基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒
阅读：1034发布：2020-10-12
专利汇可以提供基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种基于 磁珠 和微流控芯片的循环 肿瘤 干细胞检测 试剂 盒 ，其特征在于，包含微流控芯片、至少一种能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的标记有肿瘤干细胞 生物 标志物的免疫磁珠以及至少一种针对肿瘤干细胞生物标志物的 荧光 抗体 ，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底，所述的玻璃芯片基底上设有微流控通道，微流控通道内设有软 磁性 微阵列。本发明可实现一次样品进样即可捕获检测多种不同类别的稀有循环肿瘤干细胞，具有较高的灵敏度和特异性，操作方便快速，捕获细胞易于收集，无需芯片内部 微流通道 复杂的一抗二抗表面修饰过程等特点。，下面是基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，其特征在于，包含微流控芯片、能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的针对肿瘤干细胞生物标志物EpCAM、CD133、CD90、CD24的免疫磁珠、相应的针对所述肿瘤干细胞生物标志物EpCAM、CD133、CD90、CD24的荧光抗体以及针对白细胞标志物CD45的荧光抗体，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底(1)，所述的玻璃芯片基底(1)上设有微流控通道(2)，微流控通道(2)内设有软磁性微阵列；所述的软磁性微阵列由镍铁合金圆柱(3)构成，相邻两列镍铁合金圆柱(3)交错排列；
其中所述微流控芯片的制备方法为：
i)在玻璃基片上溅射Ti/Cu种子层，然后通过正胶光刻得到依据软件模拟设计的软磁性微阵列的阳模，接着进行电铸，获得由镍铁合金圆柱(3)构成的软磁性微阵列；所述的相邻两列镍铁合金圆柱(3)的距离(c)为100μm，镍铁合金圆柱(3)的直径(d)为30μm，每列中相邻两个镍铁合金圆柱(3)之间的距离(e)为50μm；
ii)通过化学腐蚀的方法去除Ti/Cu种子层，获得透明的玻璃芯片；接着划片，获得单个玻璃芯片基底(1)；
iii)通过硅片基底上的SU8胶光刻，获得所需要的微流控通道的阴模，然后通过PDMS快速成型，制备微流控通道(2)；
iv)最后采用常规方法将微流控通道(2)与玻璃芯片基底(1)进行加压键合，制成微流控芯片。
2.权利要求1所述的基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的使用方法，该方法用于非疾病诊断的目的，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：裂解外周血红细胞，离心，去除上清，重悬获得外周血有核细胞悬液；
步骤2：将能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的针对肿瘤干细胞生物标志物EpCAM、CD133、CD90、CD24的免疫磁珠掺入外周血有核细胞悬液，孵育，得到标记有所述免疫磁珠的外周血有核细胞悬液；
步骤3：在微流控芯片底部施加外磁场，将标记有所述免疫磁珠的外周血有核细胞悬液泵入微流控芯片的微流控通道(2)中；
步骤4：将相应的针对肿瘤干细胞生物标志物EpCAM、CD133、CD90、CD24的荧光抗体以及针对白细胞标志物CD45的荧光抗体泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，孵育，显微镜鉴定循环肿瘤干细胞；
步骤5：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
3.权利要求1所述的基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的使用方法，该方法用于非疾病诊断的目的，其特征在于，具体步骤包括：
步骤A：裂解外周血红细胞，离心，去除上清，重悬获得外周血有核细胞悬液；
步骤B：将针对肿瘤干细胞生物标志物的EpCAM、CD133、CD90、CD24荧光抗体以及 针对白细胞标志物CD45的荧光抗体掺入外周血有核细胞悬液，孵育，得到含有所述荧光抗体的外周血有核细胞悬液；
步骤C：将相应的能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的针对所述肿瘤干细胞生物标志物EpCAM、CD133、CD90、CD24的免疫磁珠掺入含有所述荧光抗体的外周血有核细胞悬液，孵育，得到标记有所述免疫磁珠的外周血有核细胞悬液；
步骤D：在微流控芯片底部施加外磁场，将标记有所述免疫磁珠的外周血有核细胞悬液泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，显微镜鉴定循环肿瘤干细胞；
步骤E：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒。
背景技术
[0002] 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)(简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在中国每年新诊断的肝癌约占全世界55％，其死亡率在我国恶性肿瘤中列第二位。虽然手术切除是目前肝癌治疗的首选方式，但即便是根治性切除5年内仍有60-70％的病人出现转移复发。肝癌术后转移和复发是病人术后的主要死亡原因，它已成为进一步提高肝癌治疗效果的最主要障碍。因此，探索肝癌转移、复发的机制，寻找更有效的转移早期预警及疗效评估手段，以便进行早期合理干预，已成为进一步提高肝癌生存率的关键。
[0003] 近来研究提示循环肿瘤细胞在肿瘤转移和复发中扮演关键角色。但是每天有数以千计的肿瘤细胞脱离原发瘤进入循环血中，但并不是每个循环肿瘤细胞都能成为转移复发的“种子”。这除有环境(土壤)因素外，“种子”本身特性也决定着其能否在新环境中成功“定植”。我们在前期研究中发现具有干细胞特性的循环肿瘤细胞的数量与肝癌切除术后早期肝内复发和肺转移密切相关，相对于较成熟的循环肿瘤细胞而言，那些循环肿瘤干细胞具有很强的成瘤、抗凋亡能力。因此精确地捕获分类这些导致癌症转移、复发的“种子”细胞具有重大的临床和科研意义。然而这群细胞在外周血中极其稀有，平均107个白细胞中只有一个循环肿瘤干细胞。目前已有的循环肿瘤细胞捕获技术如梯度密度离心技术、滤膜技术和流式细胞技术在实现循环肿瘤干细胞的捕获分类方面均存在一定的缺陷。梯度密度离心和滤膜技术通过循环肿瘤细胞与血细胞之间物理特性的差异(密度、大小)实现细胞的捕获，由于这两种基于物理特性实现捕获的技术其灵敏度和特异性较低，无法对捕获细胞进行分类，细胞易丢失，限制了其在循环肿瘤细胞捕获中的应用。流式细胞术通过对待测样品进行特定的荧光标记，然后利用复杂的光学检测系统进行鉴定分选，该技术虽可实现不同类别肿瘤细胞的分类收集，但是设备本身成本昂贵、检测效率低、需专人操作，同时检测稀有细胞灵敏度差，无法对 细胞形态学进行观察，也很难广泛应用于循环肿瘤干细胞的捕获。因此亟需开发一种廉价、操作简单，一次性使用的，具有高灵敏度、特异性和多标志物检测的循环肿瘤干细胞方法。
[0004] 微流控芯片技术具有检测高效、集成化、试剂消耗量小等诸多优点正被越来越多地应用于生物医学领域，并已发展出多种微流控细胞捕获技术。然而目前大多数已报道的细胞捕获芯片仍停留在单标志物、单种细胞的捕获，对于多标志物、多类别细胞捕获仍然缺乏相应的手段。它们中的代表是Nagrath S等2007年于Nature上报道的一种单标志物循环肿瘤细胞捕获芯片，该芯片在流道内设置圆形的微柱阵列，经过化学修饰，在流道内壁及微柱表面结合上皮细胞黏附因子抗体，通过细胞流动中与微柱的碰撞来捕获靶细胞。这种方法捕获细胞的成功与否完全取决于靶细胞是否碰撞微柱，因此其捕获效率较低。该类芯片无法一次进样实现多标志物循环肿瘤干细胞捕获的功能。此外这种芯片的应用还受制于捕获的细胞很难释放收集和前期芯片化学修饰过程复杂等缺点。为了实现多标志物癌细胞捕获的目的，Xu Y等2009年在Anal Chem上提出蛇形管道划定不同捕获区域，在每个捕获区域的上下游设置进出样开孔，利用开孔的交替开放与封闭在不同区域固定上各自不同的核酸适体，以此来达到在同一管道中并行捕获不同癌细胞的目的。该方法虽然可以实现多标志物细胞的捕获，但多次重复的流道固定使芯片制备过程时间长、步骤多，又由于在同一管道内进行流动固定，容易产生上下游的交叉污染，使假阳性增高，而为了控制假阳性率，必须加长各区域的长度，这对芯片的进一步集成造成了障碍。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，无需对其芯片的内部进行繁复的化学修饰，具备一次样品进样就能对完成包括单、多标志物循环肿瘤干细胞的捕获、鉴定和回收等功能，同时还具有操作简便、集成度高的特点。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供了一种基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，其特征在于，包含微流控芯片、至少一种能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的标记有肿瘤干细胞生物标志物的免疫磁珠以及至少一种针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体，其中，所述的微流控芯片包括玻璃芯片基底， 所述的玻璃芯片基底上设有微流控通道，微流控通道内设有软磁性微阵列。
[0008] 更优选地，所述的相邻两列镍铁合金圆柱的距离为100μm，镍铁合金圆柱的直径为30μm，每列中相邻两个镍铁合金圆柱之间的距离为50μm。
[0009] 优选地，所述的肿瘤干细胞生物标志物包括EpCAM、CD133、CD90、CD24、CD13、ICAM-1、SALL4、CD44和ALDH的至少一种。
[0010] 本发明还提供了上述基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的第一种使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
[0011] 步骤1：裂解外周血红细胞，离心，去除上清，重悬获得外周血有核细胞悬液；
[0012] 步骤2：将能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的标记有肿瘤干细胞生物标志物的免疫磁珠掺入外周血有核细胞悬液，孵育，得到标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液；
[0014] 步骤4：将相应的针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体泵入微流控芯片的微流控通道(2)中，孵育，显微镜鉴定循环肿瘤干细胞；
[0015] 步骤5：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
[0016] 本发明还提供了上述基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的另一种使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
[0017] 步骤A：裂解外周血红细胞，离心，去除上清，重悬获得外周血有核细胞悬液；
[0018] 步骤B：将针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体掺入外周血有核细胞悬液，孵育，得到含有针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体的外周血有核细胞悬液；
[0019] 步骤C：将相应的能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的标记有肿瘤干细胞生物标志物的免疫磁珠掺入有针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体的外周血有 核细胞悬液，孵育，得到标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液；
[0020] 步骤D：在微流控芯片底部施加外磁场，将标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液泵入微流控芯片的微流控通道中，显微镜鉴定循环肿瘤干细胞；
[0021] 步骤E：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
[0022] 图2中的上面一行显示了基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的第一种使用方法的流程，其余部分显示了基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒的第二种使用方法的流程。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0024] 本发明利用标记有循环肿瘤干细胞标志物的免疫磁珠掺入外周血与循环肿瘤干细胞特异性结合，通过微流控芯片内软磁性微阵列捕获循环肿瘤干细胞，实现外周血稀有循环肿瘤干细胞的多标志物分类检测，撤除外加磁场后去磁化，使吸附的循环肿瘤干细胞脱落以便于收集。本发明结合了免疫磁珠对细胞高效率结合以及微流控芯片高通量动态捕获的这两大优点，可实现一次样品进样即可捕获检测多种不同类别的稀有循环肿瘤干细胞，具有较高的灵敏度和特异性，操作方便快速，捕获细胞易于收集，无需芯片内部微流通道复杂的一抗二抗表面修饰过程等特点。附图说明
[0025] 图1为微流控芯片结构示意图；
[0026] 图2为基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒使用流程图；
[0027] 图3为对EpCAM、CD133、CD90、CD24阳性的循环肝癌干细胞检测结果图。右上，红色荧光标记EpCAM+循环肝癌干细胞，蓝色荧光标记细胞核；左上，红色荧光标记CD133+循环肝癌干细胞，绿色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核；右下，绿色荧光标记CD90+循环肝癌干细胞，红色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核；左下，红色荧光标记CD24+循环肝癌干细胞，绿色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核。
具体实施方式
[0029] 下面结合实施例来具体说明本发明。
[0030] 实施例1
[0031] 1、一种基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，由以下组分组成：
[0032] (1)微流控芯片，如图1所示，为微流控芯片结构示意图，所述的微流控芯片微流控芯片包括玻璃芯片基底1，所述的玻璃芯片基底1上设有长度a为50mm，宽度b为17mm的微流控通道2，微流控通道2内设有软磁性微阵列。所述的软磁性微阵列由镍铁合金圆柱3构成，相邻两列镍铁合金圆柱3交错排列。所述的相邻两列镍铁合金圆柱3的距离c为100μm，镍铁合金圆柱3的直径d为30μm，每列中相邻两个镍铁合金圆柱3之间的距离e为50μm。后一列镍铁合金圆柱3水平中轴线到前一列镍铁合金圆柱3边缘的最短垂直距离f为25μm。
[0033] (2)能够与循环肿瘤干细胞特异性结合的标记有肿瘤干细胞生物标志物的免疫磁珠，包括：抗EpCAM的免疫磁珠(Catalog no.130-061-101.Miltenyi Biotec，Germany)、抗CD133的免疫磁珠(Catalog no.130-050-801.Milteny Biotec)、抗CD90的免疫磁珠(Catalog no.130-096-253，Milteny Biotec)和抗CD24的免疫磁珠(Catalog no.130-095-951，Milteny Biotec)。
[0034] (3)针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体，包括：抗EpCAM-PE的荧光抗体(Catalog no.130-091-253，Milteny Biotec)，抗CD133-PE的荧光抗体(Catalog no.130-080-801，Milteny Biotec)，抗CD90-FITC的荧光抗体(Catalog no.130-095-953，Milteny Biotec)，抗CD24-PE的荧光抗体(Catalog no.130-095403，Milteny Biotec)，白细胞标志物的荧光抗体CD45-FITC(Catalog no.555482，BD bioscience)和CD45-PE(Catalog no.561866，BD bioscience)。
[0035] 2、制备微流控芯片：
[0036] (1)在玻璃基片上溅射Ti/Cu种子层，然后通过正胶光刻得到依据软件模拟设计的软磁性微阵列的阳模，接着进行电铸，获得如图1所示的由镍铁合金圆柱3构成的软磁性微阵列，镍铁合金圆柱3的材料由(镍和铁按照80∶20的质量百分比组成)组成。
[0037] (2)通过化学腐蚀的方法去除Cu/Ti种子层，获得透明的玻璃芯片；接着划片，获得单个玻璃芯片基底1；
[0039] (4)最后采用常规方法将微流控通道2与玻璃芯片基底1进行加压键合，制成微流控芯片。
[0040] 3、使用基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，对肝癌患者外周血中四种不同标志物阳性(包括EpCAM+、CD133+、CD90+、CD24+)的循环肝癌干细胞进行捕获，具体步骤为：
[0041] 步骤A：采集肝癌患者8ml外周静脉血，等分成4份，每份2ml，分别与其9X体积的红细胞裂解液(Red blood cell lysis solution10X，Catalog no.130094183，Miltenyi Biotec)室温混匀2分钟，加入等体积PBS缓冲液(PBS1X，pH＝7.4，Catalog no.21-040-CVR，Corning，)终止裂红反应，室温以350g的离心力离心5分钟，去除上清，300μl PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，获得外周血全部有核细胞(包括肿瘤细胞、白细胞、内皮细胞等)。最终获得4份300μl外周血有核细胞悬液。
[0042] 步骤B：将抗EpCAM-PE的荧光抗体(同上)以比例1∶100、白细胞标志物CD45-FITC(同上)的荧光抗体以比例1∶200与第一份300μl外周血有核细胞悬液混合，将抗CD133-PE的荧光抗体以比例1∶100、白细胞标志物CD45-FITC(同上)的荧光抗体以比例1∶200与第二份300μl外周血有核细胞悬液混合，将抗CD90-FITC的荧光抗体以比例1∶100、白细胞标志物CD45-PE(同上)的荧光抗体以比例1∶200与第三份300μl外周血有核细胞悬液混合，将抗CD24-PE的荧光抗体以比例1∶100、白细胞标志物CD45-FITC(同上)的荧光抗体以比例1∶200与第四份300μl外周血有核细胞悬液混合，室温孵育1小时，室温以350g离心力离心5分钟，去除上清，分别加入300μl PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，得到4份300μl含有针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体的外周血有核细胞悬液；
[0043] 步骤C：取4种抗EpCAM、CD133、CD90、CD24免疫磁珠各100μl与步骤B获得的4份300μl含有针对肿瘤干细胞生物标志物的荧光抗体的外周血有核细胞悬液分别充分混匀(针对肝癌干细胞标志物的免疫磁珠在检测中与本次 检测中使用的肿瘤干细胞标志物荧光抗体相对应)，4℃孵育30分钟，加入1mlPBS缓冲液(pH＝7.4)，以350g的离心力4℃离心5分钟，去除上清，加入1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，得到标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液；
[0044] 步骤D：取4块微流控芯片，在微流控芯片底部分别施加外磁场(汝铁硼永磁铁)，步骤C获得的4份1ml标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液以2ml/hr的速度匀速分别泵入微流控芯片的微流控通道2中。荧光显微镜下观察捕获的EpCAM+、CD133+、CD90+、CD24+循环肝癌干细胞。(如图3所示)
[0045] 步骤E：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
[0046] 在本实施例中检测了33名原发性肝癌患者外周血的EpCAM+、CD133+、CD90+、CD24+循环肝癌干细胞。同时还从这33名患者外周静脉采集了另一份7.5ml外周血，并使用目前商TM售的循环肿瘤细胞检测系统(CellSearch ，Johnson & Johnson，USA)对这33份外周血进行EpCAM+循环肿瘤干细胞检测。实验结果显示：使用本发明方案中的微流控芯片检测EpCAM+循环肿瘤干细胞检出率为75.76％，而CellSearchTM系统的检出率为54.54％。(如图4所示)。
此外CellSearchTM系统仅能检测一种标志物的循环肿瘤干细胞。因此本发明方案的微流控芯片循环肿瘤干细胞检出效率显著高于目前商售系统，并且可以实现多种标志物循环肿瘤干细胞检测。
此外CellSearchTM系统仅能检测一种标志物的循环肿瘤干细胞。因此本发明方案的微流控芯片循环肿瘤干细胞检出效率显著高于目前商售系统，并且可以实现多种标志物循环肿瘤干细胞检测。
[0047] 实施例2
[0048] 1、一种基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，组成与实施例1相同。
[0049] 2、微流控芯片制备同实施例1。
[0050] 3、制备掺入Hep3B细胞株的血液样本，模拟含有循环肿瘤干细胞的血样：
[0051] (1)Hep3B细胞株(购自中科院上海生命科学园，肝细胞肝癌肿瘤细胞，表达EpCAM、CD133、CD90和CD24的Hep3B细胞阳性率分别为99.8％分、98％、0.2％和1％，本实施例中以Hep3B细胞作为掺入法的循环肿瘤细胞细胞)。取4×107的Hep3B细胞，按每份1×107细胞分别与如下荧光抗体以1∶100混合CD24-PE(Catalog no.130-095-403，Milteny Biotec)，CD90-FITC(Catalog no.130-095-953，Milteny Biotec)，EpCAM-PE(Catalog no.130-091-253，Milteny Biotec)，CD133-PE(Catalog no.130-080-801，Milteny Biotec)，4℃孵 育
15min，使用流式细胞仪(BD FACSAria，BD Biosciences)分别分选EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的Hep3B细胞各1000个，分别用1ml PBS(PBS1X，Catalog no.21-040-CVR，Corning)重悬。取4支Eppendorf管，每个管中放入上述四种Hep3B细胞悬液各100μl(每个管内含有100个Hep3B细胞)，另取4支Eppendorf管，每个管中放入上述四种Hep3B细胞悬液各10μl(每个管内含有10个Hep3B细胞)。
15min，使用流式细胞仪(BD FACSAria，BD Biosciences)分别分选EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的Hep3B细胞各1000个，分别用1ml PBS(PBS1X，Catalog no.21-040-CVR，Corning)重悬。取4支Eppendorf管，每个管中放入上述四种Hep3B细胞悬液各100μl(每个管内含有100个Hep3B细胞)，另取4支Eppendorf管，每个管中放入上述四种Hep3B细胞悬液各10μl(每个管内含有10个Hep3B细胞)。
[0052] 将上述制备好的四种Hep3B细胞悬液分别掺入1ml健康人外周血，分别得到100个EpCAM+Hep3B/1ml外周血样本、100个CD133+Hep3B/1ml外周血样本、100个CD90+Hep3B/1ml外周血样本和100个CD24+Hep3B/1ml外周血样本。10个EpCAM+Hep3B/1ml外周血样本、10个+ + +CD133Hep3B/1ml外周血样本、10个CD90Hep3B/1ml外周血样本和10个CD24Hep3B/1ml外周血样本。
[0053] 4、使用基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒，对血样中四种不同标志物阳性(包括EpCAM+、CD133+、CD90+、CD24+)的循环肝癌干细胞进行捕获，具体步骤为：
[0054] 步骤(1)：将上述制备好的血液样本，分别与其9X体积的红细胞裂解液(Red blood cell lysis solution10X，Catalog no.130094183，Miltenyi Biotec)室温混匀2分钟，加入等体积PBS缓冲液(PBS1X，pH＝7.4Catalog no.21-040-CVR，Corning)终止裂红反应，室温以350g的离心力离心5分钟，去除上清，300μlPBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，获得外周血全部有核细胞(包括肿瘤细胞、白细胞、内皮细胞等)。最终获得8份300μl外周血有核细胞悬液。
[0055] 步骤(2)：取抗EpCAM、CD133、CD90、CD24免疫磁珠各100μl与步骤B获得的8份300μl外周血有核细胞悬液分别充分混匀(针对肝癌干细胞标志物的免疫磁珠在检测中单独使用并与本次检测中使用的肿瘤干细胞标志物荧光抗体相对应)，4℃孵育30分钟，加入1ml PBS缓冲液(pH7.4)，以350g的离心力4℃离心5分钟，去除上清，加入1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，得到标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液。
[0056] 步骤(3)：取8块微流控芯片，在微流控芯片底部分别施加外磁场(汝铁硼永磁铁)，将8份1ml标记有免疫磁珠的外周血有核细胞悬液以2ml/hr的速度匀速分别泵入微流控芯片的微流控通道2中。荧光显微镜下观察捕获的EpCAM+、CD133+、CD90+、CD24+循环肝癌干细胞。
[0057] 步骤(4)：将抗EpCAM-PE的荧光抗体以1∶100的比例和白细胞标志物CD45-PE的荧光抗体以1∶200的比例一起加入第一份600μl PBS缓冲液(pH7.4)，将抗CD133-PE的荧光抗体以1∶100的比例和白细胞标志物CD45-PE的荧光抗体以1∶200的比例一起加入第二份600μl PBS缓冲液(pH7.4)，将抗CD90-FITC的荧光抗体以1∶100的比例和白细胞标志物CD45-PE的荧光抗体以1∶200的比例一起加入第三份600μl PBS缓冲液(pH7.4)，将抗CD24-PE的荧光抗体以1∶100的比例和白细胞标志物CD45-PE的荧光抗体以1∶200的比例一起加入第四份600μl PBS缓冲液(pH＝7.4)，室温避光的环境下，以1ml/hr的速度分别泵入含有相应的免疫磁珠的微流控芯片的微流控通道2中，直至600μl全部泵入(需36分钟)，整个操作过程保持底部外加磁场存在，显微镜鉴定循环肿瘤干细胞。
[0058] 步骤(5)：撤除微流控外磁场，回收循环肿瘤干细胞以进行下游分子生物学实验。
[0059] 本试剂盒捕获的EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的Hep3B细胞数量分别为：掺入100个/ml细胞，每种标志物细胞的捕获效率高达99％、98％、98％和99％，掺入10个/ml细胞，每种标志物细胞的捕获效率高达100％、80％、90％和90％。使用目前商售的MACS细胞富集系统(QuadroMACSTM Separator and Starting Kits，Miltenyi Biotec，Germany)，按照产品说明书对相同的血样进行处理，掺入100个/ml细胞，每种标志物标志物Hep3B细胞的捕获率分别仅为32％、25％、30％、36％。掺入10个/ml细胞，四种标志物标志物Hep3B细胞回收效率为零。实验结果显示，本发明方案中微流控芯片对外周血不同标志物循环肿瘤细胞的分类捕获效率，尤其是外周血中极微量细胞(＜10个/ml)捕获效率明显高于目前商售系统。
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