发 生组成性表达。另外，正调节可通过基因活化蛋白结合序列(如果存在，那么其通常最 接近RNA聚合酶结合序列的(5′))获得。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白 (CAP)，其帮助起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET. (1984)18：173]。调节性表达因此可为正性或负性的，进而增强或减弱转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其适用的启动子序列。实例包含来源于诸如半乳糖、 乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]和麦芽糖的糖代谢酶的启动子序列。 其他实例包含来源于生物合成酶的启动子序列，诸如色氨酸(trp)(Goeddel等人，NUC. ACIDS RES.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美国专利 第4,738,921号；IFNPub.第036 776号以及第121 775号)，其每一者是以引用的方式全 部并入本文中。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and other mistakes.″In Interferon 3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake 等人，NATURE(1981)292：128]以及T5[美国专利第4,689,406号]，其每一者是以引用 的方式全部并入本文中，启动子系统也提供适用的启动子序列。本文中涵盖的优选方法 利用强启动子(诸如T7启动子)以诱发多肽以高水平产生。这些载体的实例包含(但 不限于)来自Novagen的pET29系列，以及WO99/05297(其是以引用的方式全部并入 本文中)中描述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高水平的多肽而不危及宿主 细胞生活力或生长参数。
另外，在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细 菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，产生 合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号]。举例来说，tac启动子为由trp启动子与受lac 阻遏物调节的lac操纵子序列两者构成的杂合trp-lac启动子[Amann等人，GENE(1983) 25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包 含具有结合细菌RNA聚合酶且起始转录的能力的非细菌来源的天然存在启动子。非细 菌来源的天然存在启动子也可与相容性RNA聚合酶偶合以产生原核生物中一些基因的 高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统为偶合启动子系统的实例[Studier等人， J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，Proc Natl.Acad.Sci.(1985)82：1074]。另外， 杂合启动子也可包括噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(IFNPub.第267 851号)。
除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于外源基因在原核生物中的表 达。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno(SD)序列且包含起始密码 子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine 等人，NATURE(1975)254：34]。认为SD序列通过使SD序列与大肠杆菌16S rRNA的 3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，″Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA″，In Biological Regulation and Development：Gene Expression(R.F.Goldberger编，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原 核基因[Sambrook等人.″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”指的是可用作或已用作重组载体或其他转移 DNA的受体的细菌。所述术语包含已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于 偶然或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或与原始亲本互补的总DNA上 不必完全一致。充分类似于欲由相关性质(诸如存在编码所需多肽的核苷酸序列)表征 的亲本的母体细胞的后代包含于由此定义意谓的后代中。
所属领域的技术人员熟知用于表达所需多肽的适合宿主细菌的选择。在选择用于表 达的细菌宿主时，适合宿主可包含(但不限于)展示尤其具有以下特征中的至少一者且 优选具有以下特征中的至少两者的那些宿主：良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性、 良好分泌能力、良好可溶性蛋白产生能力以及整体活性。细菌宿主通常可获自多种来源， 其包含(但不限于)加利福尼亚大学(Berkeley，CA)生物物理和医学物理系的细菌遗 传储备中心(the Bacterial Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California(Berkeley，CA))；以及美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)(“ATCC”)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常 使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。因为 其生长参数极其熟知且为活性的，所以这些菌株尤其适用。另外，这些菌株为非病原性 的，出于安全和环境的原因，其为商业上重要的。在本文中描述且涵盖的方法的一实施 例中，大肠杆菌宿主包含(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本文中描 述且涵盖的方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为去蛋白酶菌株，其包含(但不限于) OMP-和LON-。在另一实施例中，细菌宿主为假单胞菌的物种，诸如荧光假单胞菌、铜 绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。假单胞菌表达菌株的实例为荧光假单胞菌生物型I，菌 株MB101(Dow Chemical)。
一旦已建立重组宿主细胞株(即，表达构筑体已引入宿主细胞中且将具有适当表达 构筑体的宿主细胞分离)，就在适于制备多肽的条件下培养重组宿主细胞株。重组宿主 细胞株的培养方法应取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞本身。重组宿主菌株 通常使用所属领域中熟知的方法来培养。重组宿主细胞通常在含有可吸收的碳、氮和无 机盐来源，且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域中熟知的其他蛋白质培 养补充剂的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有防止不需 要的微生物生长的抗生素或抗真菌剂及/或包含(但不限于)用于选择含有表达载体的宿 主细胞的抗生素的化合物。
重组宿主细胞可以分批或连续形式培养，其中以分批或连续形式收集细胞(在其中 所需多肽在细胞内积累的情况下)或收集培养物上清液。对于在原核宿主细胞中制备， 优选分批培养和细胞收集。
在一实施例中，本文中描述的非天然氨基酸多肽是在于重组系统中表达之后纯化。 多肽可由所属领域中已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化。通常，在细菌宿主细 胞中制备的多种多肽可溶性较差或不可溶(以包涵体的形式)。在一实施例中，为增大 重组制备的多肽的溶解性的目的，利用本文中揭露的方法以及所属领域中已知的那些方 法，可易于于经选择的多肽中进行氨基酸取代。在不溶性多肽的情况下，所述多肽可通 过离心或过滤从宿主细胞溶解产物中收集且可进一步接着进行细胞的均质化。在可溶性 差的多肽的情况下，可添加包含(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱发部分 可溶多肽的沉淀。沉淀的多肽随后可通过离心或过滤方便地收集。可使用所属领域的技 术人员熟知的多种方法将重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放包涵体。宿主细胞 破碎或均质化可使用熟知技术进行，所述技术包含(但不限于)酶促细胞破碎、超声波 降解、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破碎。在本文中描述且涵盖 的方法的一实施例中，使用高压释放技术破碎大肠杆菌宿主细胞以释放多肽的包涵体。 已发现通过仅利用大肠杆菌宿主细胞通过均质器的一个通道可增加呈包涵体形式的不 溶性多肽的产率。当处理多肽的包涵体时，由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解的因 素，最小化重复均质化时间以便最大化包涵体的产率而无损失为有利的。
随后可使用所属领域中已知的众多适合溶解剂中的任一者使不溶性或沉淀的多肽 溶解。举例来说，用尿素或盐酸胍溶解多肽。溶解多肽的体积应最小化以便可使用可方 便处理的批量大小来大批量制备。在其中重组宿主可以体积为上千升的批量生长的大规 模商业装置中此因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，尤其对于 人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损坏机器和容器，或多肽产物本身的苛性 化学品。在本文中描述且涵盖的方法中已展示可用较温和变性剂尿素代替较苛性变性剂 盐酸胍溶解多肽包涵体。尿素的使用显著降低对在多肽的制造和纯化过程中所用的不锈 钢设备损坏的风险，同时有效溶解多肽包涵体。
在可溶性多肽的情况下，肽可分泌入周质空间或培养基中。另外，可溶性肽可存在 于宿主细胞的细胞质中。可溶性肽可在进行纯化步骤之前加以浓缩。可使用标准技术(包 含(但不限于)本文中描述的那些技术)从(例如)细胞溶解产物或培养基中浓缩可溶 性肽。另外，可使用标准技术(包含(但不限于)本文中描述的那些技术)破碎宿主细 胞且从宿主细胞的细胞质或周质空间中释放可溶性肽。
当将多肽制备为融合蛋白时，优选移除融合序列。融合序列的移除可由包含(但不 限于)酶促裂解或化学裂解的方法来实现，其中优选酶促裂解。可使用所属领域的技术 人员熟知的方法来实现融合序列的酶促移除。用于移除融合序列的酶的选择由融合的特 性确定，且反应条件由酶的选择指定。可使用包含(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶以 及其他试剂的试剂来实现化学裂解。裂解的多肽视情况通过熟知方法从裂解的融合序列 中纯化。这些方法将由融合序列和多肽的特性和性质来确定。纯化方法可包含(但不限 于)尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
多肽也视情况经纯化以从蛋白质溶液中移除DNA。DNA可由所属领域中已知的任 何适合方法来移除，其包含(但不限于)沉淀或离子交换色谱。在一实施例中，通过以 核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来移除DNA。可使用标准熟知方法 (包含(但不限于)离心或过滤)将多肽与沉淀的DNA分离。在使用多肽以治疗人类 的环境下，宿主核酸分子的移除为一个重要因素，且本文中描述的方法将宿主细胞DNA 降低至医药学上可接受程度。
小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，其包含(但不限于)发酵桶、 震荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养系统以及搅拌槽生物反 应器系统。这些方法中的每一者可以分批式、流加式或连续模式方法进行。
本文中描述的非天然氨基酸多肽的人类形式通常可使用所属领域中的方法标准回 收。举例来说，培养基或细胞溶解产物可经离心或过滤以移除细胞残骸。上清液可经浓 缩或稀释至所需体积或渗滤入适合缓冲液中以调节制剂用于进一步纯化。本文中描述的 非天然氨基酸多肽的进一步纯化包含(但不限于)使多肽变体的脱酰胺和截短形式与相 应完整形式分离。
以下例示性程序中的任一者可用于纯化本文中描述的非天然氨基酸多肽：亲和色 谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅石色 谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包含，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水相互作 用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦； 置换色谱；电泳程序(包含(但不限于)制备型等电聚焦)、差示溶解性(包含(但不 限于)硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、提取或其任何组合。
根据所属领域的技术人员已知且使用的标准程序，本文中描述的方法和组合物中涵 盖的多肽(包含(但不限于)包括非天然氨基酸的多肽、包括非天然氨基酸的多肽的抗 体、包括非天然氨基酸的多肽的结合搭配物)可部分纯化或实质上纯化为同质。因此， 本文中描述的多肽可由所属领域中熟知的众多方法中的任一者来回收和纯化，这些方法 包含(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱提取、管柱色谱、亲和管柱色谱、阴离子 或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、 凝胶电泳以及其任何组合。在制备恰当折叠的成熟蛋白时，必要时可使用蛋白再折叠步 骤。在需要高纯度的最终纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其他适 合方法。在一实施例中，将针对非天然氨基酸(或包括非天然氨基酸的多肽)制备的抗 体用作(包含，但不限于)包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的基于亲和性的纯 化的纯化试剂。按需要部分纯化或纯化至同质后，多肽即可视情况用于多种效用，其包 含(但不限于)作为检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂及/或作为用于抗体 制备的免疫原。
除本文中注明的其他参考文献之外，所属领域中熟知多种纯化/蛋白质折叠方法，其 包含(但不限于)以下文献中提出的那些方法：R.Scopes，Protein Purification， Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymologv第182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press，Inc.；Bollag等人.(1996)Protein Methods.第2版Wiley-Liss， NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ；Harris和Angal (1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford， England；Harris和Angal Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版 Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles.High Resolution Methods and Applications.第2版Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；以及其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中制备包括至少一个非天然氨基酸的多肽的一 个优点在于通常多肽会以其天然构象折叠。然而，在本文中描述的方法和组合物的某些 实施例中，在合成、表达及/或纯化之后，多肽可具有不同于相关多肽的所需构象的构象。 在本文中描述的方法和组合物的一方面中，视情况使所表达的蛋白质变性且随后复性。 此可选变性和复性是利用所属领域中已知的方法实现，其中这些方法包含(但不限于) 将伴侣蛋白(chaperonin)添加到所关注的多肽中，以及将多肽溶解于离液剂(包含(但 不限于)盐酸胍)中，且利用蛋白二硫化物异构酶。
一般来说，有时候需要变性和还原所表达的多肽且随后使这些多肽再折叠为优选构 象。举例来说，所述再折叠可通过将胍、尿素、DTT、DTE及/或伴侣蛋白添加到所关注 的翻译产物中来实现。所属领域的技术人员熟知还原、变性以及复性蛋白质的方法(参 见，以上参考文献，以及Debinski等人.(1993)J.Biol.Chem..268：14065-14070；Kreitman 和Pastan(1993)Bioconjug.Chem..4：581-585；和Buchner，等人，(1992)Anal.Biochem.. 205：263-270)。Debinski等人(例如)描述胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。蛋白质 可在含有(包含，但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中再折叠。 再折叠试剂可流动或否则移动以与一种或一种以上的多肽或其他表达产物接触，或反之 亦然。
在原核制备非天然氨基酸多肽的情况下，如此制备的多肽可能会错误折叠且因此缺 乏生物活性或具有降低的生物活性。蛋白质的生物活性可通过“再折叠”恢复。在一实 施例中，通过使用(例如)一种或一种以上的离液剂(包含(但不限于)尿素及/或胍) 以及能够还原二硫键的还原剂(包含(但不限于)二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇、2-ME) 溶解(其中多肽也为不溶性的)、解折叠且还原多肽链而使错误折叠的多肽再折叠。在 中等浓度的离液剂下，随后添加氧化剂(包含(但不限于)氧、胱氨酸或胱胺)，其容 许再形成二硫键。解折叠或错误折叠的多肽可使用所属领域中已知的标准方法再折叠， 诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号以及第4,512,922号中描述的那些方法， 这些文献的每一者是以引用的方式全部并入本文中。多肽也可与其他蛋白质一起共折叠 以形成异二聚体或异多聚体。在再折叠或共折叠之后，视情况将多肽进一步纯化。
非天然氨基酸多肽的纯化也可使用多种技术来实现，其包含(但不限于)本文中描 述的那些技术，例如疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相 色谱、亲和色谱以及其类似技术或其任何组合。其他纯化也可包含干燥或沉淀经纯化的 蛋白质的步骤。
在纯化之后，可将非天然氨基酸多肽交换入不同缓冲液中及/或由所属领域中已知的 多种方法(包含(但不限于)渗滤和透析)中的任一者浓缩。可使以单一纯化蛋白质形 式提供的hGH经历聚集和沉淀。在某些实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至 少90％纯(如由反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)所测量)。在某些其他实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至少 95％纯，或至少98％纯，或至少99％或更高纯度。不管非天然氨基酸多肽的纯度的确切 数值，非天然氨基酸多肽均足够纯以用作医药产物或用于进一步加工，其包含(但不限 于)与水溶性聚合物(诸如PEG)接合。
在某些实施例中，非天然氨基酸多肽分子在不存在其他活性成分或蛋白质(除了赋 形剂、载剂，以及稳定剂、血清白蛋白以及其类似物)的情况下可用作治疗剂，且在某 些实施例中，非天然氨基酸多肽分子可与另一种多肽或聚合物复合。
2.非天然氨基酸多肽的纯化
一般纯化方法这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的一 般纯化。
可对细胞溶解产物提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细 胞质或包括所需多肽的其他物质或由包含(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水 相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、 膨胀床吸附或其任何组合及/或重复的任何分离步骤且以任何适当次序产生的任何多肽 混合物进行多种分离步骤中的任一者。
用于执行本文中描述的技术的设备和其他必要材料可在市面上购得。泵、馏分收集 器、监控器、记录器以及整个系统是获自(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、 Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)以及Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway， NJ)。包含(但不限于)交换基质材料、介质以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。
使用诸如泵的专业设备可更迅速地实现本文中描述的管柱色谱方法中的平衡和其 他步骤，诸如洗涤和洗提。市售泵包含(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵 P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
馏分收集器的实例包含RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器 以及馏分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可用混合器 以形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包含梯度混合器GM-1和串联式混合器 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。
可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、荧光、pH 值以及传导率的信息。探测器的实例包含监控器UV-1、S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。实际上，包含来自Amersham Biosciences的各种 系统(Piscataway，NJ)的整个系统可在市面上购得。
在本文中描述的方法和组合物的一实施例中，例如，多肽可通过首先在尿素中使所 得经纯化的多肽变性，接着稀释于处于适合pH值的含有还原剂(诸如DTT)的TRIS 缓冲液中来还原和变性。在另一实施例中，多肽是在介于约2M至约9M之间的浓度范 围内的尿素中变性，接着稀释于在约5.0至约8.0的范围内的pH值下的TRIS缓冲液中。 随后可培养这个实施例的再折叠混合物。在一实施例中，再折叠混合物在室温下培养4 至24小时。还原和变性的多肽混合物随后可经进一步分离或纯化。
如本文中所陈述，可首先调节第一多肽混合物的pH值，随后执行任何后续分离步 骤。另外，可使用所属领域中已知的技术将第一多肽混合物或其任何后续混合物浓缩。 此外，包括第一多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液可使用所属领域的技术人 员熟知的技术交换为适于下个分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的离 子色谱。
在一实施例中，且作为可选的其他步骤，可对第一多肽混合物进行离子交换色谱。 通常参见ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS(目录 号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换管柱包含 以及管柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。这 些管柱利用强阴离子交换剂，诸如QFast Flow、QHigh Performance，以及QXL；强阳离子交换剂，诸如SPHigh Performance、SPFast Flow，以及SPXL；弱阴离子交换 剂，诸如DEAEFast Flow；以及弱阳离子交换剂，诸如CM Fast Flow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可对处于纯化过程的任何阶段的 多肽进行阴离子或阳离子交换管柱色谱以分离实质上经纯化的多肽。可使用任何适合阳 离子交换基质进行阳离子交换色谱步骤。阳离子交换基质包含(但不限于)纤维状、多 孔、无孔、微粒状、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包含(但 不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、硅石、聚醚或任 何前述物质的复合物。在多肽吸附于阳离子交换剂基质上之后，实质上经纯化的多肽可 通过使基质与具有足够高pH值或离子强度的缓冲液接触以将多肽从基质中置换出来而 得以洗提。用于实质上经纯化的多肽的高pH值洗提中的适合缓冲液包含(但不限于) 柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES，以及浓度在至少约5mM至至少约100mM 的范围内的MES缓冲液。
反相色谱这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的反相色 谱。
可根据所属领域的技术人员已知的适合方案来进行RP-HPLC以纯化蛋白质。参见 (例如)Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J. CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可对多肽 进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的多肽。在这方面，可使用具有多种长度(包含(但 不限于)至少约C3至至少约C30、至少约C3至至少约C20，或至少约C3至至少约C18) 树脂的具有烷基官能基的硅石衍生的树脂。或者，可使用聚合树脂。举例来说，可使用 TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷 基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可以诸如乙醇的溶剂洗涤RP-HPLC管柱。含有离 子对试剂和有机改性剂(诸如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的适合洗提缓冲 液可用于将多肽从RP-HPLC管柱中洗提出。最常用离子对试剂包含(但不限于)乙酸、 甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙 基铵。可使用一种或一种以上的梯度或等度条件进行洗提，其中梯度条件优选减少分离 时间且降低峰宽。另一种方法涉及使用具有不同溶剂浓度范围的两种梯度。在本文中使 用的适合洗提缓冲液的实例可包含(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水相互作用色谱纯化技术这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨 基酸多肽的疏水相互作用色谱纯化。
可对多肽执行疏水相互作用色谱(HIC)。通常参见HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1020-90， Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其是以引用的方式并入本文中。适合HIC基质 可包含(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，诸如经丁基、己基、辛基或苯基取代的 基质，所述基质包含琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、硅石、葡聚糖、聚苯 乙烯、聚甲基丙烯酸酯基质，以及混合形式的树脂，其包含(但不限于)聚乙烯胺树脂 或经丁基或苯基取代的聚甲基丙烯酸酯基质。疏水相互作用管柱色谱的市售来源包含 (但不限于)以及管柱(Amersham Biosciences， Piscataway，NJ)。简言之，在装载之前，HIC管柱可使用所属领域的一般技术人员已知 的标准缓冲液(诸如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡。硫酸铵可用作 用于装载HIC管柱的缓冲液。在装载多肽之后，随后可使用标准缓冲液和条件洗涤管柱 以移除不需要的物质，但将多肽保留在HIC管柱上。可用约3至约10管柱体积的标准 缓冲液(其中，诸如含有EDTA以及比平衡缓冲液低的硫酸铵浓度的HEPES缓冲液， 或乙酸/氯化钠缓冲液)洗提多肽。使用(例如)磷酸钾梯度的逐渐降低的线性盐梯度也 可用于洗提多肽分子。随后可(例如)通过过滤(诸如渗滤或超滤)来浓缩洗提液。可 利用渗滤以移除用于洗提多肽的盐。
其他纯化技术这部分中揭露的技术可应用于本文中描述的非天然氨基酸多肽的其 他纯化技术。
可对第一多肽混合物或其任何后续混合物进行使用(例如)凝胶过滤(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences， Piscataway，NJ)，其是以引用的方式全部并入本文中)、羟基磷灰石色谱(适合基质包含 (但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、 Bio-Gel HTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、渗滤、冻干法以及其 类似方法的另一分离步骤以移除任何过量盐且以适于下个分离步骤或甚至调配最终药 物产品的缓冲液来替换缓冲液。可使用各种技术(其包含(但不限于)本文中描述的那 些技术)来监控本文中描述的每一步骤下的包含实质上经纯化的多肽的多肽的产率。这 些技术也可用于评估最后分离步骤之后的实质上经纯化的多肽的产率。举例来说，可使 用若干具有多种烷基链长度的反相高压液相色谱管柱的任一者(诸如氰基RP-HPLC、 C18RP-HPLC)以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC来监控多肽的产率。
可使用标准技术(诸如SDS-PAGE)或通过使用西方墨点法(Western blot)以及ELISA 检定测量多肽来测定纯度。举例来说，多克隆抗体可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子 交换回收分离的蛋白质产生。这些抗体也可用于探测污染宿主细胞蛋白质的存在。
在某些实施例中，在每一纯化步骤后的多肽产率可为每一纯化步骤的起始物质中多 肽的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、 至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至 少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少 约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4-烷基链。多肽 与蛋白质杂质的分离是根据疏水相互作用的强度的差别。以于稀三氟乙酸中的乙腈梯度 进行洗提。使用不锈钢管柱(填充有2.8升至3.2升的Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。 通过添加三氟乙酸将羟基磷灰石Ultrogel洗出液酸化且装载于Vydac C4管柱上。对于洗 涤和洗提，使用于稀三氟乙酸中的乙腈梯度。将馏分收集且立即以磷酸盐缓冲液中和。 汇集在IPC限度内的多肽馏分。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由共价结合到琼脂糖凝胶珠粒的表面上的二乙基 氨基乙基(DEAE)基团组成。多肽与DEAE基团的结合由离子相互作用介导。乙腈和 三氟乙酸无滞留地通过管柱。在这些物质经洗出之后，通过以低pH值的乙酸盐缓冲液 洗涤管柱来移除痕量杂质。随后以中性磷酸盐缓冲液洗涤管柱且以具有增加的离子强度 的缓冲液洗提多肽。以DEAE Sepharose fast flow装填管柱。调节管柱体积以确保多肽装 载在每毫升凝胶3-10mg多肽的范围内。以水和平衡缓冲液(磷酸钠/磷酸钾)洗涤管柱。 装载HPLC洗出液的汇集馏分且以平衡缓冲液洗涤管柱。随后以洗涤缓冲液(乙酸钠缓 冲液)洗涤管柱，接着以平衡缓冲液洗涤。随后，以洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸 钾)将多肽从管柱中洗提出且根据主要洗提概况以单一馏分收集。将DEAE Sepharose 管柱的洗出液调节至指定传导率。将所得药物物质无菌过滤入Teflon瓶中且在-70℃下 储存。
可使用多种方法和程序评估包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的产率和纯 度，其包含(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE、银染SDS-PAGE、考马斯亮蓝染 色SDS-PAGE(coomassie stained SDS-PAGE)、质谱(包含(但不限于)MALDI-TOF) 以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其他方法。
其他方法包含(但不限于)移除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞 (诸如，大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。降低内毒素含量的方法包含(但不限于) 使用硅石载体、玻璃粉末或羟基磷灰石的纯化技术，反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色 谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱，这些方法的组合，以及其类似方法。可能需 要修饰或其他方法以从所关注的多肽中移除诸如共迁移蛋白的污染物。所属领域的一般 技术人员已知测量内毒素含量的方法且其包含(但不限于)鲎变形细胞溶解产物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)检定。
其他方法和程序包含(但不限于)与蛋白质染色方法耦合的SDS-PAGE、免疫转渍 法、基质辅助激光解吸/电离-质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型 阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
在某些实施例中，包含处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII 的范畴内的任何子式或特定化合物的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX- XXXXIII的氨基酸可通过生物合成并入多肽中，进而产生非天然氨基酸多肽。在其他实 施例中，这些氨基酸是在多肽内的特定位点处并入。在其他实施例中，这些氨基酸是使 用翻译系统并入多肽中。在其他实施例中，这些翻译系统包括：(i)编码多肽的聚核苷 酸，其中聚核苷酸包括对应于并入上述氨基酸的预定位点的选择密码子，以及(ii)包 括氨基酸的tRNA，其中tRNA对选择密码子具有特异性。在这些翻译系统的其他实施 例中，聚核苷酸为在翻译系统中产生的mRNA。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译 系统包括质粒或包括聚核苷酸的噬菌体。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统包 括包含聚核苷酸的基因组DNA。在这些翻译系统的其他实施例中，聚核苷酸稳定整合入 基因组DNA中。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统包括对选择密码子具有特 异性的tRNA，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、 独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子组成的群组。 在这些翻译系统的其他实施例中，tRNA为抑制tRNA。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括将被氨酰基化到上述氨基酸上的tRNA。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括对tRNA具有特异性的氨酰基合成酶。在这些翻译系统的其他实施例中， 翻译系统包括正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。在这些翻译系统的其他实施例中， 多肽是由核糖体来合成，且在其他实施例中，翻译系统为包括选自由细菌细胞、古细菌 细胞以及真核细胞组成的群组的细胞的活体内翻译系统。在其他实施例中，细胞为大肠 杆菌细胞、酵母细胞、来自假单胞菌的物种的细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细 胞。在这些翻译系统的其他实施例中，翻译系统为包括来自细菌细胞、古细菌细胞或真 核细胞的细胞提取物的活体外翻译系统。在其他实施例中，细胞提取物是来自大肠杆菌 细胞、来自假单胞菌的物种的细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。 在其他实施例中，至少一部分多肽是通过固相或溶液相肽合成方法或其组合来合成，而 在其他实施例中，进一步包括将多肽连接到另一多肽上。在其他实施例中，包含处于式 I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合 物的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的氨基酸可通过生物合 成并入多肽中，其中多肽为与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源的蛋白质： α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房 利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、 gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、 细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋 白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、 HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集 落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细 胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细 胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞 生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、 葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细 胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1 受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰 素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递 蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、 成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效 素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛 素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞 介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗 原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、 超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿 瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子 受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、 mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾 丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
B.活体内翻译后修饰
通过在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注的多肽，这些多肽可能 包含真核翻译后修饰。在某些实施例中，蛋白质包含至少一个非天然氨基酸以及至少一 种由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例 来说，翻译后修饰包含(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加 成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化，以及其类似机制。一方面，翻译后修饰包含通过 GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖(包含(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) 连接到天冬酰胺上。参见表1，其列出真核蛋白质的N-键联寡糖的一些实例(也可存在 其他残基，其未展示)。另一方面，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨 酸键联，或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包含(但不限于)Gal-GalNAc、 Gal-GlcNAc等)连接到丝氨酸或苏氨酸上。
表1：通过GlcNAc键联连接的寡糖的实例
在另一方面中，翻译后修饰包含前驱物(包含(但不限于)降血钙素前驱物、降血 钙素基因相关肽前驱物、前甲状旁腺激素原、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原、 前阿黑皮素以及其类似物)的蛋白水解加工、组装为多亚单位蛋白质或大分子组合体， 翻译至细胞中的另一位点(包含(但不限于)细胞器，诸如内质网、高尔基体(golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。 在某些实施例中，蛋白质包括分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨 酸标签、GST融合或其类似物。
非天然氨基酸的一个优点在于其存在可用于添加其他分子的其他化学部分。这些修 饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译 后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。 目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数翻译涉及在亲核与亲电子反应搭配物之间形成 共价键，其包含(但不限于)α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。这些情况下的 选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定的。在本文中描述或使用本文中描 述的方法制备的多肽中，可使用其他更具有选择性的反应，其包含(但不限于)在活体 外和活体内非天然酮基氨基酸与酰肼或氨基氧基化合物的反应。参见(例如)Cornish 等人，(1996)Am.Chem.Soc.118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128； Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc. 124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99：11020-11024；Wang等人， (2003)Proc.Natl.Acad.Set 100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry.42：6735-6746； 以及Chin等人，(2003)Science 300：964-967。此容许以许多试剂(其包含荧光团、交联 剂、糖衍生物以及细胞毒性分子)选择性标记几乎任何蛋白质。也参见2003年1月16 日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利申请案第10/686,944号，其是以引 用的方式并入本文中。翻译后修饰(包含(但不限于)通过叠氮基氨基酸)也可通过施 陶丁格连接(Staudinger ligation)(包含(但不限于)以三芳基膦试剂)进行。参见(例 如)Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligtation，PNAS 99(1)：19-24。
IX.用于制备非天然氨基酸多肽的替代性系统
已使用若干策略以在非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中将非天然氨基 酸引入蛋白质中。这部分中揭露的替代性系统可应用于制备本文中描述的非天然氨基酸 多肽。举例来说，使具有反应性侧链的氨基酸(诸如Lys、Cys和Tyr)衍生化使得赖氨 酸转变为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的简单方法。随着肽片 段的酶促连接和天然化学连接的最近发展，有可能制造较大的蛋白质。参见(例如)P.E. Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。化学肽连接和天然化学连 接描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开 案第2003/0208046号、WO 02/098902以及WO 03/042235中，其是以引用的方式全部 并入本文中。其中将经所需非天然氨基酸化学酰化的抑制tRNA添加到能够支持蛋白质 生物合成的活体外提取物中的一般活体外生物合成方法已用于将超过100种非天然氨基 酸位点特异性地并入几乎任何大小的多种蛋白质中。参见(例如)V.W.Cornish，D. Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34：621-633(1995)；C.J.Noren， S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244 182-188(1989)；以及J.D. Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)。已将多种官能基引入蛋白质中以研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶 机制以及信号转导。
开发了被称作选择性压力并入的活体内方法以开发野生型合成酶的杂交。参见(例 如)N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber， FASEB J..13：41-51(1999)。使其中向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢途径被切断的 营养缺陷型菌株生长于含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中，同时目标基因的转 录受到抑制。在固定生长阶段开始时，将天然氨基酸耗尽且以非天然氨基酸类似物代替。 诱导重组蛋白表达使得含有非天然类似物的蛋白质累积。举例来说，使用这种策略，已 将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸以及对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，且在UV光谱中展示 可易于鉴别的两个特征肩峰。参见(例如)C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa， Anal.Biochem.，284：29-34(2000)；已使用三氟甲硫氨酸取代噬菌体T4溶菌酶中的甲硫 氨酸以通过19F NMR来研究其与壳寡糖配位体的相互作用，参见(例如)H.Duewel，E. Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404-3416(1997)；且并入三氟亮氨酸 代替亮氨酸，其使得亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。参见(例如)Y.Tang， G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int. Ed.Engl..40(8)：1494-1496(2001)。此外，将硒甲硫氨酸和碲甲硫氨酸并入各种重组蛋白 中以利于解析X射线结晶学中的相。参见(例如)W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M. Lemaster，EMBO J.，9(5)：1665-1672(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D. Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol，1：283-284(1994)；N.Budisa， B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.， 230：788-796(1995)；以及N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T. Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol.Biol.270：616-623(1997)。具有烯或炔官能基 的甲硫氨酸类似物也已有效地并入，其容许通过化学手段进行蛋白质的其他修饰。参见 (例如)J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBS Lett..428：68-70(1998)；J.C.M.van Hest， K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.122：1282-1288(2000)；以及K.L.Kiick和 D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487-9493(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开 案2002/0042097，其是以引用的方式全部并入本文中。
这个方法的成功取决于由氨酰基-tRNA合成酶来识别非天然氨基酸类似物，其通常 需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真性。扩大此方法的范畴的一条途径在于放松氨酰 基-tRNA合成酶的底物特异性，其已在有限数目的情况下实现。仅举例来说，在大肠杆 菌苯丙氨酰基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly代替Ala294增大底物结合袋的大小，且 使得tRNAPhe由对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)酰化。参见，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke， Biochemistry.33：7107-7112(1994)。含有此突变体PheRS的大肠杆菌菌株容许并入对氯 苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸代替苯丙氨酸。参见(例如)M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.. 364：272-275(1995)；以及N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.. 467：37-40(2000)。类似地，接近大肠杆菌酪氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合位点处的 点突变Phe130Ser展示容许重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参见，F.Hamano-Takaku， T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，L Biol.Chem..275(51)：40324-40328(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一策略为修饰具有校对机制的合成酶。 这些合成酶不能区分且因此活化结构上类似于同源天然氨基酸的氨基酸。此错误在个别 位点得到纠正，其将错配氨基酸从tRNA上去酰化以保持蛋白质翻译的保真性。如果合 成酶的校对活性丧失，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能且被并入。最近已以 缬氨酰基-tRNA合成酶(ValRS)证实此方法。参见，V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle， T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science.292：501-504 (2001)。ValRS可用Cys、Thr或氨基丁酸盐(Abu)错氨酰基化tRNAVal；随后通过编 辑域水解这些非同源氨基酸。在随机诱变大肠杆菌染色体之后，选择在ValRS的编辑位 点中具有突变的突变体大肠杆菌菌株。此编辑缺陷型ValRS错误以Cys装载tRNAVal。 因为Abu在空间上类似Cys(在Abu中Cys的-SH基团经-CH3置换)，所以当此突变体 大肠杆菌菌株在Abu存在下生长时，突变体ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析 展示在天然蛋白质的每一缬氨酸位置处约24％的缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也容许合成许多含有新颖氨基酸的蛋白质。举例来说，参见 以下公开案和其中引用的参考文献，所述公开案如下：Crick，F.J.C.，Barrett，L.Brenner，S. Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，192(4809)： 1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies on polypeptides.XXXVI.The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J，Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes，Acc Chem Res.22(2)：47-54 (1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，109，3808-3810(1987)；Schnolzer，M.， Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides： backbone-engineered HIV protease，Science，256，221-225(1992)；Chaiken，I.M. Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochemu 255-301(1981)；Offord，R.E. Protein engineering by chemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；以及Jackson， D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266，243-247 (1994)。
化学修饰已用于在活体外将多种包含辅因子、自旋标记以及寡核苷酸的非天然侧链 引入蛋白质中。参见(例如)Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238，1401-1403(1987)； Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymatic specificity， Ann.Rev Biochem，54，565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Science，226，505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E. Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.，M.L.A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc， 88(13)：3153-3154(1966)；以及Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，1(242)： 1038-1040(1988)。
或者，使用经化学修饰的氨酰基-tRNA的生物合成方法已用于将若干生物物理探针 并入在活体外合成的蛋白质中。参见以下公开案和其中引用的参考文献：Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，483-514(1993)；以及Krieg， U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl. Acad.Sci.83，8604-8608(1986)。
以前，已证明可在活体外通过向经以含有所需琥珀无义突变的基因程式化的蛋白质 合成反应中添加经化学氨酰基化的抑制tRNA来将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白 质中。使用这些方法，可使用对特定氨基酸来说为营养缺乏型的菌株以紧密结构同源物 取代众多常见20种氨基酸，例如，以氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见(例如)Noren，C.J.， Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science.244：182-188(1989)；M.W. Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin， A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incoiporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc.111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51 (1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural ammo acids site-specifically into proteins.Methods in Enz.， 202，301-336(1992)；以及Mendel，D.，Cornish，V.W.和Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Strnct.24，435-62 (1995)。
举例来说，制备识别终止密码子UAG且经非天然氨基酸化学氨酰基化的抑制tRNA。 使用常规定点突变形成在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。参见(例 如)Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucleic Acids Res.16(3)：791-802(1988)。当将酰化抑 制tRNA与突变体基因在活体外转录/翻译系统中组合时，非天然氨基酸回应UAG密码 子并入得到在指定位置处含有那种氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用α-羟 基酸的实验证实仅所需氨基酸在由UAG密码子指定的位置处并入且此氨基酸并未在蛋 白质中的任何其他位点处并入。参见(例如)Noren等人，同上；Kobayashi等人，(2003) Nature Structural Biology 10(6)：425-432；以及Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255，197-200 (1992)。
微注射技术也已用于将非天然氨基酸并入蛋白质中。参见(例如)M.W.Nowak，P.C. Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J. Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science， 268：439-442(1995)；以及D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol，4：645(2000)。向爪蟾 卵母细胞中共同注射在活体外制造的两种RNA物质：在所关注的氨基酸位置处具有 UAG终止密码子的编码目标蛋白质的mRNA和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑 制tRNA。随后卵母细胞的翻译机制在由UAG指定的位置处插入非天然氨基酸。此方法 容许完整膜蛋白的活体内结构-功能研究，所述膜蛋白通常不受活体外表达系统作用。实 例包含(但不限于)将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转 移来测量距离，参见(例如)G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot， M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，I Biol.Chem.，271(33)：19991-19998(1996)； 并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中的表面暴露残基，参见(例如)J.P.Gallivan，H.A. Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4(10)：739-749(1997)；使用笼蔽酪氨酸类似物以实 时监控离子通道中的构象变化，参见(例如)J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England， D.A.Dougherty和H.A.Lester，Neuron，20：619-624(1998)；以及，使用改变离子通道骨 架的α羟基氨基酸以探测其门控机制。参见(例如)P.M.England，Y.Zhang，D.A. Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89-98(1999)；以及T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y. Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.，4(3)：239-246(2001)。
在活体内将非天然氨基酸直接并入蛋白质中的能力提供突变体蛋白质的高产率、技 术简易、在细胞中或可能在活生物体中研究突变体蛋白质的可能性以及在治疗性治疗中 使用这些突变体蛋白质的优点。将具有各种大小、酸性、亲核性、疏水性以及其他性质 的非天然氨基酸包含入蛋白质中的能力可极大地扩展我们合理且系统性地操纵蛋白质 的结构的能力，以探测蛋白质功能且产生新的蛋白质或具有新颖性质的生物体。
在试图位点特异性地并入对氟苯丙氨酸的过程中，将酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/ 苯基丙氨酰基-tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。参 见(例如)R.Furter，Protein Sci.，7：419-426(1998)。
也有可能使用无细胞(活体外)翻译系统来获得所需聚核苷酸的表达。在这些系统 中，其可包含作为模板的mRNA(活体外翻译)或作为模板的DNA(组合活体外转录 和翻译)，活体外合成由核糖体指导。已应用相当大的努力来开发无细胞蛋白质表达系 统。参见(例如)Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bio engineering， 74(4)：309-316(2001)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542， (2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.-M. 和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66(3)：180-188，(1999)；以及Patnaik，R. 和J.R.Swartz，Biotechniques 24(5)：862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利 公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式全部并入 本文中。可应用于包括非天然氨基酸的多肽的表达的另一种方法包含(但不限于)mRNA- 肽融合技术。参见(例如)R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94 12297-12302(1997)；A.FranKel等人，Chemistry & Biology 10，1043-1050(2003)。在这种 方法中，连接到嘌呤霉素上的mRNA模板在核糖体上翻译为肽。如果修饰一种或一种以 上的tRNA分子，那么非天然氨基酸也可并入肽中。在读取最后的mRNA密码子之后， 嘌呤霉素捕获肽的C-末端。如果在活体外检定中发现所得mRNA-肽接合物具有有趣的 性质，那么其身份可易于根据mRNA序列揭露。以此方式，可筛检包括一个或一个以上 非天然氨基酸的多肽的库以鉴别具有所需性质的多肽。近来，已报导具有纯化组分的活 体外核糖体翻译容许合成经非天然氨基酸取代的肽。参见(例如)A.Forster等人，Proc. Natl Acad.Sci.(USA)100(11)：6353-6357(2003)。
X.多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰
为方便起见，这部分(XA至XJ)中描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰 一般性及/或以特定实例来描述。然而，这部分中描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译 后修饰不应仅限于这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的多肽的非 天然氨基酸组分的翻译后修饰同样充分适用于处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B) 以及XXXX-XXXXIII的范畴内的所有化合物，其包含处于本文中的说明书、权利要求 以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以及XXXX-XXXXIII的范畴内 的任何子式或特定化合物。
已开发出方法、组合物、技术和策略以在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性地并 入非天然氨基酸。通过并入具有与天然存在氨基酸的那些侧链正交的侧链化学的非天然 氨基酸，此技术使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能。因此，本文中描述的方 法、组合物、技术和策略的主要优点在于衍生化的蛋白质如今可制备为确定同源产物。 然而，本文中描述的方法、组合物、反应混合物、技术和策略不限于由活体内蛋白质翻 译技术形成的非天然氨基酸多肽，而是包含由任何技术形成的非天然氨基酸多肽，所述 技术包含(仅举例来说)表达蛋白质连接、化学合成、基于核糖酶的技术(参见(例如) 本文中标题为“替代性系统中的表达”的部分)。
将非天然氨基酸并入重组蛋白质中的能力广泛扩展可实现用于翻译后衍生化的化 学，其中此衍生化发生在活体内或活体外。更明确地说，在多肽的非天然氨基酸部分上 形成肟键的蛋白质衍生化提供若干优点。第一，天然存在氨基酸通常不形成肟键且因此 经设计以形成肟键的试剂会与多肽的非天然氨基酸组分位点特异性反应(当然假设非天 然氨基酸与相应试剂已经设计以形成肟键)，因此与使用现有技术工艺产生的衍生蛋白 质的混合物相反，位点选择性衍生化蛋白质的能力提供单一均质产物。第二，肟加合物 在生物条件下为稳定的，其暗示由肟交换衍生的蛋白质为治疗应用的有效候选者。第三， 所得肟键的稳定性可根据肟键已形成于其上的非天然氨基酸的性质(即，官能基及/或结 构)来操纵。因此，如实例16中所示，非天然氨基酸的肟键的pH值稳定性可从少于1 小时变化至远远多于1周。因此，在一些实施例中，非天然氨基酸多肽的肟键具有少于 1小时的分解半衰期，在其他实施例中为少于1天，在其他实施例中为少于2天，在其 他实施例中为少于1周且在其他实施例中为多于1周。在其他实施例中，所得肟在适度 酸性条件下稳定至少两周，在其他实施例中，所得肟在适度酸性条件下稳定至少5天。 在其他实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与约8之间的pH值下稳定至少1天； 在其他实施例中，在约2至约6的pH值下稳定至少1天；在其他实施例中，在约2至 约4的pH值下稳定至少1天。在其他实施例中，使用本文中描述的策略、方法、组合 物和技术，所属领域的技术人员应能够合成具有调节至熟练技工所需(例如，用于治疗 用途(诸如持续释放)，或诊断用途，或工业用途或军事用途)的分解半衰期的非天然 氨基酸多肽的肟键。
上述非天然氨基酸多肽适用于(包含，但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、 工业酶、结合蛋白(包含(但不限于)抗体和抗体片段)以及(包含，但不限于)蛋白 质结构和功能的研究。参见(例如)Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。上述非天 然氨基酸多肽的其他用途包含(仅举例来说)基于检定的用途、化妆品用途、植物生物 学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可经历 进一步修饰以并入新的或经修饰的官能基，其包含操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安 全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学及/或药效(例如，增大水溶性、生物可用性； 增大血清半衰期；增大治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)； 向多肽提供其他官能基；向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质； 以及前述修饰的任何组合。
在某些实施例中为易化多肽的分离性质的方法，其包括利用包括至少一个非天然氨 基酸的同源生物合成非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是选自由含肟非天然氨基 酸、含羰基非天然氨基酸以及含羟胺非天然氨基酸组成的群组。在其他实施例中，这些 非天然氨基酸已通过生物合成并入如本文中所述的多肽中。在其他或替代实施例中，这 些非天然氨基酸多肽包括至少一种选自式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。
本文中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽的特定类型、种类或家族。实 际上，几乎任何多肽可包含至少一个本文中描述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可 与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、 抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、 C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、 SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化 蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞 炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、 CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、 补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表 皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、 因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤 维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、 生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、 人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、 胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。 非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
这些修饰包含使其他官能基结合于多肽的非天然氨基酸组分上，这些官能基包含 (但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂； 细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白 质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物； 聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材 料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他 分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可 光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可 光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分； 经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性 基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核 糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性 传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、 抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受 体、反胶束以及其任何组合。
另外，非天然氨基酸多肽可含有可转变为其他官能基的部分，诸如，仅举例来说， 羰基、二羰基或羟胺。图63A说明非天然氨基酸多肽转变为含羰基或二羰基的非天然氨 基酸多肽的化学转变，而图63B说明非天然氨基酸多肽转变为含羟胺的非天然氨基酸多 肽的化学转变。所得含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽以及含羟胺的非天然氨基酸多 肽可用于或并入用于制备、纯化、表征及使用本文中描述的非天然氨基酸、非天然氨基 酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略中的任一者中。化学 部分转变为其他官能基(诸如，仅举例来说，羰基、二羰基或羟胺)的化学转变可使用 所属领域的技术人员已知的技术和材料来实现，诸如(例如)于March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY第5版，(Wiley 2001)；以及Carey和Sundberg，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY第4版，A卷和B卷(Plenum 2000，2001)中所述，(所有文献是以引用的方式 全部并入)。
因此，仅举例来说，含有以下氨基酸中的任一者的非天然氨基酸多肽可使用本文中 描述的方法和组合物进一步修饰：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基，或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分、配位体、可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选 的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚 烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经 取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基、 -C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷 芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发 的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可 化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基 硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团； 电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选的，且当存在时为选自由以 下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、 2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基；
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代 亚烷基)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
本文中描述的方法和组合物的一方面为包含至少一种具有至少一个(包含(但不限 于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至 少九个，或至少十个或十个以上)已经翻译后修饰的非天然氨基酸的多肽的组合物。经 翻译后修饰的非天然氨基酸可相同或不同，包含(但不限于)在包括1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上不同的经翻译后 修饰的非天然氨基酸的多肽中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同位点。另一方面，组合物包含其中多 肽中存在的至少一个(但少于全部)的特定氨基酸用经翻译后修饰的非天然氨基酸取代 的多肽。对于具有一个以上的经翻译后修饰的非天然氨基酸的给定多肽来说，经翻译后 修饰的非天然氨基酸可相同或不同(包含，但不限于，多肽可包含两个或两个以上不同 类型的经翻译后修饰的非天然氨基酸，或可包含两个相同的经翻译后修饰的非天然氨基 酸)。对于具有两个以上的经翻译后修饰的非天然氨基酸的给定多肽来说，经翻译后修 饰的非天然氨基酸可相同、不同或为多个相同种类的经翻译后修饰的非天然氨基酸与至 少一个不同的经翻译后修饰的非天然氨基酸的组合。
A.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：含羰基非天然氨基酸与含羟胺的试剂 的反应
天然存在氨基酸的侧链缺乏高度亲电子性位点。因此，并入具有含亲电子试剂的侧 链的非天然氨基酸(包含(仅举例来说)含有诸如酮或醛的羰基或二羰基的氨基酸)使 得通过羰基或二羰基的亲核进攻的位点特异性衍生化此侧链成为可能。在其中进攻亲核 试剂为羟胺的情况下，会产生肟衍生的蛋白质。用于衍生化及/或进一步修饰的方法可用 在衍生化步骤之前或在衍生化步骤之后纯化的多肽进行。另外，用于衍生化及/或进一步 修饰的方法可用在这些修饰之前或之后纯化的合成聚合物、多糖或聚核苷酸进行。此外， 衍生化步骤可在适度酸性至微碱性条件下发生，所述条件包含(例如)介于约2-8之间 的pH值下，或介于约4-8之间的pH值下。
根据含有羰基或二羰基的多肽与经羟胺取代的分子的反应来衍生化多肽的方法具 有明显的优点。第一，羟胺在2-8的pH值范围内(且在其他实施例中在4-8的pH值范 围内)经历与含有羰基或二羰基的化合物的缩合以产生肟加合物。在这些条件下，天然 存在氨基酸的侧链为无反应性的。第二，此选择性化学使得位点特异性衍生化重组蛋白 质成为可能：衍生的蛋白质如今可制备为确定的同源产物。第三，实现本文中描述的羟 胺与本文中描述的含有羰基或二羰基的多肽的反应所需要的温和条件通常不会不可逆 地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的目的即为破坏此三级结构)。最后，尽 管羟胺基团氨基似乎由大肠杆菌代谢，但羟胺与含有羰基或二羰基的分子的缩合产生在 生物条件下稳定的肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为对可用于进一步修饰含有羰基或二羰基的非天然 氨基酸多肽的本文中描述的含羟胺的试剂有反应性的含有羰基或二羰基的氨基酸的类 型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时， 两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂；且
R2为OH、酯保护基、树脂；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经 保护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的双环或三环状环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保护 二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基。
在某些实施例中，式(I)化合物在水溶液中在适度酸性条件下与羟胺具有反应性。 在某些实施例中，所述酸性条件为pH 2至8。
仅举例来说，为前述目的，式(I)化合物包含具有以下结构的化合物：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
X1为C、S或S(O)；且L为一键、亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经 取代亚烷基)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
仅进一步举例来说，为前述目的，式(I)化合物包含具有式(XXXX)的结构的化 合物：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
M为-C(R3)-，
其中(a)指示与A基团键结且(b)指示与各别羰基键结，R3与R4独立地选自H、 卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基，或R3与R4或两个R3基团或两个 R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
T3为一键、C(R)(R)、O或S，且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取 代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸。
包括这些含有羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽的类型实际上并无限制，只要含 有羰基或二羰基的非天然氨基酸位于多肽上从而羟胺试剂可与羰基或二羰基反应且不 产生破坏多肽的三级结构的所得经修饰的非天然氨基酸(当然，除非如果此破坏是反应 的目的)。
仅举例来说，以下含羟胺的试剂为对本文中描述的含有羰基或二羰基的非天然氨基 酸有反应性且可用于进一步修饰含有羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽的含羟胺的试 剂的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或 经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-N(R8)2，其中R8各自独立地为H或氨基保护基；且n为1至3；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修 饰的”非天然氨基酸多肽上的羰基(包含二羰基)反应的羟胺基。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为包括烷基、经取代烷基、烯基、经取代 烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、 聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷 芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基的聚合物。在式(XIX)化合物的某些实 施例中，X为包括聚氧化亚烷基或经取代聚氧化亚烷基的聚合物。在式(XIX)化合物 的某些实施例中，X为包括-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x(其 中x为20-10,000)的聚合物。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为具有在2 KDa 至40 KDa的范围内的分子量的m-PEG。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为选 自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质 体、微粒以及胶束组成的群组的生物活性剂。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X 为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激 素、生长因子以及甾族剂组成的群组的药物。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X 为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶以及葡萄糖氧化酶组成的群组的 酶。在式(XIX)化合物的某些实施例中，X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光 部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分以及 能量转移部分组成的群组的可检测标记。在式(XIX)化合物的某些实施例中，L选自 由-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-以及-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)- 组成的群组。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XX)的结构的化合物：
X-L-O-NH2
(XX).。
在式(XX)化合物的某些实施例中，为选自由以下各物组成的群组的化合物：
以及
其中在其他实施例中，这些m-PEG或PEG基团具有在5 kDa至30 kDa的范围内的 分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXI)的结构的化合物：
在式(XXI)化合物的某些实施例中，为选自由以下各物组成的群组的化合物：
以及
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXII)的结构的化合物：
在式(XXII)化合物的某些实施例中，L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚 烷基或经取代亚烷基)-。在式(XXII)化合物的某些实施例中，为具有式(XXIII)的结 构的化合物：
其中在式(XXII)化合物的其他实施例中，这些m-PEG基团具有在5kDa至30kDa 的范围内的分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXIV)的结构的化合物：
在式(XXIV)化合物的某些实施例中，L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚 烷基或经取代亚烷基)-或-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XXIV)化合物 的某些实施例中，为具有式(XXV)的结构的化合物：
其中在式(XXIV)化合物的其他实施例中，这些m-PEG基团具有在5kDa至30kDa 的范围内的分子量。
在式(XIX)化合物的某些实施例中，为具有式(XXVI)的结构的化合物：
其中R10各自独立地为H或氨基保护基。
在式(XXVI)化合物的某些实施例中，聚氧化亚烷基为PEG。在式(XXVI)化合 物的其他实施例中，PEG基团具有在5kDa至30kDa的范围内的分子量。在式(XXVI) 化合物的另一实施例中为对应于下式的化合物：
用于将羟胺偶合至多肽上的含羰基非天然氨基酸上的方法的三个说明性实施例呈 示于图7中。在这些说明性实施例中，将羟胺衍生的试剂添加到含羰基的非天然氨基酸 多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。为加速接合， 添加诸如图8中呈示的那些添加剂；这些化合物在本文中也被称为促进剂。在某些实施 例中，促进剂或添加剂能够碱催化。通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来纯化所得含 肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可与经羰基或二羰基取代的非天然氨基酸多肽位点 特异性地反应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上 含有羟胺官能基的连接子(单官能性、双官能性或多官能性)。羟胺衍生的连接子与经 酮取代的蛋白质的缩合产生稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如，具有一个或一 个以上其他键联化学的羟胺)容许将不同分子(例如，其他蛋白质、聚合物或小分子) 位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所有末端上经羟胺取代) 促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将此连接子策略与本文中描 述的活体内翻译技术相组合，使得详细说明经化学精制的蛋白质的三维结构成为可能。
在某些实施例中为用于衍生化包括式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的氨基酸(其包含处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或 XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包括 使包括至少一个式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)或XXXX-XXXXIII的氨基酸的多 肽与式(XIX)的试剂接触。在某些实施例中，多肽在与式(XIX)的试剂接触之前或 之后经纯化。在其他实施例中为包括至少一个对应于式(XI)的含肟氨基酸的所得衍生 多肽，而在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。 在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这 些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少5天。在其他实施例中，所述条件为pH 2至8。 在某些实施例中，保持衍生多肽的三级结构。在其他实施例中，多肽的这些衍生化进一 步包括将衍生多肽连接至另一多肽上。在其他实施例中，这些所衍生的多肽与选自由以 下各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、 抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因 子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、 PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、 单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白 -iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、 CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制 剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因 子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、 因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋 白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、 生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长 激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、 类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白 细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在某些实施例中为产生多肽二聚体的方法，其中所述方法包括：
(i)以式(XXVI)的试剂衍生化包括式(I)的氨基酸的第一多肽，以及(ii)使 步骤(i)的所得衍生蛋白质与包括式(I)的氨基酸的第二蛋白质接触，进而形成包括 第一多肽与第二多肽的二聚体。在其他实施例中为产生多肽二聚体的方法，其中第一多 肽与第二多肽包括对应于式(II)的氨基酸。在某些实施例中，多肽是在与式(XXVI) 的试剂接触之前或之后经纯化。在其他实施例中，步骤(i)的所得衍生蛋白质包括至少 一个对应于式(XXVIII)的含肟氨基酸：
B.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：使含肟的非天然氨基酸与含羰基的试 剂反应
基于含肟蛋白质与经羰基或二羰基取代的分子的交换反应的蛋白质衍生方法具有 明显的优点。第一，研究指示基于氨基酸的肟加合物通过与比用于产生原始肟的化合物 更具反应性的含有羰基或二羰基的化合物的平衡经历肟交换。此交换反应发生在4-8的 pH值范围内：在所述条件下，天然存在氨基酸的侧链不具反应性。因此，用于制备适 于与含肟蛋白质反应的经羰基或二羰基取代的分子的一般方法可提供得到多种位点特 异性衍生的蛋白质的途径。在此活体内翻译技术的情况下，用于制备通常用于衍生化蛋 白质的那些分子(包含(仅举例来说)亲水性聚合物，诸如聚乙二醇)的经羰基或二羰 基取代的形式的一般方法为有价值的且会提供得到多种位点特异性衍生的非天然氨基 酸多肽的途径。第二，此选择性化学使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能：衍 生蛋白质如今可为确定同源产物。第三，实现本文中描述的交换反应所需要的温和条件 通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的目的为破坏此三级结 构)。最终，交换反应产生在生物条件下稳定的新肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为与可用于产生新的含肟非天然氨基酸多肽的本文 中描述的含羰基或二羰基的试剂有反应性的含肟氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经 取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代 芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚 烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其 中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、 芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或R5为L-X，其中X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶 性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲 和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段； 金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸； 糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金 属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼 蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物； 结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖； 氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光 基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生 物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物 素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、 佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂 角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选 的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚 烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、 -CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、 -(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经 取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
仅进一步举例来说，以下非天然氨基酸也为与可用于产生新的含肟非天然氨基酸多 肽的本文中描述的含羰基或二羰基的试剂有反应性的含肟氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R6与R7各自独立地选自由以下各基团组成的群组：H、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧化亚烷基、芳基、经 取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基以及经取代芳烷基、 -C(O)R″、-C(O)2R″、-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、 经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷 芳基、芳烷基或经取代芳烷基；或R6或R7为L-X，其中
X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇 的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化 合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子； 脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚 合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分； 新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发 的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可 化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基 硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团； 电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记； 小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳 米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、 血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、 拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；且L为可选的，且当存在时为选自由以 下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、 -O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、 2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、 -C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立 地为H、烷基或经取代烷基。
仅举例来说，以下含羰基或二羰基的试剂为与本文中描述的含肟非天然氨基酸具有 反应性且可用于实现交换反应以形成新肟键且因此修饰含肟非天然氨基酸多肽的含羰 基或二羰基的试剂的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基， 或经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-C(＝O)R9，其中R9为H或OR′；且n为1至3；
或其中L-L1-W共同形成包括至少一个羰基(包含二羰基)、经保护羰基(包含经保 护二羰基)或经掩蔽羰基(包含经掩蔽二羰基)的单环或双环状环烷基或杂环烷基；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够经历与非天然氨基酸或“经修饰或未 经修饰的”非天然氨基酸多肽上的肟基发生肟交换反应的羰基(包含二羰基)。
用于实现多肽上的含肟氨基酸与含羰基的试剂之间的肟交换反应的方法的两个说 明性实施例呈示于图9中。在这些说明性实施例中，将含羰基的试剂添加到含肟非天然 氨基酸多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。通过 HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来纯化经修饰含肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可位点特异性地与经肟取代的非天然氨基酸多肽反 应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羰基或 二羰基官能基的连接子(单官能、双官能或多官能)。羰基或二羰基衍生的连接子与经 肟取代的非天然氨基酸多肽的缩合产生新的稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如， 具有一个或一个以上其他键联化学的羰基或二羰基)容许将不同分子(例如，其他蛋白 质、聚合物或小分子)位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所 有末端上经羰基或二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。 通过将此连接子策略与本文中描述的活体内翻译技术相组合，使得详细说明经化学精制 的蛋白质的三维结构成为可能。
C.用于翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：使含羟胺的非天然氨基酸与含羰基 的试剂反应
上述翻译后修饰技术和组合物也可用于与含羰基或二羰基的试剂反应以产生经修 饰的含肟非天然氨基酸多肽的含羟胺的非天然氨基酸。
基于含羟胺的蛋白质与经羰基或二羰基取代的分子的反应的蛋白质衍生方法具有 明显的优点。第一，羟胺在4-8的pH值范围内经历与含有羰基或二羰基的化合物的缩 合以产生肟加合物。在所述条件下，天然存在氨基酸的侧链不具反应性。第二，此选择 性化学使得重组蛋白质的位点特异性衍生化成为可能：衍生蛋白质如今可制备为确定同 源产物。第三，实现本文中描述的含羰基或二羰基的试剂与本文中描述的含羟胺多肽的 反应所需要的温和条件通常不会不可逆地破坏多肽的三级结构(当然，除非其中反应的 目的为破坏此三级结构)。最后，尽管羟胺基氨基酸似乎由大肠杆菌代谢，但含羰基或 二羰基的试剂与含羟胺的氨基酸的缩合产生在生物条件下稳定的肟加合物。
仅举例来说，以下非天然氨基酸为与可用于进一步修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽 的本文中描述的含羰基或二羰基的试剂具有反应性的含羟胺氨基酸的类型：
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚环烷基、经取 代低级亚环烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、亚炔基、低级亚杂烷基、经取代亚 杂烷基、低级亚杂环烷基、经取代低级亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、 经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、低级亚杂烷基、经取代低级亚杂 烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、 -C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、 -NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
K为-NR6R7或-N＝CR6R7；
R1为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基，或R3与R4或两个 R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基。
在式(XIV)化合物的某些实施例中，K为NH2。
包括这些含羟胺的非天然氨基酸的多肽的类型实际上并无限制，只要含羟胺的非天 然氨基酸位于多肽上以便含羰基或二羰基的试剂可与羟胺基反应且不产生破坏多肽的 三级结构的所得经修饰的非天然氨基酸(当然，除非如果此破坏是反应的目的)。
仅举例来说，以下含羰基或二羰基的试剂为与本文中描述的含羟胺的非天然氨基酸 具有反应性且可用于进一步修饰含羟胺的非天然氨基酸多肽的含羰基或二羰基的试剂 的类型：
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、 烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化亚烷基、经取代聚氧 化亚烷基、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷 基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷 基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″ 或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷 氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基， 或经取代芳烷基；
或X各自独立地选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物； 聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记； 反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂； 辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性 树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放 射性部分；新颖官能基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光 化辐射激发的部分；配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子 的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活 性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学 发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂； 可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物； 量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配 基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载 体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束以及其任何组合；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为-J-R，其中J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；R″各自独立地为H、烷基、 经取代烷基，或保护基，或当存在一个以上的R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基； 且n为1至3；
其限制条件为L-L1-W共同提供至少一个能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修 饰的”非天然氨基酸多肽上的羟胺基反应的羰基(包含二羰基)。
在式(XIX)化合物的某些实施例中为具有式(XXI)的结构的化合物：
用于将含羰基的试剂偶合至多肽上的含羟胺的非天然氨基酸上的方法的说明性实 施例呈示于图10中。在这个说明性实施例中，将经羰基衍生的试剂添加到含羟胺的非 天然氨基酸多肽的缓冲溶液(pH 2-8)中。反应在周围温度下进行多个小时至多天。为 加速接合，添加诸如图8中呈示的那些添加剂。通过HPLC、FPLC或尺寸排阻色谱来 纯化所得含肟非天然氨基酸多肽。
在一实施例中，多个连接子化学可位点特异性地与经羟胺取代的非天然氨基酸多肽 反应。在一实施例中，本文中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端上含有羰基 或二羰基官能基的连接子(单官能、双官能或多官能)。经羰基或二羰基衍生的连接子 与经羟胺取代的蛋白质的缩合产生稳定肟键。双官能及/或多官能连接子(例如，具有一 个或一个以上其他键联化学的羰基或二羰基)容许将不同分子(例如，其他蛋白质、聚 合物或小分子)位点特异性连接至非天然氨基酸多肽上，而单官能连接子(在所有末端 上经羰基或二羰基取代)促进非天然氨基酸多肽的位点特异性二聚化或寡聚化。通过将 此连接子策略与本文中描述的活体内翻译技术组合，使得详细说明经化学精制的蛋白质 的三维结构成为可能。
在某些实施例中为用于衍生化包括式XIV-XVI的氨基酸(其包含处于式XIV-XVI 的范畴内的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包括使包括至少一个 式XIV-XVI的氨基酸的多肽与式(XIX)的试剂接触。在某些实施例中，多肽是在与式 (XIX)的试剂接触之前或之后经纯化。在其他实施例中为包括至少一个对应于式 (XXIX)的含肟氨基酸的所得衍生多肽，
其中：
A为可选的，且当存在时为低级亚烷基、经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代 低级亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代 亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为可选的，且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低级亚烷基、 经取代低级亚烷基、低级亚烯基、经取代低级亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、 -C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、 -CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、 -C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或 经取代烷基；
L为独立地选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯 基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷 基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚 烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基 或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取 代亚烷基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为可选的，且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；且
R2为可选的，且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或聚核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低级烷基或经取代低级烷基；且
X独立地为可检测标记、生物活性剂或聚合物。
在其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下在水溶液中稳定至少1个月。在 其他实施例中，这些衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少2周。在其他实施例中，这些 衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少5天。在其他实施例中，所述条件为pH2至8。在 某些实施例中，保持衍生多肽的三级结构。在其他实施例中，多肽的这些衍生化进一步 包括将衍生多肽连接至另一多肽上。在其他实施例中，这些所衍生的多肽与选自由以下 各物组成的群组的治疗蛋白质同源：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、 抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因 子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、 PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、 单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白 -iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、 CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制 剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因 子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、 因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋 白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、 生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长 激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、 类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白 细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化因子、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏 死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
D.添加官能基的实例：偶合至非天然氨基酸多肽上的大分子聚合物
可使用本文中描述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中描述的非天然氨基 酸多肽的各种修饰。这些修饰包含使其他官能基结合于多肽的非天然氨基酸组分上，这 些官能基包含(但不限于)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物； 光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂； 第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳 水化合物；聚核苷酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊 精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能 基；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分； 配位体；可光异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解 的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸； 毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密 基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子； 抑制性核糖核酸、放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素； 放射性传递素；抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成 抑制素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决 定基、受体、反胶束以及其任何组合。作为本文中描述的组合物、方法、技术和策略的 说明性、非限制性实例，以下描述应集中在将大分子聚合物添加至非天然氨基酸多肽上， 同时应了解另外描述的组合物、方法、技术和策略也可用于(必要时加以适当修改，且 所属领域的技术人员可使用本文中的揭露内容进行)添加其他官能基，其包含(但不限 于)上文列出的那些官能基。
多种大分子聚合物以及其他分子可偶合至本文中描述的非天然氨基酸多肽上以调 节非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)的生物性质，及/或向非天然氨基酸多肽 (或相应天然氨基酸多肽)提供新的生物性质。这些大分子聚合物可通过非天然氨基酸， 或非天然氨基酸的任何官能取代基，或添加至非天然氨基酸上的任何取代基或官能基偶 合到非天然氨基酸多肽上。
水溶性聚合物可偶合至并入本文中描述的多肽(天然或合成)、聚核苷酸、多糖或 合成聚合物中的非天然氨基酸上。水溶性聚合物可通过并入多肽中的非天然氨基酸或非 天然氨基酸的任何官能基或取代基，或添加至非天然氨基酸上的任何官能基或取代基偶 合。在一些情况下，本文中描述的非天然氨基酸多肽包括一个或一个以上偶合至水溶性 聚合物上的非天然氨基酸以及一个或一个以上键联至水溶性聚合物上的天然存在氨基 酸。亲水性聚合物与生物活性分子的共价连接表示增加生物活性分子(包含蛋白质、肽 以及尤其疏水分子)的水溶性(诸如在生理环境中)、生物可用性、增加血清半衰期、 增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的一种方法。这些亲水 性聚合物的其他重要特征包含生物相容性、无毒性以及无免疫原性。对于最终产物制剂 的治疗用途，优选聚合物应为医药学上可接受的。
亲水性聚合物的实例包含(但不限于)：聚烷基醚以及其烷氧基封端类似物(例如， 聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/聚氧丙二醇，以及其甲氧基或乙氧基封端类似物，尤其聚氧乙 二醇，后者也被称作聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、 聚烷基噁唑啉以及聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺以及聚羟烷基丙烯酰 胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺以及其衍生物)；聚羟烷基丙烯酸酯；聚唾液酸以 及其类似物；亲水性肽序列；多糖以及其衍生物，其包含葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如， 羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素以及其衍生物，例如，羧甲基纤维素、 羟烷基纤维素；甲壳质以及其衍生物，例如，壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基甲壳质、 羧甲基壳聚糖；透明质酸以及其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀 粉以及羧甲基支链淀粉；聚氨基酸以及其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬 氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚 马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述物质的衍 生物。水溶性聚合物可为任何结构形式，其包含(但不限于)线性、叉状或分枝。在一 些实施例中，具有2至约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用。多官能聚合物衍生 物包含(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中每一末端与可相同或不同的官能 基键结。在一些实施例中，水基聚合物包括聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在宽泛范 围内，其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物 的分子量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000 Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、 55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000 Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000 Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、 300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da 与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链PEG的分子量 可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000 Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、 50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000 Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、 2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实 施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链 PEG的分子量在约5,000Da与20,000Da之间。所属领域的技术人员应了解关于实质上 水溶性主链的前述列举绝非详尽的且仅为说明性的，且预计具有上述品质的所有聚合材 料适用于本文中描述的方法和组合物中。
如上所述，亲水性聚合物的一个实例为聚乙二醇(缩写为PEG)，其已广泛用于药 物中、人造植入物上，以及其中生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其他应 用中。本文中描述的聚合物∶多肽实施例将使用PEG作为例示性亲水性聚合物，其中应 了解其他亲水性聚合物可类似地用于这些实施例中。
PEG为熟知的水溶性聚合物，其可市面上购得或可根据所属领域中熟知的方法由乙 二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York， 第3卷，第138-161页)。PEG通常透明、无色、无味、可溶于水中、对热稳定、对许 多化学剂惰性、不水解或变质，且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容的，这就是说PEG 能够与活组织或生物体共存，而不造成危害。更明确地说，PEG实质上为非免疫原性的， 这就是说PEG在体内不趋向于产生免疫反应。当连接至体内具有一些需要的功能的分子 (诸如生物活性剂)上时，PEG趋向于掩蔽药剂且可减少或消除任何免疫反应以便生物 体可耐受药剂的存在。PEG接合物趋向于不产生实质的免疫反应或造成凝结或其他不需 要的效应。
广泛使用术语“PEG”涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑大小或在PEG末端上的修饰)， 且当键联至非天然氨基酸多肽上时可由下式表示：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
其中n为2至10,000且X为H或末端修饰，其包含(但不限于)C1-4烷基、保护 基或末端官能基。术语PEG包含(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，其包含双官能 PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉状PEG、分枝PEG(其中每一链具有约1kDa至约100 kDa、约1kDa至约50kDa或约1kDa至约20kDa的分子量)、悬垂PEG(即具有一个 或一个以上悬垂于聚合物主链的官能基的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键联 的PEG。在一实施例中，其中n为约20至约2000的PEG适用于本文中描述的方法和 组合物中。在一些实施例中，水基聚合物包括聚乙二醇部分。PEG聚合物的分子量可在 宽泛范围内，其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。 PEG聚合物的分子量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000 Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、 60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000 Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000 Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500 Da、400Da、300Da、200Da以及100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100 Da与50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。 在一些实施例中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在 约10,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚乙二醇分子为分枝聚合物。支链 PEG的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、 95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000 Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、 20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、 4,000Da、3,000Da、2,000Da以及1,000Da。在一些实施例中，支链PEG的分子量在 约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与 40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与40,000Da之间。 在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da与20,000Da之间。广泛范围的PEG 分子描述于(包含，但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录 中，其是以引用的方式并入本文中。
文献中末端官能基的特定实例包含(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(参见(例如) 美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(参见(例如)Buckmann等人，Makromol. Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(参见(例 如)Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯以及丁酸琥珀 酰亚胺酯(参见(例如)Olson等人，在Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications中第170-181页，Harris和Zalipsky编，ACS，Washington，D.C.，1997；也参 见美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(参见(例如)Abuchowski等人， Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381 (1979))、琥珀酰亚胺基酯(参见(例如)美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑(参 见(例如)美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(参见(例如)Pitha等人，Eur.J Biochem. 94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧基羰基咪唑(参 见(例如)Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(参见(例如)Veronese等人，Appl.Biochem. Biotech.，11：141(1985)；以及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛 (参见(例如)Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784 号；美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(参见(例如)Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)；Romani等人，在Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)中；以及 Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(参见(例如)Woghiren 等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(参见(例如)Sawhney等人，Macromolecules， 26：581(1993))、乙烯基砜(参见(例如)美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献 和专利是以引用的方式全部并入本文中。
在一些情况下，PEG在一端上以羟基或甲氧基终止，即，X为H或CH3(“甲氧基 PEG”)。或者，PEG可以反应性基团终止，进而形成双官能聚合物。典型反应性基团可 包含通常用于与20种常见氨基酸中存在的官能基(包含(但不限于)马来酰亚胺基团、 活化碳酸酯(包含(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包含(但不限于)N-羟基琥珀 酰亚胺、对硝基苯酯)以及醛)以及对20种常见氨基酸惰性但与非天然氨基酸中存在 的互补官能基特异性反应的官能基(包含(但不限于)肟基、羰基或二羰基以及羟胺基) 的那些反应性基团。
应注意在上式中由Y表示的PEG的另一端应通过非天然氨基酸直接或间接地连接 到多肽(合成或天然)、聚核苷酸、多糖或合成聚合物上。当Y为羟胺基时，那么含羟 胺的PEG试剂可与多肽中含有羰基或二羰基的非天然氨基酸反应以形成通过肟键键联 至多肽上的PEG基团。当Y为羰基或二羰基时，那么含有羰基或二羰基的PEG试剂可 与多肽中含羟胺的非天然氨基酸反应以形成通过肟键键联至多肽上的PEG基团。当Y 为羰基或二羰基时，那么含有羰基或二羰基的PEG试剂也可与多肽中含肟的非天然氨基 酸反应以形成通过新的肟键键联至多肽上的PEG基团。适当反应条件、纯化方法和试剂 的实例遍及本说明书和附随图式进行描述。举例来说，图7呈示含羰基的非天然氨基酸 多肽与含羟胺的PEG试剂反应形成键联至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多肽的三 个实例。此外，图9呈示含肟的非天然氨基酸多肽与含羰基的PEG试剂反应形成键联至 PEG基团上的新的含肟的非天然氨基酸多肽的两个实例。且图10呈示含羟胺的非天然 氨基酸多肽与含羰基的PEG试剂反应形成键联至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多 肽的一个实例。
仅举例来说且并非作为对可用于本文中描述的组合物、方法、技术和策略的PEG 试剂的类型或种类的限制，图11呈示可与含羰基的非天然氨基酸多肽反应以形成键联 至PEG基团上的含肟的非天然氨基酸多肽的含羟胺的PEG试剂的其他说明性实例，以 及可与含肟的非天然氨基酸多肽或含羟胺的非天然氨基酸多肽反应以形成键联至PEG 基团上的新的含肟非天然氨基酸多肽的含羰基的PEG试剂的实例。图12呈示用于形成 含羟胺的PEG试剂，或含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或含羟胺的PEG试剂的经掩 蔽形式的合成方法的四个说明性实例。图13呈示用于形成经酰胺键联的含羟胺的PEG 试剂，或经酰胺键联的含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或经酰胺键联的含羟胺的PEG 试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。图14和图15呈示用于形成经氨基甲酸酯 键联的含羟胺的PEG试剂，或经氨基甲酸酯键联的含羟胺的PEG试剂的经保护形式， 或经氨基甲酸酯键联的含羟胺的PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。图 16呈示用于形成简单含羟胺的PEG试剂，或简单含羟胺的PEG试剂的经保护形式，或 简单含羟胺的PEG试剂的经掩蔽形式的合成方法的说明性实例。此外，图17呈示具有 多个键联PEG基团的支链的含有羟胺的试剂的说明性实例，且进一步展示一种此含羟胺 的多个PEG支链试剂与含羰基的非天然氨基酸多肽形成具有键联的多个PEG支链基团 的含肟非天然氨基酸多肽的反应。
当需要将不同分子连接到聚合物的每一末端上时，异双官能衍生物也为尤其适用 的。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG会容许将具有活化亲电子基团(诸如醛、酮、 活化酯、活化碳酸酯等)的分子连接到PEG的一个末端上且将具有亚乙酰基的分子连接 到PEG的另一个末端上。
在一些实施例中，强亲核试剂(包含(但不限于)羟胺)可与非天然氨基酸中存在 的醛基或酮基反应以形成肟，在一些情况下其可通过以适当还原剂处理来进一步还原。 或者，强亲核试剂可通过非天然氨基酸并入多肽中且用于与水溶性聚合物中存在的酮基 或醛基优先反应。通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然氨基酸反应。
因此，在一些实施例中，包括非天然氨基酸的多肽通过非天然氨基酸的侧链键联到 水溶性聚合物(诸如聚乙二醇(PEG))上。本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物提 供用于以PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高度有效方法，其包括将非天然氨基酸(包含 (但不限于)含有20种天然并入氨基酸中不存在的官能基或取代基的那些氨基酸)选 择性并入蛋白质中以回应选择密码子，以及随后以适合反应性PEG衍生物修饰那些氨基 酸。多种已知化学方法适用于本文中描述的非天然氨基酸方法和组合物以将水溶性聚合 物并入蛋白质中。
聚合物主链可为线性或分枝的。分枝聚合物主链通常为所属领域中已知的。通常， 分枝聚合物具有中心分枝核部分和多个连接到中心分枝核上的线性聚合物链。PEG是以 分枝形式使用，其可通过将环氧乙烷添加到各种多元醇(诸如丙三醇、丙三醇寡聚物、 季戊四醇以及山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可衍生自若干氨基酸，诸如赖氨酸。 分枝聚乙二醇可以通用形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自核部分，诸如丙三醇、 丙三醇寡聚物或季戊四醇，且m表示臂的数目。多臂PEG分子(诸如美国专利第5,932,462 号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596； WO 96/21469；以及WO 93/21259中描述的那些PEG分子，这些文献的每一者是以引用 的方式全部并入本文中)也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为键联基团且Z 为通过确定长度的原子链键联到CH上的活化末端基团。另一分枝形式悬垂PEG沿PEG 主链而非在PEG链的末端处具有诸如羧基的反应性基团。
除PEG的这些形式之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来 说，可制备在聚合物主链中具有酯键的PEG，其经历水解。如本文中所示，此水解使得 聚合物裂解为较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
所属领域的技术人员应了解，术语聚乙二醇或PEG表示或包含所属领域中已知的所 有形式，其包含(但不限于)本文中揭露的那些形式。聚合物的分子量可在宽泛范围内， 其包含(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子 量可在约100Da与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、 90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000 Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、 15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、 3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、 300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例 中，聚合物的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da 与40,000Da之间。
为最大化PEG的所需性质，PEG聚合物或连接到生物活性分子上的聚合物的总分 子量以及水合状态应足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，诸如水溶性 和循环半衰期增加，而不会不利影响母体分子的生物活性。
本文中描述的方法和组合物可用于制备实质上均质的聚合物∶蛋白质接合物的制剂。 如本文中所使用的“实质上均质”意谓观测到聚合物∶蛋白质接合物分子比总蛋白质的一 半更大。聚合物∶蛋白质接合物具有生物活性且本文中提供的本发明的“实质上均质”PEG 化多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，易于临床应用于批次之间药物动 力学的预测中)的那些制剂。
也可选择制备聚合物∶蛋白质接合物分子的混合物，且本文中提供的优点在于可选择 包含在混合物中的单聚合物∶蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与 所连接的各种数目的聚合物部分(即，二聚物部分、三聚物部分、四聚物部分等)的混 合物且将这些接合物与使用本文中描述的方法制备的单聚合物∶蛋白质接合物组合，且使 混合物具有预定比例的单聚合物∶蛋白质接合物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会随着其在反应混合物中的浓度而改变。一般来 说，最佳比率(就反应效率来说在于存在最小过量的未反应的蛋白质或聚合物)可由所 选聚乙二醇的分子量且关于可用的可用反应性基团的数目来确定。关于分子量，通常聚 合物的分子量越高，可连接到蛋白质上的聚合物分子的数目越少。类似地，当优化这些 参数时，应考虑到聚合物的分枝。通常，分子量越高(或分枝越多)，聚合物∶蛋白质比 率越高。
如本文中所使用，且当涵盖亲水性聚合物∶多肽/蛋白质接合物时，术语“治疗有效 量”进一步指的是向患者提供所需益处增加的量。所述量会随着不同个体而改变且应取 决于众多因素，其包含患者的全面身体状态和所欲治疗的疾病、病症或病状的潜在病因。 本发明的组合物的治疗有效量可易于由所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和 程序来确定。
可调节本文中描述的键联到“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的水溶性 聚合物的数目(即，PEG化或糖基化的程度)以提供改变的(包含(但不限于)增加的 或降低的)药理学、药物动力学或药效特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，多 肽的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、两倍、五倍、10倍、50倍或至少约100倍。
在一实施例中，包括含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的 PEG衍生物修饰，其直接键联到PEG主链上。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均 分子量介于5kDa-40kDa之间)。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于) 介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约 100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、 80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000 Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、 9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的PEG 衍生物修饰，其通过酰胺键键联到PEG主链上。
在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10且n为100-1,000(即，平均 分子量介于5kDa-40kDa之间)。聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不限于) 介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da与约 100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、 80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000 Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、 9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括含羰基或二羰基的氨基酸的多肽经含有末端羟胺部分的PEG 衍生物修饰，其中分枝PEG的每一链具有在10kDa-40kDa范围内的MW，且在其他实 施例中，在5kDa-20kDa范围内。分枝聚合物的分子量可在宽泛范围内，其包含(但不 限于)介于约100Da与约100,000Da或更高之间的范围。聚合物的分子量可在约100Da 与约100,000Da之间，其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000 Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、 45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000 Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、 1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100 Da。在一些实施例中，聚合物的分子量在约100Da与50,000Da之间。在一些实施例中， 聚合物的分子量在约100Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约 1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约5,000Da与40,000Da 之间。在一些实施例中，聚合物的分子量在约10,000Da与40,000Da之间。
在另一实施例中，包括非天然氨基酸的多肽经至少一种具有分枝结构的PEG衍生物 修饰。在一些实施例中，含有羟胺基的PEG衍生物具有以下结构：
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X视情况为NH、O、S、C(O)或不存 在，m为2-10且n为100-1,000。聚合物的分子量可在约1,000Da与约100,000Da之间， 其包含(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000 Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、 35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000 Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一 些实施例中，支链PEG的分子量在约1,000Da与50,000Da之间。在一些实施例中，支 链PEG的分子量在约1,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子 量在约5,000Da与40,000Da之间。在一些实施例中，支链PEG的分子量在约5,000Da 与20,000Da之间。
可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。参见(例如)Harris，Macromol. Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)； Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6： 150-165(1995)。
用于活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号，以及更多WO 93/15189中，且用于活化聚合物与 酶之间的接合的方法包含(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989)、核糖核酸酶以及超氧化物歧化酶(Veronese 等人，App.Biochem.Biotech.11：141-152(1985))，所有这些文献是以引用的方式全部并 入本文中。
必要时，从疏水色谱获得的本文中描述的PEG化非天然氨基酸多肽可通过一种或一 种以上所属领域的技术人员已知的程序来进一步纯化，这些程序包含(但不限于)亲和 色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包含，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅石 色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包含，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水相互 作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚 焦；置换色谱；电泳程序(包含(但不限于)制备型等电聚焦)、差示溶解性(包含(但 不限于)硫酸铵沉淀)或萃取。由GPC通过与球状蛋白标准物比较可估算表观分子量 (Preneta AZ，PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris 和Angal编)IRL Press 1989，293-306)。非天然氨基酸多肽∶PEG接合物的纯度可通过蛋 白水解降解(包含(但不限于)胰蛋白酶裂解)、接着质谱分析来评估。Pepinsky RB. 等人，J.Pharmacol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
键联到本文中描述的多肽的非天然氨基酸上的水溶性聚合物可不加限制地经进一 步衍生或取代。
E.增强对血清白蛋白的亲和性
各种分子也可与本文中描述的非天然氨基酸多肽融合以调节在血清中的半衰期。在 一些实施例中，分子与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽键联或 融合以增强对动物中内源血清白蛋白的亲和性。
举例来说，在一些情况下，进行多肽与白蛋白结合序列的重组融合。例示性白蛋白 结合序列包含(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(参见(例如)Makrides 等人，J.Pharmacol Exp.Ther.277(1)：534-542(1996)以及Sjolander等人，J，Immunol. Methods 201：115-123(1997))，或白蛋白结合肽，诸如(例如)Dennis等人，J.Biol.Chem. 277(38)：35035-35043(2002)中描述的那些白蛋白结合肽。
在其他实施例中，本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽经脂肪 酸酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。参见(例如)Kurtzhals等人， Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其他实施例中，本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽直接与 血清白蛋白(包含(但不限于)人类血清白蛋白)融合。所属领域的技术人员应了解， 多种其他分子也可键联到如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽上以 调节与血清白蛋白或其他血清组分的结合。
F.本文中描述的非天然氨基酸多肽的糖基化
本文中描述的方法和组合物包含结合有一个或一个以上的带有糖残基的非天然氨 基酸的多肽。糖残基可为天然(包含(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包含 (但不限于)3-氟半乳糖)。所述糖可通过N键联或O键联的糖苷键(包含(但不限于) N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包含(但不限于)肟或相应C键联或S键联 的糖苷)键联到非天然氨基酸上。
糖(包含(但不限于)糖基)部分可在活体内或活体外添加到非天然氨基酸多肽上。 在一些实施例中，包括含羰基或二羰基的非天然氨基酸的多肽经用氨基氧基衍生化的糖 修饰以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。一旦连接到非天然氨基酸上，糖可通过以 糖基转移酶和其他酶处理来进一步精制以产生结合到非天然氨基酸多肽上的寡糖。参见 (例如)H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
G.键联基团的使用和包含多肽二聚体和多聚体的应用
除了直接向非天然氨基酸多肽添加官能基之外，多肽的非天然氨基酸部分可首先经 多官能(例如，双官能、三官能、四官能)连接子分子修饰，其随后经进一步修饰。也 就是说，多官能连接子分子的至少一个末端与多肽中的至少一个非天然氨基酸反应且多 官能连接子的至少一个其他末端可用于进一步官能化。如果多官能连接子的所有末端相 同，那么(视化学计量条件而定)可形成非天然氨基酸多肽的同型多聚体。如果多官能 连接子的末端具有不同的化学反应性，那么多官能连接子基团的至少一个末端会与非天 然氨基酸多肽结合且其他末端随后可与不同的官能基反应，这些官能基包含(仅举例来 说)：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性 化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽 或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷 酸；DNA；RNA；反义聚核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳 米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能基；与其他分子共 价或非共价相互作用的基团；光笼蔽部分；可光化辐射激发的部分；配位体；可光异构 化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解 的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位 素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团； 插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸、 放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素； 抗体酶、活化复合活化剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管生成抑制素、抗激素、 抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶 束以及其任何组合。
多官能连接子基团具有以下通用结构：
其中：
X各自独立地为NH2、-C(＝O)R9、-SR′或-J-R，其中R9为H或OR′，其中J为
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；R″各自独立地为H、烷基、 经取代烷基或保护基，或当存在一个以上的R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
L各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经 取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k- (其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取 代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚 烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷 基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、 -N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、 -N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、 -N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-以及 -C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1为可选的，且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中p 为0、1或2；W为NH2、-C(＝O)R9、-SR′或-J-R；且n为1至3；
其限制条件为X和L-L1-W共同各自独立地提供以下各基团中的至少一者：(a)能 够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的羰基(包含二羰基) 反应的羟胺基；(b)能够与非天然氨基酸或“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽 上的羟胺基反应的羰基(包含二羰基)；或(c)能够经历与非天然氨基酸或“经修饰或 未经修饰的”非天然氨基酸多肽上的肟基发生交换反应的羰基(包含二羰基)。
图18呈示合成双官能同型连接子(其中所述连接子具有两个相同末端，即，羟胺 基)的说明性、非限制性实例。此连接子可用于形成含羰基或二羰基的非天然氨基酸多 肽的同型二聚体以形成两个肟键。或者，如果此连接子的一个末端经保护，那么此部分 经保护的连接子可用于通过肟键使未经保护的羟胺末端与含羰基或二羰基的非天然氨 基酸多肽结合，留下另一个经保护的末端在去保护之后用于其他键联反应。或者，对试 剂的化学计量的仔细操作可提供类似的结果(异质二聚体)，虽然会得到其中所需异质 二聚体会类似地由一些同型二聚体污染的结果。
图19呈示其中每一连接子具有一种以上的类型的末端反应性基团(即，羟胺基、 肟基以及硫酯基)的两种多官能异型连接子的说明性、非限制性实例。使用遍及本说明 书论述的基于肟的化学，此连接子可用于形成非天然氨基酸多肽的异质二聚体。
图20呈示在多步骤合成中使用异型双官能连接子将PEG基团连接到非天然氨基酸 多肽上的示意性说明性、非限制性实例。在第一个步骤中，如此说明性图式中所描述， 含羰基的非天然氨基酸多肽与含羟胺的双官能连接子反应形成经修饰的含肟非天然氨 基酸多肽。然而，双官能连接子仍保留能够与具有适当反应性的试剂(在图式中由匹配 形状的物体说明)反应以形成经修饰的含肟的官能化非天然氨基酸多肽的官能基(本文 中由有形物体说明)。在此特定说明性图式中，官能化为PEG基团，但也可包含前述官 能基中的任一者，或在三官能或四官能连接子的情况下，包含一种以上类型的官能基或 多种类型的相同官能基。图21呈示用于将含羟胺的非天然氨基酸多肽键联到PEG基团 上的四种类型的连接子基团的说明性实例。如前所述，PEG官能基仅为说明性目的而提 供。因此，本文中描述的连接子基团提供以位点选择性方式进一步修饰非天然氨基酸多 肽的另一种方法。
本文中描述的方法和组合物也提供多肽组合，诸如同型二聚体、异质二聚体、同型 多聚体或异质多聚体(即，三聚体、四聚体等)。仅举例来说，以下描述着重于GH超 基因家族成员，然而，这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于呈二聚体和多聚体 形式的可提供益处的几乎任何其他多肽，其包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管 生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多 肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、 GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因 子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性 蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、 D31065、T64262、CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、 补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、 MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮 剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维 蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促 性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、 水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1 受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、 神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、 甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒 素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可 溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调 节素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、 SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综 合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、 肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、 jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮 质酮。
因此，本文中描述的方法、技术和组合物中涵盖直接结合至多肽主链或通过连接子 结合至另一GH超基因家族成员或其变体或非GH超基因家族成员的任何其他多肽或其 变体上的含有一个或一个以上非天然氨基酸的GH超基因家族成员多肽。由于其与单体 相比分子量增大，所以GH超基因家族成员二聚体或多聚体接合物可展现新颖或需要的 性质，其包含(但不限于)相对于单体GH超基因家族成员，不同的药理学、药物动力 学、药效学、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本文中描 述的GH超基因家族成员二聚体会调节GH超基因家族成员受体的二聚化。在其他实施 例中，本文中描述的GH超基因家族成员二聚体或多聚体会充当GH超基因家族成员受 体拮抗剂、促效剂或调节剂。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽经直接键联，其包含(但不限于)通过 Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键。在一些实施例中，键联的GH超基因家族成员多肽 及/或键联的非GH超基因家族成员会包括促进二聚化的不同的非天然氨基酸，其包含 (但不限于)第一GH超基因家族成员，及/或键联的非GH超基因家族成员，包括与包 括含羟胺的非天然氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽接合的含酮非天然氨基酸的多 肽且所述多肽通过形成相应肟来反应。
或者，两种GH超基因家族成员多肽及/或键联的非GH超基因家族成员是通过连接 子连接。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子连接两种GH超基因家族成 员，及/或键联的非GH超基因家族成员、多肽，其可具有相同或不同一级序列。在一些 情况下，用于将GH超基因家族成员，及/或键联的非GH超基因家族成员、多肽束缚在 一起的连接子可为双官能PEG试剂。
在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供具有哑铃结构的水溶性双官能连 接子，所述结构包含：a)在聚合物主链的至少第一末端上的叠氮化物、炔、肼、酰肼、 羟胺或含有羰基或二羰基的部分；以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二 官能基。第二官能基可与第一官能基相同或不同。在一些实施例中，第二官能基不与第 一官能基反应。在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供包括至少一个分枝分 子结构的臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。
在一些实施例中，本文中描述的方法和组合物提供通过与具有以下结构的水溶性活 化聚合物反应形成的包括一种或一种以上GH超基因家族成员的多聚体：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n为约5至3,000，m为2-10，X可为叠氮化物、炔、肼、酰肼、氨基氧基、 羟胺、乙酰基，或含有羰基或二羰基的部分，且R为封端基团、官能基，或可与X相同 或不同的离去基团。R可为(例如)选自由以下各基团组成的群组的官能基：羟基、经 保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀醯亚胺基酯、1-苯并三唑基酯、碳酸N-羟基琥珀醯亚胺 基酯、碳酸1-苯并三唑基酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙 烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、 经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡 啶、碘乙酰胺、环氧化物、二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯，以及三氟乙基磺酸酯、 烯和酮。
图22呈示使用本文中描述的连接子基团形成本文中描述的非天然氨基酸多肽的同 型二聚体的说明性、非限制性实例。在这个说明性实例中，使含羰基的非天然氨基酸多 肽在适于形成键联的同型二聚体含肟非天然氨基酸多肽的条件下与具有两个可用羟胺 基的双官能连接子基团反应。图式中呈示的方法并不限于与含羟胺的双官能连接子偶合 的含羰基非天然氨基酸多肽。非天然氨基酸多肽可进一步含有能够与含羰基的多官能连 接子基团经历交换反应以形成由含有多个肟基的结构连接的同型多聚体的肟基，或非天 然氨基酸多肽可进一步含有能够与含羰基的多官能连接子基团经历反应以形成由含有 多个肟基的结构连接的同型多聚体的羟胺基。当然，同型多聚体可为同型二聚体、同型 三聚体或同型四聚体。
图23呈示使用异型官能连接子基团形成多肽的异质二聚体的说明性、非限制性实 例，其中异质二聚体中的至少一个成员为本文中描述的非天然氨基酸多肽且其他成员视 情况为如本文中所述的非天然氨基酸多肽、其他类型的非天然氨基酸多肽，或天然存在 氨基酸多肽。在此图式中呈示的实例中，连接子基团含有两个相同的羟胺基，通过控制 化学计量、温度和反应的其他参数，连接子与含羰基的非天然氨基酸多肽反应的主要产 物为连接至具有可用羟胺基的连接子上的经修饰的含肟非天然氨基酸多肽。此后者基团 可进一步与另一种含羰基或二羰基的非天然氨基酸多肽反应以形成含肟的非天然氨基 酸多肽的双官能异质二聚体。当然，连接子上的官能基不必相同，且其不必为羟胺基。 使用遍及本说明书详述的化学，所属领域的技术人员可设计其中至少一个官能基可与非 天然氨基酸多肽形成肟基的连接子；连接子上的其他官能基可利用其他已知化学，其包 含有机化学领域中熟知的基于亲核试剂/亲电子试剂的化学。
H.添加官能基的实例：易化多肽的分离性质
天然存在或非天然氨基酸多肽可能因包含(但不限于)多肽的溶解性或结合特征的 多种原因难以从样本中分离。举例来说，在制备用于治疗用途的多肽的过程中，可能从 已经工程化设计以过度生产多肽的重组系统中分离此多肽。然而，由于多肽的溶解性或 结合特征，达到所需程度的纯度通常证明是困难的。本文中描述的方法、组合物、技术 和策略提供这种情形的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽具有改良的分离特 征。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽使通过生物合成制备。在另一或额外实施例 中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸中的一者中。在另一或额 外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良分离 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括与提供改良分离特征的基团的肟键。 在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进一步修饰以形成经修饰的含肟非天然氨基酸 多肽，其中所述修饰提供与提供改良分离特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基 团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非 天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上， 在其他实施例中，需要一系列化学反应来将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予 改良分离特征的基团在所利用的反应条件下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中 的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于可从改良分离特征获益的几乎任何其他多 肽，所述多肽包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗 体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、 T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、 MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核 细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、 SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、 组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤 坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长 因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌 激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良分离特征的基团改良多肽的水溶性；在其他实施 例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其他实施例中，所述基团向多肽提供新的结合 性质(包含(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在其中所述基团改良多肽 的水溶性的实施例中，基团是选自本文中描述的水溶性聚合物，其包含(仅举例来说) 本文中描述的PEG聚合物基团中的任一者。
I.添加官能基的实例：检测多肽的存在
天然存在或非天然氨基酸多肽在样本(包含活体内样本和活体外样本)中可因包含 (但不限于)缺乏可易于与多肽结合的试剂或标记的多种原因而难以检测。本文中描述 的方法、组合物、技术和策略提供这种情形的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽容许检测在活体内 样本和活体外样本中的多肽。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽是通过生物合成制 备。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸 中的一者中。在另一或额外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一 步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸多肽已经具有所需的检测 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸多肽包括至少一个选自由含肟的非天然氨 基酸、含羰基的非天然氨基酸以及含羟胺的非天然氨基酸组成的群组的非天然氨基酸。 在其他实施例中，这些非天然氨基酸已如本文中所述通过生物合成并入多肽中。在其他 或替代实施例中，非天然氨基酸多肽包括至少一个选自式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和 B)或XXXX-XXXXIII的氨基酸的非天然氨基酸。在其他或额外实施例中，非天然氨基 酸包括与提供改良检测特征的基团的肟键。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进 一步修饰以形成经修饰的含肟的非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改良检测 特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他 实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基 团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上，在其他实施例中，需要一系列化学反应来 将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予改良检测特征的基团在所利用的反应条件 下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在 氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于在活体内样本和活体外样本中需要检测的 几乎任何其他多肽，所述多肽包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、 抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、 C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、 SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化 蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞 炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、 CD40、CD40配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、 补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表 皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、 因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤 维连接蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、 生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、 人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、 胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、 白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经 素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲 状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素 A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶 性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节 素、生长激素抑制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、 SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、 胸腺素α1、组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死 因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、 血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、 myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良检测特征的基团是选自由以下各物组成的群组： 标记；染料；亲和性标记；光亲和性标记；自旋标记；荧光团；放射性部分；结合有重 原子的部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致 密基团；磁性基团；发色团；能量转移剂；可检测标记，以及其任何组合。
J.添加官能基的实例：改良多肽的治疗性质
天然存在或非天然氨基酸多肽应能够向患有特定病症、疾病或病状的患者提供某一 治疗益处。此治疗益处应取决于多种因素，其包含(仅举例来说)：多肽的安全性概况， 以及多肽的药物动力学、药理学及/或药效学(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、 治疗半衰期、免疫原性、生物活性或循环时间)。另外，向多肽提供其他官能基可为有 利的，诸如连接的细胞毒性化合物或药物，或可能需要与其他多肽连接以形成本文中描 述的同型多聚体以及异型多聚体。优选这些修饰不破坏原始多肽的活性及/或三级结构。 本文中描述的方法、组合物、技术和策略提供这些问题的解决办法。
使用本文中描述的方法、组合物、技术和策略，所属领域的技术人员可制备与所需 多肽同源的含肟的非天然氨基酸多肽，其中含肟的非天然氨基酸多肽具有改良的治疗特 征。在一实施例中，同源非天然氨基酸多肽是通过生物合成制备。在另一或额外实施例 中，非天然氨基酸已将其结构并入本文中描述的非天然氨基酸中的一者中。在另一或额 外实施例中，非天然氨基酸是在末端或中间位置处并入且进一步为位点特异性并入。
在一实施例中，如通过生物合成制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良治疗 特征。在其他或额外实施例中，非天然氨基酸包括与提供改良治疗特征的基团的肟键。 在其他或额外实施例中，非天然氨基酸经进一步修饰以形成经修饰的含肟非天然氨基酸 多肽，其中所述修饰提供与提供改良治疗特征的基团的肟键。在一些实施例中，这一基 团直接键联至非天然氨基酸上，且在其他实施例中，这一基团通过连接子基团键联至非 天然氨基酸上。在某些实施例中，这一基团通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上， 在其他实施例中，需要一系列化学反应来将这一基团连接到非天然氨基酸上。优选赋予 改良分离特征的基团在所利用的反应条件下位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中 的非天然氨基酸上，且并非键联到天然存在氨基酸上。
在其他或额外实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而， 这部分中描述的方法、技术和组合物可应用于可从改良的治疗特征获益的几乎任何其他 多肽，所述包含(仅举例来说)：α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、 载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、 NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、 降血钙素、c-kit配位体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋 化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、 RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配位体、c-kit配位体、胶原蛋白、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、 补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、 上皮中性粒细胞活化肽、红细胞生成素(EPO)、表皮剥脱毒素、因子IX、因子VII、因 子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、四螺旋束 蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受 体、grf、刺猬蛋白、血色素、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、 人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生 长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细 胞生长因子(KGF)、乳铁传递蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细 胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、 PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效素、蛋白A、蛋白G、pth、致热外毒素A、致热外毒 素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、 可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长激素抑 制素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、 SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、 组织型纤溶酶原活化剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤 坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长 因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌 激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体以及皮质酮。
在其他或额外实施例中，赋予改良治疗特征的基团改良多肽的水溶性；在其他实施 例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其他实施例中，所述基团向多肽提供新的结合 性质(包含(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在其中所述基团改良多肽 的水溶性的实施例中，基团是选自本文中描述的水溶性聚合物，其包含(仅举例来说) PEG聚合物基团。在其他或额外实施例中，所述基团为细胞毒性化合物，而在其他实施 例中，所述基团为药物。在其他实施例中，键联的药物或细胞毒性化合物可从非天然氨 基酸多肽上裂解以将药物或细胞毒性化合物递送到所需治疗位置。在其他实施例中，所 述基团为第二多肽，其包含(举例来说)含肟的非天然氨基酸多肽，其进一步包含(举 例来说)具有与第一非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构的多肽。
在其他或额外实施例中，含肟的非天然氨基酸多肽为经修饰的含肟的非天然氨基酸 多肽。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸 多肽增加多肽的生物可用性。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽， 含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的安全性概况。在其他或额外实施例中，相对于同源 天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的水溶性。在其他或额外实施 例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽增加多肽的治疗半衰 期。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多 肽增加多肽的血清半衰期。在其他或额外实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽， 含肟的非天然氨基酸多肽延长多肽的循环时间。在其他或额外实施例中，相对于同源天 然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽调节多肽的活性。在其他或额外实施例中， 相对于同源天然存在氨基酸多肽，含肟的非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
XI.经修饰多肽的治疗用途
为方便起见，这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽一般性及/或以特 定实例来描述。然而，这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽不应仅限于 这部分中提供的一般描述或特定实例，而是这部分中描述的“经修饰或未经修饰的”非 天然多肽同样充分适用于所有包括至少一个处于式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B)以 及XXXX-XXXXIII的范畴内的氨基酸的“经修饰或未经修饰的”非天然多肽，其包含 处于本文中的说明书、权利要求以及图式中描述的式I-XVIII、XXX-XXXIV(A和B) 以及XXXX-XXXXIII的范畴内的任何子式或特定化合物。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽(包含其同型多聚体和异 型多聚体)存在多种用途，其包含(但不限于)：治疗用途、诊断用途、基于检定的用 途、工业用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。 作为非限制性说明，提供“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽适用于治疗多种病症、病 状或疾病。投与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品在人类中 产生由市售多肽制剂证实的任何活性。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品 的平均量可改变且尤其应根据合格医师的建议和处方而改变。“经修饰或未经修饰的” 非天然氨基酸多肽的确切量应优先根据以下因素选择：诸如所治疗的病状的确切类型、 所治疗的患者的病状，以及组合物中的其他成分。所欲给予的量可易于由所属领域的技 术人员根据使用“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的疗法确定。
A.投药和医药组合物
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽(包含其同型多聚体和异 型多聚体)存在多种用途，其包含(但不限于)：治疗用途、诊断用途、基于检定的用 途、工业用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量生产用途及/或军事用途。 作为非限制性说明，提供“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽适用于治疗多种病症。投 与本文中描述的“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品在人类中产生由市售多 肽制剂证实的任何活性。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽产品的平均量可改 变且尤其应根据合格医师的建议和处方而改变。“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸 多肽的确切量应优先根据以下因素选择：所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的病 状，以及组合物中的其他成分。所欲给予的量可易于由所属领域的技术人员根据使用“经 修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的疗法确定。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包含(但不限于)合成酶、 包括一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况用于治疗用途，其包含(但不限 于)与适合医药载剂组合。这些组合物(例如)包括治疗有效量的如本文中所述的经修 饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽，以及医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或 赋形剂包含(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇及/或其组合。进 行调配以适应投药模式。一般来说，投与蛋白质的方法为所属领域中所熟知且其可应用 于如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的投药。
根据所属领域中熟知的方法，包括一种或一种以上如本文中所述的经修饰或未经修 饰的非天然氨基酸多肽的治疗组合物视情况于一种或一种以上患病的适当活体外及/或 活体内动物模型中测试以确定功效、组织代谢和估算剂量。具体来说，剂量初始可由非 天然氨基酸相对天然氨基酸同源物(包含(但不限于)将经修饰以包含一个或一个以上 非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽加以比较)的活性、稳定性或其他适合量度(即， 在相关检定中)来测定。
投药是通过通常用于引入分子以最终与血液或组织细胞接触的途径中的任一者来 进行。如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以 上医药学上可接受的载剂一起以任何适合方式投与。可获得向患者投与如本文中所述的 经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的适合方法，且尽管可使用一种以上的途径投与 特定组合物，但特定途径通常可比另一种途径提供更直接以及更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂部分由所投与的特定组合物以及由用于投与组合物的特定 方法确定。因此，存在多种本文中描述的医药组合物的适合配方。
本文中描述的非天然氨基酸多肽和包括这些多肽的组合物可由适用于蛋白质或肽 的任何常规途径来投与，其包含(但不限于)非经肠投与，例如注射，其包含(但不限 于)皮下注射或静脉内注射或注射或输液的任何其他形式。多肽医药组合物(包含本文 中描述的各种非天然氨基酸多肽)可由众多途径来投与，其包含(但不限于)经口、静 脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包括如本文中所述的经 修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体来投与。这些投药途径和 适当配方通常为所属领域的技术人员所已知。本文中描述的非天然氨基酸多肽也可单独 或与其他适合组分(包含(但不限于)医药载剂)组合使用。
单独或与其他适合组分组合的如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸 多肽也可制成可通过吸入来投与的气溶胶配方(即，其可“雾化”)。气溶胶配方可置入 加压的可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮以及其类似物。
适用于非经肠投药(诸如，通过关节内(在关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹 膜内以及皮下途径)的配方包含水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂以及使配方与预定受体的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮 液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。经包装的核酸的配方可存 在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。
非经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治 疗剂的投药途径(包含(但不限于)通常用于EPO、IFN、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、 白细胞介素、抗体及/或任何其他医药递送蛋白质的那些投药途径)以及目前使用的配方 提供用于如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的优选投药途径和配 方。
在本文中描述的组合物和方法的情况下，投与到患者中的剂量足以随时间在患者中 产生有益治疗反应。剂量由特定配方的功效和所使用的经修饰或未经修饰的非天然氨基 酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状，以及所欲治疗的患者的体重或表面 积来确定。剂量大小也由在特定患者中投与特定配方或其类似物伴随的任何有害副作用 的存在、性质和程度来确定。
在确定在治疗或预防疾病(包含(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS或 其类似疾病)时所欲投与的配方的有效量时，医师评估循环血浆水平、配方毒性、疾病 的进展及/或(如果相关)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
投与至(例如)70公斤的患者中的剂量通常在等效于适于相关组合物的改变的活性 或血清半衰期的目前所用治疗蛋白质的剂量的范围内。本文中描述的医药配方可由任何 已知常规疗法(其包含抗体投药、疫苗投药、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核 苷酸类似物、生物反应调节剂以及其类似物的投药)来补充治疗状况。
对于投药来说，本文中描述的医药配方是以由相关配方的LD-50或ED-50及/或对 在各种浓度(其包含(但不限于)当应用于患者的质量和总体健康状况时)下经修饰或 未经修饰的非天然氨基酸多肽的任何副作用的观测确定的速率来投与。投药可通过单次 给药或分次给药来实现。
如果经历配方输液的患者出现发热、发冷或肌肉痛，那么使他/她接收适当剂量的阿 斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其他疼痛/发热控制 药物。使经历输液反应(诸如发热、肌肉痛以及发冷)的患者在未来以阿斯匹林、醋氨 酚或(包含，但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)输液之前提前30分钟用药。对 于对退热剂和抗组胺剂无迅速反应的更严重的发冷和肌肉痛，使用度冷丁(Meperidine)。 视反应的严重性来减缓或停止细胞输液。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可直接投与至哺乳动物受 检者。由通常用于将多肽引入受检者中的途径中的任一种进行投药。如本文中所述的经 修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽包含适用于经口、经直肠、局部、吸入(包含(但 不限于)通过气溶胶)、口腔(包含(但不限于)舌下)、经阴道、非经肠(包含(但不 限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、 局部(即，皮肤与黏膜表面，其包含气管表面)以及经皮投药的那些多肽，尽管在任何 给定情况下最适合的途径应视所治疗的病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身 性的。配方可存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中。如本文中所述 的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可制备于与医药学上可接受的载剂的单位剂 量可注射形式(包含(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物中。如本文中所述的 经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽也可由连续输液(使用(包含，但不限于)诸如 渗透泵的微型真空泵)、单一大丸剂或缓慢释放储槽式配方来投与。
适于投药的配方包含水性和非水性溶液、等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂以及使配方等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮 剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒以及先前 描述种类的片剂来制备。
冻干为通常使用的呈现蛋白质的技术，其用来从所关注的蛋白质制剂中移除水。冷 冻干燥(Freeze-drying)或冻干(lyophilization)为首先将所欲干燥的物质冷冻且随后通 过在真空环境中升华来移除冰或冷冻溶剂的过程。赋形剂可包含于预先冻干的配方中以 增加冻干过程中的稳定性及/或改良冻干产物在储存时的稳定性。Pikal，M.Biopharm. 3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)：285-291(1991)。
药物的喷雾干燥也为所属领域的技术人员所已知。举例来说，参见Broadhead，J.等 人，″The Spray Drying of Pharmaceuticals，″Drug Dev.Ind.Pharm，18(11和12)，1169-1206 (1992)。除小分子药物之外，多种生物材料已经喷雾干燥且这些材料包含：酶、血清、 微生物和酵母。喷雾干燥为适用的技术，因为其可以一步法将液体药物制剂转变为精细、 无尘或凝聚的粉末。基本技术包括以下四个步骤：a)将原料溶液雾化成喷雾；b)喷雾 -空气接触；c)使喷雾干燥；以及d)将经干燥的产物与干燥空气分离。美国专利第 6,235,710号和第6,001,800号(其是以引用的方式全部并入本文中)描述通过喷雾干燥 来制备重组红细胞生成素。
本文中描述的医药组合物可包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学 上可接受的载剂部分由所投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法确定。因 此，存在多种本文中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的医药组合物(视情 况包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的适合配方，(参见(例如)Remington： The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company， 1995)；Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton， Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第17版(Lippincott Williams & Wilkins，1999))。适合载剂包含缓冲剂，其含 有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐以及其他 有机酸；抗氧化剂，其包含(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，其包含(但不限于) 小于约10个残基的那些多肽；蛋白质，其包含(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫 球蛋白；亲水性聚合物，其包含(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，其包含(但不 限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、甲硫氨酸、谷 氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，其包含(但不限于)海藻糖、蔗糖、 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，其包含(但不限于)EDTA；二价金属离子，其包含 (但不限于)锌、钴或铜；糖醇，其包含(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡 离子，其包含(但不限于)钠；及/或非离子表面活性剂，其包含(但不限于)TweenTM (包含(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM 以及其他普洛尼克酸(pluronic acid)(包含(但不限于)普洛尼克酸F68(帕洛沙姆188 (poloxamer 188)))或PEG。适合表面活性剂包含例如(但不限于)基于聚氧化乙烯- 聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(即，(PEO-PPO-PEO))，或聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙 烯(即，(PPO-PEO-PPO))，或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商 标名称PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp.，Wyandotte，Mich.)市售且进一步描述于美国专利第4,820,352号(其是以引用的 方式全部并入本文中)中。其他乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为适合的表面活性剂。表面活 性剂或表面活性剂的组合可用于抵抗一种或一种以上应力(包含(但不限于)来自搅拌 的应力)来稳定PEG化非天然氨基酸多肽。一些上述表面活性剂可被称作“膨胀剂”。 一些也可被称作“张力调节剂”。
如本文中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包含键联到水溶性聚合物 (诸如PEG)上的那些非天然氨基酸多肽)也可由持续释放系统或作为持续释放系统的 部分来投与。持续释放组合物包含(包含，但不限于)为成形物品(其包含(但不限于) 薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包含生物相容性材料，诸如 聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)； Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，如前)或聚 -D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、 聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L- 谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556 (1983))、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、 多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、聚核苷酸、聚 乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及聚硅氧。持续释放组合物也包含脂质体包封的化合物。 含有化合物的脂质体是由本身已知的方法制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，77： 4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专 利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。
脂质体包封的多肽可由以下文献中描述的方法来制备：例如，DE 3,218,121；Epstein 等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci. U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641； 日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。 脂质体的组成和大小为熟知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质 体的一些实例描述于(例如)Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331 (1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编)：MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)； Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems for cancer therapy，在Teicher B(编)： CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002)中；Park JW等人，Clin. Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)。
在本文中描述的组合物、配方和方法的情况下投与至患者的剂量应足以随时间在受 检者中产生有益的反应。通常，每剂量非经肠投与的如本文中所述的经修饰或未经修饰 的非天然氨基酸多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01μg至约100μg，或 约0.05mg至约1mg的范围内，尽管其应经受治疗判断。给药频率也经受治疗判断，且 可比经批准用于人类的市售产品的频率更高或频率更低。通常，聚合物∶多肽接合物(包 含(仅举例来说)如本文中所述的PEG化多肽)可通过上述投药途径中的任一种来投与。
实例
实例1
这个实例详述图4中呈示的含羰基的氨基酸的合成。含羰基的非天然氨基酸是如图 4中所述制备。
实例2
这个实例详述图5a中呈示的经保护含羟胺的氨基酸的合成。经保护含羟胺的非天 然氨基酸是如图5a中所述制备。
实例3
这个实例详述图5b中呈示的含羟胺的氨基酸的合成。含羟胺的非天然氨基酸是如 图5b中所述制备。
实例4
这个实例详述图5c中呈示的含羟胺的氨基酸的合成。含羟胺的非天然氨基酸是如 图5c中所述制备。
实例5
这个实例详述图5d中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图5d 中所述制备。
实例6
这个实例详述图6a中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6a 中所述制备。
实例7
这个实例详述图6b中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6b 中所述制备。
实例8
这个实例详述图6c中呈示的含肟的氨基酸的合成。含肟的非天然氨基酸是如图6c 中所述制备。
实例9
这个实例详述图24中呈示的含羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向NaOH溶液(40mL，25体积％)中添加乙醚(60mL)。将防爆屏蔽物 置于反应烧瓶前面。经3分钟分3份向所得混合物中添加N-亚硝基-N-甲基脲(6.0g， 57.9mmol)。在0℃下搅拌反应10分钟。随后使乙醚层与氢氧化钠层分离。经5分钟将 有机层逐份(约6次添加)添加到N-Boc-4-羟基甲基苯丙氨酸(7.5g，25.4mmol)于 无水THF(20mL)中的溶液中直至起始物质完全消失(由TLC监测)。随后添加5滴 冰乙酸以中止反应。通过旋转蒸发移除有机溶剂之后，添加乙酸乙酯。将有机层以 NaHCO3饱和溶液、H2O和盐水依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且浓缩以产生 呈白色粉末状的产物(5.9g，75％)。
的合成
在0℃下向醇(6.0g，19.4mmol)和吡啶(12mL，150mmol)于CH2Cl2(400mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin periodinane)(14.2g，33.4mmol)。 在室温下将混合物搅拌过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL) 中止且用CH2Cl2萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，1∶100-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈 白色固体状的醛产物(5.48g，92％)。
的合成
向醛(3.07g，10mmol)于EtOH(40mL)中的溶液中添加乙酸酰肼(1.7g，20mmol)。 将反应混合物在室温下搅拌30分钟且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加 CH2Cl2。将有机层分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯 化残余物得到呈白色固体状的产物(3.29g，90％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.29g，9.1mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌1小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止 反应且以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到白色固体(3.05g，96％)。
的合成
在0℃下向上述酸(3.02g，8.6mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)， 接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈黄色固 体状的产物(2.07g，83％)。
实例10
这个实例详述图25中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向胺(10g，34mmol)于DMF(70mL)中的经搅拌溶液中添加丙酮酸(5 mL，72mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC，20g，104mmol)、 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，85g，71mmol)以及N，N-二异丙基乙基胺(DIEA，35 mL，200mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时且随后以柠檬酸水溶液(5％，500mL) 中止且以EtOAc(500mL)萃取。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物 得到呈固体状的产物(4.78g，40％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(2.96g，8.1mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时。随后将反应以柠檬酸水溶液(5％) 中止且以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到呈黄色固体状的产物(2.87g，100％)。
的合成
在0℃下向上述酸(2.05g，5.9mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(10mL)。将混合物搅拌2小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl(1mL，4N， 于二噁烷中)，接着添加乙醚(400mL)。收集呈白色固体状的沉淀物(1.38g，82％)。
实例11
这个实例详述图26中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在90℃下向4′-甲基苯丙酮(20g，122mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，23g， 130mmol)于苯(300mL)中的溶液中添加2，2′-偶氮双异丁腈(AIBN，0.6g，3.6mmol)。 将所得溶液加热至回流过夜。随后将反应冷却至室温。将褐色溶液以H2O和盐水依次洗 涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物从己烷中结晶以得到呈 浅黄色固体状的产物(27g，87％)。
的合成
在0℃下向EtONa(14.5g，203mmol)于EtOH(400mL)中的溶液中添加乙酰胺 基丙二酸二乙酯(39g，180mmol)，接着添加上述溴化物(27g，119mmol)于EtOH (100mL)中的溶液。将所得混合物加热至回流历时1小时且以柠檬酸(30g)中止且 用H2O(300mL)稀释。在真空中移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机 层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速 色谱(硅石，10∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色固体状的产物(37g，88％)。
的合成
在0℃下向酮(5g，13.8mmol)于乙醚(100mL)中的溶液中添加Br2(0.8mL， 15.6mmol)。在室温下搅拌混合物3小时且随后以NaHCO3饱和水溶液中止。以Et2O萃 取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空 中浓缩以得到呈黄色固体状的产物(5.4g，88％)，其无需进一步纯化即可直接用于下个 步骤中。
的合成
向α-溴酮(5.4g，12.2mmol)和Na2CO3(2.0g，18.9mmol)于DMSO(20mL) 中的溶液中添加KI(2.1g，13.2mmol)。在90℃在氮气氛下搅拌混合物28小时。随后 将反应以H2O中止且以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，6∶1-1∶10己烷∶EtOAc) 纯化残余物以得到呈固体状的产物(1.12g，24％)。
的合成
将二酮(1.12g，3.0mmol)于浓HCl(10mL)和二噁烷(10mL)中的溶液加热 至回流过夜。在真空中移除溶剂后，添加MeOH(3mL)以溶解残余物。随后添加乙醚 (300mL)以沉淀呈浅黄色固体状的产物(302mg，42％)。
实例12
这个实例详述图27中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向C3H7MgCl(2M，50mmol)于乙醚(25mL)中的溶液中添加于乙醚(50 mL)中的苯甲醛(5mL，42.5mmol)。在0℃下搅拌所得溶液30分钟。随后将反应以 NH4Cl饱和溶液中止且以乙醚稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无 水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到粗产物(7.2g)，其无需纯化即可直接用于 下个反应中。
的合成
在0℃下向上述醇(7.2g，43.9mmol)和吡啶(7mL，86.7mmol)于CH2Cl2(300 mL)中的溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(19.2g，45.3mmol)。将所得混合物搅拌过夜且 以Na2S2O3饱和水溶液和NaHCO3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O和盐水依 次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，8∶1-4∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的产物(6.28g，对于两个步骤为91％)。
的合成
在90℃下向上述酮(4.43g，27.3mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS，5.5g，30.9 mmol)于苯(150mL)中的溶液中添加2，2′-偶氮双异丁腈(AIBN，0.2g，1.2mmol)。 将所得溶液加热至回流过夜且随后冷却至室温。将褐色溶液以H2O和盐水依次洗涤，随 后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物从己烷中结晶以得到呈白色固 体状的产物(6.21g，95％)。
的合成
在0℃下向EtONa(2.5g，34.9mmol)于EtOH(200mL)中的溶液中添加乙酰胺 基丙二酸二乙酯(6.7g，30.9mmol)，接着添加上述溴化物(6.2g，25.8mmol)于EtOH (100mL)中的溶液。将所得混合物加热至回流历时1小时且随后以柠檬酸(9g)中 止且以H2O稀释。移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机层以H2O和盐水 依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，4∶1-2∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅黄色固体状的产物(8.92g，92％)。
的合成
向上述酮(1.4g，3.71mmol)于HOAc(50mL)中的溶液中添加Br2(0.7mL，13.6 mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜且随后以NaHCO3饱和水溶液中止。以Et2O萃取混 合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，5∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈黄色固体状的产物 (1.23g，73％)。
的合成
向α-溴酮(1.12g，2.46mmol)和Na2CO3(0.4g，3.77mmol)于DMSO(30mL) 中的溶液中添加KI(0.45g，13.2mmol)。将混合物在90℃下搅拌过夜且随后以柠檬酸 (2g)和H2O(200mL)中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗 涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，6∶1-1∶10己 烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈油状的α-羟基酮(0.62g，64％)。
在0℃下向上述醇(0.62g，1.58mmol)和吡啶(0.5mL，6.19mmol)于CH2Cl(100 mL)中的溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.9g，2.12mmol)。将所得混合物搅拌过夜且 随后以Na2S2O3饱和水溶液和NaHCO3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O和盐 水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石， 9∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈黄色油状的产物(287mg，对于两个步骤为 30％)。
的合成
将上述二酮(272mg，0.7mmol)于浓HCl(10mL)和二噁烷(10mL)中的混合 物加热至回流过夜。在真空中移除溶剂后，添加MeOH(1mL)以溶解残余物。随后添 加乙醚(200mL)以沉淀呈黄色固体状的产物(162mg，81％)。
实例13
这个实例详述图28中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。这些化合物是如图28中所 示来合成。
实例14
这个实例详述经修饰多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。使用包括正交tRNA (O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻译系统表达含有非天然 氨基酸的多肽。O-RS优先以非天然氨基酸氨酰基化O-tRNA。接下来，翻译系统将非天 然氨基酸插入多肽中，以回应编码选择密码子。氨基酸和适用于并入非天然氨基酸的 O-tRNA和O-RS的聚核苷酸序列描述于标题为“In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids”的美国专利申请案第10/126,927号以及标题为“Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs”的美国专利申请案第 10/126,931中，这些文献是以引用的方式并入本文中。也可使用以下O-RS和O-tRNA 序列：
SEQ ID NO：1 詹氏甲烷球菌mtRNACUA Tyr tRNA SEQ ID NO：2 HLAD03；优化的琥珀抑制tRNA tRNA SEQ ID NO：3 HL325A；优化的AGGA移码抑制 tRNA tRNA SEQ ID NO：4 用于并入对叠氮基-L-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(6) RS SEQ ID NO：5 用于并入对苯甲酰基-L-苯丙氨酸 的氨酰基tRNA合成酶 p-BpaRS(1) RS SEQ ID NO：6 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：7 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：8 用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS SEQ ID NO：9 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(1) RS SEQ ID NO：10 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(3) RS SEQ ID NO：11 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(4) RS SEQ ID NO：12 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(2) RS SEQ ID NO：13 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 RS
氨酰基tRNA合成酶 (LW1) SEQ ID NO：14 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (LW5) RS SEQ ID NO：15 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (LW6) RS SEQ ID NO：16 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (AzPheRS-5) RS SEQ ID NO：17 用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的 氨酰基tRNA合成酶 (AzPheRS-6) RS
以含有经修饰基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然氨基酸具有 特异性)的质粒转化大肠杆菌容许将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中。在37℃下在 含有介于0.01mM-100mM之间的特定非天然氨基酸的培养基中生长的经转化的大肠杆 菌以高度的保真性和效率表达经修饰的多肽。经His标记的含有非天然氨基酸的多肽是 由大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体形式产生。这些聚集体在变性条件下在6M盐酸 胍中溶解且经亲和纯化。在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)N- 十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)中在4℃下通过透析进行再折叠过夜。随后将所述物质以 20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2透析，接着移除His-标签。参 见Boissel等人，J.Biol.Chem.，(1993)268：15983-93。用于纯化多肽的方法在所属领域中 为熟知的且由SDS-PAGE、西方墨点分析或电喷雾电离离子阱质谱以及其类似方法确认。
实例15：测试非天然氨基酸
此实例提供对某些说明性非天然氨基酸进行的四次测试的结果，以有助于预测其并 入非天然氨基酸多肽中的性质。
实例16：测试非天然氨基酸
此实例提供对某些说明性非天然氨基酸进行的pH值稳定性测试的结果，以有助于 预测其并入非天然氨基酸多肽中的性质。
实例17
这个实例详述图29中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向氨基酸pAF(10g，41.1mmol)于H2O-二噁烷(300mL，1∶1)中的溶液中添加 NaHCO3(12g，142.9mmol)和Boc2O(12g，55.0mmol)。将混合物在室温下搅拌7 小时且随后以柠檬酸中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤， 随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到呈白色固体状的N-Boc-pAF(13.7g，定量)。
的合成
在0℃下向NaOH(40mL，25体积％)中添加乙醚(60mL)。将防爆屏蔽物置于 反应烧瓶前面。经3分钟分3份向所得混合物中添加N-亚硝基-N-甲基脲(6.0g，57.9 mmol)。在0℃下搅拌反应10分钟。随后使乙醚层与氢氧化钠层分离。经5分钟将有机 层逐份(约6次添加)添加到N-Boc-pAF(5.0g，16.2mmol)于无水THF(20mL)中 的溶液中直至起始物质完全消失(由TLC监测)。随后添加5滴冰乙酸以中止反应。通 过旋转蒸发移除有机溶剂之后，添加乙酸乙酯。将有机层以NaHCO3饱和溶液、H2O和 盐水依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且浓缩以产生白色粉末(4.1g，80％)。
的合成
向t-BuOK(60mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(3.82g，11.9mmol) 于新蒸馏的丙酸甲酯(20mL，208mmol)中的溶液。在室温下搅拌所得混合物30分钟 且以柠檬酸溶液(10％，300mL)中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐 水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，4∶1-1∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的产物(3.89g，87％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.12g，2.97mmol)于二噁烷(4mL)中的溶液中添加LiOH (4mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌3小时且以柠檬酸水溶液(5％，200mL)中止且 以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且浓缩以得到白色固体(1.02g，94％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.0g，2.75mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(10mL)。将混合物在0℃下搅拌2小时且随后浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)， 接着添加HCl(1.5mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固 体状的产物(701mg，96％)。
实例18
这个实例详述图30中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.09g，3.4mmol) 于二氟乙酸甲酯(6mL，68.7mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌30分钟且 以柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以 H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石， 20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅褐色固体状的产物(1.27g，94％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.26g，3.17mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)中止且 以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到褐色油(1.19g，98％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.19g，3.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物搅拌0.5小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)，接着添 加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体状的产 物(0.82mg，82％)。
实例19
这个实例详述图12a中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12a中所述制备。
实例20
这个实例详述图12b中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12b中所述制备。
实例21
这个实例详述图12c中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12c中所述制备。
实例22
这个实例详述图12d中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图12d中所述制备。
实例23
这个实例详述图13中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 13中所述制备。
实例24
这个实例详述图14中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 14中所述制备。
实例25
这个实例详述图15中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如图 15中所述制备。
实例26
这个实例详述图16a中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图16a中所述制备。
实例27
这个实例详述图16b中呈示的含羟胺的PEG试剂的合成。含羟胺的PEG试剂是如 图16b中所述制备。
实例28
这个实例详述图18中呈示的含羟胺的连接子试剂的合成。含羟胺的连接子试剂是 如图18中所述制备。
实例29
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(1)的合成。在氮气压 力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加对甲苯基二硫化物(5.0g，20.3 mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(8.6g，48.4mmol)和60mL无水苯。将溶液加热至95℃。 以一份添加偶氮双异丁腈(.106g，.64mmol)。将反应回流16小时。通过旋转蒸发移除 溶剂且将褐色固体溶解于100mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、去 离子水(1×50mL)和盐水(1×50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫 酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色 谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的1，2- 双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(2.1g，25％)。获得1H NMR光谱数据和质谱。重复反应以 得到(2.0g，23％)的产物。
实例30
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基丙二酸酯)苯基二硫烷(2) 的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加乙酰胺基丙二酸二 乙酯(6.48g，30mmol)和50mL无水EtOH。以一份向溶液中添加乙氧化钠(2.6g， 38mmol)。将反应冷却到0℃。将1，2-双(4-(溴甲基)苯基)二硫烷(4.1g，10.1mmol)溶 解于20mL 1∶1EtOH/THF中且通过加料漏斗经1小时的过程添加到冷溶液中。移除冰浴 且在室温下搅拌反应6小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将红色固体溶解于100mL乙酸 乙酯中。以5％柠檬酸溶液(2×50mL)、去离子水(1×50mL)和盐水(1×50mL)依次 洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用 Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量 溶剂(真空泵)后，得到呈黄色固体状的1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基丙二酸酯)苯基二 硫烷(5.0g，73％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例31
这个实例详述图36中呈示的1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(3)的合成。在 氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加1，2-双(4-二乙基-2-乙酰胺基 丙二酸酯基)苯基二硫烷(1.0g，1.4mmol)、HCl(8mL，12M)和8mL 1，4-二噁烷。 在回流下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发和真空泵移除溶剂以得到呈透明油状的粗1，2- 双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.75g，135％)。获得1H NMR光谱数据和质谱。
实例32
这个实例详述图36中呈示的N，N′-二叔丁氧羰基-1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫 烷(4)的合成。向于干燥圆底烧瓶中的1，2-双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.75g， 1.9mmol)中添加5mL 1，4-二噁烷、5mL去离子水、二碳酸二叔丁酯(.65g，3.0mmol) 和碳酸氢钠(0.98g，12mmol)。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且 将透明油溶解于100mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(5mL×2)、去离子水(50mL) 和盐水(50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在 减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓 缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N，N′-二叔丁氧羰基-1，2- 双(4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.5g，从粗产物为44％，经2个步骤为52％)。获得 1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例33
这个实例详述图36中呈示的N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸(5)的合成。 在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N，N′-二叔丁氧羰基-1，2-双 (4-(2-氨基-3-丙酸)苯基二硫烷(0.5g，0.84mmol)、正丁基膦(0.6mL，2.44mmol) 和15mL无水THF。在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解 于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(2×25mL)、去离子水(25mL)和盐水(25mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸 (0.5g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例34
这个实例详述图36中呈示的2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸盐酸盐(6)的合成。向具 有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸(.5 g，1.6mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温下搅拌反应2小时。通过 旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随 后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的2-氨基-3-(4-巯基苯基)丙酸盐酸盐(0.39 g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例35
这个实例详述图37中呈示的2-(4-(2-氧代丙硫基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯 (7)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加(2)(1.1g， 1.6mmol)、n-Bu3P(1.2mL，4.8mmol)和25mL无水THF(25mL)。在室温下搅拌反 应2小时。向反应中添加氯丙酮(0.16mL，2.0mmol)和NaHCO3(0.98g，12mmol)。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100mL乙酸乙 酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL)依次 洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用 Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量 溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的2-(4-(2-氧代丙硫基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二 乙酯(0.62g，98％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例36
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(8)的合成。在 氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加7(0.62g，1.5mmol)、10mL 1，4-二噁烷和10mL 12M HCl。使反应回流且搅拌过夜。通过旋转蒸发移除溶剂以产生 3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.40g，99％粗产物)。
实例37
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸 (9)的合成。在氮气压力下向于具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中的8(0.35g， 1.3mmol)中添加二碳酸二叔丁酯(0.63g，3.0mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、 8mL 1，4-二噁烷和8mL去离子水。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂 且将透明油溶解于100mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(50mL×2)、去离子水(50mL) 和盐水(50mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在 减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓 缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2- 氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.30g，从粗产物为66％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC 迹线以及质谱。
实例38
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基 丙酸(10)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加9(150 mg，.4mmol)、8mL冰乙酸和2mL于水中的30％v/v过氧化氢。在室温下搅拌反应2 小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液 (25mL×2)、去离子水(25mL)和盐水(25mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分 离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱 系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到N- 叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.13g，86％粗产物)。获得 HPLC迹线和质谱。
实例39
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(11)的 合成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基亚 磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸10(0.13g，0.35mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙 酸。在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的 4.0M氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的 3-(4-(2-氧代丙基亚磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.072g，从粗产物为74％)。获得1H NMR 光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例40
这个实例详述图37中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙 酸(12)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加9(150mg， 0.4mmol)、8mL冰乙酸和2mL于水中的30％v/v过氧化氢。在室温下搅拌反应24小 时。通过旋转蒸发移除溶剂且将透明油溶解于50mL乙酸乙酯中。以5％柠檬酸溶液(25 mL×2)、去离子水(25mL)和盐水(25mL)依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经 无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的 硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除微量溶剂(真空泵)后，得到N-叔丁氧羰 基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(12)(0.13g，86％粗产物)。获得HPLC 迹线和质谱。
实例41
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(13)的合 成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙基磺酰 基)苯基)-2-氨基丙酸12(0.13g，0.35mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M 氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2- 氧代丙基磺酰基)苯基)-2-氨基丙酸(0.067g，从粗产物为65％)。获得1H NMR光谱数 据、HPLC迹线以及质谱。
实例42
这个实例详述图37中呈示的3-(4-(2-氧代丙硫基)苯基)-2-氨基丙酸(14)的合成。 向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丙硫基)苯 基)-2-氨基丙酸9(0.10g，.28mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温 下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。 简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2-氧代丙硫 基)苯基)-2-氨基丙酸(0.062g，从粗产物为85％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线 以及质谱。
实例43
这个实例详述图38中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙 酸(15)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加5(0.15g， 0.76mmol)、2-氯环戊酮(0.12mL，1.25mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、15mL 无水THF。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100 mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫基) 苯基)-2-氨基丙酸(0.15g，51％)。获得HPLC迹线和质谱。
实例44
这个实例详述图38中呈示的3-(4-(2-氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙酸(16)的合 成。向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代环戊基硫 基)苯基)-2-氨基丙酸15(0.15g，0.39mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。 在室温下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M 氯化氢。简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2- 氧代环戊基硫基)苯基)-2-氨基丙酸(0.108g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC 迹线以及质谱。
实例45
这个实例详述图38中呈示的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2-氨基丙酸 (18)的合成。在氮气压力下向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加5(0.15g， 0.76mmol)、1-溴-2-丁酮(0.12mL，1.25mmol)、碳酸氢钠(0.98g，12mmol)、15mL 无水THF。在室温下搅拌反应16小时。通过旋转蒸发移除溶剂且将白色固体溶解于100 mL乙酸乙酯中。以碳酸氢钠饱和水溶液(50mL×2)、去离子水(50mL)和盐水(50mL) 依次洗涤反应混合物。将有机层分离且经无水硫酸镁干燥、过滤且在减压下浓缩。通过 使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的硅石色谱纯化粗产物，在浓缩适当馏分且移除 微量溶剂(真空泵)后，得到呈白色固体状的N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2- 氨基丙酸(0.15g，51％)。获得HPLC迹线和质谱。
实例46
这个实例详述图38中呈示的化合物19-22的合成。化合物19-22是使用类似于关于 化合物10-14所述的方法来合成。
实例47
这个实例详述图38中呈示的3-(4-(2-氧代丁硫基)苯基)-2-氨基丙酸(23)的合成。 向具有搅拌棒的经烘箱干燥的圆底烧瓶中添加N-叔丁氧羰基-3-(4-(2-氧代丁硫基)苯 基)-2-氨基丙酸18(0.15g，.56mmol)、10mL无水二氯甲烷和3mL三氟乙酸。在室温 下搅拌反应2小时。通过旋转蒸发移除溶剂且添加1mL于1，4-二噁烷中的4.0M氯化氢。 简单旋动圆底烧瓶，随后添加100mL无水乙醚以沉淀呈白色固体状的3-(4-(2-氧代丁硫 基)苯基)-2-氨基丙酸(0.149g，100％)。获得1H NMR光谱数据、HPLC迹线以及质谱。
实例48
这个实例详述图39中呈示的化合物24-27的合成。化合物24-27是使用类似于关于 化合物10-14所述的方法来合成。
实例49
这个实例详述图31中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.0g，3.1mmol) 于三氟乙酸甲酯(5mL，50mmol)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌30分钟且以 柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以EtOAc稀释。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随 后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化 残余物以得到呈浅褐色固体状的产物(1.07g，83％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.0g，2.4mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。将混合物在0℃下搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)中止且 以H2O稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到褐色油(0.87g，98％)。
的合成
在0℃下向上述酸(1.0g，2.5mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将所得混合物搅拌0.5小时且在真空中浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)， 接着添加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体 状的产物(0.56g，75％)。
实例50
这个实例详述图32中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
向t-BuOK(15mL，1.0M，于THF中)中缓慢添加经保护的pAF(1.0g，3.1mmol) 于五氟丙酸甲酯(8mL，62mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌1小时且以 柠檬酸(5g，25.4mmol)中止且以H2O(100mL)稀释。移除大部分溶剂后，以EtOAc 萃取残余物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶2己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈浅褐色固体状的产物 (1.1g，76％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.0g，2.1mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加LiOH (30mL，1N)。在0℃下将所得混合物搅拌0.5小时且以柠檬酸(10g，51mmol)以 及H2O中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4 干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1CH2Cl2∶MeOH，0.5％HOAc)纯 化残余物以得到呈黄色固体状的产物(0.8g，84％)。
的合成
在0℃下向上述酸(0.7g，2.5mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物在相同温度下搅拌0.5小时且浓缩。向残余物中添加MeOH(2mL)， 接着添加HCl(2mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色固体 状的产物(0.62g，70％)。
实例51
这个实例详述图33中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向醇1(2.35g，7.6mmol)和吡啶(1.5mL，18.6mmol)于CH2Cl2(150mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(3.5g，8.3mmol)。将混合物在室温下搅拌过 夜且以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2稀释。将有机层 分离且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速 色谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的醛2(2.15g，92％)。 ESI-MS，m/z：292(M+-OH)，232，204，175，131，115(100)。
的合成
在0℃下向二异丙胺(0.33mL，2.33mmol)于THF(60mL)中的经搅拌溶液中添 加正丁基锂(1.46mL，2.34mmol)。在0℃下将混合物搅拌20分钟且冷却至-78℃且随 后添加环戊酮。在-78℃下将混合物搅拌20分钟后，添加醛2(0.5g，1.63mmol)于THF (20mL，以20mL洗涤)中的溶液。在-78℃下将所得混合物搅拌1.0小时且以NH4Cl 饱和水溶液中止。移除大部分溶剂后，以EtOAc萃取残余物。将有机层以H2O和盐水 洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，10∶1-1∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的3(482mg，80％)。
的合成
在0℃下向醇3(0.44g，1.13mmol)和吡啶(0.6mL，7.44mmol)于CH2Cl2(150 mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.6g，1.41mmol)。将混合物在室温下 搅拌过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2萃 取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-2∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的二酮4 (342mg，78％)。ESI-MS，m/z：412(M++Na)，356，312，230，212，184，146(100)。
的合成
在0℃下向甲酯4(330mg，0.85mmol)于二噁烷(4mL)中的溶液中添加LiOH (4mL，1N)。在0℃下将所得混合物搅拌30分钟且以柠檬酸水溶液(5％，100mL) 中止。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到白色固体(310mg，97％)。ESI-MS，m/z：342，330(M+-COOH)，298， 230，185，119(100)。
的合成
在0℃下向酸5(310mg，0.83mmol)于CH2Cl2(4mL)中的溶液中添加三氟乙酸 (4mL)。将混合物在0℃下搅拌30分钟且在真空中浓缩。向残余物中添加MeOH(1 mL)，接着添加HCl(1mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(100mL)以沉淀呈白 色固体状的产物(241mg，94％)。ESI-MS，m/z：298(M++Na)，276(M++1)，230(M+- COOH)，184，119(100)。
实例52
这个实例详述图34中呈示的含二羰基的氨基酸的合成。
的合成
在0℃下向醇(6.0g，19.4mmol)和吡啶(12mL，150mmol)于CH2Cl2(400mL) 中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(14.2g，33.4mmol)。将混合物在室温下搅拌 过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL)中止且以CH2Cl2萃取。 将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，1∶100-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的醛(5.48 g，92％)。
的合成
向上述醛(3.41g，11.1mmol)于丙酮(70mL)中的溶液中添加于H2O(10mL) 中的KMnO4(2.5g，15.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。移除大部分溶剂后， 将残余物溶解于柠檬酸水溶液(5％，300mL)中且以EtOAc萃取。将有机层组合且以 H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到呈白色固体状 的产物(2.83g，79％)，其无需进一步纯化即可直接用于下个步骤中。
的合成
在0℃下向上述酸(2.83g，8.76mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加1-氨基 -2-丙醇(1.4mL，17.9mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC， 4.1g，21.4mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt，2.2g，18.5mmol)和N，N-二异丙 基乙基胺(DIEA，9mL，51.6mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜且随后以柠檬酸水溶 液(5％，200mL)中止且以EtOAc萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经 无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，10∶1-1∶1己烷∶EtOAc) 纯化残余物得到呈白色泡沫状的产物(2.45g，74％)。
的合成
在0℃下向上述醇(2.44g，6.4mmol)和吡啶(4mL，49.6mmol)于CH2Cl2(100 mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(4.1g，9.7mmol)。将混合物在室温下搅 拌过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，300mL)中止且以CH2Cl2萃取。 将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快 速色谱(硅石，1∶1-1∶3己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色固体状的产物(1.84g，76％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(1.72g，4.6mmol)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH (10mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且以柠檬酸水溶液(5％)中止。以 EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩以得到呈固体状的产物(1.7g)，其无需纯化即可直接用于下个步骤中。
在0℃下向上述酸(1.7g，4.7mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(15mL)。将混合物在相同温度下搅拌2小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl (1.5mL，4N，于二噁烷中)，接着添加乙醚(400mL)。收集呈白色固体状的沉淀产 物(1.52g，对于2个步骤为90％)。
实例53
这个实例详述图44中呈示的含酰肼的氨基酸的合成。
的合成
向醛(410mg，1.34mmol)于EtOH(15mL)中的溶液中添加甲酸酰肼(170mg， 2.83mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。移除大部分溶剂后，以CH2Cl2萃取残 余物。将有机层组合且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，1∶6-1∶1己烷∶EtOAc)纯化 残余物得到白色固体(390mg，83％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(349mg，1mmol)于二噁烷(7mL)中的溶液中添加LiOH (7mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌10分钟且以柠檬酸(2.5g)中止且以H2O 萃取。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩以得到白色固体(290mg，87％)。
的合成
在0℃下向上述酸(290mg，0.87mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(20mL)。将混合物搅拌20分钟且浓缩。向残余物中添加MeOH(1mL)，接着添 加HCl(1.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉淀呈浅黄色固体状 的产物(195mg，83％)。
实例54
这个实例详述图45中呈示的含酰肼的氨基酸的合成。
的合成
向N-叔丁氧羰基-4-羟基甲基苯丙氨酸(11.73g，39.8mmol)于DMF(100mL)中 的溶液中添加丙氨酸甲酯盐酸盐(9.0g，64.5mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳化 二亚胺盐酸盐(EDC，15.4g，80.3mmol)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA，30mL，172mmol) 和1-羟基苯并唑水合物(HOBt，8.4g，70.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜 且随后以EtOAc稀释。将有机层分离且以H2O、柠檬酸(5％)、H2O、NaHCO3、H2O 和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到呈白色固体状的经保护 二肽(13.74g，91％)。
的合成
在0℃下向上述经保护二肽(10.33g，27.2mmol)于CH2Cl2(300mL)中的溶液 中添加吡啶(8mL，99.1mmol)和戴斯-马丁过碘烷(14g，33.0mmol)。将反应混合 物搅拌过夜且随后以NaHCO3/Na2S2O3饱和水溶液(1∶1)中止。将有机层以H2O、柠檬 酸、H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。通过快速色谱(硅 石，9∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物以得到呈白色固体状的产物(10.12g，98％)。
的合成
向二肽醛(10.1g，26.7mmol)于EtOH(200mL)中的溶液中添加乙酸酰肼(3.7g， 45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟且浓缩。向残余物中添加H2O(1L)和 CH2Cl2(500mL)。将有机层分离且浓缩以得到白色固体(11.21g，97％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(11.1g，25.6mmol)于二噁烷(50mL)中的溶液中添加LiOH (50mL，1N)。将混合物在相同温度下搅拌30分钟且随后以柠檬酸(20g)中止且以 H2O(200mL)稀释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后 经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩以得到白色固体(9.52g，88％)。
的合成
在0℃下向上述酸(9.5g，22.6mmol)于CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加三氟乙 酸(50mL)。将混合物在0℃下搅拌1小时且在真空中浓缩。向残余物中添加HCl(7mL， 4N，于二噁烷中)，接着添加乙醚(500mL)。收集呈白色固体状的沉淀物(7.25g，90％)。
实例55
这个实例详述图46A中呈示的含肟的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量羟胺盐酸盐。将反应混合物在室 温下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有机层 分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生呈固 体状的产物(96％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。在0℃下将反应混合物搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(87％)。
实例56
这个实例详述图46B中呈示的含肟的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量甲氧基胺盐酸盐。将反应混合物 在室温下搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有 机层分离且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生 呈固体状的产物(93％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(89％)。
实例57
这个实例详述图46C中呈示的含肼的氨基酸的合成。
的合成
向醛(3.0g)于MeOH/H+中的溶液中添加2当量甲基肼。将反应混合物在室温下 搅拌2小时且浓缩。向残余物中添加H2O(200mL)，接着添加CH2Cl2。将有机层分离 且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，3∶7-1∶9己烷∶EtOAc)纯化残余物产生呈固体状 的产物(93％)。
的合成
在0℃下向上述甲酯(3.0g)于二噁烷(10mL)中的溶液中添加LiOH(10mL，1 N)。将混合物在相同温度下搅拌3小时且随后通过添加柠檬酸(5g)中止且以H2O稀 释。以EtOAc萃取混合物。将有机层以H2O和盐水依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且浓缩以得到固体。随后，在0℃下向所得酸于CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加 三氟乙酸(20mL)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加MeOH (1mL)，接着添加HCl(2.0mL，4N，于二噁烷中)。随后添加乙醚(200mL)以沉 淀呈固体状的产物(89％)。
实例58
这个实例详述图48A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。将混合物在室温下搅拌15小时。添加乙醚 (200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0 g，100％)。
的合成
向3-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(1.75g，10mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(3.2g，20mmol)、三苯基膦(2.0g，15mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，2.0mL，10.5mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜且浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(100mL)、H2O (100mL)和盐水(100mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。通过快速色谱(硅石，100∶1-10∶1己烷∶EtOAc)纯化粗产物以得到呈白色固体状的 标题化合物(2.6g，81％)。
的合成
向经叔丁氧羰基保护的连接子(2.0g，9.1mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl (4N，于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(1.1g，85％)。
的合成
向mPEG(30K)对硝基苯酚碳酸酯(1.0g，0.033mmol)和胺连接子(53mg，0.21 mmol)于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的的混合物中添加二异丙基乙基胺(50μL，0.28 mmol)和DMAP(5mg，0.041mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(0.83g， 83％)。
的合成
向mPEG邻苯二甲酰亚胺(30K，0.8g，0.0266mmol)于MeOH(5mL)中的溶液 中添加肼(8.5μL，0.27mmol)。在45℃下搅拌所得混合物1.0小时。在反应冷却至室 温后，添加CH2Cl2(150mL)且以HCl水溶液(0.1N，100mL)洗涤溶液。以CH2Cl2 (150mL)萃取水层。将有机层组合且以H2O(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈 白色粉末状的羟胺产物(0.72g，90％)。
实例59
这个实例详述图48B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向2-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(2.8mL，18mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5.8g，36mmol)、三苯基膦(3.6g，27mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，3.6mL，19mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜并浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、 H2O(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空中 浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的快速色谱纯化粗产物以得到呈白色 固体状的含有杂质的标题化合物(12g，206％)。
的合成
向粗的经叔丁氧羰基保护的连接子(12g)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl(4N， 于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空 中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(3.0g，对于两个步骤为68％)。
的合成
向mPEG(30K)对硝基苯酚碳酸酯(1.0g，0.033mmol)和胺连接子(50mg，0.21 mmol)于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(50μL，0.28 mmol)和4-二甲基氨基吡啶(4mg，0.033mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状 的产物(0.81g，81％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.8g，0.0266mmol)于MeOH(5mL)中的溶液 中添加肼(8.5μL，0.27mmol)。在45℃下搅拌所得混合物1.0小时。在反应冷却至室 温后，添加CH2Cl2(150mL)且以HCl水溶液(0.1N，100mL)洗涤溶液。以CH2Cl2 (150mL)萃取水层。将有机层组合且以H2O(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈 白色粉末状的羟胺产物(0.68g，85％)。
实例60
这个实例详述图49A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(4.0g，15.0mmol)于DMF(50mL)中 的溶液中添加K2CO3(10g，73mmol)和N-羟基氨基甲酸叔丁酯(2.5g，18.8mmol)。 在室温下搅拌反应混合物3小时。将混合物以H2O稀释(200mL)且以EtOAc(200mL) 萃取。将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈无色油状的产物(3.5g， 72％)。
的合成
向上述邻苯二甲酰亚胺(500mg，1.6mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加肼 (0.25mL，8.0mmol)。在室温下搅拌所得混合物3小时。移除沉淀物后，浓缩滤液。 将残余物留在高真空中过夜。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1EtOAc∶MeOH)纯化残余物 得到呈白色固体状的胺连接子(252mg，85％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色固体状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于无水CH2Cl2(30mL)中的溶液中添 加二异丙基乙基胺(88μL，0.5mmol)和胺连接子(76mg，0.4mmol)。在室温下搅拌 所得混合物15小时。添加乙醚(700mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗 涤且在真空中干燥以得到白色粉末(2.8g，93％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于无水CH2Cl2 (10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加 乙醚(500mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白 色粉末(1.8g，90％)。
实例61
这个实例详述图49B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向N-羟基氨基甲酸叔丁酯(5.0g，37.6mmol)于DMF(30mL)中的溶 液中添加K2CO3(12g，87.6mmol)和N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺(10.0g，39.7mmol)。 在室温下搅拌反应混合物3小时。将混合物以H2O稀释(200mL)且以EtOAc(200mL) 萃取。将有机层以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。 通过快速色谱(硅石，20∶1-1∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈白色固体状的产物(5.2 g，55％)。
的合成
向上述邻苯二甲酰亚胺(500mg，1.6mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加肼 (0.25mL，8.0mmol)。在室温下搅拌所得混合物3小时。移除沉淀物之后，浓缩滤液。 将残余物留在高真空中过夜。通过快速色谱(硅石，3∶1-1∶1EtOAc∶MeOH)纯化残余物 得到呈白色固体状的胺连接子(301mg，86％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(4mg，0.033mmol)和 上述胺连接子(64mg，0.31mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。添加乙醚(200 mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(0.85 g，85％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.85g，0.028mmol)于无水CH2Cl2 (10mL)中的溶液中添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加 乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白 色粉末(0.68g，80％)。
实例62
这个实例详述图50A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向单叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(2.1g，6.9mmol)于吡啶(50mL)中的 溶液中添加Boc2O(3.3g，15.1mmol)。将所得混合物加热至60℃过夜。在真空中移除 溶剂后，将残余物以EtOAc(200mL)稀释且以柠檬酸(5％，200mL)、水(200mL) 和盐水(200mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色 谱(硅石，20∶1-3∶1己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈黄色油状的产物(2.37g，85％)。
的合成
在0℃下向二叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.21g，2.98mmol)于MeOH(15mL) 中的溶液中添加于MeOH中的氨(15mL，7N，105mmol)。在室温下搅拌所得混合物 过夜。滤出沉淀物且在真空中浓缩滤液。通过快速色谱(硅石，10∶1-6∶4EtOAc∶MeOH) 纯化残余物得到呈白色固体状的胺连接子(0.61g，74％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)以沉淀mPEG(30K)产物。将产物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥(1.0g，100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(5mg，0.041mmol)和 上述二叔丁氧羰基胺连接子(90mg，0.33mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(0.82g，82％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.82g，0.027mmol)于无水CH2Cl2 (8mL)中的溶液中添加三氟乙酸(8mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加乙 醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.57g，70％)。
实例63
这个实例详述图50B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向单叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.5g，4.7mmol)于吡啶中的溶液中添 加Boc2O(2.2g，10.0mmol)。将所得混合物加热至60℃过夜。在真空中移除溶剂后， 将残余物以EtOAc(200mL)稀释且以柠檬酸(5％，200mL)、水(200mL)和盐水(200 mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。通过快速色谱(硅石，20∶1-3∶1 己烷∶EtOAc)纯化残余物得到呈油状的产物(1.6g，81％)。
的合成
在0℃下向二叔丁氧羰基邻苯二甲酰亚胺(1.5g，3.6mmol)于MeOH(15mL)中 的溶液中添加于MeOH中的氨(15mL，7N，105mmol)。在室温下搅拌所得混合物过 夜。滤出沉淀物且在真空中浓缩滤液。通过快速色谱(硅石，10∶1-6∶4EtOAc∶MeOH) 纯化残余物得到呈白色固体状的胺连接子(0.85g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)-OH(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加 对硝基苯酚氯甲酸酯(60mg，0.28mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚(200 mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(1.0g， 100％)。
的合成
向上述活化mPEG(30K)(1.0g，0.033mmol)于无水CH2Cl2(10mL)中的溶液中 添加二异丙基乙基胺(58μL，0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(5mg，0.041mmol)和 上述二叔丁氧羰基胺连接子(100mg，0.34mmol)。在室温下搅拌所得混合物15小时。 添加乙醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(0.89g，89％)。
的合成
在0℃下向经叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.89g，0.030mmol)于无水CH2Cl2 (8mL)中的溶液中添加三氟乙酸(8mL)。在室温下搅拌所得混合物5小时。添加乙 醚(200mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.65g，73％)。
实例64
这个实例详述图51A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，86％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例65
这个实例详述图51B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以水和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。将 沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，85％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例66
这个实例详述图52A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。在室温下搅拌混合物10小 时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。在室温下搅拌所得混合物3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液中 添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、 过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将 沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(73mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.43g，86％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.42g，0.014mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，83％)。
实例67
这个实例详述图52B中呈示的mPEG4-羟胺的合成。
的合成
向mPEG丙醛(30K，0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于 MeOH(10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得 混合物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例68
这个实例详述图53A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2(500 mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在 真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例69
这个实例详述图53B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10 小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(70mg，0.25mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(20mg，0.30mmol)。在室温下搅拌所得混合 物48小时。移除大部分溶剂后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到白色粉末(0.40g，80％)。
的合成
在0℃下向经二叔丁氧羰基保护的mPEG(30K)(0.40g，0.013mmol)于无水CH2Cl2 (4mL)中的溶液中添加三氟乙酸(4mL)。在室温下搅拌所得混合物8小时。添加乙 醚(100mL)至反应混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色 粉末(0.35g，87％)。
实例70
这个实例详述图54A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例71
这个实例详述图54B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合 物中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例72
这个实例详述图55中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC，190mg，1.0mmol) 和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以EtOAc (500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O(300mL)和 盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物 溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真 空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.42 g，84％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合 物中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，85％)。
实例73
这个实例详述图56A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)丙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例74
这个实例详述图56B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)(6.0g，0.2mmol)和吡啶(0.1mL，1.2mmol)于CH2Cl2 (60mL)中的经搅拌溶液中添加戴斯-马丁过碘烷(0.2g，0.47mmol)。在室温下搅拌 混合物过夜。随后将反应以Na2S2O3-NaHCO3饱和水溶液(1∶1，100mL)中止且以CH2Cl2 (500mL×2)萃取。将有机层组合且以H2O和盐水洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过 滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(1L)至溶液中。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(4.9g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例75
这个实例详述图57中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(6.0g，0.2mmol)于DMF(60mL)中的溶液中添加Boc-Ser-OH (205mg，1.0mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，190mg， 1.0mmol)和N，N′-二异丙基乙基胺(0.17mL，1.0mmol)。将混合物在室温下搅拌10 小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O (300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓 缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。将沉淀物过滤、以乙 醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(5.1g，82％)。
的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的溶液中添 加三氟乙酸(15mL)。在室温下搅拌所得混合物3小时且浓缩。向残余物中添加CH2Cl2 (5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL)以沉淀呈白 色固体状的二羟胺(2.6g，85％)。
的合成
向上述mPEG(30K)(2.0g，0.067mmol)于H2O-CH3CN(1∶1，20mL)中的溶液 中添加NaIO4(15mg，0.07mmol)。将混合物在室温下搅拌4.0小时且以CH2Cl2(500mL) 稀释。将所得混合物以H2O(100mL)和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干 燥、过滤且在真空中浓缩。将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中。添加乙醚(700mL)。 将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到白色粉末(1.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)乙醛(0.5g，0.0166mmol)和胺连接子(40mg，0.16mmol)于MeOH (10mL)中的混合物中添加NaCNBH3(12mg，0.17mmol)。在室温下搅拌所得混合 物60小时。移除大部分溶剂后，将残余物溶解于CH2Cl2(200mL)中且以柠檬酸(5％， 100mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩以得到白色固体(0.41 g，82％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(0.4g，0.013mmol)于MeOH(4mL)中的混合物 中添加H2NNH2(4.2μL，0.13mmol)。将混合物在45℃下搅拌1.0小时且浓缩。将残余 物溶解于CH2Cl2(100mL)中且以HCl(0.1N，100mL)洗涤。以CH2Cl2(100mL) 萃取水层。将有机层组合且以H2O洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤且浓缩。将残 余物溶解于CH2Cl2(5mL)中。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的羟胺产物 (0.34g，83％)。
实例76
这个实例详述图58A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
mPEG(5K)-OMs的合成
向mPEG(5K)-OH(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(40mL)中的溶液中添加三乙胺(110 μL，0.79mmol)和MsCl(50μL，0.64mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且浓缩。 粗产物(1.0g)无需纯化即可直接用于下个步骤中。
mPEG(5K)-O-NHBoc的合成
向粗mPEG(5K)-OMs(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加叔丁 基-N-羟基氨基甲酸酯(0.3g，2.2mmol)和三乙胺(0.4mL，2.9mmol)。将所得混合 物在45℃下搅拌10小时且冷却至室温。添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色固体状的产物(0.42，42％)。
mPEG(5K)-O-NH 3 + Cl - 的合成
在℃下向mPEG(5K)-ONHBoc(0.2g，0.04mmol)于CH2Cl2(3mL)中的溶液中 添加三氟乙酸(7mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的PEG二羟胺衍生物(170mg，85％)。
实例77
这个实例详述图58B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
mPEG(30K)-OTf的合成
向mPEG(30K)-OH(3.0g，0.1mmol)于CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加2，6-二 甲基吡啶(60μL，0.5mmol)和Tf2O(65μL，0.4mmol)。在室温下搅拌混合物10小 时。添加乙醚(400mL)至混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得 到白色粉末(2.7g，90％)。
mPEG(30K)-O-NHBoc的合成
向mPEG(30K)-OTf(2.5g，0.083mmol)于CH2Cl2(25mL)中的溶液中添加N- 羟基氨基甲酸叔丁酯(110mg，0.84mmol)和二异丙基乙基胺(0.2mL，1,1mmol)。 在室温下搅拌混合物过夜。添加乙醚(200mL)以沉淀呈白色粉末状的产物(2.2g，88％)。
mPEG(30K)-O-NH 3 + Cl - 的合成
在0℃下向上述mPEG(30K)-ONHBoc(2.0g，0.067mmol)于CH2Cl2(15mL)中 的溶液中添加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的PEG二羟胺衍生物(1.72g，86％)。
实例78
这个实例详述图59A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向2-(2-羟基乙氧基)邻苯二甲酰亚胺(0.5g，2.4mmol)于CH2Cl2(20mL)中的溶 液中添加光气(20％(于甲苯中)，8.0mL，15.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10 小时且在真空中浓缩。残余物(0.45g，70％)无需纯化即可直接用于下个反应。
的合成
向mPEG(30K)-NH2(3g，0.1mmol)和氯甲酸酯连接子(0.27g，1.0mmol)于CH2Cl2 (30mL)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(0.2mL，1.1mmol)。将所得混合物在室 温下搅拌15小时。添加乙醚(500mL)至混合物中。将沉淀物过滤、洗涤且在真空中 干燥以得到呈白色固体状的产物(2.7g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(2.1g，0.07mmol)于MeOH(15mL)中的溶液中 添加氨(7N，于甲醇中，15mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余 物中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的产物(2.4g，89％)。
实例79
这个实例详述图59B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向(叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸(3.0g，16mmol)于CH2Cl2(80mL)中的溶液 中添加N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC，1.3mL，8mmol)。将混合物在室温下搅拌1 小时且在真空中浓缩。粗产物(4.9g，84％)无需进一步纯化即可直接用于下个步骤中。
的合成
向酐(7.3g，20mmol)于DMF(20mL)中的溶液中添加mPEG(5K)-NH2(20g， 4mmol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以H2O稀释(200mL)。以CH2Cl2(500mL) 萃取混合物。将有机层以H2O和盐水(100mL)洗涤，随后经无水Na2SO4干燥、过滤 且在真空中浓缩。向残余物中添加CH2Cl2(10mL)，接着添加乙醚(500mL)。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(19.8g，99％)。
的合成
向经叔丁氧羰基保护的mPEG(5K)(1.0g，0.2mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液 中添加三氟乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(2mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，0.1mL)和乙醚(40mL)。将沉淀 物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到产物(0.75g，75％)。
实例80
这个实例详述图60A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向mPEG(30K)-OH(4.5g，0.15mmol)于CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加光气(20％， 于甲苯中，1.6mL，3.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10小时且在真空中浓缩。 残余物(4.2g，93％)无需纯化即可直接用于下个反应中。
的合成
向上述活化mPEG(30K)II(4.2g，0.14mmol)和胺连接子VIII(67mg，0.28mmol) 于DMF-CH2Cl2(10mL，1∶2)中的混合物中添加二异丙基乙基胺(75μL，0.42mmol)。 在室温下搅拌所得混合物15小时后，添加乙醚(200mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤 且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的产物(3.8g，90％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺III(3.5g，0.12mmol)于MeOH(15mL)中的溶 液中添加氨(7N，于甲醇中，15mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向 残余物中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300 mL)以沉淀呈白色固体状的产物(3.0g，86％)。
的合成
向2-羟乙基氨基甲酸叔丁酯(2.8mL，18mmol)于THF(60mL)中的溶液中添加 N-羟基邻苯二甲酰亚胺(5.8g，36mmol)、三苯基膦(3.6g，27mmol)。将反应混合物 在室温下搅拌10分钟且随后冷却至0℃。经1小时通过注射器逐滴添加二异丙基偶氮二 甲酸酯(DIAD，3.6mL，19mmol)。移除冰浴且将混合物搅拌过夜并浓缩。将白色固 体溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将反应混合物以碳酸氢钠饱和水溶液(2×50mL)、去 离子水(50mL)和盐水(50mL)依次洗涤，随后经无水MgSO4干燥、过滤且在真空 中浓缩。通过使用Biotage Inc.HORIZONTM色谱系统的快速色谱纯化粗产物以得到呈白 色固体状的含有杂质的标题化合物(12g，206％)。
的合成
向粗的经叔丁氧羰基保护的连接子(12g)于CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加三氟 乙酸(5mL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时且浓缩。向残余物中添加HCl(4N， 于二噁烷中，1.5mL)，接着添加Et2O(150mL)。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空 中干燥以得到呈白色固体状的胺连接子(3.0g，对于两个步骤为68％)。
实例81
这个实例详述图60B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向mPEG(5K)-OH(10g，2.0mmol)、Ph3P(790mg，3.0mmol)和N-羟 基邻苯二甲酰亚胺(0.49g，3.0mmol)于CH2Cl2-THF(2∶3，45mL)中的溶液中添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，409μL，2.0mmol)。将混合物在室温下搅拌15小时后， 添加乙醚(1L)至混合物中。将沉淀物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色 粉末状的mPEG(5K)-邻苯二甲酰亚胺(9.8g，98％)。
的合成
向mPEG(5K)邻苯二甲酰亚胺(3g，0.6mmol)于MeOH(25mL)中的溶液中添 加氨(7N，于甲醇中，25mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的羟胺(2.5g，83％)。
的合成
在0℃下向mPEG(30K)-OH(6g，0.2mmol)、Ph3P(80mg，0.3mmol)和N-羟基 邻苯二甲酰亚胺(49mg，0.3mmol)于CH2Cl2-THF(2∶3，45mL)中的溶液中添加偶氮 二甲酸二异丙酯(DIAD，41μL，0.2mmol)。在室温下搅拌混合物15小时。添加乙醚 (200mL)至混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在真空中干燥以得到呈白色粉末状的 mPEG(30K)-邻苯二甲酰亚胺产物(5.8g，96％)。
的合成
向mPEG(30K)邻苯二甲酰亚胺(3g，0.1mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添 加氨(7N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物 中添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL) 以沉淀呈白色固体状的mPEG(30K)-ONH2(2.6g，87％)。
实例82
这个实例详述图61A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
向2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙胺(5.0g，33.8mmol)于DMF(100mL)中的溶 液中添加(叔丁氧羰基-氨基氧基)乙酸(14.2g，74.2mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC，28.5g，0.15mol)和N，N′-二异丙基乙基胺(26mL， 0.15mol)。将混合物在室温下搅拌10小时且以EtOAc(500mL)稀释。将所得混合物 以NaHCO3饱和水溶液(300mL)、H2O(300mL)和盐水(300mL)依次洗涤，随后 经无水Na2SO4干燥、过滤且在真空中浓缩。粗产物(14.2g，85％)无需纯化即可直接 用于下个反应中。
的合成
在0℃下向上述二叔丁氧羰基连接子(3.0g，6.1mmol)于CH2Cl2(15mL)中的 溶液中添加三氟乙酸(15mL)。将所得混合物在室温下搅拌3小时且浓缩。向残余物中 添加CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，2mL)。添加乙醚(400mL) 以沉淀呈白色固体状的二羟胺(1.47g，82％)。
实例83
这个实例详述图61B中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向三(乙二醇)(1.5g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(3.72g，82％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.2g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的三(乙二醇)二羟胺连接子(1.1g，87％)。
实例84
这个实例详述图61C中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向四(乙二醇)(1.94g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(3.58g，74％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.42g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的四(乙二醇)二羟胺连接子(1.27g，85％)。
实例85
这个实例详述图62A中呈示的mPEG-羟胺的合成。
的合成
在0℃下向六(乙二醇)(2.82g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加Ph3P (8.0g，30mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(4.9g，30mmol)。向混合物中缓慢添加 偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，4.08mL，20mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时 且在室温下搅拌2天。添加乙醚(25mL)至反应混合物中。将沉淀物以乙醚洗涤且在 真空中干燥以得到呈白色粉末状的二邻苯二甲酰亚胺产物(4.40g，77％)。
的合成
向二邻苯二甲酰亚胺(2.86g，5.0mmol)于MeOH(20mL)中的溶液中添加氨(7 N，于甲醇中，20mL)。将所得混合物在室温下搅拌15小时且浓缩。向残余物中添加 CH2Cl2(5mL)，接着添加HCl(4N，于二噁烷中，1mL)。添加乙醚(300mL)以沉 淀呈白色固体状的六(乙二醇)二羟胺连接子(1.68g，87％)。
实例86
这个实例详述图62B中呈示的mPEG化合物的合成。
的合成
向mPEG-OH(30K，3.0g，0.1mmol)于无水CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加双 光气(63μL，0.5mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。添加乙醚(700mL)以沉淀 mPEG。将产物过滤、以乙醚洗涤且在真空中干燥(3.0g，100％)。
以下实例描述测量和比较经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体外和活体内 活性与治疗活性天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性的方法。
实例87：细胞结合检定
在0℃下在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未经标记GH、hGH或GM-CSF 的情况下和在125I-GH(约100,000cpm或1ng)存在下将细胞(3×106)在PBS/1％BSA (100μl)中培养(两份)90分钟(总体积：120μl)。随后将细胞悬浮且在350μl塑胶 离心管中的200μl冰冷FCS上分层且离心(1000g；1分钟)。通过切断管的底部来收集 离心块且以γ计数器(Packard)对离心块和上清液分别计数。
以在不存在竞争者的情况下的总结合(双重复的平均值)减去存在100倍过量的未 经标记的GH的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)的形式来测定特异性结合(cpm)。 对所使用的细胞类型的每一者测量非特异性结合。实验是使用相同125I-GH制剂在隔开 的天数进行且应显示内部一致性。125I-GH证实与产生GH受体的细胞的结合。结合以剂 量依赖性方式受到未经标记的天然GH或hGH抑制，但不受GM-CSF或其他阴性对照 抑制。hGH竞争天然125I-GH(类似于天然GH)结合的能力暗示受体同样良好地识别两 种形式。
实例88：PEG化hGH的活体内研究
将PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液投与小鼠或大鼠。结果应展示由体重显 著增加指示的与未经修饰的hGH相比，本发明的PEG化hGH具有出众的活性和延长的 半衰期。
实例89：接合hGH和未接合hGH以及其变体的活体内半衰期的测量
所有动物实验是于AAALAC质量合格设备中且以由圣路易斯大学(St.Louis University)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee) 认可的方案进行。在室内以12小时灯光/黑暗的循环将大鼠个别圈养于笼中。使动物能 够随意接近合格的Purina啮齿动物食物5001和水。对于切除垂体的大鼠，饮用水额外 含有5％葡萄糖。
实例90：药物动力学研究
在进入动物实验之前通过三次检定来评估每一PEG化突变体hGH的品质。通过用 非还原性条件下的MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)电泳4％-12％丙烯 酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶检测PEG-hGH的纯度。将凝胶以考马斯亮蓝(Coomassie blue) 染色。根据密度测定扫描，PEG-hGH条带的纯度大于95％。通过使用来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2试剂盒的动力学LAL检定来测试每一PEG-hGH 中的内毒素含量，且每剂量小于5EU。以IM-9pSTAT5生物检定评估PEG-hGH的生物 活性，且证实EC50值小于15nM。
在获自Charles River Laboratories的雄性Sprague-Dawley大鼠(261g-425g)中彼 此比较经PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学性质且将其与非PEG化生长激素进 行比较。通过手术将导管安装于颈动脉中用于血液采集。在导管成功安装之后，在给药 之前将动物分配成治疗组(每组三只至六只)。以0.41-0.55ml/kg的给药体积向动物皮 下给药1mg/kg的化合物。在各个时间点通过留置导管采集血样且使其进入经EDTA涂 布的微离心管中。在离心后收集血浆，且储存在-80℃下直至分析。使用来自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗体 夹心生长激素ELISA试剂盒测量化合物浓度。使用对应于所给的类似物的标准来计算浓 度。使用模型程序WinNonlin(Pharsight，版本4.1)来估算药物动力学参数。使用具有 线性上/对数下梯形积分的非房室模型分析(Noncompartmental analysis)，且均一加权浓 度数据。
在于大鼠中单次皮下给药之后，以规则时间间隔获得血浆浓度。向大鼠(每组n＝ 3-6)给予每公斤蛋白质1mg的单一大丸药剂量。将hGH野生型蛋白(WHO hGH)、 His标记hGH多肽(his-hGH)或包括在六个不同位置的每一者处与30kDa PEG共价键 联的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的His标记hGH多肽与WHO hGH和(his)-hGH进 行比较。在规定时间间隔内采取血浆样本且按照所述检定其中的注射化合物。下表显示 单剂量投与各种hGH多肽的药物动力学参数值。由非房室模型分析(Pharsight，版本 4.1)来评估浓度对时间曲线。显示的值为平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；末 期t1/2：末期半衰期；AUC0-＞inf：外推至无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均 滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：在末期阶段期间的表观分布体积。与对照 hGH相比，观测到30KPEG-pAF92(his)hGH循环明显延长，血清半衰期增加且生物可 用性增加。
表：在正常雄性Sprague-Dawley大鼠中皮下投与单剂量的1mg/kg大丸药的药物 动力学参数值。
实例91：药效学研究
切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠是获自Charles River Laboratories。在3-4周龄 时通过手术移除垂体。使动物适应新环境3周的时期，在此期间监测体重。将在开始研 究之前经7天的时期体重增加0g-8g的动物放入和随机组合为治疗组。对大鼠投与大丸 药剂量或每日皮下给药。在整个研究中，每日且依次对大鼠称重、麻醉、放血且给药(适 当时)。使用肝素化毛细管从眶窦采集血液且置入经EDTA涂布的微离心管中。通过离 心分离血浆且储存在-80℃下直至分析。绘制平均(+/-S.D.)血浆浓度对时间间隔的曲 线。
肽IGF-1为生长调节素或类胰岛素生长因子的家族的成员。IGF-1介导生长激素的 许多促进生长的效应。使用针对提供的大鼠/小鼠IGF-1标准的竞争性结合酶免疫检定试 剂盒(Diagnosic Systems Laboratories)来测量IGF-1浓度。切除大鼠的垂体。对大鼠(每 组n＝5-7)皮下给予单次剂量或每日剂量。每日依次对动物称重、麻醉、放血且给药(适 当时)。获得安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)、His标记hGH((his)hGH)和包括在位 置35和92处与30kDa PEG共价键联的对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。观 测到对于30KPEG-pAF35(his)hGH化合物在第9天时的体重增加与 30KPEG-pAF92(his)hGH化合物在统计学上不同(p＜0.0005)，不同之处在于观测到更 大的体重增加。在投与单次剂量的包括经PEG化的非天然编码氨基酸的hGH多肽后， 通过使用双尾分布、未成对、相等方差的t-测试测定的对循环血浆IGF-1水平的效应具 有显著差异。
实例92：包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的安全性及/或功效的人类临床试验。
目的为比较经皮下投与的PEG化的包括非天然编码氨基酸的重组人类hGH与一种 或一种以上的市售hGH产品(包含(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM (Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM (Serono))的安全性和药物动力学。
患者研究中招收18个年龄在20岁-40岁范围内且体重介于60kg-90kg之间的健 康志愿者。受检者应不具有临床上显著异常的血液学或血清化学以及阴性尿液毒性筛 检、HIV筛检和肝炎B表面抗原实验值。其应不具有任何以下迹象：高血压；任何原发 性血液疾病史；重大肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖器疾病、代谢疾病、 神经病病史；贫血或癫痫病史；对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白 的已知敏感性；含咖啡因的饮料的习惯性以及重度消费者；在进入研究的30天内参与 任何其他临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内已接触过hGH；在进入研究 的7天内患病；以及在进入研究的14天内对研究前身体检查或临床实验室评估具有显 著异常。对所有受检者评估安全性且定时采集用于药物动力学分析的所有血液采集物。 经机构伦理委员会批准以及患者同意进行所有研究。
研究设计其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机、两 周期交叉研究。将18个受检者随机指派至两个治疗序列组中的一组中(每组9名受检 者)。使用相等剂量的包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH和所选市售产品在大腿上部 以快速皮下注射形式经两个单独给药时期投与GH。投与市售产品的剂量和频率是按照 包装标记中的说明。按照需要，使用市售产品的其他剂量、给药频率或其他参数可通过 包含其他受检者组而添加到研究中。每一给药时期由14天的清洗期隔开。对于两次给 药时期中的每一者，受检者在给药之前至少12小时和给药后72小时被限定在研究中心， 但在给药时期之间无需如此。如果存在其他剂量、频率或其他参数，那么也可添加额外 受检者组来测试PEG化hGH。经批准用于人类用途的多种GH配方可用于此研究中。 HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、 GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)为经批准用于人类用途的市售GH 产品。hGH的实验配方为包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH。
血液取样在投与hGH之前和之后通过直接静脉穿刺连续取血。在给药前约30分 钟、20分钟和10分钟(3个基线样本)且在给药后约以下时间：30分钟和1小时、2 小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小 时、60小时以及72小时获得用于测定血清GH浓度的静脉血样(5mL)。将每一血清样 本分为两个等分试样。将所有血清样本储存在-20℃下。血清样本在干冰上运输。在第1 天初始给药之前即刻、第4天早晨、第16天给药之前即刻以及第19天早晨进行禁食临 床实验测试(血液学、血清化学，以及验尿)。
生物分析方法使用ELISA试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]， Webster TX)测定血清GH浓度。
安全性测定在每一次给药(第1天和第16天)之前以及每一次给药后6小时、24 小时、48小时和72小时立即记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类 型以及临床实验测试自基线的变化。另外，评估生命体征测量结果(包含血压)和身体 检查结果中与研究前的变化。
数据分析通过由给药后值的每一者减去由平均化在给药前30分钟、20分钟和10 分钟时采集的三个样本的GH水平测定的平均基线GH浓度关于给药前基线GH浓度修 正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检定的定量水平，那么其不包含于 平均值的计算中。从关于基线GH浓度修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用 最近版本的BIOAVL软件于Digital Equipment Corporation VAX 8600电脑系统上通过不 依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰血清浓度 (Cmax)；到达峰血清浓度的时间(tmax)；由使用线性梯形规则计算的自时间零点到最后 血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下的面积(AUC)；以及由消除速率常数计算 的末端消除半衰期(t1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末端线性区域内通过连续数据点 的线性回归来估算消除速率常数。对于每一治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差 (SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保持配方/非保持配方)。
安全性结果在治疗组中不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测 试或血压相比无临床上显著变化，且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比无 显著变化。两个治疗组的安全性概况应看来相似。
药物动力学结果在所测量的每一时间点下，将接受单次剂量的一种或一种以上的 市售hGH产品(包含(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、 NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)) 后的所有18名受检者的平均血清GH浓度-时间概况(未关于基线GH含量修正)与包 括非天然编码氨基酸的PEG化hGH进行比较。所有受检者应具有在正常生理范围内的 给药前基线GH浓度。由关于给药前平均基线GH浓度修正的血清数据测定药物动力学 参数且测定Cmax和tmax。所选的临床比较物(HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM (Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)、Saizen/SerostimTM (Serono))的平均tmax比包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的tmax显著更短。与包 括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的末端半衰期相比，测试的市售hGH产品的末端半 哀期值显著更短。
尽管本发明的研究是在健康男性受检者中进行，但预期在其他患者群体(诸如患有 癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、小儿肾衰竭患者、自体预存程序中的患者，或预 定选择性手术的患者)中可具有类似的吸收特征和安全性概况。
总体来说，经皮下投与的单一剂量的包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH应为安 全的且健康男性受检者对其良好接受。根据不利事件的相对发生率，市售形式的hGH 和包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH的临床实验值、生命体征以及身体检查结果和 安全性概况应相当。包括非天然编码氨基酸的PEG化hGH潜在地对患者和健康护理提 供者提供大的临床效用。
实例93：PEG化hGH和非PEG化hGH的水溶性比较
通过测定可溶解于100μL水的各别多肽的量来获得hGH野生型蛋白(WHO hGH)、 His标记hGH多肽(his-hGH)或包括在位置92处与30kDa PEG共价键联的非天然氨 基酸对乙酰基-苯丙氨酸的His标记hGH多肽的水溶性。PEG化hGH的量大于WHO hGH 和hGH的量，其证明非天然氨基酸多肽的PEG化增加水溶性。
实例94：经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠中，随后将其分为两个组。一组每天用经修饰 的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗且另一组每天用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每天 测量肿瘤大小，且如由用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤大小的减 小所指示，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽具有 改良的治疗功效。
实例95：经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠中，随后将其分为两个组。一组每天用经修饰 的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗且另一组每天用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每天 测量肿瘤大小，且如由用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤大小的减 小所指示，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽具有 改良的治疗功效。
应了解，本文中描述的实例和实施例仅为说明性目的且其各种修饰或变化应可由所 属领域的技术人员提出且包含在本申请案的精神和范围内以及随附权利要求的范畴内。 本文中引用的所有公开案、专利和专利申请案是为所有目的以引用的方式全部并入本文 中。
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2004年12月22日申请的美国临时申请案第60/638,418号、2004年 12月22日申请的美国临时申请案第60/638,527号、2004年12月22日申请的美国临时 申请案第60/639,195号、2005年7月1日申请的美国临时申请案第60/696,210号、2005 年7月1日申请的美国临时申请案第60/696,302号和2005年7月1日申请的美国临时 申请案第60/696,068号的利益，其中所述申请案的揭露内容是以引用的方式全部并入本 文中。
序列表
SEQ ID# 序列表 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 1 CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAA TCCGCATGGCGCTGGTTCAAATCCGGCCCGCCGGACCA 詹氏甲烷球菌 mtRNACUA Tyr tRNA 2 CCCAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGACGGACTCTA AATCCGTTCTCGTAGGAGTTCGAGGGTTCGAATCCCTTCC C TGGGACCA HLAD03；优化的琥 珀抑制tRNA tRNA tRNA 3 GCGAGGGTAGCCAAGCTCGGCCAACGGCGACGGACTTCC TAATCCGTTCTCGTAGGAGTTCGAGGGTTCGAATCCCTCC CCTCGCACCA HL325A；优化的 AGGA移码抑制tRNA tRNA 4 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基 -L-苯丙氨酸的氨酰 基tRNA合成酶 p-Az-PheRS(6) RS 5 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTSHYLGVDV AVGGMEQRKIHMLAPJELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对苯甲酰 基-L-苯丙氨酸的氨 酰基tRNA合成酶 p-BpaRS(1) RS 6 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKAAIGFEPSGKIHLG HYLQIKKMIDL QNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMG LKAKYVYGSPFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIA REDENPKVAEVIYPIMQVNAIYLAVDVAVGGMEQRKIHML ARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEE IRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGG DLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS 7 MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SPFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNIPY LPVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKVVC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTIKRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS 8 MDEFE MIKRN TSEII SEEEL REVLK KDEKS AAIGF EPSGK IHLGH YLQIK KMIDL QNAGF DIIIL LADLH AYLNQ KGELD EIRKI GDYNK KVFEA MGLKA KYVYG SKFQL DKDYT LNVYR LALKT TLKRA RRSME LIARE DENPK VAEVI YPIMQ VNAIY LAVD VAVGG MEQRK IHMLA RELLP KKWC IHNPV LTGLD GEGKM SSSKG NFIAV DDSPE EIRAK IKKAY CPAGV VEGNP IMEIA KYFLE YPLTI KRPEK FGGDL TVNSY EELES LFKNK ELHPM DLKNA VAEEL IKILE PIRKR L 用于并入炔丙基-苯 丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 炔丙基-PheRS RS
SEQ ID# 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 9 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSNFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(1) RS 10 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELLAJREDENPKVAEVIYPIMQVNPLHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(3) RS 11 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPVHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(4) RS 12 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSATIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSSFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNPSHYQGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 p-Az-PheRS(2) RS 13 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGCHYRGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW1) RS 14 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSALIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNGTFIYRGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW5) RS 15 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELLAREDENPKVAEVIYPIMQVNGGHYLGVDV IVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMSS SKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (LW6) RS
SEQ ID# 序列 备注 蛋白质、核 酸、tRNA 或RS 16 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAAIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSRFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNVIHYDGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKWCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGWEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (AzPheRS-5) RS 17 MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAGIGFEPSGKIHL GHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIG DYNKKVFEAMGLKAKYVYGSTFQLDKDYTLNVYRLALKT TLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNTYYYLGVDV AVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMS SSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFL EYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNA VAEELIKILEPIRKRL 用于并入对叠氮基- 苯丙氨酸的氨酰基 tRNA合成酶 (AzPheRS-6) RS
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