一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片
专利汇可以提供一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 特别提供了一种单细胞凋亡DNA 片段 化检测用微流控芯片，主要涉及在微流控芯片上以集成方式实现单细胞的进样、裂解、片段化DNA标记、凋亡细胞DNA片段化 电泳 分离及检测等功能。芯片各功能单元与芯片结构相对应。芯片为双T型结构，由缓冲液池、细胞进样池、裂解液池、废液池、 检测区域 组成，各溶液池由通道连接，通道直径与所研究细胞的大小相适应，并能保证容纳单细胞运输。本发明用于筛选引起细胞凋亡各种致凋亡因子及检测不同类型细胞的凋亡。本发明操作方便易行，将各实验功能集成在一 块 微流控芯片上实现，而且具有较高的分析通量和分析效率，在细胞 生物 学等领域具有极其重大的潜在价值。，下面是一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片专利的具体信息内容。
1.一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：该芯片由三个基本功能单元构成，其中第三个基本功能单元分别和另外两个单元连接：第一个基本单元是细胞进样单元；第二个基本单元是细胞的裂解液进样单元；第三个基本单元是细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元，芯片具有双T型结构，其由以下几个部分组成：缓冲液池(1)、细胞进样池(2)、裂解液进样池(3)、废液池(4)、检测区域(5)；双T型结构芯片的各个溶液池之间由通道连接，通道直径与所研究的细胞大小相适应，并能保证容纳单个细胞的运输；芯片的双T型结构与所述各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应第一个基本单元；裂解液进样池(3)对应第二个基本单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应第三个基本单元。
2.按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第一个基本单元所用的进样溶液细胞密度是104～106个/mL；采用低电场电驱动细胞进样，进样电压为10～100V/cm。
3.按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第二个基本单元采用低电场电驱动细胞裂解液进样，进样电压为10～100V/cm。
4.按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是芯片缓冲液池和废液池之间的连接通道：DNA片段化分离所用的筛分介质是0.5％～5％羟丙基甲基纤维素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化电泳分离为100～250V/cm。
5.按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是通过激光诱导荧光单点法检测实现的。
6.按照权利要求1所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述片段化DNA标记所用标记染料是预先加在运行缓冲液或细胞裂解液中的荧光染料；荧光染料的激发波长、发射波长与激光诱导荧光检测用激光器的激光波长相适应。
7.按照权利要求6所述一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：对片段化DNA进行在线动态标记所采用的标记染料浓度是1uM。
一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片
技术领域
背景技术
大量研究表明，细胞凋亡信号传导途径的实质是一套连续的生化反应系统，该系统使细胞外刺激和细胞内应答以及细胞凋亡效应之间偶联，调控着细胞的生命。这些作用的最终结局表现为一系列细胞形态学变化和生化改变，其中由核酸内切酶激活所致的染色质DNA片段化是细胞凋亡最重要和最具特征性的生化指标。传统的分析方法包括琼脂糖平板电泳和毛细管电泳技术。前者只能对大量群体细胞进行总体分析(至少1×106细胞)，其分辨率、灵敏度均较低，且操作过程繁琐、分析过程难以集成化。后者虽可在毛细管电泳进行单个细胞分析，但所需时间相对较长，集成化程度不高。这些局限性在一定程度上限制了对细胞凋亡过程更深入、更全面的研究和认识。
微流控芯片技术是近几年发展起来的一项崭新的分析技术，它具有单细胞水平对细胞进行操作的优势，它为在同一芯片上将细胞培养，输运，清洗和电泳分离等过程集成一体提供了可能性。同时，微流控芯片的流体网络特征(二维或三维)，使之有可能对细胞进行更为复杂的物理或化学分析，配合高灵敏度的检测器可使该技术为单细胞水平研究复杂的细胞生物学过程提供强大的技术支撑。
目前，国际上仅有一个实验室报道利用芯片技术进行单个细胞DNA片段化分析，检测对象为细胞内单链DNA，但由于受所采用细胞裂解方式(氢氧化钠)的限制，分析过程相对较长，且没有芯片通道内对单细胞的连续操作过程，分析通量相对较低。
发明内容
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：该芯片由三个基本功能单元构成，其中第三个基本功能单元分别和另外两个单元连接：第一个基本单元是细胞进样单元；
第二个基本单元是细胞的裂解液进样单元；第三个基本单元是细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第一个基本单元所用的进样溶液细胞密度是104～106个/mL；采用低电场电驱动细胞进样，进样电压为10～100V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第二个基本单元采用低电场电驱动细胞裂解液进样，进样电压为10～100V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是芯片缓冲液池和废液池之间的连接通道：细胞裂解采用化学裂解方法，凋亡细胞裂解在芯片通道内在线完成。
DNA片段化分离所用的筛分介质是0.5％～5％羟丙基甲基纤维素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化电泳分离为100～250V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述第三个基本单元是通过激光诱导荧光单点法检测实现的。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述片段化DNA标记所用标记染料是预先加在运行缓冲液或细胞裂解液中的荧光染料；荧光染料的激发波长、发射波长与激光诱导荧光检测用激光器的激光波长相适应。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：对片段化DNA进行在线动态标记所采用的标记染料浓度是1uM。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述DNA片段化分离的分离电压为170V/cm。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述检测位置在反应通道中的裂解液进样通道和细胞进样通道之间，与裂解液进样通道和细胞进样通道的距离之比为1比2。
本发明一种单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片，其特征在于：所述芯片为双T型结构，其由以下几个部分组成：缓冲液池(1)、细胞进样池(2)、裂解液进样池(3)、废液池(4)、检测区域(5)；双T型结构芯片的各个溶液池之间由通道连接，通道直径与所研究的细胞大小相适应，并能保证容纳单个细胞的运输；芯片的双T型结构与芯片的各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应第一个基本单元；裂解液进样池(3)对应第二个基本单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应第三个基本单元。
本发明适用于对引起细胞凋亡各种致凋亡因子的筛选，以及不同类型细胞如肿瘤细胞、神经元、及胚胎等多种细胞凋亡的检测。本发明操作方便易行，将细胞进样、裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离、检测过程集成在一块微流控芯片上完成，而且具有较高的分析通量和分析效率，在细胞生物学、医学等领域具有重大的潜在价值。
附图说明
：图1单细胞凋亡DNA片段化检测用微流控芯片结构示意图；图2芯片电泳图。
具体实施方式
2芯片设计：本实施例所采用芯片设计如附图1所示，芯片为双T型结构，芯片分离通道宽50微米，深20微米。因为哺乳类细胞的大小通常在10-25um直径大小范围，所设计芯片分离通道直径与细胞大小在一个数量级，并能保证容纳单个细胞的运输。图中四个圆孔分别代表不同溶液池，其中1，4为缓冲液和废液池，2和3分别为细胞进样池和裂解液进样池，检测区域在1，4之间的连接通道内。
芯片的双T型结构与芯片的各基本功能单元相对应：细胞进样池(2)对应细胞进样单元；裂解液进样池对应裂解液进样单元；细胞进样池与裂解液进样池之间的反应通道对应细胞裂解、片段化DNA标记、DNA片段化分离及检测单元。
3细胞裂解方式和片段化DNA标记方式在低电场驱动下(50V/cm)，经药物处理的细胞和细胞裂解液(2％SDS)分别由池2和3进样，当进入分离通道时，细胞与裂解液混合，在10ms左右细胞迅速裂解。裂解后释放的片段化DNA与运行缓冲液中的荧光染料结合，进行在线动态标记。所采用的最佳染料标记浓度为1uM。有效标记后的DNA片段在分离电场和筛分介质的作用下，在检测区域通过激光诱导荧光单点法实现检测。实验中所用细胞密度在105个/mL左右，可避免高密度细胞悬液中细胞之间发生粘连，影响单个细胞在通道中的运行。
4 DNA片段化芯片电泳分离条件a.筛分介质本实施例中所用运行缓冲液中的主要有效成分即筛分介质为自行优化所得的1.5％羟丙基甲基纤维素50cp(1.5％HPMC-50cp，粘度15kD)，该筛分介质与常规介质相比黏度较低，特别适合于微流控芯片通道的微小尺寸，通道清洗方便，易于更换溶液，并可满足于细胞凋亡过程中芯片DNA片段化的分离要求。
b.分离电压芯片电泳过程中，分离电压的选择直接影响到片段化DNA的分离质量，高分离电压显著降低分离效果(＞250V/cm)，而低电压则明显延长分离时间(＜100V/cm)，不利于快速分析。本实施例经优化的最佳分离电压为170V/cm。
5.凋亡细胞电泳结果如附图2所示，经As2O3作用后的NB4细胞发生凋亡，出现DNA片段化，并可经芯片电泳检测。图中的前3个小峰为片段化DNA，与DNA标准品比较后确认片段大小为180bp、360bp和540bp，第4个最高峰为基因组DNA。
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